(57)【要約】【課題】  細胞を破砕することなく薬物活性の定量化を行うことができるハイスループットな薬物スクリーニング手法を提供すること。【解決手段】  凍結乾燥酵母を基板上に配置した細胞チップ、該細胞チップを用いた薬物スクリーニング法及び該細胞チップを備えてなる遺伝子発現モニタリングシステム。染色体上のポリリン酸の合成及び／又は蓄積に必要な遺伝子のプロモーターが薬物により誘導可能なプロモーターに置換され、かつDNA結合タンパク質DNA結合ドメインのC末端側に転写因子のリガンド結合ドメインと転写活性化ドメインとを融合した人工的な転写因子をコードするキメラ遺伝子が導入された出芽酵母株であって、前記転写因子のリガンドの存在下で、ポリリン酸を合成するが、前記転写因子のリガンドの不存在下では、ポリリン酸を合成しない前記出芽酵母株。【選択図】  図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結乾燥酵母を基板上に配置した細胞チップ。
【請求項２】
凍結乾燥酵母を基板上に配置した細胞チップを用いて、所望の生物活性を有する薬物をスクリーニングする方法。
【請求項３】
凍結乾燥酵母を基板上に配置した細胞チップを備えてなる、遺伝子発現モニタリングシステム。
【請求項４】
さらに、少なくとも２本のキャピラリー、ピペット、キャピラリーアダプター、キャピラリーリムーバー、キャピラリーレイヤー、NMR管、及びNMR計測装置を備えてなる、請求項３記載の遺伝子発現モニタリングシステム。
【請求項５】
染色体上のポリリン酸の合成及び／又は蓄積に必要な遺伝子のプロモーターが薬物により誘導可能なプロモーターに置換され、かつDNA結合タンパク質のDNA結合ドメインのC末端側に転写因子のリガンド結合ドメインと転写活性化ドメインとを融合した人工的な転写因子をコードするキメラ遺伝子が導入された出芽酵母株であって、前記転写因子のリガンドの存在下で、ポリリン酸を合成するが、前記転写因子のリガンドの不存在下では、ポリリン酸を合成しない前記出芽酵母株。
【請求項６】
凍結乾燥酵母が請求項５記載の出芽酵母株である請求項１記載の細胞チップ。
【請求項７】
凍結乾燥酵母が請求項５記載の出芽酵母株であり、所望の生物活性を有する薬物が転写因子の活性を調節できる物質である請求項２記載の方法。
【請求項８】
凍結乾燥酵母が請求項５記載の出芽酵母株である請求項３又は４記載の遺伝子発現モニタリングシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非破壊的な遺伝子発現モニタリング技術を活用したハイスループット型薬物スクリーニング手法に関し、より詳細には、細胞チップ、出芽酵母株、薬物スクリーニング法及び遺伝子発現モニタリングシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
発生／分化から細胞分裂／DNA複製に至るまで、すべての生命現象は必要な遺伝情報がプログラム通りに正しく発現することにより支えられている。従って個々の生命現象を分子レベルで解明していくためには、情報発現の初発段階である転写反応の制御機構を正確に理解することが必要不可欠である。特に近年組織中の遺伝子発現を細胞レベルで簡便にモニタリングできる非破壊計測法の開発が急務となっている。これまでにもグリーン蛍光タンパク質(GFP）等の蛍光を利用する方法が報告されてはいる（非特許文献１）ものの、この方法には蛍光を外部から観測できる透明な生体試料のみにしか適用できないという問題点がある。マウスの深部組織のような不透明試料を細胞レベルでモニタリングしようとすれば現時点ではマイクロMRI（磁気共鳴イメージング）の利用が最も有効であると考えられる。しかしながらマイクロMRIの場合も利用できるレポーター遺伝子の種類に制限があることや、可視化のための基質の生細胞への分配が困難である等の理由から、転写研究のin vivoモニタリング法として一般化するには至っていない。
【０００３】
無機リン酸のポリマーであるポリリン酸は全ての生物に普遍的に存在しており、31P-NMRによる定量的なマイクロイメージングが原理的に可能であることから、遺伝子発現量をモニターする上で非常に有効なプローブになりうるものと考えられる（特許文献１）。
【０００４】
近年種々の核酸をスライドガラス上に固定したDNAチップが開発され、盛んに遺伝子発現プロファイリングに利用されている。しかしながら多種類の生細胞を基板上に整列させた「細胞チップ」については未だ開発段階にあり、実用化された例はない。
【０００５】
ところで、エストロゲン活性を有する薬物のスクリーニング法としては、エストロゲンにより増殖が促進されるヒト乳ガン細胞MCF-7を用いた増殖試験（非特許文献２）が知られている。この試験法は、薬物活性を細胞の増殖速度として定量するものであるが、ヒト培養細胞を用いているため、取り扱いが煩雑、高純度のサンプルでなければ測定不可能、培地に血清を含むため高価かつバックグラウンドが高い等の問題点がある。
【０００６】
別の方法として、エストロゲンレセプターとコアクチベーターの相互作用に依存して発現するβ-ガラクトシダーゼ活性を測定することによりエストロゲン活性を定量する方法が知られている（非特許文献３）。この方法は、人工的なレポーター遺伝子を出芽酵母に組み込み、薬物に応答して発現した酵素活性を測定することにより薬物の活性を定量化するものであるが、活性測定のために酵母細胞を破砕する必要があり、手間と時間がかかるという難点がある。
【０００７】
【特許文献１】国際公開第WO 03/060117号パンフレット
【０００８】
【非特許文献１】J.Biol.Chem., 273, 34970-34975, 1998
【非特許文献２】Environ.Health Perspect, 103 (Suppl.7), 113-122, 1995
【非特許文献３】日薬理誌 (Folia Pharmacol.Jpn.), 118, 203-210, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、細胞を破砕することなく薬物活性の定量化を行うことができるハイスループットな薬物スクリーニング手法を提供することを目的とする。
【００１０】
具体的には、本発明は、レポーター遺伝子を用いて出芽酵母の細胞内部における遺伝子発現の可視化を試みるとともに、細胞チップを開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、まず対象とする薬物に反応してポリリン酸を蓄積する出芽酵母を作製し、マルチウエルプレート中に凍結乾燥処理した状態で保存した。その後、適当量の薬物を混ぜた培地を凍結乾燥酵母に少量加え、短時間培養した後にキャピラリー型のガラス容器に細胞を回収し、MRI（磁気共鳴イメージング）測定を行った。その結果、ポリリン酸蓄積量を指標にして、薬物の活性を定量化することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
本発明の要旨は以下の通りである。
【００１３】
（１）  凍結乾燥酵母を基板上に配置した細胞チップ。
【００１４】
（２）  凍結乾燥酵母を基板上に配置した細胞チップを用いて、所望の生物活性を有する薬物をスクリーニングする方法。
【００１５】
（３）  凍結乾燥酵母を基板上に配置した細胞チップを備えてなる、遺伝子発現モニタリングシステム。
【００１６】
（４）  さらに、少なくとも２本のキャピラリー、ピペット、キャピラリーアダプター、キャピラリーリムーバー、キャピラリーレイヤー、NMR管、及びNMR計測装置を備えてなる、（３）記載の遺伝子発現モニタリングシステム。
【００１７】
（５）  染色体上のポリリン酸の合成及び／又は蓄積に必要な遺伝子のプロモーターが薬物により誘導可能なプロモーターに置換され、かつDNA結合タンパク質のDNA結合ドメインのC末端側に転写因子のリガンド結合ドメインと転写活性化ドメインとを融合した人工的な転写因子をコードするキメラ遺伝子が導入された出芽酵母株であって、前記転写因子のリガンドの存在下で、ポリリン酸を合成するが、前記転写因子のリガンドの不存在下では、ポリリン酸を合成しない前記出芽酵母株。
【００１８】
（６）  凍結乾燥酵母が（５）記載の出芽酵母株である（１）記載の細胞チップ。
【００１９】
（７）  凍結乾燥酵母が（５）記載の出芽酵母株であり、所望の生物活性を有する薬物が転写因子の活性を調節できる物質である（２）記載の方法。
【００２０】
