(57)【要約】【課題】  質量分析において、タンパク質又はペプチドのジスルフィド結合の数及び位置の決定を迅速且つ容易に行うことができる方法を提供する。【解決手段】  MSの２乗以上が可能なLI質量分析装置により、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質を用いてタンパク質又はペプチドのMSを行い、ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンAとジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンBとを得て；イオンAとイオンBとの質量差を算出し、算出された質量差からジスルフィド結合の数を推定し；イオンAとイオンBとをそれぞれプリカーサーイオンとして選択してMSnを行い、イオンAからプロダクトイオンaを、イオンBからプロダクトイオンbを得て；プロダクトイオンaからアミノ酸配列情報を得て；プロダクトイオンaとプロダクトイオンbとの質量数差を求めることによって、ジスルフィド結合の位置を推定する、タンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。【選択図】図３
2006292603.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）ＭＳの２乗以上が可能なＬＩ（レーザーイオン化）質量分析装置により、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質を用いてタンパク質又はペプチドのＭＳを行い、ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡとジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンＢとを得て、
（ii）前記ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡと、前記ジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンＢとの質量差を算出し、算出された質量差からジスルフィド結合の数を推定し、
（iii）前記ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡと、前記ジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンＢとをそれぞれプリカーサーイオンとして選択し、選択されたプリカーサーイオンについてそれぞれＭＳｎを行い、前記分子量関連イオンＡから複数のプロダクトイオンａを、前記分子量関連イオンＢから複数のプロダクトイオンｂを得て、
（iv）前記複数のプロダクトイオンａから前記タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列情報を得て、
（v）前記複数のプロダクトイオンａの各々の質量数と、前記各々のプロダクトイオンａと同じ配列であり且つ同じ系列のプロダクトイオンｂの質量数との差を求めることによって、前記タンパク質又はペプチドにおける前記ジスルフィド結合の位置を推定する、タンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【請求項２】
前記ＬＩ質量分析装置が、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化型）質量分析装置である、請求項１に記載のタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【請求項３】
前記ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質が、ジスルフィド結合に対して還元性を示すマトリックスである、請求項２に記載のタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【請求項４】
（i）ＭＳの２乗以上が可能なＭＡＬＤＩ質量分析装置により、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質、及び、前記物質が示す還元性より強い還元性を示さないマトリックスを用いてタンパク質又はペプチドのＭＳを行い、ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡとジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンＢとを得て、
（ii）前記ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡと、前記ジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンＢとの質量差を算出し、算出された質量差からジスルフィド結合の数を推定し、
（iii）前記ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡと、前記ジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンＢとをそれぞれプリカーサーイオンとして選択し、選択されたプリカーサーイオンについてそれぞれＭＳｎを行い、前記分子量関連イオンＡから複数のプロダクトイオンａを、前記分子量関連イオンＢから複数のプロダクトイオンｂを得て、
（iv）前記複数のプロダクトイオンａから前記タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列情報を得て、
（v）前記複数のプロダクトイオンａの各々の質量数と、前記各々のプロダクトイオンａと同じ配列であり且つ同じ系列のプロダクトイオンｂの質量数との差を求めることによって、前記タンパク質又はペプチドにおける前記ジスルフィド結合の位置を推定する、タンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【請求項５】
前記ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質が、ジスルフィド結合に対して還元性を示すマトリックスである、請求項４に記載のタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【請求項６】
前記ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質が、ジアミノナフタレンの位置異性体から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【請求項７】
前記ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質が、１，５−ジアミノナフタレン、２，３−ジアミノナフタレン、及び１，８−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【請求項８】
前記ＭＡＬＤＩ質量分析装置が、ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ飛行時間型）質量分析装置である、請求項２〜７のいずれか１項に記載のタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【請求項９】
前記タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列情報を、de novo Sequencingの自動解析を行うことによって得る、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテオミクスに関し、より詳しくは、ＭＳの２乗以上の分析が可能な質量分析装置を用いたタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法（すなわちタンパク質又はペプチド中のジスルフィド結合の数及び位置を決定する方法）に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ジスルフィド結合を持つタンパク質又はペプチドについて、質量分析装置を用いたジスルフィドマッピングを行う場合、質量分析装置による計測を行う前に前処理が必要であった。
【０００３】
例えば、従来のジスルフィドマッピング法の例として、以下のような手順を踏む手法が挙げられる。
まず、精製されたタンパク質又はペプチドをトリプシンなどを用いてジスルフィド結合が維持される条件下(例えばpH 7)で酵素消化する。続いて、得られた消化断片を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分離し、質量分析計で計測する。
