(57)【要約】【課題】心疾患に関連する遺伝子の発現を制御する調節機構を解明し、心疾患の新たな治療及び予防手段を提供する。【解決手段】候補となる遺伝子の隣接領域又はイントロンにNRSEと類似した配列が存在するかどうかを確認する工程を含む心疾患関連遺伝子のスクリーニング方法、NRSE-NRSF系により発現が調節される遺伝子を、候補となる物質と接触させる工程および前記遺伝子の発現量を確認する工程を含む心疾患治療薬のスクリーニング方法、並びに心臓においてNRSFのリプレッサー機能を抑制していることを特徴とする心疾患モデル動物。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補となる遺伝子の隣接領域又はイントロンに配列番号１記載の塩基配列と同一又は類似した配列が存在するかどうかを確認する工程を含む心疾患関連遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項２】
以下の工程を含む心疾患治療薬のスクリーニング方法。
（１）NRSE-NRSF系により発現が調節される遺伝子を、候補となる物質と接触させる工程
（２）前記遺伝子の発現量を確認する工程
【請求項３】
NRSE-NRSF系により発現が調節される遺伝子がANP遺伝子、BNP遺伝子、SKA遺伝子、HCN2遺伝子、HCN4遺伝子、又はCACNA1H遺伝子である請求項２記載の心疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
心臓においてNRSFのリプレッサー機能を抑制していることを特徴とする心疾患モデル動物。
【請求項５】
動物がマウスである請求項４記載の心疾患モデル動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経選択的サイレンサーエレメント(NRSE)及び神経選択的サイレンサー因子(NRSF)の新たな利用方法に関するものであり、より具体的には、NRSEを利用した心疾患関連遺伝子のスクリーニング方法、NRSE-NRSF系を利用した心疾患治療薬のスクリーニング方法、及びNRSE-NRSF系を利用した心疾患モデル動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
心肥大は機械的ストレス、組織傷害や、それに引き続く神経体液性因子の活性化等の肥大（病的）刺激に応答する心臓そのものが有する生理的な代償応答であるである。しかし、これらの肥大刺激が持続すると、心臓は代償機序が破綻し、心臓の拡張と心不全（これは心臓血管性疾患への罹病およびそれによる死亡の最大原因である）に陥る。心不全は予後不良の病態であるがその死因の約半分は突然死で、予期されないものであり、最もよくみられる死因は致死性不整脈の発生である。一群の心臓遺伝子の調節異常が、肥大した不全心に見られる生化学的、構造的、機能的および電気的変化の原因と関連しているとの事実が集積されてきているが、複雑なリモデリングプロセスの基盤に存在する分子経路については殆ど知られていない。肥大した不全心における特徴的な遺伝子的変化の1つは、心臓特異的胎児型遺伝子プログラムの再発現現象、すなわちβ-ミオシン重鎖(MHC)、α-骨格性アクチン(SKA)ならびに心房性および脳性ナトリウム利尿ペプチド（それぞれANPおよびBNP）等の胎児型タンパク質をコードする遺伝子のアップレギュレーションである(Chien et al., 1991)。実際、肥大した不全心においてはANPおよびBNP産生は著しく増大し、臨床的重篤度や予後のプレディクターとなっている（総論についてはKjaer and Hesse, 2001参照）。したがって、これらの心臓特異的胎児型遺伝子の転写調節機構を解明するならば、心肥大および心不全が確立されるプロセスをより良く理解することが可能となるに相違ない。
さらに、常態では胎児心室で観察されるが成人の心室筋細胞には観察されない2つの電流［すなわち過分極活性化非選択性カチオン電流（If）およびT型Ca2+電流（ICa,T）］が肥大した不全心の心室筋細胞において観察され（Cerbai et al., 1996; Cerbai et al., 1997; Cerbai et al., 2001; Sen et al., 1993; Nuss et al., 1993; およびMartinez et al., 1999）、If電流に関与しているカチオンチャンネルであるHCN2や、ICa,T電流の構成に寄与しているT型Ca2+であるCACNA1H遺伝子発現が不全心で増加していることも報告され、これらのイオンチャンネル遺伝子は胎児型遺伝子の一種と捉えることも可能であり、これらの発現パターンの変化が、心不全時の心室不整脈受攻性 (vulnerability)の増大と関与していると考えられる。したがって、胎児型遺伝子プログラムを制御する作用機構の解明は、心不全に関連する不整脈および突然死の分子的基礎をも明らかにすることができるであろう。
【０００３】
多くの研究がなされたにも関わらず、心臓特異的胎児型遺伝子の可逆的発現を制御するプロセスは事実上全く解明されていない。GATA4、Nkx2.5/Csx、TEF-1およびSRFを含むいくつかの心臓特異的な転写エンハンサーは、胎児型遺伝子の心臓特異的発現に重大な関与をしていることが報告されている（総論についてはBruneau 2002参照）。しかし、これらの因子は、胎児型遺伝子の転写調節のみならず、収縮タンパク質（Di Lisi et al., 1998; Molkentin et al., 1994; Ip et al., 1994, 16-18）やイオン輸送体（Baker et al., 1998; Cheng et al., 1999）遺伝子の構成的発現にも寄与している。また、ANP遺伝子の近位の5'隣接領域は心臓特異的発現には必須の領域であるが、この領域はANP遺伝子のin vivoにおける肥大刺激に対する発現亢進に対しては不十分である(Rockman et al., 1991; Knowlton et al., 1995)ことも報告されている。この様に胎児型遺伝子の常態での発現や、病的状態での発現誘導の機序を、エンハンサーだけで説明することは不十分である。
【０００４】
