(57)【要約】【課題】  ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患への罹患の検出および抗ガン剤治療の効果測定方法の提供。【解決手段】  ポリ（ＡＤＰ−リボース）の主要代謝産物であるリボシルアデノシンおよびリボシルイノシンをマーカーいわゆるバイオマーカーとして用いる。被検動物から得た生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を測定することにより、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患への罹患を検出し、または抗ガン剤治療の効果を測定する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験動物におけるＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患への罹患を検出する方法であって、
被検動物から得た生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を測定することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記生物学的試料が血液または尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患が、細胞破壊またはポリＡＤＰ−リボシル化反応の亢進を伴う疾患である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患が、虚血性疾患、炎症、または自己免疫疾患である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記リボシルアデノシンが、Ｏ−α−リボシル−(１’’→２)−アデノシンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を、正常値と比較することを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度が、前記ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患に罹患した動物の生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を参照して予め設定された閾値よりも高い場合に、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患に罹患した可能性があると判定することを含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
抗ガン剤治療の効果をモニタリングする方法であって、
抗ガン剤の投与を受けている患者から生物学的試料を継続して採取し、
前記生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を測定し、
前記リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度が増加したら、抗ガン剤治療が有効と判定することを特徴とする、方法。
【請求項９】
前記生物学的試料が血液または尿である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リボシルアデノシンが、Ｏ−α−リボシル−(１’’→２)−アデノシンである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
動物におけるＤＮＡ損傷または細胞死の度合いを知る方法であって、
前記動物から生物学的試料を採取し、
前記生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を測定することを特徴とする、方法。
【請求項１２】
前記生物学的試料が血液または尿である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リボシルアデノシンが、Ｏ−α−リボシル−(１’’→２)−アデノシンである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を、正常値と比較することを含んでなる、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度が、ＤＮＡ損傷または細胞死を生じた動物の生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度と比較することを含んでなる、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患の可能性ある動物をスクリーニングする方法であって、
前記動物から生物学的試料を採取し、
前記生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を測定することを特徴とする、方法。
【請求項１７】
ＤＮＡ損傷または細胞死の度合いを表すマーカーとしての、リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの使用。
【請求項１８】
抗ガン剤治療の効果の度合いを表すマーカーとしての、リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、リボシルアデノシンおよびリボシルイノシンをいわゆるバイオマーカーとして用いた、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患への罹患の検出および抗ガン剤治療の効果測定の方法に関する。
【０００２】
背景技術