（８）  凍結乾燥酵母が（５）記載の出芽酵母株である（３）又は（４）記載の遺伝子発現モニタリングシステム。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、凍結乾燥酵母の細胞チップ、該細胞チップを用いた薬物スクリーニング法及び該細胞チップを備えてなる遺伝子発現モニタリングシステムが提供された。
【００２２】
また、本発明により、転写因子のリガンドの存在下で、ポリリン酸を合成するが、前記転写因子のリガンドの不存在下では、ポリリン酸を合成しない出芽酵母株が提供された。
【００２３】
本発明により、細胞を破砕する必要がないため、操作が簡便であり、迅速に薬物活性や遺伝子発現を評価できる薬物スクリーニング法や遺伝子発現モニタリングシステムを構築することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
１．出芽酵母株
本発明は、染色体上のポリリン酸の合成及び／又は蓄積に必要な遺伝子のプロモーターが薬物により誘導可能なプロモーターに置換され、かつDNA結合タンパク質のDNA結合ドメインのC末端側に転写因子のリガンド結合ドメインと転写活性化ドメインとを融合した人工的な転写因子をコードするキメラ遺伝子が導入された出芽酵母株であって、前記転写因子のリガンドの存在下で、ポリリン酸を合成するが、前記転写因子のリガンドの不存在下では、ポリリン酸を合成しない前記出芽酵母株を提供する。
【００２６】
宿主としての出芽酵母は、アミノ酸要求性マーカーを持つものであればいかなる出芽酵母株であってもよく、例えば、BY4741株（遺伝子型MATa his3D1 leu2D0 met15D0 ura3D0）などを例示することができる。
【００２７】
本発明の出芽酵母株は、染色体上のポリリン酸の合成及び／又は蓄積に必要な遺伝子のプロモーターが薬物により誘導可能なプロモーターに置換されている。
【００２８】
染色体上のポリリン酸の合成及び／又は蓄積に必要な遺伝子としては、VMA1, VMA2, VMA3, VMA4, VMA5, VMA6, VMA7, VMA8, VMA11, VMA12, VMA13, VMA16, VMA21, VMA22, PHM3, PHM4, SLP1などを例示することができる。
【００２９】
薬物により誘導可能なプロモーターとしては、GAL4結合部位あるいはLexA結合部位をコアプロモーター領域の上流に有するプロモーターなどを例示することができる。これらのプロモーターを用いることにより、エストロゲン、グルココルチコイドなどの薬物の添加に応答して、遺伝子の転写量が上昇する仕組みを新たに酵母に付与することができる。
【００３０】
本明細書において、「薬物」とは、生体に何らかの作用を及ぼしうる物質をいう。
【００３１】
ポリリン酸の合成及び／又は蓄積に必要な遺伝子には、タグをコードするＤＮＡを結合させるとよい。そうすることにより、染色体上の当該遺伝子の発現量の変化をタンパク質としての発現量の変化として調べることができる。タンパク質としての発現量の変化は、例えば、タグとなるペプチド又はタンパク質を特異的に認識する抗体を用いるウェスタンブロット法で調べることができる。
【００３２】
タグとしては、3xHA、3xFLAGなどを利用するとよい。
【００３３】
宿主である出芽酵母の染色体上のポリリン酸の合成及び／又は蓄積に必要な遺伝子のプロモーターを薬物により誘導可能なプロモーターに置換するためには、以下のような操作を行うとよい。
【００３４】
例えば、GAL4結合部位を4コピー有するGAL1プロモーター断片、及び出芽酵母で発現可能なカナマイシン耐性遺伝子断片をそれぞれ通常のPCR法により増幅し、さらにそれらをfusion PCR法を用いて連結する。こうして得られたDNA断片を宿主の出芽酵母株に導入し、部位特異的な相同組換え反応によりプロモーター置換を行う。
【００３５】
本発明の出芽酵母株には、DNA結合タンパク質のDNA結合ドメインのC末端側に転写因子のリガンド結合ドメインと転写活性化ドメインとを融合した人工的な転写因子をコードするキメラ遺伝子が導入されている。
【００３６】
DNA結合タンパク質のDNA結合ドメインとしては、GAL4のDNA結合ドメイン、 LexAのDNA結合ドメインなどを例示することができ、由来の生物種は特に限定されない。これらのDNA結合タンパク質のDNA結合ドメインについては以下の文献に記載されている。
【００３７】
GAL4; Cell, vol.48, 847-853, 1987
LexA; EMBO J. vol.13, 3936-3944, 1994 
【００３８】
転写因子のリガンド結合ドメインとしては、エストロゲンレセプター、グルココルチコイドレセプターのホルモン結合ドメインなどを例示することができ、由来の生物種は特に限定されない。これらの転写因子のリガンド結合ドメインについては以下の文献に記載されている。
【００３９】
エストロゲンレセプター； Gene, vol.131, 129-134, 1993
グルココルチコイドレセプター； Biochemistry, vol.32, 5381-5386, 1993
【００４０】
エストロゲンレセプターのリガンドとしては、エストロゲン（例えば、17β-エストラジオール、エストロン、エストリオール、エキリン、エキレニン、エチニルエストラジオールなど）、エストロゲンレセプターに結合して、エストロゲンと同様の生物学的活性を有する物質（例えば、ジエチルスチルベステロール、17α-エチニルエストラジオール、β-エストラジオール-17-アセテート、p-ノニルフェノール、ビスフェノールＡなど）などを例示することができる。
【００４１】
グルココルチコイドレセプターのリガンドとしては、ステロイドホルモン、デキサメタゾンなどを例示することができる。
【００４２】
転写活性化ドメインとしては、VP16, GAL4, GCN4の転写活性化ドメインなどを例示することができ、由来の生物種は特に限定されない。これらの転写活性化ドメインについては以下の文献に記載されている。
【００４３】
VP16;   Nucleic Acids Research, vol.26, 4487-4496, 1998
Science, vol.251, 87-90, 1991
GAL4;   Cell, vol.48, 847-853, 1987
GCN4;   Mol.Cell.Biol., vol.15, 1220-1233, 1995
【００４４】
DNA結合タンパク質のDNA結合ドメインのC末端側に転写因子のリガンド結合ドメインと転写活性化ドメインとを融合した人工的な転写因子をコードするキメラ遺伝子を出芽酵母に導入するには、該キメラ遺伝子を組み込みんだプラスミドで出芽酵母を形質転換してもよいし、該キメラ遺伝子を出芽酵母のゲノムに組み込んでもよい。
【００４５】
キメラ遺伝子をプラスミドに組み込む場合には、該キメラ遺伝子を構成的なプロモーター（例えば、構成的なADH1プロモーター、PGK1プロモーター、TEF2プロモーター、GPD2プロモーター）の下流に組み込むとよい。キメラ遺伝子を組み込むプラスミドは、LEU2、TRP1, URA3, HIS3などの選択マーカーを保持するものであるとよい。
【００４６】
キメラ遺伝子をプラスミドに組み込むためには、以下のような操作を行うとよい。
【００４７】
構成的なプロモーターと転写因子のDNA結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、転写活性化ドメイン、転写終結のためのターミネーターを、出芽酵母細胞内において自律複製可能な複製起点を有するプラスミドのマルチクローニングサイト内に適当な制限酵素を用いて順次組み込む。
【００４８】
キメラ遺伝子を出芽酵母のゲノムに組み込む場合には、該キメラ遺伝子を構成的なプロモーターの下流に連結し、宿主の有するアミノ酸要求性マーカー遺伝子の位置に組み込むとよい。
【００４９】
キメラ遺伝子を出芽酵母のゲノムに組み込むためには、以下のような操作を行うとよい。
【００５０】
構成的なプロモーターと転写因子のDNA結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、転写活性化ドメイン、転写終結のためのターミネーターから成るDNA断片にアミノ酸要求性マーカー遺伝子の一部を加えたDNA断片を出芽酵母細胞内に導入し、相同組み換え反応によって正しく組み込まれたものをアミノ酸要求性の消失によって選択する。
【００５１】
