(57)【要約】      （修正有）【課題】ヘッジホッグの「Ｎ」及び「Ｃ」断片、またＮ-末端及びＣ-末端断片とそれぞれ指称される２つの新規なポリペプチドを提供する。【解決手段】ヘッジホッグの「Ｎ」及び「Ｃ」断片、またＮ-末端及びＣ-末端断片とそれぞれ指称される２つの新規なポリペプチドであり、これらは天然タンパク質の自己タンパク質分解ドメインにより認識されるＧ↓ＣＦ部位（ＧとＣＦの切断部位）における特異的な開裂の後に得られるものである。Ｎ及びＣ断片の使用方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
新規ヘッジホグ由来ポリペプチド
発明の背景 
１．発明の分野 
本発明は、一般に、タンパク質プロセシングおよびタンパク質シグナル伝達（signalling）経路の分野、特に、共通のヘッジホグ（hedgehog）タンパク質前駆体に由来する異なる活性を有する２つの新規タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術の記載 
発生学者は、長い間、脊椎動物胚中のある構造が周辺組織にパターンを課すという著しい能力を明らかにする実験操作を行ってきた。通常、これらのパターン形成作用の根拠をなすメカニズムについての考察は、パターン形成されている組織から適当な応答を誘発させるシグナル伝達分子の分泌に集中している。かかるシグナル伝達分子の同定を目的としたより最近の研究は、少数の遺伝子ファミリーの個々のメンバーによりコードされる分泌タンパク質に関連している。パターン形成活性に大きな影響を及ぼしうるそのような１つのタンパク質ファミリーは、ヘッジホグ遺伝子ファミリーによりコードされるタンパク質である。
【０００３】
ヘッジホグ（ｈｈ）遺伝子は、最初、それがショウジョウバエの正常な体節パターン形成に必要であることに基づいて同定されたそれがショウジョウバエの正常な体節パターン形成に必要であることに基づいて同定された（非特許文献１）。その機能は、初期胚体節内の隣接細胞の独自性（identities）を協調させるための局所的シグナル伝達（非特許文献２）、および多数の細胞径を越えて伸長するクチクラパターン形成におけるその後の機能（非特許文献３）を含む。また、ｈｈ遺伝子は、付属肢および眼を含む成体構造の成虫前駆体のパターン形成において機能する(非特許文献４〜８)。ヘッジホグタンパク質が分泌され、細胞外シグナル伝達において機能することは、遺伝的および分子的な証拠により示されている(非特許文献４および９〜１０)。
【０００４】
脊椎動物では、ｈｈ相同染色体によりコードされる活性は、肢の前方／後方パターン形成（非特許文献１１および１２）および神経管の背側／腹側パターン形成（非特許文献１３〜１５）に関連している。
【０００５】
脊椎動物腹側中脳は、ニューロンの変性または異常機能がパーキンソン病、精神分裂病などのいくつかの疾患につながるようなニューロンを含有する。運動ニューロンは脊椎動物中脳中の底板に近接して発生することが知られている。線条への中脳投射は自発運動の制御に関与しており（非特許文献１６）、これらのニューロンの喪失はパーキンソン病の運動障害を引き起こす（非特許文献１７）。辺縁系構造および皮質を神経支配する中脳ドーパミン作動性ニューロンは、それぞれ情動行動および認知行動に影響を及ぼし、これらのニューロンの異常機能は、精神分裂病および薬物嗜癖に関連している（非特許文献１８）。
【０００６】
ニューロン細胞の運命を特定する因子の分子的性質は確立されていないが、これらのトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）（非特許文献１９）またはヘッジホグタンパク質ファミリー（非特許文献２０）のメンバーは、細胞運命の特定に関与し、組織間の誘導相互作用を媒介し、多くの場合、わずか数個の細胞径だけ離れて作用するため、かかる因子から予想される性質を有するかもしれない。
【非特許文献１】Nusslein-Volhard, C.およびWieschaus, E, Nature 287:795-801,1980）
【非特許文献２】Hooper, J.E.,およびScott,M.P．Early Embryonic Development of Animals，pp.1-48，1992
【非特許文献３】Heernskerk,J.およびDiNardo,S.，Cell.76:449-460,1994
【非特許文献４】Mohler,J.，Genetics,120:1061-1072,1988
【非特許文献５】Maら，Cell，75:927-938,1993
【非特許文献６】Heberleinら，Cell，75:913-926,1993
【非特許文献７】Tabata,T.およびKornberg,T.D.，Cell,76:89-102,1992
【非特許文献８】Basler,K.およびStruhl,G.，Nature,368:208-214,1994
【非特許文献９】Leeら，Cell,71:33-50,1992
【非特許文献１０】Taylorら，Mech.Dev., 42:89-96,1993
【非特許文献１１】Riddleら，Cell,75:1401-1416,1993
【非特許文献１２】Changら，Development，120:3339,1994
【非特許文献１３】Echelardら，Cell，75:1417-1430,1993
【非特許文献１４】Kraussら，Cell，75:1431-1444,1993
【非特許文献１５】Roelinkら，Cell，76:761-775,1994
【非特許文献１６】BjorklundおよびLindvall，In: Handbook of Chemical Neuroanatomy，Borklundら編，Amsterdam: Elsevier，pp 55-122,1984
【非特許文献１７】Hirschら，Nature，334:345,1988
【非特許文献１８】Seemanら，Nature，365:441,1993
【非特許文献１９】Lyonsら，Trends in Genetics，7:408,1991
【非特許文献２０】Smith,J.C., Cell，76:193,1994
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、これらの遺伝子によりコードされるｈｈ活性が、発生中の眼の初期パターン形成および脳のパターン形成において極めて重要な役割を果たしていることを証明するものである。本発明は、ヘッジホグタンパク質生成物の内部切断が完全機能のために決定的に重要であり、この自己タンパク質分解切断の２つの新規生成物が識別可能な活性を示すことを最初に示すものであり、したがって、ｈｈシグナル伝達活性が、共通のｈｈタンパク質前駆体に由来する２つの別個のシグナル伝達タンパク質の複合作用であることを示すものである。そうすることにおいて、本発明は、ニューロンの変性または異常機能から生じる障害を提起するために、所望のニューロン細胞型の特異的パターン形成および増殖のための手段を提供する。
発明の概要
本発明は、ヘッジホグタンパク質が、異なる機能的および構造的性質を有する２つの別個のタンパク質を生じる自己タンパク質分解切断を受けるという、発展性のある知見に基づく。それぞれヘッジホグの「Ｎ」および「Ｃ」断片、またはＮ末端およびＣ末端断片と称されるその２つのポリペプチドは、該天然タンパク質中の自己タンパク質分解ドメインにより認識されるＧ↓ＣＦ部位での特異的切断の後に生成する。
【０００８】
したがって、１つの実施態様では、本発明は、ヘッジホグタンパク質のアミノ末端アミノ酸に由来するアミノ酸配列を有し、そのカルボキシ末端に、天然ヘッジホグポリペプチドのカルボキシ末端断片のタンパク質分解活性により特異的に認識されるＧ↓ＣＦ切断部位を有することを特徴とする、実質的に純粋なポリペプチドを提供する。
【０００９】
もう１つの実施態様では、本発明は、ヘッジホグタンパク質のカルボキシ末端アミノ酸に由来するアミノ酸配列を有し、そのアミノ末端に、天然ヘッジホグポリペプチドのカルボキシ末端断片のタンパク質分解活性により特異的に認識されるＧ↓ＣＦ切断部位を有することを特徴とする、実質的に純粋なポリペプチドを提供する。
【００１０】
また、本発明は、ニューロン細胞をヘッジホグポリペプチドと接触させることを含んでなる、ニューロン細胞の増殖または分化をモジュレーションする方法を提供する。該天然ヘッジホグタンパク質、該ＮまたはＣ断片、またはそれに由来する機能的断片は、実質的に底板ニューロン細胞に由来するニューロン細胞の増殖または分化の誘導に最も有用である。
発明の詳細な記載 
本発明は、共に異なる構造的および機能的特徴を有する、もともと単一の前駆体タンパク質に由来する２つの新規ポリペプチドを提供する。該タンパク質は、ヘッジホグタンパク質に由来し、完全長ヘッジホグタンパク質の自己タンパク質分解切断により天然で生成されうる。ヘッジホグ前駆体タンパク質およびヘッジホグ前駆体タンパク質の自己タンパク質分解生成物が神経管および脊索の腹側中線の底板中で発現されることを示す本明細書中で提供する証拠に基づき、本発明は、底板および脊索に結合または近接したニューロン細胞の増殖または分化の誘導方法を提供する。
【００１１】
第１の実施態様では、本発明は、ヘッジホグタンパク質のアミノ末端アミノ酸に由来するアミノ酸配列を有し、そのカルボキシ末端に、天然ヘッジホグポリペプチドのカルボキシ末端断片のタンパク質分解活性により特異的に認識されるグリシン−システイン−フェニルアラニン（Ｇ↓ＣＦ）切断部位を有することを特徴とする、実質的に純粋なポリペプチドを提供する。本明細書中、この断片をＮ末端断片もしくはポリペプチドまたは「Ｎ」と称する。例えば、ショウジョウバエヘッジホグの場合、該Ｎ断片はヘッジホグタンパク質のアミノ酸１〜２５７を含み、そのアミノ酸８５〜２５７は非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約１９kDの分子量を有する（アミノ酸残基の番号１〜２５７は、シグナル配列などの非構造的特徴を含む）。ショウジョウバエヘッジホグ前駆体中のＧ↓ＣＦ切断部位は、アミノ酸残基２５７〜２５９に見いだされる。当業者であれば、他のヘッジホグ遺伝子中のＧ↓ＣＦ切断部位を同定することができるであろう。なぜなら、該アミノ酸位置が同様であり、該部位は対応するＣ断片の自己タンパク質分解活性により特異的に認識されるからである。
【００１２】
また、該Ｎ末端ポリペプチドは、該ポリペプチドをin vitroで発現する細胞中で細胞結合していること、および例えば脊椎動物またはショウジョウバエの細胞または胚中に特異的に局在化していることにより特徴づけられる。すなわち、ヘッジホグのこのＮ末端断片は、細胞合成部位に近接したままである。Ｎと該細胞との結合は、該アミノ末端ドメインの親油性修飾を含むプロセシング事象の結果である。（図１Ｅを参照されたし）この修飾は、該カルボキシ末端ドメインの作用により開始し、チオエステル中間体を生成する。したがって、該カルボキシ末端ドメインは、単純にプロテアーゼとして作用するのではない（尤も、最終的には、ペプチド結合の切断はその作用から生じるのではあるが）。さらに、該Ｎ断片はin vitroでヘパリンアガロースに結合する。
【００１３】
本発明のＮポリペプチドは、ヘッジホグタンパク質のアミノ末端アミノ酸に由来するアミノ酸配列（例えばショウジョウバエでは１〜２５７であり、アミノ酸１〜２５７は非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約１９kDの分子量を有する）を有することにより特徴づけられる。該Ｎポリペプチドは、完全長Ｎの機能的特徴（例、ヘパリンへの結合）を保持するより小さい断片を含む。Ｎの起源となるヘッジホグタンパク質には、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、マウスおよびヒトが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
結晶学的分析は、ＳＨＨ−Ｎの構造に亜鉛イオンの存在が含まれることを示す。
【００１５】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、亜鉛イオンの存在は亜鉛加水分解酵素活性を示唆する。亜鉛加水分解酵素には、カルボキシペプチダーゼＡ、サーモリシンなどのプロテアーゼ、ホスホリパーゼＣなどのリパーゼ、カルボニックアンヒドラーゼなどの他の酵素が含まれる。該アミノ末端シグナル伝達ドメインの亜鉛加水分解酵素部位の改変は、ヘッジホグタンパク質の拡散の範囲をモジュレーションしたり、あるいは該アミノ末端シグナル伝達ドメインのシグナル伝達特性を改変するのに有用であるかもしれない。例えば、該亜鉛加水分解酵素部位中の突然変異により、通常はある程度離れた位置から分泌される束縛された（tethered）タンパク質が生じるかもしれない。その結果、典型的には誘導されない細胞型が誘導されることとなる。該亜鉛部位中の改変により、底板でなく運動ニューロンを誘導する（逆もありうる）能力を有する分子が生じるかもしれない。
【００１６】
Ｎの細胞表面または細胞外マトリックス局在および脊索および底板結合細胞中でのその発現を同定することにより、Ｎを発現する細胞の単離または特異的選択（例えば、脊索サンプルの単離または底板細胞の単離）のための手段が提供される。さらに、Ｎに対する抗体は、Ｎタンパク質を発現する疑いのある組織の組織学的分析に有用である。
また、本発明は、ヘッジホグタンパク質のカルボキシ末端アミノ酸に由来するアミノ酸配列を有し、そのアミノ末端に、天然ヘッジホグポリペプチドのカルボキシ末端断片のタンパク質分解活性により特異的に認識されるＧ↓ＣＦ切断部位を有することを特徴とする、実質的に純粋なポリペプチドを提供する。本明細書中、この断片をＣ末端断片もしくはポリペプチドまたは「Ｃ」と称する。例えば、ショウジョウバエでは、この「Ｃ」ポリペプチドは、アミノ酸残基２５８から始まるヘッジホグ前駆体タンパク質のＣ末端ドメインに由来し、ここで該完全長Ｃ末端ドメインは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２５kDの分子量を有し、７２位にヒスチジン残基を有し、プロテアーゼ活性を有する。該天然ヘッジホグポリペプチドのカルボキシ末端断片のタンパク質分解活性により特異的に認識されるＧ↓ＣＦ切断部位は、アミノ酸残基２５７〜２５９に位置する。該Ｎ断片に関して既に記載したとおり、本発明はヘッジホグの自己タンパク質分解ドメインの正確な切断認識部位を示しているため、当業者は他のヘッジホグタンパク質中の切断部位を容易に認識でき、それにより、いずれのヘッジホグ前駆体タンパク質のいずれのＮまたはＣポリペプチドも容易に同定できる。
【００１７】
本発明の「Ｃ」ポリペプチドは、ＧＣＦアミノ酸配列で同定される自己タンパク質分解切断部位（これはショウジョウバエではアミノ酸２５７〜２５９に対応する）から始まる、ヘッジホグ前駆体タンパク質のＣ末端に由来する。ショウジョウバエでは、該天然ヘッジホグタンパク質のアミノ酸残基３２９および該Ｃポリペプチドのアミノ酸残基７２で非変異的に見いだされるヒスチジン残基は、アミノ酸２５７と２５８（ＧおよびＣ）との間の自己タンパク質分解切断に必須である。同様に、本発明の対応するＣ−ポリペプチドは、例えばショウジョウバエＣ−ポリペプチドと比較することにより容易に同定できる同様に位置するヒスチジン残基を含有する。種々の種において、該タンパク質分解ドメインは、アミノ酸配列-XTXXHLXX-により特徴づけることができる。
【００１８】
本発明のＣポリペプチドは、Ｎとは異なり、ヘパリンアガロースに有意に結合しない。Ｃは、Ｃポリペプチドをin vitroで発現する細胞の培養上清中に遊離されること、および細胞および胚中に拡散して局在化することにより特徴づけられる。Ｃポリペプチドは自由に拡散するため、それは対象の種々の体液および組織中で検出可能であろう。本明細書中に記載するとおり、神経管の中線付近のＣポリペプチド発現の同定により、例えば胚／胎児における神経管閉鎖のための有用なアッセイが提供される。羊水中のＣポリペプチドの存在は、神経管が奇形を起こしている障害の診断となる。
【００１９】
脳脊髄液中のＣポリペプチドレベルの変化は、例えば神経変性障害を示しうる。
【００２０】
Ｃポリペプチドは天然ヘッジホグ前駆体ポリペプチドの合成および自己タンパク質分解の後で該細胞から遊離されるため、高レベルのＣポリペプチドを合成し遊離する腫瘍の正確な位置を前もって知ることなく、該腫瘍が検出可能となる。
【００２１】
Ｃ断片は、脳下垂体および前脳の遺伝子を誘導するのに有効である。特に、誘導は、成長因子のＴＧＦ−βファミリーのメンバーを加えることにより増強される。例えば、ヒトアクチビンをＣ断片と組み合わせると、脳下垂体細胞の成長および活性または発生の強化に有効であるかもしれない。
【００２２】
Ｃ断片は、Ｎを阻害することにより脳の後方標識を誘導するのに有効である。
【００２３】
かかる断片は、実施例１８でΔＮ−Ｃとして例示される。したがって、もう１つの実施態様では、本発明は、Ｘ−ｂｈｈのアミノ酸残基２８〜１９４を欠失しているポリペプチドを含む。（自己タンパク質分解により、１９８〜４０９のＣドメイン、およびaa２４〜２７および１９５〜１９７をあらわす７アミノ酸のペプチドが得られる）。このポリペプチドは、外植片中のＸ−ｂｈｈおよびＮの活性を遮断し、胚中の腹側前方構造を減少させる。また、ΔＮ−Ｃをコードするポリヌクレオチド配列も含まれる。ΔＮ−Ｃは、後方神経標識（例、Ｅｎ−２、Ｋｒｏｘ−２０、Ｘｌｔｔｂｏｘ−６）の発現を増加させ、前方神経標識（例、ＸＡＮＦ−２、ＸＡＧ−１、Ｏｔｘ−Ａ）の発現を減少させるのに有用である（ただし、神経パターン形成をモジュレーションするためにそうすることが望ましい場合である）。
【００２４】
本明細書中で用いる「実質的に純粋」なる語は、ヘッジホグＮまたはＣポリペプチドに天然に結合している他のタンパク質、脂質、炭水化物、核酸または他の物質を実質的に含まないヘッジホグＮまたはＣポリペプチドを意味する。当業者であれば、タンパク質精製のための標準的な技術を用いてヘッジホグＮまたはＣポリペプチドを精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上に単一の主要バンドを与える。また、ヘッジホグＮまたはＣポリペプチドの純度は、アミノ末端アミノ酸配列分析により判定することができる。
【００２５】
本発明は、機能的ＮまたはＣポリペプチドおよびその機能的断片を含む。本明細書中で用いる「機能的ポリペプチド」または「機能的断片」なる語は、一定の機能的アッセイにより同定され、該細胞中の特定の生物的、形態的または表現型改変に関連している生物学的機能または活性を有するポリペプチドを意味する。
【００２６】
ヘッジホグＮまたはＣポリペプチドの機能的断片には、Ｃポリペプチドの活性（例、タンパク質分解活性）が維持される限り、ＮまたはＣポリペプチドの断片が含まれる。したがって、本発明には、ＮまたはＣポリペプチドの生物学的活性を含有するより小さいペプチドが含まれる。該生物学的機能は、例えば、抗体分子が結合しうるエピトープと同程度に小さいポリペプチド断片から、細胞内での表現型変化の特徴的な誘導やプログラミングに関与する能力を有する大きなポリペプチドまで様々に変化しうる。「機能的ポリヌクレオチド」は、本明細書中に記載する機能的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００２７】
該ＮまたはＣポリペプチドの一次アミノ酸配列の小さな修飾により、本明細書中に記載するＮまたはＣポリペプチドと実質的に同等の活性を有するポリペプチドが得られるかもしれない。かかる修飾は、部位特異的突然変異誘発などによる意図的なものであってもよいし、あるいは自発的なものであってもよい。これらの修飾により製造されるポリペプチドはすべて、例えばＣポリペプチドのタンパク質分解活性が存在する限り、本発明に含まれる。さらに、１以上のアミノ酸の欠失によっても、その活性を有意に改変することなく、得られる分子の構造を修飾できる。これは、より広範な有用性を有する、より小さな活性分子の発生につながり得る。例えば、ＮまたはＣポリペプチド活性に必要でないと考えられるアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸を除去することが可能である。
【００２８】
また、本発明のＮまたはＣポリペプチドは、該ポリペプチド配列の保存的変異を含む。本明細書中で用いる「保存的変異」なる語は、あるアミノ酸残基を別のの生物学的に類似した残基で置換することを意味する。保存的変異としては、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニンなどの疎水性残基の１つを別のものに置換すること、あるいは、１の極性残基を別のものに置換すること、例えば、リシンからアルギニンへの置換、アスパラギン酸からグルタミン酸への置換、アスパラギンからグルタミンへの置換などが挙げられる。また、「保存的変異」には、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することが含まれる（ただし、該置換ポリペプチドに対して産生される抗体が該非置換ポリペプチドと免疫反応する場合に限られる）。
【００２９】
本発明のＮ断片は、該ポリペプチドの活性形態および非切断シグナル配列を含むＮ断片の両方を含む。例えば、シグナル配列が内部（ほぼアミノ酸６０〜８０の位置）にあるショウジョウバエでは、開始メチオニンから始まる全非切断Ｎ断片が本発明に含まれる。当業者は、例えばvon Heijne,G.，Nucl．Acids Res．14:4683(1986)に記載されているアルゴリズムを用いることにより、該シグナル配列の性質および位置を容易に確かめることができる。
【００３０】
また本発明は、本発明のＮまたはＣポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列より本質的になる、単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。本明細書中で用いる「単離された」なる語は、ポリヌクレオチドに天然で結合している他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を実質的に含まない該ポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチド配列は、ＮまたはＣポリペプチドをコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む。ＮまたはＣポリペプチドの全部または一部をコードするすべてのポリヌクレオチドも、それらがＮまたはＣポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードする限り、本発明に含まれると理解される。かかるポリヌクレオチドには、天然に存在する、合成された、および意図的に操作されたポリヌクレオチドが含まれる。例えば、ＮまたはＣポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発に付してもよい。ＮまたはＣポリペプチドのポリヌクレオチド配列には、アンチセンス配列も含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、遺伝暗号の結果として縮重している配列が含まれる。２０個の天然アミノ酸があり、そのほとんどが２以上のコドンにより特定される。したがって、すべての縮重ヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列によりコードされるＮまたはＣポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に不変である限り、本発明に含まれる。さらに、本発明は、ＮまたはＣのアミノ酸配列を有し、ＮまたはＣポリペプチドと免疫反応性の抗体に対する少なくとも１つのエピトープを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列より本質的になるポリヌクレオチドも含む。
【００３１】
ＮまたはＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、完全ポリペプチドまたはその断片、およびその配列に相補的な核酸配列が含まれる。相補的配列には、アンチセンスヌクレオチドが含まれていてもよい。該配列がＲＮＡの場合には、デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ、リボヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＵで置換される。本発明には、生理学的条件下で該タンパク質をコードするＤＮＡと選択的にハイブリッド形成するのを許容するのに十分な少なくとも１５塩基長の前記核酸配列の断片も含まれる。好ましくは、該断片は、緊縮条件下でハイブリッド形成する。
【００３２】
本発明のＤＮＡ配列は、いくつかの方法により得ることができる。例えば、該ＤＮＡは、当該分野でよく知られているハイブリッド形成技術を用いて単離することができる。これらは、１）相同ヌクレオチド配列を検出するためのプローブとのゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのハイブリッド形成、２）共有された構造的特徴を有するクローン化ＤＮＡ断片を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング、および３）オリゴヌクレオチドプライマーを用いる所望のヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
本発明のヘッジホグ、ＮまたはＣポリヌクレオチドは、好ましくは哺乳動物生物由来、最も好ましくはヒト由来である。核酸ハイブリッド形成に基づくスクリーニング法により、いずれかの生物からのいずれかの遺伝子配列の単離が可能となる（ただし、適当なプローブが入手可能である場合に限られる）。問題のタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、化学的に合成することができる。このためには、アミノ酸配列の短いオリゴペプチド伸長が公知でなければならない。該タンパク質をコードするＤＮＡ配列は遺伝暗号から推定できるが、暗号の縮重を考慮しなければならない。該配列が縮重している場合には、混合付加反応を行うことが可能である。これは、変性二本鎖ＤＮＡの異種混合物を含む。かかるスクリーニングでは、ハイブリッド形成は、好ましくは、一本鎖ＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡのいずれかの上で行う。ハイブリッド形成は、関心あるポリペプチドに関係するｍＲＮＡ配列が非常に少量でしか存在しない起源に由来するｃＤＮＡクローンの検出に特に有用である。すなわち、非特異的結合を避けることを意図された緊縮ハイブリッド形成条件を用いることにより、例えば、標的ＤＮＡを、混合物中のその完全相補体である単一プローブに対してハイブリッド形成させることによる特定のｃＤＮＡクローンのオートラジオグラフィー的可視化を行うことが可能である（Wallaceら，Nucl．Acid Res.,9:879,1981）。
【００３４】
また、１）ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離、２）関心あるポリペプチドに必要なコドンを得るためのＤＮＡ配列の化学的製造、および３）真核供与細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のin vitro合成により、ヘッジホグをコードする特定のＤＮＡ配列を発生させることができる。
後者の場合、結局は、一般にｃＤＮＡと称される、ｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補体が生成する。
【００３５】
組換え法で使用する特定のＤＮＡ配列を発生させるための前記３つ方法のうち、ゲノムＤＮＡ単離物の単離は最も一般的でない。このことは、イントロンの存在により哺乳動物のポリペプチドの微生物発現を得たい場合に特に当てはまる。
【００３６】
ＤＮＡ配列の合成は、所望のポリペプチド生成物のアミノ酸残基の全配列が公知である場合にしばしば選択する方法である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が公知でない場合には、ＤＮＡ配列の直接合成は不可能であり、選択すべき方法はｃＤＮＡ配列の合成である。関心あるｃＤＮＡ配列を単離するための標準的な方法としては、高レベルの遺伝子発現を有する供与細胞中に豊富に存在するｍＲＮＡの逆転写に由来するプラスミド−またはファージ−保持ｃＤＮＡライブラリーの形成が挙げられる。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組み合わせて用いる場合には、希有発現産物でさえもクローニングされ得る。該ポリペプチドのアミノ酸配列の有意部分が公知である場合には、標的ｃＤＮＡ中に推定上存在する配列を複製する標識された一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ配列の生成を、一本鎖形態に変性したｃＤＮＡのクローン化コピー上で行うＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成法において用いてもよい（Jayら，Nucl．Acid Res.,11:2325,1983）。
【００３７】
