(57)【要約】【課題】試料追尾のためのビデオカメラやメモリーを必要とすることなく、標本試料の自動追尾機能を有する顕微鏡観察装置を提供する。【解決手段】顕微鏡観察装置１００は、レーザー走査型共焦点顕微鏡１１０と、これに励起光のビームを供給する四系統の光走査系１３０を有している。光走査系１３０は、ＸＹ走査機構１３５を駆動する駆動装置１４１と、励起光ビームの収束点の位置を求める位置算出装置１４２とを有している。顕微鏡観察装置１００は、光走査系１３０の光検出器１３８から出力される電気信号を二値化パルスに変換する信号処理装置１５１と、信号処理装置１５１から出力される二値化パルスから自己相関関数を求める相関解析装置１５２と、求められた自己相関関数に基づいて、試料ステージ１２２を移動させる試料ステージコントローラー１２５を制御するコンピューター１２６とを有している。【選択図】      図３
2006292420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本試料（例えば細胞）内部の被検物質の動態を測定する顕微鏡装置であり、
標本試料を保持する試料保持手段と、
標本試料の測定可能領域（例えば細胞核）を含む顕微画像を取得する画像取得手段と、
取得した顕微画像の測定可能領域内に少なくとも一つの被検物質に対して限定的に照準するように測定点を設定する測定点設定手段と、
設定された測定点を更新する測定点更新手段と、
更新された測定点から得られる複数時点の測定データに基づいて被検試料の動的特性を出力する動的特性出力手段を備えていることを特徴とする、標本試料の追尾機能を備えた顕微鏡観察装置。
【請求項２】
請求項１において、画像取得手段は取得した顕微画像を観察可能に表示する手段を有し、測定点設定手段は前記表示手段に表示された顕微画像の任意の点を指定するための入力手段を有する、標本試料の追尾機能を備えた顕微鏡観察装置。
【請求項３】
請求項１において、測定点更新手段は、保持手段に保持された標本試料と設定した測定点とを相対的に移動する手段を有する、標本試料の追尾機能を備えた顕微鏡観察装置。
【請求項４】
請求項３において、前記移動手段は、試料保持手段を移動する手段を有する、標本試料の追尾機能を備えた顕微鏡観察装置。
【請求項５】
請求項４において、測定点設定手段は取得した画像なしで設定済みの測定点を被検物質毎に移動する手段を有し、試料保持手段の移動と共働して測定点を更新するように更新手段を機能させる、標本試料の追尾機能を備えた顕微鏡観察装置。
【請求項６】
請求項４において、更新手段は、複数の少なくとも一つの測定点を測定可能領域の中心に近づけるように試料保持手段の移動手段を機能させる、標本試料の追尾機能を備えた顕微鏡観察装置。
【請求項７】
請求項１において、前記更新手段は、被検物質の動的信号を取得する手段を有し、この動的信号に基づいて測定点を更新する、標本試料の追尾機能を備えた顕微鏡観察装置。
【請求項８】
請求項１において、更新された測定点から得られる複数時点の測定データは、蛍光に由来する光信号である、標本試料の追尾機能を備えた顕微鏡観察装置。
【請求項９】
請求項１において、更新された測定点から得られる複数時点の測定データは、被検物質の動的信号に基づく自己相関関数の時間変化である、標本試料の追尾機能を備えた顕微鏡観察装置。
【請求項１０】
請求項１において、更新された測定点から得られる複数時点の測定データは、被検物質の動的信号に基づく相互相関関数の時間変化である、標本試料の追尾機能を備えた顕微鏡観察装置。
【請求項１１】
請求項１において、画像取得手段は共焦点光学系から成る、標本試料の追尾機能を備えた顕微鏡観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点光学顕微鏡をベースとして蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析（ＦＣＳ）を行なう顕微鏡観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の特定部位から統計的な性質や分子レベルの機能を解析する測定装置として、例えば特表１１−５０２６０８号公報では、共焦点光学顕微鏡をベースとし、レーザー光を顕微鏡対物レンズを通して蛍光標識された試料に照射し、試料内の蛍光分子による蛍光強度ゆらぎを解析し（蛍光相関分光を行ない）、蛍光分子の並進拡散係数などの統計的な性質や分子間の相互作用などを求める方法と装置を開示している。
【０００３】
共焦点光学顕微鏡に関しては、例えば、”Confocal Microscopy” T. Wilson(ed.) Academic press (London)、主に生物試料を対象とした解説として、”Handbook of Biological confocal Microscopy” J. B. Pawley(ed.) Plenum Press (New York)、大出孝博らによる解説（「光学」Vol.18, Vol.8, p.p.392〜398）や、河田聡による解説（「光学」Vol.18, Vol.8, p.p.380〜391）などがある。蛍光相関分光法に関しては、例えば、”Fluorescence correlation spectroscopy” R. Rigler, E. S. Elson (eds.) Springer (Berlin)などの解説がある。
【０００４】
蛍光相関分光法ではレーザー走査型共焦点顕微鏡の視野の中で蛍光物質で標識されたタンパク質や担体粒子を溶液中に浮遊させ、これらの微粒子のブラウン運動に基づく蛍光強度のゆらぎを解析して自己相関関数を求め、対象とする微粒子の数や並進拡散速度などを推測する。この技術については、金城政孝「蛋白質 核酸 酵素」(1999) Vol.44, No.9, p1431-1437に論じられている。
【０００５】
さらにこの技術に関して、いくつか特許も出願されている。レーザー走査型共焦点顕微鏡については、例えば特開平１０−２０６７４２号公報に記述されている。また特開平１０−２０６７４２号公報ではレーザー走査型共焦点顕微鏡において、標本画像を観察しながら、標本の所望の位置にレーザー光を照射し、標本の動的特性を求める方法について記述している。
【特許文献１】特表１１−５０２６０８号公報
【特許文献２】特開平１０−２０６７４２号公報
【特許文献３】特開平７−２５３５４８号公報
【特許文献４】特開平５−８０２５５号公報
【特許文献５】特開平７−２６１０９７号公報