目的に合致する出芽酵母株（すなわち、転写因子のリガンドの存在下で、ポリリン酸を合成するが、転写因子のリガンドの不存在下では、ポリリン酸を合成しない出芽酵母株）であるか否かは、転写因子のリガンドの存在下又は不存在下で、出芽酵母株を培養し、細胞内におけるポリリン酸量を測定することにより判定することができる。ポリリン酸量は、31P-NMR、31P-MRI（MRイメージング）、抽出／加水分解後の吸収スペクトル法（無機リン酸として測定）などにより測定することができる。本発明の出芽酵母株を作製する際には、ネガティブコントロールを用意して、同様の実験を行うことが好ましい。すなわち、プラスミドを用いて人工的な転写因子をコードするキメラ遺伝子を出芽酵母に導入する場合には、ネガティブコントロールとして、人工的な転写因子をコードするキメラ遺伝子を組み込んでいないプラスミドを出芽酵母に導入したものを用意して、同様の実験を行うとよい。人工的な転写因子をコードするキメラ遺伝子を出芽酵母のゲノムに組み込む場合には、ネガティブコントロールとして、人工的な転写因子をコードするキメラ遺伝子をゲノムに組み込んでいない出芽酵母を用意して、同様の実験を行うとよい。転写因子のリガンドの存在下で培養したときに、人工的な転写因子をコードするキメラ遺伝子を導入した出芽酵母においては、細胞内にポリリン酸の蓄積の上昇が認められるが、ネガティブコントロールである出芽酵母においては、細胞内にポリリン酸の蓄積の上昇が認められなければ、目的に合致した株が作製されたと言える。
【００５２】
本発明の出芽酵母株は、導入されたキメラ遺伝子にコードされる転写因子のリガンドの存在下で、ポリリン酸を合成するが、前記転写因子のリガンドの不存在下では、ポリリン酸を合成しない。本発明の一態様において、本発明の出芽酵母株は、転写因子のリガンドの存在下で、ポリリン酸を合成するが、前記転写因子のリガンドの不存在下では、ポリリン酸を合成しない。また、本発明の別の態様において、本発明の出芽酵母株は、転写因子のリガンドの存在下で、ポリリン酸の合成量が増加するが、前記転写因子のリガンドの不存在下では、ポリリン酸の合成量が増加しない。
【００５３】
本発明の出芽酵母株は、転写因子のリガンドに応答して、レポーター遺伝子であるポリリン酸の合成及び／又は蓄積に必要な遺伝子を活性化することができる。
【００５４】
従って、本発明の出芽酵母株を用いることにより、転写因子の活性を調節できる物質をスクリーニングすることができる。
【００５５】
本発明の出芽酵母株は、継代培養、冷凍保存、凍結乾燥などにより、保存することができる。
【００５６】
本発明の出芽酵母株を継代培養するには、YPD, SD, SCなどの培地中で、25-30℃、150-250rpmの条件下で振とう培養するとよい。
【００５７】
本発明の出芽酵母株を冷凍保存により保存する場合には、15%グリセロールを添加し、-80℃におくとよい。
【００５８】
本発明の出芽酵母株を凍結乾燥により保存する場合には、10%トレハロース、1%グルタミン酸ナトリウムを含む培地に懸濁し、<10-2torr, -40℃から-60℃の条件下で凍結乾燥するとよい。
【００５９】
２．細胞チップ
本発明は、凍結乾燥酵母を基板上に配置した細胞チップを提供する。
【００６０】
酵母は、サッカロミセス酵母、カンジダ酵母、分裂酵母などいかなる種類であってもよく、また、野生型の酵母株であっても、形質転換体であってもよいが、リポーター遺伝子として、ポリリン酸の合成及び／又は蓄積に必要な遺伝子を利用できる酵母株であることが好ましく、例えば、前記の１の項目で説明したような本発明の出芽酵母株、S288C株, W303株, Σ1278b株, SK1株などを例示することができる。リポーター遺伝子として、ポリリン酸の合成及び／又は蓄積に必要な遺伝子を利用できる酵母株を基板上に配置した細胞チップを用いれば、31P-MRI法により、１０〜３０分程度の測定時間で、定量可能なポリリン酸（リポーター）のシグナルを得ることができ、これにより、所望の生物活性を有する薬物（例えば、転写因子の活性を調節できる物質）をスクリーニングすることができる。
【００６１】
酵母は、10%トレハロース、1%グルタミン酸ナトリウムを含む培地に懸濁し、<10-2torr, -40℃から-60℃の条件下で凍結乾燥するとよい。
【００６２】
酵母は、基板上に配置した後に凍結乾燥してもよいし、基板上に配置する前に凍結乾燥してもよい。あるいはまた、基板上に配置する時に凍結乾燥してもよい。
【００６３】
基板としては、ディープウェルプレート（例えば、９６穴ディープウェルプレート）、マルチウエルプレートなどを例示することができる。基板の材質は、いかなるものであってもよいが、例えば、ポリプロピレンなどを例示することができる。基板の大きさ及び厚みは、特に限定されないが、市場への流通の便宜を考慮すると、縦8cm x 横12cm程度の大きさ、4cm程度の厚みが適当である。基板上に配置する酵母のスポット（例えば、ディープウェルプレートの場合はウェル）の大きさは、直径4-6mm程度が適当である。
【００６４】
リポーター遺伝子としてポリリン酸の合成及び／又は蓄積に必要な遺伝子を用い、31P-MRI法により、１０〜３０分程度の測定時間で定量可能なシグナルを得るには、１スポット（例えば、ディープウェルプレートの場合はウェル）中に少なくとも5.1x107個の酵母細胞を基板に配置するとよい。あるいは、細胞数が5.1x107個以下であっても、培養することにより、ポリリン酸測定時の細胞数が5.1x107個以上となればよい。
【００６５】
凍結乾燥酵母を基板上に配置した細胞チップは、4〜25℃、乾燥状態の条件下で保存するとよい。
【００６６】
また、本発明の細胞チップを用いることにより、転写因子の活性を調節できる物質の探索・評価、各種レセプターに結合し、生物活性を示す化合物（薬物）の探索、細胞内シグナル伝達因子に結合し、その活性を制御する化合物（薬物）の探索などができる。
【００６７】
３．転写因子の活性を調節できる物質をスクリーニングする方法
本発明は、凍結乾燥酵母を基板上に配置した細胞チップを用いて、所望の生物活性を有する薬物をスクリーニングする方法を提供する。
【００６８】
凍結乾燥酵母を基板上に配置した細胞チップは前述の通りである。
【００６９】
所望の生物活性を有する薬物は、目的によって異なるが、例えば、転写因子の活性を調節できる物質、各種レセプターに結合し、生物活性を示す化合物（薬物）、細胞内シグナル伝達因子に結合し、その活性を制御する化合物（薬物）などを例示することができる。
【００７０】
本発明の出芽酵母株を凍結乾燥させたものを基板上に配置した細胞チップを用いれば、転写因子の活性を調節できる物質をスクリーニングすることができる。
【００７１】
本発明のスクリーニング法の一態様において、本発明の出芽酵母株に、被験物質を添加した培地又は添加しない培地を添加し、適当な培養条件で培養した後、細胞内のポリリン酸量を測定する。被験物質を添加しない培地で培養した場合と比較して、被験物質を添加した培地で培養した場合に、細胞内にポリリン酸の蓄積の上昇が認められれば、被験物質は転写因子の活性を上昇させることができる物質であると判定できる。逆に、被験物質を添加しない培地で培養した場合と比較して、被験物質を添加した培地で培養した場合に、細胞内にポリリン酸の蓄積の低下が認められれば、被験物質は転写因子の活性を低下させることができる物質であると判定できる。細胞内にポリリン酸の蓄積の上昇も低下も認められなければ、被験物質は転写因子の活性を調節できる物質ではないと判定することができる。
【００７２】
被験物質は、いかなる物質であってもよく、例えば、天然成分、医薬品、食品添加物、殺虫剤、除草剤、化学工業品などの化学物質などを例示することができる。
【００７３】
ポリリン酸量は、31P-NMR、31P-MRI（MRイメージング）、抽出／加水分解後の吸収スペクトル法（無機リン酸として測定）などにより測定することができる。
【００７４】
リポーター遺伝子として、ポリリン酸の合成及び／又は蓄積に必要な遺伝子を利用できる酵母株が凍結乾燥された状態で細胞チップの基板上に配置されている場合、被験物質を添加した培地又は添加しない培地で凍結乾燥酵母株を培養した後、既存のMRI装置を使用して、細胞内のポリリン酸量を測定するには、培養細胞をNMR管に移し替えなければならない。数本のサンプルであれば手作業でも対応できるが、数百本単位のサンプルを処理するためには何らかの工夫が必要である。そこで簡便にハイスループット化を図る方法として、φ8mmのNMR管内にφ0.8mmのキャピラリーガラス管を16本挿入して測定できる方法を新たに考案した。この方法及び装置については後述する。