ゲノムＤＮＡを得るための好ましい方法としては、例えば、ＤＮＡの特定のセグメントが特異的に複製される核酸合成のin vitro法に基づくポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。増幅しようとするＤＮＡ断片に隣接する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、該ＤＮＡの熱変性、相補的配列に対する該プライマーのアニーリングおよびＤＮＡポリメラーゼによる該アニーリング化プライマーの伸長の反復サイクルで使用する。これらのプライマーは標的配列の反対の鎖にハイブリッド形成し、該プライマーの間の領域を越えて該ポリメラーゼによるＤＮＡ合成が進行するように配向させる。また、該伸長生成物自体がプライマーに相補的でありプライマーに結合する能力を有するため、増幅の連続サイクルにより、前サイクルで合成された標的ＤＮＡ量に対して実質的に倍増する。その結果、該特異的標的断片の指数関数的な蓄積（約２n倍；ｎは行った増幅サイクル数である）が生じる（出典明示により本明細書の一部とするPCR Protocols，Innisら編，Academic Press，Inc.，1990を参照されたし）。
【００３８】
ヘッジホグ、ＮまたはＣに特異的な抗体を使用して、少なくとも１つのエピトープを有するヘッジホグ、ＮまたはＣポリペプチドについて、λgt11などのｃＤＮＡ発現ライブラリーを間接的にスクリーニングすることができる。かかる抗体は、ポリクローナル的またはモノクローナル的に誘導でき、所望のヘッジホグｃＤＮＡの存在を示す発現生成物を検出するのに使用できる。
【００３９】
また、ヘッジホグ、ＮまたはＣのポリヌクレオチド配列は、ヘッジホグ、ＮまたはＣをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列（アンチセンス配列）を含む。アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部が相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子である（Weintraub，Scientific American，262:40,1990）。
【００４０】
本発明は、ヘッジホグ、ＮまたはＣポリヌクレオチドの生成を阻害する能力を有するすべてのアンチセンスポリヌクレオチドを含む。該細胞中で、該アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡとハイブリッド形成し、二本鎖分子を形成する。
【００４１】
該細胞は二本鎖のｍＲＮＡを翻訳しないため、該アンチセンス核酸はｍＲＮＡの翻訳を阻害する。約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーは容易に合成され、標的ヘッジホグ、ＮまたはＣ産生細胞中に導入された場合に、より大きな分子に比べて問題を起こす可能性が低いため、好ましい。遺伝子の翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用は、当該分野でよく知られている（Marcus-Sakura，Anal．Biochem.,172:289,1988）。例えば、ヘッジホグ、ＮまたはＣにより仲介される、ある腫瘍などの細胞増殖性障害の抑制においては、標的ヌクレオチドの阻害が望ましい。
【００４２】
さらに、ヘッジホグ、ＮまたはＣのリボザイムヌクレオチド配列も本発明に含まれる。リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似した様態で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾により、ＲＮＡ分子中の特異的ヌクレオチド配列を認識しそれを切断する分子を操作することが可能である（Cech，J．Amer．Med．Assn.,260:3030,1988）。このアプローチの大きな利点は、それが配列特異的であるため、特定の配列を有するｍＲＮＡのみが不活性化されることである。
【００４３】
リボザイムには２つの基本型、すなわちテトラヒメナ型（Hasslhoff，Nature,334:585,1988）および「ハンマーヘッド（hammerhead）」型がある。テトラヒメナ型リボザイムは４塩基長の配列を認識し、一方、「ハンマーヘッド」型リボザイムは１１〜１８塩基長の塩基配列を認識する。認識配列が長ければ長いほど、配列が専ら標的ｍＲＮＡ種中にのみ見いだされる可能性は高くなる。その結果、特異的ｍＲＮＡ種を不活性化するためには、テトラヒメナ型リボザイムよりハンマーヘッド型リボザイムが好ましく、１８塩基認識配列がそれより短い認識配列より好ましい。
【００４４】
ヘッジホグ、ＮまたはＣをコードするＤＮＡ配列は、適当な宿主細胞中へのＤＮＡ転移によりin vitroで発現させることができる。「宿主細胞」は、中でベクターが増殖でき、そのＤＮＡが発現され得る細胞である。その語は、該対象宿主細胞のいずれかの子孫も含む。複製中に生じる突然変異がありうるため、すべての子孫が親細胞と同一とは限らないと理解される。しかしながら、「宿主細胞」を用いる場合には、かかる子孫が含まれる。外来ＤＮＡを該宿主中に連続的に維持させることを意味する安定な転移方法は、当該分野で公知である。
【００４５】
本発明では、ヘッジホグ、ＮまたはＣポリヌクレオチド配列を組換え発現ベクター中に挿入してもよい。「組換え発現ベクター」なる語は、ヘッジホグ、ＮまたはＣ遺伝子配列の挿入または取り込みにより操作されている、当該分野で公知のプラスミド、ウイルスまたは他の伝達体を意味する。かかる発現ベクターは、該宿主の挿入遺伝子配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含有する。該発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、および形質転換細胞の表現型選択を許容する特異的遺伝子を含有する。本発明で使用するのに適したベクターとしては、細菌中での発現のためのＴ７に基づく発現ベクター（Rosenbergら，Gene，56:125,1987）、哺乳動物細胞中での発現のためのpMSXND発現ベクター（LeeおよびNathans，J．Biol．Chem.,263:3521,1988）、昆虫細胞中での発現のためのバキュロウイルス由来ベクターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。該ＤＮＡセグメントは、調節要素、例えばプロモーター（例、Ｔ７、メタロチオネインＩまたはポリヘドリンプロモーター）に作動可能的に結合したベクター中に存在しうる。
【００４６】
真核宿主中では真核由来ポリペプチドの翻訳後修飾（例、カルボキシル化）が生じるが、ヘッジホグ、ＮまたはＣをコードするポリヌクレオチド配列は原核生物または真核生物のいずれかの中で発現させることができる。宿主としては、微生物、酵母、昆虫、哺乳動物生物などを挙げることができる。真核性またはウイルス配列を有するＤＮＡ配列を原核生物中で発現させる方法は、当該分野でよく知られている。宿主中での発現能および複製能を有する生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは、当該分野で公知である。かかるベクターを用いて、本発明のＤＮＡ配列を取り込ませる。
【００４７】
当業者によく知られている方法を用いて、ヘッジホグ、ＮまたはＣコーディング配列および適当な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術およびin vivo組換え／遺伝的技術が含まれる。例えば、Maniatisら，1989 Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.に記載されている技術を参照されたし。
【００４８】
ヘッジホグ、ＮまたはＣコーディング配列を発現させるために、種々の宿主発現ベクター系を用いてもよい。これらには、ヘッジホグ、ＮまたはＣコーディング配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物、ヘッジホグ、ＮまたはＣコーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ヘッジホグ、ＮまたはＣコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例、カリフラワーモザイクウイルス,ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス,ＴＭＶ）に感染した又は組換えプラスミド発現ベクター（例、Tiプラスミド）で形質転換された植物細胞系、ヘッジホグ、ＮまたはＣコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例、バキュロウイルス）に感染したウイルス昆虫細胞系、またはヘッジホグ、ＮまたはＣコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染した動物細胞系、または安定発現のために操作された形質転換動物細胞系が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
該発現ベクター中では、用いる宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどのいくつかの適当な転写および翻訳要素のいずれを使用してもよい（例えば、Bitterら，1987, Methods in Enzymology 153:516-544を参照されたし）。例えば、細菌系でクローニングする場合、バクテリオファージγのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）などの誘導性プロモーターを使用してもよい。哺乳動物細胞系でクローニングする場合には、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例、レトロウイルス長末端反復、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７.５Kプロモーター）を使用してもよい。該挿入ヘッジホグＮまたはＣコーディング配列を転写させるために、組換えＤＮＡまたは合成技術により得られるプロモーターを使用してもよい。
【００５０】
細菌系では、意図される発現用途に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択しうる。例えば、大量のヘッジホグ、ＮまたはＣを生成させたい場合には、容易に精製される融合タンパク質生成物の高レベルの発現を指令するベクターが望ましいかもしれない。回収時に役立つ切断部位を含有するように操作されたものが好ましい。かかるベクターとしては、大腸菌（E．coli）発現ベクターpUR278（ハイブリッド−Lac Zタンパク質が生成されるようにヘッジホグＮまたはＣコーディング配列がlac Zコーディング領域と該ベクター中にインフレーム連結されていてもよい）（Rutherら，EMBO J.2:1791,1983）、pINベクター(InouyeおよびInouye，Nucleic Acids Res.，13:3101,1985; Van HeekeおよびSchuster，J．Biol．Chem.，264:5503,1989)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
酵母では、構成的または誘導性プロモーターを含有するいくつかのベクターを使用してもよい。総説は、Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2,1988，Ausubelら編，Greene Publish．Assoc．& Wiley Interscience，Ch.13; Grantら，1987，Expression and Secretion Vectors for Yeast，in Methods in Enzymology．WuおよびGrossman編，31987，Acad．Press，N.Y.，Vol.153，pp.516-544; Glover,1986，DNA Cloning，Vol.II，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3;およびBitter，1987，Hererologous Gene Expression in Yeast，Methods in Enzymology，BergerおよびKimmel編，Acad．Press，N.Y.，Vol.152，pp.673-684; およびThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces,1982，Strathernら編，Cold Spring Harbor Press，Vols．I and IIを参照されたし。ADH、LEU2などの構成的酵母プロモーターまたはGALなどの誘導性プロモーターを使用してもよい（Cloning in Yeast，Ch．3，R.Rothstein In: DNA Cloning Vol.11，A Practical Approach，DM Glover編，1986，IRL Press，Wash.，D.C.）。あるいは、酵母染色体中への外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進するベクターを使用してもよい。
【００５２】
植物発現ベクターを用いる場合には、ヘッジホグ、ＮまたはＣコーディング配列の発現は、いくつかのプロモーターのいずれかにより駆動されてもよい。例えば、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡおよび１９ＳＲＮＡプロモーター（Brissonら，Nature 310:511,1984）、ＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター（Takamatsuら，EMBO J．6:307,1987）などのウイルスプロモーターを使用してもよい。あるいは、RUBISCOの小サブユニット(Coruzziら，EMBO J．3:1671-1680,1984; Broglieら，Science 224:838,1984)などの植物プロモーター、または熱ショックプロモーター、例えばダイズhsp17.5-Eまたはhsp17.3-B（Gurleyら，Mol．Cell Biol．6:559,1986）を使用してもよい。Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを用いて、これらの構築物を植物細胞中に導入することができる。
【００５３】
かかる技術の総説は、例えば、WeissbachおよびWeissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，pp.421-463およびGriersonおよびCorey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blackie, London，Ch.7-9を参照されたし。
【００５４】
発現に使用しうるもう１つの発現系は、昆虫系である。かかる１つの系では、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、オートグラファカルフォルニカ核ポリヘドロシスウイルス（Autographa californica nuclear polyhedorosis virus；ＡｃＮＰＶ）を使用する。該ウイルスは、スポドプテラ・フラギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞中で増殖する。ヘッジホグ、ＮまたはＣコーディング配列を該ウイルスの非本質的領域（例えばポリヘドリン遺伝子）中にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置いてもよい。ヘッジホグ、ＮまたはＣコーディング配列の挿入が成功すれば、該ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、非閉鎖（non-occluded）組換えウイルス（すなわち、該ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質性コートを欠くウイルス）が産生される。ついで、これらの組換えウイルスを用いて、該挿入遺伝子が発現されるスポドプテラ・フラギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞に感染させる（例えば、Smithら，1983，J．Viol.46:584,1983; Smith，米国特許第4,215,051号を参照されたし）。
【００５５】
真核系および好ましくは哺乳動物発現系は、発現哺乳動物タンパク質の適当な翻訳後修飾を生じさせる。一次転写物の適当なプロセシング、グリコシル化、リン酸化および好ましくは該遺伝子産物の分泌のための細胞装置を有する真核細胞を、ヘッジホグ、ＮまたはＣの発現のための宿主細胞として用いてもよい。哺乳動物細胞系が好ましいかもしれない。かかる宿主細胞系には、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、-293およびWI38が含まれていてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
発現を指令するための組換えウイルスまたはウイルス要素を用いる哺乳動物細胞系を操作してもよい。例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いる場合、ヘッジホグ、ＮまたはＣコーディング配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三部分リーダー配列に連結してもよい。ついで、このキメラ遺伝子を、in vitroまたはin vivo組換えにより、アデノウイルスゲノム中に挿入してもよい。該ウイルスゲノムの非必須領域（例、領域Ｅ１またはＥ３）中の挿入により、生存可能で感染宿主中で該タンパク質を発現する能力を有する組換えウイルスが得られる（例えば、LoganおよびShenk，Proc．Natl．Acad．Sci．USA,81:3655,1984を参照されたし）。あるいは、ワクシニアウイルス７.５Kプロモーターを用いてもよい（例えば、Mackettら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，79:7415,1982; Mackettら，J．Virol.,49:857,1984; Panicaliら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，79:4927,1982）。特に興味深いのは、染色体外要素として複製する能力を有するウシ乳頭腫ウイルスに基づくベクターである（Sarverら，Mol．Cell．Biol.，1:486,1981）。マウス細胞中へのこのＤＮＡの侵入後まもなく、該プラスミドは細胞あたり約１００〜２００コピーに複製する。該挿入ｃＤＮＡの転写は、宿主染色体中への該プラスミドの組み込みを必要としないため、高レベルの発現を与える。これらのベクターは、該プラスミド中に選択マーカー（例、neo遺伝子）を含有させることにより、安定な発現に使用することができる。あるいは、宿主細胞中でのヘッジホグ、ＮまたはＣ遺伝子の発現を導入し指令する能力を有するベクターとして使用するために、該レトロウイルスゲノムを修飾することができる（ConeおよびMulligan，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:6349,1984）。また、メタロチオネインIIAプロモーター、熱ショックプロモーターなど（これらに限定されるものではない）の誘導プロモーターを用いて、高レベル発現が得られうる。
【００５７】
組換えタンパク質の長期にわたる高収率生産のためには、安定な発現が好ましい。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用せずに、適当な発現制御要素（例、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーにより制御されるヘッジホグ、ＮまたはＣｃＤＮＡで宿主細胞を形質転換させることができる。該組換えプラスミド中の選択マーカーは該選択に抵抗性を付与し、細胞がその染色体中に該プラスミドを安定に組み込み成長してフォーカスを形成するのを可能にし、今度は該フォーカスをクローニングし細胞系に発展させることができる。例えば、外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を強化培地中で１〜２日間成長させてもよく、ついで、これらを選択培地に移す。いくつかの選択系を用いてもよく、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら，Cell，11:223,1977）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（SzybalskaおよびSzybalski，Proc.Natl．Acad．Sci．USA,48:2026,1962）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら，Cell，22:817,1980)(これらに限定されるものではない)遺伝子を、それぞれ、tk-、hgprt-またはaprt-細胞中で用いることができる。また、メトトレキセートに対する抵抗性を付与するdhfr（Wiglerら，Natl．Acad．Sci. USA，77:3567,1980; O'Hareら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，78:1527,1981）、ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するgpt（MulliganおよびBerg，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，78:2072,1981）、アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与するneo（Colberre-Garapinら，J．Mol．Biol.,150:1,1981）、およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するhygro（Santerreら，Gene，30:147,1984）遺伝子についての選択の基礎として、代謝拮抗物質抵抗性を用いることができる。最近、追加的選択遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを用いるのを可能にするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するのを可能にするhisD（HartmanおよびMulligan，Proc．Natl. Acad．Sci．USA，85:8047,1988）、およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−(ジフルオロメチル)−ＤＬ−オルニチン，ＤＦＭＯに対する抵抗性を付与するＯＤＣ(オルニチンデカルボキシラーゼ)(McConlogue L.，1987，In: Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory編)が記載されている。
【００５８】
当業者によく知られている通常の技術により、組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換を行ってもよい。該宿主が原核性（例、大腸菌(E．coli)）である場合には、指数増殖期後に収穫され、ついで当業者によく知られた方法を用いてＣａＣｌ2法により処理された細胞から、ＤＮＡ取り込み能力を有するコンピテント細胞を調製することができる。あるいは、ＭｇＣｌ2またはＲｂＣｌを使用することもできる。また、所望により、宿主細胞のプロトプラストを形成させた後、形質転換を行うことができる。
【００５９】
該宿主が真核性である場合には、リン酸カルシウム共沈法、通常の機械的手法、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム中に封入されたプラスミドまたはウイルスベクターの挿入などのＤＮＡのトランスフェクション方法を用いてもよい。また、本発明のヘッジホグ、ＮまたはＣをコードするＤＮＡ配列および選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子（例、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子）で真核細胞を同時形質転換することができる。もう１つの方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ウシ乳頭腫ウイルスなどの真核性ウイルスベクターを用いて、真核細胞にトランジエントに感染させたり又はこれを形質転換し、そして該タンパク質を発現させることである（例えば、Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman編，1982を参照されたし）。
【００６０】
本発明により提供される微生物発現ポリペプチドまたはその断片の単離および精製は、分取クロマトグラフィー、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いる免疫学的分離などの通常の手段により行ってもよい。
【００６１】
本発明は、ヘッジホグ、ＮまたはＣポリペプチドまたはその機能的断片と免疫反応性であるか又はこれに結合する抗体を含む。異なるエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体より本質的になる抗体、および異なるモノクローナル抗体調製物を提供する。モノクローナル抗体は、当業者によく知られている方法（Kohlerら，Nature，256:495,1975）により、該タンパク質の断片を含有する抗原から作られる。本発明で用いる抗体なる語は、ヘッジホグ、ＮまたはＣ上のエピトープ決定基に結合する能力を有する無傷の分子およびその断片、例えばＦａｂおよびＦ(ａｂ')2を包含する意である。本発明の抗体には、ＮまたはＣポリペプチドに結合し、かつ、免疫反応性断片ＮまたはＣを結合する抗体が含まれる。
【００６２】
本発明で用いる「抗体」なる語には、該エピトープ決定基に結合する能力を有する無傷の分子およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')2およびＦｖが含まれる。これらの抗体断片は、その抗原または受容体と選択的に結合するある程度の能力を保持し、以下のとおり定義される。
（１）抗体分子の１価の抗原結合断片を含有する断片であるＦａｂは、全抗体を酵素パパインで消化して無傷の軽鎖および１つの重鎖の一部を生成させることにより得ることができる；
（２）抗体分子の断片であるＦａｂ'は、全抗体をペプシンで処理し、ついで還元して無傷の軽鎖および重鎖の一部を生成させることにより得ることができ、１抗体分子あたり２つのＦａｂ'断片が得られる；
（３）(Ｆａｂ')2は、全抗体を酵素ペプシンで処理する（その後の還元は行わない）ことにより得ることができる抗体の断片であり、Ｆ(ａｂ')2は２つのジスルフィド結合により一緒になっている２つのＦａｂ'断片の二量体である。
（４）Ｆｖは、可変性の遺伝的に融合した単一の鎖分子を含有する遺伝的に操作された断片と定義される。
これらの断片を得る方法は、当該分野において公知である（例えば、出典明示により本明細書の一部とするHarlowおよびLane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)を参照されたし）。
【００６３】
本発明で用いる「エピトープ」なる語は、抗体のパラトープが結合する抗原上のいずれかの抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸、糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面配置よりなり、通常、特異的な三次元構造的特徴および特異的電荷特徴を有する。
【００６４】
本発明のヘッジホグ、ＮまたはＣポリペプチドに結合する抗体は、関心ある小さなペプチドを含有する無傷のポリペプチドまたは断片を免疫抗原として用いて製造することができる。動物を免疫するために使用するＮまたはＣまたはその断片などのポリペプチドは、翻訳されたｃＤＮＡまたは化学合成（これは、所望により、担体タンパク質に結合させることができる）から誘導することができる。
【００６５】
該ペプチドに化学的にカップリングされる、そのような一般に用いられる担体には、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風トキソイドが含まれる。ついで、該カップリング化ペプチドを使用して動物（例、マウス、ラットまたはウサギ）を免疫する。
【００６６】
