(57)【要約】【課題】溶離液試料中の完全なウイルス粒子の数の測定方法の提供【解決手段】クロマトグラフィー操作からの溶離液試料中の完全なウイルス粒子の数を測定する方法であって、ａ）選択された吸光度においてウイルス粒子の数の標準曲線を作成し；ｂ）ウイルス粒子を含む試料についてアニオン交換樹脂にてクロマトグラフィーを行い；ｃ）上記の選択された吸光度における段階（ｂ）のクロマトグラフィーをモニターし；ｄ）段階（ｃ）で得られた吸光度値を段階（ａ）の標準曲線と比較することによって溶離液のウイルス粒子の総数を測定することからなる方法。【選択図】図４
2006271396.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィー操作からの溶離液試料中の完全なウイルス粒子の数を測定する方法であって、
ａ）選択された吸光度においてウイルス粒子の数の標準曲線を作成し；
ｂ）ウイルス粒子を含む試料についてアニオン交換樹脂にてクロマトグラフィーを行い；ｃ）上記の選択された吸光度における段階（ｂ）のクロマトグラフィーをモニターし；
ｄ）段階（ｃ）で得られた吸光度値を段階（ａ）の標準曲線と比較することによって溶離液のウイルス粒子の総数を測定する
ことからなる方法。
【請求項２】
クロマトグラフィー操作がポリスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー支持体に共有結合で結合したＱＡＥ基をもつアニオン交換樹脂において行われる請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶離液試料中の完全なウイルス粒子の数の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
遺伝子療法による疾患の治療は、理論上の事から実際的な領域に移行した。最初の人間の遺伝子療法の試みは、１９９０年９月に開始され、そして、アデノシン・デアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子を、この酵素が欠損する患者のリンパ球に転移させることが含まれた。ＡＤＡ活性の不足は、免疫欠損を生じさせる。治療遺伝子を罹患した細胞に届けるための幾つかの方法において、ウイルスベクターは、特に有望であった。腫瘍サプレッサー遺伝子は、癌細胞を治療するために研究されている。そのような腫瘍サプレッサー遺伝子を含むウイルスベクターは、潜在的な治療物としてガン療法の分野において評価されている。最近、アデノウイルス・ベクターは、そのような腫瘍サプレッサー遺伝子と他の生体応答調節剤の産生のために有利なベクターとして、特に注意を払われた。ガン遺伝子療法の研究が臨床試験に移るにつれて、ますます多量の精製されたウイルスベクターが必要とされる。そのような試験のために適当な量のベクターを産生する際の一つの問題は、ウイルス粒子が産生される細胞溶菌液からの粒子の精製である。
【０００３】
とりわけ、これらのベクターの精製は、歴史的には、密度に基づく超遠心分離法を使用することにより実行された。この方法は、調査道具として使用するために有効であると判明したが、それは工業的規模の産生のための方法として実行可能ではない。新しい精製スキームを開発することができない限り、将来における物質の需要に合致させることは、禁止的費用をもたらすであろう。超遠心分離法に代わるもののうちの一つは、感染性ウイルス粒子の精製のためのクロマトグラフィー的技術である。
【０００４】
いろいろな植物ウイルスの精製のためのサイズ排除(size exclusion)クロマトグラフィーの使用は、独自技術として、又は、増加密度勾配遠心分離法(augment density gradient centrifugation)〔アルブレヒトセン（Albrechtsen）ほか，J.Virological Methods 28:245-256(1990)；及びヘウィッシュ(Hewish)ほか，J.Virological Methods 7:223-228(1983)に対して示された。サイズ排除は、ウシ乳頭腫ウイルスに対する有望性を示し〔ジョ
ルス（Hjorth）及びメレノ−ロペズ(Mereno-Lopez),J.Virological Methods 5:151-158(1982)〕 ；そして、ダニ脳炎ウイルスの精製のための優れた方法であることが示された〔
クロークス(Crooks)ほか，J.Chrom.502:59-68(1990)〕。サイズ排除クロマトグラフィー
の使用は、普及するまでには至らなかったが、しかし、現在、組換え体レトロウイルスの大規模産生のために使用されている〔メント，エス．ジェイ．(Mento,S.J.)，ヴィアゲン，インコーポレーテッド（Viagene,Inc．：１９９４ヴィリアムスブルク バイオプロセッシング コンファレンス（1994Williamsburg Bioprocessing Conference）で報告された）。アフィニティークロマトグラフィー（大部分はモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を使用する）が、ウイルス起源の抗原の精製のための有効な方法であると報告された〔ナジャユー(Najayou)ほか，J.Virological Methods,32:67-77(1991)〕。ダイズ・モザイクウイルス
（ｐＨ３を耐えぬくことができるウイルス）は、Ｍａｂアフィニティークロマトグラフィーを使用して回収することができる〔ディアコ(Diaco)ほか，J.Gen.Virol.67:345-351(1986)〕。ファウラー(Fowler)〔J.VirologocalMethods,11:59-74(1986)〕は、エプシュタイン・バール(Bpstein Barr)ウイルスを精製するために、アフィニティークロマトグラフィーと密度勾配遠心分離法を使用した。
【０００５】
アデノウイルスは大きく（約８０ｎｍの直径）、且つ幾分脆い。構造と機能との関係を
扱っている大きい文献ベースが蓄積された〔総説としては、フィリプソン(Philipson)，Virology 15:263-268(1961)及びホルウィッツ(Horwitz)，Virology（第二版）レーヴン・
プレス・リミテッド(Raven Press Ltd)，ニューヨーク(1990)参照〕。生きているアデノ
ウイルスのクロマトグラフィー的精製については、前記文献の中では、殆ど何も報告されなかった。ハルナ(Haruna)ほか〔Virology 13：264-267(1961)〕は、タイプ１，３及び８アデノウイルスの精製のためにＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを使用することを報告し、そしてクレンペラー（Klemperer）及びパーラー(Pereir)〔Virology 9:536-545(1959)〕及びフィリプソン(Philipson)〔Virology 10:459-465(1960)は、他の種類のアデ
ノウイルスで同じ方法を使用することは困難であると報告した。貧弱な分解能と貧弱な収量は、この方法が持つ重要な問題であり、この事が、大規模な産生における前記方法の使用を妨げた。
【０００６】
このように、アデノウイルス・ベクターのようなウイルスベクターを精製するためのクロマトグラフィー的方法に対する必要性が存在する。
【非特許文献１】J.Virological Methods 28:245-256(1990)、アルブレヒトセン（Albrechtsen）ほか
【非特許文献２】J.Virological Methods 7:223-228(1983)、ヘウィッシュ(Hewish)ほか
【非特許文献３】J.Virological Methods 5:151-158(1982)、ジョルス（Hjorth）及びメレノ−ロペズ(Mereno-Lopez)
【非特許文献４】J.Chrom.502:59-68(1990)、クロークス(Crooks)ほか，
【非特許文献５】１９９４ヴィリアムスブルク バイオプロセッシング コンファレンス（1994Williamsburg Bioprocessing Conference）、メント，エス．ジェイ．(Mento,S.J.)，ヴィアゲン，インコーポレーテッド（Viagene,Inc．）
【非特許文献６】J.Virological Methods,32:67-77(1991)、ナジャユー(Najayou)ほか
【非特許文献７】J.Gen.Virol.67:345-351(1986)、ディアコ(Diaco)ほか
【非特許文献８】J.VirologocalMethods,11:59-74(1986)、ファウラー(Fowler)
【非特許文献９】Virology 15:263-268(1961)、フィリプソン(Philipson)
【非特許文献１０】Virology（第二版）レーヴン・プレス・リミテッド(Raven Press Ltd)，ニューヨーク(1990)、ホルウィッツ(Horwitz)
【非特許文献１１】Virology 13：264-267(1961)、ハルナ(Haruna)ほか
【非特許文献１２】Virology 9:536-545(1959)、クレンペラー（Klemperer）及びパーラー(Pereir)
【非特許文献１３】Virology 10:459-465(1960)、フィリプソン(Philipson)
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約
