(57)【要約】【課題】  ステントグラフトや人工関節、義歯床等の医療用具に利用されるバイオマテリアルである生体用金属に対して、生体に対しての毒性の有無（生体適合性）を、効率よく評価することができ、優れた生体適合性を有する生体用金属の開発に貢献することができる、生体用金属の生体適合性評価方法を提供する。【解決手段】  生体用金属の生体適合性評価方法であって、少なくとも、＜１＞生体用金属と血清とをインキュベーションする工程、＜２＞上清である血清を回収し、この血清に含まれる酵素の活性変化を分析する工程、および、＜３＞酵素活性変化の分析結果から、生体用金属による酵素活性の抑制度合いを計測する工程を含むことを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体用金属の生体適合性評価方法であって、少なくとも以下の工程：
＜１＞生体用金属と血清とをインキュベーションする工程；
＜２＞上清である血清を回収し、この血清に含まれる酵素の活性変化を分析する工程；および
＜３＞酵素活性変化の分析結果から、生体用金属による酵素活性の抑制度合いを計測する工程；
を含むことを特徴とする生体用金属の生体適合性評価方法。
【請求項２】
第２工程である酵素活性変化の分析は、少なくとも酵素の総活性および酵素のアイソザイムパターンのいずれかの分析が行われることを特徴とする請求項１の生体用金属の生体適合性評価方法。
【請求項３】
酵素は、乳酸脱水素酵素（Lactate Dehydrogenase；LDH）であることを特徴とする請求項１または２の生体用金属の生体適合性評価方法。
【請求項４】
血清は、自家血清であることを特徴とする請求項１から３いずれかの生体用金属の生体適合性評価方法。
【請求項５】
インキュベーションの条件は、温度条件が35℃から40℃の範囲であり、時間条件が15分から25分の範囲であることを特徴とする請求項１から４いずれかの生体用金属の生体適合性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、生体用金属の生体適合性評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、人工関節、人工血管の一種であるステントグラフト、義歯床等に利用される素材、つまり、生体用素材（バイオマテリアル）として、高分子材料、セラミクス材料、合金を含む金属材料およびこれらの複合材料等が利用されており、特に金属材料は、その材質の特性、つまり、耐食性や機械的特性から広く利用されている。この金属材料としては、たとえば、ステンレス鋼、チタニウムやチタニウム合金、コバルト（Co）-クロム（Cr）合金、コバルト（Co）-クロム（Cr）-モリブテン（Mo）合金、白金、金および金合金、銀合金等が挙げられる（以下、生体用金属とする）。
【０００３】
ところで、上記ステントグラフトは、ステントといわれるバネ状の金属を取付けた人工血管の一種である（たとえば、特許文献１参照）。これを圧縮して細いカテーテルの中に収納して、使用する。具体的には、たとえば、血栓のある血管部位まで収納状態にあるステントグラフトをカテーテルで運び、収納してあったステントグラフトを放出することで、ステント拡張させ、ステントの金属バネの力と患者自身の血圧によって広がって血管内壁に貼り付けられて自然に固定され、体内に留置させることができる。このため、このステントグラフトによる治療では、外科的手術による侵襲性を抑えることができ、患者の身体にかかる負担を極めて少なくすることができる、血栓（特に動脈瘤）等の治療において極めて有用な手段である。
【０００４】
ステントグラフト等の医療用具は、多くの場合、長期間に亘って体内に留置されるため、生体に対する毒性の有無、つまり、「適合性」が極めて重要になる。たとえば、ステントグラフトの多くは、上記のとおり、合金を含む金属、特に、生体適合性を有する生体用金属から構成されており、その主な素材は、ステンレス鋼とニチノールであるが、アレルギーの誘発因子となるニッケル（Ni）を含んでいる点や、耐磨耗性の点で問題になっている。近年では、Co-Cr合金やCo-Cr-Mo合金は、ステンレス鋼よりも、さらに、生体に対する毒性の少ない生体適合性、耐食性および機械的特性に優れており、問題となっているNiをほとんど含んでいないことから、特に血管に挿入、留置するステントグラフトを構成する生体用金属として、注目されている。
