(57)【要約】【課題】容易に特発性肺線維症を検出するための検出マーカー及び検出キットを提供すること。【解決手段】抗ａｎｎｅｘｉｎ  １抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  １抗体、抗ａｎｎｅｘｉｎ  ４抗体、抗ｂａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａ抗体、抗ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ−１抗体、抗ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ａｎｎｅｘｉｎ  ２抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｒｅ  １抗体、抗ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  １抗体、の少なくとも一つを含有してなる特発性肺線維症の検出マーカーとする。【選択図】図１
2006292718.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ａｎｎｅｘｉｎ  １抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  １抗体、抗ａｎｎｅｘｉｎ  ４抗体、抗ｂａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａ抗体、抗ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ−１抗体、抗ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ａｎｎｅｘｉｎ  ２抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｒｅ  １抗体、抗ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  １抗体、の少なくとも一つを含有してなる特発性肺線維症の検出マーカー。
【請求項２】
ａｎｎｅｘｉｎ  １、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  １、ａｎｎｅｘｉｎ  ４、ｂａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａ、ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ−１、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ、ａｎｎｅｘｉｎ  ２、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｒｅ  １、ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  １、の少なくともいずれかの抗原タンパクを基材に吸着させてなる特発性肺線維症の検出キット。
【請求項３】
前記抗原タンパクは標識が付されていることを特徴とする請求項３記載の特発性肺線維症の検出キット。
【請求項４】
前記標識は、Ｈｉｓ−ｔａｇ標識が付されていることを特徴とする請求項３記載の特発性肺線維症の検出キット。
【請求項５】
ａｎｎｅｘｉｎ  １、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  １、ａｎｎｅｘｉｎ  ４、ｂａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａ、ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ−１、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ、ａｎｎｅｘｉｎ  ２、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｒｅ  １、ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  １、の少なくともいずれかの標識された抗原タンパクを吸着した基材に血液又はＢＡＬ液を塗布することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特発性間質性肺線維症の検出マーカー及び検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
特発性肺線維症は原因不明の疾患であるが、肺胞上皮にａｐｏｔｏｓｉｓ  が亢進し、肺胞上皮基底膜の破壊に伴って間質の線維芽細胞の異常増殖を伴う疾患である。
【０００３】
現在の特発性肺線維症の診断には開胸／胸腔鏡下肺生検が重要な位置を占めているが、病状が進行した症例では検査による侵襲が大きな問題である。なおその問題を解決するために気管支肺胞洗浄検査（Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  :  以下「ＢＡＬ」）が行われている。特発性肺線維症においては、ＢＡＬで採取したＢＡＬ液中に好中球の軽度の増加が確認されたことの報告があり、肺胞腔や間質に浸潤した好中球が病態に重要な役割を果たしているのではないかとの示唆がある（例えば下記非特許文献１参照）。
【０００４】
ところで、ＳＥＲＥＸ（Ｓｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）法は、約１万個のｃＤＮＡの中で数個程度しか存在しない自己抗原発現ｃＤＮＡに対しても検出が可能であり、微量の自己抗原の検出に適した方法である。このＳＥＲＥＸ法により肺癌をはじめとする様々な腫瘍関連抗原が同定されている。同定された抗原には、転写因子、細胞の分化抗原、細胞構成蛋白などに対する自己抗体に加え、新規遺伝子も含まれている。即ちＳＥＲＥＸ法は自己抗原検索においては強力で有用な手法であり、これを用いた報告として、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）や過敏性肺臓炎関連自己抗体の検索に関する報告がある（例えば下記非特許文献２参照）。
