(57)【要約】      （修正有）【課題】ジベレリンのシネルギストとして効果が知られているペスタロリンを高収率で製造する方法の提供。【解決手段】Penicillium sclerotiorum TBUYN-1に属する微生物を培養することによりペスタロチンを製造する。当該微生物の培養にあたり、グルコース、ショ糖、ポリペプトン、プロリンの内少なくとも１つを培地に添加することで、ペスタロチンを合成することができるので温和な条件で製造できるばかりでなく、高い収量を得ることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Penicillium属に属する微生物を培養することを特徴とするペスタロチンの製造方法。
【請求項２】
Penicillium属に属する微生物がPenicillium sclerotiorum TBUYN-1(FERM P-20355)である請求項１記載のペスタロチンの製造方法。
【請求項３】
グルコース、ショ糖、ポリペプトン、プロリンの内少なくとも１つを培地に添加することを特徴とする請求項１又は２記載のペスタロチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を利用して、ペスタロチンを高収率で製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Pestalotia cryptomeriaecolaの産生するペスタロチンは下記[１]で示す構造式で示される化合物であり、はジベレリンのシネルギストとしての効果が知られている（例えば非特許文献１〜２）。
【化１】
2006246756.tif 000002
しがしながら、収率は低く（3mg/Ｌ）、大量に得られなかった。この問題に対して化学合成方法も研究されていたが、収率は改善されなかった（例えば非特許文献３〜４）。したがって、ペスタロチンの効率的な調整法が開発されれば、産業界に大きく参与できる可能性がある。
【非特許文献１】Yasuo Kimura, Kenji Katagiri, Saburo Tamura. Structure of Pestalotin, a New Metabolite from Pestalotia cryptomeriaecola Tetrahedron Letters No. 33 Page 3137-3140 (1971)
【非特許文献２】Yasuo Kimura, Kenji Katagiri, Tsunehisa Inoue, Saburo Tamura. Isolation and Biological Activity of Pestalotin, a Gibberellin Synergist from Pestalotia cryptomeriaecola Agricultural and Biological Chemistry Vol. 35 No. 8 Page 1313-1314 (1971)
【非特許文献３】Dieter Seebach, Hartmut Meyer. Synthesis of (+) or (-)-Pestalotin and (+) or (-)-Epipestalotin and of Optically Pure (-)-Pestalotin by Asymmetric Synthesis Angewandte Chemie - International Edition in English Vol 13 Page 77-78 (1974)
【非特許文献４】Jiancun Zhang, Dennis P. Curran. Stereoselective Synthesis of 1,2-diols by the Cycloadditive Strategy: Total Synthesis of (+)-exo-Brevicomin and (+) and (-)-Pestalotin Journal of the Chemical Society Perkin Transactions 1 No. 11 Page 2627-2631 (1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、このような状況のもとで、鋭意研究を行ったところPenicillium属に属する微生物を利用して、ペスタロチンが、高収率で製造できることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、
（１）Penicillium属に属する微生物を培養することを特徴とするペスタロチンの製造方法、
（２）Penicillium属に属する微生物がPenicillium sclerotiorum TBUYN-1(FERM P-20355)である前記（１）のペスタロチンの製造方法、
（３）グルコース、ショ糖、ポリペプトン、プロリンの内少なくとも１つを培地に添加することを特徴とする前記（１）又は（２）のペスタロチンの製造方法、
に係る。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、Penicillium属に属する微生物から薬品として好適なペスタロチンを収率良く生産することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は、Penicillium属に属する微生物を培養することによりペスタロチンを製造する。Penicillium属に属する微生物としては、P. sclerotiorumが例示でき、特に限定されないが、P. sclerotiorum TBUYN-1 (独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに受託番号FERM P-20355として寄託)が好ましい。培地は、通常Penicillium属に属する微生物の培養に用いられている培地を使用することができるがCzapek-pepton培地やBacto Potato Dextrose Agarが例示できる。効率よく、ペスタロチンを産生させるためには、培地中にグルコース、ショ糖、ポリペプトン、プロリン（proline）の内少なくとも１つを培地に添加することが好ましく、添加量は１Ｌあたりそれぞれ5〜20ｇ、5〜20ｇ、5〜20ｇ、5〜20ｇであることが好ましい。培養液からのペスタロチンの精製は、溶媒による抽出やカラムクロマト等の通常の精製法を適宜組み合わせて用いることができる。
【実施例】
【０００７】
以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