ポリＡＤＰ−リボシル化反応はポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（Ｐａｒｐ）により行われる翻訳後修飾の１つであり、ＤＮＡ損傷修復、転写、クロマチン高次構造の制御、細胞死の誘導、細胞の分化や癌化などに関与すると考えられている。Ｐａｒｐには現在Ｐａｒｐ−１をはじめとする１８種類のファミリータンパク質が同定されている。Ｐａｒｐ−１は核および中心体に存在し、ＤＮＡ損傷後、切断端に結合することにより活性化され、細胞内にあるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として、自己やヒストンなどのタンパク質のアスパラギン酸、グルタミン酸、およびリジン残基にＡＤＰ−リボースを結合させる。そして、更にＡＤＰ−リボースを一単位として、(1”α→2’O)グリコシド結合により重合させ、タンパク質をポリＡＤＰ−リボシル化する。その長さは数残基から200残基以上が認められ、直鎖または分岐鎖の構造をとっている。
【０００３】
一方、虚血性疾患や炎症等では酸化ストレスによってＤＮＡ損傷が生じ、Ｐａｒｐにより多量のポリ（ＡＤＰ−リボース）が合成され、細胞死が誘導されることが知られている（非特許文献１：Poly(ADP-ribose) polymerase gene  disruption renders mice resistant to cerebral ischemia. Nature Med. 3: 1089-1095(1997), 非特許文献２：Poly(ADP-ribose) synthetase  activation mediates mitochondrial injury during oxidant-induced cell death. J. Immunol. 161: 3753-3759, 非特許文献３：Protection against peroxynitrite-induced fibroblast injury and arthritis development by inhibition of poly(ADP-ribose) synthetase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 3867-3872. ）。このとき、細胞死に伴った細胞破壊が生じ、細胞内で合成されたポリ（ＡＤＰ−リボース）が血中に漏出する可能性がある。従って血液中のポリ（ＡＤＰ−リボース）またはその分解産物は、ＤＮＡ損傷や細胞死を伴う疾患のバイオマーカーとなりうると考えられる。現在のところ、細胞外に漏出したポリ（ＡＤＰ−リボース）からどのような代謝産物が生成するかを明らかにした報告はない。
【非特許文献１】Nature Med. 3: 1089-1095(1997)
【非特許文献２】J. Immunol. 161: 3753-3759
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 3867-3872
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、今般、ポリ（ＡＤＰ−リボース）の代謝産物を明らかにすることに成功した。具体的には、試験管内での血清によるポリ（ＡＤＰ−リボース）の分解と代謝産物の同定、さらにマウス体内でのポリ（ＡＤＰ−リボース）の分解と代謝産物の解析を行い、その結果、血中におけるポリ（ＡＤＰ−リボース）の主要代謝産物がリボシルアデノシンおよびリボシルイノシンであるとの知見を得た。従って、これら主要代謝産物が、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患の検出および抗ガン剤治療の効果測定に有用なマーカーとなり得るとの知見を得た。本発明はこれら知見に基づくものである。
【０００５】
よって、本発明によれば、リボシルアデノシンおよびリボシルイノシンをいわゆるバイオマーカーとして用いた、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患への罹患の検出および抗ガン剤治療の効果測定の方法が提供される。
【０００６】
具体的には、本発明の第一の態様によれば、被験動物におけるＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患への罹患を検出する方法が提供され、この方法は被検動物から得た生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を測定することを特徴とする。
【０００７】
また、本発明の第二の態様によれば、抗ガン剤治療の効果をモニタリングする方法が提供され、この方法は、抗ガン剤の投与を受けている患者から生物学的試料を継続して採取し、生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を測定し、リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度が増加したら、抗ガン剤治療が有効と判定することを特徴とする。
【０００８】
さらに、本発明の第三の態様によれば、動物におけるＤＮＡ損傷または細胞死の程度を知る方法が提供され、この方法は、動物から生物学的試料を採取し、生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を測定することを特徴とする。
【０００９】
またさらに、本発明の第四の態様によれば、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患の可能性ある動物をスクリーニングする方法が提供され、この方法は、動物から生物学的試料を採取し、生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を測定することを特徴とする。
【発明の具体的説明】
【００１０】