【非特許文献１】”Confocal Microscopy” T. Wilson(ed.) Academic press (London)
【非特許文献２】”Handbook of Biological confocal Microscopy” J. B. Pawley(ed.) Plenum Press (New York)
【非特許文献３】大出孝博ら「光学」Vol.18, Vol.8, p.p.392〜398
【非特許文献４】河田聡「光学」Vol.18, Vol.8, p.p.380〜391
【非特許文献５】”Fluorescence correlation spectroscopy” R. Rigler, E. S. Elson (eds.) Springer (Berlin)
【非特許文献６】金城政孝「蛋白質 核酸 酵素」(1999) Vol.44, No.9, p1431-1437
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来行なわれている光学顕微鏡における試料の追尾方法では、試料画像を観察しながら、観察者自ら、電動ステージをジョイスティックなどで操作し、試料画像がモニター画面のほぼ中央に来るようにしている。
【０００７】
あるいは特開平７−２５３５４８号公報では、試料画像をビデオカメラなどで撮影し、この画像データをフレームメモリーに記憶し、基準画像データとフレームメモリーに記憶した画像データを比較して標本の移動を検出して、電動ステージの位置を制御して標本の追尾を行なっている。この方法によると顕微鏡観察装置のほかに、試料追尾のためのビデオカメラやメモリーを必要とする。また、この方法では標本試料の移動に対して追尾を行なってから、標本試料の観察を行なう。従って標本試料の観察の前に標本試料の移動を測定しなければならない。
【０００８】
また特開平５−８０２５５号公報では移動する試料に対して一定時間毎に連続的に試料画像を得て、これを二値化して二値化画像とした後、隣接する二枚の二値化画像を一枚ずつ時間軸に沿ってずらしていきながら、論理積画像を作成し、この論理積画像に基づいて、試料の移動を測定し、自動追跡を行なう。この方法では、試料の二値化画像を作成すると共に論理積画像も作成し、論理積による判断も必要とする。このため、計算量が多く、手間を要すると共に、多くのメモリーを必要とする。
【０００９】
また、特開平７−２６１０９７号公報では、移動前後の画像データを取得し、また試料内の複数の測定点（例えば三点）を予め指定し、ここで入力した値を補助画像データとし、移動後に入力した値（補助画像データ）との差分をとるなどして比較して試料の移動量を求める。この移動量データに基づいてステッピングモーターの駆動制御を行ない、可動ステージ観察視野の中心に移動する。この方法では画像データを用いて試料の移動の判断を行なっており、試料の移動の判断のために多くのメモリーを必要とする。
【００１０】
本発明は、この様な実状を考慮して成されたものであり、その主な目的は、試料追尾のためのビデオカメラやメモリーを必要とすることなく、標本試料の自動追尾機能を有する顕微鏡観察装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、標本試料（例えば細胞）内部の被検物質の動態を測定する、標本試料の追尾機能を備えた顕微鏡装置に向けられている。本発明の顕微鏡装置は、標本試料を保持する試料保持手段と、標本試料の測定可能領域（例えば細胞核）を含む顕微画像を取得する画像取得手段と、取得した顕微画像の測定可能領域内に少なくとも一つの被検物質に対して限定的に照準するように測定点を設定する測定点設定手段と、設定された測定点を更新する測定点更新手段と、更新された測定点から得られる複数時点の測定データに基づいて被検試料の動的特性を出力する動的特性出力手段を備えていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、試料追尾のためのビデオカメラやメモリーを必要とすることなく、標本試料の自動追尾機能を有する顕微鏡観察装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００１４】
第一実施形態
本実施形態は、共焦点光学顕微鏡を利用して蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析（ＦＣＳ）を行なう顕微鏡観察装置に向けられている。より詳しくは、四つの測定点における蛍光強度ゆらぎの自己相関関数を利用する試料自動追尾機能を有する顕微鏡観察装置に向けられている。図１は、本発明の第一実施形態における試料自動追尾機能を有する顕微鏡観察装置の基本構成を概略的に示している。
【００１５】
図１に示されるように、本実施形態の顕微鏡観察装置１００は、レーザー走査型共焦点顕微鏡１１０を含んでいる。レーザー走査型共焦点顕微鏡１１０は、顕微鏡本体１１１と、試料１２１が載せられる試料ステージ１２２と、試料ステージ１２２の下方に配置された対物レンズ１１２と、観察者による試料１２１の目視観察を可能にする接眼レンズ１１８と、試料１２１の光学像を取得するためのＣＣＤカメラ１２８とを有している。対物レンズ１１２と接眼レンズ１１８と試料ステージ１２２とＣＣＤカメラ１２８は共に顕微鏡本体１１１に取り付けられている。
【００１６】
レーザー走査型共焦点顕微鏡１１０はさらに試料ステージ１２２を移動させるための二つのステッピングモーター１２３と１２４を有しており、顕微鏡観察装置１００はさらに、ステッピングモーター１２３と１２４を制御する試料ステージコントローラー１２５と、試料ステージコントローラー１２５を制御するコンピューター１２６とを有している。
【００１７】
ステッピングモーター１２３と１２４は、駆動軸が互いに直交するように配置されており、試料ステージ１２２を互いに直交する二方向、いわゆるＸ方向とＹ方向に移動させ得る。試料ステージコントローラー１２５は、コンピューター１２６に接続されており、コンピューター１２６からの指令により、ステッピングモーター１２３と１２４を駆動して、試料ステージ１２２をＸ方向とＹ方向に移動させる。
【００１８】
顕微鏡観察装置１００はさらに、蛍光を発生させるための励起光のビームをレーザー走査型共焦点顕微鏡１１０に供給する光走査系１３０を有している。図２は、図１に示される顕微鏡観察装置の光走査系の全体構成を示している。
【００１９】