リプレッサーエレメント-1 (RE-1)としても知られているNRSEは最初、非神経細胞種および未分化神経細胞における神経細胞特異的遺伝子の発現を阻止する、負に作用するDNA調節エレメントとして定義されたが（Kraner et al., 1992; Mori et al., 1992）、現在では多数の遺伝子の発現を制御することが知られている(総論についてはRoopra et al., 2001参照)。さらに、Kruppelに類似したジンクフィンガー転写因子であるNRSF［RE-1サイレンシング転写因子(REST)としても知られている］がNRSE結合タンパク質として同定された（Schoenherr et al., 1995; Chong et al., 1995）。NRSF遺伝子は殆どの非神経組織（成人心臓を含む）および神経系の未分化の神経前駆体細胞において発現している。発生期におけるNRSF発現のダウンレギュレーションは、神経特異的最終分化遺伝子の発現を可能とする(Chen et al., 1998, 35)。本発明者らは最近、（1）NRSEがANP遺伝子の3'非翻訳領域(UTR)、BNP遺伝子の5’転写調節領域に存在して、培養された新生児心室筋細胞において該遺伝子の基礎発現を抑制すること、および（2）NRSEによって媒介される転写抑制の阻害が、エンドセリン-1(ET-1)やフィブロネクチン刺激下における、該遺伝子の転写亢進において主要な分子機序であることを示した。
【０００５】
内因性心臓特異的胎児型遺伝子の発現および心臓の機能におけるNRSE-NRSF系の役割はいまだに不明であるが、NRSEはANP遺伝子、BNP遺伝子およびSKA遺伝子を含む他の心臓特異的胎児型遺伝子にも存在する(Kuwahara et al., 2001; Ogawa et al., 2002)。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように心臓特異的胎児型遺伝子は、心肥大、心不全、不整脈等の心疾患と密接に関連している。従って、これらの心疾患の効果的な治療及び予防薬の開発には、心臓特異的胎児型遺伝子の発現を制御する調節機構の解明が不可欠である。
【０００７】
本発明は、以上のような技術的背景のもとになされたものであり、心臓特異的胎児型遺伝子の発現がどのようなプロセスで制御されているのかを解明し、心疾患の新たな治療及び予防手段を提供することをその目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、(1)心室筋細胞においてNRSFが多数の心臓特異的胎児型遺伝子の発現を抑制すること、(2)NRSFによって媒介される抑制の阻害は、肥大刺激に応答する胎児型遺伝子プログラムの再活性化に関与すること、(3) NRSFリプレッサー機能の持続的な抑制は拡張型心筋症様の心疾患および突然死をもたらす、ことを見出し、これらの知見から本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明の第一は、候補となる遺伝子の隣接領域又はイントロンに配列番号１記載の塩基配列と同一又は類似した配列が存在するかどうかを確認する工程を含む心疾患関連遺伝子のスクリーニング方法である。
【００１０】
また、本発明の第二は、以下の工程を含む心疾患治療薬のスクリーニング方法。
（１）NRSE-NRSF系により発現が調節される遺伝子を、候補となる物質と接触させる工程
（２）前記遺伝子の発現量を確認する工程
更に、本発明の第三は、心臓においてNRSFのリプレッサー機能を抑制していることを特徴とする心疾患モデル動物である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）心疾患関連遺伝子のスクリーニング方法
ANP遺伝子、BNP遺伝子、SKA遺伝子、HCN2遺伝子、HCN4遺伝子、CACNA1H遺伝子は、心肥大や不整脈などの心疾患と関連する遺伝子である。これらの遺伝子はいずれも隣接領域又はイントロンにNRSE（TTTCAGCACCACGGACAGCGCC、〔配列番号１〕）と類似した配列を持っている。従って、心疾患関連遺伝子の多くは、NRSEと類似した配列を持っていると予測される。この知見から、候補となる遺伝子の隣接領域又はイントロンに配列番号１記載の塩基配列と同一又は類似した配列が存在するかどうかを確認する工程を含む心疾患関連遺伝子のスクリーニング方法が提供される。
【００１２】
ここで、心疾患関連遺伝子とは、心疾患に何らかの関連性を持つ遺伝子を意味し、例えば、心筋症、心不全、致死性不整脈などの直接又は間接の原因となる遺伝子などが含まれる。
【００１３】
隣接領域とは、NRSEのサイレンサーとしての機能が及ぶ範囲内を意味し、通常、候補となる遺伝子の翻訳領域の１０ないし２０キロ塩基上流から数キロ塩基下流までの領域である。
【００１４】
配列番号１記載の塩基配列と類似した配列とは、配列番号１においてサイレンサーとして機能を失わせない範囲内の個数の塩基が置換、欠失、付加した配列をいう。サイレンサーとして機能を失わせない範囲内の個数とは、通常は、４−６個以内である。
【００１５】
以下に示す配列は、少なくとも配列番号１記載の塩基配列と類似した配列に含まれる。
【００１６】
ヒトHCN2遺伝子由来NRSE     ：TTTCAGCACCACGGACAGCGCG（配列番号２）
マウスHCN2遺伝子由来NRSE   ：TTTCAGGACCACGGACAGCTCC（配列番号３）
ヒトHCN4遺伝子由来NRSE     ：GTTCAGCACCACGGACAGCGCC（配列番号４）
ヒトANP遺伝子由来NRSE      ：CTTCAGCACCATGGACAGAAGA（配列番号５）
ヒトCACNA1H遺伝子由来NRSE  ：ATTCAGCACCATGGACAGCAGC（配列番号６）
マウスCACNA1H遺伝子由来NRSE：CTTCAGCACCATGGACAGCGAC（配列番号７）
【００１７】
「配列が存在するかどうかを確認する」とは、配列番号1記載の配列と同一又は類似した配列の存在を確認するあらゆる操作が含まれ、例えば、配列既知のDNAと配列番号１記載の配列を対比し、この配列と同一又は類似した配列の存在を確認する操作、配列未知のDNAの配列を決定し、決定した配列と配列番号１記載の配列を対比し、この配列と同一又は類似した配列の存在を確認する操作、あるいは、DNAライブラリー中から配列番号１記載の配列を含むDNAとハイブリダイズすることのできるプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行う操作、配列番号１記載の配列を含むDNAを特異的に増幅できるプライマーを用いてPCRを行う操作などが含まれる。
【００１８】
（Ｂ）心疾患治療薬のスクリーニング方法
上述のように、NRSE-NRSF系による心臓特異的胎児型遺伝子の抑制がうまくはたらかないことが、心肥大や不整脈等の発症の原因の一つとなっている。従って、NRSE-NRSF系による心臓特異的胎児型遺伝子の抑制を強めるような働きをする物質は、心疾患に対し治療又は予防効果があると予測される。この知見から、以下の工程を含む心疾患治療薬のスクリーニング方法が提供される。
