(57)【要約】【課題】目的生産物の新規な生産増強方法の提供。【解決手段】組換えデオキシリボ核酸技術により問題のタンパク質を発現するための発現ベクターであって、前記ベクターは少なくとも１つの優性の選択可能なマーカーからなり、ここで前記マーカーの翻訳開始部位は次の配列：    -3       +1    Pyxx ATG Pyxx  ここで「Py」はピリミジンヌクレオチドであり、「ｘ」はヌクレオチドであり、そして数字の表示はコドン「ATG 」に関係する、ならなる、発現ベクター、の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えデオキシリボ核酸技術により問題のタンパク質を発現するための発現ベクターであって、前記ベクターは少なくとも１つの優性の選択可能なマーカーからなり、ここで前記マーカーの翻訳開始部位は次の配列：
-3       +1
Pyxx ATG Pyxx
ここで「Py」はピリミジンヌクレオチドであり、「ｘ」はヌクレオチドであり、そして数字の表示はコドン「ATG 」に関係する、ならなる、発現ベクター。
【請求項２】
問題のタンパク質をコードする核酸配列が前記優性の選択可能なマーカーに共連鎖している、請求の範囲第１項記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記優性の選択可能なマーカーが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギンシンセターゼ、サルモネラ（Salmonella) hisD遺伝子、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンＢリン酸転移酵素、およびネオマイシンリン酸転移酵素から成る群より選択される、請求の範囲第１項記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記翻訳開始部位の配列がTxxATGCxx, CxxATGCxx, CxxATGTxx 、およびTxxATGTxx から成る群より選択され、ここで「ｘ」はヌクレオチドであり、ただしATG コドンの下流のコドン「Txx 」は停止コドンをコードしない、請求の範囲第１項記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記翻訳開始部位の配列がTxxATGCxx であり、ここで「ｘ」はヌクレオチドである、請求の範囲第１項記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記翻訳開始部位の配列がTCCATGCTT である、請求の範囲第１項記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記翻訳開始部位の配列が二次構造内に位置する、請求の範囲第１項記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記翻訳開始部位の配列が前記開始部位のATG 開始コドンの約1000ヌクレオチド内の少なくとも１つのフレーム外の開始コドンをさらに含み、ただしフレーム内の停止コドンが前記1000ヌクレオチド内に位置しない、請求の範囲第１項記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記翻訳開始部位の配列が前記開始部位のATG 開始コドンの約350 ヌクレオチド内の少なくとも１つのフレーム外の開始コドンをさらに含み、ただしフレーム内の停止コドンが前記350 ヌクレオチド内に位置しない、請求の範囲第１項記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記翻訳開始部位の配列が前記開始部位のATG 開始コドンの約50ヌクレオチド内の少なくとも１つのフレーム外の開始コドンをさらに含み、ただしフレーム内の停止コドンが前記50ヌクレオチド内に位置しない、請求の範囲第１項記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記フレーム外の開始コドンがコンセンサスコザク（Kozak)配列の一部分である、請求の範囲第８，９及び10項記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記フレーム外の開始コドンおよび前記翻訳開始部位の配列の両方が二次構造の一部分として含まれている、請求の範囲第10項記載の発現ベクター。
【請求項１３】
前記翻訳開始部位の配列が二次構造の一部分であり、そして前記フレーム外の開始コドンが前記二次構造の一部分ではない、請求の範囲第８，９及び10項記載の発現ベクター。
【請求項１４】
優性の選択可能なマーカーの翻訳開始部位がTxxATGCxx, CxxATGCxx, CxxATGTxx 、およびTxxATGTxx から成る群より選択され、ここで「ｘ」はヌクレオチドであり、ただしATG コドンの下流のコドン「Txx 」は停止コドンをコードしない、核酸配列によりコードされる優性の選択可能なマーカー。
【請求項１５】
前記優性の選択可能なマーカーが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギンシンセターゼ、サルモネラ（Salmonella) hisD遺伝子、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンＢリン酸転移酵素、およびネオマイシンリン酸転移酵素から成る群より選択される、請求の範囲第14項記載の物質。
【請求項１６】
前記翻訳開始部位の配列がTxxATGCxx であり、ここで「ｘ」はヌクレオチドである、請求の範囲第14項記載の物質。
【請求項１７】
前記翻訳開始部位の配列がTCCATGCTT である、請求の範囲第14項記載の物質。
【請求項１８】
前記翻訳開始部位の配列が二次構造内に位置する、請求の範囲第14項記載の物質。
【請求項１９】
前記翻訳開始部位の配列が前記開始部位のATG 開始コドンの約1000ヌクレオチド内の少なくとも１つのフレーム外の開始コドンをさらに含み、ただしフレーム内の停止コドンが前記1000ヌクレオチド内に位置しない、請求の範囲第14項記載の物質。
【請求項２０】
前記翻訳開始部位の配列が前記開始部位のATG 開始コドンの約350 ヌクレオチド内の少なくとも１つのフレーム外の開始コドンをさらに含み、ただしフレーム内の停止コドンが前記350 ヌクレオチド内に位置しない、請求の範囲第14項記載の物質。
【請求項２１】
前記翻訳開始部位の配列が前記開始部位のATG 開始コドンの約50ヌクレオチド内の少なくとも１つのフレーム外の開始コドンをさらに含み、ただしフレーム内の停止コドンが前記50ヌクレオチド内に位置しない、請求の範囲第14項記載の物質。
【請求項２２】
前記フレーム外の開始コドンがコンセンサスコザク配列の一部分である、請求の範囲第19, 20及び21項記載の物質。
【請求項２３】
前記フレーム外の開始コドンおよび前記翻訳開始部位の配列の両方が二次構分として含まれている、請求の範囲第21項記載の物質。
【請求項２４】
前記翻訳開始部位の配列が二次構造の一部分であり、そして前記フレーム外の開始コドンが前記二次構造の一部分ではない、請求の範囲第19, 20及び21項記載の物質。
【請求項２５】
ANEX１（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection) の受託番号69120 内に含まれる) およびANEX２（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection) の受託番号69118 内に含まれる) から成る群より選択される発現ベクター。
【請求項２６】
前記問題のタンパク質をコードする核酸配列が前記優性の選択可能なマーカーに共連鎖している、請求の範囲第１項記載の発現ベクターからなるプラスミド。
【請求項２７】
哺乳動物宿主細胞の細胞のデオキシリボ核酸内に組込まれた請求の範囲第26項記載のプラスミド。
【請求項２８】
前記宿主細胞が DG44, DXB11, CV1, COS, R1610, SP2／０，P3x633−Ag8.653, BFA−lclBPT, RAJI、および293 から成る群より選択される、請求の範囲第27項記載のプラスミド。
【請求項２９】
前記優性の選択可能なマーカー内の人工のイントロン挿入領域をさらに含み、ここで問題のタンパク質のエンコーディング配列が前記挿入領域内に位置する、請求の範囲第１項記載の発現ベクター。
【請求項３０】
人工のイントロン挿入領域をさらに含む、請求の範囲第14項記載の優性の選択可能なマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優性選択マーカー遺伝子の発現の抑制により、目的タンパク質の生産を増強する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジーの工業の出現は大量のタンパク質の生産を可能とした。タンパク質はすべての生きている細胞の必須成分でありそしてタンパク質は20の天然に見出されるアミノ酸の組み合わせから構成されている；各アミノ酸分子は３つのデオキシリボ核酸（「DNA 」）分子のグループ（「コドン」）により定められる（「コードされる」）；１続きの DNA分子（「 DNA高分子」）は、本質的に、そのブループリントにより特定されるアミノ酸の特定の配列の生産のためのブループリントである。リボ核酸（「RNA 」）はこのプロセスに直ちに関係する；３つの型のRNA(メッセンジャーRNA ；トランスファーRNA ；およびリボソームRNA)は、DNA によりコードされる情報を、例えば、タンパク質に変換する。こうして、遺伝情報は一般に次のように転移される： DNA→RNA →タンパク質。
【０００３】
組み換えDNA 技術を包含する典型的な戦略に従い、所望のタンパク質物質をコードする DNA配列（「cDNA」）は同定されそして天然源から単離されるか、あるいは合成的に生産される。この片の遺伝物質を操作することによって、その末端を二本鎖DNA の小さい環状分子の区画の中に組込むか、あるいは「適合」させるようにつくられる。この環状分子は典型的には「 DNA発現ベクター」、または単に「ベクター」と呼ばれる。ベクターと遺伝物質との組み合わせは「プラスミド」と呼ぶことができ、そして原核宿主が複製するとき、プラスミドは自律的環状DNA 分子として原核宿主（すなわち、本質が細菌）中で複製することができる。その後、環状DNA プラスミドを単離しそして真核宿主（すなわち、本質が哺乳動物）の中に導入し、そしてプラスミドDNA を取り込んだ宿主細胞を選択する。
【０００４】
あるプラスミドのベクターは哺乳動物細胞の中の自律的環状DNA分子として複製するであろう（例えば、プラスミドはエプスタイン−バー−ウイルス (「EBV 」) およびウシ乳頭腫ウイルス (「BPV」) に基づくベクターを含む) が、 DNAベクターを包含するほとんどのプラスミド、および RNAライノウイルスのベクターを包含するすべてのプラスミドは環状DNA の中に組込まれ、こうして真核宿主細胞の環状DNA が複製するとき、プラスミドDNA はまた複製する。したがって、真核細胞が成長しかつ分割するとき、問題のタンパク質物質の生産 (「発現」) に導く組込まれたプラスミドを含有する細胞の対応する増加が存在する。プラスミドを含有する宿主細胞を好適な成長条件に暴露することによって、有意な量の宿主、それゆえ問題のタンパク質が生産される。典型的には、チャイニーズハムスター卵巣 (「CHO 」) の細胞系は真核宿主細胞として利用されるが、大腸菌(E. coli) は原核宿主細胞として利用される。
【０００５】
ベクターは前述においてきわめて重要な役割を演ずる一ベクターの操作はcDNAがどこに挿入されるかに関する変動性、cDNAが、事実、ベクター内に適切に挿入されたかどうかを決定する手段、遺伝物質の発現が起こるか否かの条件などを可能とする。しかしながら、ベクターの操作の大部分は単一の目標−所望の遺伝子生産物、すなわち、問題のタンパク質の発現の増加に向かって適合される。再び述べると、「改良されない」ベクターと比較したとき、「改良された」ベクターが有意により高いレベルにおいて遺伝子生産物の生産を可能とするように、大部分のベクターの操作は実施される。こうして、１つのベクターの特性／面／特性のあるものは他のベクターの特性／面／特性に類似するように想われるが、操作の全体の目標の結果−問題の遺伝子生産物の改良された生産を検査することがしばしば必要である。
【０００６】
１つの「改良された」ベクターは１組の環境について望ましい特性からなることができるが、これらの特性は他の環境下に必ずしも望ましくないことがある。しかしながら、１つの特性はすべてのベクターについて望ましい：増加した効率、すなわち、生産されるタンパク質の量を増加すると同時に有意な量のこのタンパク質を発生しないスクリーニングすべき宿主細胞の数を減少する能力。このような増加した効率は、操作のコストの減少および問題のタンパク質を発現している生活可能なコロニーについてスクリーニングする技術により消費される時間の減少を包含する、いくつかの望ましい利点を有するであろう。したがって、望ましいものおよび技術水準を有意に改良するものは、このような効率特性をもつ発現ベクターである。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約
ここに記載する本発明はこれらのおよび他の必要性を満足する。発現ベクターの一部分である転写カッセトの優性の選択可能なマーカーとともに最も典型的には使用される、完全に障害されたコンセンサスコザク(Kozak) 配列をここに開示する；好ましくは、優性の選択可能なマーカーは天然のイントロン挿入領域または人工のイントロン挿入領域からなり、そして問題の少なくとも１つの遺伝子生産物はこのような挿入領域内に位置するDNA によりコードされる。
【０００８】
ここにおいて使用するとき、「優性の選択可能なマーカー」は遺伝子配列またはその遺伝子配列によりコードされるタンパク質である；優性の選択可能なマーカーによりコードされるタンパク質の発現は、優性の選択可能なマーカーを含む発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞がこのタンパク質を含有しない宿主細胞をそうでなければ殺すであろう選択プロセスに生き残ることを保証する。ここにおいて使用するとき、「転写カッセト」はタンパク質生産物（例えば、優性の選択可能なマーカー）をコードするDNA および宿主細胞中のタンパク質生産物の生産に必要な遺伝要素（すなわち、プロモーター；転写開始部位；ポリアデニル化領域；など）である。
