(57)【要約】【課題】従来法より簡便な方法で、特異的な核酸配列の増幅が可能となる核酸配列増幅方法および増幅産物の検出方法を提供すること。【解決手段】（１）（ａ）標的核酸配列を含有すると推定される試料、（ｂ）標的核酸配列の３′末端領域にアニールする相補的配列、ＲＮＡポリメラーゼ認識プロモーター配列および親和性分子ペアの一方を含有する標的核酸配列捕捉プローブ、および（ｃ）親和性分子ペアの他方を微小粒子に固定してなる担体を接触させ、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体からなる複合体を形成させる工程、ならびに（２）ＲＮアーゼＨ活性を有する逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの存在下で、または逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびＲＮＡポリメラーゼの存在下で、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列を鋳型とする核酸配列増幅反応を実施する工程を含む核酸配列増幅法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）（ａ）標的核酸配列を含有すると推定される試料、
（ｂ）標的核酸配列の３′末端領域にアニールする相補的配列、ＲＮＡポリメラーゼ認識プロモーター配列および親和性分子ペアの一方を含有する標的核酸配列捕捉プローブ、および
（ｃ）親和性分子ペアの他方を微小粒子に固定してなる担体
を接触させ、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体からなる複合体を形成させる工程、ならびに
（２）ＲＮアーゼＨ活性を有する逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの存在下で、または逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびＲＮＡポリメラーゼの存在下で、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列を鋳型とする核酸配列増幅反応を実施する工程
を含む核酸配列増幅法。
【請求項２】
前記工程（１）および工程（２）の間に
（１′）複合体を試料から分離する工程
を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
親和性分子ペアが、
（ｄ）アビジンとビオチンとのペア、および／または
（ｅ）抗原と抗体とのペア
であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
抗原と抗体とのペアが、フェニトインと抗フェニトイン抗体とのペアである請求項３記載の方法。
【請求項５】
抗原と抗体とのペアが、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体とのペアである請求項３記載の方法。
【請求項６】
（１）（ａ）標的核酸配列を含有すると推定される試料、
（ｂ）標的核酸配列の３′末端領域にアニールする相補的配列、ＲＮＡポリメラーゼ認識プロモーター配列および親和性分子ペアの一方を含有する標的核酸配列捕捉プローブ、および
（ｃ）親和性分子ペアの他方を微小粒子に固定してなる担体
を接触させ、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体からなる複合体を形成させる工程、
（２）ＲＮアーゼＨ活性を有する逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの存在下で、または逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびＲＮＡポリメラーゼの存在下で、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列を鋳型とする核酸配列増幅反応を実施する工程、ならびに
（３）工程（２）において増幅された核酸配列を検出する工程
を含む核酸配列検出法。
【請求項７】
前記工程（１）および工程（２）の間に
（１′）複合体を試料から分離する工程
を含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
親和性分子ペアが、
（ｄ）アビジンとビオチンとのペア、および／または
（ｅ）抗原と抗体とのペア
であることを特徴とする請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
抗原と抗体とのペアが、フェニトインと抗フェニトイン抗体とのペアである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
抗原と抗体とのペアが、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体とのペアである請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸配列がハイブリダイゼーションプロテクションアッセイにより検出される請求項６、７、８、９または１０記載の方法。
【請求項１２】
標的核酸配列が、結核菌群または抗酸菌群由来の核酸配列である請求項６、７、８、９、１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
結核菌群が、少なくともマイコバクテリウム  ツベルクローシス、マイコバクテリウム  ボビス、マイコバクテリウム  ボビス  ビーシージー、マイコバクテリウム  アフリカナムまたはマイコバクテリウム  マイクロティを含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
抗酸菌群が、少なくともマイコバクテリウム  アビウムまたはマイコバクテリウム  イントラセルラレを含む請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列の増幅法および核酸配列の検出法に関する。詳しくは、本発明は、従来法であるＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法またはＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法の改良法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、所望の核酸配列のクローニングまたは配列決定の際、または病原菌等の検出の際など、核酸配列（標的核酸配列）の増幅が行われる場面は数多くある。標的核酸配列の増幅法としては、ＰＣＲをはじめ様々な方法が知られているが、中でも、ＴＭＡ法やＮＡＳＢＡ法等は、一定の温度で反応を遂行することができるという点で大きなメリットを有する。これらＴＭＡ法およびＮＡＳＢＡ法をより改良しようと、様々な提案がなされている。
【０００３】
たとえば、特許文献１には、ポリＴ配列および特定のＲＮＡポリメラーゼ認識プロモーター配列を含有する核酸配列を固定した粒子（オリゴヌクレオチド固定化粒子）を利用し、ＴＭＡ法またはＮＡＳＢＡ法を実施する旨が開示されている。同文献の方法は、標的核酸配列を分離、精製することが容易であるという点で非常に有効な方法である。また、同方法の検出感度については、粒子に固定されていない核酸配列を用いる場合と同等であるとのことであった。しかしながら、より操作が簡単となるように、更なる改良が常に求められている。