【０００５】
また、ＰＣＲ（Ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法による気管支肺胞洗浄液中のＴ細胞Ｖβ鎖遺伝子再構成の検索では、抗原特異的なＴ細胞増生がBAL液中に認められ、肺胞局所において疾患特異的な抗原の存在が示唆されている（例えば下記非特許文献３参照）。
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｅｌｌｓら、“Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ:  ｌｏｎｅ  ｃｒｙｐｔｏｇｅｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｎｇ  ａｌｖｅｏｌｉｔｉｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｆｉｂｒｏｓｉｎｇ  ａｌｖｅｏｌｉｔｉｓ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、１９９８年、１５７巻、１４７４−１４８２頁
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｎａｇａら、“Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ，  ｉｎ  ｓｕｍｍｅｒ−ｔｙｐｅ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ”、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００２年、１６７巻、９９１−９９８頁
【非特許文献３】Ｓｈｉｍｉｚｕｄａｎｉら、“Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＣＤＲ３  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＢＶ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ”、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００２、１２９巻、１４０〜１４９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
確かに、上記非特許文献１において好中球が何らか病態に関与していることを示唆しているが、好中球が増加する機序や肺が線維化する機序は大部分が不明であり、しかも、好中球の増加のみによっては特発性肺線維症の診断を行うことは極めて困難である。また特に、ＢＡＬによって確かに侵襲の問題を和らげることはできるが、より患者に負担のかからない非侵襲な診断も望まれる。
【０００８】
また、ＳＥＲＥＸ法については、殆どが腫瘍関連抗原の同定のために用いられているものであって、腫瘍関連抗原以外のものに適用した例は極めて稀である。これを用いた過敏性肺臓炎関連の報告としては上記非特許文献２の例があるが、これ一例に過ぎないだけでなくこの例も夏型過敏性肺臓炎に対する真菌抗原の報告に過ぎず、特発性肺線維症についての報告でもない。
【０００９】
更に、上記非特許文献３に記載の報告では、抗原特異的なＴ細胞増生が認められているが、ＰＣＲ法のみでは症例間でＨＬＡ抗原が異なること、認識している抗原は抗原提示細胞によって断片化されていること、から認識抗原の決定は極めて困難である。
【００１０】
そこで、本発明は、上記課題を鑑み、より容易に特発性肺線維症を検出するための検出マーカー及び検出キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは、上記課題につき検討したところ、特発性肺線維症において肺胞局所に疾患特異的な抗原が存在し、肺において疾患特異的な抗原／抗体反応が生じているのであれば、Ｂ細胞による抗体産生にはＣＤ４陽性Ｔ細胞の援助が必要不可欠であり、ＢＡＬ液中のＴ細胞は抗原特異的なＶα／Ｖβ鎖を有したＴ細胞が特異的に増生していると考えられ、特発性肺線維症においても、特定の抗原特異的なＶα／Ｖβ鎖を有したＴ細胞がｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌに増生しているのではないかと検討を行った。この検討の結果、特定の抗原特異的なＶα／Ｖβ鎖を有したCD4 陽性T 細胞が ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌに増生し疾患特異的な抗原抗体反応が強く生じた特発性肺線維症と、特定の抗原特異的なＶα／Ｖβ鎖の増生がみられず疾患特異的な抗原抗体反応が生じていない特発性肺線維症があることを見出した（図１参照）。
【００１２】
そこで、更に本発明者らが上記について検討を行ったところ、上記の例のうち図１の（Ｂ）はｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌにＳＥＲＥＸ法による自己抗体解析しやすい症例であり、図１（Ａ）はそうでない症例であると考え、ＳＥＲＥＸ法による自己抗体の解析をしやすい症例を用いて、特発性肺線維症の主な病変部位である肺胞上皮が発現する蛋白を非常に鋭敏な方法（ＳＥＲＥＸ法）で解析を行うことで、特発性肺線維症の患者血清中に存在する自己抗体の検出が可能であることを見いだした。以下具体的に示すが、我々の発見した１１種類の自己抗体は比較的高頻度で特発性肺線維症症例の血清中に存在し、これらを組み合わせることによって、特発性肺線維症の正確な血清学的診断が可能となる。
【００１３】