本発明による方法によって検出可能な疾患は、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患であり、具体的には、細胞破壊またはポリＡＤＰ−リボシル化反応の亢進を伴う疾患とされる、虚血性疾患、炎症、または自己免疫疾患である。
【００１１】
これら疾患に罹患すると、血中にポリ（ＡＤＰ−リボース）が漏出する可能性があり、このポリ（ＡＤＰ−リボース）がリボシルアデノシンおよびリボシルイノシンに代謝されることが、後記する実験例により確認された。従って、リボシルアデノシンおよびリボシルイノシンを指標とすれば、被験動物におけるＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患への罹患を検出することが可能となる。また、動物におけるＤＮＡ損傷または細胞死を定性または定量することが可能となる。さらに、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患の可能性ある動物をスクリーニングすることが可能となる。
【００１２】
また、ＤＮＡ損傷または細胞死は、抗ガン剤の投与によっても生じる。従って、抗ガン剤治療によっても、血中にポリ（ＡＤＰ−リボース）が漏出し、リボシルアデノシンおよびリボシルイノシンに代謝されることから、リボシルアデノシンおよびリボシルイノシンを指標とすれば、抗ガン剤治療の効果を判定することが可能となる。
【００１３】
従って、本発明の第一の態様によれば、被験動物におけるＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患への罹患を検出する方法が提供され、この方法において、被検動物から得た生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を測定し、好ましくは、リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を、正常値と比較することを含んでなる。正常値よりも大きく離れた濃度であった場合には、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患に罹患した可能性があると判定する。また、別の好ましい態様によれば、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患に罹患した動物の生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を参照して予め閾値を設定し、その値よりもリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度が高い場合に、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患に罹患した可能性があると判定することができる。
【００１４】
また、本発明の第二の態様によれば、抗ガン剤治療の効果をモニタリングする方法が提供される。この方法にあっては、抗ガン剤の投与を受けている患者から生物学的試料を継続して採取し、生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を測定し、リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度が増加したら、抗ガン剤治療が有効と判定する。
【００１５】
さらに、本発明の第三の態様によれば、動物におけるＤＮＡ損傷または細胞死の度合いを知る、すなわちそれを定性または定量する方法が提供される。この方法にあっては、動物から生物学的試料を採取し、生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を測定し、好ましくは、リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を、正常値と比較することを含んでなる。正常値との差異から、ＤＮＡ損傷または細胞死を定性的にまたは定量的に知ることが出来る。また、別の態様によれば、リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を、ＤＮＡ損傷または細胞死を生じた動物の生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度と比較する。それよって、ＤＮＡ損傷または細胞死を定性的にまたは定量的に知ることが出来る。
【００１６】
また、本発明の第四の態様によれば、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患の可能性ある動物をスクリーニングする方法が提供される。この方法にあっては、動物から生物学的試料を採取し、生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を測定し、好ましくは、リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を、正常値と比較することを含んでなる。正常値よりも有意に離れた濃度の動物を、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患に罹患した可能性があると判定する。また、別の好ましい態様によれば、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患に罹患した動物の生物学的試料におけるリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度を参照して予め閾値を設定し、その値よりもリボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度が高い場合に、ＤＮＡ損傷または細胞死をともなう疾患に罹患した可能性がある動物と判定する。