【特許文献１】特願２００３−２１９８８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１の方法では、予め核酸配列を粒子に固定する工程、ついで同粒子上の核酸配列と標的核酸配列とのハイブリッドを形成させる工程などの複数の工程が必須とされていた。本発明は、従来法に対して、より簡便な方法で、かつ、特異的な核酸配列の増幅が可能となる核酸配列増幅方法およびその増幅産物の検出方法を提供することを目的とする。本発明はまた、同核酸配列増幅方法により、高い感度で結核菌群または抗酸菌群を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、標的核酸配列に対する相補的配列、ＲＮＡポリメラーゼ認識プロモーター配列および親和性分子ペアの一方を含有する標的核酸配列捕捉プローブ、親和性分子ペアの他の一方を微小粒子に固定してなる担体、および標的核酸配列とを液相中で混合することによって、極めて良好に標的配列を増幅し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）（ａ）標的核酸配列を含有すると推定される試料、
（ｂ）標的核酸配列の３′末端領域にアニールする相補的配列、ＲＮＡポリメラーゼ認識プロモーター配列および親和性分子ペアの一方を含有する標的核酸配列捕捉プローブ、および
（ｃ）親和性分子ペアの他方を微小粒子に固定してなる担体
を接触させ、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体からなる複合体を形成させる工程、ならびに
（２）ＲＮアーゼＨ活性を有する逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの存在下で、または逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびＲＮＡポリメラーゼの存在下で、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列を鋳型とする核酸配列増幅反応を実施する工程
を含む核酸配列増幅法に関する。
【０００７】
前記核酸配列増幅法において、前記工程（１）と工程（２）との間に
（１′）複合体を試料から分離する工程
が実施されることが好ましい。
【０００８】
前記核酸配列増幅法において、親和性分子ペアは、
（ｄ）アビジンとビオチンとのペア、および／または
（ｅ）抗原と抗体とのペア
であることが好ましい。
【０００９】
前記核酸配列増幅法において、抗原と抗体とのペアは、フェニトインと抗フェニトイン抗体とのペアおよび／またはジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体とのペアであることが好ましい。
【００１０】
本発明はまた、
（１）（ａ）標的核酸配列を含有すると推定される試料、
（ｂ）標的核酸配列の３′末端領域にアニールする相補的配列、ＲＮＡポリメラーゼ認識プロモーター配列および親和性分子ペアの一方を含有する標的核酸配列捕捉プローブ、および
（ｃ）親和性分子ペアの他方を微小粒子に固定してなる担体
を接触させ、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体からなる複合体を形成させる工程、
（２）ＲＮアーゼＨ活性を有する逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの存在下で、または逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびＲＮＡポリメラーゼの存在下で、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列を鋳型とする核酸配列増幅反応を実施する工程、ならびに
（３）工程（２）において増幅された核酸配列を検出する工程
を含む核酸配列検出法に関する。
【００１１】
前記核酸配列検出法において、前記工程（１）と工程（２）との間に
（１′）複合体を試料から分離する工程
が実施されることが好ましい。
【００１２】
前記核酸配列検出法において、親和性分子ペアは、
（ｄ）アビジンとビオチンとのペア、および／または
（ｅ）抗原と抗体とのペア
であることが好ましい。
【００１３】
前記核酸配列検出法において、抗原と抗体とのペアは、フェニトインと抗フェニトイン抗体とのペアおよび／またはジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体とのペアであることが好ましい。
【００１４】
前記核酸配列検出法において、核酸配列はハイブリダイゼーションプロテクションアッセイにより検出されることが好ましい。
【００１５】
さらに本発明は、前記標的核酸配列が結核菌群または抗酸菌群由来の核酸配列である核酸配列検出法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の核酸配列増幅法および核酸配列検出法を用いれば、予め標的核酸配列を担体に結合させる工程を実施することなく、容易に標的核酸配列を増幅および検出することが可能となる。
【００１７】
また、本発明の方法は、従来法を用いる場合の検出感度に劣ることなく、迅速かつ容易に実施することができるため、たとえば、結核菌群または抗酸菌群の検出法としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、ＴＭＡ法またはＮＡＳＢＡ法の改良法である。以下にＴＭＡ法およびＮＡＳＢＡ法について、その一態様を例示することによって簡単に説明する。
【００１９】
ＴＭＡ法およびＮＡＳＢＡ法のプロセスは本質的に類似している。ＴＭＡ法においては、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（ＲＮアーゼＨ活性を有する）および２つのプライマーを使用する。ＮＡＳＢＡ法においては、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼＨ、逆転写酵素および２つのプライマーを使用する。プライマーのうちの１つは、ＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーター配列を含む（プロモーター−プライマー）。増幅の第一工程において、目的のＲＮＡ配列（標的ＲＮＡ配列）が存在する場合、プロモーター−プライマーが同配列にハイブリダイゼーションする。逆転写酵素は、プロモーター−プライマーの３′末端から伸長反応を行うことによって、標的ＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡコピーを生成する。ＲＮＡ配列とＤＮＡ配列とのハイブリッド中のＲＮＡ配列は、逆転写酵素のＲＮアーゼＨ活性によって分解される。ついで、同ＤＮＡコピーに第二のプライマーが結合し、逆転写酵素によってＤＮＡ配列の新たなストランドがプライマーの３′末端から合成され、二本鎖ＤＮＡ配列を生成する。ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型ＤＮＡ配列におけるプロモーター配列を認識し、転写を開始する。新しく合成されたそれぞれのアンプリコンは、同様の増幅プロセスに入り、新たな複製工程の鋳型となる。これにより、ＲＮＡアンプリコンが指数関数的に増加する。各鋳型ＤＮＡ配列は１００〜１０００コピーのＲＮＡアンプリコンをつくりだすことができるので、１時間未満で１００億コピーのＲＮＡアンプリコンを得ることができる。
【００２０】
標的配列がＤＮＡ配列の場合も、ＴＭＡ法およびＮＡＳＢＡ法を適用することができる。ただし、前工程として、プロモーター配列を含有するＤＮＡ配列を製造する。すなわち、二本鎖ＤＮＡ配列の変性後、プロモーター−プライマーがＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションし、ついで逆転写酵素による伸長反応が行われて二本鎖の産物が生成される。これを変性し、第二のプライマーの存在下で逆転写酵素による新たな二本鎖の産生を行う。これにより、プロモーター配列を含有する標的ＤＮＡ配列の二本鎖を得ることができる。つぎに、前述のＴＭＡ法またはＮＡＳＢＡ法のサイクルを実施する。すなわち、ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ配列中のプロモーター配列を認識して転写を開始し、ＲＮＡアンプリコンを産生する。これらアンプリコンにプライマーが結合し、逆転写酵素による伸長反応が行われ、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列とのハイブリッドが生成される。同ハイブリッド中のＲＮＡ配列をＲＮアーゼが分解して一本鎖ＤＮＡ配列が得られ、このＤＮＡ配列に前記プロモーター−プライマーがハイブリダイゼーションし、逆転写による伸長反応が行われる。