所望により、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、例えば、該ポリペプチドまたは該抗体を産生させるペプチドを結合させるマトリックスに結合させ、これから溶出させることにより、さらに精製することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製および／または濃縮のための免疫学分野において一般的な種々の技術は当業者に公知である（例えば、出典明示により本明細書の一部とするColiganら，Unit 9，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991を参照されたし）。また、抗イディオタイプ技術を用いて、エピトープを模擬するモノクローナル抗体を産生させることも可能である。例えば、第１モノクローナル抗体に対して産生された抗イディオタイプモクローナル抗体は、該第１モノクローナル抗体により結合されているエピトープの「イメージ（image）」である高頻度可変領域中の結合ドメインを有する。
【００６７】
Ｎポリペプチドに対する特異性を有すると本明細書中に記載する抗体、例えばＡｂ１（残基８３〜１６０）は、ヘッジホグのＮ断片を発現する細胞または組織の特異的同定に有用である。同様に、Ｃポリペプチドに対する特異性を有すると本明細書中に記載する抗体、例えばＡｂ２（残基３００〜３９１）は、ヘッジホグのＣ断片を発現する細胞または組織の特異的同定に有用である。また、どちらの抗体も、天然ヘッジホグポリペプチドを検出するであろう。
【００６８】
本発明のＮおよびＣ特異的抗体は、特に固相上に固定化された抗体を用いる、それぞれＮおよびＣポリペプチドの精製に有用である。サンプルを抗Ｎ抗体と接触させることにより、Ｎおよび天然ヘッジホグポリペプチドを共に単離することができる。抗Ｎ抗体により取り出されたサンプルを今度は抗Ｃ抗体と接触させることにより、該天然ヘッジホグポリペプチドが除去され、Ｎポリペプチドの精製が可能となる。同様にして、Ｃポリペプチドをサンプルから抗体精製することができる。
【００６９】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、それを液相中で使用しうる又は固相担体に結合させうるイムノアッセイでの使用に適する。さらに、このイムノアッセイにおけるモノクローナル抗体は、種々の方法により、検出可能標識を付すことができる。本発明のモノクローナル抗体を使用することができるイムノアッセイの型としては、例えば、直接的または間接的形態の競合的および非競合的イムノアッセイが挙げられる。かかるイムノアッセイとしては、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびサンドウィッチ（イムノメトリック）アッセイが挙げられる。本発明のモノクローナル抗体を用いる該抗原の検出は、生理学的サンプル上の免疫組織化学的アッセイなどの、前方向、逆または同時方式のいずれかで行うイムノアッセイを用いて行うことができる。他のイムノアッセイ形態は当業者に公知であるか、当業者であれば過度な実験を行うことなく容易にこれを認識することができるであろう。
【００７０】
「イムノメトリックアッセイ」または「サンドウィッチイムノアッセイ」なる語には、同時サンドウィッチ、前方向サンドウィッチおよび逆サンドウィッチイムノアッセイが含まれる。これらの語は、当業者によく理解されている。また、当業者であれば、現在公知の又は将来開発されうるアッセイの他の変法および形態においても本発明の抗体が有用であると理解するであろう。これらは本発明の範囲内に包含されると意図される。
【００７１】
モノクローナル抗体は、多数の異なる担体に結合させることができ、ＮまたはＣポリペプチドの存在の検出に使用することができる。よく知られている担体としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然または修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、磁鉄鉱などが挙げられる。該担体の性質は、本発明の目的により、可溶性または不溶性のいずれであってもよい。モノクローナル抗体を結合させるための他の適当な担体は当業者に公知であり、当業者であれば通常の実験によりこれを確かめることができるであろう。
【００７２】
本発明の目的のためには、ＮまたはＣポリペプチドは、生物学的流体および組織中に存在する場合には、モノクローナル抗体により検出してもよい。検出可能な量のＮまたはＣを含有するいずれかのサンプルを使用することができる。サンプルは、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体、または組織、糞などの固体または半固体、あるいは例えば組織学的診断で一般に使用されているような固体組織であってもよい。特にＣポリペプチドはＮポリペプチドより容易に拡散する傾向があるため、生物学的サンプル中で検出可能である。
【００７３】
該アッセイを行う場合、ある「遮断剤」をインキュベーション培地（通常、標識可溶性抗体と共に加える）中に含ませることが望ましいかもしれない。「遮断剤」は、実験サンプル中に存在する非特異的タンパク質、プロテアーゼ、または抗ＣまたはＮ免疫グロブリンに対する抗異好性免疫グロブリンが固相支持体上の抗体または放射標識指示抗体を架橋したり破壊して誤陽性または誤陰性の結果を与えることがないことを保証するために加えるものである。したがって、「遮断剤」の選択により、本発明で記載するアッセイの特異性を実質的に増強させうる。
【００７４】
また、本発明は、ニューロン細胞をヘッジホグポリペプチドと接触させることを含んでなる、ニューロン細胞の増殖または分化をモジュレーションする方法を提供する。該ヘッジホグポリペプチドは、天然ヘッジホグポリペプチド、またはＮまたはＣポリペプチドであってもよいし、その機能的断片であってもよい。好ましくは、該モジュレーションは、特定の細胞型の増殖または分化の誘導である。これは、Ｎによるニューロン細胞の相乗的な正の誘導、または例えばデルタＮ−Ｃによる負のモジュレーションを含んでいてもよい（Laiら，Development 121:2349,1995）。デルタＮ−Ｃは、前方の神経遺伝子に比べて後方の発現を強化し、Ｎの阻害によりそれを行う（実施例１８および図１８Ｄを参照されたし）。また、ヘッジホグポリペプチドのほかに、ＴＧＦ−β因子を本発明方法で使用してもよい。
【００７５】
ラットヘッジホグ遺伝子を用いるこれまでの研究により、神経管からの外植片とラットヘッジホグ前駆体遺伝子発現細胞との共培養は、該外植片から運動ニューロンおよび底板の形成を誘導するのに十分なものであることが示された（Jessesl,T.およびDodd,J.，In Cell-Cell Signaling in Vertebrate Development(E.J.Robertsonら,pp139-155，San Diego，Ca.)，1993）。したがって、神経管および脊索の腹側中線の底板近傍でヘッジホグが発現されることを示す本明細書中の実施例に基づけば、実質的に底板ニューロン細胞に由来するニューロン細胞は、該細胞をヘッジホグ、ＮまたはＣポリペプチドと接触させることにより誘導させることができる。本明細書中で用いる「実質的に由来する」なる語は、底板からの又は底板近傍のそれらの細胞を意味する。例えば、かかる細胞としては、運動ニューロン、ドーパミン作動性ニューロンなどが挙げられる。当業者であれば、実質的に該底板に由来する他のニューロン細胞を同定することができるであろう。該細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
【００７６】
さらに、本明細書の実施例で記載するとおり、ヘッジホグおよび特にＣ断片は、脳下垂体遺伝子の発現を誘導する。また、ヘッジホグは、ＯＴＸ−Ａマーカーにより例示されるとおり、前脳遺伝子発現を誘導するのに有効である。さらに、ＴＧＦ−βファミリーメンバー（例、アクチビン）の添加により、かかる遺伝子の発現をさらに誘導させてもよい。他のＴＧＦ−βファミリーメンバーは、当業者に公知であろう。ｈｈ断片とＴＧＦ−βファミリーメンバーとのこの明らかな相乗効果は、ノギン（noggin）、フォリスタチン（follistatin）などの神経誘導物質のＴＧＦ−βタンパク質誘導発現により生じる。ついで、該ｈｈ断片はこれらの誘導物質と相乗作用して、神経遺伝子発現をパターン形成させる。
【００７７】
また、ｈｈ断片は、神経スペアー剤（nerve-sparing agent）として、または主な肢の外傷の治癒中に適当なパターン形成を回復または促進させるのに有用である。さらに、ＮまたはＣ断片は、遺伝カウンセリングの領域で有用かもしれない。特に、単眼症、多指症、神経管欠損などの家族性中線欠損（familial midline defects）は、ｈｈ付近の地図作製をすることにより診断しうる。自己タンパク質分解欠損が該障害を引き起こしうるため、ＮまたはＣ療法が提供されうる。
【００７８】
また、本発明は、本発明のＣポリペプチドのタンパク質分解ドメインを含む第１ポリペプチド、該第１ポリペプチドにより認識される切断部位、および第２ポリペプチドを含んでなる自己タンパク質分解性融合タンパク質を提供する（該第１および第２ポリペプチドが逆であってもよいと理解される）。天然ヘッジホグタンパク質の自己タンパク質分解活性は、該Ｃポリペプチド内の全体で見いだされる。したがって、該Ｃポリペプチドは、該Ｃポリペプチドと該第２ポリペプチドとの結合部位で後で切断される融合ポリペプチドの製造に有用である。所望により、該融合タンパク質は、ニッケルカラム上で単離するためのポリヒスチジン標識、抗体エピトープ標識などの精製標識を、好ましくはＣ断片上に有していてもよい。該切断部位は、Ｃポリペプチドのタンパク質分解ドメインにより認識され、該第２ポリペプチドを該Ｃ断片から切断するのに利用される配列「ＧＣＦ」を含む。本発明には、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。
【００７９】
また、本発明は、本発明のＣポリペプチドのタンパク質分解ドメインおよび該タンパク質分解ドメインにより認識される切断部位を含む第１ポリペプチドをコードする第１ポリヌクレオチドと、第２ポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドとを作動可能的に結合させることを含んでなる、自己タンパク質分解性融合タンパク質の製造法を提供する。また、前記のとおり、該融合タンパク質は、担体ペプチドおよび／または精製標識を含んでいてもよい。
【００８０】
Ｃポリペプチドまたはその機能的断片は、新油性修飾および他のタンパク質の束縛（tethering）をin vivoまたはin vitroで起こす融合相手として有用である。例えば、ＤＮＡ構築物を特定の細胞に標的化することにより又は特定のＤＮＡ構築物でトランスフェクションされた細胞を導入することにより局所的に活性を要する因子にとって、かかる融合タンパク質は望ましいかもしれない。細胞結合タンパク質を生成させるために、正常に分泌されるタンパク質を脂質修飾することが望ましいかもしれない。例えば、細胞に結合したままのウイルス抗原を生成させることが望ましいかもしれない。
【００８１】
あるいは、Ｃポリペプチドまたはその機能的断片は、対象であるタンパク質との融合相手として使用することができる（例、ｈｈ−Ｃドメインと融合したタンパク質Ｘ）。かかる融合は、タンパク質Ｘとｈｈ−Ｃとの間の結合部位でチオエステルを形成する（ＳからＮへのシフトを経由する）。アミノ末端システインを有するいずれかのペプチドまたはタンパク質（ペプチドＹ）が添加され、自発性転位（ＳからＮへのシフト）が起こり、タンパク質ＸとペプチドＹとの間に安定なペプチド結合（タンパク質Ｘ−ペプチド結合−ペプチドＹ）を生じるペプチド連結反応の基質として、該チオエステルが利用されうる。例えば、in vivoで生成させると毒性のあるタンパク質を、該ｈｈ−Ｃドメイン融合タンパク質法によりin vitroで生成させることができる。
【００８２】
また、該融合ポリペプチドは、所望により担体ペプチドを含んでいてもよい。
「担体ペプチド」またはシグナル配列は、該融合ペプチド配列のアミノ末端に位置する。真核生物の場合、該担体ペプチドは、小胞体を横切って該融合ポリペプチドを輸送するように機能すると考えられる。ついで、該分泌タンパク質は、ゴルジ装置を通って分泌小胞中および細胞外間隙または好ましくは外部環境中に輸送される。本発明により使用しうる担体ペプチドには、タンパク質分解酵素認識部位を含有するプレプロペプチドが含まれる。許容される担体ペプチドには、隣接二塩基性部位での切断を受ける、カルシトニンまたは他のホルモンのアミノ末端プロ領域が含まれる。しかしながら、本発明はいずれかの特定のペプチドの担体としての用途に限定されるものではないことに注意すべきである。他の担体ペプチドは当業者に公知であるか、過度な実験を行うことなく容易に確かめることができる。
【００８３】
本発明の１つの実施態様では、特に該融合ポリペプチドのＮ末端に隣接して位置するシグナル配列である担体ペプチドが、発現ベクター中に含まれている。このシグナル配列により、該融合タンパク質を小胞体へ指向させるのが可能となる。典型的には、該シグナル配列は、２個または３個の極性残基で始まり高含量の疎水性アミノ酸が続く約１６〜約２９個のアミノ酸のリーダーよりなるか、さもなくば、検出可能な公知配列の保存は全くない。かかるシグナル配列は当業者に公知であり、ヘッジホグタンパク質に由来する天然に存在するシグナル配列を含む。
【００８４】
本発明の融合ポリペプチドは、構造遺伝子によりコードされるポリペプチドを、好ましくは該融合ポリペプチドのアミノ末端に含む。いずれの構造遺伝子も、Ｃ−ポリペプチド（ポリヌクレオチド）および所望により担体ペプチドと共に発現される。該融合ポリペプチドが単一単位で発現されるように、発現ベクター中で該構造遺伝子は該担体に作動可能的に結合している。
【００８５】
ＮおよびＣドメインへのヘッジホグの自己タンパク質分解の同定は、このプロセシング活性に影響を及ぼす化合物または組成物を同定するためのスクリーニング法において有用である。したがって、もう１つの実施態様では、本発明は、活性または遺伝子発現により決定することができるｈｈプロセシングに影響を及ぼす組成物の同定方法であって、被検組成物（例、薬物、小分子、タンパク質）およびｈｈポリペプチドまたはヘッジホグを発現する組換え細胞またはＮドメインまたはその機能的断片に作動可能的に結合したＣドメインまたはその機能的断片をコードする遺伝子を含む成分を、該成分が相互作用するのを許容するのに十分な条件下でインキュベーションし、ついで、ヘッジホグ活性または発現に及ぼす該組成物が有する影響を測定することを含んでなる方法を提供する。本発明の方法では、自己タンパク質分解活性が維持されるかぎり、ヘッジホグポリペプチドまたはポリヌクレオチドの断片を使用することができる（例、図１２ａおよび１２ｂ、実施例１０で例示する構築物）。ｈｈに対する観察される影響は抑制的であっても刺激的であってもよい。例えば、Ｎドメインが該細胞に結合しているか否か、またはＮドメインが該培地中に分泌されるか否か、すなわち、不完全プロセシングが生じたか否かを判定することができる。ｈｈプロセシングに対する該化合物または組成物の影響を判定するためのかかる方法は、自己タンパク質分解切断の時間経過または濃度範囲に基づく切断の経過などの本明細書中に記載する方法（実施例１０、図１２ａおよび１２ｂを参照されたし）を含む。あるいは、ｈｈに対する該組成物の影響は、前方または後方神経マーカーの発現により判定することができる。ＮおよびＣのプロセシングに対する組成物の影響を判定するための他の方法は、当業者に公知であろう。ＮまたはＣドメインを検出するために種々の標識を使用することができる。例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵素を使用することができる。他の適当な標識は当業者に公知であるか、あるいは、当業者であれば通常の実験によりそれを確かめることができるであろう。
【００８６】
本明細書中で用いる、該スクリーニング法において記載する「ｈｈ活性」は、好ましくは、自己タンパク質分解活性を意味する。しかしながら、当業者であれば、他のｈｈ活性（例、亜鉛加水分解酵素活性）に影響を及ぼす組成物を同定するために前記スクリーニングアッセイを使用しうると理解される。かかる活性に対する影響を判定するのに適当なアッセイは、当業者に公知であろう。
【実施例】
【００８７】
以下の実施例は、例示を意図するものであり、本発明を限定するものではない。それらの実施例は用いうる典型的なものであるが、その代わりに当業者に公知の他の方法を使用してもよい。
【００８８】
実施例１：ヘッジホグタンパク質プロセシング 
ｈｈタンパク質の完全長形態（Ｆ）は、４６kDの相対分子質量に対応する移動度で移動する。図１（Ａ）および（Ｃ）は、アミノ−（Ａｂ１）およびカルボキシ−末端（Ａｂ２）エピトープに対する抗体によるイムノブロットである。ＨＨタンパク質からの残基８３〜１６０または３００〜３９１を含有するＧＳＴ融合タンパク質を、大腸菌（Escherichia coli）中で発現させ、推奨されているとおりに精製し［F.M.Ausubelら，Current Protocols in Molecular Biology(Greene and Wiley-Interscience，New York，1991)］、標準的な方法によりウサギを免疫するのに使用した。該抗体は、Affi-Gel 10ビーズ（Bio-Rad）に結合させたＨｉｓ6−Ｕタンパク質［E.HarlowおよびD.Lane，Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1988)］のカラム上でアフィニティー精製した。該精製は、該酸および塩基溶出液が１０％ジオキサンを含有することを除き既に記載されているとおり（HarlowおよびLane，前掲）に行った。ウサギ抗血清をプロテインＡカラム上で精製し、ついでイムノプローブビオチニル化キット（Immunoprobe biotinylation kit(Sigma)）を用いてビオチニル化することにより、ビオチニル化ｈｈ抗体を調製した。０.２５mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および５mMＥＤＴＡ（組織ホモジネーション用）を含有する冷ＲＩＰＡ溶解緩衝液を用いて、既に記載されているとおりに［HarlowおよびLane］免疫沈降を行った。ライゼートを免疫前ウサギ血清およびプロテインＡビーズ（Gibco-BRL）で２回前清澄化した。ついで、アフィニティー精製抗体または免疫前血清を加え、洗浄のためにＮＰ−４０緩衝液を用いてプロテインＡビーズで該免疫沈降を行った。
２つの化学発光に基づくプロトコールのいずれかにより、アフィニティー精製Ａｂ１またはＡｂ２でイムノブロットを行った。第１のプロトコール（図１、３および５で用いたもの）では、１５％または１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（F.M.Ausubelら，前掲）上でサンプルを分離し、エレクトロブロッティングによりマグナグラフ（Magnagraph）ナイロン膜（ＭＳＩ）に移した。推奨されている条件下でアルカリホスファターゼ結合ロバ抗ウサギＩｇＧ第２抗体およびLumi-Phos530（Boehringer Mannheim）を使用してブロットを展開させた。第２のプロトコール（図８で用いたもの）では、サンプルをニトロセルロースフィルター（SchleicherおよびSchuell）に移し、推奨されているとおりにＥＣＬ試薬（Amersham）を用いてブロットを展開させた。この場合の第２抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch）であった。レーンは、誘導されたトランスフェクションされていないＳ２細胞（レーン１および１３）、ｈｈを発現するように誘導されたトランスフェクションされたＳ２細胞（レーン２および１４）、成虫原基（レーン３および１５）、野生型胚（レーン６および１８）、およびミクロソームの存在下（レーン５および１７）および不存在下（レーン４および１６）の合成ｈｍＲＮＡのin vitro翻訳からのタンパク質を含有する。
【００８９】
メタロチオネインプロモーター制御下での誘導可能発現を許容するpMK33ベクター（M.R.Koelleら，Cell 67:59,1991）中に、種々のｈｈタンパク質種をコードするｃＤＮＡをクローニングした。ハイグロマイシン抵抗性について一定の選択を行いながらhh/pMK33プラスミドをトランスフェクションすることにより、安定なＳ２細胞系を作った。０.１Ａ595単位にまで希釈した細胞の対数増殖期培養をプレーティングし、４８時間待ち、０.２mMの最終濃度のＣｕＳＯ4で誘導し、２４時間後に該細胞および／または上清を収穫することによりタンパク質を発現させた。１０容量の１×ＳＤＳＰＡＧＥローディング緩衝液をペレット化細胞に加えることにより、イムノブロッティングのための細胞サンプルを作った。
【００９０】
ＴＮＴカップリング化転写−翻訳系（Promega）を用いてin vitro翻訳を行った。オートラジオグラフィーによる検出のために35Ｓメチオニン（DuPont NEN）を使用した。ヘパリン結合実験では、野生型ｈｈタンパク質を産生するミクロソームを含むin vitro翻訳ライゼートを、ヘパリンアガロース（Sigma）またはセファロースＣＬ−４Ｂ（Pharmacia）ビーズ［ヘパリン結合緩衝液（ＨＢＢ；２０mMトリス（７.４）、１５０mMＮａＣｌ、０.１％トリトンＸ−１００）で前平衡化させたもの］に加えた。サンプルを穏やかに振盪しながら４℃で４時間インキュベーションした。該ビーズをペレット化した後、いくつかのサンプル中の上清を分析した（レーン２および４）。ついで、該ビーズを冷却ＨＢＢで５回洗浄し、ついでサンプル（レーン３および５）をＳＤＳＰＡＧＥローディグ緩衝液中、８０℃で１０分間溶出させた（F.M.Ausubelら，前掲）。
【００９１】
野生型Canton-S系統からの胚および交配hshh/hshhまたはhshhH329A/hshhH329A Xy; Sco/CyO，enlacZ11::wg（Kassisら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．89:1919,1992）からの胚を、産卵後（ＡＥＬ）０〜１６時間で２５℃で集めた。それらに３７℃で３０分間熱ショックを与え、２５℃で１時間回復させた。図１中の胚（Canton-S）を産卵後４〜８時間で２５℃で集めた。イムノブロッティングのための調製では、すべての胚を２.６％次亜塩素酸ナトリウムでデコリオネート化し（dechorionated）、１×ＳＤＳＰＡＧＥローディング緩衝液の１０容量中でホモジナイズした。
【００９２】
複数の種が検出され、誘導されたトランスフェクションされていないＳ２細胞（レーン１および１３）の抽出物を含むほとんどのサンプルにおいて小さな交差反応性バンドが見られた。これらのバンド（両パネル中に出現する）の１つは、Ｕ（３９kDにある）と共に同時移動し、図１（Ａ）のレーン６に特に多量にあった。
【００９３】
図１（Ｂ）および（Ｄ）は、Ａｂ１（Ｂ、レーン７〜９）、Ａｂ２（Ｄ、レーン１９〜２１）または免疫前血清（Ｂ、レーン１０〜１２およびＤ、レーン２２〜２４）で免疫沈降させたサンプルのブロットである。検出は、Ａｂ１（Ｂ）およびＡｂ２（Ｄ）のビオチニル化誘導体によるものであった。使用したサンプルは、誘導されたトランスフェクションされていないＳ２細胞、レーン７、１０、１９および２２；ｈｈを発現するように誘導されたトランスフェクションされたＳ２細胞、レーン８、１１、２０および２３；および胚、レーン９、１２、２１および２４であった。どちらの抗体の場合も、ｈｈタンパク質断片をｈｈ発現細胞および胚から（トランスフェクションされていない細胞からではない）特異的に免疫沈降させた。（Ｅ）該図では、切断部位を矢印で示している。星印をつけた切断部位は、わずか１つの切断生成物の同定により推定されるものであり、したがって、該Ｃ断片内の別の位置に出現するかもしれない。該図の右側への最初の２つの欄は、各ｈｈ断片に対するＡｂ１およびＡｂ２の反応性を示す。残りの欄は、種々のサンプル中の各ｈｈ断片の存在（＋）または不存在（−）を示す。
【００９４】
ＦおよびＮssの周りの括弧は、これらの種がin vitro翻訳反応では検出されるがin vivoでは検出されないことを示す。
【００９５】
４６kDの種は、Ａｂ１およびＡｂ２によりin vitro翻訳抽出物から検出され（図１、レーン４および１６）、ミクロソームの存在下で翻訳が生じた場合に３９kDの種（Ｕ）に部分的に変換された（図１、レーン５および１７）。また、すべてのin vivo起源からの抽出物中には、Ｕと同時移動する３９kDの種が存在するが、これらの抽出物はいずれも、検出可能なレベルのＦを含有しなかった。ＵはＦのシグナル切断形態を表す。したがって、既に報告されているとおり(J.J.Leeら，Cell，71:33,1992)、シグナル切断はin vitroでは比較的非効率的と考えられるが、in vivoでは非常に効率的である。シグナル切断がこの異常な内部位置で実際に生じることを確認するために、予想されるシグナル切断部位で残基Ｓ84をＮに変える突然変異を導入した。この突然変異は、ＦからＵへのミクロソームによる変換を妨げ、培養されたＳ２細胞中へのトランスフェクションに際してＦと共に同時移動する種も生成した。該シグナル配列の上流に存在する２つのメチオニンコドンを独立に突然変異させる影響も調べた。第１のメチオニンが除去されている配列のin vitro翻訳により、ＦとＵとの間の移動度のタンパク質種中間体が生成し、この種は、ミクロソームの存在下またはin vivoで生成させた場合にはＵと共に同時移動する種に変換された。第２のメチオニンコドンの改変は、in vivoまたはin vitroで生成するＨｈタンパク質の電気泳動移動度の変化を起こさなかった。
【００９６】
in vivo起源からのＨｈタンパク質のより小さい種が既に報告されている（T.TabataおよびT.B.Kornberg，Cell 76:89,1984）。後者の研究では、内因性タンパク質ではなく、外的に導入された構築物から高レベルで発現するように誘導されたタンパク質が調べられた。使用抗体は、該分子の異なる部分からのエピトープを識別しなかった。
【００９７】
シグナル切断のほかにＵ前駆体をさらに切断することにより、in vivoで観察される他の形態のｈｈタンパク質が生成した。これは、Ａｂ１およびＡｂ２が共に該Ｕ（未切断）種を検出したが、胚および成虫原基内で内因的に発現されたより小さなタンパク質種またはＳ２細胞中へのｈｈ遺伝子の導入に際して発現された種と個々に相互作用もしたという観察から推定された。したがって、Ａｂ１は、これらの組織のすべてからの１９kDの種と相互作用し（図１、レーン２、３、６、８、９）、一方、Ａｂ２は２５kDの種および１６kDの種と相互作用する（図１、レーン１４、１５、１８、２０、２１）。以下、この１９kDの種をＮ（Ｎ末端断片）、この２５kDの種をＣ（Ｃ末端断片）、そしてこの１６kDの種をＣ*と称する。これらの種は、in vivoで存在する内因性ｈｈタンパク質の主要な形態をあらわす。
【００９８】
これらの種を生成させる提案されている切断を、図１F（図１−３）に図示する。該ＮおよびＣ種は、それぞれＡｂ１およびＡｂ２により唯一に検出され、その２つのより小さい種の相対質量の総和は、Ｕの相対質量とほぼ同等である。ＦおよびＵ種の電気泳動移動度は、予想される相対質量（それぞれ５２.１kDおよび４３.３kD）と若干相違していた。これらの種の同一性は、ＮＨ2−またはＣＯＯＨ−末端に種々の大きさの配列を含有するように修飾された種々のヘッジホグオープンリーディングフレームのin vitro翻訳により、およびエピトープ標識の挿入により確認した。この移動の異常は、ＮＨ2−およびＣＯＯＨ−の両末端断片からの配列が同時に存在するタンパク質種に関連しているらしい。これに対して、ＮＨ2−およびＣＯＯＨ−末端断片の移動度は、Ｕの予想相対質量とほぼ同等である合計４４kDとなる相対質量（それぞれ１９kDおよび２５kD）に対応する。
【００９９】
したがって、その２つのより小さい種の誘導を説明する単純なメカニズムは、Ｕ前駆体の単一の内部切断であろう。また、in vitroで翻訳される場合、該ｈｈタンパク質のプロセシングは２５kDの種（Ｃ；レーン１６および１７）および２９kDまたは１９kD（Ｎ）の種（レーン４および５）のいずれかを与える。その１９kDの種はＮと共に同時移動し、その形成はミクロソームの存在に依存する。このことは、シグナル切断およびさらに内部切断されることによりＮがＦから誘導されるという提案と一致する。したがって、in vivoで観察されるｈｈタンパク質の優勢な形態の形成のための全体の経路は、Ｕを生成するＦのシグナル切断を含んでいるらしい。ついで、Ｕは内部で切断されて、in vivoで見いだされる優勢な形態であるＮおよびＣを形成する。ついで、その２５kDのＣ種がさらにプロセシングされることにより、１６kDのＣ*種を生成するのかもしれないが、生じうるより小さい９kD断片をＡｂ２が認識しないため、このプロセシングが単一の切断事象なのか否かは明らかではない。Ｃ*を生成するＣのプロセシングは、成虫原基において胚より効率的に起こるらしい（レーン１５と１８とを比較されたし）。これは、成虫原基のより広範な大量単離方法により生じるのかもしれない（O.M.Eugeneら，Tissue Culture Assn．Man.,5:1055,1979）。
【０１００】
実施例２：ヘッジホグタンパク質の自己タンパク質分解 