【００１７】
さらに、本発明の別の態様によれば、ＤＮＡ損傷または細胞死の度合いを表すマーカーとしての、リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの使用、および抗ガン剤治療の効果の度合いを表すマーカーとしての、リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの使用が提供される。
【００１８】
上記いずれの態様にあっても、生物学的試料は適宜選択されてよいが、血液または尿であることが好ましい。
【００１９】
この生物学的試料から、リボシルアデノシンまたはリボシルイノシンの濃度の測定手法は、その濃度を測定可能である限り適宜選択されてよいが、例えば、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、液体クロマトグラフ−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）等が挙げられる。また、試料中の交雑物の影響を避けるため、予備的な精製を行った後、これら測定手法に適用されてもよい。
【００２０】
本発明者らが後記する実験例から得た知見の詳細は以下のとおりである。まず、血清中でのポリ（ＡＤＰ−リボース）の分解は、ホスホリボシル−アデノシン一リン酸（ＰＲ−ＡＭＰ）と、ＡＭＰに分解されていたことから、血液中においてはまず、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）によりポリ（ＡＤＰ−リボース）のホスホジエステル結合が切断される。細胞内においては、ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドラーゼ（Ｐａｒｇ）がポリ（ＡＤＰ−リボース）の主要な分解酵素であると考えられたが、血中においてはＰＤＥが優位に働いていると思われる。ＰＤＥは細胞内においては細胞質に局在しており、ポリ（ＡＤＰ−リボース）は主に核内で合成されるため、細胞内では核に局在するＰａｒｇにより分解が行われると考えられる。Ｐａｒｇの血液中の存在は現在のところ判っていないが、ウシ胎児血清およびマウス血液中にはＰａｒｇ活性は検出されなかった。ホスホリボシル−ＡＭＰやリボシルアデノシンのリボース-リボース結合がＰａｒｇにより分解され、リボースホスフェートなどを生成する可能性も考えられたが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合型リコンビナントrat ＰａｒｇではＰＲ−ＡＭＰやリボシルアデノシンを分解しないことを確認した。また、尿中においてもリボシルアデノシンおよびリボシルイノシンが検出されたことから、リボース-リボース結合は血液中では安定であることが示唆された。
【００２１】
また、後記する実験によれば、ポリ（ＡＤＰ−リボース）の生体内の分布は、静注後5分程度ですでに血液外に移行し、肝臓や腎臓に主に分布しており、静注5分後の各臓器では大部分が分解された状態で存在していた。尿中には5分後から分解産物が検出され、1時間後には約5%の放射能の排泄が認められ、ポリ（ＡＤＰ−リボース）は特定の臓器に集積することはなかった。32Ｐで標識したプラスミドＤＮＡを尾静脈より投与した場合にも、10分程度で血中から消失することがP. M. Mullenらによって報告されている(Strength of conjugate binding to plasmid DNA affects degradation rate and expression level in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 2000 1523, 103-110)。このようにポリ（ＡＤＰ−リボース）はＤＮＡと同様に血中ですみやかに分解されることが判った。肝臓および腎臓に多く分布が見られたが、これが臓器中の血液に存在するのか、細胞中に取り込まれているのかは明らかではない。腎臓では時間の経過につれて減少しているため、尿中へ排泄されていると考えられる。また、静注量から比較すると検出された放射能は約30%であった。検出されなかった放射能は他の臓器や、毛細血管等へ分布していると考えられる。
【００２２】
また、リボシルアデノシンおよびリボシルイノシンは尿中にも検出され、血液と比較しその含有量も多いことから、バイオマーカーとして有用である。リボシルアデノシンには、リボース （１’’α→2’O）リボース型と、リボース（１’’β→2’O）リボース型の結合を有する異性体が存在しうるが、リボシルアデノシンがリボース （１’’α→2’O)リボース結合のみを有するものであることから、ポリ（ＡＤＰ−リボース）からの直接の分解産物はＯ−α−リボシル−(１’’→２)−アデノシンであると考えられる。よって、本発明において検出、測定の対象とされるリボシルアデノシンは、好ましくはＯ−α−リボシル−(１’’→２)−アデノシンである。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
１．標準物質の作成
（１）32Ｐ-phosphate
オリゴヌクレオチドDNAにT4 polynucleotide kinase (TAKARA社)、γ-32P-ATP (Amersham社)を添加し、T4 polynucleotide kinase buffer (TAKARA社)中で16℃で1時間反応させ、オリゴヌクレオチドDNAのリン酸化を行った。40μLの反応液に1 M Tris-HCl (pH 8.0)を50μL加え、bacterial alkaline phosphatase (BAP、TOYOBO社)を1μL添加し、60℃で1時間反応させ、32Ｐ-phosphateを遊離させた。
【００２５】
（２）リボシルアデノシン