【０００４】
計測結果から、システインを含む2つのペプチドの質量を合計した理論値、すなわち2つのペプチドがジスルフィド結合で架橋されていると想定して算出した理論値、と一致するペプチド断片を確認する。
【０００５】
これらの確認されたペプチド断片を、ジスルフィド結合の交換が起こらないよう低pH下(例えばpH 4.5〜5.5)で、鎖間ジスルフィド結合からシステイン残基を遊離させ、遊離したシステイン残基に対して、4-vinilpyridine(4-VP)を用いてS-ピリジルエチル化を行い、S-ピリジルエチル化ペプチドを得る。
【０００６】
その後、S-ピリジルエチル化ペプチドを適当な条件下でジチオスレイトール(DTT)などを用いて鎖内ジスルフィド結合を還元し、還元部位をS-カルボメチル化などにより保護し、還元アルキル化ペプチド断片を得る。
【０００７】
得られた還元アルキル化ペプチド断片を、質量分析装置で計測する。質量分析により得られたアミノ酸配列情報から、ペプチド断片のシステイン残基の位置を確認し、ジスルフィド結合を特定する。
【０００８】
また、従来のジスルフィドマッピング法の他の例として、以下のような手法もある。    タンパク質を、過剰の2-ニトロ-5-シアノ安息香酸(NTCB)を用いて室温でアルカリ条件下15分間反応させることによりシアニル化し、1 M水酸化アンモニウムを加えて1時間インキュベートすることによりシステイン部位で切断する。
【０００９】
その後、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)のような還元剤を5〜10倍量加えて、37℃、30分で還元反応を行う。得られた還元断片を質量分析装置で計測し、これらの断片のアミノ酸配列情報を得ると共に、遊離のチオール基を持つシステイン残基を同定する。
【００１０】
一方で、タンパク質を、まずTCEPを用いて37℃、30分間で還元し、還元されたタンパク質を、NTCBを用いてシステイン部位で切断する。得られた断片を質量分析装置で計測し、これらの断片のアミノ酸配列情報を得ると共に、全てのシステイン残基を同定する。
【００１１】
シアニル化したタンパク質を断片化し、その後還元した前者の分析結果と、シアニル化していないタンパク質を還元し、その後断片化した後者の分析結果とを比較することで、ジスルフィド結合の数と位置を決定する。
【００１２】
このように従来から行われてきたジスルフィドマッピング法に関しては、例えば、Wu, J., Gage, D.A., Watson, J.T., Anal.Biochem., vol. 235, p. 161-174 (1996)、Wu, J., Watson, J.T., Anal. Biochem., vol. 258, p. 268-276 (1998)、及び、Christoph Spiess, H. Peter Happersberger, Michael O. Glocker, Eberhard Spiess, Karsten Rippe, and Michael Ehrmann., J.Biol.Chem., vol. 272, p. 22125-22133 (1997)に詳細に記載されている。
【００１３】
【非特許文献１】ウー・Ｊ（Wu, J.）、ゲイジ・Ｄ・Ａ（Gage, D.A.）、及びワトソン・Ｊ・Ｔ（Watson, J.T.）、「アナリティカル・バイオケミストリー（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY）」、１９９６年、第２３５巻、ｐ．１６１−１７４
【非特許文献２】ウー・Ｊ（Wu, J.）、ゲイジ・Ｄ・Ａ（Gage, D.A.）、及びワトソン・Ｊ・Ｔ（Watson, J.T.）、「アナリティカル・バイオケミストリー（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY）」、１９９８年、第２５８巻、ｐ．２６８−２７６
【非特許文献３】クリストフ・スピース（Christoph Spiess）、Ｈ・ピーター・ハッパスベーガー（H. Peter Happersberger）・ミヒャエル・Ｏ・グロッカー（Michael O. Glocker）、エベラール・スピース（Eberhard Spiess）、カーステン・リペ（Karsten Rippe）、及びミヒャエル・アーマン（Michael Ehrmann）、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）」、１９９７年、第２７２巻、ｐ．２２１２５−２２１３３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上に述べた従来のジスルフィドマッピング法は、以下の点で不都合である。
・前処理に手間と時間がかかる。
・タンパク質について、還元前及び還元後（すなわちジスルフィド結合が有る場合及び無い場合）の分析結果を比較するため、2種類の試料を用意する必要がある。
・試料分子の他の部位に影響を与えないように、ジスルフィド結合のみを還元し保護することが要求されるため、pHなどの反応条件の制約が厳しい。
・前処理において用いられる過剰の試薬が除去されきれないため、残留試薬の質量分析に対する影響が危惧される。
【００１５】
そこで本発明の目的は、質量分析において、タンパク質又はペプチドのジスルフィド結合の数及び位置の決定を迅速且つ容易に行うことができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、ＬＩ質量分析装置により、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質を用いることによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
本発明は、以下の＜１＞〜＜８＞の発明を含む。
＜１＞
（i）ＭＳの２乗以上が可能なＬＩ（レーザーイオン化）質量分析装置により、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質を用いてタンパク質又はペプチドのＭＳを行い、ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡとジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンＢとを得て、
（ii）前記ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡと、前記ジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンＢとの質量差を算出し、算出された質量差からジスルフィド結合の数を推定し、
（iii）前記ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡと、前記ジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンＢとをそれぞれプリカーサーイオンとして選択し、選択されたプリカーサーイオンについてそれぞれＭＳｎを行い、前記分子量関連イオンＡから複数のプロダクトイオンａを、前記分子量関連イオンＢから複数のプロダクトイオンｂを得て、
（iv）前記複数のプロダクトイオンａから前記タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列情報を得て、
（v）前記複数のプロダクトイオンａの各々の質量数と、前記各々のプロダクトイオンａと同じ配列であり且つ同じ系列のプロダクトイオンｂの質量数との差を求めることによって、前記タンパク質又はペプチドにおける前記ジスルフィド結合の位置を推定する、タンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【００１８】
前記＜１＞においては、分子量関連イオンＡは、還元性を示す物質によって還元されたことによって生成し、分子量関連イオンＢは、還元性を示す物質によって還元されなかったことによって生成する。
【００１９】
＜２＞
前記ＬＩ質量分析装置が、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化型）質量分析装置である、＜１＞に記載のタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【００２０】
＜３＞
前記ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質が、ジスルフィド結合に対して還元性を示すマトリックスである、＜２＞に記載のタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【００２１】
＜４＞