遺伝子療法の成功した実例における一つの障害は、治療遺伝子を摘出するための精製されたウイルスベクターの入手可能性である。本発明は、治療遺伝子を含むウイルスベクターを含む細胞溶菌液を酵素処理し；第一の樹脂上で、酵素処理された細胞溶菌液をクロマトグラフィーに付し；そして、第一のカラムからの溶出液を、第二の樹脂上でクロマトグラフィーに付すこと：からなる三段階法を使用することにより、治療遺伝子を含むウイルスベクターを、治療の及び／又は予防の用途のために充分に精製することができるという、予想外で驚くべき発見により、前記の問題を解決する。治療遺伝子を有する、結果として得られる精製されたウイルスベクターは、クロマトグラフィー的処理の間及び後に、その感染性を保持し、そして、遺伝子転移を行なうことができる。本発明の精製方法を使用することにより初めて、治療遺伝子を含むクロマトグラフ的に精製されたウイルスベクターは、三日超遠心分離法(three day ultracentrifugation)を使用して精製されたウイル
スベクターと同程度に純粋で且つ活性であることが判った。本発明の精製方法は、精製さ
れたウイルスベクターの品質、一貫性、減少された工程時間、及び多量の試料を加工する能力を包含する、既存の方法を越える幾つかの利点を提供する。更に、この新しい精製スキームは、ビリオンの表面特性に基づくので、この新しい精製スキームは、異なる治療遺伝子で異なる内部ＤＮＡ構造物を含むビリオンにだけでなく、本発明の教示を使用する他のビリオンに広く適用できる。この破過時間精製方法(break-through purification method)は、遺伝子療法のバルクな商業化において重要な観点である。
【０００８】
本発明は、クロマトグラフィー操作からの溶離液試料中の完全なウイルス粒子の数を測定する方法であって、
ａ）選択された吸光度においてウイルス粒子の数の標準曲線を作成し；
ｂ）ウイルス粒子を含む試料についてアニオン交換樹脂にてクロマトグラフィーを行い；ｃ）上記の選択された吸光度における段階（ｂ）のクロマトグラフィーをモニターし；
ｄ）段階（ｃ）で得られた吸光度値を段階（ａ）の標準曲線と比較することによって溶離液のウイルス粒子の総数を測定する
ことからなる方法である。
本発明の好ましい態様は、クロマトグラフィー操作がポリスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー支持体に共有結合で結合したＱＡＥ基をもつアニオン交換樹脂において行われる前記方法である。
したがって、本発明は、遺伝子療法の際に使用するための治療遺伝子を含むウイルスベクターの精製方法に関連する。一つの態様において、本発明は、治療遺伝子を含む組換え体ウイルスベクターの、細胞溶菌液からの精製方法であって、ａ）非被包性(unencapsulated)のＤＮＡとＲＮＡの両方を選択的に分解する酵素的試薬を用いて前記溶菌液を処理し；ｂ）第一の樹脂上で、工程ａ）からの処理された溶菌液をクロマトグラフィーに付し；次いでｃ）第二の樹脂上で、工程ｂ）からの溶出液をクロマトグラフィーに付し；この場合、一方の樹脂はアニオン交換樹脂であり、そして、他方の樹脂は、固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ；immobilizedmetal ion chromatography）樹脂である、方
法に関連する。
別の関連する態様において、疎水的相互作用クロマトグラフィー(hydrophobic interaction chromatography)樹脂で固定化金属イオン・クロマトグラフィー樹脂を代用してよく、及び／又はカチオン交換樹脂でアニオン交換樹脂を代用してよい。
【０００９】
別の関連する態様において、酵素的に処理された細胞溶菌液は、三段階法に第四工程を加える濾過工程を経る。
【００１０】
より好ましい関連する態様において、精製されているウイルスベクターは、治療遺伝子を含むアデノウイルス・ベクターである。更に一層好ましい態様において、アデノウイルス・ベクターは、腫瘍サプレッサー遺伝子を含む内部ＤＮＡ構造物を有する組換え体タイプ５のアデノウイルスである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、
ａ）細胞溶菌液を非被包性ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を選択的に分解する酵素性薬剤で処理し；ｂ）段階ａ）からの処理された溶菌液に対し第１の樹脂上でクロマトグラフィーを行い；そしてｃ）段階ｂ）からの溶出液に対し第２の樹脂上でクロマトグラフィーを行うことからなり、上記樹脂の一方はアニオン交換樹脂であり、そして他方は固定化金属イオン親和性樹脂である、細胞溶菌液から治療遺伝子を含有する組換えウイルスベクターを精製する方法に関連する。
【００１２】
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルスが複製不全であるように本来のゲノム内
の遺伝子のいくつかまたは全てが除去された組換えウイルスを意味する。
さらに、ウイルスベクターは、遺伝子治療のために所望のヒト細胞に治療遺伝子を移送するためにウイルスベクターが使用されるように、治療遺伝子をコードするＤＮＡを組換えウイルスゲノムが含有しているウイルスを意味する。代表的なベクターは哺乳類、特にヒトの細胞に感染するものを包含し、そしてレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびアビポックスウイルスからなる群から選択されるウイルスから誘導される。レトロウイルスおよびアデノウイルスベクターが好ましい。アデノウイルスベクター、特に２型および５型アデノウイルスベクターが特に好ましい。組換え体５型アデノウイルスベクターが最も好ましい。
【００１３】
「治療遺伝子」は所望の治療効果を有する分子をコードする遺伝子またはその機能的な一部を意味する。例えば、その不在または突然変異のいずれかにより、病的な細胞成長または細胞の増殖における増加を引き起こす遺伝子。本明細書において使用されるような治療遺伝子はそのような不在または突然変異遺伝子に取って代わる。治療遺伝子は、遺伝子が染色体外の位置から細胞により発現されるらうに染色体外に留まるか、または内因性遺伝子と結合するように遺伝子が細胞のゲノム内に組み込まれ得る、いずれかによりそれらの治療効果を引き起こし得る。そのような遺伝子はＲｂ，Ｒｂ突然変異体，ｐ５３，ｐ５３突然変異体，ＤＣＣ，ＮＦ−１，ウイルム腫瘍，ＮＭ２３，ＢＲＣＡ−１，ＢＲＣＡ−２，ＢＲＵＳＨ−１，ｐ５６，Ｈ−ＮＵＣ，甲状腺ホルモンレセプター遺伝子、レテン酸レセプター遺伝子，ｐ１３０，ｐ１０７およびｐ８５をコードする遺伝子からなる群から選択されるものを包含する腫瘍サプレッサー遺伝子を含む。他の遺伝子置換または補足戦略はアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、種々のサイトカイン、例えばγ−インターフェロン、α−インターフェロン、ＩＬ−２および他のホルモンをコードする遺伝子を包含する。
【００１４】
治療遺伝子はまた、リボザイムをコードするＤＮＡを包含すると理解される。
そのようなＤＮＡ構築体は選択された正に作用する成長調節遺伝子、例えば（１）ｃ−ｍｙｃ，ｃ−ｆｏｓ，ｃ−ｊｕｎ，ｃ−ｍｙｂ，ｃ−ｒａｓ，ＫｃおよびＪＥからなる群から選択されるが、それに限定されない腫瘍遺伝子または原（プロト）腫瘍遺伝子；（２）表皮成長因子、血小板誘導成長因子、トランスフェリンおよびインシュリンからなる群から選択されるが、それに限定されない成長因子レセプター遺伝子のＲＮＡに結合し、そして破壊するＲＮＡ酵素をコードする。
【００１５】
好ましい治療遺伝子は腫瘍サプレッサー遺伝子であり、最も好ましい腫瘍サプレッサー遺伝子はＲｂ，Ｒｂ突然変異体，ｐ５３，ｐ５３突然変異体，ＢＲＵＳＨ−１，ｐ５６，ＢＲＣＡ−１，ＢＲＣＡ−２，ｐ１６およびｐ２１である。
【００１６】
「細胞溶菌液」という用語は、ベクター、好ましくはウイルスベクターを含有する宿主細胞等の細胞であって、該細胞はそれらの成長環境から取り出され、そして物理的または化学的手段によりそれらの細胞膜が破壊された細胞の集合体を意味する。
【００１７】
「酵素性薬剤」という用語は、非被包性ＤＮＡおよびＲＮＡを選択的に分解するが、組換えウイルスベクターをそれらが感染性ではなくなり、そして所望の標的細胞に治療遺伝子の無傷のコピーを移送することができなくなる程度まで分解しない化合物または混合物を意味する。そのような酵素性薬剤は一般的にはエンドヌクレアーゼまたはＤＮアーゼもしくはＲＮアーゼと呼ばれる１種またはそれ以上の酵素の組合せである。ベンゾナーゼ（登録商標，Benzonase）は好ましい酵素性試薬である。
【００１８】
「アニオン交換樹脂」という用語は不活性ポリマー支持体に共有結合により架橋結合した正に荷電した有機部分を意味する。代表的な有機部分は第一、第二、第三および第四ア
ミノ基、例えばトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）および他の基、例えば約５ないし約９のｐＨ範囲内の正の形式電荷を既に有するか、または有するであろうポリエチレンイミン（ＰＥＩ）から引き出される。
【００１９】
同様に代表的な負に荷電した有機基はカルボキシメチル基およびスルホニルメチル基および約５ないし約９のｐＨ範囲内の負の形式電荷を有するか、または有するであろう他の基からなる群から選択される。
【００２０】
支持体材料は容易に誘導化され得、かつ、良好な機械的強さを有するものであるべきである。該材料は天然のポリマー物質、合成ポリマーもしくはコポリマー、または天然ポリマーと合成ポリマーの混合物であってよい。上記支持体は多孔性または非多孔性粒子、ビーズ、膜、ディスクまたはシートの形状を採り得る。
【００２１】