【００７５】
４．遺伝子発現モニタリングシステム
本発明は、凍結乾燥酵母を基板上に配置した細胞チップを備えてなる、遺伝子発現モニタリングシステムを提供する。
【００７６】
凍結乾燥酵母を基板上に配置した細胞チップは前述の通りである。
【００７７】
本発明の遺伝子発現モニタリングシステムは、さらに、少なくとも２本のキャピラリー、ピペット、キャピラリーアダプター、キャピラリーリムーバー、キャピラリーレイヤー、NMR管、及びNMR計測装置を備えてもよい。
【００７８】
本発明の遺伝子発現モニタリングシステムの一態様について、図面を参照しつつ、以下に説明する。
【００７９】
本発明の遺伝子発現モニタリングシステムを構成する各部材の名称と機能は以下の通りである。
【００８０】
・マイクロピペットまたは8連ピペット（図１（Ａ））：測定する資料を定量的にキャピラリーに採るための装置。ビーエム機器社製、ギルソン社製などの既製品を利用することができる。
・キャピラリーアダプター（図１（Ｂ））：マイクロピペットまたは8連ピペットにキャピラリーを接続するための装置。
・キャピラリー（図１（Ｃ））：測定試料をいれるための試料管。ヒルゲンベルグ社製の既製品を利用することができる。既製品をそのまま使用してもよいし、キャピラリープーラーによって加工し、サンプルの吸引能力を高めた加工品を使用してもよい。
・96ウェル2.2ml  培養槽（図２（Ａ）の左下）：測定試料を保存または培養するための装置。これが細胞チップに相当する。またキャピラリーをキャピラリーアダプターに装着する際のキャピラリー立てとしても使用する。日本ジェネティクス社製の既製品を利用することができる。
・キャピラリーシーリング材（図２（Ａ）の右）：キャピラリーに採った試料がキャピラリーより漏れでないように封入するための装置。フィッシャー社製の既製品を利用することができる。
・キャピラリーリムーバー（図２（Ｂ）の上段左及び下段左）：8連ピペットに接続された複数のキャピラリー（図２（Ｂ）の上段右及び下段右）を同時に抜き取るための装置。
・キャピラリーレイヤー（図３）：試料を封入したキャピラリーを整列させるための装置。
・固定用テープ（図３）：キャピラリーレイヤーで整列させたキャピラリーを固定するためのテープ。既製品の透明荷造りテープを利用することができる。
・平底8mm NMR管（図４（Ａ））：整列させテープで固定されたキャピラリーをまとめるための装置。シゲミ社製などの既製品を利用することができる。
・イメージング装置付帯のNMR計測装置（図４（Ｂ））：作成したサンプルの測定装置。NMR測定に加えて、NMR画像（MRI）を得ることができる。Bruker社の500MHz NMR装置（ナローボア）などの既製品を利用することができる。
【００８１】
上記の各部材同士の構造的あるいは機能的な関連性について説明する。
【００８２】
まず、測定手順を説明する。
【００８３】
９６ウェル2.2.ml  培養槽にて適当な液体培地にて培養した酵母を遠心分離機によって沈澱させる。沈澱上清を除き、沈澱した酵母を再度けん濁する。
【００８４】
ピペットまたは8連ピペットにキャピラリーアダプターを装着し、キャピラリー立てにあるキャピラリーを装着する。
【００８５】
ピペットに装着したキャピラリーの先端をけん濁させた酵母液に漬けて、キャピラリーに吸い上げる（図２（Ａ））。
【００８６】
吸い上げたキャピラリーをキャピラリーシーリング材に3度突き刺して、栓をする。
【００８７】
栓をしたキャピラリーをキャピラリーリムーバーに差込み、リムーバーのグリップをつかみながらピペットマンをキャピラリーの方向と平行に抜くと、キャピラリーとピペットマンが分離される（図２（Ｂ））。
【００８８】
キャピラリーをリムーバー挟み込んだままの状態で、キャピラリーの栓をしていない側の先端をシーリング材に1度差し込んで栓をする。
【００８９】
栓がされたところで、リムーバーのグリップを放し、キャピラリーを順番通りにキャピラリーレイヤーに並べていく。並べたら、油性ペンで斜めに線を引いて順番を認識できるようにし、固定用テープでキャピラリーを4本づつ固定する。余分なテープをきりとる。テープでキャピラリーを固定する代わりに、スプレーのりでキャピラリーを固定してもよい。
【００９０】
4本づつに固定されたキャピラリーをレイヤーより取り出して重ね、16本（横方向4本、縦方向4本）の状態（図３）にし、平底８mmNMR管に入れて測定を行う。
【００９１】
サンプルを封入したNMR管をNMR装置に付属するスピナーに取り付け、NMRの磁石内に導入する。導入されたサンプルの測定はキャピラリーの軸方向を投影する撮像野で行い、1-H測定と31-P測定を同一撮像野で行うことにより両者を比較する。これはポリリン酸のMRI画像だけでキャピラリー位置を判断することができないために、1-Hの画像が必要であるためである（図４）。
【００９２】
次いで、各部材の機能的な関連性を説明する。
【００９３】
キャピラリーを測定に用いている理由は、NMR装置で測定する際に、多数のサンプルを同時に測定できるようにすることである。NMR装置で一般的であるナローボアーサイズのプローブが付帯できる装置でイメージングをする際には、31-P測定と1-H測定の両方を行うことができるサンプルの最大径は8mmであり、その中に多数のサンプルをつめるにはキャピラリーを用いるのがもっとも簡便であると考えられたからである。
【００９４】
多数のサンプルをキャピラリーにつめる作業を軽減させるために、一般的に使用されているマイクロピペットと複数サンプルを同時に扱えることができる96ウェル 2.2ml 培養槽を用いた。
【００９５】
96ウェル 2.2ml 培養槽と8連ピペットのピペット口の間隔は揃っており、多数のサンプルを同時に扱う際に便利である。ピペットには通常、チップと呼ばれるプラスチック製の交換可能なサンプル吸入器を用いるが、キャピラリーを取り付けることはできなかったので、キャピラリーとピペットを連結させるためのアダプターを作成した。
【００９６】
アダプターはチップを利用しており、用いるキャピラリーに応じて安価に製作することができる。
【００９７】
マイクロピペット用のチップを利用する際に用いるチップケースを扱いやすい大きさに加工し、そこにチップを適当な接着剤で固定してキャピラリーアダプターとしている。また、キャピラリーをキャピラリープーラーと呼ばれる加熱引き伸ばし機で加工することにより、キャピラリーとアダプターの密着性が高まり、吸引力を保持することができる。また、空の96ウェル 2.2ml 培養槽にキャピラリーを立てて整列させておくことで、キャピラリーの取り付けを容易にすることができる。
【００９８】
サンプルを吸い上げ、シーリング材でキャピラリーに栓をした後、キャピラリーをアダプターから抜きとるが、一本づつ抜き取る方法でもよいが、操作を簡便にかつ抜き取り時におけるサンプルの順番を間違える操作ミスをなくすために8本同時に抜き取ることができる装置としてキャピラリーリムーバーを作成した。
【００９９】
抜き取ったキャピラリーをNMR管内に入れて測定を行うが、入れた後にサンプルの位置がずれることが無いように、その順番を固定する必要があった。この固定の操作を簡便にするためにキャピラリーレイヤーを作成した。キャピラリーリムーバーに移したキャピラリーをあらかじめ設定した本数分、順番通りに抜き取り（図では4本づつ）、レイヤーに並べていく。並べたところで、油性ペンでキャピラリーの長さ方向に対して斜めに線を引き順番を認識できるようにする。その後荷造り用テープで固定し、不要な部分のテープを切り取る。適当な本数でまとめられたキャピラリーを順番通りにまとめてNMR管に入れサンプルとすることで作業の効率化が図れる。
【０１００】
さらに、本発明の遺伝子発現モニタリングシステムの動作の説明をする。
【０１０１】
(1)ピペットとアダプターの接続
ピペットとアダプター間の接続はチップの着脱と同じ要領で行う。
【０１０２】
(2)ピペットに接続されたアダプターとキャピラリーの接続
９６ウェル容器のウェルごとに一本づつ立てた状態のキャピラリーを同じ方向、等間隔にして、８連ピペットに装着したアダプターのキャピラリー挿入口に入れてキャピラリーを接続する。
【０１０３】
(3)キャピラリーへのサンプルの吸入
装着したキャピラリーの先端部分をけん濁させた酵母溶液につけ、通常のピペット操作をして取り込む。