【０００９】
これらのベクターは、最も好ましくは、宿主細胞のDNA の中へのベクターの組込みが起こる哺乳動物の発現系におけるタンパク質の発現のために利用される。有益なことには、このような完全に障害されたコンセンサスコザク配列の使用は、生活可能なコロニーの数を有意に減少すると同時に、このような生活可能なコロニーにより発現されるタンパク質の量を有意に増加することによって、タンパク質の発現の効率を改良することができる。
【００１０】
ここにおいて使用するとき、「天然のイントロン挿入領域」はこの場合において遺伝子内に自然に存在するDNA の領域、典型的には優性の選択可能なマーカーであり、これは問題の遺伝子生産物をコードするDNA の挿入のために利用することができる；「人工のイントロン挿入領域」は、問題の遺伝子生産物をコードするDNA の挿入のために利用することができる、遺伝子の中に選択的につくられるDNA の領域（再び、最も典型的には、優性の選択可能なマーカー）である。イントロンの位置決定に関する情報は、Abramas, J.M.ら、"Intronic Positionig Maximizes Co-expression and Co-amplification of Nonselectable Heterologous Genes." J. Biol. Chem. 264124 ：14016 (1989)、および米国特許第 5,043,270号 (両方の文献をここに引用によって加える) に記載されている。
【００１１】
ここにおいて定義、開示および特許請求するように、「完全に障害されたコンセンサスコザク(Kozak) 」は次の配列からなる：
-3        +1
Pyxx ATG Pyxx
ここで：「ｘ」はアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはチミジン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）から成る群より選択されるヌクレオチドである；「Py」はピリミジンヌクレオチド、すなわち、ＣまたはＴ／Ｕである；「ATG 」はアミノ酸メチオニンをコードするコドン、いわゆる「開始」コドンである；そして−３および＋１は ATGと向かい合った方向の参照点である、すなわち、−３は ATGから３ヌクレオチド上流を示すことを意味しそして＋１はATから１ヌクレオチド下流を示すことを意味する。
【００１２】
好ましくは、完全に障害されたコンセンサスコザクは、発現ベクターの一部分である転写カッセトの優性の選択可能なマーカー部分の翻訳を開始するメチオニン開始コドンの一部分である。好ましい優性の選択可能なマーカーは次のものを包含するが、これらに限定されない：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ；アデノシンデアミナーゼ；アスパラギンシンセターゼ；サルモネラ (Salmonella) hisD遺伝子；キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；ヒグロマイシンＢリン酸転移酵素；およびネオマイシンリン酸転移酵素。最も好ましくは、優性の選択可能なマーカーはネオマイシンリン酸転移酵素である。
【００１３】
とくに本発明の好ましい態様において、少なくとも１つのフレーム外の開始コドン（すなわち、ATG)は完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンから上流に位置し、インフレームの停止コドンは上流の開始コドンと完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンとの間に位置しない。ここにおいて使用するとき、用語「停止コドン」はコードされた物質の翻訳が停止するようにアミノ酸をコードしないコドンを示すことを意味する；この定義は、とくに、伝統的な停止コドンTAA, TAGおよび TGAを包含する。ここにおいて使用するとき、用語「インフレーム」および「フレーム外」は完全に障害されたコンセンサスコザクの開始に関係する。
【００１４】
例えば、次の配列において：
-3      +1
GAC CAT GGC Cxx ATG Cxx
配列の下線部分は完全に障害されたコンセンサスコザクを代表する（ここで「ｘ」はヌクレオチドを表す）そしてコドンGAC, CATおよび GCCは ATG開始コドンに関して「インフレーム」のコドンである。上の線が引かれたヌクレオチドは、完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンから上流にある「フレーム外」の開始コドンを表す。
【００１５】
好ましくは、フレーム外の開始コドンは完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンから約1000ヌクレオチド上流内、より好ましくは完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンから約350 ヌクレオチド上流内、最も好ましくは完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンから約50ヌクレオチド上流内に存在する。好ましくは、フレーム外の開始コドンはコンセンサスコザクの一部分である。例えば、前述の配列はこの基準を満足する：−５ヌクレオチドはプリン（Ｇ）である：ヌクレオチド−６，−７および８はフレーム外の開始コドン(ATG) をコードする；そしてヌクレオチド−11はプリン（Ａ）である。
【００１６】
さらに、二次構造内の完全に障害されたコンセンサスコザク（すなわち、いわゆる「ステム−ループ」または「ヘアピン」）の利用は、優性の選択可能な数によりコードされるタンパク質の翻訳の障害に対して有益には実行可能である。このような態様において、完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンは最も好ましくはステム−ループのステム内に位置する。
【００１７】
ここに開示する本発明のこれらの面を取り込んだとくに好ましい発現ベクターは「TCAE」、および「ANEX」および「NEOSPLA 」ベクターと呼ぶ；とくに好ましいベクターはANEX１，ANEX２およびNEOSPLA3F と呼ぶ。
ここに開示する本発明のこれらおよび他の面を以下の節においてさらに詳細に描写する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
最も好ましくは、哺乳動物の発現ベクターの中に取り込まれた優性の選択可能なマーカーの翻訳および開始を障害しそして、好ましいが、必ずしも必要ではないが、問題の遺伝子生産物のためのエンコーディング配列に共連鎖された、核酸配列の配置をここに開示する。好ましくは、優性の選択可能なマーカーは少なくとも１つの天然または人工のイントロン挿入領域からなり、そして少なくとも１つの問題の遺伝子生産物は少なくとも１つのこのようなイントロン内に位置する DNAによりコードされる。このような配置は、なかでも、細胞につき当量のトランスフェクションされたプラスミドDNA から得られた生活可能なコロニーの数を減少するが、各クローンの中で発現された遺伝子生産物の量を増加することによって、問題の遺伝子生産物の発現効率を増加するという作用を有する。
【００１９】
簡素化おび提示の目的で、特許の開示のこの節の焦点は、マウス／ヒトキメラ免疫グロブリンの発現ベクターの中に取り込まれた、特定の優性の選択可能なマーカー、ネオマイシンリン酸転移酵素に主として向けられるであろう。しかしながら、ここに開示する本発明は、これらの特定の系に限定されることを意図せず、また限定されるとして解釈すべきでないことを理解すべきである。その反対に、開示する本発明は、ベクターDNA が宿主細胞のDNA の中に組込まれた、哺乳動物の発現系に完全に適用可能である。
【００２０】
高いレベルのタンパク質を生産する哺乳動物細胞系（すなわち、「生産細胞系」）を生産するために当業者により利用されている最も好ましい方法の１つは、最も典型的には、外因性DNA を組込んだ細胞の選択を可能とする、「優性の選択可能なマーカー」と呼ぶ、薬物耐性遺伝子を使用することによる、所望の遺伝子生産物をコードするDNA(すなわち、「外因性DNA 」）のランダム組込みを包含する。再び述べると、例えば、薬物耐性遺伝子を包含する、外因性DNA を適切に取り込んだ細胞は対応する薬物に対する耐性を維持する。
【００２１】
次いで、最も典型的には、所望の遺伝子生産物をコードするDNA の共増幅をトランスフェクションされた細胞中で、また、薬物耐性、例えば、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（DHFR) 遺伝子の場合においてメトトレキセート(MTX) に対する耐性をコードする隣接する遺伝子 (「増幅遺伝子」) を増幅することによって実施する。増幅遺伝子は優性の選択可能なマーカー遺伝子と同一であることができるか、あるいは別の遺伝子であることができる。 (当業者は知るように、「トランスフェクション」は典型的には哺乳動物宿主細胞の中にプラスミドを導入するプロセスまたは状態を記載するために利用するが、「形質転換」は典型的には細菌宿主細胞の中にプスミドを導入するプロセスまたは状態を記載するために利用する）。
【００２２】
典型的には２つの増幅アプローチが当業者により使用される。第１において、トランスフェクションされた細胞および薬物耐性細胞の全体の集団（各細胞は薬物耐性をコードする遺伝子の少なくとも１つの組込みを含む）を増幅する；第２において、単細胞から誘導された個々のクローンを増幅する。各アプローチは独特の利点を有する。
【００２３】
第１のアプローチに関すると、個々のクローンと比較して全体の集団を増幅すること（典型的には「ショットガン」アプローチ、適切な記載）は多少「いっそう容易」である。なぜなら、個々のクローンの増幅は、最初に、なかでも、「高い」レベル、すなわち、最低の検出可能な発現レベルより３桁大きい大きさのレベルで所望の遺伝子生産物を分泌する１または２つの「究極の目標」を単離する努力において、数百の単離した哺乳動物のコロニー（各々は単細胞から誘導され、それらの大部分は発現プラスミドの単一のコピーの組込み体である）のスクリーニングを含むからである。これらの細胞は、また、発現プラスミドの単一のコピーの組込み体を有することがしばしば発現される。さらに、個々のクローンの増幅は、すべてのトランスフェクションされた細胞の増幅に比較して、より少ないコピーの増幅された遺伝子を含有する生産細胞系を生ずる（典型的には、10〜20／ 500〜1000）。
【００２４】
第２のアプローチに関すると、個々のクローンの増幅から誘導される生産細胞系は、１または２以上の薬物耐性のための遺伝子および外因性遺伝子生産物からなるコロニーについて選択するために使用した１または２以上の薬物のより低いレベルにおいて、典型的には誘導される（すなわち、メトトレキヤートおよびDHFRの場合において、５nM／１μＭ）。さらに、個々のクローンは典型的にはより短い期間で単離することができる（３〜６月／６〜９月）。
【００２５】
次いで理想的には、両方のアプローチの現実の利益は合同されるべきである；実質的レベルにおいて、これはスクリーニングすべきコロニーの数の減少、およびこれらのコロニーが分泌する生産物の量の増加を包含する。本発明はこの仕事を達成する。
【００２６】
プラスミドDNAの優性の選択可能なマーカーのDNAが宿主細胞の細胞DNA内に組み込まれる位置は、当業者は確認するように、優性の選択可能なマーカーのタンパク質の発現レベルを決定する。優性の選択可能なマーカーのDNAに共連鎖するか、あるいはその近くに位置する問題のタンパク質をコードする遺伝子の発現は、優性の選択可能なマーカーのタンパク質の発現に比例すると仮定される。
【００２７】
いかなる特定の理論にも拘束されたくないが、哺乳動物細胞において外来性DNAの組込みのために選択するために使用する遺伝子（すなわち、優性の選択可能なマーカー）をその優性の選択可能なマーカーの翻訳が障害されるようにデザインする場合、優性の選択可能なマーカーの遺伝子生産物の過度の生産によりこのような障害を克服することができるプラスミドのみが、例えば、薬物スクリーニングプロセスに、生き残ることができると発明者は仮定した。
【００２８】
外因性DNA を優性の選択可能なマーカーと関連させることによって、優性の選択可能なマーカーの遺伝子生産物の過度の生産は、また、関連する外因性DNA から誘導される遺伝子生産物の過度の生産を生ずるであろう。仮定するアプローチに従うと、優性の選択可能なマーカー遺伝子の翻訳の障害は必要であり、そしてこのような障害の道筋は遺伝子のコンセンサスコザク部分であった。
【００２９】
数百の脊椎動物mRNAを比較することによって、Marilyn Kozak, "Possible role of flanking nucleotides in recognition of theAUG initiator codon by eukaryotic ribosomes," Nucl. Acids Res. 9: 5233-5252 (1981)および "Compilation and analysis of sequences from the translational start site in eukaryotic mRNAs," Nucl. Acids Ros. 12: 857-872 (1984) は、高等真核生物における翻訳の開示のための次の「コンセンサス」配列を提案した：
-3      +1
CC Acc AUG G
（当業者は知るように、 RNAにおいて、ウラシル、Ｕ、はデオキシヌクレオチドチミジン、Ｔ、を置換する）。
【００３０】
「コンセンサスコザク」と呼ぶ、この配列において、最も高度に保存されるヌクレオチドは、上に大文字で示す、プリン、ＡおよびＧ、である；突然変異の分析はこれらの２つの位置が開始に最も強い影響を及ぼした。参照、例えば、Kozak, M. "Effects of interoistronic length on the efficency of reinitiation of eukaryotic ribosomes." Mol. Cell. Biol. 7 ／10：3438-3445 (1987)。さらに、 Kozakはコンセンサスコザクから上流の変更が翻訳に影響を与えることができることを決定した。
【００３１】
例えば "Inflences of mRNA secondary structure on initiation by eukaryotic ribosomes." PNAS 83:2850−2854 (1986) 。Kozak は、プレプロインスリンをコードしたいくつかのプラスミドにおいてコンセンサスコザクから上流の二次ヘアピン構造領域の「人工的」導入を記載している；安全なステムループ構造はプレプロインスリン遺伝子の翻訳を阻害し、プロインスリンの収率を85〜95％だけ減少することが実験的に決定された。
