(57)【要約】      （修正有）【課題】病院内や老人施設、市中において問題となっているMSSA、MRSA、MR-CNSを簡便に迅速に診断できる製品を提供する。【解決手段】黄色ブドウ球菌検出用のfemA プライマーとメチシリン耐性検出用のmecAプライマーをLAMP法に適応することによって、迅速簡便にMSSA、MRSA、MR-CNSを区別可能にする。黄色ブドウ球菌検出用femAのプライマーは、特定の配列、メチシリン耐性検出用のmecAプライマーは特定の配列を使用する。MSSAはfemA (+),mecA (-)、MRSAはfemA(+),mecA(+)、MR-CNSはfemA (-),mecA (+)として検出できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、３及び４の４種のオリゴヌクレオチド又は配列番号１３、１４、１５及び１６の４種のオリゴヌクレオチド（ただし、任意のチミン（ｔ）はウラシル（ｕ）と置換されていてもよい）を遺伝子増幅反応プライマーとして用いるLoop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)法によるメチシリン耐性菌の検出法。
【請求項２】
配列番号５、６、７及び８の４種のオリゴヌクレオチド（ただし、任意のチミン（ｔ）はウラシル（ｕ）と置換されていてもよい）を遺伝子増幅反応プライマーとして用いることを特徴とするLAMP法による黄色ブドウ球菌の検出法。
【請求項３】
請求項１記載の配列番号１、２、３及び４の４種のオリゴヌクレオチド又は配列番号１３、１４、１５及び１６の４種のオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とするメチシリン耐性菌検出用キット。    
【請求項４】
請求項２記載の４種のオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする黄色ブドウ球菌検出用キット。
【請求項５】
配列番号１、２、３及び４の４種のオリゴヌクレオチド又は配列番号１３、１４、１５及び１６の４種のオリゴヌクレオチドと配列番号５、６、７及び８の４種のオリゴヌクレオチド（ただし、任意のチミン（ｔ）はウラシル（ｕ）と置換されていてもよい）を含有する黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）又はメチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（MR-CNS）の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、院内感染ばかりでなく老人医療センターや老人ホーム、介護施設から市中感染まで問題となっているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌とメチシリン感性黄色ブドウ球菌を迅速に判定区別するだけでなく、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌までも迅速に判定可能なプライマーとそれを含有するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、MRSA）は大病院ばかりか中小病院までをも汚染し、院内感染菌として感染患者ばかりでなく医療コストにも多大な悪影響を与えている。しかも、最近は老人病院、介護施設、老人ホームまでも汚染し、その汚染は市中までも拡大している。MRSA感染症の治療薬は限定されており、現在ではバンコマイシン、テイコプラニン、アルベカシンの3薬剤しかない。一般的に感染症が疑われた場合、その第一次選択薬はβ-ラクタム薬など投与されるが、これらの抗菌薬はMRSAに効果がない。そのため、MRSA感染者が重篤化する場合が認められる。これらの危険性を回避するためにも、検査検体からMRSAを迅速かつ正確に検出・同定することが必須であると考えられている。
【０００３】
MRSAの同定は、分離培養法によって黄色ブドウ球菌と同定し、その後、抗菌薬の感受性試験結果からMRSAと判断されていた。一方では、MRSA選択培地（黄色ブドウ球菌選択培地に抗菌薬が含有された培地）にて簡易に判定されていた。しかし、いずれの方法を用いても培養が必須であり、培養条件によってはMRSAであっても感受性と判定される不確実さが認められた。この不確実さにはMRSAの耐性発現が制御遺伝子（mecI，mecR1，blaI,blaR1）によって複雑に制御されていることも要因の一つであるため、本質的に培養法によるMRSAの検出には不確実さが伴う。
【０００４】
その問題を解決するためには、MRSAの耐性の本体であるmecA遺伝子の検出が考えられる。mecA遺伝子の検出方法はPolymarase chain reaction (PCR)法を用いて既に実用化されているが（特許文献１、非特許文献１）、PCRを行うためには高価なサーマルサークラーが必要であり、その検出に使用される試薬も高いため、幅広く使用されるには至っていない。
【特許文献１】特開平１１−５６３７１号