【００２１】
本明細書において、「標的核酸配列」または「標的配列」は、核酸配列増幅法における鋳型となる核酸配列を意味する。標的核酸配列は、目的および従来技術に基づき、当業者により適宜設定されることができる。たとえば、標的核酸配列は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列であってもよい。さらにたとえば、標的核酸配列は、天然由来の核酸配列、従来法により人工的に製造された核酸配列もしくは人工的な配列を一部含有する核酸配列であってもよく、遺伝子配列の全長もしくはその一部であってもよく、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖であってもよい。具体的には、標的配列は、結核菌群由来の配列であってもよく、たとえば、マイコバクテリウム  ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム  ボビス（Mycobacterium bovis）、マイコバクテリウム  ボビス  ビーシージー（Mycobacterium bovis BCG）、マイコバクテリウム  アフリカナム（Mycobacterium africanum）またはマイコバクテリウム  マイクロティ（Mycobacterium microti）由来の核酸配列であってもよい。また、抗酸菌群由来の配列であってもよく、たとえば、マイコバクテリウム  アビウム（Mycobacterium avium）またはマイコバクテリウム  イントラセルラレ（Mycobacterium intracellulare）由来の核酸配列であってもよい。標的核酸配列の長さに特に制限はなく、本分野における知識に基づき当業者が適宜設定することができる。
【００２２】
本明細書において、「ＲＮアーゼＨ」は、本分野においてよく知られた酵素であり、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列とのハイブリッド二本鎖構造におけるＲＮＡ配列のみを特異的に分解する活性をもつリボヌクレアーゼを意味する。
【００２３】
本明細書において、「標的核酸配列の３′末端領域にアニールする相補的配列」は、標的核酸配列の３′末端領域にアニーリングするために充分な塩基数および標的核酸配列の相補鎖との充分な相同性を有するものであれば特に限定されず、当業者が適宜設定し得るものである。標的核酸配列の３′末端領域にアニールする相補的配列としては、たとえば、ＴＭＡ法またはＮＡＳＢＡ法において標的核酸配列を増幅するために使用する核酸配列を用いることができる。また、標的核酸配列の３′末端領域にアニーリングする相補的配列は、プライマーとしての機能も備えていることが好ましい。
【００２４】
本発明において、「ＲＮＡポリメラーゼ」とは、ＤＮＡ配列依存的にＲＮＡ配列の合成を触媒する酵素である。ＲＮＡポリメラーゼとしては公知のものを用いることができ、たとえば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
本明細書において、「ＲＮＡポリメラーゼ認識プロモーター配列」は、転写開始反応に関与する核酸配列であって、ＲＮＡポリメラーゼにより認識（結合）される核酸配列である。本発明において、ＲＮＡポリメラーゼ認識プロモーターとしては、公知のものを用いることができる。具体的にはたとえば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの認識配列（５′−taa tac gac tca cta tag gga ga−３′：配列番号１）、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼの認識配列（５′−aat taa ccc tca cta aag gga ga−３′：配列番号２）またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼの認識配列（５′−att tag gtg aca cta tag aag ng−３′：配列番号３）などを挙げることができるが、特に限定されない。
【００２６】
本明細書において、「ＲＮアーゼＨ活性を有する逆転写酵素」は、前述のＲＮアーゼＨ活性を有し、かつ、ＲＮＡ配列依存的にＤＮＡ配列への転写を触媒する酵素を意味する。本発明において、「ＲＮアーゼＨ活性を有する逆転写酵素」としては公知のものを用いることができ、たとえば、トリ骨髄芽球細胞症ウイルスの逆転写酵素（ＡＭＶ逆転写酵素）、モロニーネズミ白血病ウイルスの逆転写酵素（ＭＭＬＶ逆転写酵素）などを挙げることができるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００２７】
本明細書において、「逆転写酵素」は、少なくともＲＮＡ配列依存的にＤＮＡ配列への転写を触媒する機能を有する酵素であればよく、ＲＮアーゼＨ活性を有していないものであってもよい。
【００２８】
本明細書において、「親和性分子ペア」は２つの分子の組み合わせからなっており、双方の分子はそれぞれ天然由来のものであってもよく、人工的に製造されたものであってもよい。親和性分子ペアの一方は、他方に結合するための表面上の領域または空洞などを有しており、そのような領域または空洞などを介して他方の分子と特異的に結合することができる。「特異的に結合することができる」とは、親和性分子ペアの双方の分子が、バックグラウンドよりも高い親和性をもってお互いに結合することを意味する。本発明において、親和性分子ペアとしては、たとえば、ビオチンとアビジンとのペア、抗原と抗体とのペア、ホルモンとホルモン受容体とのペア、受容体とリガンドとのペア、ＩｇＧとプロテインＡとのペアなどが挙げられ、アビジンとビオチンとのペアまたは抗原と抗体とのペアを用いることが好ましい。
【００２９】
当技術分野において周知のタンパク質であるアビジンは、ビオチンと特異的に結合する卵白中の塩基性糖タンパク質である。ここで、本明細書においては、「アビジン」として、アビジンおよびその類似体が含まれる。アビジンの類似体としては、たとえば、ストレプトマイセス  アビジニ（Streptomyces avidinii）培養液に見出されたストレプトアビジン、およびＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商品名）（ピアース社、米国）（参考文献としては、Hiller,Y., Gershoni, et al (1987)Biochem. J., 248, 167-171）を挙げることができるが、ビオチンに対してアビジンと同等またはそれ以上の親和性を有するアビジン類似体（たとえば、遺伝子工学的に改変されたアビジンなど）である限り、特に制限することなく本発明において使用することができる。
【００３０】
ビオチンは、ビタミンの１種であり、カルボキシル化−脱カルボキシル化反応における補酵素としてよく知られている物質である。本明細書における「ビオチン」としては、ビオチンおよびその類似体が含まれる。ビオチンの類似体としては、前記アビジンに対してビオチンと同等またはそれ以上の親和性を有する類似体である限り、特に制限することなく使用することができる。
【００３１】