図２に示されるように、顕微鏡観察装置１００は、励起光のビームを射出すると共にそれを走査する四系統の光走査系１３０Ａと１３０Ｂと１３０Ｃと１３０Ｄを有している。四系統の光走査系１３０Ａ〜１３０Ｄは共に同様の構成を有している。以下の説明において、それらを区別する必要がない場合には、参照符号の末尾の英字を省略して単に光走査系１３０と記す。これに伴い、光走査系を構成している部材についても参照符号の末尾の英字を省略して記す。
【００２０】
光走査系１３０は、励起光ビームを射出するレーザー光源１３１と、レーザー光源１３１から励起光ビームを平行化するレンズ１３２と、レンズ１３２からの励起光ビームを偏向するミラー１３３と、ミラー１３３からの励起光ビームを反射して偏向するダイクロイックミラー１３４と、ダイクロイックミラー１３４からの励起光ビームをＸＹ走査するＸＹ走査機構１３５とを有している。ダイクロイックミラー１３４は、励起光を反射する一方、その励起光によって発生された蛍光を選択的に透過する特性を有している。
【００２１】
ＸＹ走査機構１３５は、これに限定されないが、例えば、光ビームを一本の軸に沿って走査し得る二つのガルバノスキャナーを組み合わせて構成されてよい。二つのガルバノミラーは好ましくはそれぞれの走査軸が互いに直交するように配置される。あるいは、音響光学変調素子（ＡＯＭ）やポリゴンミラーやホログラムスキャナーなど利用して構成されてもよい。
【００２２】
光走査系１３０はさらに、光走査系１３０から射出された励起光のビームによって発生された蛍光を収束させるレンズ１３６と、光走査系１３０から射出された励起光のビームの収束点に対して共焦点の位置関係にあるピンホール１３７と、ピンホール１３７を通過した蛍光を検出するための光検出器１３８とを有している。光検出器１３８は、これに限定されないが、例えば、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）（Avalanche Photo Diode）で構成されてよい。あるいは、光電子増倍管で構成されてもよい。
【００２３】
顕微鏡本体１１１の内部には、それぞれの光走査系１３０に対して、光走査系１３０からの励起光ビームを対物レンズ１１２に方向付けると共に、その励起光ビームによって発生された蛍光のビームをその光走査系１３０に方向付ける偏向素子１１６が設けられている。偏向素子１１６は、例えばダイクロイックミラーで構成されてよい。一番下に配置される偏向素子１１６Ｄは、選択機能が不要なため、通常のミラーで構成されてもよい。
【００２４】
試料１２１は、予め四種類の蛍光物質で標識されている。四系統の光走査系１３０は、それぞれ、それらの蛍光物質の種類に適した波長の励起光のビームを射出する。
【００２５】
蛍光物質は、これに限定されないが、例えば、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）（Rhodamine Green）とＴＭＲ（Tetramethylrhodamine）と５−Ｔａｍｒａ（5-carboxytetramethylrhodamine）とサイファイヴ（Ｃｙ５）である。蛍光物質は、これらの他に、ＦＩＴＣ（Fluorescein-isothiocyanate）やＴＯＴＯ１、Acridine-Orange、Texas-Redなどが適用されてもよい。
【００２６】
先に述べた蛍光物質に対応して、例えば、レーザー光源１３１Ａは、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）を励起するために、波長４８８ｎｍの光を発するアルゴンレーザーであり、レーザー光源１３１Ｂは、ＴＭＲを励起するために、波長５１４．５ｎｍの光を発するアルゴンレーザーであり、レーザー光源１３１Ｃは、５−Ｔａｍｒａを励起するために波長５４３．５ｎｍの光を発するＨｅ・Ｎｅレーザーであり、レーザー光源１３１Ｄは、サイファイヴ（Ｃｙ５）を励起するために、波長６３２．８ｎｍの光を発するＨｅ・Ｎｅレーザーである。
【００２７】
レーザー光源１３１から射出された励起光ビームは、ミラー１３３とダイクロイックミラー１３４で反射され、ＸＹ走査機構１３５を経て顕微鏡本体１１１の中に入り、偏向素子１１６によって対物レンズ１１２に方向付けられる。対物レンズ１１２に入射した励起光ビームは、対物レンズ１１２により、試料１２１の内部に収束される。
【００２８】
励起光ビームの収束点は、ＸＹ走査機構１３５によって、二次元的に移動され得る。また、対物レンズ１１２はＮＡ１．０程度の大きい開口数を有しており、励起光ビームの収束点の近傍に、直径０．６μｍ程度、長さ２μｍ程度の略円柱状の共焦点領域が形成される。
【００２９】
この領域内に存在する蛍光物質は、励起光により励起され、蛍光信号（フォトンパルス）を発生させる。蛍光物質から発生された蛍光の一部（信号光）は、対物レンズ１１２に入射し、偏向素子１１６に方向付けられた蛍光ビーム（蛍光信号）となる。偏向素子１１６に入射した蛍光ビームは、光走査系１３０に方向付けられる。
【００３０】
光走査系１３０に戻った蛍光ビームは、ＸＹ走査機構１３５を経て、ダイクロイックミラー１３４に入射する。前述したように、ダイクロイックミラー１３４はそれが反射した励起光によって発生された蛍光を選択的に透過する特性を有しているため、ダイクロイックミラー１３４に入射した蛍光ビームはこれを透過する。ダイクロイックミラー１３４を透過した蛍光ビームは、レンズ１３６により収束され、ピンホール１３７を通過した成分のみが光検出器１３８に入射する。光検出器１３８は、入射した光の強度を反映した電気信号を出力する。
【００３１】
図３は、図１に示される蛍光観察装置の全体構成を示している。図３に示されるように、光走査系１３０は、前述の構成に加えて、ＸＹ走査機構１３５を駆動する駆動装置１４１と、ＸＹ走査機構１３５の駆動信号に基づいて励起光ビームの収束点の位置を求める位置算出装置１４２とを有している。
【００３２】
顕微鏡観察装置１００は、レーザー走査型共焦点顕微鏡１１０と四系統の光走査系１３０に加えて、光走査系１３０の光検出器１３８から出力される電気信号を波形整形してオン・オフの二値化パルスに変換する信号処理装置１５１と、信号処理装置１５１から出力される二値化パルスに対して相関演算を行なって自己相関関数を求める相関解析装置１５２と、相関解析装置１５２で得られた自己相関関数から蛍光物質の並進拡散速度や測定領域中の蛍光分子の数の変化などを求めるためのコンピューター１２６とを有している。あるいは相関解析装置１５２を用いず、コンピューター１２６で相関演算を実施してもよい。