【非特許文献１】Ubukata,K.,et al. J. Clin. Microbiol.30,1728-1733, 1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（MSSA）、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（MR-CNS）を抵コストで迅速に簡便に判別する方法とキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するべく、本発明者等は安価で簡便な等温増幅方法として、栄研化学で開発されたLoop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法（T.Notomi et al. Nucleic Acid Research, 2000, vol28, No.12, e63）を用いることで高価な機器を必要とする上記問題の解決手段の一つとした。
【０００７】
しかし、LAMP法に使用されるプライマーは適合性が最大の問題であり、栄研化学で推奨しているソフトを使用したプライマー設計方法では適切なプライマーは得られなかった。そこで、独自に様々なプライマーを設計し、mecAの検出に適合するプライマーの設計を試みた。同時に、MRSAと同定するためには、mecA保有黄色ブドウ球菌と確定する必要があるため、黄色ブドウ球菌特異的な遺伝子を検索した。その結果、femAが妥当と判断した。femAはブドウ球菌が保有している遺伝子であるが（Unal S et al. J Clin Microbiol. 1992 Jul;30(7):1685-91.）、一部黄色ブドウ球菌特異的な領域があり、その領域に適合するプライマーの設計を試み、本発明に到達した。
【０００８】
即ち、本発明は以下のとおりである。
１．配列番号１、２、３及び４の４種のオリゴヌクレオチド又は配列番号１３、１４、１５及び１６の４種のオリゴヌクレオチド（ただし、任意のチミン（ｔ）はウラシル（ｕ）と置換されていてもよい）を遺伝子増幅反応プライマーとして用いるLoop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)法によるメチシリン耐性菌の検出法。
２．配列番号５、６、７及び８の４種のオリゴヌクレオチド（ただし、任意のチミン（ｔ）はウラシル（ｕ）と置換されていてもよい）を遺伝子増幅反応プライマーとして用いることを特徴とするLAMP法による黄色ブドウ球菌の検出法。
３．前記１項記載の配列番号１、２、３及び４の４種のオリゴヌクレオチド又は配列番号１３、１４、１５及び１６の４種のオリゴヌクレオチド各４種のオリゴヌクレオチドのいずれかを含有することを特徴とするメチシリン耐性菌検出用キット。
４．前記２項記載の４種のオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする黄色ブドウ球菌検出用キット。
５．配列番号１、２、３及び４の４種のオリゴヌクレオチド又は配列番号１３、１４、１５及び１６の４種のオリゴヌクレオチドと配列番号５、６、７及び８の４種のオリゴヌクレオチド（ただし、任意のチミン（ｔ）はウラシル（ｕ）と置換されていてもよい）を含有する黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）又はメチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（MR-CNS）の検出キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明者は、mecA及びfemA遺伝子をLAMP法で確実に増幅可能なプライマーの作成を試み、femAで特異的に黄色ブドウ球菌のみが反応するプライマーを見出した。さらにmecAではMRSAだけでなく、MR-CNSにも反応するプライマーを見出した。本発明は、LAMP法に使用可能な黄色ブドウ球菌特異的領域を含有するfemA検出プライマーとLAMP法に使用可能なmecA検出プライマーを提供するものであり、これらを単独、もしくは併用したキットを使用することで、MSSA、MRSA、MR-CNSを抵コストで迅速簡便に検出することができる。黄色ブドウ球菌特異的femAとメチシリン耐性に関与するmecAの両方が検出された場合はMRSAと確定診断でき、黄色ブドウ球菌特異的femAのみであれば感受性の黄色ブドウ球菌と確定できる。また、mecAのみであればMR-CNSと診断できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明で使用するLAMP法は、標的遺伝子の６箇所の領域に対して設定した４種類のプライマーおよび鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用し、このＤＮＡポリメラーゼのもつ鎖置換活性を利用することにより一定温度で増幅反応を行う方法で、検出までを１ステップで行うことができる。増幅メカニズムは、増幅サイクルの起点構造ができるまでの初期反応と増幅産物が連続して生成する増幅サイクルから成る。
【００１１】
本発明において使用する黄色ブドウ球菌を検出するfemAのプライマーは配列番号５〜８の４種であり、メチシリン耐性を検出するmecAのプライマーは配列番号１〜４の４種又は配列番号１３〜１６の４種である。これらのプライマーは人工合成品でもDNA自動合成機を用いて合成したものでも構わない。本発明のMRSAの検出法は、前記femAとmecAの個々に４種のプライマーを用いる以外は、通常のLAMP法に従って行われる。すなわち、検体に黄色ブドウ球菌検出用の４種類のfemAプライマーを、別にメチシリン耐性検出用の４種類のmecAプライマーを用いて、等温増幅によるLAMP法を行って増幅された遺伝子を検出する。