（１）NRSE-NRSF系により発現が調節される遺伝子を、候補となる物質と接触させる工程
（２）前記遺伝子の発現量を確認する工程
【００１９】
ここで、NRSE-NRSF系により発現が調節される遺伝子とは、その隣接領域又はイントロンにNRSEとして機能する配列を持っており、その配列にNRSFが結合することにより、発現が抑制される遺伝子をいう。このような遺伝子としては、ANP遺伝子、BNP遺伝子、SKA遺伝子、HCN2遺伝子、HCN4遺伝子、CACNA1H遺伝子などを例示できるが、これらに限定されるわけではない。遺伝子は、NRSE-NRSF系により発現が抑制された状態にあってもよく、何らかの手段（例えば、ドミナントネガティブNRSFの発現など）により、発現の抑制が阻害された状態にあってもよい。
【００２０】
候補とする化合物は特に限定されず、生体由来の物質、人工的に合成された物質のいずれでもよい。
【００２１】
接触方法は特に限定されず、例えば、NRSE-NRSF系により発現が調節される遺伝子を含む細胞を、候補となる物質を含む培地中で一定時間培養したり、あるいは、前記遺伝子を含む細胞に、候補となる物質を接種したりすればよい。
【００２２】
NRSE-NRSF系により発現が調節される遺伝子の発現量は、例えば、この遺伝子がレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子など）と共に発現するようにしておき、そのレポーター遺伝子の発現量を指標として確認することができる。候補物質との接触により、前記遺伝子の発現量が減少していれば、その候補物質は、心疾患に対し治療又は予防効果があると予測される。
【００２３】
（Ｃ）心疾患モデル動物
上述のように、NRSFリプレッサー機能の持続的な抑制は心筋症様の心疾患など心疾患を引き起こす。従って、動物のNRSFリプレッサー機能を抑制することにより、その動物に心疾患に類似した病態を発症させることが可能である。この知見から、心臓においてNRSFのリプレッサー機能を抑制していることを特徴とする心疾患モデル動物が提供される。
【００２４】
ここで使用する動物は、実験動物として使用され得るものであればどのようなものでもよく、例えば、マウス、ラット、ウサギなどを使用することができる。
【００２５】
心臓におけるNRSFのリプレッサー機能の抑制は、実施例で示したように、心臓特異的なプロモーターの下流にドミナントネガティブNRSFを発現させることにより行うことができる。
【００２６】
本発明の心疾患モデル動物は、心疾患治療又は予防薬のスクリーニング、あるいは、心疾患の発症機構の解明などに有用である。
【００２７】
【実施例】
〔実施例１〕  培養心筋細胞におけるNRSFの機能の検討
本発明者らは以前に、NRSEは培養された新生児ラット心室筋細胞(NRVM)においてANP遺伝子の基礎発現を抑制し、そしてANP遺伝子プロモーター活性のET-1により誘導される増大に関与すると報告した(Kuwahara et al., 2001)。本実施例において、本発明者らはNRVM中でドミナントネガティブ形態のNRSFを発現する組換えアデノウイルス(Ad/dnNRSF)を用いて、内因性心臓特異的胎児型遺伝子発現の調節におけるNRSFの機能を検討する。対照アデノウイルスAd/lacZに感染したNRVMと比較すると、Ad/dnNRSFに感染したNRVMにおいては、SKA遺伝子およびGAPDH遺伝子のmRNAではなく、ANP遺伝子、BNP遺伝子およびα-骨格アクチン遺伝子のmRNAの内因性発現が顕著に増大した（図１）。さらに、dnNRSFの発現はANP遺伝子、BNP遺伝子およびSKA遺伝子の発現におけるET-1によって誘導される増大を顕著に弱化させた(図２および図３)。総合的に考えると、これらのデータは以下のことを示している。
(1)NRSFは心室筋細胞における内因性ANP遺伝子、BNP遺伝子およびSKA遺伝子の発現を抑制する。
(2)NRSFはこれらの遺伝子発現のET-1によって誘導される増大を調節するうえで重大な役割を果たす。
(3)NRSEによる抑制は、ET-1シグナル伝達経路の下流に存在するNRSFによって阻害される。
【００２８】
本発明者らはまた、ET-1で処理したNRVMではNRSF遺伝子のmRNA量が減少しないことをも報告し(Kuwahara et al., 2001)、そして心室肥大マウスモデルまたはヒト不全心において心室NRSF遺伝子のmRNA量が減少しないことを示す予備的データを持っている(K.K., S.Y.およびY.S.、未刊行データ)。ET-1はNRSFのリプレッサー機能を抑制することによって心室筋細胞に遺伝子発現を誘導するのかどうかを決定するため、本発明者らはプラスミド5UAS-hANPLucおよび GAL4-NRSF融合タンパク質をコードするプラスミドに共感染させたNRVMをET-1と共に48時間インキュベートした。本発明者らは、ET-1が5UAS-hANPLucリポーター活性のGAL4-NRSF媒介抑制を部分的に阻害し、ET-1への応答を大幅に増大させることを見いだした。5UAS-TKLucをGAL4-NRSFと共に共感染させた場合、本質的に同一の結果が得られた（図４）。このことは、翻訳後修飾によるNRSFレプレッサー機能の抑制は、胎児型遺伝子発現のアップレギュレーションをもたらす肥大シグナル伝達経路の重要な構成要素であるという意見を支持する。
【００２９】
〔実施例２〕  in vivoにおけるNRSFの機能の検討
NRSFの役割、および心臓におけるNRSFリプレッサー機能の抑制の効果を調べるため、本発明者らは心臓特異的α-MHCプロモーターの制御下でdnNRSFを発現するトランスジェニックマウスを作製した(図５)。由来を異にする2系統のdnNRSFトランスジェニック(Tg)初代マウス(Tg401およびTg404)を調査した（図６）。ウエスタンブロット分析は、弱いdnNRSFの発現が肺に観察されるが、dnNRSFの発現は内因性α-MHCが静脈中で発現される心臓に主として限定されることを示した（図７）（Subramaniam et al., 1991）。心臓特異的胎児型遺伝子発現のin vivo調節におけるNRSFの役割を突き止めるため、本発明者らは8週齢および20週齢マウスから採取した心室より調製した全RNAを用いて、ANP遺伝子、BNP遺伝子、SKA遺伝子、β-MHC遺伝子、α-心臓アクチン遺伝子、ミオシン軽鎖-2v遺伝子 (MLC-2v)、筋小胞体／小胞体Ca2＋ ATPase 2遺伝子（SERCA2遺伝子）およびGAPDH遺伝子のノーザンブロット分析を実施した（図８および図９）。8週齢までに、NRSEを含むANP遺伝子、BNP遺伝子、およびSKA遺伝子の発現はTgマウスの心臓において選択的に増強された。他方、NRSEを含まないβ-MHC遺伝子の発現はこの週齢では誘導されなかった。このように、NRSFはANP遺伝子、BNP遺伝子およびSKA遺伝子の発現を選択的に調節し、そして8週齢Tgマウス心臓におけるそれらの発現の誘導はNRSF抑制の「第一次」結果であり、病理学的変化の発生とはほぼ無関係である。この考えと一致して、8週齢Tgマウスと非トランスジェニック（NTg）マウスの間では、心臓重量：体重比には差がなかった（図１６）。しかし20週齢までに、NTgマウス心臓と比較してTgマウス心臓においてはβ-MHC遺伝子は著しくアップレギュレーションされ、そしてSERCA2遺伝子発現はダウンレギュレーションされた。遺伝子発現におけるこれらの遅延された変化は、20週齢までにTgマウス心臓に起こった病理学的変化の進行を示すものである。