【０１０４】
(4)キャピラリーシーリング材による栓の動作
サンプルを取り込んだキャピラリーをシーリング材に垂直にとまるまで差込み、その後引き抜くことで栓がなされる。
【０１０５】
(5)キャピラリーリムーバーによるキャピラリーのアダプターからの取り外し
栓をしたキャピラリーをリムーバーのガイドの間を通して最期まで差し込み、リムーバーの開閉するグリップ部位を握りキャピラリーをリムーバーの内面に押し当てて固定する。固定している間にピペットを抜き取るとアダプターからキャピラリーが抜ける。
【０１０６】
(6)アダプターから取り外したキャピラリーのキャピラリーレイヤーへの並べ方
リムーバーに並んでいるキャピラリーを、順番どおりにレイヤーへ並べる。並べたキャピラリーを適当な幅のテープで固定し、並べたキャピラリーの幅で切断し、余分なテープが無い状態にする。あるいは、テープでキャピラリーを固定する代わりに、スプレーのりでキャピラリーを固定する。
固定されたキャピラリーを順番に重ねるようにNMR管に挿入し、測定に用いる。
【０１０７】
(7)NMR計測装置による測定
NMR計測では装置付属のスピナーにNMR管を装着し、磁石内へ導入する。測定は通常のNMR測定手法と同様であるが、ポリリン酸のMRI画像を得る際には測定感度を向上させるたに、サンプル管方向の投影像となるように撮像野を選択する。また1-Hの画像も同時に同視野で撮像しポリリン酸画像との比較に用いる。
【０１０８】
本発明の遺伝子発現システムを用いることにより、転写因子の活性を調節できる物質の探索・評価、各種レセプターに結合し、生物活性を示す化合物（薬物）の探索、細胞内シグナル伝達因子に結合し、その活性を制御する化合物（薬物）の探索などができる。
【０１０９】
本発明の出芽酵母株を凍結乾燥したものを基板上に配置した細胞チップを備えてなる遺伝子発現システムを用いれば、転写因子の活性を調節できる物質をスクリーニングすることができる。
【０１１０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例により限定されることはない。
【０１１１】
［実施例１］
本実施例においては、モデル化合物としてエストロゲンを選び、環境中のエストロゲン様活性物質を容易にスクリーニングし得る出芽酵母株の作製を試みた。レポーター遺伝子としてVMA2（液胞型ATPaseのサブユニットをコードし、ポリリン酸の合成・蓄積に必須の遺伝子）を選び、その上流にGAL1プロモーター（配列番号１）を組み込んだ出芽酵母株を作製し、そこにプラスミドM4499（文献Louvion JF, Havaux-Copf B, Picard D. Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast. Gene. 1993 Sep 6;131(1):129-34.に記載のプラスミドpHCA/GAL4.ER.VP16からApaI-NotI断片を切り出して、pRS315のApaI, NotI部位にサブクローニングしたもの）を形質転換により導入した（図５）。M4499とは、GAL4 DNA結合ドメインのC端側にエストロゲンレセプターのホルモン結合ドメインとウイルス由来の転写活性化ドメインVP16を融合した人工的な転写因子をコードするキメラ遺伝子を構成的なADH1プロモーター（配列番号８）の下流に組み込んだものであり、このプラスミドをもつ酵母株はエストロゲンに応答してレポーター遺伝子であるVMA2（配列番号４・５）を活性化することができる。まずエストロゲン添加時にのみレポーター遺伝子の発現が誘導されることを確認するため、あらかじめVMA2に付加したHAエピトープタグを用いてウエスタンブロッティングを行い、タンパク質としての発現量の変化を調べた。また同時に31P-NMRを用いて細胞内のポリリン酸量についても測定を行った。その結果、エストロゲン添加12時間後において、著量VMA2タンパク質の蓄積ならびにポリリン酸の蓄積が認められたことから、目的に合致した株が得られたものと判断した。
【０１１２】
一方、31P-MRI（MRイメージング）法の感度を調べるため、段階希釈した野生型の酵母細胞をキャピラリーガラス管に詰め、約1, 3, 12, 25, 50, 300分間シグナルの積算を行い、どの程度のS/N比が得られるかを調べたところ、10-30分間程度の測定で定量可能なシグナルを得るためには、少なくともコロニー10個程度の細胞量（〜5.1x107個）が必要であることが明らかとなった。そこで本実施例においては、96穴マルチウエルプレートを用いたシステムを細胞チップのプロトタイプと位置づけ、まずはその完成を目指すこととした。
【０１１３】
種々の薬剤に応答する出芽酵母を入れた96穴マルチウエルプレートを将来商品化するためには、常温で長期間のストックが可能であることが望ましい。そこで酵母は凍結乾燥状態で保存することとし、高い生存率の得られる保存条件について検討を行った。その結果、96穴マルチウエルプレート内に細胞を凍結乾燥状態で保存し、その後培養することが可能となった。しかしながら既存のMRI装置を使用する場合には、薬剤を添加して一定時間培養した後の細胞をφ8mm以下のガラス管に移し替えなければならない。数本のサンプルであれば手作業でも対応できるが、数百本単位のサンプルを処理するためには何らかの工夫が必要である。そこで簡便にハイスループット化を図る方法として、φ8mmのガラス管内にφ0.8mmのキャピラリーガラス管を16本挿入して測定する方法を新たに考案し、実際に定量的なMRI測定が可能であることを示した。
【０１１４】
材料及び方法
＜出芽酵母株の作製＞
BY4742株（遺伝子型MATalpha his3 leu2 lys2 ura3）をEuroscarfより入手した。この株に対して、プラスミドpFA6a-His3MX6-PGAL1-3HA（文献Longtine MS, McKenzie A 3rd, Demarini DJ, Shah NG, Wach A, Brachat A, Philippsen P, Pringle JR. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 1998 Jul;14(10):953-61.に記載）を鋳型として、TK4985 (CACCCCGTTGAAAGAAAAGGATAAGAGATAAAGGACTAAAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC) （配列番号２１）及びTK4986 (TCTTATTTATGGCAAACAACTCCTTATCAGACAAAACCATGCACTGAGCAGCGTAATCTG) （配列番号２２）によりPCR増幅して得られたDNA断片を形質転換することにより、K79株を得た。この株にプラスミドM4499（下記に記載）またはpRS315（文献Sikorski RS, Hieter P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 1989 May;122(1):19-27.に記載）を形質転換して、それぞれyTK6231株、yTK6235株を得た。
強度の異なる８種類のプロモーター支配下にVMA2遺伝子(配列番号４・５), PHM4遺伝子(配列番号６・７),を連結した酵母株の作製は以下のように行った。プラスミドpFA6a-His3MX6（文献Longtine MS, McKenzie A 3rd, Demarini DJ, Shah NG, Wach A, Brachat A, Philippsen P, Pringle JR. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 1998 Jul;14(10):953-61.に記載）を鋳型として、TK4981 (CACCCCGTTGAAAGAAAAGGATAAGAGATAAAGGACTAAACGGATCCCCGGGTTAATTAA) （配列番号２３）及びTK3756 (GTCGACGGATCCCCGGGAATTCATGCAGGTTAACCTGGCTTA) （配列番号２４）によりPCR増幅して得られたDNA断片と、酵母ゲノムからTK3757 (GAATTCCCGGGGATCCGTCGACGATTTCACGAAAACACCTTG) （配列番号２５）及びTK5275 (TCTTATTTATGGCAAACAACTCCTTATCAGACAAAACCATCTTTGGAATGGTCGGTTATT) （配列番号２６）によりPCR増幅して得られたDNA断片をfusion PCR法により融合し、BY4742株に対して形質転換することにより、K190株（RPS5(-593bp)プロモーター（配列番号９）支配下にVMA2遺伝子を有する）を得た。