そのような支持体はシリカ、親水性ポリマー〔モノビーズ（登録商標，MonoBeads），
ファルマシア，ピスカタウェィ，ニュージャージー〕、架橋結合されたセルロース〔例えばセファセル（登録商標，Sephacel）〕、架橋結合されたデキストラン〔例えばセファデックス（登録商標，Sephadex）〕、架橋結合されたアガロース〔例えばセファロース（登録商標，Sepharose）〕、ポリスチレン、またはコポリマー、例えばポリスチレン−ジビ
ニルベンゼンまたはオリゴエチレングリコール、グリシジルメタクリレートおよびペンタエリトロルジメタクリレートから構成されるものであり、それにアクリルアミド誘導体の重合鎖がグラフト化されているもの（後者のコポリマーは「触手（テンタクル）」支持体として知られている）を包含する。
【００２２】
樹脂は伝統的な（重力）カラムクロマトグラフィーまたは放射状または軸方向の流れを用いる高圧液体クロマトグラフィー装置、流動床カラムにおいて、またはスラリー（バッチ）法において使用され得る。後者の方法において、樹脂はデカンテーションまたは遠心分離または濾過またはこれらの方法の組合せにより試料から分離される。ウイルスベクターは塩勾配、好ましくは塩化ナトリウムの勾配により上記樹脂から溶離されて精製され得る。
【００２３】
適当なアニオン交換樹脂の例はＤＥＡＥまたはＤＭＡＥのいずれかで誘導化されたフラクトゲル（登録商標，Fractogel）（イー．メルク，ギッブスタウン，ニュージャージー
）樹脂；ＤＥＡＥ,．ＤＭＡＥまたはＴＭＡＥで誘導化されたフラクトゲル（登録商標）
ＥＭＤテンタクル樹脂；ＤＥＡＥまたはＱＡＥで誘導化されたトヨパール（登録商標，Toyopearl）（トーソーハース，モントゴメリービル，ペンシルバニア）樹脂；Ｑｕａｔ、
ＤＥＡＥまたはＰＥＩで誘導化されたアクチ−ディスク（登録商標，Acti-Disk）（ホワ
ットマン，クリフトン，ニュージャージー）支持体；ＤＥＡＥで誘導化されたセファロース（登録商標，Sepharose）（ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー）樹脂
；ＤＥＡＥで誘導化されたセファセル（登録商標，Sephacel）（ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー）樹脂；ＤＥＡＥまたはＱＡＥで誘導化されたセファデックス（登録商標，Sephadex）樹脂を包含する。好ましいアニオン交換樹脂はＤＥＡＥ基で誘導化されており、そしてさらに好ましいカラムはフラクトゲル、トヨパールおよびストリームライン（登録商標，Streamline）（ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー）ＤＥＡＥ樹脂である。
【００２４】
同様に、「カチオン交換樹脂」という用語は不活性ポリマー支持体に共有結合により架橋結合した負に荷電した有機部分を意味する。代表的な負に荷電した部分はカルボキシメチル（ＣＭ）およびスルホメチル（ＳＰ）基を包含する。約５．０ないし約９．０のｐＨ範囲内の負の形式電荷を既に有するか、または有するであろう他の有機部分はまたこの定
義内に包含される。アニオン交換樹脂のための支持体および使用方法に対する上記記載はカチオン交換樹脂にも同様に当てはまる。適当な市販されて利用可能なカチオン交換樹脂の例は、ＣＭまたはＳＰ基のいずれかに共有結合したセファロース、セファセルおよびセファデックスを包含する。
【００２５】
「固定化金属イオン親和性（アフィニティ）クロマトグラフィー」（"ＩＭＡＣ"）樹脂は金属キレート化基と共有結合で架橋結合した不活性な天然または合成ポリマー支持体を意味する。金属キレート化基は形式的な（＋２）酸化状態で亜鉛、ニッケル、銅、コバルト、カルシウムまたはマグネシウムイオンに結合することが当業界で知られているものである。そのような基はイミノ二酢酸（ＩＤＡ）基、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）基、Ｎ−（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸基、および誘導体例えばＮ−（メチル）、およびＮ−（ヒドロキシメチル）ＩＤＡ基を包含する。これらの基は標準的脂肪族エーテル結合および試薬、例えばビスオキシラン、エピクロロヒドリンおよび１，４−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）ブタンにより天然または合成ポリマー支持体に架橋結合され得る。本発明の方法のために、キレート化基は上記金属（亜鉛が好ましい金属）のいずれかに結合され得る。用語「アニオン交換樹脂」に対して上記した化学的組成、物理的形態およびポリマー支持体の使用方法の記載はＩＭＡＣ樹脂にも同様に当てはまる。架橋結合されたアガロースおよび「触手」支持体が好ましい。ウイルスベクターは、高まる濃度の競合キレート化剤、例えばイミダゾール、ヒスタミン、グリシンまたは塩化アンモニウムを添加することによりＩＭＡＣカラムから溶離され得、また、使用されるｐＨ勾配の範囲の最大最小が約５ないし約９に留まりさえすれば、溶離剤のｐＨは高められても、低められてもよい。当該方法に使用され得る市販されて利用可能な製品の例はアクチ−ディスクＩＤＡカートリッジ（ホワットマン）、フラクトゲルＡＦキレート、およびトヨパールＡＦキレートＩＭＡＣ樹脂を包含する。
【００２６】
さらに、ウイルスベクター、例えば５型アデノウイルスから誘導されるベクターのＤＥＡＥでの精製のための固定化金属親和性イオン樹脂に対する好ましい条件は、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、カルシウムおよびマグネシウムからなる群から選択される２価金属カチオンで荷電された樹脂を有し、そしてさらに、該樹脂はＩＤＡまたはＴＥＤ架橋結合されたアガロース樹脂、特に亜鉛イオンで荷電されたＩＤＡアガロース樹脂である。
【００２７】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（"ＨＩＣ"）は本発明の方法におけるＩＭＡＣ樹脂に取って代えられ得る。そのような樹脂は非極性基、例えば脂肪族エーテルを介して不活性ポリマー支持体に共有結合した低級アルキルまたはアリール基を有する。低級アルキル基、例えばメチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ネオペンチル基、およびオクチル基およびフェニル基は本発明の樹脂上の相互作用基の例である。ブチル基は好ましい相互作用基である。用語「アニオン交換樹脂」に対して上記した化学的組成、物理的形態および支持体の使用方法の記載はＨＩＣ樹脂にも当てはまる。架橋結合されたアガロース、ヒドロキシル化されたポリエーテル、親水性媒体およびシリカは好ましい支持体であり、架橋結合されたアガロースが最も好ましい。ウイルスベクターは低下する塩勾配（硫酸アンモニウムが好ましい塩である）によりＨＩＣ樹脂から溶離されて精製され得る。本発明のために有用な市販されて利用可能であるＨＩＣカラムの例は架橋結合されたアガロースカラム、例えばフェニル−、ブチル−およびオクチルセファロース、およびトヨパール（フェニル，プロピルおよびブチル）およびフラクトゲル（プロピルまたはフェニル）を包含する。
【００２８】
上記したように、本発明に関連してＩＭＡＣまたはＨＩＣ樹脂はアニオン交換樹脂の前または後に使用され得る。前に使用されるならば、ＨＩＣまたはＩＭＡＣ樹脂からの溶出液の塩濃度は、交換樹脂からのウイルス粒子の早期流出を防止するために、約４５０ミリモル未満まで希釈されるべきである。
【００２９】
「緩衝剤」または「緩衝化溶液」という用語は、それが溶液中に存在するならば、酸または塩基が添加された場合に溶液に生じるであろうｐＨの変化を低減または緩和する酸および塩基の混合物を意味する。一つの態様において、細胞溶菌液は緩衝化溶液中に維持される。適当な緩衝剤は約５．０と約９．０の間に得られる溶液のｐＨを維持し得るものである。そのような緩衝剤は市販されて利用可能であり、そしてホスフェート，ＭＥＳ，ＨＥＰＥＳ，ＭＯＰＳ，ボレート，ＴＲＩＳ，ＢＥＳ，ＡＤＡ，ＡＣＥＳ，ＰＩＰＥＳ，ＭＯＰＳＯ，ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ＰＲＯＰＡＮＥ，ＢＥＳ，ＴＥＳ，ＤＩＰＳＯ，ＴＡＰＳ
Ｏ，ＴＲＩＺＭＡ，ＨＥＰＰＳＯ，ＰＯＰＳＯ，ＴＥＡ，ＥＰＰＳ，ＴＲＩＣＩＮＥ，ＧＬＹＣＹＬＧＬＹＣＩＮＥ，ＢＩＣＩＮＥ，ＴＡＰＳ等を包含する。好ましい緩衝剤はホスフェート，ＭＥＳ，ＨＥＰＥＳ，ＭＯＰＳ，ボレートおよびＴＲＩＳを包含し、そしてＨＥＰＥＳが最も好ましい。
【００３０】
ウイルスベクター、例えば遺伝子治療に使用するための５型と呼ばれるアデノウイルスベクターを精製するためのクロマトグラフィーの使用は、塩化セシウム密度勾配超遠心分離に代わる有効手段であることが示されている。この方法論には、品質、一貫性、処理時間の短縮、系の自動化および大量の粗製溶菌液の処理能等の種々の利点がある。本発明に記載された精製スキームはビリオンの表面の特徴に基づいて生成物を選択する。これらの特徴は、例えば構築体内に異なる治療遺伝子を有する異なる内部ＤＮＡ構築体で変化せず、それ故に、類似のクロマトグラフィー応答を導く。換言すれば、クロマトグラフィーはベクター内に挿入された治療遺伝子の性質により影響されない。
【００３１】