「抗原と抗体とのペア」に関し、好ましい抗原と抗体とのペアとしては、フェニトインと抗フェニトイン抗体とのペアまたはジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体とのペアが挙げられる。フェニトインおよびジゴキシゲニンは共に、本技術分野においてよく知られた化合物であり、容易に購入することができる。抗体については、本技術分野で周知の方法（たとえば、Kohler and Milstein, Nature 256,495（1975）またはSecherらのNature, 285,446（1980）に記載の方法）に基づき製造することができ、たとえば次の方法により製造することができる。すなわち、まず、抗原を用いて動物（たとえば、マウスなど）に免疫し、免疫した動物の抗体産生細胞（たとえば、脾細胞など）と腫瘍細胞（たとえば、ミエローマ細胞など）とを融合してハイブリドーマを作製する。免疫原性が小さい抗原の場合は、免疫の際に、免疫原性を有するキャリアタンパク質（たとえば、キーホールリンペットヘモシアニン（Keyhole Limpet Hemocyanin、ＫＬＨ）やウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）など）と抗原とを結合したものを用いることが好ましい。次いで、ハイブリドーマをＨＡＴ培地のような選択培地を用いて選択した後、限界希釈法のような適当な方法で単クローン化して培養し、培養上清について、酵素免疫分析などの適当な免疫分析手段により目的の抗体を産生しているか否かをチェックする。次いで、培養上清から、公知の方法、たとえばアフィニティクロマトグラフィーや電気泳動のような分離精製手段の組み合わせにより、抗体を精製することができる。
【００３２】
本明細書において、「標的核酸配列捕捉プローブ」は、標的核酸配列の３′末端領域にアニールする相補的配列、ＲＮＡポリメラーゼ認識プロモーター配列および親和性分子ペアの一方を含有する。標的核酸配列捕捉プローブにおいて、ＲＮＡポリメラーゼ認識プロモーター配列は、標的核酸配列の３′末端領域にアニールする相補的配列の５′末端側に位置する。ＲＮＡポリメラーゼ認識プロモーター配列と標的核酸配列の３′末端領域にアニールする相補的配列とは、直接連結されていてもよいが、プロモーターとしての機能が阻害されない限り、それらの配列の間に何らかの配列が挿入されていてもよい。標的核酸捕捉プローブ中の核酸配列にプライマー配列が含有される場合であって、同プローブ中の親和性分子ペアの一方が同核酸配列に対して非常に大きな分子量を有する場合（たとえば、アビジンを核酸配列に結合させる場合）は、同分子がプライマーの機能を阻害する傾向がある。したがって、標的核酸配列捕捉プローブに含有される親和性分子ペアの一方としては、親和性分子ペアを構成する２つの分子のうち、分子量の小さい分子を用いることが好ましい。たとえば、アビジンとビオチンとのペアの場合、標的核酸配列捕捉プローブに含有される親和性分子ペアの一方としては、ビオチンを用いることが好ましい。また、フェニトインと抗フェニトイン抗体とのペアおよびジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体とのペアの場合、標的核酸配列捕捉プローブに含有される親和性分子ペアの一方としては、それぞれ、フェニトインおよびジゴキシゲニンを用いることが好ましい。親和性分子ペアの一方は、標的核酸配列捕捉プローブ中のプロモーターの機能を阻害しない限り、ＲＮＡポリメラーゼ認識プロモーター配列および標的核酸配列の３′末端領域にアニールする相補的配列を少なくとも含む核酸配列において、いずれの位置に導入されていてもよい。親和性分子ペアの一方を核酸配列に導入する方法は、本分野では公知であるので、当業者が適宜選択することができる。核酸配列の５′末端側にビオチンを導入する場合、たとえば、以下のようにして実施することができる。まず、核酸配列にアミノ基を導入し、アミノ基が導入された核酸配列を1M炭酸緩衝液(pH=9.0)に溶解する。同核酸配列溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解したビオチン−Ｘ−ＮＨＳを混合して、混合液を室温で2時間インキュベーションし、ついでＨＰＬＣ等で精製することにより、５′末端側にビオチンが導入された標的核酸配列捕捉プローブを得ることができる。同様にして、３′末端側にビオチンを導入することもできる。なお、ＮＨＳはN-ヒドロキシコハク酸イミド、Ｘはリンカーを意味する。Ｘとしては、たとえば、ＣＨ２が数個続いたものを使用することができる。また、ビオチンを核酸配列の中間部分に導入することも、ＤＮＡ合成機を用いれば容易に実施することができる。
【００３３】
本明細書において、「担体」は、親和性分子ペアの他方（すなわち、親和性分子ペアである２つの分子のうち、標的核酸配列捕捉プローブに含有されていない方の分子）を微小粒子に固定したものを意味する。
【００３４】
本明細書において、「微小粒子」は、水不溶性の粒子を意味する。粒子の大きさは特に限定されないが、たとえば、平均粒径が０．１〜１０μｍのものを用いることができる。微小粒子としては、たとえば、ゼラチン粒子、ラテックス粒子、磁性粒子などを使用することができる。ゼラチン粒子は、たとえば、ゼラチン、水溶性多糖類、メタリン酸ナトリウムおよびアルデヒド架橋剤などを混合することによって製造することができる（たとえば、特公昭６３−４８０２１公報参照）。ラテックス粒子は、たとえば、有機高分子であるポリスチレン、アクリル樹脂などの合成樹脂からなる粒子を用いることができる。磁性粒子は、磁力を帯びている粒子または集磁され得る性質を有する粒子を意味する。磁性粒子としては、たとえば、マグネタイトを核としてシランを被覆した粒子（特開昭５５−１４１６７０公報、特開昭５０−１２２９９７公報参照）などが挙げられる。
【００３５】
微小粒子に親和性分子ペアの一方を結合する方法は、本分野では公知であるので、当業者が適宜選択することができる。たとえば、アビジンや抗体を粒子に結合させる場合、以下のようにして実施することができる。粒子としてはカルボン酸が表面に出ているものを使用する。まずこの粒子に、水に溶解した１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加え、室温で３０分間インキュベートして粒子表面を活性化させる。上清を除き、10mM  ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）緩衝液(pH=5.0)などに溶解したアビジンや抗体を粒子に添加した後、３７℃で６０分間インキュベーションする。ついで、粒子を洗浄し、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ(pH=7.4)や０．５〜２％  ＢＳＡ溶液などを添加し、３７℃で８時間〜一晩の間インキュベーションする。粒子の調製方法はこれに限らず、温度やインキュベーション時間、緩衝液等は適宜変更可能である。
【００３６】
以下、本発明の方法について説明する。
（ｉ）試料調製工程
本発明における試料の調製に関しては、ＴＭＡ法（たとえば、特許第３２４１７１７号明細書参照）またはＮＡＳＢＡ法（たとえば、特開平９−３２７２９８号公報）などの従来法に基づき、当業者は適宜実施することができるが、たとえば、以下のようにして行うことができる。
【００３７】
ヒト体液を検体とする結核菌群または抗酸菌群の検出を目的とし、標的核酸配列がＲＮＡ配列である場合、まず検体１ｍＬを遠沈管（容量１５mL）に採取し、同遠沈管に検体量の等量〜２倍量のアルカリ性溶液（たとえば、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ溶液（２％ＮａＯＨ、１．４５％クエン酸ナトリウム、０．５％Ｎ−アセチル  Ｌ−システイン））を添加して、検体が可溶化するまでボルテックスミキサーを用いて混和する（たとえば、２０秒間）。ついで、遠沈管を１５分間常温（たとえば、２０℃〜３０℃）に放置し、リン酸緩衝液（たとえば、１/１５Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．８）を加えて全量を約１０ｍＬとする。転倒混和し、遠心分離（たとえば、３０００ｇで１５分間）した後、遠沈管を傾斜させて上清を除く。遠沈管にリン酸緩衝液（たとえば、１/１５Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．８）約１mLを加え、ボルテックスミキサーで撹拌し、沈殿物を懸濁させる。懸濁液のｐＨを確認し、中性でない場合は、たとえば、４％塩酸で中和する。得られた懸濁液２００μLを、希釈液（たとえば、１００ｍＭ  Ｎ−アセチル  Ｌ−システイン、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、４００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンから成るｐＨ＝８．０の溶液）２０μLを分注したチューブに添加し、ボルテックスミキサーで撹拌（たとえば、３秒間）した後、超音波処理（たとえば、１５分間）を行う。得られた溶液を、次に行う核酸配列増幅工程の試料として用いることができる。