【００３３】
顕微鏡観察装置１００はさらに、信号処理装置１５１で得られた結果に、位置算出装置１４２からの信号をあわせて処理して、試料の二次元蛍光画像を形成すると共に、コントラスト向上や輪郭強調などの画像処理を行なう画像処理装置１５５と、画像処理装置１５５で得られた画像を表示するＴＶモニター１５６とを有している。
【００３４】
図３において、光検出器１３８で光電変換された電気信号は、信号処理装置１５１で波形整形され二値化パルス信号に変換される。二値化パルス信号は相関解析装置１５２に送られ、相関解析装置１５２において例えば自己相関関数が求められる。自己相関関数はコンピューター１２６に送られ、蛍光物質の並進拡散速度や測定領域中の蛍光分子の数の変化などの算出に利用される。
【００３５】
光検出器１３８から出力される電気信号は時系列信号となる。この場合、信号処理装置１５１でＡＤ変換し、波形整形を行ない、先と同様に二値化パルス信号に変換する。この二値化パルス信号をコンピューター１２６に導くことによって相関演算が行なわれ、自己相関関数が求められる。
【００３６】
また、対物レンズ１１２を光軸に沿って移動させることにより、励起光の収束点の位置を光軸に沿って移動させることができる。励起光の各収束位置で二次元光走査を行ない、蛍光信号を捉えることにより、三次元蛍光画像を得ることができる。
【００３７】
次に、このようにして求められる蛍光強度ゆらぎの自己相関関数に基づいて、試料の移動をリアルタイムに測定する方法について述べる。
【００３８】
１．試料１２１内に複数の測定点を定め、ＸＹ走査機構により励起光のビームの光スポットを移動させて、それらの測定点に励起光のビームの光スポットが当たるようにする。
【００３９】
２．この光スポット位置で固定し、蛍光の強度ゆらぎを測定し、自己相関関数を求める。
【００４０】
３．蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数を記憶する。
【００４１】
４．測定点を４ヶ所固定し、それぞれの測定点について、蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数を一定時間間隔を置いて繰り返し求める。
【００４２】
５．４の測定において、時間経過によって蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数に変化が生じた場合は、試料内の分子の反応や結合などによる蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数の変化なのか、試料の移動による蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数の変化なのかを見極める。
【００４３】
６．５で得られた蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数を解析することにより、試料１２１内の測定対象物の移動が確認された場合には、試料ステージ１２２と対物レンズ１１２とを相対的に移動させて、最初に定めた測定点に励起光のビームの光スポットが当たるように、試料１２１内の測定対象物の位置を調整する。
【００４４】
７．試料１２１内の測定対象物の移動と共に試料内の分子の反応や結合などが確認された場合は、測定結果をコンピューター１２６内のメモリーに記憶し、ＴＶモニターに表示する。
【００４５】
図４は、四つの光スポットａとｂとｃとｄと試料１２１内の測定対象物の位置関係の一例を示し、左側が試料の移動前を、右側が試料の移動後を示している。図４に示される例では、試料の移動前では、四つの光スポットａとｂとｃとｄは共に試料内に位置しているが、試料の移動後では、三つの光スポットａとｂとｄは試料内に位置しているが、光スポットｃは試料から外れている。
【００４６】
光スポットａはローダミン・グリーン（ＲｈＧ）を励起するためのものであり、光スポットｂはＴＭＲを励起するためのものであり、光スポットｃはタムラ（Ｔａｍｒａ）を励起するためのものであり、光スポットｄはサイファイヴ（Ｃｙ５）を励起するためのものである。
【００４７】
図５（ａ）と図５（ｂ）と図５（ｃ）と図５（ｄ）はそれぞれ、図４の左側に示される試料の移動前の四つの光スポットａとｂとｃとｄにおける蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数を示している。図６（ａ）と図６（ｂ）と図６（ｃ）と図６（ｄ）はそれぞれ、図４の右側に示される試料の移動後の四つの光スポットａとｂとｃとｄにおける蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数を示している。
【００４８】
図７（ａ）と図７（ｂ）と図７（ｃ）と図７（ｄ）はそれぞれ、図４の左側に示される試料の移動前の四つの光スポットａとｂとｃとｄにおける蛍光の強度ゆらぎの変化を示している。図８（ａ）と図８（ｂ）と図８（ｃ）と図８（ｄ）はそれぞれ、図４の右側に示される試料の移動後の四つの光スポットａとｂとｃとｄにおける蛍光の強度ゆらぎの変化を示している。
【００４９】
図４に示されるように、光スポットｃは試料の移動後に試料から外れている。このため、試料の移動後は、蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数が測定不能になり、図６（ｃ）に示されるように、蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数が得られなくなる。また、試料の移動後は、蛍光の強度ゆらぎも測定不能になり、図８（ｃ）に示されるように蛍光の強度ゆらぎはノイズ信号となっている。
【００５０】
このように、光スポットが試料から外れると、その光スポットに対応する蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数が得られなくなる。従って、それぞれの光スポットに対応する蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数に基づいて、試料が光スポットを外れたこと、すなわち、試料が移動したことが分かる。例えば、特定の光スポットに対応する蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数が得られなくなった場合には、その光スポットから試料が外れたことが分かる。