アニオン交換樹脂、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換樹脂および疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂は当業者には公知の方法を用いて洗浄される。例えば、ＤＥＡＥはＮａＯＨで最初に、次にＨＣｌで、最後にＮａＣｌで処理される。ＩＺＡＣはＥＤＴＡで最初に、次にＮａＯＨ、ＨＣｌ、ＮａＣｌフラッシュをＨ2Ｏ
と共に各段階の間に処理される。カラムは適当な結合条件を用いて適当な緩衝剤で平衡化される。カラムには、ＤＥＡＥのためのｐＨおよび塩濃度を調整し、そして固定化金属イオン親和性カラムのためのｐＨ、塩濃度および２価金属イオン濃度を調整することにより生成物が樹脂に結合するであろう緩衝剤中の試料が注入される。カラムは洗浄されて混入物が除去され、そして再利用され得る。
【００３２】
本発明と関連する他の態様は、酵素性薬剤での処理後に細胞溶菌液を濾過する追加の段階を包含する。別の関連する態様において、細胞溶菌液はそれを第１の樹脂に注入する（アプライする）前に約５．０と約９．０の間のｐＨにベンゾナーゼでの処理に先立ち緩衝化される。これらの態様はレトロウイルスまたはアデノウイルスのいずれかから誘導される組換えウイルスベクターの精製のために好ましく、そして特にベクターがアデノウイルスから誘導される場合が好ましく、そしてそのようなベクターは腫瘍サプレッサー遺伝子を含有する。
【００３３】
腫瘍サプレッサー遺伝子を含有するアデノウイルス誘導ベクターを精製するための他の態様は、処理後の緩衝化細胞溶菌液がアニオン交換樹脂上で最初にクロマトグラフィーが行われ、次いで固定化金属親和性樹脂上でクロマトグラフィーが行われる場合のものである。
【００３４】
これらの条件は、組換えウイルスベクターが２型または５型のアデノウイルス、特に５型のアデノウイルスから誘導される場合に特に好ましい。
【００３５】
細胞溶菌液を処理するために使用される酵素性薬剤は１またはそれ以上の酵素であり、特に当業者には公知であるような、ＲＮアーゼおよびＤＮアーゼからなる群から選択され
るもの、またはエンドヌクレアーゼの混合物である。この態様において使用するための好ましい酵素性薬剤はベンゾナーゼ（登録商標，Benzonase）、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方
を切断する組換え非特異的ヌクレアーゼである。
【００３６】
最後に、これまで記載したものの中の特に好ましい関連する方法は、５型アデノウイルス誘導組換えウイルスベクターが野生型ｐ５３遺伝子を含有するゲノムを有する場合である。
【００３７】
本明細書は以下の態様の発明をも包含するものである。
１．細胞溶菌液からの治療遺伝子を含む組換えウイルスベクターの精製方法であって、ａ）上記細胞溶菌液を非被包性ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を選択的に分解する酵素性薬剤で処理すること；
ｂ）段階ａ）からの処理された溶菌液について第一の樹脂にてクロマトグラフィーを行い；ならびにｃ）段階ｂ）からの溶離液について第二の樹脂にてクロマトグラフィーを行うことからなり、上記において一方の樹脂がアニオン交換樹脂であり、他方が固定化金属イオン親和性樹脂である、方法。
２．第一の樹脂がアニオン交換樹脂であり、第二の樹脂が固定化金属親和性樹脂である前記１．に記載の方法。
３．段階（ａ）からの処理された溶菌液をろ過する追加の段階を含む前記２．に記載の方法。
４．第一の樹脂に適用する前に、細胞溶菌液のｐＨを約５．０および約９．０の間に緩衝化する追加の段階を含む前記３．に記載の方法。
５．組換えウイルスベクターがレトロウイルスである前記４．に記載の方法。
６．組換えウイルスベクターがアデノウイルスである前記４．に記載の方法。
７．組換えアデノウイルスベクター中に含まれる治療遺伝子が腫瘍サプレッサー遺伝子である前記６．に記載の方法。
８．組換えアデノウイルスベクターがタイプ２またはタイブ５アデノウイルスである前記７．に記載の方法。
９．組換えアデノウイルスベクターがタイプ５アデノウイルスである前記８．に記載の方法。
１０．腫瘍−サプレッサー遺伝子が野性型ｐ５３遺伝子である前記９．に記載の方法。
１１．アニオン交換樹脂がＤＥＡＥ，ＴＭＡＥ，ＤＭＡＥ，ＱＡＥおよびＰＥＩからなる群から選択される前記３．に記載の方法。
１２．アニオン交換樹脂がＤＥＡＥ樹脂である前記１１．に記載の方法。
１３．固定化金属親和性樹脂がコバルト，ニッケル、銅，亜鉛，カルシウムおよびマグネシウムからなる群から選択される金属の２価カチオンにより荷電している前記３．に記載の方法。
１４．固定化金属親和性樹脂がＴＥＤまたはＩＤＡ樹脂である前記１３．に記載の方法。１５．固定化金属親和性樹脂がＩＤＡ−（架橋化アガロース）樹脂である前記１４．に記載の方法。
１６．二価カチオンが亜鉛である前記１５．に記載の方法。
１７．非被包性ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を選択的に分解する酵素性薬剤が１またはそれ以上の酵素である前記１．に記載の方法。
１８．１またはそれ以上の酵素がエンドヌクレアーゼである前記１７．に記載の方法。
１９．酵素がベンゾナーゼである前記１８．に記載の方法。
２０．細胞溶菌液からの治療遺伝子を含む組換えウイルスベクターの精製方法であって；ａ）上記細胞溶菌液を非被包性ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を選択的に分解する酵素性薬剤で処理すること；
ｂ）段階ａ）からの処理された溶菌液について第一の樹脂にてクロマトグラフィー行い；ならびに
ｃ）段階ｂ）からの溶離液について第二の樹脂にてクロマトグラフィーを行うことからなり、
上記において、一方の樹脂がアニオン交換樹脂であり、他方が疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂であるか；または
一方の樹脂がカチオン交換樹脂であり、他方が疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂もしくは固定化金属イオン親和性樹脂のいずれかである、方法。
２１．一方の樹脂がアニオン交換樹脂であり、他方が疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂である前記２０．に記載の方法。
２２．第一の樹脂がアニオン交換樹脂であり、第二の樹脂が疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂である前記２１．に記載の方法。
２３．一方の樹脂がカチオン交換樹脂であり、他方が固定化金属イオン親和性樹脂である前記２０．に記載の方法。
２４．一方の樹脂がカチオン交換樹脂であり、他方が疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂である前記２０．に記載の方法。
２５．クロマトグラフィー操作からの溶離液試料中の完全なウイルス粒子の数を測定する方法であって、
ａ）選択された吸光度においてウイルス粒子の数の標準曲線を作成し；
ｂ）ウイルス粒子を含む試料についてアニオン交換樹脂にてクロマトグラフィーを行い；ｃ）上記の選択された吸光度における段階（ｂ）のクロマトグラフィーをモニターし；
ｄ）段階（ｃ）で得られた吸光度値を段階（ａ）の標準曲線と比較することによって溶離液のウイルス粒子の総数を測定する
ことからなる方法。
２６．クロマトグラフィー操作がポリスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー支持体に共有結合で結合したＱＡＥ基をもつアニオン交換樹脂において行われる前記２５．に記載の方法。
【実施例】
【００３８】
実験の部
工程１ ＡＣＮ５３標準物質（ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３）
ＡＣＮ５３と命名されている標準組換えアデノウイルス５型はヒトサイトメガウイルスプロモータにより駆動される全長1.4−ｋｂのｐ５３ｃＤＮＡを持つＦ１をコードしてい
る配列を持つ５型アデノウィルスから誘導されたベクターである（Ｗｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１０７９−１０８８（１９９４））。ウイ
ルスは、（Ｌａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５９８−６１４（１９７
１））に記述されている３段階遠心分離法を下記のように変形したものである。感染した細胞を、凍結−解凍の３周期により溶菌しそしてＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂ遠心分離機
中、１５，０００rpmで４℃で１０分間にわたり遠心分離した。ペレットを廃棄し、上澄
み液をＢｅｎｚｏｎａｓｅTMを使用して１３３Ｕ／ｍＬ、室温で３０分間にわたり処理した。次いで、処理した物質を、１０ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ8.1中の1.25ｇ／ｍＬと1.40ｇ／ｍＬのＣｓＣｌ非連続段階勾配上に層状に置き、Ｓｏｒｖａｌｌ ＴＳＴ ４１−１４ロータ中、３０，０００rpm、１０℃で７５分間にわたり遠心分離した。各々の管からのウイル
スバンドを集め、1.35ｇ／ｍＬＣｓＣｌ（１０ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ8.1）と混合し、ＢｅｃｋｍａｎＶＴｉ５０ロータ中、４５，０００rpm，１０℃で遠心分離した。各々の管から
のウイルスバンドを集め、前と同様にして４５，０００rpmで更に４時間にわたり遠心分