【００１２】
本発明の検出法における検体として、各種臨床検査材料、血液、膿汁、喀痰、髄液、皮膚、鼻腔、咽頭、糞便、尿など、もしくはそれらから得られた菌液、細菌コロニーなどを用いることができる。上記検体からの核酸抽出方法は、熱処理、酵素処理、物理的破壊などで行うことができ、得られた核酸抽出液をフェーノール処理やエタノール処理などの一般的な核酸精製方法で処理して使用することもできる。  
【００１３】
核酸増幅方法は基本的に栄研化学が開発したLAMP法に従う。即ち、4種類のプライマーを利用した核酸増幅反応を行う。本プライマーの場合、好ましくは63℃の等温で10分から1時間の反応を行う。
ＤＮＡ増幅の判定は、一般的に行われている電気泳動法、標識プローブとのハイブリダイゼーション法、DNA増幅時に産生されるピロリン酸とマグネシウムが結合して不溶性（ピロリン酸マグネシウム）となる性質を利用した目視法などで可能であるが、より簡便にＤＮＡ増幅の判定を行うには、識別可能な標識を施したプライマーを用いてＰＣＲやLAMP法などの核酸増幅反応を行い、標識された増幅ＤＮＡを固相に捕獲して識別する方法が有利であるが、いずれの方法も本検出方法に適用可能である。
【実施例】
【００１４】
以下、実施例で本発明を説明する。
参考例１
試験菌株は（1）Staphylococcus aureus  FDA 209P、（2）MRSA（臨床分離株）、（3）Staphylococcus  epidermidis（臨床分離株）、（4）MRSE（臨床分離株）、（5）Micrococcus  luteus  ATCC9341、（6）Streptococcus  pyogenes（臨床分離株）、（7）Streptococcus  pneumoniae（臨床分離株）、（8）Streptococcus  agalactiae（臨床分離株）の8株を用いた。Staphylococcus属はMuller Hinton寒天培地にて培養し、Streptococcus属は血液寒天培地に培養したコロニーを用いた。菌体のDNAは熱水処理による菌体破壊後、飽和フェノール/クロロホルムで簡易抽出した。本LAMP法に使用するプライマーの評価を行う目的で、従来法であるPCRによるfemAとmecAの確認も行った。PCR用のプライマーは、femAが配列番号９と１０、mecAが配列番号１１と１２ (PCR products 519bp)であり、AmpliTaq Gold（Applied Biosystems）にて増幅反応を行った。
【００１５】
PCR反応液は、抽出DNAを0.2μL（コントロールは滅菌蒸留水を添加）、各100pmol/μLのプライマーをそれぞれ0.2μL、5.0U/μLのAmpliTaq Gold（Applied Biosystems）を0.4μL、2mMdTNPmix(GeneAmp)を1.0μL、25ｍMMgCl2を3.0μL、10xPCR緩衝液(Applied Biosystems）を5.0μL、蒸留水を40.0μL添加した。サイクリング時間と温度設定は、femA用が、95℃で12分間加温後、 (94℃,30sec.→52℃,1min.→70℃,1min.)×40サイクルし、70℃で10分間処理した。mecA用は95℃で12分間加温後、(94℃,30sec.→52℃, 1min.→70℃,1min.)×40サイクルし、70℃で10分間処理した。サーマルサイクラーはGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)を使用した。反応結果は電気泳動にて確認した。つまり、反応終了後、反応液8.0μLを分取し3.0μLのブロムフェノールブルーを添加・混和し、Tris(hydroxymethyl)aminomethane-酢酸- Disodium EDTA(pH8.0) bufferで作成した2%アガロースゲルに各サンプルを8μLずつと2μL のDNA ladderをロード後、Tris(hydroxymethyl)aminomethane-酢酸- Disodium EDTA(pH8.0)buffer中で100Vの電圧をかけて35分間電気泳動を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルを1.0μg/mLのエチジュームブロマイドに20分間浸漬後、精製水に10分間浸漬した。バンドはUVランプで確認した。表1にまとめた結果を、図１に電気泳動結果を示す。femAは（1）と（2）の黄色ブドウ球菌のみで検出され、mecAは（2）、（4）、（5）のメチシリン耐性ブドウ球菌で検出された。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
実施例１
試験菌とDNA抽出方法と試験菌は参考例１に順ずる。LAMP法のfemAのプライマーは、配列番号５(f-1)と配列番号６(f-2)及び配列番号７ (f-3)と配列番号８ (f-4)である。
また、メチシリン耐性を検出するmecAのプライマーは、配列番号１(m-1)と配列番号２ (m-2)及び配列番号３ (m-3)と配列番号４(m-4)を使用した。