【００３２】
驚くべきことには、プリンＡ(ATG開始コドンと向かい合って−３）および（＋１）をピリミジンに交換することによって、翻訳の障害が有意であることを本発明者は発見した；ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子についてのコンセンサスコザクをこのような変更に暴露するとき（下にいっそう詳しく説明するように）、G418耐性コロニーの数は有意に減少した；しかしながら、個々のG418耐性クローンにより発現される遺伝子生産物の量は有意に増加した。当業者は認識するように、これは発現系の効率を増加するという作用を有する−スクリーニングーすべきコロニーの数はより少なく、そして生活可能なコロニーの大部分は、通常得られるよりも有意に多い生産物を生産する。本発明者の仮定した理論の確証をこうして実験的に決定した。
【００３３】
前述したように、この特許の記録の目的で、「コンセンサスコザク」は次の配列からなる：
-3      +1
Pxx ATG Pxx
「部分的に障害されたコンセンサスコザク」は次の配列
-3           +1
P/Pyxx ATG P/Pyxx
からなり、そして開示および特許請求する「完全に障害されたコンセンサスコザク」は次の配列からなる：
-3       +1
Pyxx ATG Pyxx
【００３４】
ここで；「ｘ」はアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはチミジン（Ｔ) (RNAの場合において、ウラシル、Ｕ）から成る群より選択されるヌクレオチドであり；「Ｐ」はプリン、すなわち、ＡまたはＧであり、「Py」はピリジン、すなわち、ＣまたはＴ／Ｕであり； ATGはアミノ酸メチオニン(Mol) をコードする普通の開始コドンである；数字の表示は ATGコドンに関係する、すなわち、負の数字は ATGから「上流」を示しそして正の数字は ATGから「下流」を示す；部分的に障害されたコンセンサスコザクについて、次の条件が適用可能である：−３またはび＋１ヌクレオチドの一方のみがピリジンであり、例えば、−３がピリジンである場合、＋１はプリンでなくてはならならいか、あるいは−３がプリンである場合、＋１はピリジンでなくてはならない。
【００３５】
最も好ましくは、完全に障害されたコンセンサスコザクは、問題の遺伝子生産物をコードする外因性DNA に好ましくは共連鎖した（必ずしもこれは必要ではない）優性の選択可能なマーカーの翻訳開始部位に関連する。ここにおいて使用するとき、「ヌクレオチド」は天然および合成のデオキシ−およびラジオヌクレオチドならびに修飾されたデオキシ−およびラジオヌクレオチド、すなわち、３′OH、５′OH、糖および／または複素環式塩基が修飾されている場合、ならびにホスフェート主鎖、例えば、メチルホスフェート、ホスホロチオエートおよびホスホロアミダイトの修飾を包含することを意味する。
【００３６】
優性の選択可能なマーカーの遺伝子配列に関する情報は好ましくは既知である；しかしながら、全体の配列の代わりに、優性の選択可能なマーカーの翻訳開始部位におけるヌクレオチド配列（またはアミノ酸配列）に関する情報は既知でなくてはならない。再び述べると、コンセンサスまたは部分的に障害されたコンセンサスコザクにおける変化を行うために、その配列を知らなくてはならない。
【００３７】
コンセンサスまたは部分的に障害されたコンセンサスコザクを完全に障害されたコンセンサスコザク配列に変化することは、当業者によく知られている種々のアプローチにより達成することができ、このようなアプローチは次のものを包含するが、これらに限定されない：部位特異的突然変異およびプライマーに基づく増幅による突然変異（例えば、PCR)；最も好ましくは、このような変化は好ましくはプライマーに基づく増幅による突然変異を経て達成される。この好ましさは、この仕事を達成するときの比較的「容易さ」、ならびにそれに関連する効率に主として基づく。提示の容易さのために、完全に障害されたコンセンサスコザクへの変化を達成するために最も好ましい手段を説明する。
【００３８】
本質的に、プライマーに基づく増幅による突然変異は増幅プロセスそれ自体の力に頼る− PCRは日常的に利用されるので、それに焦点を合わせる。しかしながら、他のプライマーに基づく増幅技術（例えば、リガーゼ連鎖反応など）を使用することができる。２つのPCR プライマーの一方（「突然変異のプライマー）」は、問題の優性の選択可能なマーカーを取り込んだ転写カッセト内で完全に障害されたコンセンサスコザクを生ずる増幅されたDNA が取り込むことを確実にする配列を取り込んでいる；他方の PCRプライマーは優性の選択可能なマーカーの他の領域；優性の選択可能なマーカーを取り込んだ転写カッセト；または転写カッセトからなるベクターに対して相補的である。
【００３９】
例えば、コンセンサスコザクを含む優性の選択可能なマーカーに対する補体は次の配列（配列識別番号：１）を有することができるであろう：
3′-tagctaggTccTACCcc-5′
【００４０】
完全に障害されたコンセンサスコザクをつくるために、突然変異のプライマーは次の配列を有することができるであろう (配列識別番号：２)(便宜上、配列識別番号：１を比較の目的で突然変異のプライマーの上に配置する）：
5′-atcgatccTggATGCgg-3′
3′-tagctaggTccTACCcc-5′
*     *
明らかなように、相補性はプライマーにおいて欠如されている (参照、「＊」の記号）。
【００４１】
PCR反応において過剰の突然変異のプライマーを利用することによって、コンセンサスコザクを含む配列を増幅するとき、生ずる増幅されたDNA 生産物は突然変異を取り込み、こうして増幅されたDNA 生産物が引き続いて増幅されるとき、突然変異体は優勢であるので、完全に障害されたコンセンサスコザクは増幅生産物の中に取り込まれるであろう。
【００４２】
２つの基準が突然変異のプライマーについて要求される−第１に、その長さは標的へのハイブリダイゼーションが生ずるように十分でなくてはならない。理解されるように、突然変異のプライマーは標的に対して 100％相補的ではない。こうして、必要なハイブリダイゼーションを確実にするために十分な数の相補的塩基が要求される。好ましくは、突然変異のプライマーの長さは約15〜約60ヌクレオチド、より好ましくは約18〜約40ヌクレオチドであるが、より長いまたはより短いものも有効である。(突然変異のプライマーがまたフレーム外の開始コドンまたは二次構造を取り込むために利用される程度に、突然変異のプライマーの長さは対応して増加することができる）。第２に、突然変異のプライマー／標的の比は突然変異を「強制」するために十分に過剰でなくてはならない。好ましくは、突然変異のプライマー／標的の比は約 250：１〜約5000：１、より好ましくは約 400：１〜約2500：１、最も好ましくは約 500：１〜約1000：１である。
【００４３】
PCR 反応のパラメーターは技術水準の範囲内に完全に入ると考えられるので、その反応の特定の事項に関する詳細はここに記載しない；当業者は PCR技術を使用してこの種類の突然変異を達成することができる方法を既に認識していると信じられる−詳細な教化と反対に説明を提供する手段として上の事柄は提供された。
【００４４】
前述したように、完全に障害されたコンセンサスコザクは発現ベクターの一部分を形成する転写カッセトの中に組込まれた優性の選択可能なマーカーの翻訳開始部位に関連することが最も好ましい。好ましい優性の選択可能なマーカーは次のものを包含するが；これらに限定されない：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ；アデノシンデアミナーゼ；アスパラギンシンセターゼ；サルモネラ (Salmonella) hisD遺伝子；キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（「XGPRT 」）；ヒグロマイシンＢリン酸転移酵素；およびネオマイシンリン酸転移酵素（「NEO 」) 。最も好ましくは、優性の選択可能なマーカーは NEOである。
【００４５】
優性の選択可能なマーカーの単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼは、次の部分的に障害されたコンセンサスコザクを有すると報告されている：
-3      +1
cg Cgt ATG Gct
参照、Heller, S. "Insertinal Activities of a Promotorlcss Thymidine Kinase Gene," Molec. & Cell. Biol. 8/8 : 3218-3302、第４図、ヌクレオチド764。
【００４６】
＋１プリン（Ｇ）をピリミジン（ＣまたはＴ／Ｕ）に変化させることによって、ここに定義するような完全に障害されたコザクが発生する（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの−３はピリミジンである）。＋１プリンをピリミジンに変化させることは、また、コードされたアミノ酸をアラニン(GCT) からプロリン(CCT) またはセリン(TCT) に変化させる作用を有する；保存のアミノ酸の変化はヌクレオチドへの変化から生ずることが好ましい。こうして、アラニンからセリンへの変化はアラニンからプロリンへの変化よりもいっそう保存的なアミノ酸の変化であるので、 TCTへの変化を行うことが好ましい。
【００４７】
ヒスチジノールデヒドロゲナーゼは他の優性の選択可能なマーカーである。参照、Hartmen, S. C.およびMulligan, R. C. "Two dominant acting selectable Markers for gene transfer studies in mammalian cells," PNAS 85:8047-8051 (1988) 。ネズミチフス菌 (Salmonella typhimurium) のhisD遺伝子は、次の部分的に障害されたコンセンサスコザクを有する。
-3      +1
gc Aga ATG Tta
−３はプリンであるので、−３をピリミジン（ＣまたはＴ／Ｕ）に変化すると、完全に障害されたコンセンサスコザクが生ずる；理解されるように、これらのヌクレオチドは開始コドンから上流にあるので、この変化からアミノ酸への翻訳への衝撃は生じない。
【００４８】
ヒグロマイシンＢリン酸転移酵素は他の優性の選択可能なマーカーである； hph遺伝子について報告された配列 (参照、Gritz, L.およびDavies, J. "Plasmid encoded hygromaycin B resistance :the sequence of hygromaycin B phosphotransferase gene and its expressing in Escherichia coli and Succharomyces cerevisiae ド" Gene 25 :179-188、1983) は、コンセンサスコザクが
-3      +1
ga Gat ATG Aaa
であることを示している。−３および＋１の両方はプリンである；こうして−３および＋１をピリミジンに変化させると、完全に障害されたコンセンサスコザクが生ずる（これは次のコードされたアミノ酸を生ずる：＋１→Ｃ−グルタミン；＋１→Ｔ−停止コドン。このコドンは開始コドンから下流にあるので、停止コドンTAA への変化は達成させるべきではい)。
【００４９】
XGPRT は他の優性の選択可能なマーカーである。報告されたXGPRT の部分的に障害されたコンセンサスコザクは次の配列を有する：
-3      +1
tt Cac ATG Agc
参照、Mulligan, R. C. およびBerg, P. "Factors governing theexpression of a bacterial gene in mammalian celles." Molec.& Cell. Biol. １／５：499-459 (1981)、第６図。＋１プリンをピリミジンに変化させることによって、完全に障害されたコンセンサスコザクがつくられる；コードされたアミノ酸(AGC−セリン）への作用は次の通りである： CGC−アルギニン； TGC−システイン。
【００５０】
アデノシンデアミナーゼ(ADA) を、また、優性の選択可能なマーカーとして利用することができる。アデノシンデアミナーゼのための報告されたコンセンサスコザク配列は次の通りである：
-3      +1
ga Acc ATG Gcc
参照、Yeung, C. Y.ら、"Identification of functional murine adenosine deaminase cDNA clones by complementation in Escherichia coli," J. Biol. Chem. 260／18：10299-10307 (1985)、第３図。−３および＋１の両方のプリンをピリミジンに変化させることによって、完全に障害されたコンセンサスコザク配列が生ずる。GCC(アラニン) に相当するコードされたアミノ酸はプロリン(CCC) またはセリン(TCC) に変化され、セリンへの変化は、この変化の保存的性質のために、好ましい。
【００５１】
アスパラギンシンセターゼのための報告された部分的に障害されたコンセンサスコザクは次の通りである：
-3      +1
gc Acc ATG Tgt
参照、Andrulis, I. L. ら、"Isolation of human cDNAs for asparagine synthetase and expression in Jensen rat sarcoma cells," Mol. Cell. Biol. ７／７：2435−2443 (1987) 。＋３プリンをピリミジンに変化すると、完全に障害されたコンセンサスコザクが生ずる。
【００５２】
ネオマイシンリン酸転移酵素のための部分的に障害されたコンセンサスコザク（これは上流のフレーム外の開始コドンを含む）は次の通りである：
-3      +1
ggA TGg gga tcg ttt Cgc ATG Att
＋１プリンのピリミジンへの変化は完全に障害されたコンセンサスコザクをつくる作用を有する（コードされたアミノ酸イソロイシン、 ATT、への変化は次の通りである： CTT−ロイシンおよび TTT−フェニルアラニン、ロイシンへの変化は、この変化の保存的性質のために、好ましい）。