【０００５】
ただ、上記のような、毒性が少ないといわれている高い生体適合性を有するCo-Cr合金やCo-Cr-Mo合金でさえ、依然として生体に対する毒性を有している。たとえば、ステントの場合には、ステント自身が引き起こす血管障害、つまり、ステント表面に血清タンパク質複合体が形成され、血栓の生成等を誘導して、再狭窄を惹起することがある。これは、上記いずれの生体用金属もが有する共通の問題である。
【０００６】
現在、血清タンパク質複合体（血栓）が形成されることを防止することはもちろん、毒性の無い（あるいは、極めて少ない）、優れた生体適合性を有する生体用金属を開発するため、研究が進められているが、上記のようにステントグラフトをはじめとする、人工関節や義歯床等に利用される生体用金属が有する、金属の生体に対しての毒性の有無（生体適合性）を、効率のよく評価する方法が存在しないのが実状である。
【０００７】
このような問題を解決するため、たとえば、JIS規格では株化細胞を用いた培養毒性検査が行われている。この検査では、試料金属板上で細胞を培養して増殖抑制の有無を調べる方法と金属溶出液を培養系に添加して評価する方法が、一般的に知られている。また、高い検出感度を実現するために、遺伝子工学的な手法で作成した特殊な細胞を用いて、生体に対する環境有害化学物質を検出し、評価する方法が提案されている（特許文献２参照）。
【０００８】
しかしながら、上記のような、金属溶出液を培養系に添加して評価する方法では、高度に専門的な技術と多大の時間と経費を必要とするという問題があった。また、上記のような特許文献２記載の評価方法では、使用する細胞は遺伝子操作を行う必要があり、極めて高度な技術等を必要とすることや、検査・評価には時間がかかる等の問題があるという問題があった。したがって、優れた生体適合性を有する生体用金属の研究開発の現場では、新しく創出した多くの金属素材について、迅速かつ簡単に生体適合性を推測・評価できる技術が必要であることを考慮すると、依然として、金属の生体に対しての毒性の有無（生体適合性）を、効率よく評価することは困難であり、結果的に優れた生体適合性を有する生体用金属の研究開発の進展において、弊害となっている。
【特許文献１】米国特許第5891191号公報
【特許文献２】特開2003-79365号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本願発明は、以上のとおりの背景から、従来の問題点を解決すべく、ステントグラフトや人工関節、義歯床等の医療用具に利用されるバイオマテリアルである生体用金属に対して、生体に対しての毒性の有無（生体適合性）を、効率のよく評価することができ、優れた生体適合性を有する生体用金属の開発に貢献し得る、新しい生体用金属の生体適合性評価方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明は、前記の課題を解決するものとして、第１には、生体用金属の生体適合性評価方法であって、少なくとも以下の工程：
＜１＞生体用金属と血清とをインキュベーションする工程；
＜２＞上清である血清を回収し、この血清に含まれる酵素の活性変化を分析する工程；および
＜３＞酵素活性変化の分析結果から、生体用金属による酵素活性の抑制度合いを計測する工程；
を含むことを特徴とする。
【００１１】
また、本願発明は、第２には、第２工程である酵素活性変化の分析では、少なくとも酵素の総活性および酵素のアイソザイムパターンのいずれかの分析が行われることを特徴とし、第３には、酵素は、乳酸脱水素酵素（Lactate Dehydrogenase；LDH）であることを特徴とする。
【００１２】
さらに、第４には、血清は、自家血清であることを特徴とし、そして、第５には、インキュベーションの条件は、温度条件が35℃から40℃の範囲であり、時間条件が15分から25分の範囲であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本願第１の発明によれば、ステントグラフトや人工関節、義歯床等の医療用具に利用されるバイオマテリアルである生体用金属に対して、生体に対しての毒性の有無（生体適合性）を、効率のよく評価することができ、優れた生体適合性を有する生体用金属の開発に貢献することができる。