ポリ（ＡＤＰ−リボース）にPDEを添加し、PDE buffer [10 mM sodium-phosphate緩衝液 (pH 7.0)、10 mM MgCl2]中で37℃で一晩反応させ、ホスホリボシル−AMPとAMPに分解し、後述のHPLCによりホスホリボシル−AMPの保持時間17分のピークを分取した。ホスホリボシル−AMPに0.5 M Tris-HCl (pH 8.0)存在下でBAPを添加し60℃で1時間反応させ、同様にHPLCにより保持時間32分のピークを分取し、後述のLC-MSにより分子量が399であることとその紫外線吸収スペクトルを確認し、リボシルアデノシンを得た。
【００２６】
（３）リボシルイノシン
リボシルアデノシンを0.05 M pottasium-phosphate  (pH 7.5)中でadenosine deaminase (Sigma)10 U/mLと25℃で30分反応させた。HPLCにより保持時間26分のピークを分取し、LC-MSにより分子量が400であることとその紫外線吸収スペクトルを確認した。
【００２７】
２．ＴＬＣ分析
（１）一次元ＴＬＣ
PEI (polyethyleneimine-impregnated) cellulose TLC plate (MACHERHY-NAGEL)
展開溶媒A: 0.1 M LiCl-3 M acetic acid-3 M urea
展開溶媒B:H2O
（２）二次元ＴＬＣ
Cellulose TLC plate (F1440, Schleicher & Schuell及びCellulose F, Merk))
展開溶媒1: isobutyric acid/25% NH4OH/H2O (容量比が50 / 1.1 / 28.9)
展開溶媒2 : 0.1 M sodium-phosphate (pH 6.3)/ammonium sulfate/n-propanol (100 / 60 / 2)
展開後、BAS2500 (Fuji Film)により放射能を解析した。
【００２８】
３．ウシ胎児血清によるポリ（ＡＤＰ−リボース）の分解
（１）血清中でのポリ（ＡＤＰ−リボース）分解の経時的変化
100 ng 32P-ポリ（ＡＤＰ−リボース）に、ウシ胎児血清 (PAA Laboratories, GmbH)20 μLを加えて全量50μLとし、37℃で0分、10分、30分、60分、3時間、5時間、及び24時間反応させた。各ポイントでそれぞれ10 μLずつ反応液を分取し、SDSを0.2%となるように添加し反応を停止した。2μLを一次元TLC (展開溶媒A)により展開した。
【００２９】
（２）分解産物の同定
ウシ胎児血清 (三光純薬社) 40%、50 mM Tris-HCl (pH 7.5)を含む反応液中で、14C-ポリ（ＡＤＰ−リボース）または、非放射能標識ポリ（ＡＤＰ−リボース） 50μgを37℃で一晩反応させた。SDSを1%になるように添加し反応を停止した。14C-ポリ（ＡＤＰ−リボース）反応液を一次元(展開溶媒B)および二次元TLCで分析し、リボシルアデノシンとRf値を比較した。非放射能標識ポリ（ＡＤＰ−リボース）反応液はHPLCで分解産物の画分を分取し、後述のLC-MSにより解析した。
【００３０】
４．32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）静脈注射後の臓器分布の測定 
ICRマウス (11〜13週齢、雄) に、ネンブタール (大日本製薬社) 1.5 mg/60μLを腹腔内投与して麻酔後、尾静脈より32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）10μg/4〜8 x 104 cpm/100 μLを静注し、採尿のために尿路を瞬間接着剤で閉鎖した。投与5分、1時間、および3時間後に解剖し、心臓より採血し、また膀胱より採尿を行った。肝臓、腎臓、脾臓、および肺を摘出し、各臓器重量を測定した。各臓器はホモジナイザー (Polytron) を用いてPBS中で破砕した。各臓器、血液、および尿の一部に等量のSolvable (Packard社) を加え、50℃で一晩溶解させた。各溶解液にEDTA (pH 8.0) を20％、H2O2を6％になるように加え、一日室温に置いた。そして、その全量に10〜15 mLの液体シンチレーションカウントカクテル、Insta-gel plus (ParkinElmer社)を加え透明になるまで混和し、液体シンチレーションカウンター (Beckman)で放射能を測定した。
【００３１】
５．各臓器での32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）分解の解析
採取した血液、ならびに破砕した肝臓および腎臓の溶液の一部を0.5 N HClO4で20分処理し、3 N KOH/0.7 M Gly-Glyで中和後、15,000 rpmで10分間遠心し、一部を酸処理可溶性画分（上清）と酸処理不溶性画分（沈澱）とに分けた。ポリ（ＡＤＰ−リボース）は沈澱に、その分解された低分子のものは上清画分に回収される。沈澱を1 N NaOHに溶解し、6 N HClで中和後、SDS、proteinase Kをそれぞれ最終濃度0.1％、100μg/mLになるように加え、37℃で一晩反応させた。フェノールで抽出し、エタノール沈澱によりポリ（ＡＤＰ−リボース）を抽出した。70％エタノール洗浄し、乾燥後、H2Oに溶解した。ポリ（ＡＤＰ−リボース）の分解の割合を測定するため、過塩素酸処理後の上清、沈澱のフェノール抽出処理後のサンプルをDE81 paper (Whatman)にスポットし、BAS2500で放射能を測定した。
【００３２】
６．マウス体内での32P-ポリ（ＡＤＰ−リボース）分解産物の解析