（i）ＭＳの２乗以上が可能なＭＡＬＤＩ質量分析装置により、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質、及び、前記物質が示す還元性より強い還元性を示さないマトリックスを用いてタンパク質又はペプチドのＭＳを行い、ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡとジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンＢとを得て、
（ii）前記ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡと、前記ジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンＢとの質量差を算出し、算出された質量差からジスルフィド結合の数を推定し、
（iii）前記ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡと、前記ジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンＢとをそれぞれプリカーサーイオンとして選択し、選択されたプリカーサーイオンについてそれぞれＭＳｎを行い、前記分子量関連イオンＡから複数のプロダクトイオンａを、前記分子量関連イオンＢから複数のプロダクトイオンｂを得て、
（iv）前記複数のプロダクトイオンａから前記タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列情報を得て、
（v）前記複数のプロダクトイオンａの各々の質量数と、前記各々のプロダクトイオンａと同じ配列であり且つ同じ系列のプロダクトイオンｂの質量数との差を求めることによって、前記タンパク質又はペプチドにおける前記ジスルフィド結合の位置を推定する、タンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【００２２】
上記＜４＞においては、分子量関連イオンＡは、還元性を示す物質によって還元されたことによって生成し、分子量関連イオンＢは、還元性を示す物質によって還元されなかったことによって生成する。
【００２３】
＜５＞
前記ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質が、ジスルフィド結合に対して還元性を示すマトリックスである、＜４＞に記載のタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【００２４】
＜６＞
前記ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質が、ジアミノナフタレンの位置異性体から選ばれる、＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【００２５】
上記＜６＞に記載のジアミノナフタレンは、ＭＡＬＤＩ法において、マトリックスとしての性質とともに還元性を有する物質、すなわち還元性を示すマトリックスとして使用されることがある。また、上記＜６＞に記載のジアミノナフタレンは、マトリックスを用いないＬＩ法において、気相中で還元性を示す物質として使用されることがある。
【００２６】
＜７＞
前記ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質が、１，５−ジアミノナフタレン、２，３−ジアミノナフタレン、及び１，８−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれる、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【００２７】
＜８＞
前記ＭＡＬＤＩ質量分析装置が、ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ飛行時間型）質量分析装置である、＜２＞〜＜７＞のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。
【００２８】
＜９＞
前記タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列情報を、de novo Sequencingの自動解析を行うことによって得る、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドのジスルフィドマッピング法。  
【発明の効果】
【００２９】
本発明によると、質量分析において、タンパク質又はペプチドのジスルフィド結合の数及び位置の決定を迅速且つ容易に行うことができる方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明においては、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質を用い、ＭＳの２乗以上が可能なＬＩ質量分析装置によって、タンパク質又はペプチドの質量分析を行い、ジスルフィドマッピングを行う。
【００３１】
本明細書においては、質量分析装置によって行われる分析において、測定試料の１回目の分析をＭＳとし、ＭＳにおいて得られたスペクトルのイオンピークから特定のイオンを選択し、選択された特定のイオンをプリカーサイオンとして２回目の分析を行うことをＭＳ/ＭＳ又はＭＳ２と表記する。同様に、ＭＳn-1において得られたスペクトルのイオンピークから特定のイオンを選択し、選択された特定のイオンをプリカーサイオンとしてｎ回目の分析を行うことをＭＳｎと表記し、ＭＳのｎ乗と呼称する。
【００３２】
本発明では、ＬＩ（レーザーイオン化）質量分析装置が用いられる。ＬＩ法は、固相または液相の試料に対しては、適切な波長のレーザー光を照射して試料を気相中に脱離した後イオン化し（レーザー脱離イオン化；ＬＤＩ）、気相の試料に対しては、気相の状態を保ったままで適切な波長のレーザー光を照射して、試料をイオン化する方法である。気相試料のＬＩには、ＬＳ（レーザースプレー；液体を噴霧させ、赤外レーザーを照射して、試料を気相中でイオン化する方法）などがある。固相または液相試料のＬＩには、ＬＤＩ（レーザー脱離イオン化）質量分析装置などがある。
【００３３】
ＬＤＩ法は、レーザー光を吸収する固体又は液体に試料を混合または搭載し、適切なレーザー光を照射し、気相中に試料をイオン化する方法である。ここで、レーザー光を吸収する固体または液体が試料そのものである場合もある。ＬＤＩには、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）やＳＥＬＤＩ（表面増強レーザー脱離イオン化）、ＤＩＯＳ (desorption/ionization on silicon)などがある。
【００３４】
ＭＡＬＤＩ質量分析装置としては、ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型）質量分析装置が好ましい。ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ質量分析装置としては、島津製作所ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴなどが挙げられる。
【００３５】
本発明のジスルフィドマッピング法は、以下の工程を含む。
（i）タンパク質又はペプチドのＭＳを行う。
（ii）ＭＳの結果から、ジスルフィド結合の数を推定する。
（iii）ＭＳｎを行う。
（iv）ＭＳｎの結果から、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列情報を得る。
（v）ＭＳｎの結果から、ジスルフィド結合の位置を推定する。
なお、これらの工程は、上記の順番に限定されるものではない。以下、これらの工程について詳しく説明する。
【００３６】
（i）ＭＳ
本工程では、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質を用いて、タンパク質又はペプチドのＭＳを行う。本工程によって、ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡと、ジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンＢとを得る。
【００３７】
本発明における、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質としては、質量分析に用いるレーザーの波長を吸収し、ジスルフィド結合を還元的に開裂する能力を有するものであれば特に限定されない。ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質の一例として、本発明の条件下で、タンパク質試料又はペプチド試料中のジスルフィド結合の、例えば２０％以上、好ましくは５０％以上を還元的に開裂させる能力を有する物質が挙げられる。