【００５３】
以上の説明は限定を意図せず、また限定と解釈すべきではない；むしろ、開示された本発明に関して、以上の説明はいくつかのよく知られた優性の選択可能なマーカーの報告されたコンセンサスコザク配列または部分的に障害されたコンセンサスコザク配列における
変化の同等の例を提供する努力において提示された。
【００５４】
前述したように、最も好ましい優性の選択可能なマーカーは NEOである。 NEOのためにとくに好ましい完全に障害されたコンセンサス配列は次の通りである：
Txx ATG Ctt (SEQ ID NO: 3)
Cxx ATG Ctt (SEQ ID NO: 4)
Txx ATG Ttt (SEQ ID NO: 5)
Cxx ATG Ttt (SEQ ID NO: 6)
ここで「ｘ」はヌクレオチドである。配列番号：３は最も好ましい；そしてxxは好ましくはCCである。
【００５５】
完全に障害されたコンセンサスコザクを含むか、あるいは含まないことができる、他の転写カッセトは、開示しかつ特許請求する完全に障害されたコザクを含有する転写カッセトを含むベクターの中に組込むことができる；このような「他の転写カッセト」は典型的には遺伝子生産物の抑制の「増強」、「増幅」または「調節」を可能とするために利用される。例えば、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（DHFR) 遺伝子を使用する外因性DNA の共トランスフェクションが例である。このような細胞に提示される、抗葉酸薬物メトトレキセート(MTX) 、DHFRの競合インヒビターのレベルを増加することによって、DHFR遺伝子の増幅を経てDHFR生産の増加は起こることができる。有益には、広範な量のフランキング外因性DNA は、また、増幅されるようになるであろう；したがって、発現可能なDHFR遺伝子と共直線的に挿入された外因性DNA も過度に発現されるようになるであろう。
【００５６】
さらに、発現の調節を可能とする転写カッセトを利用可能である。例えば、RSウイルスLTR(Ｔ抗原によるフィードバック発現に対して不感受性）の指令下にSV40ts突然変異体の大きいＴ抗原遺伝子を配置することによって誘導された、温度感受性 COS細胞が記載された。参照、227 Science 23−28 (1985) 。これらの細胞は SV40oriからの複製を33℃において支持するが、40℃において支持せず、そしてトランスフェクションされた SV40oriを含有するベクターのコピー数の調節を可能とする。以上の事柄は限定を意図せず、また限定として解釈すべきではない：むしろ以上の事柄は開示した完全に障害されたコンセンサスコザクからなる発現ベクターの中に取り込むことができるカッセトの型の例示であることを意図する。当業者は、適用可能でありかつ有利に利用することができる、発現系の目的に関して、他の転写カッセトの特定の型を決定することができると信じられる。
【００５７】
特に、本発明の好ましい態様において、上に示したように、少なくとも１つのフレーム外の開始コドン（すなわち、ATG)が完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンから上流に位置し、停止コドンはフレーム外の開始コドンと完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンとの間に位置しない。フレーム外の開始コドンの意図は、実際に、優性の選択可能なマーカーの翻訳をさらに障害することである。
【００５８】
ここにおいて使用するとき、用語「停止コドン」は「ナンセンスコドン」、すなわち、コードされた物質の翻訳が停止コドンの領域において停止するように、20の天然に見出されるアミノ酸の１つをコードしないコドンを示すことを意味する。この定義は、とくに、伝統的停止コドンTAA, TAGおよび TGAを包含する。
【００５９】
ここにおいて使用するとき、用語「フレーム外」は完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンに関する。当業者は知るように、すべてのインフレーム配列について任意の DNA高分子 (またはRNA 高分子) において、２つのフレーム外配列が存在する。こうして、例えば、完全に障害されたコンセンサスコザク取り込んだ次の配列に関すると、
-3      +1
gcA TGg cAT Ggc Cxx ATG Cxx
【００６０】
インフレームコドンはトリプレット、例えば、gcA, TGe, cAT および Ggcにより分離されている；フレーム外コドンは、例えば、cAT, ATG, Gcc, ccA, ATG および TGgを包含するであろう。こうして、２つの開始コドン（大文字および下線を引いた）は完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンに関してフレーム外である。
【００６１】
このようなフレーム外の開始コドンを利用するとき、これは完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンの約1000ヌクレオチド内、より好ましくは完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンの約 350ヌクレオチド内、最も好ましくは完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンの約50ヌクレオチド内にあることが好ましい。
【００６２】
理解されるように、上流の配列は、前述の種類の増幅のプロトコールにおいて使用する突然変異のプライマーを使用して (最も好ましくは) 、完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンから上流に少なくとも１つのフレーム外配列の配置を達成するように操作することができる。
【００６３】
二次構造（すなわち、「ステムループ」または「ヘアピン」）内に位置する完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンの利用は、優性の選択可能なマーカーによりコードされるタンパク質の翻訳の障害のために有益には有効である。このような態様において、開始コドンはステムループ二次構造のステム内に位置することが好ましい。これらは、このような態様において、概略的例であり、完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンは次のように位置する：
【００６４】
【化１】
2006271402.tif 000002
【００６５】
（二次構造の一部分ではないフレーム外の開始コドンも表されている。）理解されるように、ステムループ内で、ステムに沿った相補性は、定義により、典型的には要求される。なかでも、このような二次構造の配列の中への導入、ならびに二次構造の安定性に関する情報に関する例示的方法については、 Kozak, PNAs, 1986、前掲、を参照のこと。
【００６６】
前述したように、天然に見出されるイントロン挿入領域または人工的につくられたイントロン挿入領域をもつ優性の選択可能なマーカーを利用しそして少なくとも１つの問題の遺伝子生産物をこの領域内に挿入することが好ましい。いかなる特定の理論にも拘束されたくないが、優性の選択可能なマーカーに関する選択プロセスに生き残る生活可能なコロニーの数が減少するので、このような配置は発現効率を増加すると、本発明者は仮定する；選択プロセスに事実生き残るコロニーは、定義により、生き残りに必要なタンパク質を発現しており、そしてそれに関して、問題の遺伝子生産物は発現されるより大きい傾向を有するであろう。さらに仮定されるように、イントロン挿入領域内の問題の遺伝子生産物から転写される RNAは優性の選択可能なマーカーの転写(RNAの伸長）の完結を妨害する；したがって、優性の選択可能なマーカーが細胞DNA 内の組込まれる位置は、より大きい量のRNA が最初に転写される位置であるようである。
【００６７】
理解されるように、原核タンパク質は典型的にはスプライスおよびイントロンを含まない。しかしながら、発現ベクター技術のために好ましい優性の選択可能なマーカーの大部分は原核系から誘導される。こうして、好ましいように、原核誘導の優性の選択可能なマーカーを利用するとき、問題の遺伝子生産物からなるイントロンの挿入のための位置をつくるために、遺伝子内に人工のスプライスを発生することがしばしば必要である。原核遺伝子中のスプライス部位の選択のために次のルールを設けるが、それらは真核遺伝子に容易に適用することができることに注意すべきである。
【００６８】
真核細胞中のメッセンジャーRNA 前駆体のスプライシングのために一般のメカニズムは、 Sharp, Philip A., "Splicing of Messenger RNA Precursors" Science, 235：736-771 (1987) (参照、とくに、第１図)(これをここに引用によって加える) の中に描写および要約されている。 Sharpに基づき、スプライスに必要な核酸配列における４つの最小の基準が存在する：（ａ）５′スプライスドナー；（ｂ）３′スプライスアクセプター；（ｃ）分岐点、および（ｄ）ポリピリミジントラクト。
【００６９】
５′スプライスドナーのためにコンセンサス配列は
C     A
AAG/GTGAGT
であり、そして３′スプライスアクセプターについて、NCAG／G(ここで「／」記号はスプライス部位を示す）であると報告されている；参照、Mount, S. M. "A Catalogue of Splice Junction Sequences" Nucl. Acids Res. 10/2: 459−472 (1992) (これをここに引用によって加える) 。
【００７０】
分岐点のためのコンセンサス配列、すなわち、５′スプライスドナーを使用する投げ縄の形成の位置は PyNPyPAPyとして報告されている；そして哺乳動物 RNAスプライシングのための報告された好ましい分岐部位は TACTAACである (Zhuang, Y.ら"UACUAAC is the preferred branch site for mammalian mRNA aplicing" PNAS 86：2752−2756 (1989) 、これをここに引用によって加える) 。典型的には、分岐点は５′スプライスドナーから少なくともほぼ70〜約80塩基対のところに位置する（この距離の上限について定義されていない）。ポリピリミジン道は典型的には約15〜約30塩基対でありそして最も典型的には分岐点および３′スプライスアクセプターにより境界される。
【００７１】
以上は天然に見出されるスプライシングメカニズムに自然が付与した基準の説明である。５′スプライスドナーと分岐点との間の塩基対の数に正確な上限は存在しないので、天然のイントロンが優性の選択可能なマーカー内に存在する場合に、この領域内に問題の遺伝子生産物を挿入することが好ましい。しかしながら、前述したように、このようなイントロンは好ましい優性の選択可能なマーカーの大部分内に事実存在しない；それ自体、人工のイントロンの利用は好ましくはこれらのマーカーとともに利用される。
【００７２】
人工のイントロンを発生するために、「スプライスドナー：スプライスアクセプター」部位は優性の選択可能なマーカーのエンコーディング配列内に位置しなくてはならない。 SharpおよびMontに基づいて、次の配列はスプライスドナー：スプライスアクセプター部位として機能することが最も好ましい−−CAGG (人工のスプライスはGG領域に存在する）。好ましい配列はAAGGである。
【００７３】
最も好ましい配列CAGGに焦点を合わせると、次のコドンおよびアミノ酸は人工のイントロン挿入領域の発生のために優性の選択可能なマーカーのエンコーディング領域内に位置することができる：
【００７４】
【表１】
2006271402.tif 000003
【００７５】
（理解されるように、有効なアミノ酸残基を決定する同一のアプローチをAAGGの好ましい配列のために利用することができる）。スプライスドナー：スプライスアクセプター部位の誘導のために最も好ましいコドンのグループはグループＡである。これらのアミノ酸配列がいったん位置すると、人工のイントロン挿入領域の発生のための有効な点を定めることができる。
【００７６】
好ましい NEO優性の選択可能なマーカー焦点を合わせると、アミノ酸残基Bln Asp(コドングループＡ）は NEOの位置51および52に位置し、そしてアミノ酸残基Ala Arg(コドングループＣ）は位置 172および 173に位置する (理解されるように、多数のイントロン挿入領域を利用することができる）。 NEOの残基50〜53に焦点を合わせると、核酸配列およびアミノ酸配列は次の通りである：
50  51  52  53
5′CTG CAG GAC GAG 3′
Leu Gln Asp Glu
【００７７】
したがって、人工のイントロン挿入領域は NEOの残基51と52との間に発生させることができる。この領域は最も好ましくは分岐点、ポリピロミジン道および、好ましくは、問題の遺伝子生産物の挿入のための領域、すなわち、酵素の消化に修正可能な領域からなる。
２つの基準が人工のイントロン挿入領域のために重要である；５′スプライス部位の最初の２つの核酸残基（例えば、隣接するCAG)は最も好ましくはGTであり、そして３′スプライス部位最初の２つの核酸残基（例えば、隣接するＧ）は最も好ましくはAGである。
上に定義した基準を使用して、人工のイントロン挿入領域は NEOのアミノ酸残基51と52との間に存在した：
【００７８】
【化２】
2006271402.tif 000004
【００７９】
（この人工のイントロン挿入領域をつくるための方法に関する詳細は下の実施例の筋に記載されている）。問題の遺伝子生産物を取り込むことができる領域として、NotI部位をつくった。したがって、取り込みのとき、 NEOの伝達の間に、問題の遺伝子生産物が「スプライス−アウト」されるように、問題の遺伝子生産物は NEOの残基51と52との間に位置する。
【００８０】
宿主細胞系は最も好ましくは哺乳動物起源である；当業者は、その中で発現すべき所望の遺伝子生産物に最もよく適する、特定の宿主細胞系を優先的に決定することができると信じられる。宿主細胞系の例は次のものを包含するが、これらに限定されない：DG44およびDX11癌) 、CV１（サル腎臓系統）、COS (SV40T抗原をもつCV１の誘導体) 、R1610(チャイニーズハムスター線維芽) BALBC/3T3(マウス線維芽) 、IIAK (ハムスター腎臓系統) 、SP２／Ｏ（マウス骨髄腫）、P3x633−Ag3.653(マウス骨髄腫) 、 BFA−1c1BPT (ウシ内皮細胞) 、RAJI (ヒトリンパ球) および 293 (ヒト腎臓) 。宿主細胞系は典型的には商業源、アメリカ組織菌株保存機関(American Tissue Culture Collection)から、あるいは発表された文献から入手可能である。