離した。この段階からの最後のウイルスプールを、スクロース２％と２ｍＭＭｇＣｌ2を
添加したリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して広範囲に４℃で透析した。精製したウイルスプールをヒト胎芽腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））から購入）に、下記の工程２に記述の通り感染するの
に使用した。
【００３９】
工程２ ＡＴＣＣ２９３細胞の増殖、採取と溶菌
ＡＴＣＣ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）細胞をＣＯ2インキュベータ中、1.5Ｌの下記の組成を持つ培養液中、Ｃｅｌｌ ＦａｃｔｏｒｙTM（Ｎｕｎｃ，Ｒｕｓｋｉｌｄｅ
，デンマーク）中で培養した〔定義した１０％Ｈｙｃｌｏｎｅウシ血清を含むＤＭＥ高グルコース培養液、２ｍＭグルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，Ｃａｌｉｆｏｎｉａ），１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ）で補填した。抗生物質は培養液に添加してない。〕。
Ｃｅｌｌ ＦａｃｔｏｒｙTM接種、二日ないし二日半後に、細胞単層の約５０−６０％が
合流した時に、細胞に新鮮培養液５００ｍＬに細胞当り５ないし１０感染単位を複数回感染（ＭＯＩ）で感染した。ウイルスを培養液に添加し、十分に攪拌し、ユニット中の細胞に導入した。
調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）１からの細胞単層がＣｅｌｌ ＦａｃｔｏｒｙTMの表面
からの剥離の徴候を示した時に（普通は感染後３ないし４日）、ゆっくりと出して細胞を採取し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＪ−６中、１５００rpmで５分間にわたり遠心分離した。それらを血清を含まない培養液で一度洗浄し、再度ペレット化し、超遠心分離−誘導標準ウイルスの調製に使用するための２５ｍＬの５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ8.0／１５０ｍＭＮ
ａＣｌ，２ｍＭＭｇＣｌ2，２％スクロースに再懸濁した。実施例１ないし３を通して使
用する予定の試料は、２５ｍＬの５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ7.５／１５０ｍＭＮａＣｌ，２ｍＭＭｇＣｌ2，２％スクロースに再懸濁した。細胞をこの時点で凍結−解凍の３
周期により溶菌した。３回目の周期に続いて、細胞破片を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＪ−６中
、１５００rpm、４℃での５分間にわたる遠心分離により除いた。
【００４０】
工程３組換えアデノウイルス粒子を含有する試料のウエスタンブロット分析
ＳＤＣ−ＰＡＧＥゲルを実施例３、工程Ｆに記載したのと同様に、銀染色したゲルに大体同じ量を添加して、実施した。次いでバンドを１００％メタノールで予湿潤しそしてＴｒｉｓ緩衝した生理食塩水（ＴＢＳ）中平衡させたＰＶＤＦ膜に移した。そのゲルもＴＢＳ中で平衡させた。タンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄ半乾燥移動装置を２５Ｖで３０分間使用してその膜に移した。次いでその膜を１％カゼイン／0.01％窒化ナトリウムで一夜、４℃又は室温で１時間ブロックし、ＴＢＳで３回洗浄した。その膜を一番目の抗体（Ｃｙｔｉｍｍｕｎｅ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧａ-アデノウイルス５型，Ｌｅｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）５μｇ／ｍＬ（ＴＢＳ中）と共に
１時間にわたり室温で保温した。一番目の保温に続いて、膜をＴＢＳで３回洗浄し２番目の抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇ
ｈｔｓ，ＩＬ）
Ｈｏｒｓｅｒｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ Ｉｇ）１μＬストック抗体／１ｍＬＴＢＳに希釈した）と共に室温で１時間保
温した。最後の３回の洗浄をＴＢＳで実施しそして膜をＡｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ検出試
薬と共に１分間保温し、暗所でいろいろの時間（いろいろの対照を選択をするために数秒ないし数分）、ハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）−ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に露光し、そしてＸ線フィルム現像液中で現像した。
このウエスタンブロット分析を使用して、いろいろの精製状態にあるＡＣＮ５３のバンドパターンの間の相違を図７で見ることができる。
【００４１】
工程４ＳＤＳ存在下の２６０ｎｍにおける吸光度による組換えアデノウイルス粒子数の測定
この測定のために、濃厚ウイルスをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、0.1％ＳＤＳ中
の１０中の１に希釈する。試料を１分間渦攪拌し、Ｅｐｅｎｄｏｒｆｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で１４，０００rpmで遠心分離し沈澱物を除いた。キュベットの合致する対を、ＰＢＳ
緩衝液中0.1％ＳＤＳを使用して、島津ＵＶ１６０Ｕ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ．）上にベースライ
ン走査線を記載することによりブランクを決める。次いでＳＤＳ処理したウイルス試料を試料キュベット中に置きそして２２０ｎｍから３４０ｎｍまで走査した。３１０ないし３２０の間に吸光がある場合は、試料は濃過ぎるので更に希釈しそして再測定した。Ａ250
／Ａ280比もこの走査から決め、そしてそれは粒子数を測定するために十分に純粋である
ことを確実にするためには1.2と1.3の間になければならない。もしこの条件が満たされるならば２６０ｎｍだけにおける吸光度はヴィリオン／ｍＬ数を計算するのに使用される。２６０ｎｍにおける吸光単位当り1.1×１０12粒子の変換係数（Ｍａｉｚｅｌ ｅｔ ａｌ
．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３６：１１５−１２５（１９６８））
は、粒子数を計算するのに約１０％の誤差で使用されていた。アニオン交換クロマトグラフィーだけにかけた試料（即ち、ＤＥＡＥ樹脂を使用する実施例１と２）の典型的な値は1.14ないし1.19の間であった。そのような試料を実施例３に記載したＩＺＡＣに処すると、その比は1.22ないし1.25の範囲にあった。
【００４２】
未カプセル化核酸の溶菌 ヌクレアーゼ処理
感染した細胞の溶菌液は初めは宿主細胞とウイルスの両方の汚染物からなる。
これらの汚染物のあるものは、クロマトグラフィーに先立って除かれる。特に宿主細胞、未カプセル化又は不完全ＡＣＮ５３核酸はＢｅｎｚｏｎａｓｅTMのようなヌクレアーゼを使用する工程のこの段階で酵素的に分解された。これは、二つの理由により工程の早期に実施されてよい。初期のＢｅｎｚｏｎａｓｅTM処理はアニオン交換樹脂における収率を良くする。ＢｅｎｚｏｎａｓｅTMを次の工程段階で除いた。その工程の間のＢｅｎｚｏｎａｓｅの存在は市販のＥＬＩＳＡキット（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＤ）により測定し得る。
処理した溶菌液の清澄化は、遠心分離よりはむしろろ過により実施された。遅い回転を細胞破片を除くのに使用した（図１）。次に１番目のカラム上に載せるための生成物を調製するためにろ過を使用した。使用したろ過材の型（即ち、組成と孔径）とその効果的な生成物回収は実施例３、工程Ａに記載されている定量アニオン交換測定法により評定された。
遠心分離の次は、Ｇｅｌｍａｎ ＳｃｉｅｎｃｅｓのＡｃｒｏｄｉｓｃTM0.8／0.2μｍ
の２段円筒ろ過器を通過するものであった。ＡＣＮ５３の回収は、ろ過に使用された孔径と膜の型に依存した。ポリスルホン膜、ＰＶＤＦ膜と酢酸セルロース膜を基材とする膜のようなろ過材が使用された。ポリスルホンとＰＶＤＦが好ましかった。
この段階での上澄み液を、ＭｇＣｌ2２ｍＭ、スクロース２％（ｗｔ／ｖｏｌ）及びβ
−シクロデキストリン2.5％（ｗｔ／ｖｏｌ）にした。ＢｅｎｚｏｎａｓｅTM（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）は最終濃度１００単位／ｍＬになるまで添加しそして１時間室温で保温した。処理した物質を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＪ−６中、３０００rpmでの１０分間にわたる遠心分離とＧｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓのＡｃｒｏｄｉｓｃTM0.8／0.2μｍのろ過器を通過するろ過により清澄化した。得られた上澄み液を実施例２用に採取した。
【００４３】
アニオン交換クロマトグラフィー