【００１４】
第２から第５の発明によれば、上記第１の発明の効果に加え、さらに効率のよく、生体に対しての毒性の有無（生体適合性）を効率のよく評価することができる。特に、第４の発明によれば、生体用金属の使用対象となる本人にとって相性のよい生体用金属を見出すことに貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本願発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。
【００１６】
一般的に、タンパク質は金属に触れると立体構造の変化（コンフォメーション変化）を起こし、このコンフォメーション変化がタンパク質の生理的機能や生物活性に影響を与えるが、この影響を従来の吸収スペクトルの変化だけからで判定するのは困難であるが、本願発明は、発明者の鋭意研究によって明らかになった、[１]血清タンパク質が生体用金属の材料に接触すると、吸収スペクトルの特異的な波長領域が変化をすること、および、その変化の様式は金属の種類により異なること、さらに、[２]金属（生体用金属）との接触により引き起こされる血清タンパク質の立体構造変化が、酵素活性の変化をも引き起こすこと、に基づいている。
【００１７】
その結果、本願発明は、バイオマテリアルとして、たとえば、ステントグラフトや人工関節、義歯床等に利用される生体用金属が有する毒性の有無、つまり生体適合性を、効率よく評価する方法であって、血清タンパク質複合体（血栓）の形成をはじめとする種々の生体に対する毒性の無いあるいは極めて少ない、優れた生体適合性を有する生体用金属の開発に貢献することができる。
【００１８】
その具体的な評価方法として説明すると、少なくとも以下の工程：
＜１＞生体用金属と血清とをインキュベーションする工程；
＜２＞上清である血清を回収し、この血清に含まれる酵素の活性変化を分析する工程；および
＜３＞酵素活性変化の分析結果から、生体用金属による酵素活性の抑制度合いを計測する工程；
を含むことを特徴としている。
【００１９】
このとき、第１工程の実施前に前処理として、たとえば、生体用金属を高温熱処理してもよい。なお、生体用金属によって、高温熱処理における温度や雰囲気は適宜に選択、設定することができる。たとえば、生体用金属がCo-Cr-Mo合金の場合は、アルゴン雰囲気下で、温度1230℃前後で高温熱処理を行う。さらに、生体用金属の表面を鏡面仕上げにするため研磨処理してもよいし、またさらに、アセトンやエタノール、蒸留水等それぞれを用いて超音波等による洗浄をしてもよい。
【００２０】
また、本願発明において、第２工程である酵素活性変化の分析において、少なくとも酵素の総活性および酵素のアイソザイムパターンのいずれかの分析が行われることで、より精度よく酵素活性の抑制度合いを計測できるため、生体用金属の生体適合性をさらに効率よく評価でき、好ましい。
【００２１】
この酵素の活性変化を分析する手段としては、種々の公知の分析手段が利用できるが、中でも、酵素の総活性の分析には、たとえば、酵素染色用試薬を利用して、マイクロプレートリーダー（吸光度測定）、蛍光プレートリーダー、トップカウント（発光測定）等によって分析することができ、また、アイソザイムパターンの分析には、たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）である、SDS-PAGEによるタンパク質の分離(Laemmli法)やNative-PAGEによるタンパク質の分離(Davis法)等によりアイソザイムを分離し、ゲル中の酵素を活性染色等で発色操作を行って検出することで、アイソザイムパターンを分析することができる。さらに、各アイソザイムの濃度も測定することで、生体用金属の生体適合性の評価精度を上げることができ、その測定手段としては、たとえば、単色光のビームで走査し、可視光または紫外光の吸収、あるいは、紫外光照射で発する蛍光を測定するデンシトメトリー等が利用できる。なお、吸光の測定は、透過光または反射光のいずれかである。