【００３８】
ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質は、１種又は複数種を組み合わせて用いることができる。そして、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質は、このような還元性の強さを考慮して適宜用いることができる。ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質の中でも比較的還元性が強くないものを用いれば、ジスルフィド結合が還元されていない分子量関連イオンＢが相対的に多く得られる。
【００３９】
具体的には、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質の構造としては、質量分析に用いるレーザーの波長に吸収帯を有する分子骨格と、ジスルフィド結合を還元的に開裂させることができる官能基とを有するものであれば特に限定されない。例えば、ジアミノナフタレン類が挙げられる。ここでいうジアミノナフタレン類には、ジアミノナフタレンの存在しうる位置異性体が全て含まれる。この中でも、１，５−ジアミノナフタレン（１，５−ＤＡＮ；下記式(I)）、１，８−ジアミノナフタレン（１，８−ＤＡＮ；下記式(II)）、２，３−ジアミノナフタレン（２，３−ＤＡＮ；下記式(III)）が特に好ましく用いられる。
【００４０】
【化１】
2006292603.tif 000003
【００４１】
【化２】
2006292603.tif 000004
【００４２】
【化３】
2006292603.tif 000005
【００４３】
これら位置異性体は、測定試料に応じて適宜使い分けることができる。この中では、１，５−ＤＡＮは、もっとも強いＳ/Ｎ比を示し、２，３−ＤＡＮは、もっとも強い還元性を持つ。従って、これら位置異性体は、このように感度や還元性などの各々の能力を考慮しながら、適宜使い分けると良い。
【００４４】
本発明の還元性を示す物質は、気相中で還元するために用いることができる。よって、ＤＩＯＳ(desorption/ionization on silicon)などマトリックスを用いないＬＩにおける還元に使用することもできる。例えば、ジアミノナフタレンは気相にて還元作用を示す。さらにジアミノナフタレンは、後述するように、マトリックスとしても働くため、還元性を示すマトリックスとしてＭＡＬＤＩ質量分析装置にて用いることができる。
【００４５】
ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質は、上記の強さの還元性を損なわない程度の十分な量で用いると良い。
【００４６】
ＭＳでは、主に分子量関連イオンが得られる。ここで分子量関連イオンとは、分子量情報の獲得に直接役立つイオン種をいう。ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質によって、タンパク質又はペプチドから、分子量関連イオンをジスルフィド結合が還元的に開裂された状態で生じさせることができる。また、このようにジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡとともに、ジスルフィド結合が還元されなかった分子量関連イオンＢも生成する。
【００４７】
また、タンパク質又はペプチドがジスルフィド結合をｍ個有している場合は、分子量関連イオンＡとして、ジスルフィド結合が１個還元された分子量関連イオンＡ１、ジスルフィド結合が２個還元された分子量関連イオンＡ２、・・・ジスルフィド結合がｍ個還元された分子量関連イオンＡｍが得られる。
【００４８】
以下に、本発明においてＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いる場合を挙げて、ジスルフィド結合を有する物質、及び測定試料をＭＡＬＤＩ質量分析装置に導入する手順について説明する。
【００４９】
本発明においてＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いる場合、タンパク質試料又はペプチド試料は、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質と混合され、ＭＡＬＤＩ測定用試料混合物に調製される。この測定用試料混合物は、ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いる一般の測定用試料混合物と同様に、マトリックス物質を含んでいる。従って本発明では、測定用試料混合物中の還元性を示す物質として、ジスルフィド結合を還元する働きとともにマトリックスとしての働きを有する物質（すなわち、還元性を示すマトリックス）が用いられることがある。この場合は、還元性を示すマトリックスを単独で用いても良いし、そのような強い還元性を示さないマトリックス（例えば従来から用いられてきたマトリックスなど）とともに用いても良い。さらに、前記の還元性を示す物質として、ジスルフィド結合に作用する働きを有するがマトリックスとしての働きは有しない物質を選択し、このような物質を、前記の強い還元性を示さないマトリックスとともに用いても良い。
【００５０】
測定用試料混合物において、還元性を示すマトリックス、強い還元性を示さないマトリックス、還元性を示し且つマトリックスでない物質は、それぞれ１種又は複数種を選択して用いることができる。すなわち、タンパク質試料又はペプチド試料と混合させる物質の還元性の強弱やマトリックスの有無などを考慮することによって、測定用試料混合物に含まれる物質の種類と数とを制限なく組み合わせることができる。
【００５１】
例えば、測定用試料混合物としては、以下の混合物などが挙げられる。
タンパク質試料又はペプチド試料と、ジスルフィド結合に対して還元性を示すマトリックスとの混合物；タンパク質試料又はペプチド試料と、還元性を示すマトリックスと、強い還元性を示さないマトリックスとの混合物；又は、タンパク質試料又はペプチド試料と、還元性を示し且つマトリックスでない物質と、強い還元性を示さないマトリックスとの混合物など。
【００５２】
なお、「強い還元性を示さないマトリックス」としては、「還元性を示す物質」が有する還元性よりも強い還元性を有しないマトリックスであれば特に限定されない。強い還元性を示さないマトリックスの例としては、タンパク質試料又はペプチド試料中のジスルフィド結合を全く還元する能力を有しないものや、還元する能力があっても、本発明の条件下で、タンパク質試料又はペプチド試料中のジスルフィド結合の、例えば５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくはせいぜい５％を還元することができる程度のものが挙げられる。
【００５３】
強い還元性を示さないマトリックスは、イオン化能力に優れたもの（例えば従来から用いられてきたマトリックスなど）から選択することができる。強い還元性を示さないマトリックスを用いることによって、より効率的にイオン化を行うことが可能になる。
【００５４】
本発明においてＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いる場合、ジスルフィド結合に対しての還元性を示す物質としては、ＭＡＬＤＩ質量分析に用いられるレーザーの波長に吸収帯を有する分子骨格と、ジスルフィド結合を還元的に開裂する能力を有する官能基とを有するものが挙げられる。すでに挙げたジアミノナフタレン類は、マトリックスとしての働きを有するため、還元性を示す物質として還元性を示すマトリックスを用いる場合に、このようなジアミノナフタレン類が特に有用に用いられる。
【００５５】
還元性を示すマトリックスを単独で用いる場合、ＭＡＬＤＩ質量分析においてマトリックスとして用いるという目的において通常用いられる量を、当業者が適宜決定すれば良い。すなわち、測定試料に対してマトリックスが過剰量となるような適当な濃度、例えば１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として用いると良い。溶媒としては、有機溶媒水溶液、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液、有機溶媒−ＴＦＡ水溶液などを用いることができる。有機溶媒としては、アセトニトリル、エタノール、メタノールなどを用いることができる。
【００５６】
測定試料をＭＡＬＤＩ質量分析装置に導入する手順としては特に限定されない。例えば、還元性を示すマトリックスを単独で用いる場合、以下のような方法が挙げられる。