A）Penicillium sclerotiorumの培地とペスタロチンの精製
100ｍl容三角フラスコにCzapek-pepton培地（１リットル当たり、ショ糖（15g）、グルコース（15g）、ポリペプトン（5g）、K2HPO4（1.0g）、MgSO4・7H2O（0.5g）、KCl（0.5g）、FeSO4・7H2O（0.01g）、蒸留水（1,000ml）、pH=7.0）50mlを分注し、オートクレーブで殺菌した後、P. sclerotiorumを植菌し、30℃で1〜20日間静置培養をした。ペスタロチン生成の経時的変化は培養培地から培養液2mlを取り出し、Extrelutに入れ、エーテルで溶出し、エーテル溶出物を得た。生成物の確認は薄層クロマトグラフィー（TLC）（展開溶媒n-ヘキサン：酢酸エチル＝1:1、UVで検出）を用いて行った。
生成物が確認された培養液は、減圧濾過し、濾液と菌体を得た。濾液はソックスレーの連続抽出器を用いてエーテル抽出することによって粗ペスタロチンを得た。
Czapek-pepton培地と生成物の分離方法（図１）
【０００８】
B）種々のアミノ酸による培養
ペスタロチン生成におけるアミノ酸の影響を調べるため実施例１の培地組成中のポリペプトンの代わりに18種類の0.5%アミノ酸（glycine、L-alanine、L-valine、L-leucine、L-isoleucine、L-phenylalanine、L-serine、L-threonine、L-cystine、L-methionine、L-tyrosine、L-tryptophane、L-aspartic acid、L-glutamic acid、L-lysine、L-arginine、L-histidine、L-proline）のいずれか一つを加えたものとCzapek-pepton、ポリペプトン、ミネラルのみの２１種類の培地を作り、培養を行った。
その結果、図２に表す様にglycine、L-alanine、L-valine、L-leucine、L-phenylalanine、L-serine、L-threonine、L-prolineに菌の生育がみられ、薄層クロマトグラフィーを行ったところ、ペスタロチン生成は、glycine、L-alanine、L-phenylalanine、L-serine、L-threonine、およびL-prolineの培地でみられた。また、生成物量はCzapek-pepton培地  23.4 mg、polypeptone  2.4 mg、L-proline  3.2 mgであった。
以上の結果から、L-prolineが、ペスタロチン生成に大きく影響しているのが分かった。
【０００９】
C）ペスタロチンの生成：L-proline代謝物の同定
Czapek-pepton培地のポリペプトンをL-prolineで置換した培地（50 ml x 20本）にP. sclerotiorumを植菌し、30℃で約15日間静置培養した。３回の培養を繰り返した後、常法に従ってL-proline代謝物（656 mg）を得た。
このものを展開溶媒としてn―ヘキサン：エーテル（100:0、75:25、50:50、40:60、30:70、20:80、0:100）、アセトン、酢酸エチル各100 mlを用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 cm x 2.0 cm i.d.）を行った。その結果を表１に要約した。この段階で精製ペスタロチンは169 mg（回収率約26%）であった。全体としての収量は538 mgで回収率は82 %（538/656 x 100）であった。
【００１０】
【表１】
2006246756.tif 000003
【００１１】
D）フラクション8のみを溶出溶媒としてn―ヘキサン：エーテル（100:0、50:50、0:100、0:100）、アセトン各100 mlを用いて、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（15 cm x 2.0 cm i.d.）を行った。
それぞれのフラクション（Fra.）をFra. 8-1〜Fra. 8-5とした。その結果を表２に要約した。Fra. 8-3と8-4を集め、減圧乾燥させたところ、板状結晶が得られ、このサンプルのNMR(H1), NMR(C13)、質量分析、比旋光度、Ｘ―線構造解析で構造を確認したところ、文献記載のデータからペスタロチンと同定された（McGahren, W. J. et al, J. Org. Chem., 1973, 38, 3542、Kimura, Y. et al, Agric. Biol. Chem. 1980, 44, 451）。
収量は203.3 mgであった。
【００１２】
【表２】
2006246756.tif 000004
【００１３】
さらに、アセトン溶出区分（Fra. 8-5）を再々シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行いペスタロチンの結晶49mgを得た。その結果を表３に要約した。以上三度のシリカゲルコラムクロマトグラフィーの結果、ペスタロチン315 mgを得た。最初のエーテル抽出物から回収率48％であった（315 mg/656 mg x 100）。
【００１４】
【表３】
2006246756.tif 000005
【００１５】
E）グルコース、ショ糖の濃度（3.0%と6.0%）のペスタロチン生成に及ぼす影響
Czapek-pepton培地50mlで培養したP. sclerotiorumの培養液をグルコース3.0%、6.0%およびショ糖3.0%、6.0%の濃度の培地で５本ずつを置換培養し、16日間静置培養した。その後、グルコースとショ糖を濃度別に濾過し、塩析条件にて酢酸エチルで抽出し、脱水、濃縮後、TLCでペスタロチン生成量として秤量した。その結果を表４に示した。
【００１６】
【表４】
2006246756.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００１７】
微生物の培養によりペスタロチンを合成することができるので、温和な条件で製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Penicillium sclerotiorumの培養方法とペスタロチンの精製方法を示す図である。
【図２】種々のアミノ酸を用いて培養を行った時のペスタロチンの生成量(mg)を示す図である。
【図１】
2006246756.tif 000007
【図２】
2006246756.tif 000008