【００３８】
なお、結核菌群または抗酸菌群の検出を目的とし、検体がヒト組織であって、標的核酸配列がＲＮＡ配列の場合は、ヒト組織をホモジナイズした後に前記同様の処理を行うことにより、試料を調製することができる。
（ｉｉ）核酸配列の増幅工程
本発明における核酸配列の増幅は、標的核酸配列捕捉プローブを予め担体に固定する工程を含むことなく、標的核酸配列を含有する試料、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体を接触させる点を特徴とする。本発明における核酸配列の増幅工程は、従来のＴＭＡ法またはＮＡＳＢＡ法などに基づき実施することができ、たとえば、以下のように実施することができる。
【００３９】
前述の工程（ｉ）で調製した試料に、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体を添加する。標的核酸配列捕捉プローブおよび担体は、試料に同時に添加してもよいし、別個に添加してもよい。あるいはまた、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体を含有する混合物を調製した後、同混合物を、インキュベーションすることなく速やかに、試料に添加してもよい。なお、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体の混合物としては、たとえば、５００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、７００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのエデト酸（EDTA）、０．１％〜２．０％のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドから成る水溶液に、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体を添加したものを用いることができる。
【００４０】
ついで、試料、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体を含有する混合液を、標的核酸配列、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体の複合体を形成させるために充分な時間、インキュベーションする。同インキュベーションは、たとえば、６０℃〜６５℃、５分間〜３０分間で実施することができる。
【００４１】
前記インキュベーション終了後、標的核酸配列、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体の複合体は、前記混合液から分離されることが好ましい。混合液から同複合体を分離する方法としては、たとえば、遠心器を用いる方法が挙げられる。あるいは、担体が磁性粒子の場合、たとえば、磁石を用いることによって混合液から複合体を分離することができる。
【００４２】
つぎに、標的核酸配列、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体の複合体に、たとえば、標的配列の相補鎖の３′領域にアニールする核酸配列（フォワードプライマー）０．２ｐｍｏｌ/μＬ〜０．４ｐｍｏｌ/μＬ、８０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３５ｍＭの塩化カリウム、３０ｍＭ〜５０ｍＭの塩化マグネシウム、８ｍＭのＮＴＰ、２ｍＭのｄＮＴＰおよび５％〜１０％のポリビニルピロリドンから成る水溶液（たとえば、50μL）およびリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）（たとえば、２５μL）を添加した後よく撹拌し、水分の蒸発を防ぐためにオイル（たとえば１００μL）を添加して、同混合物を６０℃〜１００℃で５分間〜１５分間、ついで３７℃〜４２℃で５分間インキュベーションすることが好ましい。なお、「標的配列の相補鎖の３′領域にアニールする核酸配列」は、標的核酸配列の相補鎖の３′末端領域にアニーリングし相補鎖の伸長反応を行うために充分な塩基数および標的核酸配列との相同性を有するものであれば特に限定されず、当業者が適宜設定し得るものである。
【００４３】
インキュベーション終了後、前記混合物に、ＲＮアーゼＨ活性を有する逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを添加、または逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびＲＮＡポリメラーゼを添加して反応液とし、反応液のインュベーションを実施することによってＲＮＡアンプリコンを得ることができる。なお、反応液のインキュベーションは、たとえば、３７℃〜４２℃、３０分間〜１８０分間で実施することができる。
（ｉｉｉ）標的核酸配列の検出工程
標的核酸配列の検出については、従来法（たとえば、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ。特許第３１９０３４８号明細書参照）に基づき当業者が適宜実施することができるものである。たとえば、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイにより標的核酸配列の検出を行う場合は、たとえば、以下ようにして実施することができる。
【００４４】
前述の工程（ｉｉ）により得られたＲＮＡアンプリコンを含む反応液に対し、同ＲＮＡアンプリコン内の配列に対して特異的にハイブリダイズし、かつ、アクリジニウムエステルで標識されたＤＮＡプローブを含有するプローブ試薬を添加した後よく撹拌し、たとえば、５５℃〜６５℃で５分間〜２０分間インキュベーションを実施する。なお、プローブ試薬としては、たとえば、１００ｍＭこはく酸リチウム、２．５％ラウリル硫酸リチウム、２０ｍＭ  ＥＧＴＡ、標的核酸配列に対するプローブ配列を混合した水溶液(ｐＨ＝４．７)を用いることができ、たとえば、同水溶液を反応液１００μLあたり５０μＬ〜２００μＬ添加することができる。
【００４５】
インキュベーション終了後、加水分解液を添加してよく撹拌し、得られた混合液を、たとえば、５５℃〜６５℃で１０分間〜１５分間インキュベーションする。なお、加水分解液としては、たとえば、６００ｍＭ ホウ酸ナトリウム、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を混合した水溶液（ｐＨ＝８．５）を用いることができ、たとえば、同水溶液を混合液１００μLあたり１５０μＬ〜６００μＬ添加することができる。
【００４６】
インキュベーション終了後、たとえば、２０℃〜３０℃で５分間以上放置することによって混合液を冷却する。ついで、過酸化水素水および水酸化ナトリウム水溶液を添加し、化学発光測定装置（たとえば、リーダー450、Gen-Probe社、カルフォルニア州、米国）を用いてアクリジニウムエステルの発光量を測定する。
【００４７】
以下に、本発明の具体的な態様を実施例として記載する。しかしながら、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４８】
実施例１