すなわち、ＭＡＬＤＩ質量分析用のプレートに、測定試料の溶液とマトリックスの溶液とを、同一の位置に微量滴下し、乾燥させる。測定試料の溶液は、測定試料のタンパク質又はペプチドを、ＴＦＡ水溶液に適当な濃度で溶解することによって調製すると良い。マトリックスの溶液は、上記の溶媒に、上記の濃度で溶解することによって調製すると良い。滴下する量としては、特に限定されず、当業者が適宜決定すればよい。例えば、試料にして数ｆｍｏｌ〜数ｐｍｏｌ程度となるような量とすることができる。
【００５７】
乾燥させたプレートは、ＭＡＬＤＩ質量分析装置内に導入される。プレート上の試料とマトリックスとの混合結晶にレーザー光が照射されると、そのレーザー波長を吸収してマトリックスが励起し、そのとき試料も同時にイオン化される。すなわち、マトリックスは、質量分析装置のレーザー波長を吸収して励起する際に、マトリックスとともにプレート上に搭載された試料を同時にイオン化する働きをする。マトリックスと共にイオン化した試料は、電位差によりイオン源を飛び出し、高真空である分離部を飛行し、質量による飛行速度の違いによって分離される。その後、検出器においてそれぞれのイオンの質量値を示すイオンピークとして検出される。
【００５８】
ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いた場合は、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質（すなわち還元性を示すマトリックスや還元性を示し且つマトリックスでない物質）によって、タンパク質又はペプチドから、分子量関連イオンをジスルフィド結合が還元的に開裂された状態で生じさせることができる。また、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質によって、このようにジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンとともに、ジスルフィド結合が還元されなかった分子量関連イオンも生成する。
【００５９】
ＭＡＬＤＩ質量分析装置以外のＬＩ質量分析装置により質量分析測定を行う場合は、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質を用いて試料を調製すること以外は、それぞれの分析装置にて通常用いられる手順に従って、試料調製及び分析を行うことができる。
【００６０】
このようにＭＡＬＤＩ質量分析装置をはじめ、ＬＩ質量分析装置により質量分析測定にかけられた測定試料は、ジスルフィド結合が還元的開裂された状態で検出することができる。従って本発明の方法では、ジスルフィド結合の開裂のために従来必ず行われてきたような、煩雑な前処理を行う必要がない。すなわち、そのような前処理に必要とされていた時間、手間、試薬類、より具体的には、ｐＨなどの反応条件の調整、チオール基の保護、試薬等の塩類の除去等という作業が不要になる。そして、そのような前処理によって危惧されていた残留試薬のスペクトルへの影響もなくなる。
【００６１】
このように、本発明の方法を用いると、ジスルフィド結合の還元反応を、迅速且つ容易に行うことが可能になる。ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いた場合は、ジスルフィド結合の還元反応を、オンターゲットで、すなわちＭＡＬＤＩプレート上で行うことが可能になるため、迅速且つ容易な処理が可能になる。
【００６２】
（ii）ジスルフィド結合の数の推定
従来法において、還元性を持つ物質を
用いない場合や、強い還元性を持たないマトリックスのみを用いた場合に得られるＭＳスペクトルにおいては、測定試料がジスルフィド結合を有する場合も、分子量関連イオンのピークは、通常［Ｍ＋Ｈ］＋（ポジティブモードでの測定の場合でプロトン付加分子として検出された場合（金属イオン付加分子として検出される場合もある。））又は［Ｍ−Ｈ］−（ネガティブモードでの測定の場合）として帰属される。すなわち、分子量関連イオンはジスルフィド結合を維持した状態のものとして得られる。
【００６３】
一方、本発明のようにジスルフィド結合に対して還元性を持つ物質を用いて得られるＭＳスペクトルにおいて、ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンについては、分子量関連イオンのピークを、理論上、［Ｍ＋２ｍ＋Ｈ］＋（ポジティブモードでの測定の場合でプロトン付加分子として検出された場合（金属イオン付加分子として検出される場合もある。））又は［Ｍ＋２ｍ−Ｈ］−（ネガティブモードでの測定の場合）として帰属する。従来のマトリックスを用いた場合と比べて質量数が２ｍＤａ大きいとするのは、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）が還元的に開裂を受けることによって、１個のジスルフィド結合につき２個のチオール基（−ＳＨ，ＨＳ−）へと変換されて質量が２Ｄａ大きくなるためである。
【００６４】
従って、測定試料がジスルフィド結合を１個有するものである場合、ＭＳスペクトルにおけるジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンのピークは、［Ｍ＋２＋Ｈ］＋（プロトン付加分子の場合）又は［Ｍ＋２−Ｈ］−として帰属する。同様に、測定試料がジスルフィド結合を２個有するものである場合は、ＭＳスペクトルにおけるジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンのピークは、［Ｍ＋４＋Ｈ］＋（プロトン付加分子の場合）又は［Ｍ＋４−Ｈ］−として、測定試料がジスルフィド結合を３個有するものである場合は、ＭＳスペクトルにおけるジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンのピークは、［Ｍ＋６＋Ｈ］＋（プロトン付加分子の場合）又は［Ｍ＋６−Ｈ］−として帰属する。
【００６５】
測定試料のタンパク質又はペプチドが有するジスルフィド結合の数が未知である場合、以下のようにしてジスルフィド結合の数を決定する。
ジスルフィド結合の数をｍ個として仮定する。そして、上述の工程（i）によって、ジスルフィド結合が還元された分子量関連イオンＡと、ジスルフィド結合が維持された分子量関連イオンＢとを得る。
【００６６】
次に、分子量関連イオンＡの質量数ＭＡと、分子量関連イオンＢの質量数ＭＢとの差（ＭＡ−ＭＢ）を求める。
ジスルフィド結合の数ｍ（個）に対して、双方の分子量関連イオンの差が２ｍ（Ｄａ）で表される、すなわち、２ｍ＝ＭＡ−ＭＢという関係に基づき、実際に求められた差（ＭＡ−ＭＢ）からジスルフィド結合の数ｍを算出する。
【００６７】
例えば、双方の分子量関連イオンの差が２であれば、測定試料のタンパク質又はペプチドが有するジスルフィド結合の数は１個であると決定することができる。同様に、当該差が４であればジスルフィド結合の数は２個、当該差が６であればジスルフィド結合の数は３個であると決定することができる。また、双方の分子量関連イオンの差がなければ、測定試料のタンパク質又はペプチドはジスルフィド結合を有しないと決定することができる。このように、ジスルフィド結合の有無及び数を確認することが可能になる。
【００６８】
（iii）ＭＳｎ
本工程では、分子量関連イオンＡと分子量関連イオンＢとをそれぞれプリカーサーイオンとして選択し、選択されたプリカーサーイオンについてそれぞれＭＳｎを行う。前記工程（i）で、ジスルフィド結合をｍ個有するタンパク質又はペプチドから、複数の分子量関連イオンＡ（分子量関連イオンＡ１、Ａ２・・・Ａｍ）が得られた場合は、それぞれの分子量関連イオンをプリカーサーイオンとして選択し、選択されたプリカーサーイオンについてそれぞれＭＳｎを行うことができる。
【００６９】
本工程により、分子量関連イオンＡから、複数のプロダクトイオンａ（プロダクトイオンａ群）を、分子量関連イオンＢから、複数のプロダクトイオンｂ（プロダクトイオンｂ群）を得る。
【００７０】
（iv）アミノ酸配列情報の取得
本工程では、ＭＳｎの結果から、ジスルフィド結合が還元されたタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列情報を得る。このときに関わるプロダクトイオンａについて、以下に説明する。
【００７１】
従来法において、還元性を示す物質を用いない場合や、強い還元性を示さないマトリックスを用いた場合は、プリカーサイオンがジスルフィド結合を有するため、ＭＳ/ＭＳで得られるプロダクトイオンは、さまざまな種類のプロダクトイオン種が入り混じる。このようなプロダクトイオン種としては、例えば、ジスルフィド結合を維持したもの、ジスルフィド結合に由来し且つシステイン残基のチオール基「−ＳＨ」のＨが外れた「−Ｓ」に相当する基を生成するフラグメンテーションが起こったもの、ジスルフィド結合に由来し且つシステイン残基のチオール基に相当する「−ＳＨ」を生成するフラグメンテーションが起こったものなどが含まれる。さらに、ジスルフィド結合を維持した内部断片なども相対的に多く検出され得る。