内因性およびin vitro生成ｈｈタンパク質種の同時移動は、in vitroプロセシングがin vivoで観察されるものと同様であることを示唆した。図２は、ｈｈタンパク質とセリンプロテイナーゼとの間の限定された配列類似性を示す。ｈｈタンパク質配列をキイロショウジョウバエタンパク質の残基３２３〜３２９に対して整列させ、１〜７位の番号を付している（Ａ群）。保存されたｈｈ残基を太字で示す。哺乳動物セリンプロテイナーゼ（Ｂ群）の触媒性ヒスチジン（A.J.Barrett，in Proteinase inhibitors A.J.Barrett，G.Salvesen編(Elsevier，Amsterdam，1986)pp.3-22）を、Ｈｈタンパク質中の７位の非変異ヒスチジンに対して整列させている。略語は、以下のとおりである：Ｃ−Ｓｈｈ、ニワトリソニック（sonic）ｈｈ（R.D.Riddleら，Cell 75:1401,1993）；Ｍ−Ｓｈｈ、マウスソニックｈｈ(Y.Echelardら，Cell 75:1417,1993)(Hhg-1 と同一)；Ｒｖｈｈ−１、ラットｖｈｈ−１（H.Roelinkら，Cell 76:761,1994）；Ｚ−Ｓｈｈ、ゼブラフィッシュソニックｈｈ(S.Kraussら，Cell 75:1431,1993)(ｓｈｈと同一)およびゼブラフィッシュｖｈｈ−１（H.Roelinkら，前掲）；ｔｗｈｈ、他の略語はなし；Ｍ−Ｄｈｈ、マウスデザート（Desert）ｈｈ（Y.Echelardら，Cell 75:1417,1993）；Ｍ−Ｉｈｈ、マウスインディアン（Indian）ｈｈ（Y.Echelardら，前掲）；ＣＨＴ、ウシキモトリプシン; ＴＲＰ、ウシトリプシン; ＥＬＡ、ブタエラスターゼ; ＵＫＨ、ヒトウロキナーゼ; Ｃ１Ｒ、ヒト補体因子ＩＲ; ＣＩＳ、ヒト補体因子ＩＳ; ＭＣＰ、ラット肥満細胞プロテアーゼ; ＦＡＸ、ヒト血液凝固因子; ＴＰＡ、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子。
【０１０１】
図２は、ｈｈコーディング配列の７残基領域（ショウジョウバエタンパク質における残基３２３〜３２９）が、セリンプロテアーゼの配列とのいくつかの類似性を示すことを示す。この領域は、該シグナル切断部位からカルボキシ末端までの距離のほぼ３分の２に位置し、すべての種からのすべてのｈｈ配列において非変異であるThrおよびHis残基（図２の４および７位）を含む。セリンプロテアーゼでは、この保存配列は、触媒作用で一般的な塩基として作用する非変異Hisを含有する（A.J.Barrett，in Proteinase inhibitors A.J.Barrett，G.Salvesen編．Elsevier，Amsterdam，1986，pp.3-22）。
【０１０２】
該ｈｈタンパク質中のこの非変異His残基が自己タンパク質分解において実際に何らかの役割を果たしているか否かを判定するために、大腸菌（E．coli）からの２つのタンパク質（一方は野生型配列を保持し、他方は３２９位のHisコドンがAlaコドンで置換されている（Ｈ３２９Ａ））を精製した。これらのタンパク質は共に、シグナル切断部位の直前の残基からカルボキシ末端まで伸長するショウジョウバエ配列に融合しているアミノ末端にヘキサ−ヒスチジン標識を含有するように操作した（残基８３〜４７１；このタンパク質の野生型形態をＨｉｓ6−Ｕと称する）。Ｎｉ++キレート化マトリックスを用いて変性条件下で、両タンパク質を十分に精製した。図３（Ａ）は、大腸菌（E．coli）からのＨｉｓ6−ＵおよびＨｉｓ6−ＵH329Aタンパク質の生成および精製を示す、クーマシーブルー染色されたポリアクリルアミドゲルである。サンプルは、分子量マーカー（レーン１および２）、ＩＰＴＧによる誘導がない場合（レーン３）およびある場合（レーン４）のＨｉｓ6−Ｕ発現構築物を保持する大腸菌（E．coli）細胞のライゼート、精製Ｈｉｓ6−Ｕタンパク質（レーン５）、ＩＰＴＧによる誘導がない場合（レーン６）およびある場合（レーン７）のＨｉｓ6−ＵH329A発現構築物を保持する大腸菌（E．coli）細胞のライゼート、精製Ｈｉｓ6−ＵH329Aタンパク質（レーン８）であった。精製タンパク質は、より小さい相対質量のいくつかの小さな種を除くと、本質的に均質であった。これらの種は、非誘導抽出物中には存在せずｈｈ抗体で検出可能であったため、完全長タンパク質の内因性分解産物である。図３（Ｂ）は、ｈｈを発現するように誘導されたトランスフェクションされたＳ２細胞（レーン１）、切断反応緩衝液中で０時間（レーン２および５）、２０時間（レーン３および６）および２０mMＴＡＭＥ（セリンプロテアーゼ阻害剤）の存在下で２０時間（レーン４および７）インキュベーションされたＨｉｓ6−ＵおよびＨｉｓ6−ＵH329Aタンパク質を示す、Ａｂ２で検出されたイムノブロットである。インキュベーションに際して、Ｈｉｓ6−Ｕ（Ｈｉｓ6−ＵH29Aタンパク質ではない）は、Ａｂ２との反応性およびＳ２細胞中で生成されたＣとの同時移動に基づきＣと推定される断片を遊離した。Ｃ（レーン３）の遊離は、ＴＡＭＥにより部分的に阻害されるにすぎなかった。
【０１０３】
予備的プロテイナーゼ阻害剤研究は、翻訳反応の開始時に種々の阻害剤を加えることにより、in vitro翻訳Ｈｈタンパク質上で行った。多数のプロテアーゼ阻害剤が翻訳効率を低下または阻害させたという事実のため、これらの研究は複雑なものとなった。いくつかの場合には、完了した翻訳反応への阻害剤の添加が、通常は生じ続ける自己プロセシングを阻害するか否かを判定することにより、阻害剤の有効性を評価した。この段階では、確信をもって言えるのは以下のことにすぎない：（ｉ）セリンプロテアーゼ阻害剤ＴＡＭＥ（p−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンメチルエステル）がin vitro翻訳Ｈｈタンパク質の自己タンパク質分解を阻害する、（ii）ダイズトリプシン阻害剤であるａ1抗トリプシン、アプロチチン、リューペプチンおよびＥ−６４は、翻訳されたＨｈタンパク質の自己タンパク質分解を遮断しない、および（iii）ＴＡＭＥは精製Ｈｉｓ6−Ｕタンパク質の自己タンパク質分解を部分的に阻害する（図３、パネルＢ）。
【０１０４】
図３Ｂからわかるように、変性剤の希釈に際して、該野生型タンパク質（Ｈ３２９Ａ突然変異タンパク質ではない）は、Ａｂ２により検出可能でありin vitro翻訳および種々のin vivo起源から生じたＣ種と移動度が同一である２５kＤの種を遊離した。この切断は、該野生型タンパク質を他のプロトコールにより精製し復元させ、異なる条件下で切断した場合にも観察された。Ｈｉｓ6−ＵおよびＨｉｓ６−ＵH329Aタンパク質をコードするプラスミドは、該野生型またはｈｈＨ３２９ＡＯＲＦからの残基８３〜４７１に対応する配列をpRSETB発現ベクター（Invitrogen）中に挿入することにより得た。既に記載されているとおりに（F.M.Ausubelら，前掲）、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ大腸菌（E．coli）細胞中でタンパク質を誘導した。基本的な精製は、本質的には推奨されているとおりに、６M グアニジウムＨＣｌおよび８M 尿素を用いる変性プロトコールにより、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Qiagen）上で行った（使用する厳密な条件の詳細なプロトコールは請求すれば入手できる）。洗浄液は、０.２％トゥイーン２０および５mMｂ−メルカプトエタノールを含有していた。最終洗浄緩衝液は、６M尿素、１００mMトリス、５００mMＮａＣｌ、２０％グリセロール（ｐＨ７.４）であった。溶出は、２５０mMイミダゾールを含有する最終洗浄緩衝液により行った。該精製タンパク質（最終混合物中で１：３０に希釈したもの）を切断緩衝液［５０mMトリス、５００mMＮａＣｌ、５％グリセロール、０.２％トリトンＸ−１００、５０mMＤＴＴ、（ｐＨ７.４）］中でインキュベーションすることにより、in vitro切断反応を行った。変性剤または洗浄剤を含まない可溶性完全長Ｈｉｓ6−Ｕタンパク質を単離するために、追加的工程に付した（これは、本明細書中で記載する残りの復元プロトコールを意味する）。前記の溶出液からの完全長タンパク質を、透析による尿素除去により沈殿させることにより、分解産物からさらに精製した。ついで、グアニジニウムＨＣｌを含有する緩衝液中で該沈殿物を再度可溶化し、別のＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム上にローディングした。
【０１０５】
前記のとおりに洗浄した後、４℃で８時間かけて希釈緩衝液［１００mMトリス、５００mMＮａＣｌ、２０％グリセロール、（ｐＨ７.４）］］で尿素（６M〜０.５M）を徐々に希釈することにより、該タンパク質を再度折りたたませた（該ビーズに結合させたまま）。２５０mMイミダゾールおよび０.５M尿素を含有する希釈緩衝液により、該タンパク質を溶出させた。該溶出液を１００mMトリス、１５０mMＮａＣｌ、１０％グリセロール、（ｐＨ７.４）中４℃にて透析し、−７０℃で保存した。
【０１０６】
実施例３：ｈｈの自己タンパク質分解機能の地図作製
この自己タンパク質事象を起こすｈｈタンパク質のドメインをより詳細に特定するために、in vitroプロセシングに対するいくつかの異なる型の突然変異の影響を調べた。最も得るところの大きい突然変異は、残基８９〜２５４（Δ８９〜２５４）（これらは一緒になって、Ｎ断片を形成すると推定される分子部分内のアミノ酸の大部分を構成する）を除去する欠失であった。ショウジョウバエ（図４Ａ〜Ｃ）およびゼブラフィッシュ（図４Ｄ）からの野生型および突然変異Ｈｈタンパク質のin vitro翻訳を示す。これらのタンパク質中の突然変異および切断部位（矢印）の位置を図示する（図４Ｅ）。ショウジョウバエタンパク質（図４Ａ、ＢおよびＣ）では、自己タンパク質分解は、ＣＯＯＨ末端中のいくつかの突然変異（Ｈ３２９Ａ、２９４トランケート（trunc）、４１０トランケート（trunc）、flu４０８および４５６トランケート（trunc））により遮断されるか又は激しく阻害されるが、ＮＨ2末端中の大きな欠失（Δ８９−２５４）またはflu-tagエピトープ三量体（flu２２７）の挿入により影響されることはない。したがって、自己タンパク質分解は、主にＣ断片内の残基（下方の概略図中の切断部位の右側の配列、図１を参照されたし）に依存する。さらに、Ｈ３２９Ａ／flu２２７の二重突然変異体は、混合実験では（レーン１１）、野生型タンパク質により切断されない。これは、自己タンパク質分解の分子内メカニズムを示唆するものである。各ゼブラフィッシュタンパク質のＮＨ2末端断片（ｔｗｈｈでは２３ｋDおよびｓｈｈでは２２kD）はＣＯＯＨ末端断片（ｔｗｈｈおよびｓｈｈでは２５kD）より低い見かけ質量を有するが、ゼブラフィッシュ遺伝子ｔｗｈｈおよびｓｈｈによりコードされるＨｈタンパク質は、ショウジョウバエタンパク質のものと同様のプロセシングパターン（Ｄ）を示す。これは、ショウジョウバエタンパク質に比べて、該シグナル配列に先行する残基のより短い伸長の結果である。
【０１０７】
プロセシングは、ｔｗｈｈおよびｓｈｈタンパク質のそれぞれＨ２７３ＡおよびＨ２７０Ａ突然変異により遮断され（ショウジョウバエタンパク質中のＨ３２９Ａ突然変異に類似する）、このことは、ショウジョウバエタンパク質について観察されるものと同様の自己タンパク質分解プロセシングメカニズムが用いられていることを示唆するものである。
ＴＮＴ共役転写−翻訳系（Promega）を用いて、in vitro翻訳を行った。オートラジオグラフィーによる検出のために、35Ｓメチオニン（DuPont NEN）を使用した。ヘパリン結合実験では（図８Ｃ）、野生型Ｈｈタンパク質を生成するミクロソームを含むin vitro翻訳ライゼートをヘパリンアガロース（Sigma）またはセファロースＣＬ−４Ｂ（Pharmacia）ビーズ［ヘパリン結合緩衝液（ＨＢＢ；２０mMトリス（７.４）、１５０mMＮａＣｌ、０.１％トリトンＸ−１００）で前平衡させたもの］に加えた。サンプルを４℃で４時間、穏やかに振盪しながらインキュベーションした。該ビーズをペレット化した後、いくつかのサンプル中の上清を分析した（レーン２および４）。ついで、該ビーズを冷却ＨＢＢで５回洗浄し、ついでサンプル（レーン３および５）をＳＤＳＰＡＧＥローディング緩衝液中８０℃で１０分間溶出した（F.M.Ausubelら，前掲）。
【０１０８】
ｈｈ遺伝子中のすべての突然変異をプラスミドpF1中で生成させた（J.J.Leeら，前掲）。ゼブラフィッシュｔｗｈｈおよびｓｈｈ遺伝子中の突然変異は、既に記載されているとおり（Ekkerら，Current Biology,5(8):944,1995）、もとのｃＤＮＡクローンを用いて生成させた。組換えサークルＰＣＲ（D.H.JonesおよびS.C.Winistorfer，Biotechniques 12:528,1992）を用いて、すべての点突然変異を生成させた。ｈｈＯＲＦ中に存在するAlwN IおよびBgl I部位中（それぞれ、ヌクレオチド１６０４位および１０５８位）にインフルエンザ血球凝集素抗原（flu４０８では４２残基およびflu２２７では４３残基）の三量体を挿入することにより、flu４０８およびflu２２７突然変異を生成させた（J.J.Leeら，前掲）。
【０１０９】
Δ８９−２５４突然変異は、EcoN I部位（６４４）とPml I部位（１１４５）との間の配列を除去することにより生成させた。該２９４トランケート（trunc）突然変異は、Acc I部位（１２６５）とXcm I部位（１７９２）との間の配列を除去することにより生成させた。該４１０トランケート（trunc）突然変異は、既に生成され、Ｈｈ410と同定されている（J.J.Leeら，前掲）。ｈｈ13E対立遺伝子中の突然変異（Ｃ1756からＡへの塩基変化；Tyr457から停止コドンへのコーディング変化）を地図作製するために、ｈｈ13E／ＴＭ３から単離されたＤＮＡを用いて、ｈｈＯＲＦおよび隣接配列の領域を生成するＰＣＲ反応をシードし、これをBluescript KSM（Stratagene）中にサブクローニングした。２つの異なるＰＣＲ増幅に由来するそれぞれ６つのクローンを配列決定した。
【０１１０】
図４Ａのレーン１および２に示すように、この構築体は、予想される 33 kDの相対質量に対応する移動度の全長物質および見かけの相対質量（25および 9kD）を合わせると大きい方の物質の相対質量になる二つの切断産物を生じる。切断産物の小さい方は、ときどき、図４Ａに示すように二つのバンドとして移動する。
【０１１１】
分子量測定に対しては、14.3 kD および 6.2 kD の間の二つのバンドの低い方を選択した。二つの切断産物の大きい方は、野生型タンパク質から産生したＣ物質とともに移動し、これは、Δ89〜254 hhタンパク質が、正常であればＣに存在する残基および自己タンパク質分解に必要な決定基の全て（正常な切断部位を含む）を含み、Ｎ内の残基のほとんどは、自己タンパク質分解活性には必ずしも必要でないことを示唆するものである。
【０１１２】
これに対して、Ｃ内にあると考えられる残基に影響を及ぼす損傷は、in vitroで自己タンパク質分解を阻止する。in vitro翻訳によって試験した全ての突然変異はまた、イムノブロット法によってＳ２細胞でも調べた。全ての場合において、Ｓ２細胞での切断パターンは、Ｃが形成されるときはいつもＣ*が存在することを除いて、翻訳において認められたものと同じであった。Ｃ*断片は、翻訳では認められなかった。これらは、インフルエンザウイルスエピトープを残基 408と 409との間に挿入する突然変異(flu 408)である上記した H329A突然変異およびカルボキシ末端でタンパク質の未熟終結を引き起こす３個の突然変異を含む。
【０１１３】
最も厳しい二つの切断である 294切断および 410切断は、in vitroで生じる突然変異である。それらは、各々、タンパク質のカルボキシル末端からの 177および 61 残基の欠失を引き起し、タンパク質分解は受けない。456 切断 hh タンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端からの 15 残基の欠失を招くＥＭＳ−誘導 hh13E突然変異体対立遺伝子によってコードされるものと同様である。このタンパク質は、Ｃの代わりの 24 kDのバンドの出現によって示されるように自己タンパク質分解を受けるが、その反応の効率は、in vitroではかなり減じる（図４Ｂ）。hhタンパク質の自己タンパク質分解は、主にＣ内の残基に頼り、このドメイン内の残基の欠失または変化は、プロセシングの効率の減少と関連し、そのような欠失の一つが、hh13E突然変異の原因であると思われる。
【０１１４】
全長 hh タンパク質の配列相同性および自己タンパク質分解機能は、ＦまたはＣ断片が配列特異的プロテアーゼである可能性を示唆した。自己タンパク質分解のメカニズムの解明における第一段階として、インフルエンザウイルスエピトープタグを、H329A突然変異も有する hh オープンリーディングフレームのＮ−末端に導入した。図４Ｃは、エピトープタグのみの挿入は自己タンパク質分解を妨害するものではなく（レーン９）、（レーン１２の野生型と比較して）相対的質量が増加した正常なＣ断片およびＮ断片を生じることを示す。両方の突然変異を有するタンパク質はタンパク質分解を受けない（レーン１０）し、また、エピトープ標識したＮ断片はＮとは異なって移動するので、この二重突然変異体は、野生型の配列と混合した場合の分子間切断を求めるための理想の基質となる。レーン１１は、そのような混合物では、正常なＮは形成されるが、標識されたＮは検出できないことを示す。すなわち、この実験では、認められるほどの分子間切断は生じない。また、次の二つの実験でも、分子間切断を検出することはできなかった。すなわち、（ｉ）野生型および 410切断配列のＳ２細胞への共トランスフェクション（切断された 410切断タンパク質は、より小さい、従って確認できる形状のＣを生じる）；（ii）標識していない過剰の精製 His6-U タンパク質と、in vitro 翻訳された標識 H329A突然変異体タンパク質との混合である。すなわち、自己タンパク質分解の調節または他のタンパク質の切断に対する分子間のメカニズムを除外することはできないが、現在の証拠は、hhタンパク質の切断が主に分子間のメカニズムによって生じることを示唆するものである。
【０１１５】
hh遺伝子は、進化において広く保存されており、種々の無脊椎動物種で未確認の単一相同体およびいくつかの脊椎動物種の各々で異なる多数の相同体がある（Y．Echelard ら、Cell 75: 1417，1993; S．Kraussら、Cell 75: 1431，1993; H．Roelink ら、Cell、前出）。図２に示すように、これらのコード配列は全て、ショウジョウバエ（Drosophila）のタンパク質の H329 に対応する位置に、不変のヒスチジンおよび他の保存残基を含む。さらに、マウスの遺伝子の少なくとも一つによってコードされるタンパク質は、in vivo でプロセシングを受けて、ショウジョウバエ（Drosophila）のタンパク質の in vivoプロセシングと類似した方法で、より小さい二つの断片を生じると思われる。自己タンパク質分解が脊椎動物でも重要な役割を果たしているかどうかを調べるために、ゼブラフィッシュの異なる二つの hh 相同体である twhh および shhによってコードされるタンパク質の挙動を調べた。図４Ｄは、これらの配列を in vitro で翻訳すると、より小さい断片が生じ、それらの相対的質量を合わせると、全長のタンパク質の相対的質量にほぼ等しくなることを示す（レーン１および３）。レーン２および４に示すように、この切断反応は、ショウジョウバエ（Drosophila）の H329 に対応する位置の Hisコドンを Alaコドンで置き換えると阻止される（図２参照）。すなわち、脊椎動物の hh タンパク質は、ショウジョウバエ（Drosophila）のタンパク質と同じメカニズムでプロセシングを受けると思われる。これらのタンパク質における突然変異および切断部位の位置（矢印）を図４Ｅにおいて模式的に示す。
【０１１６】
実施例４：胚での自己タンパク質分解の役割 
hh遺伝子に対する多くの機能が、ショウジョウバエ（Drosophila）において記載されている。これらは、形態学的レベルでは、幼虫のクチクラ構造ならびに目および付属器官などの成虫の構造のパターン形成における役割を含み（C．Nusslein-Volhard および E．Wieschaus，Nature 287: 795，1980; ならびに J．Mohler，Genetics 120: 1061，1988）、形態学的影響に対するメカニズム上の基礎は、胚および成虫原基における遺伝子発現の維持または誘導に対するシグナル化を含む(J．J．Lee, 前出; T．Tabata および T．B．Kornberg，Cell 76: 89，1994; および K．Baslerおよび G．Struhl，Nature 368: 208，1994)。これらの機能に対する自己タンパク質分解の重要性を確かめるために、hsp 70プロモーターの制御下にある H329A突然変異体遺伝子を、Ｐ因子−媒介形質転換によりショウジョウバエ（Drosophila）生殖系列に導入した。hshh H329A構築体を、H329A 突然変異を含む hh ＯＲＦ断片を使用して、hshh 構築体と同様に作製した。Ｐ因子−媒介形質転換の標準的方法を使用して、y1w1118親株からトランスジェニックハエを生じさせた（A．C．Spradling および G．M．Rubin，Science 218: 341,1982）。第二染色体上に hshh H329A Ｐ因子を有するＨＡ３系列を、ホモ接合ストックとして維持した。wg片の拡張をアッセイするために、産卵後（ＡＥＬ）
４〜６時間で、25℃で集めた胚を次の熱ショックプロトコールにかけた後、固定した。単独ショック（10または30分、37℃）を受けた胚は、25℃で１時間回収した。二重のショック（37℃で10分を２回または30分を２回）を受けた胚は、最初のショックの90分後および２回目のショックの40分後に回収した（どちらの回収も25℃で行った）。30分を２回のプロトコールは、先の記載に従った(S．Krauss、前出)。in situ ハイブリダイゼーションは、wg特異的プローブを使用して（D．T.Chang ら、前出）、記載の通りに行った(D．Tautz，Chromosoma 98:81，1989)。
【０１１７】
クチクラ表現型に対してアッセイする胚は、ＡＥＬ６〜８時間で、37℃で 30 分間熱ショックにかけ、25℃で 36 時間発育させた後、記載の通りにプロセシングおよび固定を行った(M．Ashburner，Drosophila: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor aboratory Press，New York，1989)。第一抗体に対してはアフィニティー精製した Ab1または Ab2を使用し、第二抗体に対してはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がコンジュゲートした抗ウサギまたはマウスＩｇＧ（Jackson Immunoresearch）を使用した。hh13E対立遺伝子に対してホモ接合である hh13E／TM3 ftz-lacZ（均衡染色体は、the Bloomington Stock Center、菌株 3218 から得た。）ストック由来の胚は、Ab2 による二重染色における抗β−ガラクトシダーゼ抗体(Promega)による染色の欠如により確認した（図９、パネルＤ）。図９、パネルＢおよびＣの染色は、ＡＰがコンジュゲートした抗−ウサギＩｇＧ二次抗体を使用して、ホルムアルデヒド固定 Canton-S 胚で行った。一般的には標準的なホルムアルデヒド固定を使用したが、熱および酸−ホルムアルデヒド固定でも同様の結果が得られた。Hhタンパク質由来の残基 83 〜 160または 300〜391 を含むＧＳＴ融合タンパク質を大腸菌(E．coli)で発現させ、推奨されるように精製し(F．M．Ausubelら、前出)、標準的方法によりウサギを免疫感作するために使用した。抗体は、Affi-Gel 10 ビーズ(Bio-Rad)に結合した His6-U タンパク質（Harlowおよび Lane,前出）のカラムによりアフィニティー精製した。精製は、酸および塩基溶離に 10 % のジオキサンを含めることを除き、記載(Harlow および Lane,前出)の通りに行った。ビオチニル化 hh 抗体は、タンパク質Ａカラム上でウサギ抗血清を精製した後、Immunoprobe ビオチニル化キット(Sigma)を使用してビオチニル化することにより調製した。免疫沈降法は、組織均質化のために 0.25 mMのＰＭＳＦおよび 5 mM のＥＤＴＡを含む冷ＲＩＰＡ溶解緩衝液を使用して、記載（Harlowおよび Lane,前出）の通りに行った。溶解産物は、前免疫ウサギ血清＋タンパク質Ａビーズ(Gibco BRL)で２回前洗浄した。次いで、アフィニティー精製した抗体または前免疫血清を添加し、免疫沈降を、洗浄のための NP-40溶解緩衝液の使用とともに、タンパク質Ａビーズを使用して行った。
【０１１８】
図５（Ａ）および（Ｂ）は、各々、Ab1 および Ab2抗体の使用により展開させたイムノブロットである。レーン１および６はトランスフェクションしていない誘導Ｓ２細胞であり、レーン２および７は、hhを発現するために誘導したトランスフェクションしたＳ２細胞であり、レーン３および８は、熱ショックを行った野生型の胚であり、レーン４および９は、熱ショックを行った hshh 胚であり、レーン５および１０は、熱ショックを行った hshh H329A 胚である。熱ショックを行った hshh 胚では、野生型 Hh タンパク質が誘導され、かつ適切にプロセシングを受けて、他の発現で見られるＵ、Ｎ、ＣおよびＣ*種を生成させる。これに対して、hshh H329A胚では、H329A は誘導されるが、プロセシングはあまり受けない（レーン５および１０におけるプロセシングを受けた低レベルの物質は、恐らく、内因性 hh 発現による。なぜならば、レーン３および８における熱ショックを行った野生型の胚でも同じレベルで認められるからである。）。
【０１１９】
図５は、熱ショック誘導により、その可動性ならびに Ab1および Ab2との相互作用に基づいて、Ｕに対応する多くの物質の形成が生じることを示す（レーン５および１０）。これに対して、同様の構築体を使用した野生型 hh タンパク質の誘導は、同様のレベルのＮおよびＣプロセシング産物を生じ（レーン４および９）、分解されていないＵはほとんどない。すなわち、in vitroおよびＳ２細胞で認められるように、胚での H329A突然変異は、hhタンパク質の自己タンパク質分解の効率をかなり低下させるように思われる。
【０１２０】
図６では、in situ ハイブリダイゼーションによって示されるウイングレス(wg)ＲＮＡの胚での分布を示し、（Ａ）野生型（ホモ接合 y1w1118）、（Ｂ）hshhおよび（Ｃ）hshh H329Aの胚であり、それらは、10分間の２回の熱ショックの間に 90 分の回収期間をおいた。野生型の胚は、wg発現における変化がほとんど示されなかったが、野生型タンパク質および程度は低いが H329Aタンパク質の各々は、異所性 wg 発現を誘導した（表１）。パネル（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）は、各々、y1w1118、hshhおよびhshh H329Aの幼虫の、第四腹部体節のレベルでの背面表面を示す。これらの幼虫は、胚と同様に 30 分間ショックを与え、胚形成を完了させた。クチクラ細胞型（１°、２°、３°および４°）は、記載に従って標識する(J．Heemskerkおよび S．DiNardo，Cell 76: 449，1994)。なお、２°の細胞型（覆いのないクチクラ）は、hshh H329A胚（Ｆ）の表現型が対照の胚（Ｄ）と同一である条件下では、hshh の胚（Ｅ）において、３°の型およびいくつかの４°の型を犠牲にして拡張する。
【０１２１】
多分、Hhタンパク質に対して最も早く知られた要件は、胚の各体節における隣接片のウイングレス(wg)遺伝子発現の維持にある(A．Martinez Arias，ら、Development 103: 157，1988; および S．DiNardo ら、Nature 332: 604，1988)。この要件は、hh機能がない場合は、wg発現の減少により低下する。さらに、野生型 Hh タンパク質の偏在発現は、wg遺伝子発現のドメインの拡張を誘導する(P．W. Ingham，Nature 366: 560，1993)。wg拡張に対する H329A突然変異の影響を、野生型構築体を含む胚と同時にH329A 突然変異体構築体を有する胚に熱ショックを与えることにより調べた。H329A 突然変異体タンパク質は、wgドメインの拡張をいくらか誘導するが、この活性の効率は、野生型タンパク質に対して低下する（図６、ＢおよびＣ；表１）。効率の違いの範囲は、熱ショック過程に依存して約３倍と大きく、これらの結果は、Hhタンパク質の自己タンパク質分解が wg 発現を誘導するための胚でのシグナル化における最適活性に対して重要であることを示唆するものである。
【０１２２】
【表１】
2006151989.tif 000002
【０１２３】