【００８１】
好ましくは、宿主細胞系はDG44またはSP２／Ｏである。参照、それぞれ、Urland, G.ら、"Effect of gamma rays and the dihydrofolate reductase locus: deletions and inversions." Som. Cell& Mol. Gen. 12/6：555-566 (1986)および Shulman, M.ら、"A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies." Nature 276: 269 (1978)。最も好ましくは、宿主細胞系はDG44である。
【００８２】
宿主細胞の中へのプラスミドのトランスフェクションは、当業者にとって入手可能な任意の技術により達成することができる。これらは次のものを包含するが、これらに限定されない：トランスフェクション（電気泳動およびエレクトロポレイション）、エンベロープドDNA との細胞融合、マイクロインジェクション、および無傷ウイルスを使用する感染。参照、Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors." Chapter 24.2, pp.470-472 Vectors, RodrigezおよびDenhardt編 (マサチュセッツ州ボストン、バッターワースス) 。最も好ましくは、宿主の中へのプラスミドの導入はエレクトロポレイションを経る。
【実施例】
【００８３】
以下の実施例は、本発明の限定を意図せず、また限定として解釈すべきではない：実施例はここに開示する本発明の態様の適用可能性を証明することを意図する。開示する完全に障害されたコンセンサスコザク配列は前述したように広く適用することを意図する。しかしながら、提示の効率のために、完全に障害されたコンセンサスコザク配列のとくに好ましい態様の例示的使用は、後述するように、直列のキメラ抗体の発現ベクター（また、ここにおいて抗体の発現ベクターと呼ぶ）と組み合わせて利用する。
【００８４】
Ｉ．直列のキメラ抗体の発現（「TCAE」) ベクター
Ｂ細胞リンパ球は多能性幹細胞から発生しそして個体発生を通して形質細胞系を分泌する完全に成熟した抗体に進行する。この分野において「CD20」と呼ぶ、ヒトＢリンパ球制限された分化抗原Bp35は、35,000ダルトンの細胞表面非グリコシル化リンタンパク質である；CD20は、初期の前Ｂ細胞の発生の間の細胞質μ重鎖の発現の直前に発現される。CD20は形質細胞の分化段階まで絶えず発現される。CD20分子は、細胞サイクルの開始および分化のために要求される活性化プロセスにおけるステップを調節する。CD20は新形成Ｂ細胞上で発現されるので、CD20はＢ細胞リンパ腫および白血病の治療のための有望な標的を提供する。
【００８５】
免疫エフェクターメカニズムを経る溶解に対する造血腫瘍のアクセス可能性および感受性のために、CD20抗原は抗CD20抗体仲介治療のための標的としてことに適当である。抗CD20抗体仲介治療は、なかでも、同時継続米国出願第07/978,891号、及び 号、本願と同時に提出、に開示されている。利用する抗体は、哺乳動物細胞中で高いレベルで発現されるマウス／ヒトキメラ抗CD20抗体（「キメラ抗CD20」）である。この抗体はここに開示するベクター、すなわち、次のベクターを使用して誘導された： TCAE5.2；ANEX１；ANEX２； GKNEOSPLA3F；およびNEOSPLA3F(追加のベクター、TCAE８、をまた利用してキメラ抗CD20を誘導した−−TCAE８は、 NEO翻訳開始部位が部分的に障害されたコンセンサスコザクである以外、 TCAE5.2と同一である。TCAE８は本願と同時提出の同時継続米国出願の記録に記載されている。）。
【００８６】
普通に譲渡された米国特許出願第07/912,292号の中に、なかでも、ヒト／旧世界(Old World) サルキメラ抗体が開示されている；その中に開示されている発明の態様はベクターTCAE６中のヒト／マカクキメラ抗CD４抗である（参照、米国特許出願第07／12,292号の第６図、および対応する論考）。TCAE６は TCAE5.2と実質的に同一である；TCAE６はヒトラムダ一定領域を含有するが、 TCAE5.2はヒトカッパ一定領域を含有する。 TCAE5.2およびANEX１（その特許記録においてTCAE12と呼ばれている）はヒト／旧世界サルキメラ抗体と組み合わせて利用できるベクターとして開示されている。 TCAE5.2およびANEX１に関して米国特許出願第07/912,292号に記載されている比較のデータは、キメラ抗CD20抗体の発現に関するものである。
【００８７】
TCAE5.2 はベクターCLDN、すなわち、ベクターRLDN10b の誘導体から誘導された (参照、253 Science 77−91, 1991) 。 RLDN10bはベクターTND の誘導体である (参照、7DNA 651−661, 1988)。すなわち、ベクター「族系統」は次の通りである： TND→ RLDN10b→CLDN→ TCAE5.2→ANEX１（「→」記号の使用は１つのベクターから次のものへの変化を達成するために必要な努力の指示として意図せず、またそのように解釈すべきでない；例えば、その反対に、CLDNからTCAE5.2 を発生するために必要な工程の数および複雑さは広範であった) 。
【００８８】
TND はヒト組織プラスミノゲンアクチベーターの高いレベルの発現のためにデザインされた。 RLDN10bは次の方法で TNDと異なる：ジヒドロ葉酸リダクターゼ（「DHFR」) の転写カッセト (プロモター、ネズミDHFR cDNA 、およびポリアデニル化領域からなる）を組織プラスミノゲンアクチベーターカッセト (「ｔ−PA発現カッセト」) とネオマイシンリン酸転移酵素 (「NEO 」カッセト) との間に配置されたので、すべての３つのカッセトは直列でありかつ同一の転写の向きであった。 TNDベクターは、メトトレキセートMTX に応答するDHFR遺伝子の増幅について選択する前に、G418を使用する DHFR, NEOおよびｔ−PAを有する細胞についての選択を可能とした。
【００８９】
DHFR遺伝子の前のプロモーターはマウスベータグロビン主要プロモーターに変化された (参照、３ Mol. Cell. Biol. 1246−1254, 1983) 。最後に、異なる問題の遺伝子をポリリンカーの中に挿入することができるように、ｔ-PA cDNAはポリリンカーにより置換された。TND ベクターのすべての３つの真核転写カッセト（ｔ−PA, DHFR, NEO)は、制限エンドヌクレアーゼNotIを使用する消化により細菌プラスミドDNA (pUC19誘導体) から分離することができる。
【００９０】
CLDNは次の方法で RLDN10bと異なる：ポリリンカーの前に位置するラウスLTR は、-581におけるSpeI部位から−16におけるSstIまで (これらの番号はCell参考文献からのものである) の、ヒトサイトメガロウイルスの直接初期の遺伝子プロモーターエンハンサー (「CMV 」) 、 (参照、41 Cell 521, 1985)と置換された。
【００９１】
名称が示すように、TCAEベクターはキメラ抗体の高いレベルの発現のためにデザインされた。 TCAE5.2は次の方法でCLDNと異なる：
A, TCAE5.2は、３つ（３）と反対に、４つ（４）転写カッセトからなり、そしてこれらは直列の順序である、すなわち、ヒト免疫グロブリンの軽鎖は可変領域を欠く；ヒト免疫グロブリンの重鎖は可変領域；DHFR；および NEOを欠く。各転写カッセトはそれ自身の真核プロモーターおよびポリアデニル化領域を含有する(TCAE5.2ベクターの線図的表示である第２図を参照されたい）。免疫グロブリンの重鎖の前の CMVプロモーター／エンハンサーは、-350におけるNheI部位から−16におけるSstIまで (番号はCell参考文献、前掲、からのものである) の、軽鎖の前のプロモーター／エンハンサーの切形バージョンである。
【００９２】
詳しくは、
１）ヒト免疫グロブリンの軽鎖の一定領域は、 PCR反応によりcDNAの増幅を経て誘導された。 TCAE5.2において、これはヒト免疫グロブリンの軽鎖のカッパ一定領域(Kabat数、アミノ酸108-214 、アロタイプKm３）、およびヒト免疫グロブリンの重鎖のガンマ１一定領域(Kabat数、アミノ酸114-478 、アロタイプGmla, Gmlz) であった。軽鎖は通常のヒト血液から単離された (IDEC Pharmaceuticals Corporaiton、カリフォルニア州ラジョラ）；それからの RNAを使用してcDNAを合成し、次いでこれを PCR技術を使用して増幅した (プライマーはコンセンサスKabat に関して誘導された) 。
【００９３】
重鎖を RNAから調製したcDNAから単離し(PCR技術を使用して) これを引き続いてヒトIgG1ベクターでトランスフェクションされた細胞から誘導された (参照、3 Prot. Eng. 531, 1990) ；ベクターpN  １62) 。２つのアミノ酸は単離されたヒトIgG1において Kabatにおけるコンセンサスアミノ酸配列に合致するように変化させた、すなわち：アミノ酸225 をバリンからアラニンに変化させ(GTT→GCA)、そしてアミノ酸287 をメチオニンからのリジンに変化させた(ATG→AAG)；
【００９４】
２）ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のカッセトは、免疫グロブリン鎖の分泌のための合成シグナル配列を含有する；
３）ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のカッセトは、移行リーディングフレームを維持しそして免疫グロブリン鎖の中に通常見出されるアミノ酸を変更する、軽鎖および重鎖の免疫グロブリンの可変領域の挿入を可能とする特別の DNA制限部位を含有する；
【００９５】
４）DHFRカッセトはそれ自身の真核プロモーター (マウスのベータグロビン主要プロモーター、「BETA」) およびポリアデニル化領域 (ウシ成長ホルモンのポリアデニル化、「BGH 」) を含有した；そして
５）NEO カッセトはそれ自身の真核プロモーター (BETA) およびポリアデニル化領域 (SV40初期ポリアデニル化、「SV」) を含有した。
【００９６】
TCAE5.2 および NEOカッセトに関すると、コザク領域をコンセンサスコザク (これは上流のClaI部位配列番号：７を含んだ）であった：
ClaI    -3      +1
TTGGGAGCTTGG ATCGAT ccAcc ATG Gtt
ANEX１（参照したケースにおいて以前にTCAE12と命名された) は、 NEOカッセトにおいて、コザク領域が完全に障害されていた (配列番号：８）以外、TCAE12と同一である：
ClaI    -3      +1
TTGGGAGCTTGG ATCGAT ccTcc ATG Ctt
【００９７】
普通に譲渡された参照したケースに開示されているように、完全に障害されたコンセンサスコザクの利用の衝撃は顕著であった： TCAE5.2に関して、細胞につき同一量のトランスフェクションされたプラスミドDNA からのANEX1 G418耐性コロニーの数の有意な（８倍の）減少（２エレクトロポレイションからの258/６エレクトロポレイションからの98）が存在した；そして、ANEX１クローンの各々において発現された共連鎖した遺伝子生産物の量の有意な増加が存在した。
【００９８】
第３図（普通に譲渡された参照したケースの第16図）のヒストグラムド参照すると、翻訳開始部位にコンセンサスコザクをもつネオマイシンリン酸転移酵素の遺伝子を含有するDNA の25μｇの２エレクトロポレイションから 258コロニーが誘導された。これらのコロニーのうちの二百一(201) は検出可能な遺伝子生産物 (25ng／mlより少ないキメラ免疫グロブリン）を発現せず、そしてわずかに８コロニーが100ng ／mlより多くを発現した。
【００９９】
再び、第３図を参照すると、翻訳開始部位に完全に障害されたコンセンサスコザクをもつネオマイシンリン酸転移酵素の遺伝子を含有するDNA の25μｇのANEX１についての６エレクトロポレイションから98コロニーが誘導された（統計学的に比較する値を発生するために６エレクトロポレイションを利用した；なぜなら、平均すると、ANEX１についての各エレクトロポレイションは約16コロニーを生じ、これに対して TCAE5.2については約 129コロニー／エレクトロポレイションであったからである）。ANEX１コロニーの８つ（８）は検出可能な遺伝子を発現しなかった（25ng／mlより少ない）が、これらのコロニーのうちの62は 100ng／mlより多く発現されていた；これらの62コロニーのうちで、ほぼ23は 250ng／mlを超えて発現されており（23％）、６は1000ng／mlより多く発現されていた（６％）。
【０１００】
上の証拠は、なかでも、次の通りである：１） TCAE5.2とANEX１との問の差は NEO遺伝子のコザク翻訳開始部位に限定され、そして問題の遺伝子生産物 (キメラ抗CD20抗体）は NEO遺伝子に共連鎖されたので、結果におけるこれらの差はコザク翻訳開始部位における差にのみ帰属されるという結論が導かれる；２）優性の選択可能な数と組み合わせた完全に障害されたコンセンサスコザクの利用は有意により少ない生活可能なコロニーを生ずるということが実験的に確証された；３）所望の DNA遺伝子生産物に共連鎖した優性の選択可能なマーカーと組み合わせた完全に障害されたコンセンサスコザクの利用は発現された遺伝子生産物の量を有意に増加するということが実験的に確証された。こうして、スクリーニングすべきコロニーの数は減少すると同時に発現される遺伝子生産物の量は増加した。
【０１０１】
II．フレーム外開始配列の衝撃
概念的には、ANEX１の優性の選択可能なマーカーの転写開始のそれ以上の障害は、ネオマイシンリン酸転移酵素開始コドンから上流の少なくとも１つのフレーム外 ATG開始コドンの利用により実施することができた。このアプローチをさらに１工程取ると、そのステム内に neo開始コドン取り込んだ二次構造 (「ヘアピン」) の利用は転写開始をさらに阻害すると推定されるであろう。こうして、フレーム外の開始コドン／完全に障害されたコンセンサスコザクを考慮したとき、この領域はこのような二次構造の可能性が増加されるようにデザインした。
【０１０２】
前に示したように、ANEX１ベクター中の neo開始コドンのためのコザク領域は次の通りである：