即ち、本発明に係る特発性肺線維症の検出マーカーは、抗ａｎｎｅｘｉｎ  １抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  １抗体、抗ａｎｎｅｘｉｎ  ４抗体、抗ｂａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａ抗体、抗ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ−１抗体、抗ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ａｎｎｅｘｉｎ  ２抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｒｅ  １抗体、抗ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  １抗体、の少なくとも一つを含有してなることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係る特発性肺線維症の検出キットは、ａｎｎｅｘｉｎ  １、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  １、ａｎｎｅｘｉｎ  ４、ｂａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａ、ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ−１、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ、ａｎｎｅｘｉｎ  ２、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｒｅ  １、ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  １、の少なくともいずれかの抗原タンパクを基材に吸着させてなることを特徴とする。なおここで基材としては上記抗原タンパクを吸着させて抗体反応を確認できる限りにおいて限定はされないが、メンブレンやＥＬＩＳＡ法にも散られるプレートなどが該当する。またこの場合において、抗原タンパクは標識が付されていること、標識は、Ｈｉｓ−ｔａｇ標識が付されていること、も望ましい。
【００１５】
また、本発明に係る方法としては、ａｎｎｅｘｉｎ  １、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  １、ａｎｎｅｘｉｎ  ４、ｂａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａ、ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ−１、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ、ａｎｎｅｘｉｎ  ２、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｒｅ  １、ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  １、の少なくともいずれかの標識された抗原タンパクを吸着した基材に血清又はＢＡＬ液を塗布することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
以上、特発性肺線維症を検出するための検出マーカー及び検出キットを提供することができるようになる。特に、今回我々の発見した１１種類の自己抗体は既存には報告されておらず、特発性肺線維症以外の症例ではほとんどの自己抗体は検出されず、診断検査としての利用価値が高い。
【００１７】
本発明を用いることによって、治療前後のＢＡＬ液または経時的に採取した血清による連続的な疾患特異的自己抗体の解析が可能となる。とりわけ、Ｈｉｓ−ｔａｇ標識自己抗原蛋白を用いた自己抗体の測定は、病勢フォローやステロイドなどの治療効果判定に最適な検査法となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明する。
【００１９】
本発明の実施の形態としては、特発性肺線維症の検出マーカー、検出キットの態様を採用できる。検出マーカーの態様として、抗ａｎｎｅｘｉｎ  １抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  １抗体、抗ａｎｎｅｘｉｎ  ４抗体、抗ｂａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａ抗体、抗ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ−１抗体、抗ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ａｎｎｅｘｉｎ  ２抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｒｅ  １抗体、抗ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  １抗体、の少なくとも一つを含んでなることとする。即ち、特発性肺線維症の疑いのある患者から血清又はＢＡＬ液を抽出し、この抗体が存在しているか否かを調べ、存在している場合は特発性肺線維症の疑いがあると判定することができる。これにより精度よく調べることができるようになる。
【００２０】
また本発明の一実施形態として、ａｎｎｅｘｉｎ  １、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  １、ａｎｎｅｘｉｎ  ４、ｂａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａ、ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ−１、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ、ａｎｎｅｘｉｎ  ２、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｒｅ  １、ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  １、の少なくともいずれかの抗原タンパクを基材に吸着させてなる特発性肺線維症の検出キットとすることもできる。