クチクラ構造のパターン形成に対する Hh タンパク質の影響は、４つのはっきり異なる細胞型が各擬体節において確認できる幼虫の背面表面上で最もはっきり見られる。これらの細胞型は、前から後へ１°、２°、３°および４°と命名され、hh転写は、１°細胞の前駆体において生じる(J．Heemskerk および S．DiNardo、前出)。最初の３個の細胞型の分化は、hh遺伝子の作用に依存していることが分かり、これらの細胞の運命は Hh タンパク質の濃度で決定することが提案されている。すなわち、最も高い濃度が１°の運命をもたらし、中位の濃度が２°の運命をもたらし、最も低い濃度が３°の運命をもたらす(J．Heemskerk および S．DiNardo、前出)。この提案は、最も前にある細胞型が hh 発現の減少に対して最も大きい感受性を示し、hhが高レベルで至る所に発現される場合は、３°の剛毛の全ておよび４°の剛毛のいくつかがより前にある２°の細胞型の覆いのないクチクラ特性によって置き換えられるという観察結果によって支持された。野生型構築体を有する胚の熱ショック誘導によって３°およびいくつかの４°の運命の抑圧が再現されたが（図６Ｅ）、H329A 突然変異体は、幼虫の背面クチクラにおける細胞の運命を変えることができないことが分かる（図６Ｆ）。すなわち、H329A 突然変異によって阻止される自己タンパク質分解、または恐らく他のいくつかの機能は、Hh タンパク質の背面クチクラに対するパターン形成の影響に対して必須であると思われる。
【０１２４】
実施例５：成虫原基におけるシグナル化に対する H329A突然変異の影響 
H329A 突然変異体タンパク質の研究を、成虫構造のパターン形成および成虫原基内でのシグナル化に対する作用まで拡張した。目の成虫原基では、hh 機能が、パターンの適切な発生に対して必要であり(J．Mohler，Genetics 120: 1061，1988; J．J．Lee、前出および J．Mohlerおよび K．Vani、前出)、さらに最近は、目の形態形成溝におけるデカペンタプレージック(dpp)遺伝子の誘導によって分化の波の進行が制御されることが示されている(U．Heberleinら、Cell 75: 913,1993; および C．Maら、Cell 75: 927，1993)。肢および翅の成基では、hhの異所性発現が、パターンの重複および欠損を生じることも分かっており、前／後区画の境界に沿ったゾーンで正常に発現する他のシグナル化分子の異所性発現の誘導と関連する(T．Tabataおよび T．B．Komberg，Cell 76: 89，1994;および K．Baslerおよび G．Struhl，Nature 368: 208，1994)。
【０１２５】
成虫原基におけるシグナル化の研究に対しては、熱サイクラーを使用して、熱ショックによって誘導される hh 構築体を有する幼虫を、熱ショックおよび回収に順次かけた。成虫原基における dppおよび wg の発現に対する温度サイクリングの影響を、dpp プロモーター配列を有するレポーター遺伝子により、または wg 遺伝子に挿入したエンハンサー検出Ｐ因子によりβ−ガラクトシダーゼ発現をモニターすることにより調べた。図７では、X-gal 染色を使用して、wg-lacZ または dpp-lacZ 受容体遺伝子を有する三齢後期の幼虫の成虫原基における wg の発現（図７、Ａ〜Ｃ）または dppの発現（図７、Ｄ〜Ｌ）を行った。対照の幼虫（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ）由来の肢（Ａ〜Ｆ）、翅（Ｇ〜Ｉ）および目−触角原基（Ｊ〜Ｌ）、hshh導入遺伝子を有する幼虫（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ）ならびに hshh H329A導入遺伝子を有する幼虫（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）を示す。全てのパネルにおいて、前部は左側である。矢印によって次の特徴を強調する。すなわち、hshh H329A幼虫（Ｉ）における翅原基の前部区画での dpp発現の異所性部分；および hshh 幼虫（Ｋ）における形態形成溝（さらに後部に dpp発現の他のバンドで記す）より前部の目−触角原基の目の部分での dpp発現の異所性バンドである。hshh幼虫での肢原基における wg 発現ならびに肢および翅原基における dpp発現の前部区画への拡張は、肢（ＢおよびＥ）および翅原基（Ｈ）の前部区画での hh 形態学的変化の異所性発現に対して記載したものと同じであり、記載された通りであった(K.Baslerおよび G．Struhl、前出)。これに対して、hshh H329A および対照の幼虫由来の原基は、たとえ延長した熱ショック条件下でも、wgおよび dpp発現における変化はごくわずかであり、形態学的変化は全く認められなかった。（Ｍ〜Ｏ）は、上記した成虫原基の実験と同様の方法で幼虫発生中にショックを与えた成虫の対照（Ｍ）、hshh（Ｎ）および hshh H329A （Ｏ）のハエの目の表現型である。hshhハエでは目の重複構造が認められたが、hshh H329A ハエでは全く認められなかった。（Ｎ）における矢印は、二つの目の構造間の細いクチクラ片を示す。hshhハエでは、他の変形も見られた（例えば、ＮとＭの胸部を比較）。
【０１２６】
ホモ接合系 hshh（D．T．Changら、Development，1994, 印刷中）、hshh H329Aおよび y1w1118由来の処女ハエを、ホモ接合 BS3.0系（第２染色体上にＰ因子 dppレポーター構築体を有し、dpp-lacZと言う。）(R．K．Blackmanら、Development 111:657，1991)または系 y; Sco/CyO，enlacZ11::wg （第２染色体バランサー上に wg レポーターＰ因子エンハンサートラップを有し、wg-lacZ と言う。）(J．A．Kassisら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89: 1919，1992)由来の雄と交配させた。子孫を、酵母ペーストを含む通気した 0.5 ml マイクロ遠心チューブにおいて 25 ℃で、幼虫の二齢後期または三齢初期段階の発生まで成長させた。次いで、その幼虫を、三齢後期段階に達するまで、37℃で 30 分間、次いで 25℃で 90 分間、Perkin-Elmer熱サイクラーで連続的に熱サイクルにかけた。次いで、切開し、記載に従って X-galにより染色する（M．Ashburner、前出）か、表現型分析のために成熟期まで成長させた。
【０１２７】
図７Ａに示すように、wg発現は、正常には、前／後部区画の境界線に沿って肢原基の腹部で生じるが、dpp は、この境界線に沿ってその原基の背面部分で発現される（図７Ｄ）。野生型 hh 遺伝子を有する幼虫の熱サイクルにより、異常な肢原基形態および両方の標的遺伝子の広範囲にわたる異所性発現が生じたが、異所性 hh 発現に対して以前に報告したように（図７ＢおよびＥ）、H329A 構築体は、これらの発現パターンにおいて、たとえあっても、検出可能な相違はほとんど生じなかった（図ＣおよびＦ）。翅原基における異所性 hh 発現も、形態学的変化および dppの拡張発現をもたらす（図７、ＧおよびＨを比較）が、H329A 構築体は、時折、小さい部分の前部異所性発現のみを生じた（図７Ｉ）
野生型 hh の偏在発現は、目−触角原基における dppの異所性発現ももたらす（図７、ＪおよびＫを比較）。この原基の触角部分では、dpp 発現の拡張が、肢原基において認められるものと似ている。その原基の目の部分では、dpp 発現が溝の正常な位置で認められるが、異所性発現も、溝より幾分前の位置で第二の背腹バンドの形状で生じる。すなわち、目の原基が二つの形態学的な溝とともに現れる（図７Ｋ）。実際、野生型 hh 構築体を有する、熱サイクルを受けた幼虫に由来する成虫では、図７Ｎに見られるような明らかに重複した目の構造を認めることができ、二つの目の構造は、細いクチクラ片によって隔てられる（矢印）。
【０１２８】
これに対して、H329A 突然変異体タンパク質は、目−触角原基のどちらの部分でも dpp発現の拡張を誘導しなかった（図７Ｌ）し、成虫での目の重複またはクチクラの欠損も誘導しない（図７Ｏ）。
【０１２９】
すなわち、これまで記載した実験は、２日間熱サイクルにかけた後、直ちに切開して成虫構造の分析を行い、または一定温度でさらにインキュベートして成虫構造の分析を行う多系列の幼虫を含む。H329A タンパク質は、これらの実験ではほとんど活性がないように見えたが、翅原基において誘導された小さい部分の異所性 dpp発現（図７Ｉ、矢印）は、いくらか残留活性が残っていることを示唆した。この示唆は、切開の前に３日間の熱サイクルを含む同様の実験からもたらされた。H329A タンパク質は、この実験で、明らかにいくらかの dpp−誘導活性を示した。これは、恐らく、より長い熱サイクル期間中に蓄積されたより多量のタンパク質の結果としてである。他の成虫原基もそうであるが、特に翅原基は、量が低くて可変の異所性 dpp発現を示した。全ての場合のこの発現は、同時に調べた野生型構築体に対して認められたものと比べてあまり広くない。さらに、成虫原基の形態学的変形は、野生型タンパク質の場合はかなり一般的であるが、H329A の場合は極めてまれであった。その効力は、野生型に対してかなり低められるが、H329A タンパク質は、wg および dpp発現の初期の胚による誘導ならびに成虫原基による誘導において、少なくともいくらかの活性を保持した。これに対して、H329A 突然変異体は、野生株による実施に対して必要な条件よりもかなり厳しい熱ショック条件下でさえ、幼虫の背面クチクラでの細胞の運命の再特定に関しては完全に不活性のままであった。
【０１３０】
実施例６：ＮおよびＣの培養細胞上清への異なる遊離 
hh機能で当惑させられる特徴は、wgおよび dppへの胚および成虫原基によるシグナル化などの状況におけるその明らかに短い範囲の機能、ならびに、背面幼虫クチクラのパターン形成などの他の状況におけるより長い範囲の機能である。これらの観察結果および in vivoでの二つの主なタンパク質産物の存在により、Ｓ２培養細胞で発現したＮおよびＣの可溶性または分散性における相違が容易に見いだされた。図８（Ａ）および（Ｂ）は、Hhタンパク質を発現する、トランスフェクションしたＳ２細胞培養物の細胞ペレット（レーン１）または上清（レーン２）の、Ab1 （Ａ）および Ab2（Ｂ）で展開させたイムノブロットである。各レーンにおけるサンプルは、同量の再懸濁した全培養物から採取した。Ｎは、ほとんどが細胞ペレットと会合したままであった（Ａのレーン１および２を比較）が、Ｃは、ほぼ定量的に上清に遊離した（Ｂのレーン１および２を比較）。Ｕは、ＮおよびＣの特性間に分配される特性を示した（ＡおよびＢ）。（８Ｃ）は、in vitro翻訳によって生じた種々の Hh タンパク質物質のヘパリン結合活性をミクロソームによって示す。サンプルは、全翻訳混合物（レーン１）、ヘパリンアガロースまたはアガロース（対照）ビーズとともにインキュベートした後の上清（レーン２および４）および洗浄後にヘパリンアガロースまたはアガロースビーズから溶離した物質（レーン３および５）であった。Ｆ、Ｕ、ＮssおよびＮ断片は、アガロースビーズではなくヘパリンアガロースとともにインキュベートした反応物で減少しており（レーン２および４を１と比較）、同物質は、次いで、アガロースビーズではなくヘパリンアガロースから溶離することができる（レーン３および５をレーン１と比較）。図８、ＡおよびＢは、実際に、これらのタンパク質が異なって挙動し、Ｎ断片のほとんどは細胞に会合したままであり、Ｃの全て、またはほとんど全ては、培養上清に遊離されていることを示す。
【０１３１】
この異なる挙動の説明として考えられる一つは、Ｓ２細胞の表面上でのＮ断片と細胞外マトリックスタンパク質との会合である。そこで、ヘパリン結合が、細胞外マトリックスと会合するタンパク質の一般的特性であるため、これら二つのタンパク質のヘパリンアガロースに対する相対的親和性を調べた。
【０１３２】
培養細胞から可溶性のＮを得ることは明らかに困難であるため、ミクロソームの存在下での in vitro 翻訳を使用して、可溶性の標識ＮおよびＣを生じさせた。図８Ｃに示すように、ＣではなくＮが、ヘパリンアガロースビーズとの処理により、これらの翻訳抽出物で減少しているが、未修飾アガロースビーズでの処理では、どちらの断片も減少しなかった。さらに、ＣではなくＮは、0.1 % Triton X-100および 150 mM のＮａＣｌを含む溶液で十分洗浄しても、ヘパリンアガロースビーズに保持されたままであった。これに対して、未修飾アガロースの場合は、どちらの断片も保持されなかった。ＣではなくＮは、ヘパリンにしっかり結合する。そして、この挙動は、培養上清に遊離されるＮの濃度が低いことが、細胞外マトリックスへの結合の結果であると考えられることを示唆している。ＮおよびＣの培養上清への異なる遊離に寄与すると考えられる別のメカニズムは、ＣではなくＮに対する受容体のＳ２細胞での発現である。本発明者らの現在データでは、これらの可能性を判別することはできない。
【０１３３】
実施例７：ＮおよびＣの胚におけるはっきり異なる局在化
ＮおよびＣの培養細胞上清への異なる遊離は、これらの断片が、胚での局在化でも異なっている可能性を示唆した。先に報告された hh タンパク質の局在化は、Ｎエピトープに対して特異的である抗体またはＮおよびＣの間を区別することができない抗体を使用したものである。図９は、ＮおよびＣの胚での異なる局在化を hh 転写産物の in situ局在化によって示したものである。図９（Ａ）は、各々、パネル（９Ｂ）および（９Ｃ）での Ab1および Ab2により検出されるＮおよびＣエピトープの分布と比較して示す。ＮおよびＣエピトープの分布は、各々、各体節単位の約３分の１および２分の１に及び、転写産物は、各単位の約４分の１に限られることに着目されたい。（９Ｄ）では、hh13E対立遺伝子に対してホモ接合である胚でのＣエピトープの局在化を Ab2を使用して検出する。自己タンパク質分解活性が低下したこの突然変異体でのＣエピトープは、より制限され、Ｎの野生型局在化に似ている。ホモ接合性 hh13E胚は、ヘテロ接合性の親ストックからの印のあるバランサーの減少により確認した。全ての胚は、中期〜後期ステージ９にある（生殖バンドの拡張）。
【０１３４】
図９Ｂは、これらの報告の通り、Ｎエピトープに対して特異的である Ab1が、体節によって局在した分布を示し、同じステージの hh 転写産物よりもわずかに広いことを示す（図９Ａ）。また、これらの報告と一致して、より後期ステージでのＮエピトープは、大きい点のような構造で蓄積することが確認された。本発明者らのここでの分析は、抗体染色は弱いが、後に表皮に折り目をつけ、それによって解釈を複雑にする陥入および溝が形成される前である初期のステージに集中している。また、Ab2 を使用することにより、種々の固定および染色法を使用してＣ−特異的エピトープを検出した。上記背景でのＣエピトープの検出はＮの場合より困難であるが、分布がＮよりも広いにもかかわらず、体節により調節されたパターンが一致して確認された（図９）。この局在化は、初期または後期ステージでのＣエピトープが、Ｎに特徴的な点構造では存在しないという点でもはっきり異なる。
【０１３５】
hh13E突然変異は、早期に切断されて、正常にはＣＯＯＨ末端に存在する 15残基を失ったタンパク質をコードする。このタンパク質は、自己タンパク質分解の効率がかなり低下しているので、この突然変異体の背景におけるＣの分布を調べた。図９Ｄは、ホモ接合性 hh13E胚でのＣエピトープ（印のあるバランサーの不在によって確認）が、野生型よりもかなりぎっしり詰まった体節パターンで分布していることを示す。この局在化はＮのものと似ている。すなわち、Ｃエピトープは正常には広く分布するが、hh13Eでは、合成部位付近での切断されていない前駆体の保持によってその分布が変化すると結論付けられる。
【０１３６】
実施例８：活性ヘッジホッグタンパク質の生物発生における自己タンパク質分解の役割
シグナル切断の他に、hhタンパク質は、内部で自己タンパク質分解を受けて、in vivo で認められる主なタンパク質種を生じる。この自己タンパク質分解機能に必要なアミノ酸残基の全てまたはほとんどは、この内部切断のカルボキシ末端Ｃ側にあるのが認められる。自己タンパク質分解の機能に対する重要性を調べる努力において、hh タンパク質の自己タンパク質分解を阻止する単一残基の突然変異(H329A)を in vitro で導入し、このタンパク質のプロセシングおよび機能がともに、in vivo で損なわれるのを示した。同様のレベルの誘導タンパク質が、野生型構築体を有する菌株または突然変異構築体の独立した挿入物を有するいくつかの菌株から検出されたので（図５）、野生型に対して損なわれた H329A タンパク質の機能は、発現レベル低下の結果ではない。自己タンパク質分解の役割を支持するさらに別の証拠が、hhタンパク質の自己タンパク質分解を in vitroで低下させるが、無くすわけではない hh13E突然変異の影響から得られる（図４）。従って、hh13E突然変異は、in vivo での中間強度の表現型と関連する（J．Mohler、前出）。
【０１３７】
不思議なことに、H329A Hhタンパク質は、胚でのシグナル化において弱い活性を保持して異所性 wg 発現を誘導するように思われ、また、程度は小さいが、成虫原基でのシグナル化において機能して異所性 wg および dpp発現を誘導することができる。胚および成虫組織での少なくともいくつかのシグナル化機能の保持とは反対に、H329 タンパク質は、幼虫の背面クチクラにおける細胞の運命のプログラムを作りなおす能力に対してアッセイすると、完全に不活性である。
【０１３８】
H329A タンパク質が活性であるか、部分的に活性であるアッセイは、正常には、一つまたは精々いくつかの細胞の直径にわたって生じる短い範囲のシグナル化を含む。これに対して、H329A タンパク質は、正常には体節のほとんどにわたって作用する長い範囲の活性である背面クチクラのパターン形成に対しては何ら影響を及ぼすことができない。長い範囲のパターン形成活性を明らかにするための以前の提案は、hh発現が他のシグナル化分子を誘導し、それがパターン形成機能に関与していることを示唆している（シグナルリレーモデル；図１０Ａ参照）。
【０１３９】
図１０は、hhタンパク質機能に対するシグナルリレーモデル対二重機能モデルを示す。図１０（Ａ）では、hhシグナル化の長い範囲の影響が第二のシグナル化分子（Ｘ）の短い範囲の誘導によって間接的に達成される。その生化学的特性および限定された組織局在化に基づくと、Ｎは、短い範囲の活性シグナルを表すと推測され、一方、Ｃの役割は、Ｎの生物発生に必要な触媒機構の提供に限定されるだろう。（１０Ｂ）では、hhの長い範囲および短い範囲のシグナル化機能が、Ｕ前駆体の内部自己タンパク質分解によって誘導されるＮおよびＣタンパク質によって提供される。Ｎは、その細胞での合成部位付近に留まることにより、短い範囲のシグナル化に関係し、一方、Ｃは、その分布における制限があまりなく、長い範囲のシグナル化機能を行う。両方のモデルとも、十分活性なシグナル化タンパク質の生成には、自己タンパク質分解が必要である。これ以上の議論は、テキストを参照されたい。
【０１４０】
これらの提案は、hh産物の見かけの長い範囲の活性を、短い範囲のシグナル化の間接的結果として理論的に説明することにより、hhヘッジホッグ機能の矛盾のないモードを支持することを意図したものである。確認された分布に基づくと、このモデルでの活性分子はＮであり、Ｃの役割は、Ｎの生物発生に必要な触媒機構の提供に限定される。
【０１４１】
本発明者らの証拠は、別のモデル、すなわち二重機能モデル（図１０Ｂ）を示唆するものである。このモデルでは、hhタンパク質の長い範囲および短い範囲の活性が、in vivo で認められる二つの主要な分子形状であるＮおよびＣによって行われる。hhを発現するＳ２細胞の培養培地へのＣ断片のほぼ定量的な遊離および広いが体節的に調節されたその胚内での分布は、Ｃが長い範囲のシグナル化を行い、またはそれに関与することを示唆している。他方、Ｎ断片は、主として、発現Ｓ２細胞と会合したままであり、ヘパリンにも結合する。これは、細胞外マトリックスとの会合の可能性を示唆している。これらの特性および体節的に限定されたＮの胚での分布は、短い範囲の hh シグナル化活性における役割を示唆するものである。試験した脊椎動物の Hh タンパク質は、自己プロセシングを受け、またそのシグナル配列のカルボキシ末端側に予測されるヘパリン結合部位を有すると思われるので、ショウジョウバエ（Drosophila）の発生情況におけるここで議論した二重機能モデルの多くの点が、脊椎動物の発生における hh タンパク質の機能にも当てはまると考えられる。
【０１４２】
Ｎによる短い範囲の機能は、H329A 突然変異体タンパク質が wg および dppの誘導に対するシグナル化において少なくとも部分的機能を有することと一致する。なぜならば、この突然変異は、正常であればＮを生じるタンパク質のアミノ末端部分に位置する残基は変えないからである。すなわち、未切断 H329Aタンパク質は、正常にはＮに対する推測される受容体と相互作用する全ての残基を有するが、カルボキシ末端配列の存在によりその相互作用の親和性に何らかの影響があると考えられ、こうして、H329A タンパク質の効力の減少が説明される。あるいは、H329A タンパク質の部分的機能は、切断を受けると思われるタンパク質の極めて小さい断片から誘導される可能性があり、Ｃと同一の移動度を有する非常にかすかなバンドが、H329A タンパク質による in vitro 翻訳において現れる（図４、レーン３）。Ｃによる長い範囲の機能は、長い範囲のシグナル化が、Ｃ断片の遊離を必要とし、またはそうでなければ、切断以外のいくつかの機能に対する H329A残基を必要とするので、本発明者らの観察結果とも一致する。
【０１４３】
Ｎを天然構築体（野生型 hh）から合成する場合、Ｎは、主として細胞に会合したままである（図１０Ｃ）が、培養細胞において切断した構築体から生じたＮは、主として培養培地に入る（図１０Ｄ）（構築体に関しては、Porterら、Nature，374:363，1995 を参照）。これらの結果により、断片Ｃによる自己プロセシングによって、細胞表面とのＮの会合度、従ってその作用範囲が調整され得ることがさらに確認される。
【０１４４】
実施例９：ヘッジホッグ相同体の単離 
マウスおよびヒトの hh-様配列を、Chang ら（Development，120: 1994）の図１における下線部の配列の可能な全てのコードの組み合わせに対して縮重したプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離した。ＰＣＲ増幅は 50 μl の反応液中に、50 μl に、100 ng〜2 μg のゲノムＤＮＡ（種のゲノムの大きさによる）、2 μM の各プライマー、200 μM のｄＮＴＰ(Pharmacia)、1X 反応緩衝液(Boehringer-Mannheim)および 2.5単位の Taqポリメラーゼ（Boehringer-Mannheim）を含む。増幅は、94℃で５分、75℃で Taqポリメラーゼを添加した後、94℃で１分、52℃で 1.5分および 72 ℃で１分を 30 サイクル行い、最後に 72 ℃で５分の伸長を行った。全ＰＣＲ産物を pBluescript（Stratagene）でクローン化した後、配列決定を行った。
【０１４５】
こうして得られたマウスのクローンは、プライマーの両端の間に 144個の塩基配列を含んでおり、［α-32Ｐ］ｄＡＴＰで標識し、8.5 dpc の胚ＲＮＡ全体および 14.5 dpc の胚脳から作製したマウスｃＤＮＡライブラリーのλZAP ベクター（A．Lanahanからの提供）での高緊縮スクリーニングに使用した。Hhg-1 に対応するいくつかのクローンを単離し、最も大きい 2629 bpの長さのもの（pDTC 8.0）を選択して、ジデオキシチェーンターミネーション法（Sangerら、1977）および Sequenase v2.0（US Biochemicals）を使用した配列分析を行った。緊縮は、７−デアザ−グアノシン(US Biochemicals)によって解いた。配列分析は、Geneworks 2.0（IntelliGenetics）および Mac Vector3.5(IBI)ソフトウェアパッケージを使用した。
【０１４６】
３つのマウスクローンのうちの１つ、Hhg-1 をプローブとして使用すると、8.5 dpc マウス胚ＤＮＡライブラリーから 2.0 kb のクローンが、また、14.5 dpc胚ｃＤＮＡライブラリーから 2.7 kb のクローンが得られた。2.7 kbのｃＤＮＡは、ノーザンブロットでのハイブリダイゼーションによって検出された 2.7 kbのバンドに対応するので、ほぼ全長のｍＲＮＡを表すと思われる。このｃＤＮＡ内のメチオニンで始まる最も大きいオープンリーディンクグフレームは、437 コドンを含み、その前に１個のインフレーム上流停止コドンがある。配列を比較すると、Hhg-1 によってコードされるタンパク質は、独立して解析したマウス Shh(Echelardら、Cell，75: 1417-1430，1993)と、残基 122におけるアルギニンがリシンであることを除いて同一であることが分かる。Hhg-1 はまた、ラット vhh-1遺伝子(97 %のアミノ酸が同一; Roelink ら、Cell，76: 761-775，1994)、ニワトリソニックヘッジホッグ(81 %が同一; Riddleら、Cell，75: 1401-1416，1993)およびゼブラフィッシュ由来の Shh(68 %が同一; Kraussら、Cell，75: 1431-1444，1993; Roelinkら、Cell，76: 761-775，1994)と密接に対応している。ＰＣＲによって生じた断片 Hhg-2および Hhg-3は、各々、マウスのヘッジホッグ遺伝子のインディアンおよびデザート(Indian and Desert)クラスに対応すると思われる(Echelardら、Cell，75: 1417-1430，1993)。
【０１４７】
Hhg-1 オープンリーディングフレームが二つのショウジョウバエ（Drosophila）hh配列と一列になることから、３個のタンパク質全てがそのアミノ末端付近に疎水性のアミノ酸配列を含むことが分かった。D．melanogaster タンパク質（残基 64 〜 83）内およびマウスタンパク質内の疎水性の広がりは、切断のためのシグナル配列として効率よく作用することが知られている(Lee ら、Cell，71: 33-50，1992)。ショウジョウバエ（Drosophila）のシグナル配列は共に、それらの内部の位置において独特であるが、マウス遺伝子の疎水性の広がりは、切断されるシグナル配列に対してより一般的な位置である最先端のアミノ末端で生じる。ショウジョウバエ（Drosophila）のシグナル配列のＮ−末端側の配列の一部は保存され、機能的役割を示唆するが、マウス遺伝子は、この領域に欠ける。
【０１４８】
Hhg-1 とシグナル配列のカルボキシ末端側の hh との間のアミノ酸同一性の全体的なレベルは 46 % である。より精密に調べると、残基 25 〜 187のアミノ末端部分は 69 % の同一性を示し、カルボキシ末端部分の残りの残基の同一性は 31 % とかなり低いことが分かる。hhと同様に、Hhg-1 をコードする配列は３個のエキソンに分けられ、これらのエキソンの境界は、コード配列内の、３個のショウジョウバエ（Drosophila）hhエキソンと同じ位置である。不思議なことに、第二および第三のエキソンのコード配列間の境界は、配列全体の保存レベルが高から低へ移る辺りに生じる。これら２つの境界の一致は、これらのタンパク質内の機能性ドメインの境界の可能性を示唆している。Hhg-1 コード配列内でのこの位置は、推測されるタンパク質加水分解による切断部位ともほぼ一致する。
【０１４９】
実施例１０：hh遺伝子のヒトクローニング 
２つのヒト hh 遺伝子に対する部分的配列が、Chang ら（Development，120: 3339，1994）および実施例９（図１１ＡおよびＢ）の概説に従い、hh−特異的縮重プライマーを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅により誘導したクローンのＤＮＡシークエンシングにより得られた。同じ方法により、同じプライマーまたは hh コード領域由来の他のプライマーまたは図１１ＡおよびＢに見られるヒト hh 断片のいずれかを使用してさらにスクリーニングすると、マウスで少なくとも３つの遺伝子が確認されているので、少なくとも第三の遺伝子、そして恐らくはさらに多くの遺伝子が得られることが予想される。ヒト hh 遺伝子のこれらの分節を使用すると、下記の、当業者が通常使用し、文献に広く記載されているクローン化法によって、ヒトタンパク質に対する全コード配列を得ることができる。
【０１５０】
例えば、胎児の種々の段階および器官（流産児由来）ならびに特定の乳児または成人の器官（病理学的または剖検試料由来）を含む種々のヒト起源の既製のｃＤＮＡライブラリーまたはＲＮＡが、hh配列の有無に関して、Chang ら（前出）に記載のプライマーおよびヒト断片の配列から直接誘導される他のプライマーを使用したＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲにより試験されている。hh配列を含む既製のライブラリーは、直接スクリーニングされ、必要な場合は、新しいライブラリーが、hh配列を含むＲＮＡ源から標準的方法によって構成されている。これらのスクリーニングのプローブは、異なるヒト hh 断片全ての混合物である。次いで、ｃＤＮＡクローンの配列を決定することができる。プローブ配列を含むほとんどのクローンはＮ領域に位置するが、ライブラリー作製の標準的方法により、３’端が極めて完全であるｃＤＮＡクローンが生じるので、Ｃをコードする全領域も含む。脊椎動物および無脊椎動物で以前に得られた hh をコードする全長の配列は全て、一本鎖ＲＮＡにおいてコードされるＮおよびＣ配列を含む。スクリーニングは、ヒト hh 遺伝子の断片の全てに対応する完全なオープンリーディングフレームが得られるまで続ける。特に、ヒト胎児脳ライブラリー（Stratagene，La Jolla，CA）からの 1.2 x 106個のクローンは、２つのヒト hh 断片（図１１ＡおよびＢ）の混合物をプローブとして使用してスクリーニングした。29個のクローンが、これらのプローブと特異的にハイブリダイズするとして確認された。