TTGGGAGCTTGG ATCGAT CC Tcc ATG Ctt
ANEX１と同一であるが、 neo開始コドンに関して上に識別した変化を取り込んだベクターのための所望の配列 (ANEX２と呼ぶ）は次の通りである：
CCA GCA TGG AGG A ATCGAT CC Tcc ATG Ctt
（フレーム外の開始コドンに下線が引かれている。）
【０１０３】
ANEX２の完全に障害されたコンセンサスコザクはANEX１と同一である。主要な差は上流のフレーム外の開始コドンを含むことである。可能な差はこの配列を含む二次構造の形成であり、次のように提案される：
【０１０４】
【化３】
2006271402.tif 000005
【０１０５】
肉太の配列、 ATG、は上流のフレーム外の開始コドンである：二次構造の「ループ」部分はCLA Ｉ部位である；そして「Ｔ」および「Ｃ」（イタリックおよび肉太）の間の配列は完全に障害されたコンセンサスコザクの開始コドン（下線）である。
【０１０６】
この変化を実施するために、 PCR断片をANEX１中の抗CD20の中にXhoI（5520）〜ClaI（5901）においてクローニングした；参照、第４図。プライマーは次の通りであった：
【０１０７】
【化４】
2006271402.tif 000006
【０１０８】
プライマー489 の上線の部分はClaI部位である；下線の部分は完全に傷害されたコンセンサスコザク翻訳開始部位である。
５′−プライマー488 （配列番号：11）：
５′−CTG GGG CTC GAG CTT TGC−３′
プライマー488 の上線の部分はXhoI部位である。
【０１０９】
これらのプライマーはABI 391 PCR MATEＴＭDNA 合成装置（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して調製した。ホスホルアミダイトはクルアケム（Cruachem) （グアスゴウ、スコットアンド）から入手した：dA（bz）−製品 No.20−8120−21；dG(ibu) −製品 No.20−8110−21；dC(bz)−製品 No.20−8130−21；Ｔ−製品 No.20−8100−21。
【０１１０】
これらのプライマーを使用するPCR 反応のための条件は次の通りであった：大腸菌（E.coli) 株GM48（ATCCから入手した) 中で成長させたプラスミド中のTCAE5.2 中の２λ（「マイクロリットル」）の抗CD20を77λの脱イオン水；２λのプライマー488 (64pmol)；および４λのプライマー489 (56pmol)と混合した。次いで、変性工程（94℃、５分）および復元工程（54℃、５分）を実施した。
【０１１１】
その後、４λの５mnのdNTPS(Promeg、ウイスコンシン州マディソン：dATP、製品No.U1201; dCTP、製品No.U1221; dGTP、製品No.U1211; dTTp、製品No.U1231) 、１λのPfu DNA ポリメラーゼ（Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ、製品 No.600135、 2.5Ｕ／ml）、および50λの鉱油オーバーレイをそれに添加し、次いで30サイクルを実施し、各サイクルは次からなっていた：72℃、２分；94℃、１分；54℃、１分。この混合物の10マイクロリットル（10λ）をアガロースゲルの電気泳動（結果は示されていない）により分析した；単一のバンドが約 400塩基対において見出された。
【０１１２】
PCR 生成物およびベクターを結合のために次のようにして調製した：大腸菌（E.coli) 細菌株GM48中で成長させたANEX１プラスミド中の抗CD20を次のようにClaIおよびXhoIで消化した：ANEX１中の20λの抗CD20を10λの10×NEB4緩衝液(New England Biolabs、マサチュセッツ州ベベリイ; 以後、NEB)；５λのClaI(NEB、製品No.197Ｓ、60ｕ）および64λの脱イオン水と混合した。この混合物を37℃において一夜インキュベーションし、次いで５λのXhoI(NEB、製品No.146Ｓ、 100ｕ）を添加しそして37℃において２時間インキュベーションした。生ずる物質を「ClaI／XhoI切断ANEX１」と表示する。
【０１１３】
ほぼ 400塩基対のPCR 断片を次のようにして調製しそしてClaIおよびXhoIで消化した：90λのPCR 断片を10λの３Ｍ NaOAc; １λの10％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS）; および90λのフェニル／CHCl3／イソアミルと混合した。この混合物を30分間撹拌し、次いで１分間回転（1700RPM)した。水性相を回転カラムに暴露し、これにより合計85λの混合物が得られた。この混合物に、10λの10×NEB4、１λのウシ血清アルブミン(BSA、 100×;NEB) 、２λのClaI（24ｕ）、および２λのXhoI（40ｕ）を添加した。この混合物を37℃において２時間インキュベーションした。生ずる物質を「ClaI／XhoI切断PCR488／489 」と表示する。両方のClaI/ XhoI切断ANEX１およびClaI／XhoI切断PCR488／489 をアガロースゲルの電気泳動により分析し、そして生ずるバンドは同一の相対位置において観測された（結果は示されていない。）。
【０１１４】
ClaＩ／XhoＩ切断PCR488／489およびClaＩ／XhoＩ切断ANEX１の結合を次のように達成した：１λのtRNA(Sigma、ミゾリー州セントルイス、製品 No.Ｒ−8508）を0.75λのトリス−ヒドロキシメチルアミノメタンエチレンジアミン四酢酸（TE）；および42λのTE中の１λの10％SDS:10λの３Ｍ NaOAc; 45λのClaI／XhoI切断PCR488／489（約22.5ng）；１：４希釈（25λ）のClaI／XhoI切断ANEX１（約32ng) と混合した。この混合物に、90λのフェニル／CHCl3／イソアミルを添加し、次いで30秒間撹拌しそして１分間回転（1700RPM)した。
【０１１５】
水性相を新しい管に移し、次いで 270λの 100％EtOH（−20℃）を添加し、10分間回転（12,000RPM)し、次いでさらに 270λの 100％EtOH（−20℃）を添加し、そしてさらに１分間回転（13,000RPM)した。この混合物をスピード(Speed)VACＴＭ中で乾燥し、そして17λのTE、２λのリガーゼ緩衝液(Promega、T4DNA リガーゼキット、製品 No.M180) および１λのリガーゼ(Promega、リガーゼキット）の中に再懸濁させた。この結合混合物を14℃において一夜インキュベーションした。
【０１１６】
20マイクロリットル（20λ）の結合混合物を10λの３Ｍ NaOAc、１λの10％SDS 、69λのTE、および90λのフェニル／CHCl3／イソアミルと混合した。この混合物を30秒間撹拌し、次いで１分間回転（1700RPM)した。水性相を新しい管に移し、そして 270λの 100％EtOH（−20℃) をそれに添加し、次いで10分間回転（1700RPM)した。この混合物をスピード(Speed)VACＴＭ中で乾燥し、そして20λのTEの中に再懸濁させた。再懸濁させた混合物の10マイクロリットルを大腸菌（E.coli) X-L1 blueTM（Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ）中で製造業者の使用説明書に従い形質転換した。
【０１１７】
10の細菌のコロニーを、アンピシリン（50μｇ／ml; Sigma 、製品 No.Ａ−9393）を含むLBブロス(Gibco BRL、ニューヨーク州グランドアイランド、製品 No.M27950B)の中に接種した。プロメガ(Promega）DNA 精製システム（製品 No.PR−A7100)を製造業者の使用説明書に従い使用して10培養物からプラスミドを単離した；これらのプラスミドは、以上の十分な量に依存して、ANEX２ベクターを構成していることがある。
【０１１８】
ANEX２はneo 開始部位から上流のHinfI 部位（「GAATC 」) を含む(neo開始コドンに関して−９〜−13）；ANEX１はこのHinfI 部位を含まない。推定上のANEX２、および前に精製したANEX１標準からなる精製したプラスミドを次のようにHinfI 消化した：２λの各単離物を８λのHinfI 消化緩衝液（15λの10×NEB2緩衝液; 15λのHinfI (NEB、製品No.155Ｓ、10ｕ／λ）；および90λのH2O)と混合した。この混合物を37℃において３時間インキュベーションし、そして各単離物をアガロースゲルの電気泳動により分析した（結果は示されていない）；バンドの９つ（９）はANEX１標準と実質的に同一であり、１つ（１）はバンドのパターンのわずかの差を示した。
【０１１９】
この単一の単離物について、最初の２つのバンドは1691および670kBに存在した; ANEX１のHinfI 消化した生成物について、最初の３つのバンドは1691, 766 、および670kB に存在した。単一の単離物について766kB における欠けているバンドはその中のHinfI 部位の存在に帰属され、ANEX１への所望の変化がこのベクターの中に取り込まれたことを示した。このベクターを「ANEX２中の抗CD20（Ｇ１，Ｋ）」と表示し、そして一般に本発明者はANEX２と呼ぶ。
【０１２０】
ANEX２中の抗CD20のエレクトロポレイションを次のように達成した：240マイクロリットル(240λ) のANEX２中の抗CD20 DNA ( 400μｇ）を 100λの10×NEB4緩衝液； 100λのStuI(NEB、製品No.187Ｓ、1000ｕ）；および 560λのTEと混合し、そして37℃において２時間インキュベーションした。次いでこの混合物を８回転カラム（各々 125λ) の上に配置し、次いで 110λの10×NotI緩衝液(NEB）；10λのBSA ；および20λのNotI(NEB、製品No.189Ｓ、 800ｕ）を添加した。この混合物を37℃において３時間インキュベーションし、次いで 120λの３Ｍ NaOAcおよび12λの10％SDS を添加した。
【０１２１】
この混合物を２本の撹拌管に移しそして 500λのフェニル／CHCl3／イソアミルを各々に添加し、次いで30秒間撹拌し、そして１分間回転（1700RPM)した。水性相を管から取り出し、そして３本の管の中に分離し、次いで各に−20℃の 100％ETOHを添加し、次いで10分間回転（13,000RPM)した。その後、−20℃の 100％ETOMを各管に添加し、次いで１分間回転（13,000RPM)した。次いで管をスピード(Speed)VACＴＭ中で乾燥し、次いで内容物を無菌のフード中で 100λのTEの中に再懸濁させた。５マイクロリットル（５λ）の再懸濁させたDNA を 995λの脱イオン水と混合した（１：200 の希釈) 。
【０１２２】
光学密度を読み（OD＝260)そして存在するDNA の量は0.75μg ／λであると計算された。25μｇのDNA をエレクトロポレイションのために利用するために、32λのDNA を利用した（25μｇは前の実施例１においてTCAE5.2 およびANEX１のために利用したDNA の量であったので、これを利用した）。DNA の１：200 希釈物を形式的に「TE中のANEX２（25μｇ）中のStuI、NotI切断抗CD20」と呼び、そして一般に「ANEX２中の抗CD20」と呼んだ。
【０１２３】
利用した宿主細胞はDG44 CHO（「CHO」）であった（参照、Urlaub, G.Somatic Cell, 1986、前掲) 。 100mlの 6.6×105 細胞／ml（84％）を1000RPM で２分間回転した。これらを50mlのスクロース緩衝化溶液で洗浄し、次いで1000RPM で５分間回転した；次いで物質を4.5ml のスクロース緩衝化溶液の中に再懸濁させた。その後、細胞をカウントし、そして0.4ml のCHO 細胞(4.0×106 細胞）をBTX 無菌の使い捨てエレクトロポレイションクベット内のANEX２中の32λの抗CD20と混合した。エレクトロポレイションのセットは次の通りであった： 210ボルト； 400マイクロファラデーのキャパシタンス；13オームの抵抗、BTX600ＴＭ電池マニュピュレーター(BTX、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用した。
【０１２４】
９つ（９）エレクトロポレイションを実施した；実際の時間にわたって供給された実際の電圧は次の通りであった：１〜199Ｖ、4.23msec：２〜188Ｖ、4.57msec；３〜189Ｖ、4.24msec、４〜200Ｖ；4.26msec、５〜200Ｖ、4.26msec；６〜199Ｖ、4.26msec；７〜189Ｖ、4.59msec；８〜189Ｖ、4.57msec；９〜201Ｖ、4.24msec。（実施例Ｉに記載したように、実施したエレクトロポレイションの数の差は、３つの条件、TCAE5.2 、ANEX１およびANEX２の各々について生活可能なコロニーの統計学的に有意な数を達成するための必要性に帰属された；各エレクトロポレイションのために使用したDNA の量（25μｇ）は各々について同一であり、そして同一数の細胞をエレクトロポレイションした。
【０１２５】
その後、エレクトロポレイション物質を20mlのG418成長培地(CHO−Ｓ−SFM IIマイナスハイポキサンチンおよびチミジン(Gibco、グランドアイランド、NT, Form No.91−0456PK) 50μＭのハイポキサンチンおよび８μＭのチミジンを含む）と混合した。この混合物をおだやかに撹拌し、次いで 200μｌ／ウェルの混合物を96ウェルのプレート、各エレクトロポレイション（９）について１プレート、に入れた。エレクトロポレイション後第２日に開始し、第17日を通して、各ウェルの 150μｌを取り出し、そして 400μｇ／mlのG418を含有する新鮮なG418成長培地の 150μｌをそれに添加した。コロニーを第25日に分析した。
【０１２６】
121個のコロニーは抗CD20抗体を発現した（すなわち、13コロニー／エレクトロポレイション）。これらのうちで、63（52％）は 250μｇ／mlを超えるタンパク質を発現した；63のうちで、20のコロニー（16.5％）は1000μｇ／mlを超えるタンパク質を発現した。 121コロニーのうちの５(4.1％) のみは25μｇ／mlより少ないタンパク質を発現した。第５図は、ベクターTCAE5.2 、ANEX１およびANEX２から誘導されたコロニーにつきタンパク質の発現を比較するヒストグラムドを提供する。
【０１２７】