全体を通して、ＤＥＡＥクロマトグラフィーの特性は一貫していることが見出され、そして高濃度溶菌液（３×１０12ＡＣＮ５３粒子／ｍＬ）による負荷試験は注入された体積と回収されたＡＣＮ５３ピーク領域の間で一次応答（ｌｉｎｅａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）
を示した。一次塩勾配（ｌｉｎｅａｒ ｓａｌｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ）の導入によるＤＥＡＥカラムの溶離は３個の主要なピークを示した。これらピークの一番目は約0.5のＡ260／Ａ280比を持つタンパク質ピークであった。次はＡＣＮ５３ピーク（Ａ260／Ａ280＝1.23
）であり、それに続いて、勾配（グラジエント）の末端にＤＮＡ（Ａ260／Ａ280＝２）ピークがあった。
同じピークが、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液又はリン酸塩緩衝系のいずれでも得られた。ｐＨは変更できるが、ＨＥＰＥＳｐＨ７．５／ＮａＣｌ／スクロース／ＭｇＣｌ2を使
用してｐＨ7.5で操作するとより汚染の少ない物質がカラムに吸着される。ＤＥＡＥクロ
マトグラフィーは高程度の初期精製をもたらす。不動化金属イオン精製クロマトグラフィー段階はこれらの汚染物を除く。
カラム樹脂をその分離性能について、6.6×５０ｍｍ（1.7ｍＬ）の硼珪酸ＯｍｎｉｆｉｔTMカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ Ｌｔｄ．，ケンブリッジ、イングランド）中で試験した。
カラムはＰｅｒＳｅｐｔｉｖ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＢｉｏｃａｄTM（ケンブリッジ、ＭＡ）クロマトグラフィーワークステーションで取り付けた。クロマトグラフィーはオンラインで、ｐＨ、電導度と２８０ｎｍと２６０ｎｍの二つの波長における光学密度について追跡、調査された。
アニオン交換樹脂は、１ｍＬ／分において、５０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ7.5，３００ｍ
ＭＮａＣｌ，２ｍＭＭｇＣｌ2，２％スクロースで平衡化された。５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝
液ｐＨ8.0（３００ｍＭＮａＣｌ，２ｍＭＭｇＣｌ2，２％スクロースを含む）も使用された。細胞溶菌液を充填した後、吸光度により追跡してベースラインまで洗浄し、溶離は２０カラム容積の３００−６００ｍＭ一次ＮａＣｌ勾配で実施し、0.5ｍＬのフラクション
を採取した。将来の使用のために、次にカラムを２カラム容量の0.5ＭＮａＯＨ，1.5ＭＮａＣｌ洗浄液で清浄にし次に再平衡化した。
適当な対照保持時間を得るために、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８中で平衡化したＤＥＡＥカラム上に、２ｍＬ／分（３５０ｃｍ／ｈｒ）で、ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３を、注入しそして１０分間（11.7カラム容積の）０−1.5Ｍ一次ＮａＣｌ勾配で溶離した。1.23のＡ260／Ａ280が検出された。このフラクション中に存在するタンパク質バンドはスロット−ブロッ
ト（ｓｌｏｔ−ｂｌｏｔ）分析上のＡｄ５ポリクロナール抗体と反応した。
幾つかのピークを、感染細胞溶菌液試料をＤＥＡＥカラム（図２）に適用した時に分割した。ピークの組成はＡ260／Ａ280吸光比から推測した。例えば１番目のピークは、0.5
のＡ260／Ａ280比を持つので主にタンパク質である。三番目のピークは２のＡ260／Ａ280比を持つので、この物質は核酸であることを暗示している。ＡＣＮ５３ウイルスピークは1.23の比を持って二番目に溶離した。これらのピークの同定は、実験を一部変更しそして各々のピークをＳＤＳゲルに通すことにより確認した。上述の条件を使用する典型的な試験では、1.23±0.8のＡ260／Ａ280比がウイルスピークの特性であることが見出された。
ＤＥＡＥクロマトグラフィーの精製能を評価するために、感染しなかったＡＴＣＣ−２９３細胞溶菌液とＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３の両方をカラムに適用した（図３）。宿主細胞物質の殆どは負荷の間にカラムを通過するか又はＡＣＮ５３の保持時間より早い時間に溶離したというものの、小さいピークがＡＣＮ５３と同じ保持時間に溶離した。これらのデータから、ＡＣＮ５３ピークのウイルス性でない汚染物は、宿主細胞物質からであると期待される。汚染ピーク、即ち図３に示した細胞溶菌液試料中の最後に溶離するピークの検査は、約２のＡ260／Ａ280ｎｍ比であることを明らかにした。これは、そのピークは高い核酸含量を持ちそしてヌクレアーゼ処理により減少又は排除することが可能であることを示している。ＢｅｎｚｏｎａｓｅTM前処理をした又はしないＤＥＡＥ操作は、その酵素がＡＣＮフラクションプール中の宿主細胞からの汚染物の量を減少することを示した。
【００４４】
固定化金属親和性クロマトグラフィー
二価カチオンとして亜鉛原子を使用する（ＩＺＡＣ）固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、高い生成物の回収率を与え、またロードする前のＤＥＡＤ画分プールのあらゆる試料操作を必要としなかった。この方法によって除去される不純物は流出分ピーク中に溶出し、また生成物から良く溶解し、シンンプラープール基準に導く。ＩＺＡＣは再生可能で、またＤＥＡＥを伴って使用されたとき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウエスタンブロッド、Ａ260／Ａ280比および感染しない粒子に対する感染する粒子の比によって特定される、純粋なＡＣＮ５３を得ることが可能である２カラム精製プロトコルを与える。要約された全体のプロトコルは以下のようである。
集菌細胞
↓
ヌクレアーゼ処理
β−シクロデキストリン処理
↓
清浄
↓
ＤＥＡＥクロマトグラフィー
↓
ＩＺＡＣクロマトグラフィー
↓
バッファ交換
全粒子および感染する単位における段階ごとの回収率を実験セクションにおける表１および２に要約する。
固定化亜鉛親和性クロマトグラフィー（ＩＺＡＣ）系を、それぞれの段階後の水でのフラッシングを伴う１００ｍＭ ＥＤＴＡ１体積部および０．２Ｍ ＮａＯＨ１体積部で連続してカラムを洗浄することにより、金属チャージすることに備えた。マトリクスを続いて亜鉛原子で、０．５μＬ／ｍＬ氷酢酸で酸性化されたＨ2Ｏ中の１００ｍＭ ＺｎＣｌ2の
１カラムの体積を注入することによってチャージした。マトリクスをその後５０ｍＭＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５／４５０ｍＭ ＮａＣｌ／２％スクロース／２ｍＭ ＭｇＣｌ2中での平衡化の前に、水中で完全に洗浄した。試料のロードはあらゆる操作を必要とせず、ＤＥＡＥプール画分またはＣｓＣｌ誘導された物質はカラムに直接に注入された。ロード後、カラムを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５／４５０ｍＭ ＮａＣｌ／２％スクロース／２ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2から５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／２％スクロ
ース／２ｍＭ ＭｇＣｌ2への、１０カラム体積の減少するＮａＣｌ線形勾配液で洗浄した。溶出を、１０カラム体積以上が適用された０ないし５００ｍＭの線形グリシン勾配液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ中）で行われた。
ＡＣＮ５３の金属親和性カラムとの相互作用は金属特有の性質（亜鉛原子が好まれる）を示し、チャージされていないカラム（亜鉛原子で前ロードされていないカラム）へのＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３の注入は生成物ピークの流出分へのシフトの結果となった。実施例２画分プールからのＩＺＡＣで精製されたＡＣＮ５３−ＤＥＡＥを図５に示す。ＩＺＡＣ画分プールの分析は４９ないし６５％の収率および１．２２ないし１．２５のＡ260／Ａ280比を生じた。ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３、ＤＥＡＥ精製およびＤＥＡＥ／ＩＺＡＣ精製された物質のゲルおよびウエスタンブロット比較を図６および７に見ることができる。ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３およびＤＥＡＥ／ＩＺＡＣ物質はとても類似しており、またＤＥＡＥのみで精製された物質はこれらの基準よりも純粋でない。
異なるＩＺＡＣバッファおよび溶出系の効果を、ＤＥＡＥ−ＡＣＮ５３プールを半分に分けそして両方の半分をＩＺＡＣでＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５およびＴｒｉｓｐＨ８バッフ
ァ系中で精製することによって評価した。ＩＺＡＣはまた分離に影響することのないスクロースおよびＭｇＣｌ2の存在中でも行った。金属イオンとしての銅および溶出試薬とし
てのイミダゾールの使用もまた試験した（金属親和性クロマトグラフィーの一般的な批評について、Belew et．al．1987、Kato et．al．1986を見よ。）。様々な系、亜鉛／グリ