【００２２】
なお、生体用金属の生体適合性の評価精度を高めるため、たとえば、紫外部吸収差スペクトル法等で、紫外吸収スペクトルを分光光度計で測定して、血清タンパク質の構造変化を分析してもよい。また、血清中における、生体用金属から溶出するイオン濃度を測定する場合には、その測定手段は特に限定されるものではない。たとえば、物質中の成分をプラズマ発光させ、分光することによって含まれる元素を高感度・高精度で定性・定量分析できる、ICP発光分光分析（Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Specryometry）が挙げられる。
【００２３】
本願発明における、その活性を分析する対象とする酵素は、基本的に、生体で広範囲に発現しているものであれば、特に限定されるものではない。たとえば、乳酸脱水素酵素（Lactate Dehydrogenase；LDH）等の代謝系酵素や、β-アクチン、アルカリフォスファターゼ（alkaline phosphatase；ALP）等が挙げられるが、本願発明においてはLDHであることが好ましい。
【００２４】
そして、このLDHは、LDH1、LDH2、LDH3、LDH4およびLDH5の5種類のアイソザイムからなることから、LDHの活性を分析対象とする場合、上記酵素活性変化の分析において、総活性の測定とともに、アイソザイムパターンの分析を行うことがさらに好ましい。
【００２５】
本願発明の評価方法の対象となり得る生体用金属は、その素材の種類は特に限定されるものではなく、たとえば、ステンレス鋼、チタニウムやチタニウム合金、コバルト（Co）-クロム（Cr）合金、コバルト（Co）-クロム（Cr）-モリブテン（Mo）合金、白金、金および金合金、銀合金等、また、これらを含有する複合素材が挙げられる。
【００２６】
そして、これら生体用金属を用いて、上記のとおり、バイオマテリアルとして、たとえば、ステントグラフトや人工関節、義歯床等の医療用具を構成することができる。
【００２７】
本願発明の評価方法における血清は、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、サル等の各動物を由来とする血清を使用することができ、特に限定されるものではない。また、ヒト由来の血清を使用する場合、他人を由来とする血清である他家血清、あるいは、生体用金属からなる医療用具の使用対象である患者本人を由来とする血清、つまり、自家血清が使用できるが、上記のとおり、患者本人と相性のよい生体用金属を見出すという観点から、自家血清であることが好ましい。
【００２８】
本願発明の評価方法における工程の一つであるインキュベーションは、主として、生体用金属と血清（特に、血清に含まれる成分の一種であるタンパク質）とを反応させ、血清タンパク質複合体（血栓に相当）を形成させることを図るものである。このインキュベーションの条件である温度と時間については、生体の環境条件に近似させることを考慮すると、インキュベーションの温度条件は35℃から40℃の範囲であり、かつ、インキュベーションの時間条件は15分から25分の範囲であることが好ましい。さらに、インキュベーション温度については、生体、特にヒトの平均体温を考慮すると、37℃±1℃程度（つまり、36℃から38℃の範囲）であることがさらに好ましく、また、インキュベーション時間については、血清タンパク質の立体構造が変わるときの変曲点を考慮すると、20分±2分程度（つまり、18分から22分の範囲）であることがさらに好ましい。
【００２９】
なお、本願発明の評価方法は、生体に対して毒性の無い、「優れた生体適合性を有する生体用金属」の研究開発に貢献するものであるから、上記インキュベーションを行っても、当然ながら、開発された生体用金属によっては、血清タンパク質複合体（血栓）の形成をはじめとする、生体にとって不都合な現象（有毒性）がない場合もある。
【００３０】
以下に、実施例として血清タンパク質と金属材料との反応を評価し、さらに詳しく本願発明の生体用金属の生体適合性評価方法について説明する。もちろん、以下の例によって本願発明が限定されることはない。
【実施例】
【００３１】