【００５１】
蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数は、試料内の分子の反応や結合などによっても変化するが、その変化は、蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数が得られなくなる程ではなく、プロファイルが変わる程度であるため、試料内の分子の反応や結合などによる変化か試料の移動による変化かは容易に判別可能である。
【００５２】
図９は、四つの光スポットａとｂとｃとｄの配置例を示している。図９に示される例では、四つの光スポットａとｂとｃとｄが共に同心円上に位置し、そのうちの二つの光スポットａとｂはＸ軸上に位置し、残りの二つの光スポットｃとｄはＹ軸上に位置している。このような、光スポットａとｂとｃとｄの配置は、試料の移動方向の判断を容易にするという利点を有する。例えば、試料が光スポットａから外れことが分かった場合、試料がおおよそ−Ｘ方向に移動したと判断してよく、試料が光スポットｄから外れことが分かった場合、試料がおおよそ＋Ｙ方向に移動したと判断してよい。
【００５３】
図１０と図１１は、本実施形態における試料の移動の検出のフローチャートを示している。ここでは測定点を四点とした場合について、また測定点と試料の移動の検出点が一致している場合について説明する。
【００５４】
工程１．まず、試料の蛍光顕微鏡画像を取得し、次に、観察視野内の試料内に四つの測定点を決める。これは、観察者が、取得した顕微鏡画像を観ながら、それぞれの光走査系１３０内のＸＹ駆動機構１３５により光スポットを所望の位置まで移動させることにより行なわれる。さらに、測定点の位置座標をコンピューター１２６内のメモリーに記憶させる。それぞれの測定点において、ＦＣＳ測定を行ない、蛍光強度ゆらぎの自己相関関数を求め、それらの値をコンピューター１２６のメモリーに記憶させる。また、これらのプロファイルを理論曲線とのカーブフィッティングにより近似的に求め、これも合わせて記憶させる。カーブフィッティングについては最小自乗法により求めても良いし、非線形最小自乗法の一つであるレーベンバーグ・マーカート（Levenberg Marquard）法を用いて最適化してもよい。（”Numerical Recipes in C”, William H. Pressら著、丹慶勝市ら訳、技術評論社、１９９４）
工程２．一定時間経過後あるいは予め設定された時間経過後に再び、全く同じ四つの測定点において、ＦＣＳ測定を行ない、蛍光強度ゆらぎの自己相関関数を求め、それらの値をコンピューター１２６内のメモリーに記憶させる。
【００５５】
工程３．四つの測定点のすべてにおいて蛍光強度ゆらぎの自己相関関数が得られた場合には、それらを記憶する。それらのプロファイルをカーブフィッティングにより近似的に求め、コンピューターにより工程１で記憶した測定結果と照合して変化があるか調べる。照合の結果、四つの蛍光強度ゆらぎの自己相関関数のいずれにも変化がない場合には、試料の移動はなく、状態変化もないと判断する。一方、四つの測定点における蛍光強度ゆらぎの自己相関関数のいずれかに変化がある場合には、試料の移動はないが、状態変化はあると判断し、その結果をコンピューター１２６内のメモリーに記憶させると共にＴＶモニター上に表示させる。
【００５６】
工程４．また、四つの測定点のいずれかにおいて蛍光強度ゆらぎの自己相関関数が得られない場合には、試料が移動したと判断し、測定点をすべて同時に二次元的あるいは三次元的に移動させ、工程１で記憶した測定結果と照合し、比較演算しながら差分が最小になる位置を求め、その位置に配置する。測定点の移動は、試料ステージコントローラー１２５により試料ステージ１２２を移動させることにより、さらに必要であれば、対物レンズ１１２を光軸に沿って移動させることにより行なう。
【００５７】
以下、蛍光強度ゆらぎの自己相関関数について説明する。
【００５８】
光検出器で受光される蛍光物質からの蛍光強度ゆらぎの自己相関関数Ｒ（τ）は次式で表される。
【数１】
2006292420.tif 000003
【００５９】
ただし、Ｉは光検出器で受光される蛍光物質からの蛍光の強度、ｔは時間、τは相関時間である。＜＞はアンサンブル平均を表わす。
【００６０】
蛍光強度ゆらぎの自己相関関数を規格化すると、次のようになる。
【数２】
2006292420.tif 000004
【００６１】
【数３】
2006292420.tif 000005
【００６２】
ただし、Ｇ（τ）は規格化した蛍光強度ゆらぎの自己相関関数、Ｎは共焦点領域内に存在する平均粒子数である。共焦点領域内に存在する粒子の存在はポアソン分布に従うと仮定している。
【００６３】
入射光がガウス分布を有する光（アルゴンレーザーやヘリウムネオンレーザーなど）であるとすると、光強度ゆらぎの自己相関関数Ｇ（τ）は次のようになる。
【数４】
2006292420.tif 000006
【００６４】
ただし、Ｄは蛍光分子の並進拡散係数、ω1は共焦点領域を円柱と近似したときの高さの１／２、ω2は半径である。
【００６５】
このとき、τＤを蛍光物質の分子の拡散時間とすると、次のようになる。
【数５】
2006292420.tif 000007
【００６６】
測定により、蛍光強度ゆらぎの自己相関関数が得られれば、これらのプロファイルをカーブフィッティングして、共焦点領域内に存在する平均粒子数（Ｎ）や蛍光分子の拡散時間（τＤ）を求めて、これらの時間経過を各測定点でモニターすればよい。
【００６７】
観測の時間経過と共に、試料のいずれかの測定点で各種の生物学的な反応や状態変化が生じた場合は、その測定点について蛍光強度ゆらぎの自己相関関数のプロファイルが変化する。このプロファイルの変化から拡散時間の変化、蛍光分子の観測領域内での平均存在数の変化などを求めることができる。蛍光強度ゆらぎの自己相関関数のプロファイルの変化を調べるには自己相関関数を規格化し、すなわち、蛍光強度ゆらぎの自己相関関数を蛍光強度ゆらぎの時間平均値の二乗で割って、カーブフィッティングを行なって拡散時間、及びＹ軸切片（自己相関関数がｙ軸と交差する点のｙ軸座標）を求める。なお、蛍光強度ゆらぎの自己相関関数のＹ軸切片の値は（３）式から分かるように、共焦点領域内に存在する平均の蛍光分子の数に対応する。
【００６８】