本実施例では、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体を用いて標的核酸配列を増幅し、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイにより標的核酸配列の検出を実施した。
【００４９】
本実施例において、担体としては、アビジンを磁性粒子に固定してなる担体Dynabeads M280 Streptavidine（Dynal社、オスロ、ノルウェイ）（以下、「アビジン粒子」とする）を用いた。
【００５０】
標的核酸配列捕捉プローブは、ビオチンに５′末端の塩基を結合させた後、ＤＮＡ合成装置を用いて所望の配列を合成することにより製造した。同捕捉プローブの配列は、５′末端から順にＴ７プロモーター配列（5′-taatacgactcactatagggaga-3′：配列番号１）および標的核酸配列に対する相補配列（標的核酸配列に対するリバースプライマーとして機能する。5′-gccgtcaccccaccaacaagct-3′：配列番号４）からなる（以下、「捕捉プローブ１」とする）。
【００５１】
鋳型ＲＮＡ配列（標的核酸配列）をアビジン粒子に捕捉するための溶液（以下、「ＴＣ試薬」とする）として、0.024%アビジン粒子、0.075pmol/μL捕捉プローブ１、500mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、700mM塩化ナトリウム、10mMエデト酸（EDTA）、0.5%ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドから成る水溶液を用いた。
【００５２】
標的核酸配列を含有する溶液としては、マイコバクテリウム  アビウム（Mycobacterium avium）から精製したリボソームＲＮＡ  25pg/25μL（以下、「標的配列含有溶液１」とする）を、希釈液（50mM Tris-Cl、2mM EDTA、10mM N-アセチル-L-システイン (pH=8.0)）で10倍または100倍希釈したものを使用した。
【００５３】
前記ＴＣ試薬を調製後直ちに、ＴＣ試薬200μL、標的配列含有溶液１の10倍または100倍希釈液25μLおよび1/15Mリン酸塩緩衝液（pH=7.8）175μLを混合し、62℃で30分間インキュベーションした後、室温で10分間静置することにより、捕捉プローブ１を介して鋳型ＲＮＡ配列をアビジン粒子上に捕捉した。ついで、磁石を用いてアビジン粒子を集め、洗浄液（10mM HEPES、0.1% SDS (pH=7.5)）で洗浄を行った後、標的核酸配列、捕捉プローブ１および担体からなる複合体を次の工程に使用した。
【００５４】
前記複合体に、標的核酸配列に対するフォワードプライマー（5′-gggataagcctgggaaactgggtctaatacc-3′：配列番号５。以下、「フォワードプライマー１」とする）0.3pmol/μL、80mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、35mM塩化カリウム、40mM塩化マグネシウム、8mM NTP、2mM dNTPおよび10%ポリビニルピロリドンから成る水溶液を50μL、1/15Mリン酸塩緩衝液（pH=7.8）を25μLおよびオイルを100μL添加した。
【００５５】
これらの溶液を良く撹拌し、62℃で15分間、42℃で5分間インキュベーションした。その後、酵素溶液（80U/μL 逆転写酵素（MMLV）および80U/μL T7RNAポリメラーゼ）を、それぞれに25μL添加することにより反応液を調製し、42℃で30分間インキュベーションし、標的核酸配列の増幅反応を実施した。
【００５６】
標的核酸配列の増幅産物を検出するために、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイを実施した。すなわち、標的核酸配列増幅後の反応液にプローブ試薬（100mMこはく酸リチウム、2.5%ラウリル硫酸リチウム、20mM EGTA、標的核酸配列に対するプローブ（5′-ggacctcaagacgcatgtc-3′：配列番号６。以下、「検出プローブ１」とする） (pH=4.7)）を100μL添加した後、良く撹拌し、60℃で15分間インキュベーションした。インキュベーション後、加水分解液（600mM ホウ酸ナトリウム、1% TritonX-100 (pH=8.5)）を300μL添加し、良く撹拌した後、60℃で15分間インキュベーションした。インキュベーション後、室温で10分間放置し、Gen-Probe社製リーダー450を用いて、発光量を測定した。測定結果を表１および図１に示す。なお、表中の数値は、相対光単位（Relative Light Unit：RLU）を示す。
【００５７】
【表１】
2006075031.tif 000002
【００５８】
表１および図１から明らかであるように、捕捉プローブ１を用いない従来の方法と比較すると、捕捉プローブ１を用いる本発明の方法において、より高いＲＬＵ値を得ることができた。
【００５９】
比較例１
標的配列含有溶液１を希釈液（50mM Tris-Cl、2mM EDTA、10mM N-アセチル-L-システイン (pH=8.0)）で10倍または100倍希釈したものについて、アビジン粒子の非存在下での鋳型ＲＮＡ配列（標的核酸配列）の増幅操作を以下のように実施した。
【００６０】
標的配列含有溶液１の10倍または100倍希釈液25μLに、0.3pmol/μL捕捉プローブ１、0.3pmol/μL フォワードプライマー１、80mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、35mM塩化カリウム、40mM塩化マグネシウム、8mM NTP、2mM dNTPおよび10%ポリビニルピロリドンから成る水溶液を50μL、およびオイルを100μL添加した。これらの溶液を良く撹拌し、62℃で15分間、42℃で5分間インキュベーションした。その後、酵素溶液（80U/μL 逆転写酵素（MMLV）および80U/μL T7RNAポリメラーゼ）をそれぞれに25μL添加することにより反応液を調製し、42℃で30分間インキュベーションし、標的核酸配列の増幅反応を実施した。
【００６１】
標的核酸配列の増幅産物の検出は、実施例１と同様の方法で実施した。測定結果を表１および図１に示す。
【００６２】
実施例２
本実施例において、担体としては、実施例１に記載のアビジン粒子を使用した。
【００６３】
標的核酸配列捕捉プローブとしては、捕捉プローブ１のビオチンとＴ７プロモーター配列との間にポリＴ配列を追加して５５mers、６０mers、６５mers、７５mersまたは９５mersとしたものを用いた。
【００６４】
ＴＣ試薬としては、標的核酸配列捕捉プローブとして前記５５mers（捕捉プローブ２）、６０mers（捕捉プローブ３）、６５mers（捕捉プローブ４）、７５mers（捕捉プローブ５）または９５mers（捕捉プローブ６）を用いた以外は実施例１記載のＴＣ試薬と同じ組成のものを用いた。標的核酸配列を含有する溶液としては、標的配列含有溶液１の100倍希釈液を使用した。
【００６５】
前記ＴＣ試薬試薬の調製後直ちに、ＴＣ試薬  200μL、標的配列含有溶液１の希釈液  25μLおよび1/15Mリン酸塩緩衝液（pH=7.8）175μLを混合し、62℃で30分間インキュベーションした後、室温で10分間静置することにより、各標的核酸配列捕捉プローブを介して鋳型ＲＮＡ配列（標的核酸配列）をアビジン粒子上に捕捉した。ついで、磁石を用いてアビジン粒子を集め、洗浄液（10mM HEPES、0.1% SDS (pH=7.5)）で洗浄を行った後、標的核酸配列、捕捉プローブ２、３、４、５または６ならびに担体からなる複合体を次の工程に使用した。
【００６６】