【０１５１】
第二に、hh配列を含むと確認されたＲＮＡ源は、アンカーＰＣＲ（文献では、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ端の迅速増幅）とも言う。）による鋳型として使用することができる。簡単に述べると、この方法は、配列が内部開始点から公知であるならば、ｍＲＮＡ配列の５’または３’側をさらに単離するための方法を提供する。
【０１５２】
第三に、ゲノムライブラリーは、第一の方法において記載したプローブを使用してスクリーニングすることができる。必要であれば、ヒト hh エキソンおよびコード配列は、配列決定により先に単離したヒトおよびマウスのコード配列にハイブリダイズさせることにより、また、ゲノムクローン内の全ての hh コード配列を同定するためのエキソン捕獲法によって同定する。これらのコード配列は、標準的組換えＤＮＡによって「縫い綴じる」ことにより、完全な hh オープンリーディンクグフレームを生じさせることができる。
【０１５３】
図１２ＡおよびＢは、大腸菌(E．coli)で産生され、精製して均一にしたショウジョウバエ（Drosophila）hhタンパク質の in vitro 切断反応を示す。このタンパク質は、残基 89 〜 254が欠失しているので、より溶解性が大きく、精製も容易である。また、Ｎ−末端には His6精製タグが付いている。このタンパク質の自己タンパク質分解は、還元剤（ＤＴＴ）の添加が引き金となって生じ、得られる産物は、in vivo で確認されるＣ断片に対応する。図１２、パネルＡは、ＤＴＴの添加による開始後の切断の時間経過を示す。パネルＢは、一定時間（４時間）で３桁にわたる大きさの濃度範囲でのインキュベーションを示すが、切断形への変換程度に相違はない。この濃度に依存しない切断速度は、切断の分子内メカニズムを暗示している。パネルＣは、切断された断片Ｃのアミノ末端配列により決定した切断部位周辺の配列を示す。切断部位は矢印で示し、Ｃ断片のエドマン分解によって分析した実際の残基は下線部である。パネルＣはまた、公表された全ての脊椎動物の hh 配列ならびに魚およびアフリカツメガエル由来の未公表のいくつかの配列も示す。示した配列は、ショウジョウバエ（Drosophila）hhの切断が生じる領域に対応し、その切断部位での Gly-Cys-Phe配列の絶対的な保存を示す。パネルＤは、種々の hh 遺伝子を鋳型として使用して、先の実施例で記載した in vitro 転写／翻訳反応を行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。dhh はショウジョウバエ（Drosophila）であり、twhhおよび zfshhはゼブラフィッシュの twiggy-winkleおよびソニック hh 遺伝子であり、mshhは、マウスの shh/Hgh-1/vhh-1遺伝子である。翻訳混合物は35Ｓ−標識システインを含み、得られる産物のオートラジオグラフィーによる可視化に使用した。なお、各遺伝子は、大きい物質（前駆体またはＵ）および二つの小さい切断物質（ＮおよびＣ）を生じる。より大きい物質は、脊椎動物の遺伝子の各々に対してはＣであるが、ショウジョウバエ（Drosophila）のＮは、脊椎動物のオープンリーディングフレームに存在するシグナル配列にアミノ末端をもたらす 60 残基が存在するため、Ｃより大きい。このパネルは、脊椎動物の hh タンパク質がショウジョウバエ（Drosophila）のタンパク質と同様にプロセシングを受けることを示す。パネルＥは、Ｃ断片のエドマン分解により、これら全てのタンパク質に対して、最初の回ではカウントされる35Ｓが放出されるが、その後は放出されないことを示し、これは、これら全ての hh タンパク質に対する自己タンパク質分解による切断部位が、パネルＣで強調して示した、保存される Gly-Cys-Phe配列の中央を形成する Cys残基のアミノ末端側に結合したアミドであることを示している。これは、他の hh ファミリーメンバー由来のタンパク質断片の組成物を確立するために一般的に適用できる方法である。
【０１５４】
実施例１１：中胚葉軸および神経前駆体での２種類の hh 遺伝子の異なる発現 
５つの異なるゼブラフィッシュ hh 様遺伝子に対応する部分配列を単離し、これらの遺伝子の２つに対する完全なコード配列を胚のｃＤＮＡライブラリーから得た。これら２つの配列の一つは、ゼブラフィッシュ nhh-1遺伝子と同一であり（Roelink ら、Cell，76: 761,1994）、Kraussら（Cell，75: 1431，1993）によって報告された shh遺伝子に対応すると思われる（図１３の記載を参照）。他の遺伝子である tiggy-winkle(Potter，B.，The Tale of Mrs．Tiggy-Winkle，The Penguin Group，London，1905)は、脊椎動物の新規 hh を表す。両方のコード配列を、ソニック/vhh-1クラスのマウスおよびニワトリの配列と並べて示す（図１３ｂ）。他の脊椎動物 hh 相同体と同様、twhhおよび shhタンパク質は、疎水性残基のアミノ末端の広がりを含む。これらの残基は、コード配列をミクロソームの存在下で翻訳すると、切断が認められるので、シグナル配列として機能する。すなわち、脊椎動物の hh 遺伝子は、ショウジョウバエ（Drosophila）hhに対して先に報告したように（Kimmel C.B．& Warga，R.M.，Developmental Biology，124: 269-280，1987; Warge，R.M.，& Kimmel，C.B.，Development，108: 569-580，1990）、分泌タンパク質をコードすると思われる。
【０１５５】
最初の４個の配列は、記載したように（Chang ら、前出）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で縮重プライマーを使用して、ゼブラフィッシュのゲノムＤＮＡ（J．Pellegrino からの提供）から単離し、twhhおよび shhクローンは、最初の３個の配列をプローブとして使用して、20〜28時間のｃＤＮＡライブラリー（R. Riggleman，K．Helde，D．Grunwald および J．Pellegrinoからの提供）から単離した。twhhおよび shhの翻訳リーデイングフレームは、各々、推定上の開始メチオニンの上流の閉じた 12 および 16 コドンであった。
【０１５６】
図１３はには、予測されるアミノ酸配列を一文字コードで示す。１３（ａ）は、異なる５個の hh 様遺伝子に共通の配列を示し、点が、ゼブラフィッシュの twiggy-winkle（twhh; Potter 1905; 前出）の対応する残基と同一であることを示す。hh[zfB]および hh[zfC]は、より多くずれており、新規クラスを表すと思われる。１３（ｂ）は、twhhおよび shhのアミノ酸配列を、ニワトリおよびマウス由来のソニック/vhh-1クラスの配列(Riddleら、Cell，75: 1401-1416，1993; Chang，D.T.ら、Development, 前出; Echelard，Y.，ら、Cell，75: 1431-1444, 1993)と並べて示す。ゼブラフィッシュのソニックヘッジホッグ(shh)は、Roelink ら、Cell，76: 761-775，1994 で報告された z-vhh-1と配列が同じである。
【０１５７】
コード領域のほとんどにわたる発現および広範囲の配列の同一性に基づくと、vhh-1 およびここで報告したソニック配列は恐らく、Kraussら、Cell，75: 1431-1444，1993 の shhに対応し、カルボキシ末端付近の 26 残基が激しくずれている。ラットの vhh-1／ソニック hh（Roelinkら、前出）は、その 97 % の配列が予想されるマウスタンパク質と同一であるため、この配列では除いた。４個全ての配列が同じである残基は四角で囲み、ダッシュ（−）はその配列におけるギャップを示す。矢印は、twhhに対して予想されるシグナル配列切断部位を示す（von Heijine，G.，Nucleic Acids Res.，14，4683-4690，1986）。４個全ての hh 遺伝子に共通のアミノ末端の疎水性部分には影をつけた。１３（ｃ）は、カルボキシ末端から疎水性領域までの残基の同一性（％）を示す。
【０１５８】
図１４は、ゼブラフィッシュの胚発生中の twhh、shh および pax-2の発現の比較を示す。0 〜 36 時間の胚に対するホールマウント in situハイブリダイゼーションを、Tautz および Pfeifle，Chronosoma，98: 81-85，1989 の方法の改良を使用し、アンチセンスプローブを用いて行った。転写産物の局在化は、アルカリホスファターゼ酵素反応の紫色の産物によって示される。胚のステージは、Westerfield，M.,（The Zebrafish Book，University of Oregon Press，Eugene，1993）に従う。転写産物は、胚全体に対する in situハイブリダイゼーションにより可視化した。（ａ，ｂ）は、single late shieldステージの胚での twhh の発現である。（ａ）は、背面図であり、動物極は上側である。三角形の発現は、内胚葉の軸性中胚葉形成細胞の特徴である(Statchel，S.E.ら、Development，117: 1261-1274，1993)。（ｂ）は側面図であり、胚の左（背）側の細胞のより厚みのある層は、胎盾である。二つの矢印は、twhh発現内胚葉細胞および非発現外胚葉原基を示す。続く全ての胚において、前部は左側である。全ての側面図において、背部は上側である。（ｃ，ｄ）は、原腸形成の終わりの単一胚であり（100 % 被覆）、twhh発現細胞を有する。（ｄ）は、尾−背側から見た図である。
【０１５９】
運命が予定されている尾芽では広く染色されており、前部にいくと狭くなっている。（ｅ，ｊ）は初期体節発生の胚である（11.5時間、３〜４体節）。眼胞は、間脳壁からの膨出をまだ始めていない。（ｅ，ｈ，ｋ）は、発生中の脳の側面図である。（ｆ，ｉ，ｌ）は、発生中の脳の背面図である。（ｅ，ｆ，ｇ）は、底板を形成する一列の細胞における twhh 発現の局在化を示す。矢じりは、尾芽に対して外側の twhh 発現細胞の部分を示す。（ｈ，ｉ，ｊ）は、shh の局在化を示す。shh は、隆起においても強く発現する。（ｊ）は、発生中の尾の側面図である。shh は、隆起においても強く発現する。（ｊ）は、発生中の尾の側面図である。shh は、底板および脊索の両方を形成する細胞で発現する。（ｋ，ｌ，ｍ）は、眼胞の初期形成中の pax-2の局在化を示す。（ｍ）は twhh 発現も示す。（ｋ）は、12時間（４〜５体節）の胚である。（ｌ）は、12.5時間（5〜6 体節）の胚である。発生中の眼胞における pax-2の発現は、隆起から離れて傾斜している。pax-2 の発現（星印）は、将来の中脳−菱脳の境界にある。（ｍ）は、６〜７体節（13時間）ステージの胚における twhh （矢印）および pax-2の発現を示す。腹部神経キール（他の脊椎動物では、神経管に対応する）では twhh の異なる発現が見られる。（ｎ〜ｓ）は、体節発生終期（22〜24時間）の胚である。（ｎ，ｏ，ｐ）は、twhh の局在化を示す。（ｎ，ｏ）は、発生中の脳である。間脳（黒い三角）および隆起（矢じり）での孤立した細胞染色ならびに中脳および菱脳の下における底板の発現が見られる。底板の発現は、軸に沿って、尾の方に連続している。（ｎ）は側面図である。（ｏ）は背面図である。（ｐ）は尾の側面図である。発現は、底板に限定されている。（ｑ，ｒ，ｓ）は、shh の局在化を示す。（ｑ，ｒ）は発生中の脳である。（ｑ）は側面図である。耳胞での pax-2の発現を示す。（ｒ）は側面図である。隆起（矢じり）および神経キールで発現が見られる。（ｓ）は尾の側面図である。発現は底板で最も強いが、Kraussら、前出の報告とは反対に、脊索でもまだ見られる。略号：白字ｅ：外胚葉原基；ｈ：内胚葉；ｔｂ：尾芽；ｐ：隆起；ｃ：目；ｏｖ：眼胞；ｏｔ：耳胞；ｆｐ：底板；ｎｃ：脊索；＊：中脳−菱脳の境界または pax-2標識した将来の中脳−菱脳の境界；ｔ：終脳 twhh及びshh 発現パターン(Kraussら、上出)を比較することにより、タイミング、吻−尾部範囲(rostra-caudal extent)及び組織限定において顕著な差異を示すものの、両者の遺伝子は正中線構造において主として発現されることが判る。
【０１６０】
twhhの発現は背部中胚葉における原腸形成の間に最初に検出される(図14a,b)。
この発現は、ツメガエルのSpemann 形成体に類似した構造、胎盾の成分に対応するバンド中に見られる(Stachelら、Dev.，117:1261-1274，1993 及びその中の引用文献; Ho.，R.，Seminars in Developmental Biology，pg.3，1992)。集中及び延長の動きと協調して、原腸形成の終わりまでに軸全体にわたって発現が起こるまで、このtwhh発現のバンドは赤道面に沿って短くなり、初期胚軸に沿って延長する(図14c,d)。体節発生の初期に、twhhＲＮＡは全体に沿って推定腹側神経組織に限定的に見られ(図14e,f,g)、尾芽中及びその付近の細胞のみを例外とする(図14g)。twhhが神経に限定されるのに対し、shh は推定神経細胞及び脊索細胞の両方に局在している(図14j)。
【０１６１】
体節発生が進行するにつれて、shh 及びtwhhの腹側正中線発現は予定前脳の大部分において減少するが、予定間脳の床内では正中線細胞の前方斑(anterior patch)において強いままである(twhhについて図14e，f、shhについて図h，i)。この斑は後に間脳の前方延長である隆起を生じさせる(Schmitt，E.A.及びDowling, J.D.，J．Comp．Neur.，344:532-542，1994)。発生中の眼茎の内側でちょうど吻側のこの構造が、発生中の眼の初期パターン形成活性の焦点として我々が提案する部位である(下記参照)。体節発生の終了までに、twhh及びshh の両方が底板上に強く発現されるが(図14p,s)、この段階及び発生の36時間においてshh 転写物は依然として脊索に検出される(図14s、後の段階は示していない)。28時間において、twhh転写物は最初の鰓弓内の細胞の小クラスター中においても見られ(示していない)、これは発生の33時間においてshh についても報告されているのと同様である(Kraussら、上出)。
【０１６２】
twhh及びshh 発現の差異は原腸形成の当初から明らかで、twhhＲＮＡが遮蔽段階と同じくらい早く検出できるのに対し、shh は約60% 被覆において後に検出される(示していない、Kraussら、上出)。さらに、twhh転写物は発生の初期においては神経組織に限定され、脊索には全く検出されない(図14gを図14jと比較せよ)。発現のその後の差異には、間脳及び中脳内における異なる吻−尾部限定、及び前記隆起におけるより弱くさらに限定されたtwhhの発現があり（図14n 及び14q を比較のこと）、脳内のtwhh発現の後期のドメインがshh ドメインの要素を構成するようである。さらにshhは発生中の鰭芽で発現されるが、twhhではされない(Krauss ら、上出)。shh 及びtwhh発現パターンをこの熱帯魚及びその他の脊椎動物種のhh同族体についてのこれまでの報告と比較することにより、shh はsonic/vhh-I クラスの熱帯魚同族体であり、twhhは脊椎動物hhの新しいクラスを表すものであることが示される。
【０１６３】
実施例１２：熱帯魚胚発生の間の異所性hh発現の発生における結果 
発生におけるhh産物の潜在的役割についての考察を得るために、合成twhh及びshh ｍＲＮＡを1-8 の細胞胚に注入した。この方法により、β-ガラクトシダーゼをコードする対照ｍＲＮＡについて測定されるように（示していない）、モザイク状ではあるがかなり均一な発現パターンが得られる。発現の均一性は初期熱帯魚胚の原基分布図の研究とよく一致しており(Kimmel 及びWarga、上出; Warga 及びKimmel、上出; Heide ら、Science，265:517-520，1994)、これは原腸形成の前の開裂の間に卵割球が広範な細胞混合を経験することを示している。モザイク状発現は、驚くほどわずかながhh注入胚の表現型における変化しか引き起こさず、これはおそらくhh遺伝子産物の分泌によるものと思われる。
【０１６４】
合成twhhまたはshh ｍＲＮＡ(hhＲＮＡ)を注入された胚は、lacZｍＲＮＡを注入された対照胚と比較してさらに高度に再現可能な奇形を示した。これらの奇形は以下に説明するが、主として脳及び眼における異常である。異所性twhh及びshh 発現の効果は定性的には同様なものであるが、範囲及び強さはtwhhＲＮＡによるものの方が大きい（以下の記載、図15及び図16参照）。これらの２種の遺伝子によりコードされるタンパク質は、定性的には同様の生物学的活性を有しているが、その潜在力において明確な差異を有している。
【０１６５】
図15は、熱帯魚発生における異所性hhの影響を示す。野生型熱帯魚(Danio rerio，Ekkwill Waterlife Resources)を28.5℃で維持し、いくつかの胚を室温で一晩培養した。熱帯魚胚に1-8 細胞段階においてtwhh、shhまたはlacZＲＮＡを注入し、発生28時間後に調べた。(a-c)中脳-後脳領域の背部図、前方が左である(a) lacZ(b) twhh(c) shh(d-f)前脳領域の前頭眼断面、前方が上である。(d) lacZ(h) twhh(f) shh(g-l)眼領域の側方図、前方が左である。(g) lacZ(h) twhh(i) twhh予定脳の下部のレベルにおいて、殆どのhh注入胚において形成された脊索、体節及び神経隆条は、軸の全体的な短縮と背部屈曲を除いては概ね正常であるようであった。hh注入胚の少数(15%は示していない)は部分的に分岐した軸を示し、これは二重になった軸中胚葉及び平行な神経隆条を含み、各神経隆条は腹側正中線細胞といくらかの左右対照の側方細胞を含む(示していない)。我々はこれらの軸の異常の主要な原因を究明していないが、後期の原腸形成段階の胚の分析により、分岐は被覆及び集中の困難性によるものであり得ることを示している。略号: mv- 中脳脳室、rv- 菱脳脳室、アスタリスク- 中脳-後脳境界、ot- 耳小胞、tv- 第三(間脳)脳室、r-網膜または網膜様構造、l-水晶体または水晶体様構造、pe- 色素網膜上皮。
【０１６６】
脳及びその他の吻側神経誘導体の形態的異常は、hh注入胚において高い頻度で起こる。発生28時間後に通常は明確な魚の脳の三つの脳室、すなわち菱脳、中脳(図15a)、及び間脳(第三脳室、図15d)の脳室は、hhを注入した胚の脳においては、内腔が明らかに存在しているにもかかわらず形成されない(図15b,c 、図15e,f)。通常は中脳-後脳境界に存在する明確な構築物もない(図15a を図15b,cと比較せよ)。この構築物の形成はpax-2 の機能を必要とし(Krauss ら、Nature，353:267-270，1991; Kraussら、Nature，360:87-89，1992)、これは通常は中脳-後脳境界のバンドに発現する(Kraussら、上出; Kraussら、Development，11 3:1193-1206，1991)。しかし、この境界においてpax2発現はhhＲＮＡの注入によって中断されず、この表現型は吻−尾部情報の中断により生じるものではないことを示している。
【０１６７】
眼の発生における異常は、hhＲＮＡを注入された胚においても高い頻度で起こる。即ち、28時間において、正常な熱帯魚の眼は水晶体と色素上皮を有する網膜とを有するが(図15d,g)、hh注入胚は通常、水晶体と網膜色素を発生させることができない(図15e,h)。眼の二重化(eye duplication)も低い頻度で見られる(図15i)。注入された胚のその他の部位における色素形成は正常なスケジュールで起こることから、十分に発生しない眼は単に発生が遅延していることによるものではないようである。発生の３日目に調べると、hhＲＮＡ注入の結果として、眼が完全にない場合から網膜の腹側部分を有する部分的に形成された眼に至る異常が見られた。
【０１６８】
hhＲＮＡ注入により起こる眼表現型は、熱帯魚及びアフリカツメガエル胚をレチノイン酸で処理したときに生成されるものに似ている。ツメガエルにおいて、表現型の範囲は、眼の減少及び水晶体の不存在から網膜の折り畳み（眼の二重化に似ている）及び多数の小さい水晶体を有する眼にわたる(Manns，M．& Fritzsch，B.，Neurosci．Lett.，127:150-154，1991)。熱帯魚においては、原腸形成の間にレチノイン酸に曝されると、眼の形成が阻害され(Holder，N．& Hill，J.，Development，113:1159-1170，1991)、眼原基の形成の間に曝されると二重の網膜や余分な水晶体の形成が誘導される(Hyattら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:8293-8297，1992)。ニワトリの肢節の発生に対するレチノイン酸のパターン形成効果は内因性のsonic hh遺伝子の異所性活性化を介して生じるようであり(Riddleら、上出)、異所性hh発現によるこれらの結果は、同様なメカニズムが、脊椎動物の眼のレチノイン酸処理のパターン形成効果の基礎となっている可能性を示唆している。
【０１６９】
実施例１３：眼胞におけるhhの発現は遠位運命を犠牲として近位運命を特定する 
眼の発生におけるhhの役割をさらに解明するために、pax-2 及びpax-6(Kraussら、EMBO J，10:3609-3619，1991; Pitischelら、Development，114:643-651，1992)を使用した。これらを位置マーカーとして使用して眼胞における異所性hh発現の効果を調べた。眼胞が熱帯魚前脳の側壁から膨出する時に(Schmitt，E.A.及びDowling，J.D.，J．Comp．Neur.，344:532-542，1994)、pax-2 は勾配で発現され、最高のＲＮＡレベルは眼胞の前方及び腹側領域にある(Krauss ら、上出; 図14k,l,m)。このpax-2 発現勾配の最大値に直ぐ隣接して隆起と呼ばれる間脳の領域があり(Schmitt及びDowning、上出)、ここではtwhh及びshh の両方が強く発現されるが、pax-2 はされない(図14e,f,h,i,m)。従って、眼胞におけるpax-2 発現の濃度勾配は隆起におけるtwhh及びshh 発現の部位に隣接する位置における最大値から下方に傾斜しているようである。pax-2 発現のパターンに対して眼胞内の発生運命が上位にあることより(Schmittら、上出)、pax-2 ＲＮＡの勾配が眼の将来の近位/遠位軸を予測していることを示している。
【０１７０】
異所性hhは、pax-2、pax-6 及びF-spondin の発現を変化させる。熱帯魚胚に1-8 細胞段階でtwhhまたはshh ＲＮＡを注入し、pax-2、pax-6またはF-spondin 発現のパターンを全組織in situ ハイブリダイゼーションにより調べた。lacZＲＮＡを注入した対照胚を全ての場合について使用し、これは野生型発現パターンを示すものであった。胚段階においての眼胞の前方-後方軸は将来の眼の近位-遠位軸に対応する。発生の次の時間の間に、眼胞の後方端が間脳から分離する(Schmitt及びDowling，Comp．Neur.，344:532-542，1994)。
いずれのhhＲＮＡの注入によっても、眼胞が膨出し始めるとその近位-遠位軸及び背部- 腹部軸の両方に沿ってpax-2 発現が均一に開始される。異所性pax-2発現は、正常なpax-2 発現が眼で開始されるのと同時に現れ、ある場合には、眼胞の間の間脳にも見られる。体節形成の終期、即ちpax-2 が通常は眼茎に限定されるときに、hh注入胚のpax-2 ＲＮＡは眼胞の最も遠位の部分を除く全てにおいて検出される。
【０１７１】
眼の発生に必須の転写因子をコードするpax-6 の発現に対する異所性hhの効果も調べた。熱帯魚の発生22時間後において、pax-6 は正常には水晶体及び眼杯の遠位部分の殆どにおいて発現される(Krauss ら、上出; Puschel ら、Developmemt，111:643-651，1992)。hh注入胚においては、pax-6 は眼胞において抑制されるが、多くの胚が最も遠位の細胞においてpax-6発現を保持している。位置同定のマーカーとしてのpax-2 及びpax-6 に関しては、眼胞におけるhh発現は近位運命を誘発し、遠位運命を抑制するものとして特徴付けることができる。
【０１７２】
眼胞の遠位部分が、pax-2 及びpax-6 遺伝子発現のhh誘発変化に最も耐性が高い。後の回転により、この眼胞の遠位部分は成熟した眼の背側部分を生じ(Schmittら、上出)、興味深いことに、これが中間的な表現型を有する３日齢の注入胚に残存する眼の部分である（上記参照）。
【０１７３】
pax-6 遺伝子の障害が、ヒト、マウス及びショウジョウバエにおけるそれぞれ無虹彩症(Tonら、Cell，67;1059-1074，1991; Glaserら、Nat．Genetics，2:232-239，1992)、小眼(Hill ら、Nature，354:522-525，1992)、及び無眼突然変異(Quiringら、Science 265:785-789，1994)の原因とされている。従って、pax-6の機能は、ショウジョウバエ及び哺乳動物の眼の発生に必須とされるようである。
【０１７４】
我々が本明細書で記載するように、hhによりコードされた活性も脊椎動物の眼の発生において何らかの役割を果たすようであり、ショウジョウバエの眼の発生におけるhhの役割は十分に確立されていることから、これは脊椎動物と昆虫との間の別の分子対等性を示唆している(Mohlerら、上出; Maら、上出; Heberlein ら、上出; Lee ら、上出)。発生中のショウジョウバエの眼における相互的で重複しないhhとpax-6 発現のパターン(Maら、上出; Quiring ら、Science，265:785-789，1994)は、hhによるpax-6 の抑制の可能性を示唆しているが、脊椎動物及びショウジョウバエの眼の発生において同様なメカニズムによりhhが機能するかどうかはさらに研究を要する問題である。
【０１７５】
マウスにおいては、正常な眼の発生のためにはpax-6 タンパク質の投与が必須である(Hillら、上出)。小眼異型接合体は異常に小さい水晶体を発生させ(Hoganら、J．Embryol．Exp．Morph.，97:95-110，1986; Hoganら、Development，103 Suppl.，115-119，1988)、これはより弱い表現型を有するhh注入胚と同様である(図14f)。その結果、水晶体を欠く小眼異型接合体が生成され、動物は誕生時において眼を欠いており(Hoganら、上出; Hogan ら、上出)、発生３日目におけるhh注入胚の多くのものも同様である。これらの対等性は、hh注入熱帯魚に見られる後期の眼の異常の多くのものは、眼の発生の間のpax-6 の部分的または完全な抑制により生じたものであり得ることを示唆している。
【０１７６】
実施例１４：hh前脳発現の遺伝子削除は眼胞の近位死亡を消失させる 
twhh及びshh 発現のパターン(図14)並びに異所性hh発現の効果(図15)は、眼発生におけるshh 及びtwhhの正常な役割と一致している。もしhh活性が発生中の眼における近位運命の促進において正常な役割を実際に果しているならば、hh活性を除去すると近位運命が消失することが予想される。cyclops 突然変異の胚異型接合子においては、腹側神経構造が形成されず、発生する眼が正中線で融合し、単眼の胚を生じる(Hattaら、Nature，350:339-341，1991)。cyclops 突然変異体の失われた腹側構造として、我々がtwhh及びshh の発現を観察した領域が含まれることから、cyclops 突然変異体のhh発現に対する影響を調べた。
【０１７７】
cycb16(Hattaら、Nature，350:339-341，1991)、異型接合体成体(R．Riggleman からの寄贈)を産卵させ、その子孫を全組織in situ ハイブリダイゼーションにより分析した。cyc 突然変異またはその野生型同胞細胞の胚異型接合子におけるpax-2及びtwhhまたはshh ＲＮＡの検出。twhhＲＮＡはcyc 胚の推定尾芽(カレット)に発現されるのみである。Kraussら、Cell、上出に報告されるように、shh の神経発現はcyc 胚において失われる。強いpax-2 発現が野生型胚の芽胞において観察され、これはcyc 突然変異胚において有意に減少する。
cyclops 胚におけるtwhhＲＮＡは、推定尾芽における細胞の小斑においてのみ見られ、調べた後期のいかなる段階においても神経発現は検出されなかった。shh の神経発現はeye 突然変異体でも失われるが、脊索においては発現が再度見られた(Kraussら、上出、データは示されていない)。
【０１７８】