シン、亜鉛／イミダゾール、銅／グリシンおよび銅／イミダゾールの全てが金属親和性精製カラムで作用した。ＡＣＮ５３をｐＨ７からｐＨ９への勾配液を使用して溶出することができる。
【００４５】
Ａ：アニオン交換ＨＰＬＣによる組換えアデノウイルス粒子数についてのアッセイ
１ｍＬ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａway，NJ）アニオ
ン交換カラムを、様々な試料中のウイルス粒子の数を定量するために使用した。カラムを３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中で１ｍＬ／分の流速で、７１７プラスオートサンプラーおよび９９１発光ダイオード配列検出器（ＰＤＡ）を備えたＷａｔｅｒｓ６２５クロマトグラフィー系で平衡化した。クロマトグラフィーは２１０から
３００ｎｍへ走査するＰＤＡ検出器（Milford，MA）で監視した。標準線を、選択された
吸光度、０．１％ＳＤＳ中のＡ260で全粒子について評価された、ＣｓＣｌ精製されたＡ
ＣＮ５３ビリオンを注入することによって作成した。
アッセイは注入された試料の体積と無関係であった。試料をロードした後、カラムを平衡化バッファの２カラム体積、続いて５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．
５中の３００から６００ｍＭへのＮａＣｌ線形勾配液１０カラム体積以上で洗浄した。勾配液の次に５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中の６００ｍＭ ＮａＣｌでの２カラム体積の洗浄を行った。
それぞれのクロマトグラフィー実行の後に、カラムを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．
５中の１．５Ｍ ＮａＣｌの２．６カラム体積で清浄し、そしてその後次の注入のために
再平衡化した。カラムは粗試料の注入後は０．５Ｎ ＮａＯＨの０．２５ないし１カラム
体積の注入、続く１．５Ｍ 塩での洗浄によって、より強く清浄した。ＮａＯＨの注入お
よびその後の勾配液の流出は清浄を達成するための便利な方法であった。アデノウイルス粒子の存在の全数を測定することにおける前記アッセイの使用を以下の表１に説明する。表１：全ＡＣＮ５３粒子に基づいた収率および精製データ
【表１】
2006271396.tif 000003
a分析的イオン交換により決定
bウイルス粒子数における
c最終配合物への透析後
【００４６】
Ｂ：バッファ条件
バッファ条件の変化を７．０ないし８．０のｐＨ範囲における本研究のカラムクロマトグラフィーによるＡＣＮ５３の精製に使用した（例えば、Seth，Virology 68:1204-1206
（1994））。様々なｐＨ限界での崩壊についての調査を、崩壊についてＴＣＩＤ５０（後述の方法Ｃ）および分析的アニオン交換分析（上述の方法Ａ）によってアッセイすることによって行う。ＡＣＮ５３の生存率についてのバッファ塩濃度の効果は、イオン強度の急激な変化はウイルスの損失を導くことになることを示した。塩濃度は注意深く制御および監視されるべきである。
【００４７】
Ｃ：ＴＣＩＤ50アッセイによる感染する組換えアデノウイルス粒子の測定
これらの実施例において教示される精製法の前、間および後の感染するアデノウイルスＴｙｐｅ５粒子の定量を、終点タイターアッセイ（組織培養感染率−５０％、略号ＴＣＩＤ50）によって行う（Philipson，Virology15: 263-268 (1961)を見よ。）。試薬、物質
リストおよび説明はChemicon International，Inc（cat.#3130:"Adenovirus Direct Immunofluorescence Assayi"，Temecula，CA）から用いることができる。
ＡＴＣＣ２９３細胞を９６穴プレートに、完全ＭＥＭ（１０％子牛血清、１％グルタミン）培養液中にそれぞれの穴について１００μＬの５×１０5細胞／ｍＬをプレートする
。個々のプレートにおいて、１：１０6に希釈されたウイルス試料の２５０μＬのアリコ
ートを第一のカラムに添加し、そしてプレートにわたり連続して２倍に希釈する。一つの列をポジティブ制御（ＣｓＣｌ精製されたＡＣＮ５３）のために、一つの列をネガティブ制御のために保存する。それぞれの穴の１００μＬのアリコートをＡＴＣＣ−２９３種付けプレートにおける同一の位置へ移動し、３７℃で加湿インキュベーターにおいて２日間培養した。培養液をその後反転によってデカントし、そして細胞を５０％アセトン／５０％メタノールの添加で固定した。ＰＢＳでの洗浄後、固定された細胞を４５分間、キットの説明に従って製造されたＦＩＴＣラベルされたアンチ−ａｄ５抗体（Chemicon International #5016）と共に培養する。ＰＢＳでの洗浄後、プレートを蛍光顕微鏡（４９０ｎｍ励起、５２０ｎｍ放射）下で検査し、そしてラベルの存在について得点をつけた。タイターはTiterprint Analysisプログラム（Lynn，Bio Techniques，12:880-881(1994)）を使
用して定量した。本方法に従って行われたアッセイからの結果を以下の表２に説明し、該表は上述の表１からの値を使用して計算された比を包含する。
表２：感染するＡＣＮ５３粒子に基づいた収率および精製データ。
【表２】
2006271396.tif 000004
全ウイルス粒子の感染するウイルス粒子に対する比は製造ごとに広範囲に変化することができる。ＣｓＣｌ誘導されたウイルスについての値は６０ないし８０の範囲である。粗溶解液または半精製画分におけるこの比の計算は、アニオン交換粒子アッセイ（実施例３［Ａ］）を見よ。）によって可能とされた。分析的アニオン交換を使用して、理想的なウイルス粒子の感染するウイルス粒子に対する比における変化を監視することができる。本発明の精製方法を使用して、粗溶解液および続いて精製される物質の全ウイルス粒子の感染するウイルス粒子に対する比を、超遠心分離を使用して得られたものと比較することができる。アッセイの誤差内において、これらの値は等価である。この基準により、クロマトグラフ精製にウイルスは良い耐性がある。他の基準、すなわちＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッド分析（図６および７）により、クロマトグラフ精製は超遠心分離に基づいた方法より優れている。
【００４８】
Ｄ：Ｐ５３タンパク質の発現による感染する組換えアデノウイルス粒子についてのアッセイ
ウイルス製造物の活性をまたＳａｏｓ−２細胞、ｐ５３−ネガティブ骨肉腫細胞ラインにおけるｐ５３遺伝子生成物の発現についてアッセイすることによって試験した。Ｓａｏｓ−２細胞を６穴組織培養プレート中に５×１０5細胞／穴の濃度で培養液、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１０％牛胎児血清を補充されたＫａｉｇｈｎ'ｓ栄養混合物Ｆ１２：Ｄ
ＭＥ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ（１：１混合物）３ｍＬ中に種付けした。細胞を加湿空気
において、７±１％ＣＯ2、３７℃で１６ないし２４時間培養した。使い終った培養液を
除去し、そして１ｍＬの新鮮な培養液で置き換え、そして細胞を精製されたウイルスの２０、４０、または６０ＭＯＩで感染させた。１時間の培養後、さらなる２ｍＬの培養液を添加しそして８時間培養させた。細胞をその後一度Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ−ＰＢＳで洗浄
し、そして５０ｍＭ ｔｒｉｓ／０．５％Ｎｏｒｉｄｅｔ Ｐ−４０／２５０ｍＭＮａＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／５ｍＭ ＮａＦ／５μｇ／ｍＬ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎおよび５μｇ／
ｍＬ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ／２ｍＭ ＰＭＳＦの２５０μＬの添加により溶解した。プレートを氷上で５分間培養し、その後溶解液を個々の１．７ｍＬマイクロ遠心分離チューブに移した。それらを４５秒間１４０００ｒｐｍでミクロヒュージ（microfuge）において回
転降下し、そして上清をｐ５３タンパク質の存在についてウエスタンブロット分析によってプライマリーアンチ−ｐ５３モノクローナル抗体１８０１（Vector Laboratories，Burlingame，California）および羊アンチ−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ並びにストレプトアビジ
ン（streptavidin）−ＨＲＰ（Amersham）の１：１混合物でアッセイした。ｐ５３タンパク質バンドをＡｍｅｒｓｈａｍ'ｓ ＥＣＬ検出キットを使用して、製造者説明に従って検出した。前記アッセイの使用の結果を図８に示す。ｐ５３の発現は、ＤＥＡＥクロマトグラフィーによって並びにＤＥＡＥおよびＩＺＡＣクロマトグラフィーの両方によってのみ精製されたＡＣＮ５３において見ることができる。（レーン５および６における低いレベルの発現は、これらの試料がＤＥＡＥ試料よりも低いＭＯＩで行われた事実のためである。）
【００４９】
Ｅ：宿主細胞タンパク質汚染物
宿主細胞汚染物をウエスタンブロッド分析によってＡＴＣＣ−２９３細胞成分に対して発生分化されたポリクローナル抗体を使用してアッセイした。ポリクローナル抗体を商業的に得、そして様々な２９３種の細胞抗原（HTI，Ramona，CA）に対して育成した。結果