以上のデータが示すように、なかでも、ANEX１とANEX２との間におけるように、優性の選択可能なマーカーの転写開始に関連する完全に障害されたコンセンサスコザクから上流の少なくとも１つのフレーム外の開始コドンの使用は、共連鎖した遺伝子生産物を発現する生活可能なコロニーの数を減少し、そして発現された共連鎖遺伝子生産物の量を有意に増加する。
【０１２８】
III ．優性の選択可能なマーカーの少なくとも１つの人工のイントロン挿入領域内の問題の遺伝子生産物の挿入の衝撃
さらにANEX２ベクター上に構成するとき、ANEX２のNEO コーディング領域のアミノ酸残基51と52との間に人工のスプライスを発生させ、次いでその中に抗CD20エンコーディング領域を挿入した。２つのこのようなベクターを発生させた：第１は、 NEOのためのコンセンサスコザク配列を含むが、フレーム外の開始コドンを含まず、「GKNEOSPLA3F 」と呼ぶ；第２は、完全に障害されたコンセンサスコザクおよびフレーム外の開始コドンを含み、「NEOSPLA3F 」と呼ぶ。
【０１２９】
GKNEOSPLA3F およびNEOSPLA3F の両方は、 NEOのアミノ酸残基51と52との間に人工のイントロンを含有する：
【０１３０】
【化５】
2006271402.tif 000007
【０１３１】
下線が引かれている部分はNotI酵素で消化可能な配列を表す；なかでも、抗CD20のためにエンコーディング領域はこの領域内に挿入された。
【０１３２】
いかなる特定の理論にも拘束されたくないが、優性の選択可能なマーカーの人工のイントロン挿入領域内に問題の遺伝子生産物を含める（例えば、 NEO遺伝子）と、開示したGKNEOSPLA3F およびNEOSPLA3F ベクターの場合において、抗CD20抗体を生産する生活可能なコロニーの数は有意に減少すると本発明者は仮定する。これは２つの点について予測される：第１に、抗体エンコーディング領域を転写しかつ正しくスプライス−アウトしそしてNEO を正しく翻訳することができるベクターのみがG418耐性である；第２に、各抗体カッセトはそれ自身のプロモーターおよびポリアデニル化領域を有するので、抗体の転写および翻訳はNEO の翻訳に対して独立である。
【０１３３】
GKNEOSPLA3F およびNEOSPLA3F ベクターは次の方法で構成した：
ANEX２中の抗CD20を次のようにNotIおよびXhoIで消化して、1503bpのNEO カッセトDNA 断片を単離した（参照、第４図、「NotI 7023 」と「XhoI 5520 」との間）：10μｌのANEX２中の抗CD20を６μｌの脱イオンH2O （「dH2O」）：１μｌのNotI酵素(NEB、製品No.189Ｓ）；２μｌの10×NotI消化緩衝液(NEB; 酵素とともに提供される）；および１μｌのXhoI酵素(Promega、ウイスコンシン州マディソン、製品No.R4164）と混合した。この消化混合物を37℃において一夜インキュベーションした。生ずる消化したDNA を 0.8％アガロースゲルの電気泳動により大きさで分画し、そして1503において移動する所望の断片を、ｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）プラスミド（Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ) の中に挿入するために、グラス(Glass)MAXTM法(Gibco BRL、ニューヨーク州グランドアイランド、製品No.15590−011)により単離した。
【０１３４】
ｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）は、ANEX２中の抗CD20について前述したのと同一の条件を使用して、NotIおよびXhoIにより二重消化によりNEO カッセトの受容のために前もって調製した。次いで消化したｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）を70μｌのdH2O；２μｌのtRNA(Sigma、ミゾリー州セントルイス、製品 No.Ｒ−8508）；10μｌの３Ｍ NaOAc；および 300μｌの 100％ETOH（−20℃）の添加によるエタノール沈澱により集めた。次いで10分間回転（13,000RPM)し、上澄み液をデカンテーションし、70％ETOHですすぎ、液体をデカンテーションし、スピード(Speed)VACＴＭ中で乾燥し、そして20μｌの１×TEの中に再懸濁させた。
【０１３５】
調製したｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）ベクターの中へのNEO カッセトDNA 断片の結合は、次のように達成した：10μｌのNEODNA断片を６μｌのdH2O；１μｌの切断ｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）ベクターDNA ；２μｌの10×結合緩衝液(Promega、酵素とともに供給された）；および１μｌのＴ−4DNAリガーゼ(Promega、製品No.M1801) と混合し、次いで14℃において一夜インキュベーションした。ｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）ベクターDNA の調製について前述したように、結合したDNA をエタノール沈澱により集めた。
【０１３６】
10μｌの再懸濁させた結合DNA を、製造業者の使用説明書に従い、大腸菌（E.coli) XL−１BlueＴＭ（Stratagene) の中に形質転換した。10の細菌コロニーをアンピシリン（50μｇ／ml；Sigma 、製品 No.Ａ−9393）を含むLBブロス(Gibco BRL、製品No.M27950B) の中に接種した。プラスミドを、製造業者の使用説明書に従い、10の培養物からプロメガ(Promega）DNA 精製システム（製品 No.PR−A7100)で単離した；これらのプラスミドは上の適切性に依存して BlueNEO＋と呼ぶプラスミドを含んでいることがある(BlueNEO＋は次の手順の適切性のために確証された。）。
【０１３７】
BlueNEO＋は、ｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）ベクター中にNEO カッセト断片DNA の結合したとき再形成されたNotI制限認識配列を含有する。この部位は次により破壊した；１μｌの BlueNEO＋を16μｌのdH2O；２μｌの10×NotI消化緩衝液(NEB) ；１μｌのNotI酵素(NEB）と混合した。次いで37℃において２時間インキュベーションした。次いで、この消化したDNA を回転カラムの分画により精製して、15μｌの最終体積を得た。この15μｌのNotI消化DNA を、４μｌの５×クレノー緩衝液（20mMのTris−HCl 、pH8.0 、 100mMのMgCl２)および１μｌのDNA ポリメラーゼＩの大きい（Klenow) 断片(Promega、製品No.M2201) と混合することよって「平滑末端」とした。この混合物を室温において30分間インキュベーションした。次いで、平滑末端のDNA を回転カラムの分画により精製して、15μｌの最終体積を得た。
【０１３８】
最終DNA を17μｌの１×TEの中に再懸濁させた以外、ｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）ベクターの中へのNEO カッセト断片DNA の結合と類似の方法で、平滑末端のDNA の結合を実施した。
結合後、17μｌのDNA を２μｌの10×NotI消化緩衝液および１μｌのNotI酵素(NEB) と混合することによって、 DNAをNotIを使用する第２回の消化に付した。消化を37℃において60分間進行させた。消化後、混合物を回転カラムの分画により精製して、15μｌの最終体積を得た。
【０１３９】
10μｌの精製したDNA を、製造業者の使用説明書に従い、大腸菌（E.coli) XL-1 BlueTM（Stratagene) の中に形質転換した。10の細菌コロニーをLBブロス(Gibco BRL、アンピシリン（50μｇ／ml；Sigma)を含む) の中に接種した。プラスミドを10の培養物からプロメガDNA 精製システムで製造業者の使用説明書に従い単離した；これらのプラスミドは以上の適切性に依存して BlueNEO−と呼ぶプラスミドを含んでいることがある。(BlueNEO−は次の手順の適切性のために確証された。）
【０１４０】
BlueNEO−はアミノ酸残基51および52のためのコドンをスパニングする独特PstI制御部位を含有する。 BlueNEO−を次のように消化した：15μｌのdH2O；１μｌの BlueNEO−DNA 、２μｌの消化緩衝液３(NEB) および２μｌのPstI酵素(NEB、製品No.140S)を含有する混合物を形成した。この混合物を37℃において３時間インキュベーションした。次いで消化したDNA を回転カラムの分画により精製した。次いで次の合成オリゴヌクレオチドを BlueNEO−のPstI粘着末端に結合した：
5′GGTAAGTGCGGCCCCTACTAACTCTCTCCTCCCTCCTTTTTCCTGCA3′（配列番号：12）およびその相補的配列：
5′GGAAAAAGGAGGGAGGAGAGAGTTAGTAGCGGCCGCACTTACCTGCA3′（配列番号：13）。
【０１４１】
このリンカーの挿入は、上に示したように、コンセンサス５′スプライスドナー部位（結合により）、次いでNotI部位、次いでコンセンサススプライス分岐点、次いで合成ポリピリミジン道、次いでコンセンサス３′スプライスアクセプターをつくる。
２μｌのPstI線状化 BlueNEO−DNA および14μｌ（175pmol)のアニーリングした相補的オリゴヌクレオチドを使用する以外、ｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）中へのNEO カッセトの結合について前述したように結合を実施した。
【０１４２】
アプライド・バイオシステム（Applied Biosystems）391 PCR MATEＴＭ合成装置（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して、以上（および以下）の合成オリゴヌクレオチドを化学的に合成した。
ｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）ベクターDNA の調製について前述したように、結合したDNA をエタノール沈澱により集めた。
【０１４３】
10μｌの再懸濁させた結合DNA を、製造業者の使用説明書に従い、大腸菌（E.coli) XL−１BlueTM（Stratagene) の中に形質転換した。10の細菌コロニーをアンピシリン（50μｇ／ml；Sigma)を含むLBブロス(Gibco BRL) の中に接種した。プラスミドを10の培養物からプロメガDNA 精製システムで製造業者の使用説明書に従い単離した；これらのプラスミドは以上の適切性およびオリゴヌクレオチドの挿入の向きに依存してNEOSPLA および／または NEOSPLA−と呼ぶプラスミドを含んでいることがある。
【０１４４】
シクエナーゼ・バージョン（Sequenase Version) 2.0 DNA配列決定キット(Unites States Biochemical、オハイオ州クレブランド、製品No.70770）を製造業者の使用説明書に従い使用する核酸の配列決定により、スプライス接合リンカーの向きの決定を実施した。６つの独立のプラスミド単離物内のリンカーの向きが決定されると、挿入された接合配列がNEO 転写の方向に関して正しい前方の向きにあるように、NEOSPLA の同定を行った。
【０１４５】
15μｌのdH２O；１μｌのNEOSPLA DNA ：２μｌの10×消化緩衝液(Promega、酵素とともに供給された）; および２μｌのXhoI酵素(Promega、製品No.R6161) の混合物を形成することによって、NEOSPLA をXhoIで消化した。この混合物を37℃において３時間インキュベーションし、次いで回転カラムの分画によりDNA を精製した。この部位の中に次の配列を有する自己相補的合成オリゴヌクレオチドを結合した：５′TCGATTAATTAA３′（配列番号：14）。この配列の挿入はXhoI部位をPacI制限部位に効果的に変化させる（配列番号：14において下線が引かれているように）。
【０１４６】
２μｌのXhoI線状化 NEOSPLA−DNA および14μｌ(175pmol) のアニーリングした相補的オリゴヌクレオチドを使用する以外、ｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）中へのNEO カッセトの結合について前述したように結合を実施した。
ｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）ベクターDNA の調製について前述したように、結合したDNA をエタノール沈澱により集めた。
【０１４７】
10μｌの再懸濁させた結合DNA を、製造業者の使用説明書に従い、大腸菌（E.coli) XL−１BlueTM（Stratagene) の中に形質転換した。10の細菌コロニーをアンピシリン（50μｇ／ml；Sigma)を含むLBブロス（Gibco BRL)の中に接種した。プラスミドを10の培養物からプロメガDNA 精製システムで製造業者の使用説明書に従い単離した；これらのプラスミドは以上の適切性に依存してNEOSPLA3と呼ぶプラスミドを含んでいることがある。（NEOSPLA3は次のプロセスの適切性のために確証された。）
【０１４８】
ANEX２（G1，K）中の抗CD20は、５′末端におけるNotI部位および３′末端におけるXhoI部位により結合された抗CD20の軽鎖および重鎖の免疫グロブリンのカッセトおよびDHFRカッセトを含有する。15μｌのdH2O、１μｌのANEX２（G1，K）中の抗CD20DNA 、２μｌの10×消化緩衝液Ｄ(Promega、酵素とともに供給された）；および２μｌのXhoI酵素(Promega、製品No.R6161) の混合物を形成することによって、ANEX２（G1，K）中の抗CD20をXhoIで消化した。この混合物を37℃において３時間インキュベーションし、次いで回転カラムの分画によりDNA を精製した。この部位の中に次の配列を有する自己相補的合成オリゴヌクレオチドを結合した：５′ TCGAAGCGGCCGCT3′（配列番号：15）。この配列の挿入はXhoI部位をNotI制限部位に効果的に変化させる（配列番号：15において下線が引かれているように）。
【０１４９】