ポリ（ＡＤＰ−リボース）の分解産物を調べるため、過塩素酸処理後の上清の二次元TLCを行った。尿は採取したサンプルをそのまま二次元TLCにより分析した。また、H2Oに溶解した血液中のポリ（ＡＤＰ−リボース）、静注したポリ（ＡＤＰ−リボース）を20% polyacrylamide gelに泳動し、鎖長の変化を調べた （Panzeter et. al., High resolution size analysis of ADP-ribose polymers using modified DNA sequencing gels. Nucleic Acids Res. 1990 Apr 25;18(8):2194）。
【００３３】
LC-MSでの解析の為、非放射能標識ポリ（ＡＤＰ−リボース） 100μgの生理食塩水液100μL、コントロールとして生理食塩水100μLをマウス尾静脈より投与し、投与1時間後に採血、採尿を行った。採取した血液及び尿をHClO4処理し、その上清を後述のようにSep-Pak cartridgeで前処理した後、HPLCでリボシルアデノシンの溶出する保持時間31〜32分の画分と、リボシルイノシンの溶出する保持時間26〜27分の画分を分取し、LC-MSによる解析を行った。
【００３４】
７．LC-MSサンプル調製
Sep-Pak cartridge light (Waters社)を50% CH3CN 5 mLで湿潤、50 mM triethylamine acetate (TEAA、Wako社)5 mLで平衡化し、HClO4処理後の上清を吸着させた。H2O 500μLで2回洗い、20% CH3CN 1 mLで溶出した。その溶出液を濃縮し、ウルトラフリーC3GV (MILLIPORE社)でろ過した後、HPLCで分析し分解産物の画分を分取した。各画分を濃縮後、Microcon YM3 (MILLIPORE社)でろ過し、後述のようにLC-MSで分析した。
【００３５】
８．ＨＰＬＣ
装置：HPLC分析装置（SCL-10A VP、島津製作所）
カラム：Develosil C30-UG-5（f46 × 250 mm、野村化学）
溶離液：A液  0.1 M CH3COONH4 (Wako)
B液  50 mM CH3COONH4-50％CH3CN (Wako)
0分, A：B=98：2→100分, A：B=0：100 のリニアグラジエント
流速：0.5 mL/min
検出：photo diode array detector (SPD-M10A VP、島津製作所)
【００３６】
９．液体クロマトグラフ −質量分析法（Liquid chromatography-mass spectrometry、LC-MS)
LC装置は(Series 1100、Agilent)、カラムはDevelosil C30-UG-5を用い、溶離液はA液 0.1 M CH3COONH4、B液 50 mM CH3COONH4-50％ CH3CNとし、流速0.3 mL/min、B液2%から50%まで50分 のリニアグラジエントにより分析した。UV 254 nmの検出も同時に行った。MS装置 (Micromass ZQ、Waters)はelectrospray ionization (ESI)法によりイオン化を行い、検出を行った。
【００３７】
試験結果１：ウシ胎児血清 (FBS)によるポリ（ＡＤＰ−リボース）の分解産物の同定
（１）32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）の分解の経時的変化と分解産物分析
32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）のFBSによる分解の経時的変化を、一次元TLCで解析した。Rf値0.23のホスホリボシル-AMPと考えられる分解産物が出現し、続いてRf値0.7のAMPに相当するスポットと、Rf値0.25のスポット(分解産物１)が出現した。さらに詳しく分解産物を調べるため、37℃で3時間及び24時間反応後のサンプルを二次元TLCに展開した。3時間後の反応液にはAMP、ホスホリボシル-AMP、そして分解産物１が検出され、24時間後には完全に分解産物１に分解されていた。分解産物１を同定するため、予測される物質の一つであるリン酸の一次元および二次元TLCのRf値を調べた。γ-32P-ATPより32Ｐ-phosphateを作成し、一次元および二次元TLCに展開すると、Rf値は各々分解産物１とほぼ一致した。このことから、血清中ではホスホジエステル結合を切断するPDEによりPR-AMPに分解され、その後リン酸残基が遊離することが示唆された。
【００３８】
（２）14Ｃ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）の分解産物分析
32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）の分解の解析から、PR-AMPに分解後、リン酸酸残基が遊離することが示唆された。よって、32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）を用いた実験ではリン酸以外の主要分解産物を同定できない。そのため、アデニン残基とリボース残基が標識された14C-ポリ（ＡＤＰ−リボース）を用いて実験を行った。
14C-ポリ（ＡＤＰ−リボース）を血清で分解した反応液を一次元および二次元TLCで分析した。H2Oで展開したcellulose plateを用いた一次元TLCの結果、スポットは一つのみ検出され、それはアデニンまたはアデノシンとは異なり、リボシルアデノシンに近いRf値を示した。また、二次元TLCにおいてリボシルアデノシンと同じRf値を示した。一次元TLCではFBS含有量の高い反応液をそのままTLCにスポットしているため、血清成分や反応停止のために添加したSDSが影響し、移動度が多少変化していると考えられる。これらの結果から、ポリ（ＡＤＰ−リボース）の分解産物はリボシルアデノシンであることが示唆された。血液中にはアデノシンデアミナーゼ(ADA)が存在するため、14C-リボシルアデノシンをADAで処理することにより14C-リボシルイノシンを作成した。14C-ポリ（ＡＤＰ−リボース）の一次元TLCでは血清による分解産物中にリボシルイノシンは検出されなかった。