１．金属材料および試薬
（１）金属固体としては、Co-Cr-Mo合金および純Tiを用いたが、特にCo-Cr-Mo合金は、Co-29Cr-6Mo（wt%）合金を用いた。また、金属イオンとしては、Co、Cr、MoおよびTiの標準液（NAKARAI TESQUE製）を用いた。
（２）血清タンパク質としては、はウシ由来の血清タンパク質（CHM製）を使用した。
（３）乳酸脱水素酵素（LDH）活性の測定に使用した試薬は、臨床検査試薬キット（ワコー製）を使用した。アイソザイムパターン分析のための電気泳動および発色操作は、試薬キット付属のマニュアルにしたがった。総活性の測定には、酵素染色用試薬を使用した。各アイソザイムの濃度は、デンシトメトリーにより測定し、デンシトグラムから濃度比を算出した。なお、一般試薬は、特に断らない限り、NAKALAI TESCUE製のものを使用した。
２．金属による血清タンパク質の構造変化の測定
粒径600〜710μmのビーズ状粒子のCo-29Cr-6Mo合金および純Tiそれぞれを、ウシ血清負荷し、金属処理血清タンパク質溶液を調製した。この溶液を試料として、分光光度計で紫外吸収スペクトル（280nm）を測定した。なお、コントロールとして、金属未処理の血清も調製し、測定した。
【００３２】
図１に示したCo-29Cr-6Mo合金と純Tiとの差スペクトルの経時的変化のとおり、Co-29Cr-6Mo合金は、コンフォメーション変化が純Tiと比べて、時間経過に対して比較的に安定であることが確認できた。
３．金属処理血清中の金属濃度の測定
蒸留水（Distilled Water；DW）、リン酸緩衝液（PBS）および血清（5倍希釈）それぞれ20ml用意し、これらに2.5mlのCo-Cr-Mo、または、2.5mlの純Tiを加え、金属処理溶液として調製した。
【００３３】
これら金属処理溶液を、37℃、20minインキュベートし、その上清をICP発光分光分析した。
【００３４】
分析結果は、表１に示したとおりであった。なお、表中の「＊」は、未使用のCo-Cr-Mo粒子を使用したことを意味しており、また単位はppmである。
【００３５】
【表１】
2006271232.tif 000002
【００３６】
４．生体用金属の生体適合性の評価
（１）評価方法の手順
以下の工程によって行った。
第１の工程：ウシ由来の原血清または1000倍希釈した血清に、（I）金属固体の場合は、金属0.2mlに、前記原血清または希釈血清1.1mLを加え、緩やかな転倒を繰り返しながら、37℃で20分間インキュベートした。また、（II）金属イオンの場合は、前記原血清または希釈血清に所定濃度になるように金属イオンを加え、37℃で20分間、インキュベートした。
第２の工程：インキュベーション後、上清である血清を回収し、血清に含まれる酵素LDHの活性変化を分析した。分析は、LDHの総活性を酵素染色用試薬を使用して、吸光度（570nm）の経時的変化、すなわち酵素反応を分光光度計で測定して分析し、かつ、LDHのアイソザイムパターンをDavis法による電気泳動および発色操作で分析した。なお、アイソザイムの電気泳動パターンの分析には、前記原血清および希釈血清を用いた。また、各アイソザイムの濃度についてもデンシトメトリーにより測定し、デンシトグラムから濃度比を算出した。
第３の工程：上記酵素活性変化の分析結果を基に、生体用金属による酵素活性の抑制度合いを計測した。
（２）評価結果
結果は、図２および図３に示したとおりであった。なお、図２は、LDH総活性に及ぼす金属の影響を示した図であり、（A）は金属イオンの場合、（B）金属固体（粒子）の場合である。また、図３は、LDHのアイソザイムパターンの分析結果を示した図であり、（A）は電気泳動パターン、（B）はデンシトグラムによる各画分の相対比率である。
（A）LDH総活性に及ぼす金属の影響
図２（A）に示したとおり、Coイオンは0.01ppmから1ppmに亘って濃度依存性にLDH活性を抑制したが、Crイオンは0.1ppm以下では活性化し、１ppmでは抑制した。また、MoイオンはCrイオンと逆に、0.1ppm以下では抑制傾向をしめし、１ppmではわずかな活性化を示した。一方、Tiイオンは、0．1ppm以下ではむしろ活性化を示したが、１ppmでは強い抑制を示した。