試料の移動のみが起きた場合は、複数の試料内測定点で得られた蛍光強度ゆらぎの自己相関関数のプロファイルは基本的には変化しないか、または試料の移動が大きい場合は蛍光強度ゆらぎの自己相関関数そのものを得ることが不可能になるので、この変化を捉えることができる。
【００６９】
一方、試料内の複数の測定点で時間経過と共に生物学的な反応や状態変化が起こった場合は、必ず自己相関関数のプロファイルが変化する。従って、これを捉えることができる。
【００７０】
試料内の複数の測定点で、時間経過と共に生物学的な反応や状態変化が起き、かつ試料の移動も同時に起こった場合は、試料内の生物学的な反応や状態変化が起きた箇所で蛍光強度ゆらぎの自己相関関数のプロファイルに変化が生じ、試料の移動が起きた箇所では蛍光強度ゆらぎの自己相関関数のプロファイルは基本的には変化しない。これに試料の移動が伴う場合は蛍光強度ゆらぎの自己相関関数の測定をさらに何回かデータを蓄積して試料の移動量と方向を検出する。実際に複数箇所で測定を実施しているので、試料内の複数の測定点で、時間経過と共に生物学的な反応や状態変化が起き、かつ試料の移動や変形も同時に起こった場合でも、これを捉えることができる。この場合は、測定点ができるだけ多いことが望ましい。
【００７１】
なお、測定点をさらに増やして同様に測定することにより、試料の変形についても測定可能となる。
【００７２】
また蛍光の強度ゆらぎの変化、例えば蛍光の強度ゆらぎの時間平均値と分散に着目し、これらの値の測定点すべてについての初期値と一定時間経過後の値を求め、これらを比較することにより、試料の移動と方向を推定することも可能である。さらに、この推定結果に基づいて試料ステージを必要量移動させればよい。
【００７３】
今回は測定点と試料の移動の検出点が一致している場合について説明したが、測定点と試料の移動の検出点が必ずしも一致していなくてもよい。この場合は、試料内の四つの測定点において測定値を取得する際に、試料の生物学的な反応や状態変化の測定と、試料そのものの移動を把握するための測定を時間的なラグを与えて実施し、それぞれの測定結果をコンピューター１２６内のメモリーに記憶させると共にＴＶモニター上に蛍光画像を表示すればよい。
【００７４】
これまでの説明から分かるように、本実施形態においては、試料追尾のためのビデオカメラやメモリーを必要とすることなく、標本試料の自動追尾機能を有する顕微鏡観察装置が得られる。
【００７５】
第二実施形態
本実施形態は、レーザー走査型共焦点顕微鏡を利用して蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう顕微鏡観察装置に向けられている。より詳しくは、三つの測定点における蛍光強度ゆらぎの相互相関関数を利用する試料自動追尾機能を有する顕微鏡観察装置に向けられている。
【００７６】
本実施形態の顕微鏡観察装置も、基本的には、第一実施形態と同様の構成（つまり図１に示される構成）を有している。
【００７７】
図１２は、本発明の第二実施形態における試料自動追尾機能を有する顕微鏡観察装置の全体構成を示している。
【００７８】
図１２に示されるように、本実施形態の顕微鏡観察装置２００は、レーザー走査型共焦点顕微鏡１１０を含んでいる。レーザー走査型共焦点顕微鏡１１０は、顕微鏡本体１１１と、試料１２１が載せられる試料ステージ１２２と、試料ステージ１２２の下方に配置された対物レンズ１１２とを有している。
【００７９】
顕微鏡観察装置２００はさらに、蛍光を発生させるための励起光のビームをレーザー走査型共焦点顕微鏡１１０に供給する三系統の光走査系２３０Ａと２３０Ｂと２３０Ｃとを有している。三系統の光走査系２３０Ａ〜２３０Ｃは共に同様の構成を有している。以下の説明において、それらを区別する必要がない場合には、参照符号の末尾の英字を省略して単に光走査系２３０と記す。これに伴い、光走査系を構成している部材についても参照符号の末尾の英字を省略して記す。
【００８０】
光走査系２３０は、第一の励起光のビームを射出する第一のレーザー光源２３１と、第二の励起光のビームを射出する第二のレーザー光源２３２と、第一のレーザー光源２３１からの励起光ビームを偏向するミラー２３３と、ミラー２３３からの励起光ビームを反射して偏向するダイクロイックミラー２３４と、第二のレーザー光源２３２からの励起光ビームを偏向するミラー２３５と、ミラー２３５からの励起光ビームを反射して偏向するダイクロイックミラー２３６と、第一の励起光ビームと第二の励起光ビームを共にＸＹ走査するＸＹ走査機構２３７とを有している。
【００８１】
ダイクロイックミラー２３４は、第一の励起光を反射する一方、第一の励起光によって発生された蛍光を選択的に透過する特性を有している。また、ダイクロイックミラー２３６は、第二の励起光を反射する一方、第一の励起光と第一の励起光によって発生された蛍光と第二の励起光によって発生された蛍光とを透過する特性を有している。
【００８２】
ＸＹ走査機構２３７は、第一実施形態と同様に、例えば、光ビームを一本の軸に沿って走査し得る二つのガルバノスキャナーを組み合わせて構成されてよい。二つのガルバノミラーは好ましくはそれぞれの走査軸が互いに直交するように配置される。あるいは、音響光学変調素子（ＡＯＭ）やポリゴンミラーやホログラムスキャナーなど利用して構成されてもよい。
【００８３】
光走査系２３０はさらに、第一の励起光によって発生された第一の蛍光を検出するための第一の光検出器２３８と、第二の励起光によって発生された第二の蛍光を検出するための第二の光検出器２３９と、第一の蛍光を透過し第二の蛍光を反射して第一の蛍光と第二の蛍光とを分離する分離素子２４０と、分離素子２４０で反射された第二の蛍光を反射するミラー２４１とを有している。
【００８４】
図示されていないが、第一の光検出器２３８の手前には、第一の励起光のビームの収束点に対して共焦点の位置関係にあるピンホールが配置され、第二の光検出器２３９の手前には、第二の励起光のビームの収束点に対して共焦点の位置関係にあるピンホールが配置されている。
【００８５】
光検出器２３８と光検出器２３９は、第一実施形態と同様に、例えば、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）（Avalanche Photo Diode）で構成されてよい。あるいは、光電子増倍管で構成されてもよい。
【００８６】
光走査系２３０はさらに、ＸＹ走査機構２３７を駆動する駆動装置２４２と、ＸＹ走査機構２３７の駆動信号に基づいて励起光ビームの収束点の位置を求める角度検出装置２４３とを有している。