【００３０】
NRSFがin vivoにおける心臓特異的胎児型遺伝子の再発現においても重大な役割を果たすか否かを突き止めるため、本発明者らはTgマウスおよびそれらのNTg同腹子の心臓を横行大動脈収縮(TAC)によって創り出される圧過負荷にかけた。以前に報告されたように（Harada et al., 1998）、急性圧過負荷はTAC後30分以内にNTgマウス心臓にc-fos遺伝子およびBNP遺伝子の発現を誘導した(図１０)。8週齢Tgマウス心臓はNTgマウス心臓よりもBNP遺伝子発現の高い基礎レベルを示したが、TACによるBNP遺伝子発現の誘導はTgマウス心臓の方が少なかった（図１０および１１）。対照的に、TACの近位部と遠位部での収縮期圧勾配およびc-fos遺伝子発現の誘導性は、TgおよびNTgマウスの心臓で類似していた（図１０、図１２及び図１３）。
【００３１】
〔実施例３〕  NRSFを抑制したマウスの心臓の分析
Tgマウスは8週齢までに死亡し始め、30週齢までに60-90%が死亡した。対照的に、同腹のNTgは100%生残した(図１４)。8週齢では心臓の大きさに何ら有意差がないという事実（図１５）にも関わらず、肉眼でみた心臓の外見は20週齢Tgマウスの心臓がNTgマウスの心臓よりもはるかに大きいこと明らかにした。8および12週齢のTgおよびNTgマウスにおける心臓重量：体重比にも有意差は存在しなかったが、20週齢までにはTgマウスにおける心臓重量：体重比はNTgマウスのそれよりも1.45倍大きくなっていた(図１６)。Tgマウスの死に方は「突然死」によって特徴づけられた。なぜなら、かれらの体重および肺重量：体重比は、NTgマウスのそれらと差がなかったからである（図１７および図１８）。
【００３２】
Tgマウスの心臓における変化をより良く理解するために、本発明者らは一連の詳細な心エコー法的、血流力学的および病理学的分析を実施した。8週齢および20週齢で実施した二次元Mモード心エコー検査は、Tgマウスにおける内径短縮率および駆出率の漸進的低下を明らかにした（表１および図１９）。8週齢では左室拡張末期径(LVDd)および左室収縮末期径(LVSd)に重大な影響は見られなかったが、20週齢までにTgマウスではNTgマウスと比較してLVDdおよびLVSdがそれぞれ30%および80%高くなっていた(表１)。壁厚には有意差はなく、このことはTgマウスにおける左室壁肥大を伴わない進行性左室機能不全を示している。
【００３３】
先端トランスデューサー型カテーテルを用いた血流力学的分析の結果は心エコー検査の所見（図２０）と一致し、心臓NRSFの抑制は進行性左室機能不全を引き起こすに十分であることを示した。Tgマウスは20週齢で収縮期心室圧の低下ならびに左室圧の最大一次微分値(dP/dtmax)および左室圧の最大負微分値(dP/dtmin)の両方における重大な低下を示した；これらは8週齢では見られなかった状態である(表２)。
【００３４】
横断切片の組織学的検査は、20週齢Tgマウス心臓における壁厚の重大な増加を伴わない左室拡張を明らかにした(図２１Ａおよび図２１Ｂ)。さらに、心室筋細胞の大きさにおける顕著な不均一が目立ち、ある細胞は肥大化しており、またある細胞は萎縮していた（図２２Ａおよび図２２Ｂ）。dnNRSFトランスジェニックマウスの心臓には重大な炎症性細胞浸潤物は観察されず、コラーゲンに対するマッソントリクローム染色はTgマウス心室における間質性繊維症の存在を示した（図２２Ｃおよび図２２Ｄ）。
【００３５】
透過型電子顕微鏡による心室筋細胞の超構造の検査は、20週齢NTgマウスにおいては筋原繊維が整然と存在しており、またミトコンドリアが完全な形であることを明らかにした（図２３Ａおよび図２３Ｃ）。他方、同週齢のTgマウスにおいては、筋原繊維は粗しょう化で配列が乱れ、Z帯は不連続で、そしてミトコンドリアは変形しているか又は完全に破壊されていた（図２３Ｂおよび図２３Ｄ；矢印は破壊されたミトコンドリアを示す）。これらはヒトの拡張型心筋症に特有の特徴である。
【００３６】
【表１】
2006075001.tif 000002
【００３７】
【表２】
2006075001.tif 000003
【００３８】
〔実施例４〕  NRSFを抑制したマウスにみられる不整脈の検討
心不全患者の死因は進行性のポンプ機能不全、または心不全患者の半数に起こり、おそらく致死性不整脈の結果であると思われる突然死である。Tgマウスの死に方は突然死として特徴づけられた。彼らは比較的正常な挙動および活動レベルを示してから24時間以内に、死亡しているのが不意に見いだされた。この概念と一致して、20週齢になっても体重および肺重量：体重比はNTgマウスとTgマウスの間で差がなかった(図１７および図１８)。また、心不全の兆候である肺もしくは肝臓鬱血の明らかな徴候は見られなかった。したがって、本発明者らは生命を脅かす不整脈がTgマウスの死に寄与すると仮定した。この仮説を試験するため、本発明者らは埋め込み可能な遠隔計測器（テレメータ）を用いてマウスの心電図データを継続的にモニターした。基礎ECGパターンは、TgマウスではNTgマウスと比較してPQ間隔が長い(p<0.05)ことを示した(第I度房室ブロック)。Tgマウスでは、より重篤な第II度房室ブロック（図２４Ａ）および心室頻脈(VT)の連発を含む心室性不整脈（図２４Ｂおよび図２４Ｃ）もまた観察された。NTgマウスにはそのような不整脈は全く観察されなかった。驚くにはあたらないが、不全収縮期に先立つVTおよび心室細動(VF)がTgマウスの死亡時に記録された（図２４Ｄ）。このように、Tgマウスはヒト心筋症心臓にしばしば観察される種々の不整脈を示し、最終的には突然死をとげる。
【００３９】