これにより、特発性肺線維症の疑いのある患者から血清又はＢＡＬ液を抽出し、この抗原タンパクが抗体と反応しているか否かを調べることにより、特発性肺線維症の疑いがあるか否かを判定することができる。具体的にはこれら抗原タンパクを基材に吸着させ、ＢＡＬ液又は血清などを塗布することにより抗原タンパクと反応させ、更に発光又は発色部位を有する二次抗体と反応させることで、発光等が行われるか、又はその量にもとづいて抗体が存在しているか否かを判定し、特発性肺線維症であるか否かを判定することが可能となる。この場合において、抗原タンパクには抗原タンパクを作成する観点から標識が付されていることが望ましい。特に本実施形態によると、あらかじめ作成した自己抗原蛋白が吸着したメンブレンやプレートを利用することによって、迅速な検査が可能であり、１時間程度で結果を得ることができる。そのため、病状が刻々と変化する重症例の特発性肺線維症においても迅速な対応が可能である。特発性肺線維症が悪化した場合には、できるだけ早い治療が必要であるが、他の合併症（感染症、悪性腫瘍）の除外に時間がかかり、診断に苦慮する場合が多い。本発明は特発性肺線維症自体が悪化したのか他の合併症が重なったのかを鑑別するうえで非常に重要な情報を提供可能であり、迅速な対応に結びつくことができる。
【実施例】
【００２１】
以下、本実施形態に係る発明の効果を実証すべく検討を行った。以下説明する。
【００２２】
Ｔ細胞Ｖβ鎖は２５種類のサブファミリーから構成されているため、まずそれぞれのサブファミリーに特異的なプライマーを作成した。作成したプライマーを図２に示す。なお図中、Ｖβ１、Ｖβ２…、Ｖβ２５はｆｏｗａｒｄプライマーとして用い、Ｃβはｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして共通に用いた。
【００２３】
そして特発性肺線維症２０症例に対しＢＡＬを行い、そのＢＡＬを抽出した。そしてこのＢＡＬ液からＤｙｎａ  ｂｅａｄｓを用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞の分離、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＴ細胞のＶβ鎖可変部領域の増幅を行い、更にこのＰＣＲ産物を２％アガロースで泳動し、ナイロンメンブレンに転写し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ法によってＴ細胞Ｖβ鎖レパートリーについて解析した。その結果、特発性肺線維症はＢＡＬ液中のCD4陽性Tリンパ球のＴ細胞Ｖβ鎖レパートリーは、２５種類すべてのＶβ鎖サブグループが均等に発現している症例とごく一部のＶβ鎖サブグループのみが発現している症例に分類されることが判明した（図１参照。図１（Ａ）は全体が発現している例であり、図１（Ｂ）はごく一部のＶβ鎖サブグループのみが発現している例である。）。
【００２４】
そして、特定のＶβ鎖のみが発現しＶβ鎖の発現に偏りがみられた症例１２例をＳＥＲＥＸ法による自己抗体の検索に適した症例として考え、このＰＣＲ増幅産物をさらに２重濃度勾配ゲルに泳動し、ナイロンメンブレンに転写し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ法によって
oligoclonality の有無について検討した。
【００２５】
次に、上記Ｖβ鎖の発現に偏りが見られた１２例に対し、ＳＥＲＥＸ法を用いた。ＳＥＲＥＸ法の概要を図３に示す。ＩＩ型肺胞上皮癌培養株からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを作成後、得られたｃＤＮＡライブラリーを蛋白発現ベクター（ＺＡＰ発現ベクター）に組み込み作成したファージを大腸菌に感染させ、ｃＤＮＡのコードする蛋白を大腸菌に発現させた。そしてｃｏｌｏｎｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法によって、特発性肺線維症の血清およびＢＡＬ液中の免疫グロブリンと結合するプラークを選別し、陽性ファージをファジェミドベクターに変換後、シークエンスによって特異的蛋白の塩基配列を決定した。ホモロジー検索によって蛋白の構造を決定し、特発性肺線維症症例の血清中およびＢＡＬ液中に存在する自己抗体の認識自己抗原の同定を行った。以上の結果、各症例において検出されたＶβ鎖サブファミリーを図４に示し、その認識された抗体の一覧を図５に示す。なお図４中ＢＡＬＦはＢＡＬ液を用いて同定した場合を、ＶＡＴＳは胸腔鏡下肺生検によって取り出した組織から同定した場合を示している（Ｖｉｄｅｏ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ）。また図４の右側列に記載されている数字はＶβ鎖のサブファミリーの番号であって、特に数字の右上の *はｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌｉｔｙが確認されたものを示し、太字となっているものは同一症例において時間経過した後であっても共通に同定できたＶβ鎖のサブファミリーを示す。
【００２６】
また図５によると、１１種類の抗体のうち、抗ａｎｎｅｘｉｎ  １抗体は、ＳＥＲＥＸ法によって解析した特発性肺線維症１２例中５例（４１％）の血清および  ＢＡＬ液中に存在した。抗ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  １抗体は特発性肺線維症１２例中４例（３３％）の血清およびBAL 液中に存在が認められた。抗ａｎｎｅｘｉｎ  ４抗体、抗bａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １抗体、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａ  抗体は特発性肺線維症１２例中３例（２５％）の血清および  ＢＡＬ  液中に存在してした。さらに、抗ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １抗体、抗ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ−１抗体、抗ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ａｎｎｅｘｉｎ  ２抗体は特発性肺線維症１２例中２例（１７％）に、抗ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  １  抗体は１２例中１例（８．３％）に存在していた。これにより、自己抗体を検出することによって、特発性肺線維症の有無を判定することができることを確かめた。