以下プライマーの種類のみを変更することにより、K191株（CLN2(-543bp)プロモーター支配下にVMA2遺伝子を有する）、K194株（RPS5(-87bp)プロモーター（配列番号１０）支配下にVMA2遺伝子を有する）、K197株（CLN2(-100bp)プロモーター（配列番号１２）支配下にVMA2遺伝子を有する）、K198株（RPS5-UAS90bp+CLN2(-100bp)プロモーター（配列番号１３）支配下にVMA2遺伝子を有する）、K201株（RPS5-UAS90bp+RPS5(-87bp)プロモーター（配列番号１１）支配下にVMA2遺伝子を有する）、K16株（RPS5(-593bp)プロモーター支配下にPHM4遺伝子を有する）、K17株（RPS5(-87bp)プロモーター支配下にPHM4遺伝子を有する）、K20株（RPS5-UAS90bp+RPS5(-87bp)プロモーター支配下にPHM4遺伝子を有する）、K23株（CLN2(-100bp)プロモーター支配下にPHM4遺伝子を有する）、K26株（RPS5-UAS90bp+CLN2(-100bp)プロモーター支配下にPHM4遺伝子を有する）、K29株（CLN2(-543bp)プロモーター（配列番号１４）支配下にPHM4遺伝子を有する）を得た。、K190株（RPS5(-593bp)プロモーター支配下にVMA2遺伝子を有する）を得た。
用いたプライマーの塩基配列は以下の通りである。
K191株：
pFA6a-His3MX6に対して、TK4981 (上記記載)及びTK3756 (上記記載)を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3768 (GAATTCCCGGGGATCCGTCGACGCGAACTAAAGCAACTATAC) （配列番号２７）及びTK5276 (TCTTATTTATGGCAAACAACTCCTTATCAGACAAAACCATTGTCTGTCGTTAAATTTAAT) （配列番号２８）を使用。
K194株：
pFA6a-His3MX6に対して、TK4981 (上記記載)及びTK3756 (上記記載)を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3759 (GAATTCCCGGGGATCCGTCGACCTAAAATATTTTGTACTTTT) （配列番号２９）及びTK5275 (上記記載)を使用。
K197株：
pFA6a-His3MX6に対して、TK4981 (上記記載)及びTK3756 (上記記載)を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3763 (GAATTCCCGGGGATCCGTCGACTAACTTACTATCTCTTTCAT) （配列番号３０）及びTK5276 (上記記載)を使用。
K198株：この場合は以下の三断片を融合して使用した。
pFA6a-His3MX6に対して、TK4981 (上記記載)及びTK3756 (上記記載)を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3760 (GAATTCCCGGGGATCCGTCGACTATACAACAACACCCATATA) （配列番号３１）及びTK3767 (ATGAAAGAGATAGTAAGTTACTCCTTCCCCGTAGCAGGGC) （配列番号３２）を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3766 (GCCCTGCTACGGGGAAGGAGTAACTTACTATCTCTTTCAT) （配列番号３３）及びTK5276 (上記記載)を使用。
K201株：この場合は以下の三断片を融合して使用した。
pFA6a-His3MX6に対して、TK4981 (上記記載)及びTK3756 (上記記載)を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3760 (上記記載)及びTK3762(AAAAGTACAAAATATTTTAGCTCCTTCCCCGTAGCAGGGC) （配列番号３４）を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3761 (GCCCTGCTACGGGGAAGGAGCTAAAATATTTTGTACTTTT) （配列番号３５）及びTK5275 (上記記載)を使用。
K16株：
pFA6a-His3MX6に対して、TK3755 (TTAAGAGTCCATATTTCCATAACCAGCGACTTGCATACACCGGATCCCCGGGTTAATTAA) （配列番号３６）及びTK3756 (上記記載)を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3757 (上記記載)及びTK3758(TTTTCCCAGGTGTTCTTTGTAATAATGGTGCTGAAGACATCTTTGGAATGGTCGGTTATT) （配列番号３７）を使用。
K17株：
pFA6a-His3MX6に対して、TK3755 (上記記載)及びTK3756 (上記記載)を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3759 (上記記載)及びTK3758(上記記載)を使用。
K20株：この場合は以下の三断片を融合して使用した。
pFA6a-His3MX6に対して、TK3755 (上記記載)及びTK3756 (上記記載)を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3760 (上記記載)及びTK3762(上記記載)を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3761 (上記記載)及びTK3758(上記記載)を使用。
K23株：
pFA6a-His3MX6に対して、TK3755 (上記記載)及びTK3764 (GTCGACGGATCCCCGGGAATTCATGCAGGTTAACCTGGCTTA) （配列番号３８）を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3763 (上記記載)及びTK3765(TTTTCCCAGGTGTTCTTTGTAATAATGGTGCTGAAGACATTGTCTGTCGTTAAATTTAAT) （配列番号３９）を使用。
K26株：
pFA6a-His3MX6に対して、TK3755 (上記記載)及びTK3764 (上記記載)を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3760 (GAATTCCCGGGGATCCGTCGACTATACAACAACACCCATATA) （配列番号４０）及びTK3767(上記記載)を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3766 (上記記載)及びTK3765(上記記載)を使用。
K29株：
pFA6a-His3MX6に対して、TK3755 (上記記載)及びTK3764 (上記記載)を使用。
酵母ゲノムに対して、TK3768 (上記記載)及びTK3765(上記記載)を使用。
＜プラスミドの作成方法＞
プラスミドpHCA/GAL4.ER.VP16（文献Louvion JF, Havaux-Copf B, Picard D. Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast. Gene. 1993 Sep 6;131(1):129-34.に記載）のApaI-NotI断片を切り出し、pRS315のApaI, NotI部位にサブクローニングすることによりプラスミドM4499を得た。
＜培地の作成＞
YPD, SD培地等の作成は、実験書（Methods in Yeast Genetics; A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 1997 Edition, edited by Alison Adams, Daniel E. Gottschling, Chris A. Kaiser, Tim Stearns, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-508-0）145-157頁記載の定法に従って行った。