【００７２】
このような多種類のプロダクトイオンのピークが混在した複雑なスペクトルは、その解析が非常に困難である。例えば、de novo Sequencing（すなわち数学的演算によりアミノ酸配列を算出する方法）による自動解析を試みたとしても、配列のほとんどを解析することができない。これは、自動解析に用いられるソフトウェアが、通常はジスルフィド結合が維持されている条件に対応していないことが原因に挙げられる。このようなソフトウェアによる計算は、ジスルフィド結合を持たない状態か、或いはジスルフィド結合が還元されてカルボアミドメチル化などの修飾を受けた状態としてのみ行われると考えられるため、誤った配列情報を与えてしまう。
【００７３】
マニュアルでde novo Sequencingを行う場合は、プロダクトイオンの構造、すなわちジスルフィド結合の有無やジスルフィド結合に由来する官能基（あるいは基）を考慮しながら、一つ一つのプロダクトイオンピークに関して質量の理論値を計算する必要があり、大変な手間がかかる上に困難を極める。しかも、得られたプロダクトイオンの多くは解析できない結果に終わってしまう。
【００７４】
一方、本発明で還元性を示す物質を用いた場合は、プリカーサイオンがジスルフィド結合を有しないため、プロダクトイオンａとしては、通常の規則性を持ったフラグメンテーションにより生じるイオン（ｘ−、ｙ−、ｚ−系列、ａ−、ｂ−、ｃ−系列及びそれに関連するプロダクトイオン）が得られる。すなわち、質量分析の前処理としてジスルフィド結合の還元・アルキル化を行った測定試料を解析するときと同様に、シンプルなスペクトルが得られる。従って、アミノ酸残基の質量のみを考慮するだけの、容易な解析が可能となる。
【００７５】
ここで、ペプチド内の１箇所でフラグメンテーションが起こった結果、Ｎ末端側のフラグメントに電荷が保持される場合、そのプロダクトイオンは、ａ−、ｂ−、ｃ−系列イオンとして分類される。また、Ｃ末端側のフラグメントに電荷が保持される場合、そのプロダクトイオンは、ｘ−、ｙ−、ｚ−系列として分類される。そして、下記式に例示されているように、これらのプロダクトイオンは、ペプチドのアミノ酸残基の番号を付して表記する。
【００７６】
【化４】
2006292603.tif 000006
【００７７】
具体的には、自動又はマニュアルによるde novoSequencingによりジスルフィド結合が還元されたタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列情報を得る。これによりシステイン残基の位置も確認する。
【００７８】
本発明では、還元・アルキル化の前処理を行っていないにもかかわらず、還元・アルキル化の前処理を行ったときと同様の簡便さでアミノ酸配列の解析を行うことが可能になる。そして、従来からのアミノ酸配列解析用のソフトウェアが適応できるスペクトルを与えるため、たとえば市販のde novo Sequencing用ソフトウェアをそのまま使用することが可能になる。市販のde novo Sequencing用ソフトウェアとして、ＰＥＡＫＳTMなどが挙げられる。
【００７９】
（v）ジスルフィド結合の位置の推定
本工程では、プロダクトイオンａとプロダクトイオンｂとの質量差を利用して、ジスルフィド結合の位置を推定する。
【００８０】
ここで、プロダクトイオンａ群は、すでに述べたように、通常の規則性を持ったフラグメンテーションにより生じるイオン（ｘ−、ｙ−、ｚ−系列、ａ−、ｂ−、ｃ−系列及びそれに関連するプロダクトイオン）が得られる。これらイオンは、ｙ−/ｂ−系列のイオンを中心として得られる。
【００８１】
一方、プロダクトイオンｂ群は、従来法において、還元性を示す物質を用いない場合や、強い還元性を示さないマトリックスを用いた場合と同様に、さまざまな種類のプロダクトイオン種が入り混じる。すなわち、ｂ群には、(1b)ジスルフィド結合を維持したもの、(2b)ジスルフィド結合に由来し且つシステイン残基のチオール基「−ＳＨ」のＨが外れた「−Ｓ」に相当する基を生成するフラグメンテーションが起こったもの、(3b)ジスルフィド結合に由来し且つシステイン残基のチオール基に相当する「−ＳＨ」を生成するフラグメンテーションが起こったものなどが含まれる。さらに、ジスルフィド結合を維持した内部断片なども相対的に多く含まれ得る。
【００８２】
このようなさまざまな種類のプロダクトイオンが含まれるプロダクトイオンｂ群から、例えば上記の(1b)、(2b)及び(3b)の形式を有するプロダクトイオンｂのみを考慮する。(1b)、(2b)及び(3b)の形式を有するプロダクトイオンｂについて、それらを生じたフラグメンテーションと、ジスルフィド結合の位置との関係を考慮すると、以下のように説明できる。なお、以下の説明では、ジスルフィド結合を１個有するタンパク質又はペプチドにおいて１箇所でフラグメンテーションが起こる、最もシンプルな場合を想定している。
【００８３】
(1b)の形式のプロダクトイオンｂは、プリカーサーイオンとして用いた分子量関連イオンＢにおいて、ジスルフィド結合のＮ末端側のシステイン残基よりもＮ末端側でフラグメンテーションが起こった場合の、Ｃ末端側のイオン（例えばｙ−系列イオン）として生じる。また、(1b)の形式のプロダクトイオンｂは、プリカーサーイオンとして用いた分子量関連イオンＢにおいて、ジスルフィド結合のＣ末端側のシステイン残基よりもＣ末端側でフラグメンテーションが起こった場合の、Ｎ末端側のイオン（例えばｂ−系列イオン）としても生じる。
【００８４】
(2b)及び(3b)の形式を有するプロダクトイオンｂはいずれも、プリカーサーイオンとして用いた分子量関連イオンＢにおいて、１個のジスルフィド結合を形成する２個のシステイン残基の間でフラグメンテーションが起こった場合の、Ｃ末端側/Ｎ末端側のイオン（例えばｙ−/ｂ−系列イオン）として生じる。
【００８５】
プロダクトイオンａ群にも、上記(1b)、(2b)及び(3b)の形式のプロダクトイオンｂにそれぞれ対応する、(1a)、(2a)及び(3a)の形式のプロダクトイオンａが含まれる。
【００８６】
すなわち、(1a)の形式のプロダクトイオンａは、プリカーサーイオンとして用いた分子量関連イオンＡにおいて、ジスルフィド結合のＮ末端側のシステイン残基よりもＮ末端側でフラグメンテーションが起こった場合の、Ｃ末端側のイオン（例えばｙ−系列イオン）として生じる。また、(1a)の形式のプロダクトイオンａは、プリカーサーイオンとして用いた分子量関連イオンＡにおいて、ジスルフィド結合のＣ末端側のシステイン残基よりもＣ末端側でフラグメンテーションが起こった場合の、Ｎ末端側のイオン（例えばｂ−系列イオン）としても生じる。
それぞれの場合において、(1b)の形式のプロダクトイオンｂとそれに対応する(1a)の形式のプロダクトイオンａとは、ジスルフィド結合が還元されているか否かという違いがあることを除いては、互いに同系列、同配列である。
【００８７】
そして、(2a)の形式を有するプロダクトイオンａは、プリカーサーイオンとして用いた分子量関連イオンＡにおいて、１個のジスルフィド結合を形成する２個のシステイン残基の間でフラグメンテーションが起こった場合の、Ｃ末端側/Ｎ末端側のイオン（例えばｙ−/ｂ−系列イオン）として生じる。
この場合において、(2b)の形式のプロダクトイオンｂとそれに対応する(2a)の形式のプロダクトイオンａとは、切断されたジスルフィド結合がさらに還元されているか否かという違いがあることを除いては、互いに同系列、同配列である。
【００８８】
さらに、 (3a)の形式を有するプロダクトイオンａは、プリカーサーイオンとして用いた分子量関連イオンＡにおいて、１個のジスルフィド結合を形成する２個のシステイン残基の間でフラグメンテーションが起こった場合の、Ｃ末端側/Ｎ末端側のイオン（例えばｙ−/ｂ−系列イオン）として生じる。
この場合において、(3b)の形式のプロダクトイオンｂとそれに対応する(3a)の形式のプロダクトイオンａとは、ジスルフィド結合が同じ形に切断されており、互いに同系列、同配列である。  
【００８９】
ここで、(1a)の形式のプロダクトイオンａと(1b)の形式のプロダクトイオンｂとにおいて、両者が同系列のイオンの場合、双方の質量差は、理論的に２となる。
また、(2a)の形式のプロダクトイオンａと(2b)の形式のプロダクトイオンｂとにおいて、両者が同系列のイオンの場合、双方の質量差は、理論的に１となる。
さらに、(3a)の形式のプロダクトイオンａと(3b)の形式のプロダクトイオンｂとにおいて、両者が同系列のイオンの場合、双方の質量差は、理論的に０となる。
【００９０】
上述のプロダクトイオン、すなわちジスルフィド結合に関与するシステイン残基を有するプロダクトイオンの他に、ジスルフィド結合に関与するシステイン残基を有しないプロダクトイオンについては、プロダクトイオンａ及びｂを、対応するもの同士で（すなわち同配列、同系列のもの同士で）比較すると、双方の質量差は、理論的に０となる。なお、ジスルフィド結合に関与するシステイン残基を有しないプロダクトイオンは具体的には以下のものが挙げられる。