Tgマウス心臓の刺激伝導特性およびそれら心臓の心室不整脈に対する感受性をより定量的に評価するため、本発明者らは8極性EPカテーテル(Gehermann et al., 1999)を用いて12週齢マウスの心臓内電気生理学的分析を実施した。Tgおよび NTgマウスの間で洞周期には有意差がないことが判明したが（NTg: 103.2±6.5 ms vs. Tg: 113.8±4.8 ms;それぞれ n=6）、Tgマウス心臓において房室間隔は有意に延びていた（Tg: 48.5±2.0 ms vs. NTg: 31.0±2.4 ms; それぞれn=6; p<0.001）。これはテレメータのデータと一致していた。Tgマウス心臓の右室有効不応期とNTgマウス心臓のそれに有意差はなかった（Tg: 22.9±1.3 ms vs. NTg: 26.0±1.8 ms; それぞれn=6）。心室不整脈の誘導性を評価するためにプログラムされた電気刺激をかけた場合、Tgマウス10匹中6匹の心臓にVTが誘導されたが、NTgマウスでは10匹中いずれの心臓にもVTは誘導されなかった(図２５Ａ〜図２５Ｃ)。明らかに、Tgマウスの心臓はNTgマウスのそれよりも心室不整脈に対してより感受性である。
【００４０】
〔実施例５〕  NRSFとHCN2/HAC1遺伝子との関連性の検討
Tgマウスにおける不整脈に対する感受性および死亡率の増大が、重篤な構造異常および心機能不全の確立に先だつという事実は、心筋症様の表現型のみならずイオンチャネル遺伝子発現の「第一次」変化もまた、Tgマウスの心室不整脈および突然死への高い感受性に関与していることを示唆する。そこで、本発明者らは6週齢のNTgおよびTgマウスの心室から抽出したmRNAを用いてcDNAアレイ(Affymetrix)を評価し、そしてTgマウス心臓においてHCN2/HAC1遺伝子発現がアップレギュレーションされていることを見いだした。HCN2遺伝子は、胎児の心室筋細胞に観察されるが正常な成熟心室筋細胞には見出されない過分極活性化電流(If)を運ぶイオンチャネルをコードしている。Ifは肥大化した心臓または不全心において再誘導される；そしてそれは不整脈出現頻度の増加に寄与するのかもしれない(Cerbai et al., 1996; Cerbai et al., 1997; Cerbai et al., 2001)。したがって、本発明者らは定量的RT-PCRを用いて、心室で発現される主要なHCN遺伝子のアイソフォームであるHCN2遺伝子およびHCN4遺伝子のmRNAの発現を検査した（Santoro and Tibbs, 2000）。図２６および図２７に示すように、HCN2遺伝子およびHCN4遺伝子の発現は両方とも、それらの産物の発現と同じく（図２８）、8週齢Tgマウス心臓において大幅にアップレギュレーションされていた。さらに、NRSEに非常によく似た配列がHCN2遺伝子およびHCN4遺伝子両方のイントロン1内で検出され（図２９）、そして電気泳動移動度シフトアッセイはNRSFがHCN2遺伝子およびHCN4遺伝子両方のNRSEに結合することを明確に示した（図３０）。このことは、両方の遺伝子がNRSF下流の標的遺伝子であることを示している。
【００４１】
8から10週齢のマウスから単離した単一心室筋細胞を用いて実施したパッチクランプ法による試験は、Tgマウス心臓由来の心室筋細胞におけるIf活性化のさらなる証拠を提供した。内向き整流性K+電流(IK1)の完全な抑制後、過分極はNTgマウス由来の心室筋細胞に対して実質的に何の効果もない（図３１Ａ）。対照的に、Tgマウス由来の筋細胞においては、過分極は時間および電位依存性内向き電流を活性化した（図３１Ｂ）。この電流は5 mM Cs+の添加によって完全にブロックされ、この電流がIfであることが確認された(図３２)。Cs+感受性成分を引き去ることによってIfの電流-電位関係を特徴づけた；NTgマウスの筋細胞ではCs+感受性電流は全く記録されなかった（図３３）。ペースメーカー細胞中のIfのように、Tgマウス心室筋細胞中のIfは電位依存性活性化曲線の右向きシフトのゆえに（図３４）βアドレナリン作動刺激によって増大した（図３２）。半最大活性化電位(Vh)(各データセットにBoltzmannの式を適用して計算される)は3μMイソプロテレノールの添加によって-93.3±6.4 mV から-79.7±2.4 mVに変化した（図３４）。
【００４２】
〔実施例６〕  NRSFとHCN2/HAC1遺伝子との関連性の検討
T型Ca2+電流(ICa,T)もまた胎児心室筋細胞で発現され、成熟筋細胞では抑制され、そして肥大心または不全心の筋細胞で再活性化される（Sen et al., 1993; Nuss et al., 1993; Martinez et al., 1999）。心臓で発現される2つのT型Ca2+チャネル遺伝子(Leuraguer et al., 2000)、すなわちCACNA1H遺伝子およびCACNA1G遺伝子のうち前者のイントロン1内に本発明者らはNRSEに類似した複数の配列を同定した（図３５）。NRSEをプローブとして実施した電気泳動移動度シフトアッセイは、NRSFがそれらの配列と結合することを明確に示した（図３６）。さらに、定量的RT-PCRは8週齢Tgマウス心室におけるCACNA1G遺伝子ではなくCACNA1H遺伝子の発現増加（図３７および図３８）、およびそれに対応するICa,Tの活性化を示した。したがって、(1)NRSFは胎児性イオン電流をコードする遺伝子を調節し、そして(2)これらのイオンチャネル遺伝子発現の調節異常は、少なくとも部分的に、Tgマウスの不整脈および突然死への感受性増大に寄与する、と考えられる。
【００４３】
〔実験方法〕
以下、上記実施例で用いた実験方法について説明する。
【００４４】
＜プラスミド構築物＞
5つのGAL4結合部位を含む122 bpのKpn I/Nhe I断片をpG5luc ベクター(Promega, Madison, WI)から得て、TKluc中の単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(TK)プロモーターの上流に挿入し、プラスミド5UAS-TKLucを作製した。上記TKluc中ではTKプロモーターはPGV-B2 (東洋インキ、東京)のBgl II/Hind III部位に挿入されていた(Kuwahara et al., 2001)。5UAS-hANPLucを作製するため、TKプロモーターを含むBgl II/Hind III断片を5UAS-TKLucから除去し、ANP遺伝子の-452位から+97位にわたるBgl II/Hind III断片(Kuwahara et al., 2001)をそこに挿入した。全てのプラスミド構築物は配列決定によって確認した。マウス全長NRSFおよびdnNRSF (Chen et al., 1998)をコードするプラスミドは、David J. Anderson (California Institute of Technology, Pasadena, California)より親切に提供された。GAL4-NRSF発現プラスミド（pBIND-NRSF）は以前に記述されているようにpBINDベクター (Promega)内に構築された(Kuwahara et al., 2001)。