２μｌのANEX２DNA 中のXhoI線状化抗CD20および14μｌ（175pmol)のアニーリングした相補的オリゴヌクレオチドを使用する以外、ｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）中へのNEO カッセトの結合について前述したように結合を実施した。
ｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）ベクターDNA の調製について前述したように、結合したDNA をエタノール沈澱により集めた。
【０１５０】
10μｌの再懸濁させた結合DNA を、製造業者の使用説明書に従い、大腸菌（E.coli) XL−１BlueTM（Stratagene) の中に形質転換した。10の細菌コロニーをアンピシリン（50μｇ／ml；Sigma 、製品 No.Ａ−9393）を含むLBブロス(Gibco BRL、製品No.M27950B) の中に接種した。プラスミドを10の培養物からプロメガDNA 精製システム（製品 No.PR−A7100)で製造業者の使用説明書に従い単離した；これらのプラスミドは以上の適切性に依存してANEX２（Ｇ１，Ｋ）中の抗CD20と呼ぶプラスミドを含んでいることがある。（これは次のプロセスの適切性のために確証された）。
【０１５１】
６μｌのdH2O；10μｌのANEX２（G1，K）中の抗CD20；２μｌの10×NotI消化緩衝液(NEB、NotI酵素とともに供給された) ；および２μｌのNotI酵素(NEB) の混合物を形成することによって、ANEX２（G1，K）中の抗CD20で消化した。この混合物を37℃において３時間インキュベーションし、次いで 0.8％アガロースゲルの電気泳動による大きさ分画を実施し、そして5515において移動する所望の断片をNEOSPLA3の中への挿入のためにグラス(Glass)MAX法により単離した。
【０１５２】
16μｌのdH2O；２μｌの10×NotI消化緩衝液(NEB）；１μｌのNotI酵素(NEB）からなる混合物を使用してNotIで１μｌのDNA を消化し、次いで37℃において２時間インキュベーションすることによって、抗CD20カッセトの受容のためにNEOSPLA3を前もって調製した。次いでこの消化したDNA を回転カラムの分画により精製して、15μｌの最終体積を得た。
【０１５３】
調製したNEOSPLA3ベクターの中への抗CD20DNA 断片の結合は、次のように達成した：10μｌの抗CD20断片DNA を６μｌのdH2O：１μｌの切断NEOSPLA3ベクターDNA ；２μｌの10×結合緩衝液(Promega、酵素とともに供給された）；および１μｌのＴ−4DNAリガーゼ(Promega) と混合し；次いで14℃において一夜インキュベーションした。ｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）ベクターDNA の調製について前述したように、結合したDNA をエタノール沈澱により集めた。
【０１５４】
10μｌの再懸濁させた結合DNA を、製造業者の使用説明書に従い、大腸菌（E.coli) XL−１BlueＴＭ（Stratagene) の中に形質転換した。10の細菌コロニーをアンピシリン（50μｇ／ml；Sigma)を含むLBブロス（Gibco BRL)の中に接種した。プラスミドを、製造業者の使用説明書に従い、10の培養物からプロメガ(Promega）DNA 精製システムで単離した；これらのプラスミドは上の適切性およびNEO 転写に関する挿入された断片の相対的向きに依存しNEOSPLA3F 中の抗CD20およびNEOSPLA3R 中の抗CD20と呼ぶプラスミドを含んでいることがある。
【０１５５】
抗CD20カッセトの挿入の向きの決定は、次のようにNEB 緩衝液１＋アセテート化BSA 中のKpnIおよびSpeI(NEB、製品No.1335)を使用する二重消化により実施した：４μｌのDNA ；２μｌのNEB 緩衝液１；１μｌのKpnI；１μｌのSpeI；２μｌのBSA ；および10μｌのdH２Oからなる混合物を形成した。この混合物を37℃において２時間インキュベーションし、次いで 0.8％アガロースゲルの電気泳動の大きさ分画を実施した。独立のプラスミド単離物内の抗CD20挿入の向きが決定されたとき、挿入された配列がNEO 転写に関して前方の向きであるように、NEOSPLA3F 中の抗CD20の同定を行った。
【０１５６】
5515bpの抗CD20断片は、SV40起点、キメラマウスヒト免疫グロブリン軽鎖転写カッセト、キメラマウスヒト免疫グロブリン重鎖転写カッセト、およびネズミジヒドロ葉酸リダクターゼ転写カッセトを含有する（参照、第４図）。
【０１５７】
14μｌのdH2O、１μｌのNEOSPLA3F 中の抗CD20、２μｌの10×消化緩衝液１(NEB、酵素とともに供給された）、２μｌの10×アセチル化BSA (NEB、KpnI酵素とともに供給された）、１μｌのKpnI酵素、１μｌのSpuI酵素(NEB、それぞれ、製品No.142Ｓおよび187S)から成る混合物をつくることによって、NEOSPLA3F 中の抗CD20をKpnIおよびStuIで二重消化した。この混合物を37℃において３時間インキュベーションし、次いで 0.8％アガロースゲルの電気泳動による大きさ分画を実施し、そして9368塩基対において移動する所望の断片を断片をグラス(Glass)MAX法により単離した。
【０１５８】
DNA のPCR 断片をTCAE5.2 から発生させた。２つの次の合成オリゴヌクレオチドのプライマーをPCR 反応において利用した：
５′プライマー５′GCA TGC GGT ACC GGA TCC ATC GAG CTA CTAGCT TTG C3′（配列番号：16）；
３′プライマー５′CTG ACT AGG CCT AGA GCG GCC GCA CTT ACCTGC AGT TCA TCC AGG GC３′（配列番号：17）
配列番号：16の下線の部分はKpnI部位を表し、そして配列番号：17の下線の部分はStuI部位を表す。
【０１５９】
PCR 生成物をKpnIおよびStuIで消化し、次いで調製したNEOSPLA3F 中の抗CD20の中に結合した。
調製したNEOSPLA3F 中の抗CD20の中への627bp の結合は次のように達成された：
２μｌのNEOSPLA3F 中の抗CD20；１μｌのSDS ; １μｌのtRNA (Sigma)；11μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（pH4.5)を混合した。この混合物のフェニル／クロロホルムイソアミル抽出後、 270μｌのエタノール（氷冷）の添加によりDNA を沈澱させ、そしてこれを13,000rpm において10分間回転した。
【０１６０】
70％ETOHの洗浄後、DNA を16μｌのTEの中に再懸濁させ、10μｌのPCR 断片DNA を６μｌのdH2O、１μｌのNEOSPLA3F ベクターDNA 中の切断抗CD20、２μｌの10×結合緩衝液(Promega、酵素とともに供給された) および１μｌのＴ−4DNAリガーゼ(Promega) と混合し、次いで14℃において一夜インキュベーションした。ｐブルースクリプト（Bluescript) SK (−）ベクターDNA の調製について前述したように、結合したDNA をエタノール沈澱により集めた。
【０１６１】
10μｌの再懸濁させた結合DNA を、製造業者の使用説明書に従い、大腸菌（E.coli) XL−１BlueTM（Stratagene) の中に形質転換した。10の細菌コロニーをアンピシリン（50μｇ／ml；Sigma 、製品 No.Ａ−9393) を含むLBブロス(Gibco BRL、製品 No.M27950B)の中に接種した。プラスミドを10の培養物からプロメガDNA 精製システム（製品 No.PR−A7100)で製造業者の使用説明書に従い単離した；これらのプラスミドは以上の適切性に依存してNEOSPLA3F 中の抗CD20と呼ぶプラスミドを含んでいることがある。（確証は GKNEOSPLA3F／NEOSPLA3F の異なる領域の配列の決定に基づいた。）
【０１６２】
新しいプラスミドは、次の通りであるの遺伝子についてそのコザク配列におけるNEOSPLA3F 中の抗CD20と異なる：
【０１６３】
【化６】
2006271402.tif 000008
【０１６４】
TCAE５ベクター（コンセンサスコザクをもつNEO からなる）、ANEX２ベクター（完全に障害されたコザク、および上流のフレーム外の開始配列をもつNEO からなる）；NEOSPLA3F (NEOのアミノ酸51と52との間の人工のイントロン挿入領域を経て挿入された抗CD20；NEO は完全に障害されたコザクおよび上流のフレーム外の開始配列を有する) ；およびGKNEOSPLA3F (NEOのアミノ酸51と52との間の人工のイントロン挿入領域を経て挿入された抗CD20；NEO はコンセンサスコザクを有する）中の抗CD20の発現の比較分析。
【０１６５】
25μｇの各プラスミド（次のように消化した：TCAE５およびANEX２中の抗CD20−NotI：NEOSPLA3F 中の抗CD20−PacI；GKNEOSPLA3F 中の抗CD20−PacIおよびKpnI) を４×10６CHO細胞の中にエレクトロポレイションした; これらの消化物を利用して、哺乳動物細胞中で発現された遺伝子を細菌中のプラスミドの成長に使用したDNA から分離した。消化、DNA のEtOH沈澱、およびその乾燥後、DNA は無菌のTEの中に１μｇ／μｌの濃度で再懸濁させた。エレクトロポレイション条件は実施例IIに記載されている通りであったが、ただし 230ボルトを利用しそして、エレクトロポレイション後、細胞とDNA との混合物を室温において無菌の使い捨てエレクトロポレイションクベット中で10分間維持した。
【０１６６】
エレクトロポレイション後、G418耐性コロニーの期待された頻度に基づいて、表２に下に示すように、細胞を96ウェルの皿の中にプレートした（予備的実験から誘導されるように；データは示されていない）：
【０１６７】
【表２】
2006271402.tif 000009
【０１６８】
（細胞にG418含有培地を第２，５，７，９，12，14，18, 22, 26,30および34日に供給した；コロニーからの上澄み液を免疫グロブリンについてアッセイしそしてコロニーはウェル中で第18, 22, 26,30および34日にコンフルエントとなった）。
第７Ａ図〜第７Ｃ図は耐性のヒストグラムドを提供しそして特定のレベルにおける発現におけるコロニーの百分率を明らかにする。
【０１６９】
ここにおいて提供された実施例は、特定のベクター、完全に障害されたコンセンサスコザク配列、優性の選択可能なマーカー、転写カッセト、および／または発現されたタンパク質に制限されるとして解釈すべきではない。完全に障害されたコンセンサスコザク、およびその利用は、ANEX１およびANEX２ベクターに限定されるとして解釈すべきではない。同様に、好ましい完全に障害されたコンセンサスコザク配列およびベクターは、それらが本発明者が権利を与えられる配列またはベクターのみであるという、実際のまたは意味する許可を、いかなる方法においても構成しない。本発明者は適用可能な特許法の下で完全な範囲の保護を受ける権利がある。
【０１７０】
完全に障害されたコンセンサスコザク配列を取り込んだ好ましいベクターは、これらのベクターからなるプラスミドを表示することによってこれらのベクターを特許請求する目的でANEX１およびANEX２について本発明者により同定され、そして抗CD20は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的認識ついてのブダベスト条約の規定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection) (ATCC)米国20852 マリイランド州ロックビレパークローンアヴェニュー12301 に受託された。プラスミドはATCCにより1992年11月９日に試験され、そしてその日付で生活能力があると決定された。ATCCはこれらのプラスミドに次のATCC受託番号を割り当てた：69120 (TCAE12 (ANEX １) 中の抗CD20) および69118 （ANEX２（Ｇ１，Ｋ）中の抗CD20）；この受託の目的で、これらのプラスミドを大腸菌（E.coli) の中に形質転換した。
【０１７１】
本発明をそのある種の態様に関してかなり詳細に記載したが、本発明の教示の範囲内の他の態様が可能である。したがって、開示または以下の請求の範囲は、ここに含まれる好ましい態様の記載により限定されることを意図せず、また限定されると解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】図１は、コンセンサスコザクの関係する部分およびいくつかのとくに好ましい完全に障害されたコンセンサスコザク配列の関係する部分を提供する。
【図２】図２は、優性の選択可能なマーカーとしてネオマイシンリン酸転移酵素を使用する、マウス／ヒトキメラ免疫グロブリンの発現のためにデザインされたベクターTCAE5.2 およびANEX１（TCAE12) の線図的表示を提供し、ここで免疫グロブリン遺伝子は直列の立体配置で配置されている。
【図３】図３は、タンパク質の発現レベルとベクターTCAE5.2 およびANEX１とを比較するヒストグラムドである。
【図４】図４は、優性の選択可能なマーカーとしてネオマイシンリン酸転移酵素を使用する、マウス／ヒトキメラ免疫グロブリンの発現のためにデザインされたベクターANEX２の線図的表示を提供し、ここで免疫グロブリン遺伝子は直列の立体配置で配置されている。
【図５】図５は、タンパク質の発現レベルとベクターTCAE5.2 、ANEX１およびANEX２とを比較するヒストグラムドである。
【図６】図６は、マウス／ヒトキメラ免疫グロブリンの発現のためにデザインされた NEOSPLAベクターの線図的表示を提供する。
【図７Ａ】図７Ａは、タンパク質の発現レベルに関し、ベクター TCAE5.2とNEOSPLA3Fとをとを比較するヒストグラムドである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、タンパク質の発現レベルに関し、ベクターANEX２とNEOSPLA3Fとを比較するヒストグラムドである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、タンパク質の発現レベルに関し、ベクターGK-NEOSPLA3FとNEOSPLA3Fとを比較するヒストグラムドである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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