【００９１】
すなわち、プロダクトイオンａについては、プリカーサーイオンとして用いた分子量関連イオンＡにおいて、ジスルフィド結合のＮ末端側のシステイン残基よりもＮ末端側でフラグメンテーションが起こった場合の、Ｎ末端側のイオン（例えばｂ−系列イオン）や；プリカーサーイオンとして用いた分子量関連イオンＡにおいて、ジスルフィド結合のＣ末端側のシステイン残基よりもＣ末端側でフラグメンテーションが起こった場合の、Ｃ末端側のイオン（例えばｙ−系列イオン）。
【００９２】
一方、プロダクトイオンｂについては、プリカーサーイオンとして用いた分子量関連イオンＢにおいて、ジスルフィド結合のＮ末端側のシステイン残基よりもＮ末端側でフラグメンテーションが起こった場合の、Ｎ末端側のイオン（例えばｂ−系列イオン）や；プリカーサーイオンとして用いた分子量関連イオンＢにおいて、ジスルフィド結合のＣ末端側のシステイン残基よりもＣ末端側でフラグメンテーションが起こった場合の、Ｃ末端側のイオン（例えばｙ−系列イオン）。
【００９３】
このような原理を利用し、互いに対応するプロダクトイオンａとプロダクトイオンｂとの質量差を次々に算出していくと、ジスルフィド結合の位置を確認することができる。タンパク質又はペプチドは、プロダクトイオンとしてｙ系列及びｂ系列のものを中心に得られるため、ｙ系列イオン及びｂ系列イオンの両方について質量差を算出していくと良い。
【００９４】
本工程では、ＭＳ２測定で得られたプロダクトイオンから特定のイオンをプリカーサイオンとして選択してＭＳ３測定を行うことで、より詳細な構造情報を得ることができる。同様に、ＭＳn-1測定で得られたプロダクトイオンから特定のイオンをプリカーサイオンとして選択してＭＳｎ測定を行うことで、さらに詳細な構造情報を得ることができる。ＭＳｎ測定を行うことで、より詳細な構造情報を得ることができる。ＭＳｎ測定で得られるプロダクトイオンは、特定のプリカーサイオンに帰属できるので、分子量関連イオンピークについてのより正確な構造解析が可能となる。
【００９５】
本発明によって、以下の効果が得られる。
・前処理の手間と時間が大幅に縮小される。
・前処理における調整の難しさや残留試薬の問題が軽減される。
・基本的に通常の質量分析と手順が同じであるため、操作が容易である。
・使用する試料の量が少なくてすむ。
【実施例】
【００９６】
＜実験例１＞
測定試料として、図１に示すように、Ａ鎖（（A-chain：ＧＩＶＥＱＣＣＡＳＶＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列表の配列番号１），ジスルフィド結合CysA6-CysA11）とＢ鎖（B-chain：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ（配列表の配列番号２））とがジスルフィド結合CysA7-CysB7及びCysA20-CysB19で架橋した構造を有するInsulinを用い、還元性を示すマトリックスとして、ジアミノナフタレンの位置異性体３種、及び比較用として強い還元性を示さない2,5-dihydroxybenzoic acid（ＤＨＢＡ）をそれぞれ用いて、ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ（島津製作所）によりポジティブモード及びネガティブモードで質量分析を行った。本実験例で用いたジアミノナフタレンの位置異性体は、1,5-diaminonaphthalene（１，５−ＤＡＮ）、1,8-diaminonaphthalene（１，８−ＤＡＮ）、及び2,3-diaminonaphthalene（２，３−ＤＡＮ）である。また、ＤＨＢＡを用いた場合においては、還元性を有する物質は用いなかった。
【００９７】
図１の（ａ−１）は、比較用のＤＨＢＡを用いた、ポジティブ（positive）モードでのＭＳスペクトル、（ａ−２）は、比較用のＤＨＢＡを用いた、ネガティブ（negative）モードでのＭＳスペクトル、（ｂ−１）は、１，５−ＤＡＮを用いた、ポジティブモードでのＭＳスペクトル、（ｂ−２）は、１，５−ＤＡＮを用いた、ネガティブモードでのＭＳスペクトル、（ｃ−１）は、１，８−ＤＡＮを用いた、ポジティブモードでのＭＳスペクトル、（ｃ−２）は、１，８−ＤＡＮを用いた、ネガティブモードでのＭＳスペクトル、（ｄ−１）は、２，３−ＤＡＮを用いた、ポジティブモードでのＭＳスペクトル、及び、（ｄ−２）は、２，３−ＤＡＮを用いた、ネガティブモードでのＭＳスペクトルである。なお、本明細書における全てのスペクトルにおいて、横軸は（質量/電荷）(m/z)、縦軸は相対強度(% Int.)を表す。
【００９８】
ＤＨＢＡを用いた結果によると、図１（ａ−１）及び（ａ−２）が示すように、主にInsulinの分子量関連イオンが検出された。これに対し、１，５−ＤＡＮを用いた結果によると図１（ｂ−１）及び（ｂ−２）が示すように、主にＡ鎖及びＢ鎖の分子量関連イオンが検出された。これは、Insulin分子の架橋構造を形成していたジスルフィド結合が還元的に切断された結果、Ａ鎖とＢ鎖とに分解されたことを示す。同じ結果が、１，８−ＤＡＮを用いた場合（図１（ｃ−１）及び（ｃ−２））、及び、２，３−ＤＡＮを用いた場合（図１（ｄ−１）及び（ｄ−２））においても得られた。
【００９９】
さらに、この３種類のジアミノナフタレンを用いた結果を比較すると、１，５−ＤＡＮが最も強いＳ/Ｎ比を示し、２，３−ＤＡＮが最も強い還元性を持つことが確かめられた。なお、還元性については、Insulinの分子量関連イオンと、Ａ鎖及びＢ鎖の分子量関連イオンとのピーク強度比を比較することにより行った。
【０１００】
＜実施例１＞
測定試料として、ペプチドUrotensin II (human由来; アミノ酸配列：ＥＴＰＤＣＦＷＫＹＣＶ（配列表の配列番号３）， ジスルフィド結合：Cys5-Cys10, 分子式：Ｃ64Ｈ86Ｎ13Ｏ18, 分子量：１３８８．６, 最小質量による精密質量: １３８７．６)を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型)質量分析装置によりＭＳを、ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ飛行時間型）質量分析装置（ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ（島津製作所））によって、ＭＳと、ＭＳで得られた分子量関連イオンをプリカーサイオンとしたＭＳ/ＭＳとを行った。マトリックスにＤＨＢＡを用いた場合と、１，５−ＤＡＮを用いた場合とを、得られた結果について比較した。
【０１０１】
ＤＨＢＡをマトリックスとして用いたＭＳスペクトルでは、分子量関連イオンＢとして［Ｍ＋Ｈ］＋が主に得られた。一方、１，５−ＤＡＮをマトリックスとして用いたＭＳスペクトルでは、分子量関連イオンＡとして［Ｍ＋Ｈ］＋と共にそれ以上の強度で［Ｍ＋２＋Ｈ］＋が主に得られた。分子量関連イオンＡ［Ｍ＋２＋Ｈ］＋は、１，５−ＤＡＮがジスルフィド結合を還元することにより生じた２つのチオール基の存在によるものと考えられる。ジスルフィド結合が還元されるごとに２つのチオール基を生じることから、ｍ個のジスルフィド結合をもつタンパク質あるいはペプチドのジスルフィド結合が全て還元された場合、分子量関連イオンＡは、プロトン化分子として生じる場合は［Ｍ＋２ｍ＋Ｈ］＋、金属イオンMetalが付加した分子として生じる場合は［Ｍ＋２ｍ＋Metal］＋として示すことができる。今回の試料Urotensin IIに対しては、ｍ＝１であるため、ジスルフィド結合は１個と推定できる。
【０１０２】
ＤＨＢＡによる、［Ｍ＋Ｈ］＋をプレカーサイオン（Precursor ion）としたＭＳ/ＭＳスペクトルを図２に、１，５−ＤＡＮによる、［Ｍ＋２＋Ｈ］＋をプレカーサイオン（Precursor ion）ＭＳ/ＭＳスペクトルを図３に示す。続いて、１，５−ＤＡＮをマトリックスとして用いたＭＳで得られた分子量関連イオンＡ［Ｍ＋２＋Ｈ］＋をプリカーサイオンとして行ったＭＳ/ＭＳで、得られたＭＳ/ＭＳスペクトルから、ｙ/ｂ−系列を中心とした多くの規則的な開裂を示すプロダクトイオンａ（ｘ−、ｙ−、ｚ−系列、及びａ−、ｂ−、ｃ−系列及びそれに関連するイオン）を効率良く確認した。これにより、ペプチドUrotensin IIの全アミノ酸配列情報を得、同時にシステイン残基の位置を確認した。尚、このアミノ酸配列の解析は、de novo Sequencingによるマニュアル解析だけでなく、自動解析でも可能であった。
【０１０３】