前記複合体に、0.3pmol/μL フォワードプライマー１、80mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、35mM塩化カリウム、41mM塩化マグネシウム、8mM NTP、2mM dNTP、10%ポリビニルピロリドンから成る水溶液を50μL、1/15Mリン酸塩緩衝液（pH=7.8）を25μL、オイルを100μL添加した。これらの溶液を良く撹拌し、62℃で15分間、42℃で5分間インキュベーションした。その後、酵素溶液（80U/μL 逆転写酵素（MMLV）および80U/μL T7RNAポリメラーゼ）をそれぞれに25μL添加することにより反応液を調製し、42℃で60分間インキュベーションし、標的核酸配列の増幅反応を実施した。
【００６７】
増幅したＲＮＡ配列を検出するために、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイを実施した。すなわち、ＲＮＡ配列増幅後の反応液にプローブ試薬（100mMこはく酸リチウム、2.5%ラウリル硫酸リチウム、20mM EGTA、検出プローブ１ (pH=4.7)）を100μL添加した後、良く撹拌し、60℃で15分間インキュベーションした。インキュベーション後、加水分解液（600mM ホウ酸ナトリウム、1% TritonX-100 (pH=8.5)）を300μL添加し、良く撹拌した後、60℃で15分間インキュベーションした。インキュベーション後、室温で10分間放置し、Gen-Probe社製リーダー450を用いて発光量を測定した。測定結果を表２および図２に示す。なお、表中の数値は相対光単位を示す。
【００６８】
【表２】
2006075031.tif 000003
【００６９】
表２および図２より明らかであるように、標的核酸の相補的配列部分とアビジン粒子との距離が離れた場合でも、標的配列の増幅効率に大きな影響は見られなかった。
【００７０】
比較例２
マイコバクテリウム  アビウムのリボソームＲＮＡについて、アビジン粒子の非存在下でのＲＮＡ配列（標的核酸配列）の増幅操作を以下のように実施した。
【００７１】
25μLの標的配列含有溶液１の100倍希釈液に、0.3pmol/μLの捕捉プローブ２、３、４、５または６、0.3pmol/μL フォワードプライマー１、80mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、35mM塩化カリウム、41mM塩化マグネシウム、8mM NTP、2mM dNTPおよび10%ポリビニルピロリドンから成る水溶液を50μL、ならびにオイルを100μL添加した。これらの溶液を良く撹拌し、62℃で15分間、42℃で5分間インキュベーションした。その後、酵素溶液（80U/μL 逆転写酵素（MMLV）および80U/μL T7RNAポリメラーゼ）をそれぞれに25μL添加することにより反応液を調製し、42℃で60分間インキュベーションし、標的核酸配列の増幅反応を実施した。
【００７２】
標的核酸配列の検出は、実施例２と同様の方法で実施した。測定結果を表２および図２に示す。
【００７３】
実施例３
本実施例では、捕捉プローブ１に含有される核酸配列と同一の配列からなるが、ビオチンが結合されていないプライマー（「リバースプライマー１」とする）をさらに用いた。
【００７４】
本実施例では、実験全体で使用する捕捉プローブ１とリバースプライマー１との量が合計１５pmolとなるように、以下に示すとおり各試料に用いる捕捉プローブ１およびリバースプライマー１の量を調整し、実験を行った。
【００７５】
本実施例において、担体としては、実施例１に記載のアビジン粒子を使用した。
【００７６】
ＴＣ試薬としては、捕捉プローブ１の濃度を0.01、0.02、0.04、0.06または0.075pmol/μLとした以外は実施例１記載のＴＣ試薬と同じ組成のものを用いた。
【００７７】
標的核酸配列を含有する溶液としては、標的配列含有溶液１を希釈液（50mM Tris-Cl、2mM EDTA、10mM N-アセチル-L-システイン (pH=8.0)）で100倍希釈したものを使用した。
【００７８】
前記ＴＣ試薬の調製後直ちに、ＴＣ試薬200μL、標的配列含有溶液１の100倍希釈液25μLおよび1/15Mリン酸緩衝液（pH=7.8） 175μLを混合し、62℃で30分間インキュベーションした後、室温で10分間静置することにより、捕捉プローブ１を介して鋳型ＲＮＡ配列（標的核酸配列）をアビジン粒子上に捕捉した。ついで、磁石を用いてアビジン粒子を集め、洗浄液（10mM HEPES、0.1% SDS (pH=7.5)）で洗浄を行った後、標的核酸配列、捕捉プローブ１および担体からなる複合体を次の工程に使用した。
【００７９】
前記複合体に、リバースプライマー１、0.3pmol/μL フォワードプライマー１、80mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、35mM塩化カリウム、40mM塩化マグネシウム、8mM NTP、2mM dNTP、10%ポリビニルピロリドンから成る水溶液を50μL、1/15Mリン酸緩衝液（pH=7.8）を25μL、オイルを100μL添加した。なお、複合体に添加した水溶液中のリバースプライマー１濃度については、前述のＴＣ試薬中の捕捉プローブ１の濃度が0.01、0.02、0.04、0.06および0.075pmol/μLの試料に対し、それぞれ、0.26、0.22、0.14、0.06および0pmol/μLとなるよう調整した。これらの溶液を良く撹拌し、62℃で15分間、42℃で5分間インキュベーションした。その後、酵素溶液（80U/μL 逆転写酵素（MMLV）および80U/μL T7RNAポリメラーゼ）をそれぞれに25μL添加することにより反応液を調製し、42℃で30分間インキュベーションし、標的核酸配列の増幅反応を実施した。
【００８０】
標的核酸配列を検出するために、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイを実施した。すなわち、標的核酸配列増幅後の反応液にプローブ試薬（100mMこはく酸リチウム、2.5%ラウリル硫酸リチウム、20mM EGTA、検出プローブ１ (pH=4.7)）を100μL添加した後、良く撹拌し、60℃で15分間インキュベーションした。インキュベーション後、加水分解液（600mM ホウ酸ナトリウム、1% TritonX-100 (pH=8.5)）を300μL添加し、良く撹拌した後、60℃で15分間インキュベーションした。インキュベーション後、室温で10分間放置し、Gen-Probe社製リーダー450を用いて、発光量を測定した。測定結果を表３および図３に示す。
【００８１】
【表３】
2006075031.tif 000004
【００８２】
表３および図３から明らかであるように、核酸配列、捕捉プローブ１および担体からなる複合体を形成させる工程において捕捉プローブ１が充分に存在していれば、標的核酸配列の増幅工程でリバースプライマー１を添加する必要がないことが分かった。
【００８３】
実施例４
本実施例において、担体としては、実施例１に記載のアビジン粒子を使用した。
【００８４】
標的核酸配列捕捉プローブとしては、捕捉プローブ１を用いた。
【００８５】
ＴＣ試薬としては、0.032%アビジン粒子、0.1pmol/μL捕捉プローブ１、500mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、700mM塩化ナトリウム、10mMエデト酸（EDTA）、0.5%ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドから成る水溶液を用いた。
【００８６】
標的核酸配列を含有する溶液としては、標的配列含有溶液１を、希釈液（50mM Tris-Cl、2mM EDTA、10mM N-アセチル-L-システイン (pH=8.0)）で10倍、100倍または500倍希釈したものを使用した。
【００８７】
前記ＴＣ試薬試薬の調製後直ちに、ＴＣ試薬150μL、標的配列含有溶液１の10倍、100倍または500倍希釈液25μLおよび1/15Mリン酸塩緩衝液（pH=7.8）75μLを混合し、62℃で30分間インキュベーションした後、室温で10分間静置することにより、標的核酸配列捕捉プローブを介して鋳型ＲＮＡ配列（標的核酸配列）をアビジン粒子上に捕捉した。ついで、磁石を用いてアビジン粒子を集め、洗浄液（10mM HEPES、0.1% SDS (pH=7.5)）で洗浄を行った後、標的核酸配列、捕捉プローブ１および担体からなる複合体を次の工程に使用した。