【００８７】
顕微鏡本体１１１の内部には、それぞれの光走査系２３０に対して、光走査系２３０からの励起光ビームを対物レンズ１１２に方向付けると共に、その励起光ビームによって発生された蛍光のビームをその光走査系２３０に方向付ける偏向素子２１６が設けられている。
【００８８】
顕微鏡観察装置２００はさらに、光走査系２３０の光検出器２３８と光検出器２３９から出力される電気信号を波形整形してオン・オフの二値化パルスに変換する信号処理装置２５１と、信号処理装置２５１から出力される二値化パルスに対して相関演算を行なって、蛍光強度ゆらぎの相互相関関数を求めるための相関解析装置２５２とコンピューター１２６とを有している。
【００８９】
顕微鏡観察装置２００はさらに、信号処理装置２５１で得られた結果に、角度検出装置２４３からの信号をあわせて処理して、試料の二次元蛍光画像を形成すると共に、コントラスト向上や輪郭強調などの画像処理を行なう画像処理装置２５５と、画像処理装置２５５で得られた画像を表示するＴＶモニター２５６とを有している。
【００９０】
試料１２１は、予め二種類の蛍光物質で標識されている。蛍光物質は、これに限定されないが、例えば、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）（Rhodamine Green）とサイファイヴ（Ｃｙ５）である。これに対応して、例えば、レーザー光源２３１は、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）を励起するために、波長４８８ｎｍの光を発するアルゴンレーザーであり、レーザー光源２３２は、サイファイヴ（Ｃｙ５）を励起するために、波長６３２．８ｎｍの光を発するＨｅ・Ｎｅレーザーである。
【００９１】
第一のレーザー光源２３１から射出された第一の励起光ビームは、ミラー２３３とダイクロイックミラー２３４で反射され、ダイクロイックミラー２３６を透過し、ＸＹ走査機構２３７を経て顕微鏡本体１１１の中に入る。また、第二のレーザー光源２３２から射出された第二の励起光ビームは、ミラー２３５とダイクロイックミラー２３６で反射され、ＸＹ走査機構２３７を経て顕微鏡本体１１１の中に入る。顕微鏡本体１１１に入った第一と第二の励起光ビームは、偏向素子２１６によって対物レンズ１１２に方向付けられる。対物レンズ１１２に入射した第一と第二の励起光ビームは、対物レンズ１１２により、試料１２１の内部に収束される。
【００９２】
第一と第二の励起光ビームの収束点は、ＸＹ走査機構２３７によって、二次元的に移動され得る。また、対物レンズ１１２はＮＡ１．０程度の大きい開口数を有しており、第一と第二の励起光ビームの収束点の近傍に、直径０．６μｍ程度、長さ２μｍ程度の略円柱状の共焦点領域が形成される。
【００９３】
それぞれの励起光ビームの収束点はＸＹ走査機構２３７を停止させることによって被検物質内の測定点に決められる。そして再びＸＹ走査機構２３７の電源を入れて動作させることによって励起光ビームが二次元走査される。再び所望の位置でＸＹ走査機構２３７の電源を切ることによって励起光ビームの収束点は被検物質内の異なる位置に一義的に決められる。この動作を繰り返し実施することにより収束点すなわち測定点を順次移動させることができる。
【００９４】
この領域内に存在する二種類の蛍光物質は、それぞれ、対応する励起光により励起され、蛍光信号（フォトンパルス）を発生させる。二種類の蛍光物質から発生された蛍光の一部（信号光）は、それぞれ、対物レンズ１１２に入射し、偏向素子２１６に方向付けられた第一の蛍光ビームと第二の蛍光ビームとなる。偏向素子２１６に入射した第一の蛍光ビームと第二の蛍光ビームは共に、光走査系２３０に方向付けられる。
【００９５】
光走査系２３０に戻った第一の蛍光ビームと第二の蛍光ビームは、ＸＹ走査機構２３７を経て、ダイクロイックミラー２３６とダイクロイックミラー２３４を透過し、分離素子２４０によって分離される。分離素子２４０を透過した第一の蛍光ビームは、図示しないピンホールを通過した成分のみが第一の光検出器２３８に入射する。分離素子２４０で反射された第二の蛍光ビームは、ミラー２４１を経て、図示しないピンホールを通過した成分のみが第二の光検出器２３９に入射する。光検出器２３８と光検出器２３９は、それぞれ、入射した光の強度を反映した電気信号を出力する。
【００９６】
光検出器２３８と光検出器２３９から出力される電気信号は、信号処理装置１５１で波形整形され二値化パルス信号に変換される。画像処理装置２５５は、二値化パルス信号に、角度検出装置２４３からの信号をあわせて処理して、試料の二次元蛍光画像または三次元蛍光画像を形成する。画像処理装置２５５はさらに、コントラスト向上や輪郭強調などの画像処理を行なう。その顕微鏡画像は、ＴＶモニター２５６に表示される。
【００９７】
信号処理装置１５１からの二値化パルス信号はまた、信号処理装置２５１を相関解析装置２５２を経てコンピューターに入力され、蛍光強度ゆらぎの相互相関関数が求められる。
【００９８】
本実施形態の顕微鏡観察装置２００においては、蛍光画像を観察しながら、蛍光強度ゆらぎの相互相関関数を求めることができると共に、試料の移動を測定することができる。
【００９９】
試料の移動を測定し、測定値に基づいて試料ステージを移動させる方法についても、第一実施形態と同様にして行なうことができる。以下、試料の測定点と試料の移動の測定点が一致している場合について説明する。
【０１００】
測定観測の時間経過と共に、試料のいずれかの測定点で対象となる二種類の蛍光物質で標識されたタンパク質などの分子が生物学的な反応などのために結合した割合が変化した場合は、その測定点について蛍光強度ゆらぎの相互相関関数のプロファイルが変化する。このプロファイルの変化から対象となる二種類の分子の結合体の観測領域内での平均存在数の変化などを求めることができる。
【０１０１】
蛍光強度ゆらぎの相互相関関数のプロファイルの変化を調べるには相互相関関数を規格化し、すなわち、蛍光強度ゆらぎの相互相関関数をそれぞれの光検出器で受光された蛍光強度ゆらぎの時間平均値の積で割って、カーブフィッティングを行ない、Ｙ軸切片の値を求める。すなわち、（６）式を用いて二種類の分子の結合体の数が得られる。
【数６】
2006292420.tif 000008
【０１０２】
ただし、ＮABは二種類の分子の結合体の数、ＧAB（０）は二種類の分子の結合体による蛍光強度ゆらぎの相互相関関数のＹ軸切片の値、ＧA（０）は蛍光物質Ａによる蛍光強度ゆらぎの自己相関関数のＹ軸切片の値、ＧB（０）は蛍光物質Ｂによる蛍光強度ゆらぎの自己相関関数のＹ軸切片の値である。