＜酵母細胞への形質転換＞
酢酸リチウム法による形質転換については、実験書（Methods in Yeast Genetics; A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 1997 Edition, edited by Alison Adams, Daniel E. Gottschling, Chris A. Kaiser, Tim Stearns, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-508-0）103頁記載の定法に従って行った。
＜酵母細胞の培養方法とエストラジオール添加によるポリリン酸合成の誘導＞
形質転換によって得られた酵母株を適当な液体培地で30℃、12時間振振培養しエストラジオールを適当量（標準量として最終濃度200nM）加えてポリリン酸の蓄積を誘導した。
＜凍結乾燥酵母の作成方法＞
適当な培地で培養した出芽酵母細胞を、1%グルタミン酸ナトリウムに10%トレハロースもしくは10%スキムミルクを添加したバッファーに懸濁し、ドライアイスで氷冷したエタノール中もしくは液体窒素中で凍結した。その後-40℃、10-2torr以下で凍結乾燥を行った。
＜乾燥凍結酵母を用いたイメージング実験（１）図７について＞
前述の要領で凍結乾燥酵母を作成し、96穴プレートでSD培地で約3日間培養したのちエストラジオールを最終濃度200nM添加し、16時間半培養した。培養後、それぞれのウェルから全量を1.5mlエッペンに移し、3000r.p.mで集菌し、上清を除いた後残り培養液に懸濁し、1.5mmのキャピラリーに詰め替えてMRI測定を行った。MRIの測定手法はケミカルシフト選択的イメージング法でポリリンを選択して画像を得た。繰り返し時間は0.4秒で、積算回数は3500回、撮像野は10mmx10mm、撮像画素は32x12、で、測定後に32x16に0フィリングした。ポリリン酸選択画像と比較するために同じ画素数で撮像した1H-MRI画像を左に示す。
＜乾燥凍結酵母を用いたイメージング実験（２）図８について＞
凍結乾燥させたyTK6231, 6235をマイクロタイタープレートでエストラジオール存在下で培養し、エストラジオール添加より24時間後に直径の異なるキャピラリーにつめMRI測定を行った。測定条件は繰り返し時間は0.5秒で、積算回数は3500回、撮像野は10mmx10mm、撮像画素は32x12、で、測定後に32x16に0フィリングした。
【０１１５】
結果
エストラジオール添加によるポリリン酸合成の誘導（yTK6231株）の結果を図６に示す。図６のIは、あらかじめVMA2に付加したHAエピトープタグを用いてウエスタンブロッティングを行い、タンパク質としての発現量の変化を調べた結果を示す。エストラジオール添加12時間後において、著量VMA2タンパク質の蓄積が認められた。図６のIIは、31P-NMRを用いて細胞内のポリリン酸量についても測定を行った結果を示す。エストロゲン添加12時間後において、ポリリン酸の蓄積が認められた。以上のことから、目的に合致した株が得られたものと判断した。
凍結乾燥酵母を用いたイメージング実験(1)の結果を図７Aに示す。凍結乾燥酵母（野生型WT）もしくはyTK6231, 6235をエストラジオール存在下、非存在下で培養し、それをキャピラリーに詰めて、1H-MRI, 31P-MRIで解析したもの。B：凍結乾燥処理をしていない酵母（野生型WT、エストラジオール非添加で培養）を記載の細胞数でキャピラリーに詰め、記載の測定時間、1H-MRI, 31P-MRIで解析したもの。現在使用している器械の感度では10個程度のコロニーに相当する細胞数が必要であることが分かる。
凍結乾燥酵母を用いたイメージング実験（２）の結果を図８に示す。（1）では試験管による培養を行ったが、ここではディープウエルプレートを使用して培養を行った。キャピラリーの直径がシグナル／ノイズ比に及ぼす影響について調べるため、yTK6231, 6235を凍結乾燥後、記載の条件下（エストラジオール存在下）で培養し、種々の直径（0.8mm, 1.2mm, 1.5mm）をもつキャピラリーにつめ、1H-MRI, 31P-MRIで解析した。yTK6231株においてのみポリリン酸の蓄積が見られ、0.8mmのキャピラリーを用いても十分測定可能であることが明らかとなった。
凍結乾燥酵母の作製条件を検討した結果を以下の表に示す。
【０１１６】
【表１】
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凍結方法を液体窒素ではなく、ドライアイスに変更することで、生存率は1〜10%になった。生存率についてはこの程度で十分と思われる。
マルチキャピラリー管を用いたハイスループット型のMRI測定について、結果を図9に示す。強度の異なる8種類のプロモーター支配下にVMA2, PHM4遺伝子（いずれもポリリン酸の合成蓄積に必須）を連結した酵母株を作製し、ディープウエルプレートで一定時間培養後、ガラスキャピラリー管（内径0.8mm）に移送し、1H-MRI測定(図9-a, c)及び31P-MRI測定(図9-d)を行った。コントロールとして、水(最下段) についても同様の測定を行った。dと比較するために、cにaの低解像度像を示した。Bに定量結果を示したが、いずれのレポーター遺伝子を用いた場合にも、ノザンブロッティングにより測定したプロモーター活性とポリリン酸シグナル値との間に非常に良い相関が見られた。
【０１１７】
まとめ
本研究では、一般的なNMR機器でも測定可能な遺伝子発現モニタリングシステムの構築を目指した。その結果、エストロゲンに反応してポリリン酸を蓄積する出芽酵母株の作製、この酵母株に適した凍結乾燥条件（保存条件）の決定、マルチウエルプレートでの培養及びそこからNMR測定デバイスへのハイスループットな移送などに成功した。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明により、細胞を破砕することなく薬物活性の定量化を行うことができるハイスループットな薬物スクリーニング手法及びツールが提供された。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】本発明の遺伝子発現モニタリングシステムの一態様における、システムを構成するマイクロピペットまたは8連ピペット（（Ａ））、キャピラリーアダプター（（Ｂ））及びキャピラリー（（Ｃ））を示す。
【図２】（Ａ）：本発明の遺伝子発現モニタリングシステムの一態様における、システムを構成するキャピラリーアダプター及びキャピラリーを装着したマイクロピペットまたは8連ピペット、96ウェル2.2ml  培養槽並びにキャピラリーシーリング材を示す。（Ｂ）：本発明の遺伝子発現モニタリングシステムの一態様における、システムを構成するキャピラリーアダプター及びキャピラリーを装着したマイクロピペットまたは8連ピペット及びキャピラリーリムーバーを示す。
【図３】本発明の遺伝子発現モニタリングシステムの一態様における、システムを構成するキャピラリー及びキャピラリーレイヤーを示す。
【図４】本発明の遺伝子発現モニタリングシステムの一態様における、システムを構成する平底8mm NMR管（キャピラリー挿入済み）（（Ａ））及びNMR計測装置（イメージング装置付帯）（（Ｂ））を示す。
【図５】本発明の出芽酵母yTK6231株の模式図である。MATalpha his3 leu2 lys2 ura3 pGAL1-3HA-VMA2::His3MX6は、この酵母株の遺伝子型である。
【図６】エストラジオール添加によるVMA2遺伝子の発現誘導とそれに伴うポリリン酸合成の誘導（yTK6231株）の結果を示す。