【００２７】
また、図４における特発性肺線維症例２（Ｃａｓｅ２）においては、ＢＡＬ液と、このＢＡＬ液採取から３ヶ月後に得られた胸腔鏡下肺生検組織において一部に共通の抗原を認識するＴ細胞Ｖβ鎖の増生が認められた（図６参照）。この所見は、肺胞腔に存在する同一抗原に対して反応するＴリンパ球が長期間、同一生体の肺に存在することを示す。このようなCD4陽性Tリンパ球のＶβ鎖の抗原反応性可変部領域の遺伝子解析を行ったところ、今回検出したａｎｎｅｘｉｎ  １の一部と強い相同性があり（図７）、本発明の自己抗体反応抗原蛋白のひとつであるａｎｎｅｘｉｎ  １に対して肺胞局所で強い免疫反応が生じていることを示している。
【００２８】
近年、ａｎｎｅｘｉｎ  １の特定のアミノ酸部分（ＥＹＶＱＴＶＫ）は、好中球が血管内腔から血管外への遊走を阻止する機能を有するという報告がなされている（Ｗａｌｔｈｅｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ５:８３１−８４０，２０００）。一方、ここで認められたＴ細胞Ｖβ鎖可変部領域はこのＥＹＶＱＴＶＫのアミノ酸と強い相同性が認められており、特発性肺線維症の肺胞局所においてａｎｎｅｘｉｎ  １のＥＹＶＱＴＶＫ部分が重要な役割を果たしていることが読み取れ、特発性肺線維症の病態と密接な関係のある好中球浸潤がこのａｎｎｅｘｉｎ  １のＥＹＶＱＴＶＫを自己抗体がブロックするために増強している可能性が示唆され、矛盾しない結果を得ることができた（図７参照）。
【００２９】
また、今回検出した１１種類の自己抗原蛋白について、ＩＩ型肺胞上皮癌培養株（Ａ５４９）および単球系培養株（ＴＨＰ−１）の双方に対し、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて確認したところ、発現を確認することができた。特発性肺線維症は肺胞腔内に病変の主座が存在すると考えられており、肺胞腔側の構成細胞の大部分を占めるＩＩ型肺胞上皮および肺胞マクロファージの両者から自己抗体認識抗原蛋白が産生されている可能性を確認した。この結果を図８に示す。なお、上記ＲＴ−ＰＣＲ法においては上記に示した自己抗体認識抗原遺伝子全体に対するプライマーを作成した。図９にここで設計したプライマーを示す。
【００３０】
そして更に、発見した自己抗体認識抗原蛋白をＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白として人工的に大腸菌に作成させた。以下に行った蛋白作成方法の概要を示す。
【００３１】
上記のＲＴ−ＰＣＲ法によって得られたＰＣＲ産物をＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白発現ベクター（Ｐｑｅ−３０ＵＡ）にライゲーションし、コンペテントＭ１５細胞にトランスフォーメーションを行った。得られたＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白発現コロニー蛋白をニトロセルロースフィルターに転写後、ＩＰＴＧを含むプレートにフィルターを移し６×Ｈｉｓ−ｔａｇ標識蛋白質を発現させた。得られたフィルターをＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ  ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを用いて免疫染色を行い自己抗体認識抗原蛋白発現コロニーを選別した。得られたコロニーをピックアップし培養液中で増殖させ、６×Ｈｉｓ−ｔａｇ標識蛋白質の抽出を行った。Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法によって蛋白発現を確認した後、大腸菌大量培養液から、自己抗体認識抗原蛋白（Ｈｉｓ−ｔａｇ標識蛋白）の精製を行った。
【００３２】
これにより得られた１１種類の特発性肺線維症特異的Ｈｉｓ−ｔａｇ標識自己抗原蛋白をＴｈｅ  Ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ  社）を用いて、６ｍｍ  Ｄｏｔとしてナイロンメンブレン上に吸着させた。これにより、得られた蛋白吸着メンブレンに対し症例の血清又はＢＡＬ液でｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行い、二次抗体として抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させ化学発光にて自己抗体発現の有無を１１種類同時に検出した。Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ法およびＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法による検索では、特発性肺線維症例の血清およびBAL液を用いた場合にのみＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白に対して陽性バンドを検出することができ、またバンドの発現強度は、病勢が悪化した場合に強く検出される傾向が認められた。
【００３３】