【００４５】
＜心室筋細胞培養物およびトランスフェクション＞
新生児ラット心室筋細胞の調製およびそれらの一過性トランスフェクションは以前に記述されているように実施した(Kuwahara et al., 2001)。トランスフェクトされた筋細胞を培養し、10 nM ET-1（ペプチド研究所、大阪）を用いて48時間処理し、そして以前に記述されているようにルシフェラーゼ活性をアッセイした(Kuwahara et al., 2001)。各実験において、3つのウエル由来の細胞溶解物のアリコートをアッセイした。
【００４６】
＜アデノウイルス感染＞
心室筋細胞を播いた翌日に、dnNRSFを発現する組換えアデノウイルス(Ad/dnNRSF)(Kuwahara et al., 2001)に感染多重度= 5粒子/細胞で12時間、無血清DMEM中で感染させた。次に、10 nM ET-1の存在下または不存在下で、これらの細胞を血清培地中でさらに24時間培養した。このプロトコールを用いた場合、lacZ 遺伝子発現(Ad/lacZ)との比較によって評価した発現効率は一貫して90%以上であった。
【００４７】
＜電気泳動移動度シフトアッセイ＞
P19細胞由来の核抽出物を以前に記述されているように調製した(Kuwahara et al., 2001)。NRSEANP (5'-CACTT CAGCA CCATG GACAG AAGA-3'), NRSEHCN2 (5'-GTTTC AGCA C CACGG ACAGC GCGC-3'), NRSEHCN4 (5'-CGTTC AGCAC CACGG ACAGC  GCCCA-3') または NRSECACNA1H(5'-GATTC AGCAC CATGG ACAGC AGCC-3')を2コピー含む2本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)のプローブとして用いた。EMSAは以前に記述されているように実施した(Kuwahara et al., 2001)。NRSFに対して産生させたモルモットポリクローナル抗体をスーパーシフト実験(Ogawa et al., 2002)に用いた。
【００４８】
＜α-MHC-dnNRSFトランスジェニックマウスの作製＞
dnNRSF cDNAを5'mycエピトープタグと共に、α-MHCプロモーターを含むpBluescript II KS(+)プラスミド(Dr. J. Robbins, The Children’s Hospital and Research Foundation, Cincinati, OHからの寛大な贈与品)のSal I/Hind III部位にクローン化した。Not Iを用いてα-MHC-dnNRSFトランスジェニック構築物を線状化し、そしてC57BL/6Jマウス由来の受精卵母細胞の前核に注入するために精製した。その後、生き残った胚を偽妊娠MCH(ICR)マウスの卵管に移植した。尾DNAを用いたサザンブロット分析によってトランスジェニック初代マウスを同定し、トランスジェニックF1マウスの作製に用いた。dnNRSFの発現は抗mycタグポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）を用いたウエスタンブロット分析によって検査した。動物の世話および全ての実験は京都大学医学部大学院が定めた指針に従って実施された。
【００４９】
＜ノーザンブロット分析＞
心室筋細胞または左心室から調製した全RNAを用いて以前に記述されているようにノーザンブロット分析を実施した（Nakagawa et al., 1995; Kim et al., 1995; Tamura et al., 2000; Harada et al., 1998; Jones et al., 1996）。
【００５０】
＜定量RT-PCR分析＞
心室から調製した50 ngの全RNAを用いて、定量RT-PCRを製造者(Applied Biosystems, Zaventam, Belgium)のプロトコールにしたがって実施することによりmHCN2遺伝子、mHCN4遺伝子、mCACNA1H遺伝子、mCACNA1G遺伝子およびGAPDH遺伝子のmRNA のレベルを測定した。下記のフォワード(F)およびリバース(R)プライマー、ならびに蛍光色素(FAM)およびクエンチャー (TAMRA)を有するプローブ(P)を用いた:
mHCN2遺伝子:
F, 5'-AGCAG GAACG CGTGA AGT-3'（配列番号８）
R, 5'-AATGA GATTT CCCAC CATGA A-3'（配列番号９）
P, 5'-FAM-ACCCC TACAG CGACT TCAGG TTCTA CTG-TAMRA-3'（配列番号１０）
mHCN4遺伝子:
F, 5'-CTTCC CCCAT GACTG CTG-3'（配列番号１１）
R, 5'-CGTCC ATACC CAATG CACA-3'（配列番号１２）
P, 5'-FAM-TGGCA TGGTG AATAA CTCCT GGGGG A-TAMRA-3'（配列番号１３）
mCACNA1H遺伝子:
F, 5'-GCCTC CGACT GGTTT GTAA-3'（配列番号１４）
R, 5'-TTCTG AACGG CACTC AACAT-3'（配列番号１５）
P, 5'-FAM-CCGTG GTTCG AGCAC ATTAG CA-TAMRA-3'（配列番号１６）
mCACNA1G遺伝子:
F, 5'-GGAGA AAAAG AGAAG GAGTA AGGA-3'（配列番号１７）
R, 5'-GAAGC GCGAG TAGTC AGAGT AG-3'（配列番号１８）
P, 5'-FAM-AAGCA GATGG CCGAT CTAAT GTTGG-TAMRA-3'（配列番号１９）
【００５１】
＜ウエスタンブロット分析＞
溶解物を電気泳動によって分離し、HCN2、HCN4 (Alomone Labs., Jerusalem, Israel)またはリアノジン受容体2(RyR2)(Affinity Bioreagent, Inc., CO)に対して産生させた抗体を用いてブロットした。
【００５２】
＜組織学的分析＞