【図７】凍結乾燥酵母を用いたイメージング実験（１）の結果（MRIによる遺伝子発現の可視化）を示す（ただしBで用いた酵母については凍結乾燥処理をしていない）。A.31P-MRIによるポリリン酸誘導の確認。凍結乾燥処理をしたyTK6231株(#2)とyTK6235株(#3)を200nM estradiol存在下で12時間培養し、内径1.5mmのキャピラリー管に細胞を充てんして、1H-MRI測定(a)及び31P-MRI測定(b)を行った。コントロールとして、水(#1)、野生株(+estradiol, #4)、野生株(-estradiol, #5) についても同様の測定を行った。B.有意なポリリン酸シグナルを検出するために必要な細胞量の決定。凍結乾燥処理をしていない野生株を培養し、5.1x105(#2), 1.5x106 (#3), 5.1x106 (#4), 1.5x107 (#5), 5.1x107 (#6), 1.5x108 (#7), 5.1x108 (#8)個の細胞になるように内径1.2mmのキャピラリー管に充てんして、 1H-MRI測定(g)及び31P-MRI測定(a〜f)を行った。31P-MRI測定については、測定時間を1分36秒(a), 3分12秒(b), 12分48秒(c), 25分36秒(d), 51分12秒(e), 6時間(f)に設定し、各々の細胞数に対して必要な測定時間の検討を行った（この図ではシグナル強度が同程度になるように解像度を調節している）。コントロールとして、水(#1)を測定した。
【図８】凍結乾燥酵母を用いたイメージング実験（２）の結果（キャピラリー管の直径がシグナル／ノイズ比に及ぼす影響）を図８に示す。凍結乾燥処理をしたyTK6231株(b, 青枠)とyTK6235株(b, 白枠)を200nM estradiol存在下で12時間培養し、内径0.8mm, 1.2mm, 1.5mmのキャピラリー管に細胞を充てんして、1H-MRI測定(a)及び31P-MRI測定(d)を行った。コントロールとして、水(b, 枠外)についても同様の測定を行った。 dと比較するために、cにaの低解像度像を示した。
【図９】強度の異なるプロモーターを用いて得られたポリリン酸の合成の結果（マルチキャピラリー管を用いたハイスループット型MRI測定）を示す。この図において、#1はプロモーター置換を行わなかった場合（それぞれVMA2, PHM4自身のプロモーターを有する）、#2はRPS5(-593bp)プロモーターを有する場合、#3はRPS5(-87bp)プロモーターを有する場合、#4はRPS5-UAS90bp+RPS5(-87bp)プロモーターを有する場合、#5はCLN2(-100bp)プロモーターを有する場合、#6はRPS5-UAS90bp+CLN2(-100bp)プロモーターを有する場合、#7はCLN2(-543bp)プロモーターを有する場合、#8はレポーター遺伝子を持たない場合（それぞれVMA2, PHM4遺伝子を欠失している）である。A.強度の異なる8種類のプロモーター支配下にVMA2, PHM4遺伝子（いずれもポリリン酸の合成蓄積に必須）を連結した酵母株を作製し、マルチウエルプレートで一定時間培養後、ガラスキャピラリー管（内径0.8mm）に移送し、1H-MRI測定(a, c)及び31P-MRI測定(d)を行った。コントロールとして、水(最下段) についても同様の測定を行った。dと比較するために、cにaの低解像度像を示した。B.A-dの定量結果。いずれのレポーター遺伝子を用いた場合にも、ノザンブロッティングにより測定したプロモーター活性とポリリン酸シグナル値との間に非常に良い相関が見られた。
【配列表フリーテキスト】
【０１２０】
＜配列番号１＞
配列番号１は、GAL1プロモーター（出芽酵母由来）のDNA配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、3xHA（インフルエンザウイルス由来）のDNA配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、3xHAのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、VMA2（出芽酵母由来）のDNA配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、VMA2がコードするアミノ酸配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、PHM4（出芽酵母由来）のDNA配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、PHM4がコードするアミノ酸配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、ADH1プロモーター（出芽酵母由来）のDNA配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、RPS5(-593bp)プロモーター（出芽酵母由来）のDNA配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、RPS5(-87bp)プロモーター（出芽酵母由来）のDNA配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、RPS5-UAS90bp+RPS5(-87bp)プロモーター（出芽酵母由来）のDNA配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、CLN2(-100bp)プロモーター（出芽酵母由来）のDNA配列を示す。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、RPS5-UAS90bp+CLN2(-100bp)プロモーター（出芽酵母由来）のDNA配列を示す。
＜配列番号１４＞
配列番号１４は、CLN2(-543bp)プロモーター（出芽酵母由来）のDNA配列を示す。
＜配列番号１５＞
配列番号１５は、GAL4のDNA結合ドメイン（出芽酵母由来）のDNA配列を示す。
＜配列番号１６＞
配列番号１６は、GAL4のDNA結合ドメインのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１７＞
配列番号１７は、エストロゲンレセプターのホルモン結合ドメイン（ヒト由来）のDNA配列を示す。
＜配列番号１８＞
配列番号１８は、エストロゲンレセプターのホルモン結合ドメインのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１９＞
配列番号１９は、VP16の転写活性化ドメイン（単純ヘルペスウイルス由来）のDNA配列を示す。
＜配列番号２０＞
配列番号２０は、VP16の転写活性化ドメインのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号２１＞
配列番号２１は、プライマー（TK4985）のDNA配列を示す。
＜配列番号２２＞
配列番号２２は、プライマー（TK4986）のDNA配列を示す。
＜配列番号２３＞
配列番号２３は、プライマー（TK4981）のDNA配列を示す。
＜配列番号２４＞
配列番号２４は、プライマー（TK3756）のDNA配列を示す。
＜配列番号２５＞
配列番号２５は、プライマー（TK3757）のDNA配列を示す。
＜配列番号２６＞
配列番号２６は、プライマー（TK5275）のDNA配列を示す。
＜配列番号２７＞
配列番号２７は、プライマー（TK3768）のDNA配列を示す。
＜配列番号２８＞
配列番号２８は、プライマー（TK5276）のDNA配列を示す。
＜配列番号２９＞
配列番号２９は、プライマー（TK3759）のDNA配列を示す。
＜配列番号３０＞
配列番号３０は、プライマー（TK3763）のDNA配列を示す。
＜配列番号３１＞
配列番号３１は、プライマー（TK3760）のDNA配列を示す。
＜配列番号３２＞
配列番号３２は、プライマー（TK3767）のDNA配列を示す。
＜配列番号３３＞
配列番号３３は、プライマー（TK3766）のDNA配列を示す。
＜配列番号３４＞
配列番号３４は、プライマー（TK3762）のDNA配列を示す。
＜配列番号３５＞
配列番号３５は、プライマー（TK3761）のDNA配列を示す。
＜配列番号３６＞
配列番号３６は、プライマー（TK3755）のDNA配列を示す。
＜配列番号３７＞
配列番号３７は、プライマー（TK3758）のDNA配列を示す。
＜配列番号３８＞
配列番号３８は、プライマー（TK3764）のDNA配列を示す。
＜配列番号３９＞
配列番号３９は、プライマー（TK3765）のDNA配列を示す。
＜配列番号４０＞
配列番号４０は、プライマー（TK3760）のDNA配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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