【００３９】
（３）非放射能標識ポリ（ＡＤＰ−リボース）分解産物の同定
分解産物がリボシルアデノシンであることをさらに確認するため、LC-MSによる同定を行った。まず、非放射能標識ポリ（ＡＤＰ−リボース） 50μgをFBSで分解し、HPLCで分析を行い、ポリ（ＡＤＰ−リボース）非添加反応液とHPLCのピークのパターンを比較した。保持時間33分付近に、反応に用いたポリ（ＡＤＰ−リボース）の約100%に相当するUV吸収を有するピークが検出され、この保持時間はリボシルアデノシンと一致していた。このピークの検出された画分を分取し、LC-MSでの解析を行ったところ、保持時間38分にリボシルアデノシンの分子量に相当するm/z=268 (ES+)、m/z=266 (ES-)の分子イオンピークが検出され、同じ保持時間にフラグメントイオンであるアデノシンおよびアデニンに相当する分子イオンピークも検出された。ポリ（ＡＤＰ−リボース）非添加の血清中にはリボシルアデノシンは検出されず、血清でのポリ（ＡＤＰ−リボース）の主要な分解産物としてリボシルアデノシンが同定された。
【００４０】
（４）リボシルアデノシン及びホスホリボシル−ＡＭＰのポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（Ｐａｒｐ）による分解
14C-リボシルアデノシン及び14Ｃ-ホスホリボシル−ＡＭＰをラットグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合型Ｐａｒｇと反応後、TLCで展開を行いアデノシン、ＡＭＰ、およびリボース−ホスフェートへの分解の有無を調べた。リボシルアデノシンおよびホスホリボシル−ＡＭＰ共に25℃で一晩反応後もほとんど分解は認められなかった。
【００４１】
試験結果２．ポリ（ＡＤＰ−リボース）の生体内での分解及び代謝産物の解析
(1) 32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）静注後の生体内分布
上述の32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）をマウス尾静脈より静注した試験結果について解析した。投与した放射能を100％とし、各臓器での放射能の割合を算出した。投与5分から3時間後において血中の残存放射能は約2.3%となり、投与5分後でほとんど血液外に移行していた。主な分布先は肝臓と腎臓で、脾臓や肺にはほとんど分布していなかった。1時間後以降、約5%の放射能の尿中への排泄が認められた。
【００４２】
（２）32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）の各臓器での分解
ポリ（ＡＤＰ−リボース）投与後の血中や各組織への放射活性の分布について検討した。その放射能がポリ（ＡＤＰ−リボース）あるいは分解産物のどちらの状態で存在しているのかを調べるため、分解率を測定した。分布量の多かった血液、肝臓、および腎臓について、投与5分後の分解率を検討した。HClO4処理後の、酸処理可溶性画分(上清)と酸処理不溶性画分(沈澱)に分離し、放射能を測定した。上清中の放射能の割合が、血液64％、肝臓84％、腎臓91％と、かなりの割合が分解された状態で存在していた。
【００４３】
（３）各臓器における32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）代謝産物の分析
尿の各時間のサンプルにおいて二次元TLCで分析した。いずれの経過時間においても同じ位置にスポットが認められた。このスポットのRf値はリン酸のRf値と一致しており、静注5分後よりリン酸が分解産物として排泄されていることが判った。ＡＭＰや、Ｐａｒｇにより分解された時に生成するＡＤＰ−リボースのスポットは認められなかった。また、血液、肝臓、および腎臓についても、5分後の分解産物を二次元TLCで分析したところ、尿と同様にリン酸と同じRf値を示すスポットが認められた。血清中で32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）を分解した時もリン酸が検出されたことから、ポリ（ＡＤＰ−リボース）を静注後、生体内中でもリン酸と、リボシルアデノシンに分解されている可能性が示唆された。
【００４４】
また、血液の酸処理不溶性画分より抽出したポリ（ＡＤＰ−リボース）を20% PAGEにより鎖長を調べると、静注したポリ（ＡＤＰ−リボース）と比較して短い鎖長分布を示し、血液中でも分解により短鎖化していることを確認した。
【００４５】
（４）血液、尿中における分解産物の解析
マウスへの32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）の静注の実験から、分解産物の1つとしてリン酸が生成していることが確認され、血清中と同様にリボシルアデノシンに分解されている可能性が示唆された。そこで、ポリ（ＡＤＰ−リボース） 100μgを静注1時間後の血液と尿における分解産物をLC-MSにより解析した。
【００４６】
血液および尿の酸処理可溶性画分をSep-pak cartridgeによる前処理後、HPLCを用いてリボシルアデノシン (画分１)とリボシルイノシン (画分２)の保持時間付近の画分をそれぞれ分取した。HPLCでの分析において、生理食塩水を静注したものと254 nmでのUV吸収ピークのパターンでの比較したが差違を認めなかった。一方、血液の画分１のLC-MSによる解析の結果は図１および図２（コントロール）に示されるとおりであった。リボシルアデノシンとアデノシンは保持時間が近く、画分１にはアデノシンも含まれていた。このLC-MSの条件では、アデノシンは36〜37分にm/z=268 (ES+)、m/z=266 (ES-)、リボシルアデノシンは38分付近にm/z=400 (ES+)、m/z=398 (ES-)の分子イオンピークが検出される。生理食塩水を静注したものではアデノシンの分子イオンピークのみ検出されたが、ポリ（ＡＤＰ−リボース）を静注したものではアデノシンとともにリボシルアデノシンの分子イオンピークが検出され、マウス体内においてもリボシルアデノシンに分解されていることが明らかとなった。