光学顕微鏡検査のためには、心室組織を10%中性緩衝化ホルマリン中に一晩置いた。固定後、それらのサンプルを一連の脱水工程にかけ、パラフィンに包埋した。標準的なヘマトキシリンおよびエオシン(HE)プロトコールまたはマッソン3色染料プロトコールを用いて切片を染色した。Olympus BX50顕微鏡を用いて顕微鏡写真を得た。透過型電子顕微鏡検査のためには、心臓組織を2.5%グルタルアルデヒドおよび0.1 Mリン酸バッファー中で4℃で4時間固定した。その後、1%緩衝化四酸化オスミウム中で後固定し、等級づけられた(graded)エタノールにより脱水し、Eponに包埋した。ダイアモンドナイフを用いて超薄切片(80 nm)を切り出し、300メッシュの銅グリッド上に集め、そして電子顕微鏡（H-700、日立、東京）で検査する前に酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で二重染色した。
【００５３】
＜心エコー検査＞
ケタミン(80 mg/kg)およびキシラジン(4 mg/kg)の腹腔内注入によってマウスを麻酔した。次に、12-MHzプローブを備えたHewlett-Packard Sonos 5500超音波イメージングシステムを用いて心エコー検査を実施した。
【００５４】
＜血流力学的分析＞
最初にエーテルで麻酔したマウスに18ゲージの血管カテーテルを挿管し、1回呼吸量を0.8-1.0 mlとして1分あたり110呼吸の割合で空気を送り、次に0.5-1.5%イソフルランを用いて麻酔した。1.4 フレンチマイクロナノメーターカテーテル(SPR-612; Millar)を用いて、右頸動脈から左室にカテーテル挿入した。
【００５５】
＜心臓内電気生理学＞
上記のようにマウスに挿管および麻酔を行って、表面心電図（ECG）（四肢誘導）を得た。電極間距離が0.5 mmである1.7 フレンチ 8極性カテーテル（CIBer mouse EP, Nume, Hopkinton, NY）を静脈切開により頸静脈から挿入した。このカテーテルを用いて、以前に記述されているように標準的EPSプロトコールを実施した（Gehrmann et al., 2000）。１〜２の余分な刺激を用いる余分刺激(S1S2)技法によって速い心室ペーシングを実施して、心室不応期を測定し、また心室不整脈の誘導を試みた。刺激は心室拡張期捕捉閾値の2倍にした。
【００５６】
＜遠隔測定法による心電図の分析＞
被験者を機械に固定しないで心電図をモニターするため、無線周波送信機(Data Science, St. Paul, MN; TA 10ETA-F20)を以前に記述されているように埋め込んだ(Lee et al., 1998)。埋め込みの72時間後から死亡時まで記録を継続した。
【００５７】
＜横行大動脈狭窄(TAC)実験＞
TACによる圧過負荷を以前に記述されているように創り出した(Rockman et al., 1991; Harada et al., 1998)。大動脈狭窄の血流学的効果をモニターするため、右および左頸動脈の両方に炎で延ばしたPE-50チューブを挿管し、そしてポリグラフシステム(福田電子、東京)を用いて脈波形を同時にモニターした。
【００５８】
＜単離された心室筋細胞の電気生理学的記録＞
左室から単離された筋細胞を用いて、以前に記述されているように全細胞パッチクランプ法実験を実施した（Powell et al., 1980）。 145 mM KCl、 5.0 mM MgATP、 5 mMリン酸クレアチン二ナトリウム、5 mM EGTA、0.1 mM Na2GTPおよび5 mM HEPESを含むK+が豊富なピペット溶液(KOHでpH=7.2に調節)を用いて、Ihを記録した。Gigaシールおよび全細胞ボルテージクランプは、140 mM NaCl, 5.4 mM KCl、0.5 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2、5 mM HEPESおよび 5 mM グルコースを含む対照浴液（NaOHでpH=7.4に調節）中で確立した。その後、0.5 mM BaCl2を添加して内向き整流性K+電流を抑制した。または、100 mM N-メチル-D-グルカミン(NMDG)、40 mMテトラエチルアンモニウムクロリド(TEA)、5.4 mM CsCl、1.8 mM CaCl2、5 mM HEPESおよび 5 mM グルコースを含むNa不含浴液(HClでpH=7.4に調節)で灌流した。T型Ca2+電流の記録にあたっては、ピペット溶液は150 mM CsCl、5.0 mM MgATP、10 mM BAPTAおよび5 mM HEPESを含んでいた（CsOHでpH=7.2に調節）。全ての32-34℃で行った。
【００５９】
＜統計学的分析＞
データは平均値±平均値の標準誤差(SEM)で表わす。有意差の決定には、分散分析(ANOVA)をポストホックFisher検定と共に用いた。p<0.05で有意と見なした。
【００６０】
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【００６１】
【発明の効果】
本発明は、心疾患関連遺伝子及び心疾患治療薬の新規なスクリーニング方法、並びに新規な心疾患モデル動物を提供する。これらの方法等は、心疾患の発症機構の解明及びの心疾患の新たな治療及び予防手段の開発に有用である。
【００６２】
【配列表】
2006075001.tif 000004
2006075001.tif 000005
2006075001.tif 000006
2006075001.tif 000007
2006075001.tif 000008
2006075001.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】  Ad/lacZまたはAd/dnNRSFに24時間感染させた培養心室筋細胞におけるANP遺伝子、BNP遺伝子、α-骨格アクチン遺伝子(Ska)、α-心臓アクチン遺伝子(CaA)およびGAPDH遺伝子のmRNAレベルを示すノーザンブロットの結果を表す図。
【図２】  10 nM ET-1の存在下または不存在下で Ad/lacZまたはAd/dnNRSFに24時間感染させた培養心室筋細胞におけるANP遺伝子、BNP遺伝子、Ska遺伝子および GAPDH遺伝子 のmRNAレベルを示すノーザンブロットの結果を表す図。
【図３】  Ad/lacZまたはAd/dnNRSFに24時間感染させた心室筋細胞における、10 nM ET-1によって誘導されたANP遺伝子、BNP遺伝子およびSka遺伝子のmRNAレベルの増加パーセントを表す図（*p<0.05 vs. Ad/lacZ、それぞれn=4）。