【００８８】
前記複合体に、0.3pmol/μL フォワードプライマー１、80mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、35mM塩化カリウム、41mM塩化マグネシウム、8mM NTP、2mM dNTP、10%ポリビニルピロリドンから成る水溶液を50μL、1/15Mリン酸塩緩衝液（pH=7.8）を25μL、オイルを100μL添加した。これらの溶液を良く撹拌し、62℃で15分間、42℃で5分間インキュベーションした。その後、酵素溶液（80U/μL 逆転写酵素（MMLV）および80U/μL T7RNAポリメラーゼ）を25μL添加することにより反応液を調製し、42℃で60分間インキュベーションし、標的核酸配列の増幅反応を実施した。
【００８９】
増幅したＲＮＡ配列を検出するために、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイを実施した。すなわち、ＲＮＡ配列増幅後の反応液にプローブ試薬（100mMこはく酸リチウム、2.5%ラウリル硫酸リチウム、20mM EGTA、検出プローブ１ (pH=4.7)）を100μL添加した後、良く撹拌し、60℃で15分間インキュベーションした。インキュベーション後、加水分解液（600mM ホウ酸ナトリウム、1% TritonX-100 (pH=8.5)）を300μL添加し、良く撹拌した後、60℃で15分間インキュベーションした。インキュベーション後、室温で10分間放置し、Gen-Probe社製リーダーHC+を用いて発光量を測定した。なお、標的配列含有溶液１の代わりに、50mM  Tris-Cl、2mM  EDTAおよび10mM  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（pH8.0）を含有する溶液を用いて前記同様の増幅工程および検出工程を実施したものを陰性コントロールとした。測定結果を表４および図４に示す。なお、表中、「nt」は試験を実施しなかったことを示すものである。
【００９０】
【表４】
2006075031.tif 000005
【００９１】
表４から明らかであるように、標的核酸配列捕捉プローブを予め担体に固定させるという従来法（比較例３）との間で、ＲＬＵ値の差が見られない。すなわち、本発明の方法によれば、標的核酸配列捕捉プローブを予め担体に固定させるという工程を省略することができる。
【００９２】
比較例３
捕捉プローブ１を予めアビジン粒子に結合させたものを用いて、鋳型ＲＮＡ配列（標的核酸配列）の増幅操作を以下のように実施した。
【００９３】
ＴＣ試薬としては、0.032%アビジン粒子、0.1pmol/μL捕捉プローブ１、500mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、700mM塩化ナトリウム、10mMエデト酸（EDTA）、0.5%ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドから成る水溶液を用いた。
【００９４】
前記ＴＣ試薬150μLを室温で20分間インキュベーションした。ついで、磁石を用いてアビジン粒子を集め、上清を除いた。次に、500mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、700mM塩化ナトリウム、10mMエデト酸（EDTA）、0.5%ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドから成る水溶液150μL、標的配列含有溶液１の10倍、100倍または500倍希釈液25μLおよび1/15Mリン酸塩緩衝液（pH=7.8）75μLを混合し、62℃で30分間インキュベーションした後、室温で10分間静置することにより、標的核酸配列捕捉プローブを介して鋳型ＲＮＡ配列（標的核酸配列）をアビジン粒子上に捕捉した。ついで、磁石を用いてアビジン粒子を集め、洗浄液（10mM HEPES、0.1% SDS (pH=7.5)）で洗浄を行った後、標的核酸配列、捕捉プローブ１および担体からなる複合体を標的核酸配列の増幅工程に使用した。
【００９５】
標的核酸配列の増幅は、前記複合体を用い、実施例４と同様の方法で実施した。ついで、標的核酸配列の検出を、実施例４と同様の方法で実施した。測定結果を表４および図４に示す。
【００９６】
なお、標的配列含有溶液１の代わりに、50mM  Tris-Cl、2mM  EDTAおよび10mM  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（pH8.0）を含有する溶液を用いて前記同様の増幅工程および検出工程を実施したものを陰性コントロールとした。
【００９７】
実施例５
本実施例では、洗浄工程を省略して標的核酸の増幅を行い、ついで標的核酸配列の検出を行った。
【００９８】
本実施例において、担体としては、実施例１に記載のアビジン粒子を使用した。
【００９９】
標的核酸配列捕捉プローブとしては、捕捉プローブ１を用いた。
【０１００】
標的核酸配列を含有する溶液としては、標的配列含有溶液１に0.192%アビジン粒子、0.6pmol/μL捕捉プローブ１を混合した溶液を、希釈液（50mM Tris-Cl、2mM EDTA、10mM N-アセチル-L-システイン(pH=8.0)）で100倍または500倍希釈したものを使用した。
【０１０１】
前記100倍または500倍希釈液25μL、0.3pmol/μL フォワードプライマー１、80mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、35mM塩化カリウム、41mM塩化マグネシウム、8mM NTP、2mM dNTPおよび10%ポリビニルピロリドンから成る水溶液50μLを調製し、同水溶液にオイルを100μL添加した。これらの溶液を良く撹拌し、62℃で15分間、42℃で5分間インキュベーションした。その後、酵素溶液（80U/μL 逆転写酵素（MMLV）および80U/μL T7RNAポリメラーゼ）を25μL添加することにより反応液を調製し、42℃で60分間インキュベーションし、標的核酸配列の増幅反応を実施した。
【０１０２】
標的核酸配列の増幅は、前記複合体を用い、実施例４と同様の方法で実施した。ついで、標的核酸配列の検出を、実施例４と同様の方法で実施した。測定結果を表４および図４に示す。なお、なお、標的配列含有溶液１の代わりに、50mM  Tris-Cl、2mM  EDTAおよび10mM  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（pH8.0）を含有する溶液を用いて前記同様の増幅工程および検出工程を実施したものを陰性コントロールとした。
【０１０３】
表４および図４から明らかであるように、標的核酸配列捕捉プローブを予め担体に結合させる工程だけでなく、洗浄工程を省略した場合でも、標的核酸配列を検出することができた。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、実施例１および比較例１の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例２および比較例２の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例４、比較例３および実施例５の結果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０１０５】
配列番号３：“ｎ”は“ａ”、“ｔ”、“ｇ”または“ｃ”である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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