【００４７】
血液中にはプリン代謝酵素であるアデノシンデアミナーゼ(ADA)が存在しており、アデノシンを脱アミノ化し、イノシンへ変換する。分解産物であるリボシルアデノシンもADAによりリボシルイノシンに代謝されている可能性が考えられるため、リボシルイノシンの保持時間である画分２についてもLC-MSによる分析を行った。その結果は、図３および図４（コントロール）に示されるとおりであった。リボシルアデノシンをADA処理することにより作成したリボシルイノシンの標準物質では31.4分にm/z=401 (ES+)、m/z=399 (ES-)の分子イオンピークが検出された。生理食塩水を静注したものでは検出されなかったが、ポリ（ＡＤＰ−リボース）を静注したマウスの血液ではm/z=399 (ES-)のピークが検出された。m/z=401 (ES+)にピークは検出されなかったが、標準物質でもこのピークは小さく、サンプル中の量が少なかったため検出されなかったと考えられる。また、保持時間が標準物質と少し異なるが、UVピークのパターンからリボシルイノシンに相当すると考えられる。以上から血液中ではポリ（ＡＤＰ−リボース）はリボシルアデノシンに分解され、その一部はリボシルイノシンに代謝されていることが判った。
【００４８】
これらの分解産物が尿中へも排泄されているのかどうかについて、同様にLC-MSで解析を行った。ポリ（ＡＤＰ−リボース）静注1時間後の尿をHClO4処理後、Sep-pak cartridgeで前処理を行い、HPLCによって画分１ (リボシルアデノシン)、画分２ (リボシルイノシン)を分取した。これらを各々LC-MS解析を行ったところ、リボシルアデノシンとリボシルイノシンに相当する分子イオンピークが検出された。その結果は、図５および７に示されるとおりであった。また、生理食塩水を静注したコントロールのマウスの結果は、図６および図８に示されるとおりであった。生理食塩水を静注したコントロールのマウスでは画分１のリボシルアデノシンは検出されず、画分２のリボシルイノシンはm/z=401 (ES+)では検出されたが、その量はポリ（ＡＤＰ−リボース）静注時に比べると少なかった。
【００４９】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）はマウス生体内でも血清と同様に、リボシルアデノシンとリン酸に分解されるが、生体内においてはその一部はリボシルイノシンに代謝されることが判った。また、それらの分解産物が尿中へも排泄されることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）を静注したマウスの血中のリボシルアデノシンのＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳの解析結果である。
【図２】32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）に代えて生理的食塩水を静注したコントロールマウスの血中のリボシルアデノシンのＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳの解析結果である。
【図３】32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）を静注したマウスの血中のリボシルイノシンのＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳの解析結果である。
【図４】32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）に代えて生理的食塩水を静注したコントロールマウスの血中のリボシルイノシンのＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳの解析結果である。
【図５】32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）を静注したマウスの尿中のリボシルアデノシンのＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳの解析結果である。
【図６】32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）に代えて生理的食塩水を静注したコントロールマウスの尿中のリボシルアデノシンのＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳの解析結果である。
【図７】32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）を静注したマウスの尿中のリボシルイノシンのＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳの解析結果である。
【図８】32Ｐ-ポリ（ＡＤＰ−リボース）に代えて生理的食塩水を静注したコントロールマウスの血中のリボシルイノシンのＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳの解析結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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