【図４】  GAL4-NRSF融合タンパク質(GAL4DBD-NRSF)の存在下または不存在下で、ET-1で処理した又は処理していない心室筋細胞における5UAS-hANPLuc（上段のグラフ）および5UAS-TKLuc(下段のグラフ)のプロモーター活性を表す図。右側のグラフにおいて、10 nM ET-1で処理した筋細胞中にトランスフェトされた構築物の活性は、ET-1で処理されていない筋細胞における活性と比較した増加倍数で表わす。グラフの各棒は、それぞれ3個のサンプルを使って実施された少なくとも3つの別個なアッセイ由来の相対ルシフェラーゼ活性の平均値±SEMを表わす。*p<0.05 vs. pBIND-NRSFおよびET-1の不存在下における5UAS-hANPLuc。†p<0.05 vs. ET-1の存在下でpBIND-NRSFの不存在下における5UAS-hANPLuc。
【図５】  dnNRSFトランスジェニック(Tg)マウスを作製するためのcDNA構築物を表す図（Hgh：ヒト成長ホルモン遺伝子のポリＡ配列）。
【図６】非トランスジェニック(NTg)マウスおよび2つの異なる系統のTg初代マウス(Tg471およびTg474)由来の心室におけるdnNRSF発現のウエスタンブロット分析の結果を示す図。
【図７】  Tgマウス由来の種々の臓器におけるdnNRSF発現のウエスタンブロット分析の結果を示す図（H：心臓、Lu：肺、L：肝臓、K：腎臓）。
【図８】  8および20週齢のNTgマウスおよびTgマウスにおける表示されたmRNAの心臓発現レベルを表す図（MLC-2v：心室ミオシン軽鎖-2）。
【図９】表示されたmRNAのTgおよびNTgマウス心臓における相対レベルを示す図。棒は3つの独立した実験由来の平均値±SEMを表わす（*p<0.05 vs. NTgマウス心臓; それぞれn=6。）。
【図１０】  TACまたはsham操作を行ったNTgおよびTgマウス心臓におけるBNP遺伝子、c-fos遺伝子およびGAPDH遺伝子のmRNAレベルを示すノーザンブロットの結果を表す図。
【図１１】  TACの30分後におけるNTgおよびTgマウス心臓のBNP遺伝子mRNAの増加倍数を表す図。
【図１２】  NTgおよびTgマウス心臓における狭窄の端から端までの圧勾配を表す図。
【図１３】  TACの30分後のc-fos遺伝子mRNAの増加倍数を表す図。
【図１４】  Tg471 (図中Tg1と表示、n=68)およびTg474 (図中Tg2と表示、n=35)ならびに NTgマウス(n=145)のカプラン-マイヤー生存分析の結果を表す図。TgマウスとNTgマウスの間の生存率の差はログランク検定により有意であった（p<0.0001）。
【図１５】  8、12および20週齢のNTgおよびTgマウスの心臓を表す図（縮尺線、10 mm）。
【図１６】表示した時点で測定したNTgおよびTgマウスの心臓重量／体重比(mg/g)を表す図（*p<0.05 vs. 週齢が一致するNTgマウス）。
【図１７】  NTgおよびTgマウスの肺重量／体重比(mg/g)を表す図（*p<0.05 vs. 週齢が一致するNTgマウス）。
【図１８】  NTgおよびTgマウスの体重(g)を表す図（*p<0.05 vs. 週齢が一致するNTgマウス）。
【図１９】  20週齢のNTgおよびTgマウス由来のMモード心エコー検査記録を表す図（IVS：心室中隔壁、LV：左室、PW：後壁、ESD：収縮末期径、EDD：拡張末期径）。
【図２０】  NTgおよびTgマウス由来の高忠実度左室圧記録を表す図（HR：心拍数、LVP：左室圧）。
【図２１】  NTgマウス(A)およびTgマウス(B)由来の心臓を縦に切片化し、HEで染色した組織片の顕微鏡写真（縮尺線：2.5 mm）。
【図２２】  HE (AおよびB)またはマッソン3色染料（CおよびD）で染色した、NTg マウス(AおよびC)およびTgマウス(BおよびD)由来の左室の組織切片の顕微鏡写真。コラーゲンは3色染料によって青く染まる(D)。倍率：400x。
【図２３】  NTg マウス(AおよびC)およびTgマウス(BおよびD)由来の心臓筋細胞の電子顕微鏡写真。矢印は破壊されたミトコンドリアを示す。My：筋原繊維、Mt：ミトコンドリア、N：核、縮尺線：1μm。
【図２４】埋め込み可能な無線遠隔計測器を用いてTgマウスの心電図。(A)第II度房室ブロック、(B)単離された心室転位、(C)非持続性心室頻脈(VT)、(D)持続性VTおよび心室細動(VF)、それらに続く不全収縮期。
【図２５】電気生理学的試験の間にTgマウスより得られた心電図。多様な形をもつVT（A及びB）、持続性の多形VTおよびそれに続くVF(C)。
【図２６】  8週齢NTgおよびTgマウスの心臓におけるHCN2遺伝子mRNAの相対レベルを表す図（ *p<0.05 vs. NTgマウス。）。
【図２７】  8週齢NTgおよびTgマウスの心臓におけるHCN4遺伝子mRNAの相対レベルを表す図（ *p<0.05 vs. NTgマウス。）。
【図２８】  8週齢NTgおよびTgマウスの心臓におけるHCN2、HCN4 およびRYR2のウエスタンブロット分析の結果を表す図。
【図２９】  HCN遺伝子におけるNRSEに類似した配列を表す図。
【図３０】  ANP遺伝子、HCN2遺伝子またはHCN4遺伝子中のNRSEに由来する放射性標識化オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてEMSAを実施した結果を表す図。ANP遺伝子中のNRSE由来の未標識オリゴヌクレオチドを冷競合物として使用した。
【図３１】  NTgマウス(A)およびTgマウス(B)由来の心室筋細胞におけるIk1の完全な抑制後に過分極によって誘導された時間依存性内向き電流を表す図。
【図３２】  5 mM Cs+ または 3 μM イソプレテノールの存在下でTgマウス由来の心室筋細胞に誘導された、過分極活性化内向き電流を表す図。
【図３３】  NTgマウス(▲)およびTgマウス(○)由来の心室筋細胞におけるIfの電流-電位関係を表す図。
【図３４】  3 μM イソプレテノールの不存在下（●）または存在下（○）でTgマウス由来の心臓筋細胞に誘導されたIfの電位依存性活性化曲線を表す図。
【図３５】  CACNA1H遺伝子中のNRSEに類似した配列を表す図。
【図３６】  ANP遺伝子中のNRSE由来の放射性標識化オリゴヌクレオチドまたはCACNA1H遺伝子をプローブとして用いてEMSAを実施した結果を表す図。ANP遺伝子中のNRSE由来の未標識オリゴヌクレオチドを冷競合物として用いた。
【図３７】  8週齢NTgおよびTgマウスの心臓におけるCACNA1H遺伝子mRNAの相対レベルを表す図（*p<0.05 vs. NTgマウス）。
【図３８】  8週齢NTgおよびTgマウスの心臓におけるCACNA1G遺伝子mRNAの相対レベルを表す図（*p<0.05 vs. NTgマウス）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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