はＣｓＣｌまたはＤＥＡＥ−ＩＺＡＣ精製の最終精製物は、検出可能な宿主細胞汚染物を含まないことを示した。半精製ＤＥＡＥ−ＡＣＮ５３の場合、精製プールにおいて見られる少量の免疫性汚染物、３本の主なバンドおよびいくつかの小さいものが存在した。宿主細胞汚染物の大部分はＤＥＡＥ段階の流出分中に回収される。ＡＣＮ５３でＤＥＡＥ段階において補助精製された汚染物を亜鉛親和性クロマトクラフィーによって除去し、そしてグリシン勾配液の挿入前にＩＺＡＣ流出画分中に回収した。
【００５０】
Ｆ：組換えアデノウイルス粒子を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析試料
クーマシ−青着色のために、１００ないし２００μＬのアデノウイルス含有試料（約１×１０11粒子／ｍＬ）を収集し、トリクロロ酢酸沈殿により、または透析および続くスピード−バック（speed-vac）における濃縮により脱塩する。試料をその後ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ還元バッファ（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ６．８、２０％グリセロール、４
％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．００５％ブロモフェノール青、０．５％β−メルカプトエタノール）中で約３０μＬに再懸濁し、５分間煮沸しそして１ｍｍ×１０穴Ｎｏｖｅｘ ８な
いし１６％勾配Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍｉｎｉｇｅｌにロードした。試料を１．５
時間１４０Ｖで電気泳動した。ゲルをその後４０％メタノール／１０％酢酸中で３０分間固定し、そしてその後クーマシーをＰｒｏ−Ｂｌｕｅ着色系（Integrated Separation Systems，Natick MA）で販売者の方法に従って着色した。
銀着色されるゲルに５ないし１５μＬの試料をロードした。試料を当体積の還元バッファと共に煮沸し、そしてクーマシー検出について記載したように電気泳動した。固定はゲルを１０％トリクロロ酢酸中で１時間処理し、続いて１８ｍｅｇｏｈｍに精製された水中で３回洗浄することにより行った。ゲルはＤａｉｉｃｈｉ銀着色キットで与えられた説明（Integrated Separation Systems）に従って着色された。
【００５１】
ベクターの感染性、治療的遺伝子の移動 ＤＥＡＥ−ＩＺＡＣ−ＡＣＮ５３の評価は、
ビリオンがＴＣＤＩＤ50によって測定されたようにクロマト処理の間にそれらの感染性を
保ち（表１、２）、そしてＳａｏｓ−２細胞におけるＰ５３タンパク質発現によってアッセイされたように遺伝子移動を生じることができるこを示している。このＤＥＡＥ−ＩＺＡＣ−ＡＣＮ５３のＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける比較は、ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３において存在するより低分子量のタンパク質バンドが存在することを示している。異なるＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３ロットの互いに横に並べた比較は、クロマトグラフィー的に生成された物質がとても良く合致するのに対して、いくらかのバッチ毎の変化性を示している。感染する粒子に対する全体の比および両方の種類の物質の吸収スペクトルは直接比較できる。クロマトグラフィー的に生成されたＡＣＮ５３の純度および活性についての評価は、１日の２カラム方法は３日の超遠心分離プロトコルに置き換わることができることを示している。
ＡＣＮ５３について上述で示されたような好ましい精製計画は、クロマトグラフィー段階の前に感染された細胞溶解液をＢｅｎｚｏｎａｓｅTMで処理するものである。清浄がその後０．８μｍおよび続く０．２μｍ膜を通るろ過段階によって行われる。もし必要ならば、大孔（例えば、５μｍ）前ろ過段階を、さらなる粘性懸濁のために追加することができる。ｐＨ７．５／３００ｍＭＮａＣｌへの調整がその後ＤＥＡＥカラムへのロードのための準備において行われる。Ａ260／Ａ280ｎｍ比によって、または特性発光ダイオード配列スペクトルによって検出されるような精製物ピークはプールされ、そして亜鉛−チャージされ等浸透圧に平衡化された金属親和性カラムに直接に注入される。バッファのイオン強度はその後、グリシン勾配液での生成物の溶出の前に、ほぼホスフェートバッファされた食塩水（およそ１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に徐々に低下される。この物質がその後最終配
合物へと透析される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
図の簡単な説明
【図１】図１：４°で、エッペンドルフ(Bppendorf)遠心分離機モデル５４１５ｃ中で、異なる速度で５分間遠心分離された粗感染細胞溶菌液の上澄からのＡＣＮ５３の回収。ＡＣＮ５３に対する分析は、分析的アニオン交換により行なった。
【図２】図２：ＡＣＮ５３感染細胞溶菌液成分の同定、並びに６０／２８０ｎｍ吸光度比を使用する二重波長紫外線吸光度による、ＤＥＡＥクロマトグラフィーによる分離。
【図３】図３：ＤＥＡＥ精製の間の、ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３対照及び宿主−細胞汚染物質保持時間。ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３の溶出は、ＤＥＡＥカラム上でクロマトグラフィーに付された非感染Ｈ２９３宿主細胞溶菌液ブランクの溶出と比較される。
【図４】図４：ＤＥＡＥ−ＡＣＮ５３分画プールのブチル−疎水的相互作用クロマトグラフィー(Butyl-Hydrophobic Interaction Chromatography)。半純粋のＤＥＡＥ精製されたＡＣＮ５３分画プールを、５０ｍＭトリス／ｐＨ８．０／３Ｍ硫酸アンモニウムの等容量と混合し、次いで、トソハース・ブチル−６５０Ｍ(TosoHaas Butyl-650M)カラム上に注射し、次いで、１．５〜０Ｍに減少する硫酸アンモニウム勾配で溶出した。
【図５】図５：ＤＥＡＥ−ＡＣＮ５３分画プールの固定化金属アフィニティー・クロマトグラフィー。半純粋のＤＥＡＥ精製されたＡＣＮ５３分画プールを、ＺｎＣｌ2が投入された６．６×５０ｍｍトソハースＡＦキレート６５０Ｍ(TosoHaas AF chelate 650M)カラム上に注射し、次いで、直線状の０〜５００ｍＭグリシン勾配で溶出した。
【図６】図６：カラムクロマトグラフィー及びＣｓＣｌ−超遠心分離法から誘導されたＡＣＮ５３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ対照。試料は、８〜１６％勾配ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動され、次いで、分析のために銀で染色した。レーン２及び３は、各々、ＤＥＡＥ及びＩＺＡＣ溶出液プールである。レーン４〜６は、ロット間の一貫性を調べるための、ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３ランの三つの異なるロット（ＣｓＣｌ−１，ＣｓＣｌ−２及びＣｓＣｌ−３）を順に示す。レーン７（ＣｓＣｌ−イオン交換処理されたロット）は、イオン交換処理されたロットを誘導したＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３の試料が、リソースＱアニオン交換ＨＰＬＣカラム〔Resource Q，パーマシア(Pharmacia)〕上で精製される場合に回収されるＡＣＮ５３ピークを示す。レーン１及び８は、標準の分子量マーカーである。
【図７】図７：カラムクロマトグラフィー及びＣｓＣｌ−超遠心分離法から誘導されたＡＣＮ５３のウェスターン・ブロット(Western Blot)対照。先に記載された試料と同一の試料は、８〜１６％勾配ゲル上で電気泳動され、次いで、ＰＶＤＦ膜に移動された。このブロットを、最初に５μｇ／ｍｌシチムン(Cytimmune)ウサギ１ｇＧ抗アデノウイルスタイプ５抗体と共にインキュベートし、次いで、抗−ウサギ１ｇと結合したアマーシャムのカラシペルオキシダーゼ(Amersham's horseradish peroxidase)と共にインキュベートし、そして電気化学的検出を使用して展開した。
【図８】図８：Ｓａｏｓ−２細胞中のｐ５３遺伝子生成物の形質発現。クロマトグラフィー的に産生されたＡＣＮ５３の二つの異なるロットは、ｐ５３−ｎｕｌ１・Ｓａｏｓ−２細胞への遺伝子転移を起こす能力に関して、ウェスターン・ブロットによって分析された。半純粋のＤＥＡＥ分画は、レーン７及び８に、最終生成物はレーン５及び６に示される。ｐ５３−発現ＳＷ４８０細胞は、正の対照として使用された；非感染Ｓａｏｓ−２細胞は、負の対照として使用された。
【図１】
2006271396.tif 000005
【図２】
2006271396.tif 000006
【図３】
2006271396.tif 000007
【図４】
2006271396.tif 000008
【図５】
2006271396.tif 000009
【図６】
2006271396.tif 000010
【図７】
2006271396.tif 000011
【図８】
2006271396.tif 000012