eye 突然変異は発生中の脳においてablatc hh-発現細胞に現れるので、この突然変異は眼の発生におけるhhの機能についての要件を調べるための遺伝子学的手段として使用できる。Iiattaら; Hattaら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91:2061-2065，1994）は最近、通常はpax-6 を発現しない腹側正中線細胞の喪失のためにpax-6 発現が正中線で融合し、さらにeye 突然変異胚の融合した眼におけるpax-2 発現が減少することを示した。我々はこれらの観察を眼胞が最初に形成される初期の段階に拡張し、そして、pax-2 発現は弱く、eye 突然変異体における眼胞内に拡張されないことを見出した。異所性hh発現の結果と併せると、これらの観察は、その活性のシグナルを与えるhhが眼胞内で近位運命の誘発を促進しそれを誘発するために必要であることを示唆している。このモデルにおいて、前記隆起は、hh活性の局所化されたソースを与えることにより熱帯魚の眼の発生の近位パターン形成中心として機能すると我々は考える。
【０１７９】
実施例１５：hh活性は発生中の脳を腹側化する 
これまでの研究により神経管の腹側パターン形成における底板及び脊索からのシグナルの重要な役割が確立されている(Jessell，T.M.及びDodd，J.，Cell，69:95-110，1992)。例えば、Gouldingら、Development，117:1001-1016，1993は最近、脊索及び底板移植片が神経管中のpax-6 の正常な側方発現を抑制し得ることを示した。その他の最近の研究で腹側神経管パターン形成の少なくともいくつかの局面におけるhh活性が示されていることから(Echelardら、Cell，75: 1417-1430，1993; Kraussら、上出; Roelinkら、上出)、我々は脳におけるpax-6発現に対する影響についてhh注入胚を調べた。
【０１８０】
発生22時間後の熱帯魚においては、pax-6 は間脳の背部−側方領域及び後脳の腹側−側方ドメイン並びに底板及び隣接する細胞が含まれていない脊髄において発現される(Krauss ら、上出; Puschel ら、上出)。この発現のパターンは間脳（図14q 及び14i を比較せよ）及び後脳におけるtwhh及びshh の両方に対して相互的である。hhＲＮＡ注入により、間脳におけるより腹側のドメインでのpax-6が抑制され、より背部側の発現は持続した。さらにpax-6 発現は菱型節1、2 及び4 において腹側で顕著に抑制され、ある場合には、これらの菱型節においては完全になくなった。正常な胚において異所的に発現されるhh及びpax-6 の抑制効果は付近のhh発現細胞によるpax-6 の抑制によるものである。
【０１８１】
pax-6 発現が存在しないことは腹側正中線の特徴であるので、側方位置のpax-6の抑制は腹側化を示唆している。そこで、底板製造体、F-spondin(Riddleら、上出)の誘発の分析のためにtwhhを胚に注入した。上記したように、異所性のtwhhはより背部のレベルで中脳及び前方後脳においてF-spondin 発現を誘発する。pax-6 及びF-spondin の両方の発現に対するhhの影響は脳の腹側化を示している。側方細胞による腹側細胞の実体の選定は、それらが脳室を形成しないことを説明し得る(図15a-f)。
【０１８２】
twhhの腹側化活性は、ニワトリ、熱帯魚及びラットのshh/vhh-1 クラス遺伝子についてこれまでに報告されていたものを確認し拡張するものである(Echelardら、上出; Kraussら、上出; Roelinkら、上出)。しかし、twhhが初期において正中線神経前駆体に限定されることは、これが底板維持と拡張の純一発生メカニズムにおいて特定の役割を果している可能性があることを示唆している(Placzekら、Dev.，117:205-218，1993)。熱帯魚においては、cyclops 宿主における野生型細胞は隣接する細胞が底板を形成するのに貢献するとともに、それを誘導するが、これは移植された細胞が脊索ではなく神経板に集中した場合のみである(Hattaら、Nature，350:339-341，1991)。cyclops 変異体において、twhhの正中線発現は消失するが、shh 発現は脊索において維持されることを我々は示したが(図18; shh についてKraussら、上出)、これらの結果を併せると、cyclops 変異体で失われた純一発生底板シグナルがtwhh遺伝子によりコードされている可能性があることが示唆される。ニワトリ及びラットにおいては、脊索におけるshh/vhhlの継続した発現にもかかわらず、脊索による底板誘導特性の消失後も底板は長く自己誘導能を維持する(Roelinkら、上出; Placzekら、上出; Yamadaら、Cell，73:673-686，1993)。その他の脊椎動物においてはtwhhクラスの同族体は報告されていないが、twhhのパターンにより近いパターンにおけるその他のhh同族体の発現は、これらの矛盾を説明する一助となり得るかもしれない。
【０１８３】
実施例１６：twhhにコードされた前駆体から２種の別々の シグナル発生タンパク質が誘導される 
ショウジョウバエにおける内因性hhタンパク質は、大きい方の前駆体(非開裂のものはU)の内部自己タンパク質開裂により誘導されるアミノ及びカルボキシ末端断片(それぞれＮ及びＣ)として主に供給され、これはin vivo においても生じるが、より低いレベルである(Leeら、上出)。アミノ末端ドメイン内の決定子は自己タンパク質分解活性に必要とされないようであるが、カルボキシ末端ドメインに作用する突然変異は自己タンパク質分解をブロックし得、in vivo で活性を低下させる(Leeら、上出)。自己タンパク質分解は、通常は位置329 に存在するヒスチジンのアラニンによる置換によりブロックされる。このヒスチジンは、全ての公知のhhを整列させた場合において完全に不変であり、この配列の状況は自己タンパク質分解における触媒的役割を示唆している(Leeら、上出)。
【０１８４】
図17は熱帯魚ツイッギー−ウィンクルヘッジホッグ(twiggy-winkle hedgehog)誘導体を示す。17(a)種々のtwhhオープンリーディングフレームの略図である。SS(影をつけた)はこれらのタンパク質の分泌のための予想されるN-末端シグナル配列であり、各オープンリーディングフレームの最初の27アミノ酸を含む。矢印は自己タンパク質分解開裂の予想される内部部位を示す。アミノ酸残基番号は図13b に従う。黒の三角形はtwhhオープンリーディングフレームの通常の終止コドンを示す。構築物UHAは自己タンパク質分解をブロックする突然変異を含む(残基273のヒスチジンはアラニンに変化している; Lee，J.J.ら、上出参照)。構築物U356HAはアミノ酸残基357 の代わりに終止コドンを含むとともに、UHAにおけるH273A 突然変異を含む。構築物Ｎはtwhhの最初の200 アミノ酸のみをコードする。
【０１８５】
構築物Ｃは削除された残基31-197のコドンを有していた。17(b)はa の部分に概略的に示した発現構築物のin vitro翻訳を示す。構築物は35S メチオニンの存在下にin vitroで翻訳し、SDS-PAGEの後にオートラジオグラフィーで分析した。タンパク質生成物は左側に概略的に示す。レーン１及び６: 完全長(USS)タンパク質の自己タンパク質分解により二つの断片、すなわちN-末端断片(NSS)及びC-末端断片(C)が生成される。レーン２: 構築物UHAは、自己開裂によりUSStwhhとともに移動するtwhhタンパク質の非開裂形態のみを生成する。レーン５: 構築物Ｃは、接近して一緒に移動する二つのバンドとして認識されるプロセッシングされた形態とされていない形態とをコードする。一番下のバンドはUSS(Δ31-197)の自己タンパク質から形成されたＣタンパク質である。全ての構築物は、RPCR法を用いて発現構築物T7TStwhhのin vitro突然変異誘発により形成されたものである(図15参照)。全ての構築物の配列はジデオキシ配列決定法により確認した。in vitro翻訳は製造者(Promega)の説明書に従って行った。
【０１８６】
shh、twhh及びマウス-shh/Hhg-1によりコードされる脊椎動物hhタンパク質も自己タンパク質分解を受け、単一のより大きい前駆体から二つのより小さい種を生じる(Leeら、上出; Chang ら、上出; 図17b のレーン１及び６を参照)。自己タンパク質分解開裂しないtwhhタンパク質の形態(UHA)をコードする構築物を生成するための不変のヒスチジンのアラニンへの突然変異。我々はまた、ナンセンスコドンを導入し、コード配列のセグメントを削除して、twhhのアミノまたはカルボキシ末端ドメインのいずれかを生成する構築物を形成した(それぞれＮ及びＣ、図17b のレーン４及び５を参照、構築物を概略的に図17a に示す)。これらのタンパク質を分泌経路に向かわせるため、全ての構築物には正常なtwhhシグナル配列を保持させた。
【０１８７】
これらの構築物から転写された合成ｍＲＮＡを注入してプロセシングの役割を調べ、各タンパク質断片の活性をアッセイした。結果を表Ｉにまとめる。これらは図15に示した活性に基づくものである。これらの実験からの最も驚くべき結論は、Ｎ及びＣの両方が活性を示し、これらの活性が区別可能なものであることである。即ち、Ｎ及びＣの両方が眼の発生においてpax-2 を異所的に活性化することができ、それにより内部注入制御を与えることができるが、Ｎのみが効率的にpax-6 を発現することができた(図16)。後の水晶体発生に対する効果もＮの方が大きく、マウスにおけるその突然変異表現型により示唆された水晶体の発生におけるpax-6 の役割と一致した(Ton，C.C.ら、Cell 67:1059-1074，1991; Glaser，T．ら、Nat．Genetics 2:232-239，1992; Hill，R.E.ら、Nature 354:522-525，1991; Hogan，B.L.ら、J．Embryol．Exp．Morph.，97:95-110，1986; 及びHogan，B.L.ら、Development，103 Suppl.:115-119，1988.を参照)。
【０１８８】
デルタN-C の活性を考慮する場合、これらの実験における内因性hh遺伝子の活性を認識することが重要であり、これはデルタN-C 及びその断片により阻害される(さらに詳しくは実施例18及び図18を参照)。
【０１８９】
非開裂UHAタンパク質は、pax-2 の誘発においてＣよりも少しだけ活性が弱いが、pax-6 を効率的に抑制できなかった(図16)。前記UHAタンパク質(U356HA; 図17a，b参照)がＮとはそれほど変わらない活性を有していることから(図16)、後者のことは特に注目に値する。即ち、自己タンパク質分解及びpax-2 誘発に重要な決定子を有することに加えて、非開裂hhタンパク質についての場合、C-末端はN-末端機能を阻害するドメインも含む。C-末端は分子間のメカニズムによってＮの作用をも阻害し得る(Laiら、上出)。Ｃにおいてそのような阻害ドメインが存在することは、自己タンパク質分解が調節され得る場合には、そのような調節によりin vivoでhhの活性が制御され得ることを示唆している。この可能性は、生成される潜在的hh活性を理解するために、いかなる特定のパターン形成中心においても発現されるhhタンパク質のプロセシング状態を確認することの重要性を強調するものである。
【０１９０】
実施例１７：初期の眼及び脳のパターン形成における hhシグナル発生タンパク質の２重の役割 
眼及び脳のパターン形成におけるＮ及びＣの正常な役割を理解するにあたって、ショウジョウバエhh遺伝子のＮ及びＣ誘導体がいくらかの考察を与えてくれるかもしれない。ショウジョウバエＮ誘導体は、セグメントとして縞状に形成されたパターンにおいてその合成の胚部位の近くに保持され(Tabata 及びKornberg，Cell，76:89-102，1994;Taylorら、Mech．Dev.，42 89-96，1993)、培養細胞中に発現される場合は細胞に結合し、in vitroではヘパリンアガロースにより効率的に結合される。これは細胞外マトリックス結合の可能性を示唆している。これに対し、C-末端断片はヘパリンアガロースによっては効率的には結合されず、発現培養細胞の培養上清中に殆ど定量的に放出され、胚において広く存在するだけである。個々の断片の活性についてはアッセイしていないが、ショウジョウバエＮ及びＣの生物学的相違及び組織分布は、ショウジョウバエの発生の間のhhに関連した機能の短期間あるいは長期間の性質に影響を与え得る。
【０１９１】
熱帯魚Ｎ及びＣの組織分布は判っていないが、異所性発現アッセイにおけるそれらの活性も、hh、pax-2 及びpax-6 の正常な発現パターンの意味において考慮した場合、短期間及び長期間の機能を示唆するものである。眼胞におけるpax-2発現の正常な勾配は隆起におけるhh発現部位に隣接するその最大値から実質的な距離が延長される。従って異所性Ｃのpax-2 を活性化する能力は、ショウジョウバエにおけるＣの分布と一致して、熱帯魚Ｃが長期間機能し得ることを示唆している。これに対し内因性pax-6 発現の抑制は短期間機能するものであるようであり、これはpax-6 発現が内因性hh発現に接近して起こることによる。pax-6 の効率的な抑制はＮを生成する構築物の特性であり、Ｎについての短期間の機能はショウジョウバエにおけるＮの分布と一致するであろう。
【０１９２】
hhトランスフェクト培養細胞についてhh依存性活性が２種類報告されている。
一つは底板製造体の明らかな接触依存誘導であり(Roelink，H.ら、Cell 76:761-775，1994)、もう一つは前原体節期の中胚葉における硬節製造体の誘導であり、これは広がることができるとともに長時間作用する。
【０１９３】
実施例１８：ツメガエルhhの特性決定
1. 材料及び方法 
完全長ツメガエルヘッジホッグをコードするｃＤＮＡ、または分泌リーダー配列に結合したアミノ末端もしくはカルボキシ末端ドメインをコードするｃＤＮＡをin vitroで転写して、翻訳可能なメッセンジャーＲＮＡを生成した。これらの合成メッセンジャーＲＮＡ及び対照のｍＲＮＡを分裂段階のツメガエル胚の動物極にマイクロインジェクトし、これを胞胚期まで発生させ、その時点で胚の上部４分の１から動物キャップから外植片を調製した。その後これらの胞胚キャップ外植片を、形質転換成長因子βファミリーメンバーである組換体ヒトアクチビンＡの存在下または不存在下に生理食塩水中in vitroで培養した。全ての外植片は、対照の胚が神経胚段階、またはオタマジャクシ段階に成長するまで発生させた。重要なことは、処理しないままにした胞胚キャップは外胚葉から異型性の表皮に分化することである。アクチビンにより処理した胞胚キャップは中胚葉及び神経細胞型に分化する。即ち、問題はヘッジホッグまたはそのタンパク質分解誘導体が細胞の分化を変化させ、表皮になることを抑制し、別の細胞型になるかどうかということであった。第二の問題は、ヘッジホッグがそれ自体でアクチビンとともにいずれかの因子に対する組織の正常な反応を変化させるように作用できるかどうかということであった。
【０１９４】
次に当業者に広く使用されている方法により外植片を抽出してｍＲＮＡを生成し、これを鋳型として逆転写酵素とともに使用してｃＤＮＡを生成した。そしてこのｃＤＮＡを鋳型としてプライマーの種々のセットとともに、特定の遺伝子のためのPCR、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、即ちRT-PCRに使用した。これにより、外植片中に存在したメッセンジャーＲＮＡの存在とレベルの指標となる放射性産物の増幅が得られる。サンプルをポリアクリルアミドゲル上で分離し、これをX-線フィルムに露光して図に示したバンドを得た。即ち、より暗いバンドが特異的なｍＲＮＡのより高いレベルに対応する。
【０１９５】
図18A 及びB は、ヘッジホッグが下垂体及び前方脳の遺伝子を誘発し、アクチビン、またはアクチビンにより誘発され外植された胚組織中でのこれらの遺伝子の発現を高める、例えばノグジン及びフォリスタチンのような神経誘発剤と共同作用し得ることを示している。全ての奇数番号のレーンはRT-PCR反応において逆転写酵素を欠くものであり、陰性対照である。全ての偶数番号のレーンはこの酵素を含み、ｍＲＮＡに特異的なバンドを生じる。パネルA において、レーン1-2は対照胞胚キャップであり、レーン3-4 はツメガエルヘッジホッグ発現胞胚キャップであり、レーン5-6 はアクチビンで処理した対照胞胚キャップであり、レーン7-8 はアクチビンで処理したヘッジホッグ発現胞胚キャップであり、レーン9-10はアクチビンで処理したプロラクチン発現胞胚キャップであり、胞胚キャップで分泌されたタンパク質を単に発現する対照しての役割を果たす。アッセイに使用したプライマーを各パネルの左に示す。即ち、XAG1はセメント腺マーカーであり、XANF1Bは下垂体マーカーであり、otx-A は前方脳マーカーであり、en-2は中脳-後脳境界マーカーであり、krox20は菱型節特異的後脳マーカーであり、HIHbox 6は後部後脳マーカーであり、NCAMは一般的な神経マーカーであり、アクチビンは中胚葉誘導の対照であり、延長因子は全ての偶数番号のレーンが存在するｃＤＮＡを実際に有することを示すための陽性対照である。
【０１９６】
XANF1Bで標識されたパネルは下垂体遺伝子を検出する。レーン4(パネルA)は、ヘッジホッグが存在せず(レーン2)この遺伝子を発現しない対照外植片と比較すると、ヘッジホッグがこの下垂体マーカー、及び可能性のある下垂体細胞型を胞胚キャップ外植片中で誘発することを示している(これを示すより強いシグナルについては図20、レーン６をも参照)。レーン6は、ヘッジホッグの不存在下にアクチビンで処理された外植片も下垂体遺伝子を発現することを示している。レーン8は、ヘッジホッグ及びアクチビンの両方で処理された外植片が下垂体遺伝子の最も高いレベルを示すことを示している。レーン10は、ヘッジホッグのこの効果が特異的であることを示しているが、これは別の分泌タンパク質であるプロラクチンがこの下垂体遺伝子の高められたレベルをもたらさないことによるものである。
【０１９７】
OTX-A で標識されたパネルはこの前方脳遺伝子を検出する。レーン4(及び図20中のレーン6)は、ヘッジホッグがこの神経特異的遺伝子を誘発できることを示している。レーン８は、この神経遺伝子のレベルが、アクチビンとヘッジホッグの両方て処理された組織において、ヘッジホッグのみ(レーン4)またはアクチビンのみ(レーン6)と比較して最も高く、対照外植片はこの遺伝子を発現しない(レーン2)ことを示している。やはりこの効果はヘッジホッグに特異的なものであり、これはプロラクチン(レーン10)がこの遺伝子の高められた発現をもたらさなかったことによるものである。XAG-1 により標識されたパネルはセメント腺特異的遺伝子を検出し、レーン4はヘッジホッグがこの遺伝子を高いレベルで誘発することを示している。
【０１９８】
パネル18B においては、胚にＮまたはΔN-C を注入し、いくつかの動物キャップ外植片については、同胞胚が尾芽段階に達するまで培養する前にアクチビンで処理した。レーン1,2:注入していない胚からの対照動物キャップ、レーン3,4:アクチビンで処理した注入していない胚からの対照動物キャップ、レーン5,6:Ｎを注入し、アクチビンで処理した胚からの動物キャップ、レーン7,8:ΔN-C を注入し、アクチビンで処理した胚からの動物キャップ。ＮはX-bhh の活性(B参照)と同様の活性をアクチビン処理外植片で示すのに対し、ΔN-C は逆の効果を生成し、前方の神経マーカー発現を減少させるとともに、後方の神経マーカーの発現を増加させる。図18B に示されるように、Ｎは、対照のアクチビン処理動物キャップ(レーン4)と比較して高められたレベルのXANF-2及びOtx-A(レーン6)を誘発することにおいて、X-bhh のように挙動する。さらにＮは、X-bhh の注入後に見られたように、krox-20 及びX(I)Hbox-6のようなより後方のマーカーの発現の減少ももたらす。Ｎの活性(図4C、レーン6)と対照的に、ΔN-C は、非注入対照(レーン4)と比較した場合、アクチビン処理動物キャップにおいて前方神経遺伝子XANF-2またはOtx-A の発現を減少させる(図4C、レーン8)。さらにΔN-C は、En-2及びXlhbox-6のようなより後方のマーカーの発現を増加させる。
【０１９９】
図19は、内因性神経誘発剤の影響下で外植片における神経遺伝子発現の前後パターンがX-bhh により改変されることを示している。(A)Kellerサンドウィッチの製造のための注入胚からの背部外植片の単離(Keller 及びDanilchik，1988; Doniachら、1992; Doniach，1993 からの再引用)。(B)Kellerサンドウィッチは非注入胚(レーン1 及び2)及びX-bhh-注入胚(レーン3 及び4)から製造し、対照胚が段階20に達したときに全ＲＮＡを単離し、RT-PCRを使用してXAG-1 及び神経マーカーの発現を分析した。XAG-1 はセメント腺マーカーであり、XANF-2は前方下垂体マーカーであり、Otx-A は前脳マーカーであり、En-2は中脳-後脳の境界を画定し、Krox-20 は後脳の菱型節３及び５をマークし、XlHbox-6は脊髄マーカーである。N-CAM は一般的な神経マーカーであり、その発現は前後軸に沿ってだけに限定されない。EF-1α対照は、各セットにおいて同等量のＲＮＡがアッセイされたことを示す。XAG-1 及び前方神経マーカーはX-bhh 処理により刺激されるが、後方神経マーカーの発現は抑制されることに注意されたい。
【０２００】
図20B（図２０−２）は、ヘッジホッグタンパク質のＮ及びＣドメインの分化活性を示す。上記図18と同様に、奇数番号のレーンは陰性対照レーンであり、正の番号のレーンは上記のマーカーの特異的遺伝子発現を示す。ヘッジホッグのＮドメインはXhh1208 と呼ばれる構築物中にコードされ(レーン8)、ＣドメインはXhh1デルタ27-208と呼ばれる構築物中にコードされる( レーン10)。構築物Xhh11-1270A(レーン12)は自己プロセシングできないように特異的に突然変異している。Ｎ及びＣドメインの上記遺伝子を誘発する能力を、対照胞胚キャップ外植片(レーン4)、陽性対照としての全胚(レーン2)、陰性対照としての突然変異ヘッジホッグを発現する胞胚キャップ外植片(レーン14)、全ヘッジホッグ1 を発現する胞胚キャップ(レーン6)、及び独立の神経誘発剤であるノグジン(Richard Harland，Univershy of California，Berkeley により発見された)により処理された胞胚キャップ外植片(レーン16)と比較する。
【０２０１】
セメント腺マーカーXAG-1 についての最初のパネルを調べると、無傷のヘッジホッグ(レーン6)及びＮドメイン(レーン8)及びプロセシング異常ヘッジホッグ(レーン12)は、セメント腺を誘発するばかりでなく、Ｃドメイン(レーン1)におけるよりもずっと優れていることが明らかである。第二のパネルを調べると、Ｃドメイン(レーン10)は下垂体遺伝子XANF1Bを誘発することにおいてＮドメイン(レーン8)よりも優れていることが示されている。上記A に記載したようにＮドメインはXAG-1 マーカーをよりよく誘発するので、二つの結果を合わせると、Ｎ及びＣドメインが区別可能な活性を有していることが明らかである。残りのパネルを分析することにより、正常なヘッジホッグ(レーン6)の全ての記載された活性は、Ｎ及びＣドメインの活性により定義できることが示される。
【０２０２】
前脳遺伝子otx-A についての第三のパネルの分析により、Ｎドメイン(レーン8)及びＣドメイン(レーン10)の両方がこの遺伝子の同様なレベルを誘発するが、プロセシング異常ヘッジホッグ(レーン12)はこの遺伝子の誘発においていずれのものよりも優れていることが示される。
【０２０３】
この図の第四のパネル(NCAM)(並びに図18パネルEn-2、krox20、XIHbox6 及びNCAM)を分析することにより、ヘッジホッグがこれらのより後方の神経遺伝子を誘発しないことが示される。特に、ノグジン(レーン16)は下垂体遺伝子及び前脳遺伝子を誘発でき、一般的な神経遺伝子NCAMも誘発するが、ヘッジホッグはしない。このことは、ヘッジホッグが神経誘発剤ノグジンとは異なる活性であり、神経遺伝子を誘発するもっと限定された能力を有することを明らかに示している。
【０２０４】
ツメガエル胚において、完全長ヘッジホッグＲＮＡを注入し、C-ドメイン特異的抗体により免疫沈降させる実験を行ったところ、完全長ヘッジホッグが実際に脊椎動物中in vivo でプロセシングを受けることが示され、これはショウジョウバエにおいて先の実施例で示したデータと一致する。即ち、ヘッジホッグＮ及びＣドメインの検出の有用性についてのアイデアは、そのようなドメインが脊椎動物におけるヘッジホッグプロセシングを通じて現れるという知見に基づくものである。さらにヘッジホッグプロセッシングがin vivo において生じるという知見は、生じるＮ及びＣドメインが独立した活性を有するのかどうかという問題を当然提起した。
【０２０５】
図18の結果は、下垂体遺伝子及び前方脳遺伝子を誘発するヘッジホッグの活性は成長因子のTGFβファミリーにより増強され得ることを示していることにおいて新規である。分析した遺伝子が同じであることから、この増強はおそらく図20A（図２０−１）に示したＮ及びＣドメインに適用される。この増強は、限定するものではないがノグジン及びフォリスタチンのような分子を含むTGF-βファミリーのメンバーによりそれ自体誘発される神経誘発因子とhhとの相乗作用によるものである。
【０２０６】
図20のデータは、いくつかの重要な点を示している。第一にこのデータは、Ｎ及びＣドメインが異なってはいるがいくらか重複した活性を有しており、Ｎ及びＣ活性は相加されて無傷のヘッジホッグタンパク質の観察される活性の全てを担っていることを示している。即ち、なるべく望ましくない免疫反応やその他の望ましくない副作用が起こらないように臨床治療のための活性を有するタンパク質の最小量を使用することが一般に望まれることから、ヘッジホッグの臨床または診断における使用は、ＮまたはＣドメインの使用により改善され得る。第二に、このデータは下垂体遺伝子発現の誘発においてＣドメインがＮドメインよりも優れており、そして無傷のヘッジホッグまたはＮドメインよりもセメント腺遺伝子の誘発が小さいことから、できるだけ特異的に下垂体の発生や発現を増強することが望まれるような臨床的状況においてＣドメインが有用であり得ることが示唆される。下垂体は多くのホルモンのソースであるので、下垂体細胞増殖及び活性を増強するような治療はできるだけ副作用が少ないようにすることが理想的であり、従ってＣドメインは下垂体細胞増殖及び機能の増強が企図される治療の可能性のある候補である。第三に、ノグジンに関する実験に関して、図20は、ヘッジホッグ及びノグジンのいずれもが下垂体遺伝子発現を誘発するが、ヘッジホッグがより特異的であることを示している。これはヘッジホッグが一般的な神経マーカーのNCAMを誘発しないのに対し、ノグジンはNCAMと下垂体とを誘発するからである。第四に、プロセシングを避けるように突然変異誘発されたヘッジホッグ(レーン12)は、下垂体遺伝子発現の誘発において完全長の野生型ヘッジホッグ(レーン6)と同様に活性であるが、プロセシング異常ヘッジホッグは前脳マーカーotx-A の誘発においてより優れている。即ち、特異的な細胞型の誘発におけるヘッジホッグの臨床応用については、プロセシング異常ヘッジホッグが正常なヘッジホッグよりも優れている場合がある。
【０２０７】
図21は、ΔN-C が動物キャップ外植片においてX-bhh 及びＮ活性を阻害することを示している。胚に種々のＲＮＡを注入し、同胞胚が尾芽に達するまで(段階25)動物キャップ外植片を培養し、この時点でRT-PCRを使用してセメント腺マーカーXAG-1 と対照ＲＮＡであるEF-1αの発現について分析した。レーン1,2:注入していない胚からの対照動物キャップ、レーン3,4: X-bhh及びプロラクチンＲＮＡの両方を注入した胚からの動物キャップ、レーン5,6:boxX-bhh及びΔN-C を注入した胚からの動物キャップ、レーン7,8:Ｎ及びプロラクチンＲＮＡの両方を注入した胚からの動物キャップ、レーン9,10: Ｎ及びΔN-C の両方を注入した胚からの動物キャップ。Ｎ及びX-bhh 実験は独立に行い、従ってレーン3-6 の絶対的なレベルはレーン7-10のレベルと比較すべきではない。X-bhh またはＮによるXAG-1 発現の誘発はΔN-C を同時に注入することにより低下されることに注目されたい。
【０２０８】
X-bhh(ΔN-C)の内部削除により外植片中のX-bhh 及びＮの活性がブロックされ、胚中の背部前方構造が減少された。高められたhh活性が前方神経遺伝子の発現を増加し、そしてΔN-C が背部前方構造を減少させるので、これらの相補的データは神経誘発及び前後パターン形成におけるhhの役割を支持している。
【０２０９】
ΔN-C はX-bhh のアミノ酸28-194を削除する。一次翻訳産物はアミノ酸1-23を除去するシグナル配列開裂を受け、自己タンパク質分解を受けると予測される。
【０２１０】
ショウジョウバエhhにおける開裂部位に基づくと(Porterら、Nature，374:363, 1995)、自己タンパク質分解によりX-bhh のＣドメインアミノ酸198-409、並びにアミノ酸24-27及び195-197 を表す予測された７アミノ酸ポリペプチドが生成されると考えられる(Laiら、Development 121:2349，1995)。神経マーカーに対するΔN-Cの効果についての分析は、ノーザンブロット分析及びin situ ハイブリダイゼーションを含む標準的な方法によった(Laiら、上出、この文献の開示は引用により本明細書の一部とする)。
【０２１１】