LAMP反応液は、抽出DNAを1.0μL（コントロールは滅菌蒸留水を添加）、各100pmol/μLのプライマーを、f-1，f-2およびm-1，m-2は各々0.05μＬ、f-3，f-4およびm-3，m-4は各々0.4μＬ、8.0U/μLのBst DNA Polymeraseを1μＬそれぞれ添加して核酸増幅反応を行った。反応液は上記プライマーと酵素以外に、20mM Tris HCl(pH8.8) 、10mM KCl、8mM MgSO4、10mM (NH4)2SO4、0.1%Tween20、0.8M Betaine、1.4mM each of dNTPsが全量25μLの反応液中に含有されている。反応液を63℃で60分間加温後、82℃で2分間処理して酵素を失活させた。反応結果は参考例１に準じ、電気泳動にて確認した。表２にまとめた結果を、図２-１と図２−２に電気泳動結果を示す。femAは黄色ブドウ球菌である（1）Staphyloccocus aureus  FDA 209P と（2）MRSA92-1191で検出されたが、黄色ブドウ球菌以外の細菌、特に近縁であるCNSにおいても検出されず、その高い特異性が証明された。また、メチシリン耐性を担うmecAは全てのメチシリン耐性ブドウ球菌（2）MRSA92-1191、（4）MRSE-001、（5）MRSE-002で検出されたが、mecAを保有しないβ-ラクタム薬に感受性の細菌では検出されなかった。これによって、mecAプライマーの高い特異性が証明されたことになる。
【００１８】
【表２】
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【００１９】
実施例２
それぞれ参考例１と実施例１の条件にて、42株のメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（MSSA）と47株のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌について、PCR法とLAMP法での反応性を検討した。コントロールとして、標準株であるメチシリン感性黄色ブドウ球菌（S. aureus）FDA209P  株とメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）92-1191株を使用した。結果のまとめを表3に示す。
PCR法とLAMP法ともに全ての臨床分離株で一致した結果が得られた。つまり、femAはメチシリンの感受性に関係なく全ての黄色ブドウ球菌で陽性であった。また、mecAは全てのメチシリン感受性ブドウ球菌で陰性であり、メチシリン耐性ブドウ球菌で陽性を示した。新規に開発したLAMP法に使用可能なfemAとmecAの各々4種類のprimerの優れた特性は上記実施例から証明され、本発明を完成するに至った。
【００２０】
【表３】
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【００２１】
実施例３
メチシリン耐性を検出するmecAのプライマーとして、配列番号１３と配列番号１４及び配列番号１５と配列番号１６を使用した以外は実施例１と全く同様にして、LAMP法により、mecAの検出を行った。結果は、実施例１の場合と同様、メチシリン耐性を担うmecAは全てのメチシリン耐性ブドウ球菌で検出されたが、mecAを保有しないβ-ラクタム薬に感受性の細菌では検出されなかった。
【００２２】
実施例４
メチシリン耐性を検出するmecAのプライマーとして、配列番号１３と配列番号１４及び配列番号１５と配列番号１６を使用した以外は実施例２と全く同様にして、42株のメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（MSSA）と47株のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌について、LAMP法での反応性を検討した。
結果は、実施例２と同様、mecAは全てのメチシリン感受性ブドウ球菌で陰性であり、メチシリン耐性ブドウ球菌で陽性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明のfemAとmecA検出プライマーをLAMP法に適応することによって、短時間でサーマルサイクラー等の高価な機器を使用しない状態でMSSA、MRSA、MR-CNSの区別が可能となる。MRSAは院内感染菌として依然問題となっているが、最近では市中からも分離されるようになり、開業医レベルでの診断が要求されるようになってきている。さらに、老人施設、介護施設、保育園、幼稚園などにおいても集団発生が報告されるようになってきており、その蔓延防止と対応には開業医レベルや細菌検査の専門家でない方が使用可能な簡便で迅速な判別キットが要望されている。これらの要望に応えることを目的として、本発明のMSSA、MRSA、MR-CNSの迅速診断方法が開発された。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】従来法であるPCRによるfemAとmecAの確認の結果を表した電気泳動写真である。
【図２】本発明の方法であるLAMP法によるfemAとmecAの確認の結果を表した電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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