また、上記により得られた１１種類の特発性肺線維症特異的Ｈｉｓ−ｔａｇ標識自己抗原蛋白をＮｉ−ＮＴＡ標識ＥＬＩＳＡプレートに添加し４度で一晩インキュベートし固定した。これによりＨｉｓ−ｔａｇ標識蛋白をＮｉ−ＮＴＡに結合させることができ、これにより得られたＥＬＩＳＡプレートを用いて症例血清又はＢＡＬ液を自己抗原蛋白と結合させ、さらに２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識した抗ひとIgG抗体を反応させ、アルカリフォスファターゼ発色基質にて発色後、４０５nmの吸光度を測定することによって自己抗体濃度を決定した。ＥＬＩＳＡの結果を図１０に示す。健常人５０例における結果の平均値から標準偏差の３倍以上を陽性とした。今回検出した１１種類の自己抗体は３０例のサルコイドーシス（sarcoidosis）、１０例の好酸球性肺炎（eosinophilic
pneumonia）、１０例の過敏性肺臓炎（hypersensitivity pneumonitis: HP）では血清中およびBAL 液中いずれにおいても検出されなかった。膠原病性間質性肺炎（collagen
vascular disease associated interstitial pneumonia: IP-CVD）では一部の抗体がごく少数にみられたのみで大部分は陰性であった。一方、特発性肺線維症においては血清中およびBAL 液中の自己抗体は５％から２５％の頻度で陽性であり、これらの抗体を組み合わせることによって約８０％の特発性肺線維症の診断が可能であった。このことから、我々の発見した１１種類の自己抗体の測定は特発性肺線維症の診断に有用であることが確認された。図１０においてPM/DMは多発性筋炎（polymyositis）/皮膚筋炎（dermatomyositis）、シエーグレン症候群（Sjogren）、全身性硬化症（systemic
sclerosis: SSc）、関節リュウマチ（rheumatoid arthritis: RA）、全身性エリテマトーデス（systemic
lupus erythematosus: SLE）を示す。さらに、特発性肺線維症急性増悪症例においては、特に  annexin 1、phosphoglycerate
kinase 1、annexin 4、bax inhibitor 1、cytochrome
c reductase core 1 に対する自己抗体が、安定した肺線維症症例よりも有意にその頻度および発現強度（405 nmの吸光度）が高い傾向が認められた（図１１）。特に、 annenxin 1、phosphoglycerate
kinase 1に対する自己抗体は特発性肺線維症急性増悪例においては、血清中および BAL 液中で５０ー６０％と高率に陽性であった。１ヶ月以内に呼吸困難が増悪し、胸部X線にて浸潤影が増加した特発性肺線維症症例で感染症や心不全が除外された症例を急性増悪例とした。これら５種類の自己抗体を経時的にフォローすることによって、特発性肺線維症の急性増悪の予測が可能である。本発明のＥＬＩＳＡ解析は、特発性肺線維症の病勢フォローに有用な指標であった。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＳＥＲＥＸ  法による自己抗体解析に適した症例と適さない症例の典型例を示す図である。
【図２】Ｔ細胞Ｖβ鎖サブファミリーに対するＰＣＲ法に用いたプライマーを示す図。
【図３】ＳＥＲＥＸ法の概略図を示す図。
【図４】特発性肺線維症におけるＢＡＬ液中のＣＤ４陽性Ｔ細胞Ｖβ鎖レパートリーの解析結果を示す図。
【図５】ＳＥＲＥＸ法によって検出した１１種類の特発性肺線維症特異的自己抗体の認識する自己抗原蛋白とその発現頻度を示す図。
【図６】ＢＡＬ液とＢＡＬから３ヶ月後に得られた胸腔鏡下肺生検組織において一部に共通の抗原を認識するＴ細胞Ｖβ鎖の増生を示す図。
【図７】特発性肺線維症例（Ｃａｓｅ２）の ＢＡＬ液および胸腔鏡下肺生検組織中のＴ細胞の抗原認識部分であるＶβ鎖と特発性肺線維症特異的自己抗原の一部に強い相同性が認められを示す図。
【図８】ＲＴ−ＰＣＲ法によって１１種類の自己抗原蛋白の発現が、ＩＩ型肺胞上皮癌培養株（Ａ５４９）および単球系培養株（ＴＨＰ−１）の双方に確認されたことを示す図。AG1 はａｎｎｅｘｉｎ  １、AG2 はｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  １、AG3 はａｎｎｅｘｉｎ  ４、AG4  はｂａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １、AG5  はｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａ、AG6 はａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １、AG7 はｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ−１、AG8 はｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ、AG9 はａｎｎｅｘｉｎ  ２、 AG10 はｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｒｅ  １、AG11 はｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  １の自己抗原蛋白を示す。
【図９】１１種類の特発性肺線維症特異的自己抗体認識抗原遺伝子を増幅するために用いたＰＣＲプライマーを示す図。
【図１０】さまざまな肺疾患における血清中およびBAL 液中の特発性肺線維症特異的自己抗体発現頻度を示す図。n は解析した症例数を示す。AG1 からAG11 は図８で示した自己抗原蛋白を示す。
【図１１】特発性肺線維症急性増悪症例(Acuteexacerbation of IPF) および安定症例 (Stable IPF) における血清中およびBAL 液中の特発性肺線維症特異的自己抗体発現頻度を示す図。AG1 からAG11 は図８で示した自己抗原蛋白を示す。右上に＊で示した自己抗体は、安定した肺線維症に比較して特発性肺線維症急性増悪例で頻度および発現強度（405 nmの吸光度）が有意に増加している抗体を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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