さらに、１，５−ＤＡＮによるＭＳ/ＭＳスペクトルで得られたプロダクトイオンａのうち、特にｙ−/ｂ−系列イオン群と、ＤＨＢＡによるＭＳ/ＭＳスペクトルで得られたプロダクトイオンｂのうち、プロダクトイオンａのｙ−/ｂ−系列イオンに対応するプロダクトイオン群とを比較すると、ジスルフィド結合の位置に特徴的な質量差を示した。具体的に、ＤＨＢＡ及び１，５−ＤＡＮによって得られたそれぞれのｙ−系列イオンの質量数と、両質量数の差を以下の表に示した。
【０１０４】
【表１】
2006292603.tif 000007
【０１０５】
また、ＤＨＢＡ及び１，５−ＤＡＮによって得られたそれぞれのｂ−系列イオンの質量数と、両質量数の差を以下の表に示した。
【０１０６】
【表２】
2006292603.tif 000008
【０１０７】
さらに、ＤＨＢＡ及び１，５−ＤＡＮによって得られたそれぞれのｙ−Ｈ２Ｏ−系列イオンの質量数と、両質量数の差を以下の表に示した。
【０１０８】
【表３】
2006292603.tif 000009
【０１０９】
そこで、本実施例で得られたこれらのプロダクトイオン（ｙ−、ｂ−、及びｂ−Ｈ２Ｏ−系列イオン）及びそれから導かれた質量差について、具体的にジスルフィド結合の位置と関連付けて示したものを以下の表に示す。なお、以下の表においては、ｂ−Ｈ２Ｏ−系列イオンを、ｙ６’、ｙ７’・・・のように、「’」を付して表している。
【０１１０】
【表４】
2006292603.tif 000010
【０１１１】
このように、ジスルフィド結合の位置に応じて、特徴的な質量差が示される。このように特徴的な質量差が示されることについて、以下に説明する。
【０１１２】
１，５−ＤＡＮをマトリックスとして用いた場合は、プロダクトイオンａは、ジスルフィド結合が還元されて２つのシステイン残基上それぞれにチオール基（−ＳＨ）が存在する状態の質量数を与えて検出された。
【０１１３】
一方、ＤＨＢＡをマトリックスとして用いた場合は、プロダクトイオンｂは、(1b)ジスルフィド結合を含む形式、(2b)ジスルフィド結合が切断されチオール基の硫黄原子Ｓを１つ含む形式、(3b)ジスルフィド結合が切断されチオール基（−ＳＨ）が１つ存在する形式などを含め、複数の形式で検出された。本実施例では特に、ＤＨＢＡによるプロダクトイオンｂのうち、上記(1b)、(2b)及び(3b)の形式のもののみを考慮している。
【０１１４】
ここで、プロダクトイオンａのうち、(1b)の形式のプロダクトイオンｂに対応するものを、(1a)の形式のプロダクトイオンａとし；(2b)の形式のプロダクトイオンｂに対応するものを、(2a)の形式のプロダクトイオンａとし；(3b)の形式のプロダクトイオンｂに対応するものを、(3a)の形式のプロダクトイオンａとする。
【０１１５】
１，５−ＤＡＮによるＭＳ/ＭＳスペクトルで得られたプロダクトイオンａのうち、ｙ−/ｂ−系列イオン群と、ＤＨＢＡによるＭＳ/ＭＳスペクトルで得られたプロダクトイオンｂのうち、プロダクトイオンａのｙ−/ｂ−系列イオンに対応するプロダクトイオン群とにおいて、対応するプロダクトイオン同士の質量差は、理論的には次の通りである。すなわち、(1b)の形式のプロダクトイオンｂと、(1a)の形式のプロダクトイオンａとの間では、両者の質量差は２；(2b)の形式のプロダクトイオンｂと、(2a)の形式のプロダクトイオンａとの間では、両者の質量差は１；(3b)の形式のプロダクトイオンｂと、(3a)の形式のプロダクトイオンａとの間では、両者の質量差は０となると考えられる。
【０１１６】
これらの質量差を、ジスルフィド結合の位置と関連付けて説明すると、以下の通りである。
ジスルフィド結合を含むペプチドで１箇所切断が生じる場合、ｙ−系列イオンは、ジスルフィド結合に関係するシステイン残基のうちＮ末端側残基までのペプチド骨格が開裂して生じるイオンであれば質量差２、ジスルフィド結合に関する２つのシステイン残基間のペプチド骨格が開裂して生じるイオンであれば質量差１か０となる。
【０１１７】
またこの場合、ｂ−系列イオン及びｂ−Ｈ２Ｏ系列イオンは、ジスルフィド結合に関係するシステイン残基のうちＣ末端側の残基までのペプチド骨格が開裂して生じるイオンであれば質量差２、ジスルフィド結合に関する２つのシステイン残基間のペプチド骨格が開裂して生じるイオンであれば質量差１か０となる。
【０１１８】
本実施例で得られた各系列のイオンにおける質量差と、ジスルフィド結合の位置とについて、より簡潔に示したものを以下の表及び式に示す。
【０１１９】
【表５】
2006292603.tif 000011
【０１２０】
【化５】
2006292603.tif 000012
【０１２１】
このように、本実施例の試料Urotensin IIの場合、ｙ系列イオンは、ｙ４〜ｙ６において質量差０か１、ｙ７〜ｙ１１において質量差２である。このように、０又は１の質量差から２の質量差に切り替わったｙ７のＣ末端側に、ジスルフィド結合に関わるシステイン残基のうちＮ末端側の残基が位置することを確認した。また、ｂ−系列イオンは、ｂ７〜ｂ９において質量差０か１、ｂ１０〜ｂ１１において質量差２である。このように、０又は１の質量差から２の質量差に切り替わったｂ１０のＮ末端側に、ジスルフィド結合に関わるシステイン残基のうちＣ末端側の残基が位置することを確認した。これは、ｂ−Ｈ２Ｏ−系列イオンがｂ６−Ｈ２Ｏ〜ｂ９−Ｈ２Ｏにおいて質量差０、ｂ１０−Ｈ２Ｏ〜ｂ１１−Ｈ２Ｏにおいて質量差２であることからも確認できる。
【０１２２】
以上のように、ジスルフィド結合の数及び位置を解析することができた。
【０１２３】
＜比較例１＞
実施例１で得られたデータのうち、マトリックスとしてＤＨＢＡを用いて得られた図２のデータのみから、de novo Sequencingによるマニュアル解析と自動解析とのそれぞれの方法によって行った。de novo Sequencingによるマニュアル解析により得られた結果を図２中に示す。
【０１２４】
（de novo Sequencingによるマニュアル解析）
マトリックスとしてＤＨＢＡを用いると、ＭＳによる分子量関連イオンが、ジスルフィド結合が維持された分子として得られる。このため、ＭＳ/ＭＳによるプロダクトイオンは、ジスルフィド結合及びそれに由来するシステイン残基のチオール基の状態を考慮して質量の理論値を計算する必要がある。さまざまなプロダクトイオン種が入り混じっているため、de novo Sequencingによるマニュアル解析は大変困難な作業となった。
【０１２５】
図２中のｙ/ｂ系列表示上に付された“＊”は、そのイオンが、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を含むプロダクトイオンであることを示す。また“＊＊”は、そのイオンが、ジスルフィド結合に由来し且つシステイン残基のチオール基「−ＳＨ」のＨが外れた硫黄原子「−Ｓ」に相当する官能基を１個有するプロダクトイオンであることを示す。さらに“＊＊＊”は、そのイオンが、ジスルフィド結合に由来し且つシステイン残基のチオール基「−ＳＨ」に相当する官能基を１個有するプロダクトイオンであることを示す。図２中“？”を付したピークは、そのイオンが、解析できなかったプロダクトイオンであることを示す。このように比較例１ではプロダクトイオンの多くは解析できなかった。解析できなかったプロダクトイオンとしては、ジスルフィド結合が維持されたまま複数の部位で開裂したことにより生じたプロダクトイオン、或いは一般の開裂様式のプロダクトイオン（すなわちｘ−、ｙ−、ｚ−系列、ａ−、ｂ−、ｃ−系列及びそれに関連するプロダクトイオン群）に当てはまらないプロダクトイオンなどが考えられる。
【０１２６】
（de novo Sequencingによる自動解析）
一方、de novo Sequencingによる自動解析を行った場合は、配列のほとんどを解析することができなかった。例えば最高の結果でも、Urotensin IIのＮ末端側のＥＴＰという配列と、Ｃ末端側のアミノ酸Ｖとが解析された程度である。これは、ソフトウェアが、ジスルフィド結合が保持されている条件に対応していないため、ジスルフィド結合を持たない状態か、或いはジスルフィド結合が還元されてカルボアミドメチル化などの修飾を受けた状態としてのみ計算するためだと考えられる。しかも実際には、この結果においては、解析されたアミノ酸の情報さえも、間違ったイオンピークを選んで解析されていたことが判明した。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】実験例１で用いられた測定試料の構造、及び本発明のマトリックス３種を用いて得られたＭＳスペクトルである。
【図２】実施例１において、ＤＢＨＡを用いることによって得られたＭＳ/ＭＳスペクトルである。
【図３】実験例１において、１，５−ＤＡＮを用いることによって得られたＭＳ/ＭＳスペクトルである。
【図１】
2006292603.tif 000013
【図２】
2006292603.tif 000014
【図３】
2006292603.tif 000015
【配列表】
2006292603000001.app