【０１０３】
本実施形態は、測定点の数を三つであるが、測定点の数は、これに限定されるものではなく、四つ以上であってよい。測定点の数が多いほど、測定精度は向上する。
【０１０４】
また、本実施形態においては、試料の移動量、移動方向についても、ガルバノスキャナーの回動角を回転角度センサー、例えばエンコーダーなどを用いて測定することにより、求めることができる。従って、リアルタイムで試料内複数の観察箇所の状態変化や生物学的な反応を捉えることができると共に、試料そのもの移動量、移動方向も同時に知ることができる。
【０１０５】
試料の移動のみが起きた場合は、複数の試料内測定点で得られた蛍光強度ゆらぎの相互相関関数のプロファイルは基本的には変化しないか、または試料の移動が大きい場合は蛍光強度ゆらぎの相互相関関数そのものを得ることが不可能になるので、この変化を捉えることができる。
【０１０６】
一方、試料内の複数の測定点で時間経過と共に二種類の蛍光物質で標識された結合体の数に変化が起こった場合は、必ず相互相関関数のプロファイルが変化する。従って、これを捉えることができる。
【０１０７】
試料内の複数の測定点で、時間経過と共に二種類の蛍光物質で標識された結合体の数に変化が起き、かつ試料の移動も同時に起こった場合は、試料内の二種類の蛍光物質で標識された結合体の数に変化が起きた箇所で蛍光強度ゆらぎの相互相関関数のプロファイルに変化が生じ、試料の移動が起きた箇所では蛍光強度ゆらぎの相互相関関数のプロファイルは基本的には変化しない。これに試料の移動が伴う場合は蛍光強度ゆらぎの相互相関関数の測定をさらに何回かデータを蓄積して試料の移動量と方向を検出する。実際に複数箇所で測定を実施しているので、試料内の複数の測定点で、時間経過と共に二種類の蛍光物質で標識された結合体の数に変化が起き、かつ試料の移動や変形も同時に起こった場合でも、これを捉えることができる。この場合は、測定点ができるだけ多いことが望ましい。
【０１０８】
測定点と試料の移動の検出点が一致していない場合は、試料内の三つの測定点において測定値を取得する際に、試料内の二種類の蛍光物質で標識された結合体の数の変化の測定と、試料そのものの移動や変形を把握するための測定を時間的なラグを与えて実施し、それぞれの測定結果をコンピューター１２６内のメモリー上に記憶させると共にＴＶモニター上に蛍光画像を表示する。
【０１０９】
なお、蛍光強度ゆらぎの相互相関関数の測定においては、同時に蛍光強度ゆらぎの自己相関関数も得られるので、蛍光強度ゆらぎの相互相関関数、自己相関関数双方のデータを基に試料の移動を測定してもよい。
【０１１０】
これまでの説明から分かるように、本実施形態においては、試料追尾のためのビデオカメラやメモリーを必要とすることなく、標本試料の自動追尾機能を有する顕微鏡観察装置が得られる。
【０１１１】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施の形態を述べたが、本発明は、これらの実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】本発明の第一実施形態における試料自動追尾機能を有する顕微鏡観察装置の基本構成を概略的に示している。
【図２】図１に示される顕微鏡観察装置の光走査系の全体構成を示している。
【図３】図１に示される蛍光観察装置の全体構成を示している。
【図４】四つの光スポットと試料の位置関係の一例を示し、左側が試料の移動前と右側が試料の移動後を示している。
【図５】図４の左側に示される試料の移動前の四つの光スポットにおける蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数を示している。
【図６】図４の右側に示される試料の移動後の四つの光スポットにおける蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数を示している。
【図７】図４の左側に示される試料の移動前の四つの光スポットにおける蛍光の強度ゆらぎの変化を示している。
【図８】図４の右側に示される試料の移動後の四つの光スポットにおける蛍光の強度ゆらぎの変化を示している。
【図９】四つの光スポットの配置例を示している。
【図１０】本実施形態における試料の移動の検出のフローチャートの前半部を示している。
【図１１】本実施形態における試料の移動の検出のフローチャートの後半部を示している。
【図１２】本発明の第二実施形態における試料自動追尾機能を有する顕微鏡観察装置の全体構成を示している。
【符号の説明】
【０１１３】
１００…顕微鏡観察装置、１１０…レーザー走査型共焦点顕微鏡、１１１…顕微鏡本体、１１２…対物レンズ、１１６…偏向素子、１２２…試料ステージ、１２３…ステッピングモーター、１２５…試料ステージコントローラー、１２６…コンピューター、１３０…光走査系、１３１…レーザー光源、１３５…ＸＹ走査機構、１３７…ピンホール、１３８…光検出器、１４１…駆動装置、１４２…位置算出装置、１５１…信号処理装置、１５２…相関解析装置、２００…顕微鏡観察装置、２１６…偏向素子、２３０Ａ…光走査系、２３０Ａ〜２３０Ｃ…光走査系、２３０…光走査系、２３１Ａ…レーザー光源、２３１…一のレーザー光源、２３１…レーザー光源、２３２Ａ…レーザー光源、２３２…レーザー光源、２３３…ミラー、２３４…ダイクロイックミラー、２３５…ミラー、２３６…ダイクロイックミラー、２３７…ＸＹ走査機構、２３８…光検出器、２３９…光検出器、２４０…分離素子、２４２…駆動装置、２４３…角度検出装置、２５１…信号処理装置、２５２…相関解析装置。
【図１】
2006292420.tif 000009
【図２】
2006292420.tif 000010
【図３】
2006292420.tif 000011
【図４】
2006292420.tif 000012
【図５】
2006292420.tif 000013
【図６】
2006292420.tif 000014
【図７】
2006292420.tif 000015
【図８】
2006292420.tif 000016
【図９】
2006292420.tif 000017
【図１０】
2006292420.tif 000018
【図１１】
2006292420.tif 000019
【図１２】
2006292420.tif 000020