【００３７】
これに対し、図２（B）に示したとおり、固体金属に暴露した場合、Co-Cr-Mo合金では強い抑制が見られたが、純Tiではほとんど活性の変化は見られなかった。固体金属とイオンでは、作用が異なっていたことが確認することができた。
（B）LDHのアイソザイムパターンの分析
図３および表２に示したとおり、Co-Cr-Mo合金でも純Tiでも、アイソザイムパターンの変化が見られた。特にアイソザイムLDH1、4および5は、Co-Cr-Mo合金および純Tiの両者により活性化されたが、LDH2は両者により大きく抑制され、LDH3も軽度の抑制がみられた。
【００３８】
なお、表２は、LDHアイソザイムの相対活性を示した。
【００３９】
【表２】
2006271232.tif 000003
【００４０】
５．本願発明の生体用金属の生体適合性評価の有用性
以上の結果から、血清タンパク質中に常在するLDHの総活性は、Co-Cr-Mo合金では抑制されたが、Tiではほとんど影響が見られなかった。これに対し、Co-Cr-Mo合金の素材をイオンの形で添加した場合、金属固体とは異なる作用を示した。
【００４１】
すなわち、Co-Cr-Mo合金ではLDH活性の抑制がみられたが、イオンでは、Coは抑制したが、CrとMoは濃度によって、活性化または抑制がみられた。したがって、イオンで作用する場合とCo-Cr-Mo合金で作用する場合とは、金属イオンとタンパク質の相互作用の様式が異なっていると考慮できる。すなわち、金属イオンとの結合では、タンパク質分子は空間的に自由な環境でコンフォメーション変化を起こし得るが、金属固体に結合した場合は結合部位が固定されるためにコンフォメーション変化が制約されると考慮できる。
【００４２】
一方、Tiでは、イオンと固体で逆の作用がみられた。Tiイオンでは、LDH活性は大きく抑制されたが、Ti固体ではほとんど影響がなかった。これは、Tiは血清やPBSで処理してもイオンの溶出がないためであるからと考慮できる。
【００４３】
また、LDHアイソザイムに対する作用もCo-Cr-Mo合金とTiでは異なっていた。Co-Cr-Mo合金では、LDH1が大きく活性化され、LDH2が強く抑制されている。そのため、対照でのLDH1/LDH2は0.86だったものが、Co-Cr-Mo合金でのLDH1/LDH2は1.6になり、TiでのLDH1/LDH2は1.4になり、その比率が大きく変わっている。また、Co-Cr-Mo合金では、LDH3の抑制も大きいが、Tiではやや小さくなっていることも確認できた。LDH4および5は、いずれも活性化されている。このようにLDHアイソザイムの活性が変化すると、それぞれの組織特異的なアイソザイムパターンが失われてしまい、エネルギー代謝に異常を引き起こし、ひいては、細胞の増殖にも影響を与えることが考慮できる。
【００４４】
なお、本実施例に対する予備実験では、図には示していないが、ステンレス鋼や純Ti等よりも、生体適合性が高いといわれているCo-Cr-Mo合金では、細胞増殖抑制が観察された。
【００４５】
タンパク質を使った方法は手軽であり、短時間に多くの試料を検査することができ、そして、LDHは金属により特異的な影響を受けること綜合して考慮すると、LDHの活性およびアイソザイムパターンの変化を指標にした生体毒性の予測が可能となる。
【００４６】
そして、本願発明の評価方法は、血清タンパク質のスペクトル測定法と併せて、細胞毒性試験を行う前の前段階的スクリーニング法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】Co-Cr-Mo合金と純Tiとの差スペクトルの経時的変化を示した図である。
【図２】LDH総活性に及ぼす金属の影響を示した図であり、（A）は金属イオンの場合、（B）金属固体（粒子）の場合である。
【図３】LDHのアイソザイムパターンの分析結果を示した図であり、（A）は電気泳動パターン、（B）はデンシトグラムによる各画分の相対比率である。
【図２】
2006271232.tif 000004
【図１】
2006271232.tif 000005
【図３】
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