ΔN-C はセメント腺マーカーXAG-1 を誘発しないが、アクチビン処理動物キャップにおいて前方外胚葉及び神経マーカーの発現を減少させる。即ち、ΔN-C は神経パターン形成に影響を与える能力を有する。ΔN-C はまた、アクチビン処理動物キャップにおいて後方神経マーカーを増加させる。ΔN-C をＮまたは完全長X-bhh と1:1 の比率で混合すると、動物キャップアッセイにおいてセメント腺の誘発の劇的な阻害がもたらされ、ΔN-C がX-hhを阻害するという仮説が支持される。
【０２１２】
これまでの記載は本発明を一般的に記載したものである。より完全な理解は、例示のためにのみ記載され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない以上の特異的な実施例を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１−１】図１−１は、アミノ（Ａｂ１）およびカルボキシ末端（Ａｂ２）エピトープに対する抗体を用いるイムノブロット（Ａ，Ｃ）によるｈｈタンパク質のプロセシングを示す。図１ＢおよびＤは、Ａｂ１（Ｂ、レーン７〜９）、Ａｂ２（Ｄ、レーン１９〜２１）または免疫前血清（Ｂ、レーン１０〜１２およびＤ、レーン２２〜２４）で免疫沈降させたサンプルのブロットである。
【図１−２】図１−２は、ヘッジホグ切断メカニズムを示す（Ｅ）。
【図１−３】図１−３は、アミノ（Ａｂ１）およびカルボキシ末端（Ａｂ２）エピトープに対する抗体を用いるイムノブロットの結果を示す（Ｆ）。
【図２】図２は、ｈｈタンパク質とセリンプロテアーゼとの間の配列類似性を示す。ｈｈタンパク質配列をキイロショウジョウバエタンパク質の残基３２３〜３２９に対して整列させ、１〜７位の番号を付している（Ａ群）。哺乳動物セリンプロテイナーゼ（Ｂ群）の触媒性ヒスチジンを、ｈｈタンパク質中の７位の非変異ヒスチジンに対して整列させている。
【図３】図３は、ｈｈタンパク質の自己タンパク質分解を示す。３Ａは、大腸菌（E．coli）からのＨｉｓ6−ＵおよびＨｉｓ6−ＵH329Aタンパク質の生成および精製を示す、クーマシーブルーで染色されたポリアクリルアミドゲルを示す。サンプルは、分子量マーカー（レーン１および２）、ＩＰＴＧにより誘導しなかった場合（レーン３）および誘導した場合（レーン４）のＨｉｓ6−Ｕ発現構築物を保持する大腸菌（E．coli）細胞のライゼート、精製されたＨｉｓ6−Ｕタンパク質（レーン５）、ＩＰＴＧにより誘導しなかった場合（レーン６）および誘導した場合（レーン７）のＨｉｓ6−ＵH329A発現構築物を保持する大腸菌（E．coli）細胞のライーゼート、精製されたＨｉｓ6−ＵH329Aタンパク質（レーン８）であった。図３（Ｂ）は、ｈｈを発現するように誘導されたトランスフェクションされたＳ２細胞（レーン１）、切断反応緩衝液中で０時間（レーン２および５）、２０時間（レーン３および６）および２０mMＴＡＭＥ（セリンプロテアーゼ阻害剤）の存在下で２０時間（レーン４および７）インキュベーションされたＨｉｓ6−ＵおよびＨｉｓ6−ＵH329Aタンパク質を示す、Ａｂ２で検出されたイムノブロットである。
【図４−１】図４−１は、野生型および突然変異ｈｈタンパク質のin vitro翻訳による、カルボキシ末端断片に対するショウジョウバエ（Ａ〜Ｃ）およびゼブラフィッシュ（Ｄ）ｈｈタンパク質地図の自己タンパク質分解機能を示す。
【図４−２】図４−２は、野生型および突然変異ｈｈタンパク質中の突然変異および切断部位（矢印）の位置（Ｅ）を示す。
【図５】図５は、ショウジョウバエ胚における野生型およびＨ３２９Ａ突然変異ｈｈタンパク質の熱ショック誘導発現を示すイムノブロット(Ａ)および(Ｂ)が、それぞれＡｂ１およびＡｂ２抗体を用いて展開したイムノブロットであることを示す。レーン１および６は誘導されたトランスフェクションされていないＳ２細胞、レーン２および７はｈｈを発現するように誘導されたトランスフェクションされたＳ２細胞、レーン３および８は熱ショック野生型胚、レーン４および９は熱ショックｈｓｈｈ胚、レーン５および１０は熱ショックｈｓｈｈＨ３２９Ａ胚である。
【図６】図６は、遍在的に発現された野生型およびＨ３２９Ａｈｈタンパク質の胚作用を示すin situハイブリッド形成を示す。図６は、in situハイブリッド形成により表される無翅（ｗｇ）ＲＮＡの胚分布が、９０分間の回復期を隔てて２回の１０分間の熱ショックにさらされた（Ａ）野生型（ホモ接合ｙ1ｗ1118）、（Ｂ）ｈｓｈｈおよび（Ｃ）ｈｓｈｈＨ３２９Ａ胚で示されることを示す（３３）。野生型胚はｗｇ発現においてほとんど変化を示さなかったが、野生型タンパク質およびより低度ではあるがＨ３２９Ａタンパク質はそれぞれ異所性ｗｇ発現を誘導した（表１）。パネル（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）は、それぞれ、第４腹節レベルでのｙ1ｗ1118、ｈｓｈｈおよびｈｓｈｈＨ３２９Ａ幼虫の背表面示す。これらの幼虫には、胚のときに３０分間ショックを与え、完全に胚形成させた。クチクラ細胞型（１°、２°、３°および４°）は、既に記載されているとおりに（J.HeemskerkおよびS.DiNardo，Cell 76,449,1994）標識している。ｈｓｈｈＨ３２９Ａ胚（Ｆ）の表現型が対照胚（Ｄ）のものと同じである条件下において、ｈｓｈｈ胚（Ｅ）では、３°型およびある程度４°型を犠牲にして２°細胞型（裸のクチクラ）が伸張していることに注目されたし。
【図７】図７は、遍在性野生型およびＨ３２９ｈｈタンパク質の成虫原基作用を示すＸ−ｇａｌ染色を示す。ｗｇ−ｌａｃＺまたはｄｐｐ−ｌａｃＺリポーター遺伝子を保持する後期第３齢幼虫の成虫原基におけるｗｇ（Ａ〜Ｃ）またはｄｐｐ（Ｄ〜Ｌ）の発現を追跡するためにＸ−ｇａｌ染色を用いた。対照幼虫（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ）、ｈｓｈｈ導入遺伝子を保持する幼虫（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ）およびｈｓｈｈＨ３２９Ａ導入遺伝子を保持する幼虫（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）からの脚（Ａ〜Ｆ）、翅（Ｇ〜Ｉ）および眼−触角原基（Ｊ〜Ｌ）を示す。パネルはすべて、前方が左側となっている。
【図８】図８（Ａ）および（Ｂ）は、ＨＨタンパク質を発現するトランスフェクションされたＳ２細胞培養からの細胞ペレット（レーン１）または上清（レーン２）の、Ａｂ１（Ａ）およびＡｂ２（Ｂ）で展開したイムノブロットである。各レーン中のサンプルは、同容量の再懸濁全培養からのものである。Ｎはほとんど該細胞ペレットに結合したままであったが（Ａ中のレーン１および２を比較されたし）、Ｃは該上清中にほぼ定量的に遊離されていた（Ｂ中のレーン１および２を比較されたし）。Ｕは、ＮとＣとの間の分配性を示した（ＡおよびＢ）。（Ｃ）は、ミクロソームによるin vitro翻訳により生成した種々のＨＨタンパク質種のヘパリン結合活性を示す（３８）。サンプルは、全翻訳混合物（レーン１）、ヘパリンアガロースまたはアガロース（対照）ビーズと共にインキュベーションした後の上清（レーン２および４）、および洗浄後にヘパリンアガロースまたはアガロースビーズから溶出した物質（レーン３および５）であった。Ｆ、Ｕ、ＮssおよびＮ断片は、ヘパリンアガロースと共にインキュベーションする反応から枯渇され（ただし、アガロースビーズと共にインキュベーションする反応からは枯渇されない）（レーン２および４と１とを比較されたし）、ついで、ヘパリンアガロースから同じ種が溶出されうる（ただし、アガロースビーズからは溶出されない）（レーン３および５と１とを比較されたし）。
【図９】図９は、ｈｈ転写物のin situ局在化による胚中のＮおよびＣの区別的局在を示す。パネル（Ｂ）および（Ｃ）においてそれぞれＡｂ１およびＡｂ２で検出されるＮおよびＣエピトープの分布と比較して、図９（Ａ）を示す。ＮおよびＣエピトープの分布は、それぞれ、各体節単位のほぼ３分の１および２分の１に及ぶが、該転写物は各単位のほぼ４分の１に限定されていることに注目されたし。（Ｄ）では、ｈｈ13E対立遺伝子に関してホモ接合である胚におけるＣエピトープの局在化をＡｂ２を用いて検出している。損なわれた自己タンパク質分解活性を示す（本文を参照されたし）この突然変異体中のＣエピトープはより制限されており、Ｎの野生型局在に類似している。ヘテロ接合の親系統からの標識平均体（marked balancer）の喪失により、ホモ接合ｈｈ13E胚を同定した。すべての胚は、中期から後期９（拡張胚帯）である。
【図１０−１】図１０−１は、ｈｈタンパク質作用に関するシグナルリレーモデルと二重機能モデルとを対比させて示す。図１０（Ａ）では、ｈｈシグナル伝達の長距離作用は、第２シグナル伝達分子（Ｘ）の短距離誘導により間接的に得られる。その生化学的性質およびその限定された組織局在に基づき、Ｎは活性な短距離シグナルをあらわすと推定されるが、Ｃの役割はＮの生合成に必要な触媒装置の供給に限定されるであろう。（Ｂ）では、ｈｈの長距離および短距離シグナル伝達機能は、Ｕ前駆体の内部自己タンパク質分解により誘導されるＮおよびＣタンパク質により与えられる。Ｎは、その細胞合成部位の近傍で維持されることにより短距離シグナル伝達に関与し、一方、Ｃは、その分布においてそれほど制限されず、長距離シグナル伝達機能を発揮するであろう。どちらのモデルでも、活性なシグナル伝達タンパク質を十分に生成させるためには自己タンパク質分解が必要である。
【図１０−２】図１０−２は、野生型構築物（Ｃ）またはＣドメインを欠く構築物（Ｄ）から合成されたＮ断片のイムノブロットを示す。
【図１１】図１１ＡおよびＢは、部分的なヒトｈｈクローンのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。
【図１２−１】図１２−１（ＡおよびＢ）は、大腸菌（E．coli）中で生成させ均質になるまで精製したショウジョウバエｈｈタンパク質のin vitro切断反応を示す。パネルＡは、ＤＴＴの添加により開始させた後の切断の時間経過を示す。パネルＢは、３オーダーの大きさにわたり変化する濃度での一定時間（４時間）のインキュベーションを示し、切断形態への変換の程度において相違が全く見られない。パネルＤは、種々のｈｈ遺伝子を鋳型として使用する、実施例に記載のin vitro転写／翻訳反応物をローディングしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ｄｈｈはショウジョウバエ、ｔｗｈｈおよびｚｆｓｈｈはゼブラフィッシュのトゥウィギー−ウィンクル（twiggy-winkle）およびソニック（sonic）ｈｈ遺伝子、およびｍｓｈｈはマウスのｓｈｈ／Ｈｇｈ−１／ｖｈｈ−１遺伝子である。
【図１２−２】図１２−２：パネルＣは、切断断片Ｃのアミノ末端配列により決定された、切断部位の周囲の配列を示す。該切断部位を矢印で示し、Ｃ断片のエドマン分解により配列決定された実際の残基に下線を付す。また、パネルＣは、すべての公開されている哺乳動物ｈｈ配列および魚類およびアフリカツメガエルからの未公開配列のいくつかを整列させて示す。示されている配列は、該切断が生じるショウジョウバエｈｈの領域に対応し、切断部位のGly-Cys-Phe配列の完全保存を示す。
【０２１４】
パネルＥは、これらすべてのタンパク質において、Ｃ断片のエドマン分解により第１サイクル（後のサイクルではない）で35Ｓカウントが遊離されることを示し、このことは、これらすべてのｈｈタンパク質の自己タンパク質分解切断部位が、パネルＣで強調されている保存的Gly-Cys-Phe配列の中心を形成するCys残基のアミノ末端側のアミド結合であることを示す。
【図１３】図１３では、予想アミノ酸配列が単一文字コードで示されている。１３（ａ）は、５つの異なるｈｈ様遺伝子に共通の配列を示し、点はゼブラフィッシュトゥウィギー−ウィンクル（twiggy-winkle）の対応する残基と同一であることを示す。１３（ｂ）は、ニワトリおよびマウスからのsoniclvhh-Iクラスのアミノ酸配列と整列させたｔｗｈｈおよびｓｈｈのアミノ酸配列を示す。４つのｈｈ遺伝子のすべてに共通のアミノ末端疎水性伸長に影を付している。星印(＊)は、種々の種からのＣ断片のタンパク質分解ドメインに関連する非変異アミノ酸残基を示す。１３（ｃ）は、該疎水性領域に対してカルボキシ末端側にある残基の同一性の割合（％）を示す。
【図１４−１】図１４−１は、ゼブラフィッシュの胚形成中のｔｗｈｈ、ｓｈｈおよびｐａｘ−２の比較発現を示す。
【図１４−２】図１４−２は、ゼブラフィッシュの胚形成中のｔｗｈｈ、ｓｈｈおよびｐａｘ−２の比較発現を示す。
【図１４−３】図１４−３は、ゼブラフィッシュの胚形成中のｔｗｈｈ、ｓｈｈおよびｐａｘ−２の比較発現を示す。
【図１５】図１５は、ゼブラフィッシュの発生に対する異所性ｈｈの影響を示す。野生型ゼブラフィッシュ（Danio rerio，Ekkwill Waterlife Resources）を２８.５℃に維持し、ついで、いくつかの胚を室温で一晩培養した。ゼブラフィッシュ胚にｔｗｈｈ、ｓｈｈまたはｌａｃＺＲＮＡを１〜８細胞期に注入し、発生の２８時間経過時に該胚を調べた。（ａ−ｃ）は中脳−後脳領域の背面図であり、前方が左である。（ａ）はＬａｃＺ、（ｂ）はｔｗｈｈ、（ｃ）はｓｈｈである。（ｄ−ｆ）は、前脳領域の前頭眼断面であり、前方が上である。（ｄ）はＬａｃＺ、（ｈ）はｔｗｈｈ、（ｆ）はｓｈｈである。（ｇ−ｌ）は、眼領域の側面図であり、前方が左である。（ｇ）はＬａｃＺ、（ｈ）はｔｗｈｈ、（ｉ）はｔｗｈｈである。
【図１６】図１６は、ゼブラフィッシュ胚発生に対するｓｈｈ、ｔｗｈｈおよびｔｗｈｈ突然変異体の異所性発現の影響を示す表である。
【図１７−１】図１７−１は、ゼブラフィッシュトゥウィギー−ウィンクル（twiggy-winkle）ヘッジホグ誘導体を示す。（Ａ）は、種々のｔｗｈｈオープンリーディングフレームの図である。ＳＳ（影部分）は、これらのタンパク質の分泌のための予想されるＮ末端シグナル配列であり、各オープンリーディングフレームの最初の２７個のアミノ酸を含む。矢印は、自己タンパク質分解切断の予想される内部部位を示す。アミノ酸残基の番号は図１３ｂのとおりである。塗りつぶされている三角形は、ｔｗｈｈオープンリーディングフレームの正常な終止コドンを示す。構築物ＵHAは、自己タンパク質分解を遮断する突然変異を含有する（２７３位のヒスチジンはアラニンに変わっている；Lee,J.J.ら、前掲を参照されたし）。構築物Ｕ３５６HAは、アミノ酸残基３５７の代わりの停止コドン、およびＵHA中のＨ２７３Ａ突然変異を含有する。構築物Ｎは、ｔｗｈｈの最初の２００個のアミノ酸のみをコードする。構築物Ｃは、残基３１〜１９７のコドンが欠失している。
【図１７−２】図１７−２は、ゼブラフィッシュトゥウィギー−ウィンクル（twiggy-winkle）ヘッジホグ誘導体を示す。（Ｂ）は、図１７−１（Ａ）に図示されている発現構築物のin vitro翻訳を示す。構築物を35Ｓメチオニンの存在下in vitroで翻訳させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のオートラジオグラフィーにより分析した。
【図１８】図１８は、種々の神経マーカーの発現に対するヘッジホグの作用のノーザンブロット分析を示す。
【図１９−１】図１９−１は、天然に存在する神経マーカーまたは作用物質（例、ＸＡＧ−１、ＸＡＮＦ−２、Ｏｔｘ−Ａ、Ｅｎ−２、Ｋｒｏｘ−２０、Ｘｌｈｂｏｘ−６、ＮＣＡＭおよびＥＦ−１α）によるｈｈ相乗作用を示す。
【図１９−２】図１９−２は、天然に存在する神経マーカーまたは作用物質（例、ＸＡＧ−１、ＸＡＮＦ−２、Ｏｔｘ−Ａ、Ｅｎ−２、Ｋｒｏｘ−２０、Ｘｌｈｂｏｘ−６、ＮＣＡＭおよびＥＦ−１α）によるｈｈ相乗作用を示す。
【図２０−１】図２０−１は、種々の神経マーカーに対するヘッジホグＮまたはＣの作用のノーザンブロット分析を示す。
【図２０−２】図２０−２は、種々の神経マーカーに対するヘッジホグＮまたはＣの作用のノーザンブロット分析を示す。
【図２１】図２１は、ＲＴ−ＰＣＲ分析により示された場合、動物キャップ外植片においてΔＮ−ＣがＸ−ｂｈｈおよびＮ活性を阻害することを示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年1月5日(2006.1.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
【図１−１】図１−１は、アミノ（Ａｂ１）およびカルボキシ末端（Ａｂ２）エピトープに対する抗体を用いるイムノブロット（Ａ，Ｃ）によるｈｈタンパク質のプロセシングを示す。図１ＢおよびＤは、Ａｂ１（Ｂ、レーン７〜９）、Ａｂ２（Ｄ、レーン１９〜２１）または免疫前血清（Ｂ、レーン１０〜１２およびＤ、レーン２２〜２４）で免疫沈降させたサンプルのブロットである。
【図１−２】図１−２は、ヘッジホグ切断メカニズムを示す（Ｅ）。
【図１−３】図１−３は、１６ｋDの種と２５ｋDの種を生成させる提案されている切断を示す（Ｆ）。
【図２】図２は、ｈｈタンパク質とセリンプロテアーゼとの間の配列類似性を示す。ｈｈタンパク質配列をキイロショウジョウバエタンパク質の残基３２３〜３２９に対して整列させ、１〜７位の番号を付している（Ａ群）。哺乳動物セリンプロテイナーゼ（Ｂ群）の触媒性ヒスチジンを、ｈｈタンパク質中の７位の非変異ヒスチジンに対して整列させている。
【図３】図３は、ｈｈタンパク質の自己タンパク質分解を示す。３Ａは、大腸菌（E．coli）からのＨｉｓ6−ＵおよびＨｉｓ6−ＵH329Aタンパク質の生成および精製を示す、クーマシーブルーで染色されたポリアクリルアミドゲルを示す。サンプルは、分子量マーカー（レーン１および２）、ＩＰＴＧにより誘導しなかった場合（レーン３）および誘導した場合（レーン４）のＨｉｓ6−Ｕ発現構築物を保持する大腸菌（E．coli）細胞のライゼート、精製されたＨｉｓ6−Ｕタンパク質（レーン５）、ＩＰＴＧにより誘導しなかった場合（レーン６）および誘導した場合（レーン７）のＨｉｓ6−ＵH329A発現構築物を保持する大腸菌（E．coli）細胞のライーゼート、精製されたＨｉｓ6−ＵH329Aタンパク質（レーン８）であった。図３（Ｂ）は、ｈｈを発現するように誘導されたトランスフェクションされたＳ２細胞（レーン１）、切断反応緩衝液中で０時間（レーン２および５）、２０時間（レーン３および６）および２０mMＴＡＭＥ（セリンプロテアーゼ阻害剤）の存在下で２０時間（レーン４および７）インキュベーションされたＨｉｓ6−ＵおよびＨｉｓ6−ＵH329Aタンパク質を示す、Ａｂ２で検出されたイムノブロットである。
【図４−１】図４−１は、野生型および突然変異ｈｈタンパク質のin vitro翻訳による、カルボキシ末端断片に対するショウジョウバエ（Ａ〜Ｃ）およびゼブラフィッシュ（Ｄ）ｈｈタンパク質地図の自己タンパク質分解機能を示す。
【図４−２】図４−２は、野生型および突然変異ｈｈタンパク質中の突然変異および切断部位（矢印）の位置（Ｅ）を示す。
【図５】図５は、ショウジョウバエ胚における野生型およびＨ３２９Ａ突然変異ｈｈタンパク質の熱ショック誘導発現を示すイムノブロット(Ａ)および(Ｂ)が、それぞれＡｂ１およびＡｂ２抗体を用いて展開したイムノブロットであることを示す。レーン１および６は誘導されたトランスフェクションされていないＳ２細胞、レーン２および７はｈｈを発現するように誘導されたトランスフェクションされたＳ２細胞、レーン３および８は熱ショック野生型胚、レーン４および９は熱ショックｈｓｈｈ胚、レーン５および１０は熱ショックｈｓｈｈＨ３２９Ａ胚である。
【図６】図６は、遍在的に発現された野生型およびＨ３２９Ａｈｈタンパク質の胚作用を示すin situハイブリッド形成を示す。図６は、in situハイブリッド形成により表される無翅（ｗｇ）ＲＮＡの胚分布が、９０分間の回復期を隔てて２回の１０分間の熱ショックにさらされた（Ａ）野生型（ホモ接合ｙ1ｗ1118）、（Ｂ）ｈｓｈｈおよび（Ｃ）ｈｓｈｈＨ３２９Ａ胚で示されることを示す（３３）。野生型胚はｗｇ発現においてほとんど変化を示さなかったが、野生型タンパク質およびより低度ではあるがＨ３２９Ａタンパク質はそれぞれ異所性ｗｇ発現を誘導した（表１）。パネル（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）は、それぞれ、第４腹節レベルでのｙ1ｗ1118、ｈｓｈｈおよびｈｓｈｈＨ３２９Ａ幼虫の背表面示す。これらの幼虫には、胚のときに３０分間ショックを与え、完全に胚形成させた。クチクラ細胞型（１°、２°、３°および４°）は、既に記載されているとおりに（J.HeemskerkおよびS.DiNardo，Cell 76,449,1994）標識している。ｈｓｈｈＨ３２９Ａ胚（Ｆ）の表現型が対照胚（Ｄ）のものと同じである条件下において、ｈｓｈｈ胚（Ｅ）では、３°型およびある程度４°型を犠牲にして２°細胞型（裸のクチクラ）が伸張していることに注目されたし。
【図７】図７は、遍在性野生型およびＨ３２９ｈｈタンパク質の成虫原基作用を示すＸ−ｇａｌ染色を示す。ｗｇ−ｌａｃＺまたはｄｐｐ−ｌａｃＺリポーター遺伝子を保持する後期第３齢幼虫の成虫原基におけるｗｇ（Ａ〜Ｃ）またはｄｐｐ（Ｄ〜Ｌ）の発現を追跡するためにＸ−ｇａｌ染色を用いた。対照幼虫（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ）、ｈｓｈｈ導入遺伝子を保持する幼虫（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ）およびｈｓｈｈＨ３２９Ａ導入遺伝子を保持する幼虫（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）からの脚（Ａ〜Ｆ）、翅（Ｇ〜Ｉ）および眼−触角原基（Ｊ〜Ｌ）を示す。パネルはすべて、前方が左側となっている。
【図８】図８（Ａ）および（Ｂ）は、ＨＨタンパク質を発現するトランスフェクションされたＳ２細胞培養からの細胞ペレット（レーン１）または上清（レーン２）の、Ａｂ１（Ａ）およびＡｂ２（Ｂ）で展開したイムノブロットである。各レーン中のサンプルは、同容量の再懸濁全培養からのものである。Ｎはほとんど該細胞ペレットに結合したままであったが（Ａ中のレーン１および２を比較されたし）、Ｃは該上清中にほぼ定量的に遊離されていた（Ｂ中のレーン１および２を比較されたし）。Ｕは、ＮとＣとの間の分配性を示した（ＡおよびＢ）。（Ｃ）は、ミクロソームによるin vitro翻訳により生成した種々のＨＨタンパク質種のヘパリン結合活性を示す（３８）。サンプルは、全翻訳混合物（レーン１）、ヘパリンアガロースまたはアガロース（対照）ビーズと共にインキュベーションした後の上清（レーン２および４）、および洗浄後にヘパリンアガロースまたはアガロースビーズから溶出した物質（レーン３および５）であった。Ｆ、Ｕ、ＮssおよびＮ断片は、ヘパリンアガロースと共にインキュベーションする反応から枯渇され（ただし、アガロースビーズと共にインキュベーションする反応からは枯渇されない）（レーン２および４と１とを比較されたし）、ついで、ヘパリンアガロースから同じ種が溶出されうる（ただし、アガロースビーズからは溶出されない）（レーン３および５と１とを比較されたし）。
【図９】図９は、ｈｈ転写物のin situ局在化による胚中のＮおよびＣの区別的局在を示す。パネル（Ｂ）および（Ｃ）においてそれぞれＡｂ１およびＡｂ２で検出されるＮおよびＣエピトープの分布と比較して、図９（Ａ）を示す。ＮおよびＣエピトープの分布は、それぞれ、各体節単位のほぼ３分の１および２分の１に及ぶが、該転写物は各単位のほぼ４分の１に限定されていることに注目されたし。（Ｄ）では、ｈｈ13E対立遺伝子に関してホモ接合である胚におけるＣエピトープの局在化をＡｂ２を用いて検出している。損なわれた自己タンパク質分解活性を示す（本文を参照されたし）この突然変異体中のＣエピトープはより制限されており、Ｎの野生型局在に類似している。ヘテロ接合の親系統からの標識平均体（marked balancer）の喪失により、ホモ接合ｈｈ13E胚を同定した。すべての胚は、中期から後期９（拡張胚帯）である。
【図１０−１】図１０−１は、ｈｈタンパク質作用に関するシグナルリレーモデルと二重機能モデルとを対比させて示す。図１０（Ａ）では、ｈｈシグナル伝達の長距離作用は、第２シグナル伝達分子（Ｘ）の短距離誘導により間接的に得られる。その生化学的性質およびその限定された組織局在に基づき、Ｎは活性な短距離シグナルをあらわすと推定されるが、Ｃの役割はＮの生合成に必要な触媒装置の供給に限定されるであろう。（Ｂ）では、ｈｈの長距離および短距離シグナル伝達機能は、Ｕ前駆体の内部自己タンパク質分解により誘導されるＮおよびＣタンパク質により与えられる。Ｎは、その細胞合成部位の近傍で維持されることにより短距離シグナル伝達に関与し、一方、Ｃは、その分布においてそれほど制限されず、長距離シグナル伝達機能を発揮するであろう。どちらのモデルでも、活性なシグナル伝達タンパク質を十分に生成させるためには自己タンパク質分解が必要である。
【図１０−２】図１０−２は、野生型構築物（Ｃ）またはＣドメインを欠く構築物（Ｄ）から合成されたＮ断片のイムノブロットを示す。
【図１１】図１１ＡおよびＢは、部分的なヒトｈｈクローンのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。
【図１２−１】図１２−１（ＡおよびＢ）は、大腸菌（E．coli）中で生成させ均質になるまで精製したショウジョウバエｈｈタンパク質のin vitro切断反応を示す。パネルＡは、ＤＴＴの添加により開始させた後の切断の時間経過を示す。パネルＢは、３オーダーの大きさにわたり変化する濃度での一定時間（４時間）のインキュベーションを示し、切断形態への変換の程度において相違が全く見られない。パネルＤは、種々のｈｈ遺伝子を鋳型として使用する、実施例に記載のin vitro転写／翻訳反応物をローディングしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ｄｈｈはショウジョウバエ、ｔｗｈｈおよびｚｆｓｈｈはゼブラフィッシュのトゥウィギー−ウィンクル（twiggy-winkle）およびソニック（sonic）ｈｈ遺伝子、およびｍｓｈｈはマウスのｓｈｈ／Ｈｇｈ−１／ｖｈｈ−１遺伝子である。
【図１２−２】図１２−２：パネルＣは、切断断片Ｃのアミノ末端配列により決定された、切断部位の周囲の配列を示す。該切断部位を矢印で示し、Ｃ断片のエドマン分解により配列決定された実際の残基に下線を付す。また、パネルＣは、すべての公開されている哺乳動物ｈｈ配列および魚類およびアフリカツメガエルからの未公開配列のいくつかを整列させて示す。示されている配列は、該切断が生じるショウジョウバエｈｈの領域に対応し、切断部位のGly-Cys-Phe配列の完全保存を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月22日(2006.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物のヘッジホグタンパク質のアミノ末端アミノ酸に由来するアミノ酸配列を有し、そのカルボキシ末端に、天然ヘッジホグポリペプチドのカルボキシ末端断片のタンパク質分解活性により特異的に認識されるＧ↓ＣＦ切断部位を有することを特徴とする精製されたポリペプチド、但し、前記断片は非還元SDS-PAGEで19kDの分子量を有し、前記ポリペプチドはヘッジホグタンパク質内に含まれる前記切断部位の特異的切断によって生成し、発生中の脳のPax-2を異所性に活性化し、かつPax-6を抑制し、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列を有する。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項６】
前記抗体がポリクローナルである、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体がモノクローナルである、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドを含む医薬組成物であって、ニューロン細胞を該ポリペプチドと接触させることを含む方法によりニューロン細胞の増殖または分化をモジュレーションするために用いられる前記医薬組成物。
【請求項９】
前記モジュレーションが増殖または分化の誘導である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ニューロン細胞が実質的に底板ニューロン細胞に由来する、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ニューロン細胞が運動ニューロンである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ニューロン細胞が脊椎動物ニューロン細胞である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記脊椎動物がヒトである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記方法が前記細胞をＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触させることをさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ＴＧＦ−βファミリーがアクチビンである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記方法が前記細胞を神経誘導剤と接触させることをさらに含んでなる、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記神経誘導剤が、ノギン、フォリスタチンおよびニューロトロフィンよりなる群から選ばれる、請求項１６に記載の医薬組成物。