(57)【要約】【課題】新しい神経細胞退化等起因疾病治療剤及びその有効成分、その有効成分調整法等これに必要な物質と技術を提供すること。【解決手段】サルビアノール酸B及びその光学又は幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の作用を有するもの及びそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物又はそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物に、神経幹細胞及びその分化細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化する作用を見つけ、これらを有効成分とすることを特徴とする神経系細胞作用剤、当該作用剤による神経系細胞作用法、当該作用法による神経系細胞含有液調整法、当該調整法による神経系細胞含有液、当該作用剤及び／又は当該神経系細胞含有液を有効成分とする神経細胞退化等起因疾病治療剤を開発した。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルビアノール酸B及びその光学又は幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の作用を有するもの及びそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物又はそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物を有効成分とし、神経幹細胞又は神経幹細胞及びその分化細胞からなる神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化することを特徴とする神経系細胞の作用剤。
【請求項２】
化合物が、サルビアノール酸B及びそのプロドラッグ、ならびに薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれることを特徴とする請求項１に記載する作用剤。
【請求項３】
化合物が、サルビアノール酸B及び薬学的に許容することのできるその塩ならびにそれらの水和物から選ばれることを特徴とする請求項２に記載する作用剤。
【請求項４】
請求項１から請求項３に記載する作用剤を要すれば賦活化後体外で神経系細胞に投与することを特徴とする体外での神経系細胞作用法。
【請求項５】
他家又は異種の血清、塩基性繊維芽細胞増殖因子及び神経成長因子を含まない培養液を用いることを特徴とする請求項４に記載する作用法。
【請求項６】
請求項４又は請求項５に記載する作用法で処理することを特徴とする神経系細胞含有液の調整法。
【請求項７】
請求項６において、請求項５に記載する作用法で処理することを特徴とする移植可能な神経系細胞含有液の調整法。
【請求項８】
請求項６又は請求項７に記載する調整法で調整された神経系細胞含有液。
【請求項９】
請求項８において、請求項７に記載する調整法で調整された移植可能な神経系細胞含有液。
【請求項１０】
請求項１から請求項３に記載する作用剤及び請求項９に記載する移植可能な神経系細胞含有液の少なくとも一つから選ばれるものを有効成分とすることを特徴とする神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療剤。
【請求項１１】
請求項１から請求項３に記載する作用剤を有効成分とすることを特徴とする請求項１０に記載する治療剤。
【請求項１２】
請求項９に記載する移植可能な神経系細胞含有液を有効成分とすることを特徴とする請求項１０に記載する治療剤。
【請求項１３】
サルビアノール酸B、亜硫酸塩及びビタミンＣ以外の薬学的に許容することのできる抗酸化剤から選ばれる抗酸化剤を少なくとも１種類を添加することを特徴とする請求項１から請求項３に記載する作用剤、請求項４及び請求項５に記載する作用法、請求項６及び請求項７に記載する神経系細胞含有液の調整法、請求項８及び請求項９に記載する神経系細胞含有液、請求項１０から請求項１２に記載する治療剤。
【請求項１４】
請求項１０から請求項１３に記載する治療剤を投与することを特徴とする神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療剤及びその有効成分並びにその調整法等を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
サルビアノール酸B（別名：サルビアノリック・アシッドＢ又はリソスペルミン酸Ｂ又はシナバル・フェニック・アシドＢ、英語名：Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ・ａｃｉｄ・Ｂ又はＬｉｔｈｏｓｐｅｒｍｉｃ・ａｃｉｄ・Ｂ又はＣｉｎｎａｂａｒ・ｐｈｅｎｉｃ・ａｃｉｄ・Ｂ、中国名：丹フン酸Ｂ又は丹フン酸乙、但し、フンに該当する中国字は酉偏に分と書く。以下、Sal・Bと略称する。）はシソ科の植物の１種である丹参（学名：Ｌａｂｉａｔａｅ・Ｓａｌｖｉａ・ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ・Ｂｕｎｇｅ）等の水溶性成分の一つで、図１に示される立体構造を有する（特許文献１、非特許文献１）。
【０００３】
Ｓａｌ・B及びその関連化合物であるサルビアノール酸Ａ、サルビアノール酸Ｃ、サルビアノール酸Ｄ、サルビアノール酸Ｅ、サルビアノール酸Ｆ、サルビアノール酸Ｇ、サルビアノール酸Ｈ、サルビアノール酸Ｉ、サルビアノール酸Ｊ、イソサルビアノール酸Ｃ（Ｉｓｏｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ・ａｃｉｄ・Ｃ）、サルビアフラシド（Ｓａｌｖｉａｆｌａｓｉｄｅ）、プルゼワルスキン酸Ａ（Ｐｒｚｅｗａｌｓｋｉｎｉｃ・ａｃｉｄ・Ａ）、リソスペルミン酸（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｉｃ・ａｃｉｄ）、ロスマリン酸（Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ・Ａｃｉｄ）（以下、順にＳａｌ・Ａ、Ｓａｌ・Ｃ、Ｓａｌ・Ｄ、Ｓａｌ・Ｅ、Ｓａｌ・Ｆ、Ｓａｌ・Ｇ、Ｓａｌ・Ｈ、Ｓａｌ・Ｉ、Ｓａｌ・Ｊ、Ｉｓｏｓａｌ・Ｃ、Ｓｆｓｉｄｅ、ＰｒｚＡ、Ｌｉｔｈ・Ａ、Ｒｏｓ・Ａと略称する。）の化学構造は図２に示される（非特許文献２）。
【０００４】
Sal・Bは、腎機能改善作用、リボキシゲナーゼ作用と抗アレルギー作用、肝機能改善作用、心室心筋細胞と大動脈内皮細胞障害の抗酸化作用による保護作用、ＴＮＦによる微小血管内皮細胞障害の保護作用、酸化低密度リポタンパク質誘導心臓血管系炎症障害保護作用、血圧降下作用心臓血管系細胞に対する作用、抗糖尿病作用、抗ウイルス作用、体重過剰症改善作用等が認められる他、更に、一酸化窒素遊離を減少させることにより（非特許文献３）、或はベーターアミロイドの線維化を阻害することにより（非特許文献４）、或はベーターアミロイドによるパル４（Ｐａｒ‐４）発現の増加を予防することにより（非特許文献５）ベーターアミロイドの神経細胞毒を軽減し、脂質過酸化の減少と遊離ラジカルの除去等により虚血‐再潅流による脳障害を保護し（非特許文献６）、一過性脳虚血に対し記憶機能を保護し（非特許文献７）、局地的脳血流速度を改善し、血小板凝集を阻害する（非特許文献８）。
【０００５】
Sal・Bの関連化合物の1つであるSal・Ａは、Sal・Bより強い抗酸化作用を有し（非特許文献９）、その抗酸化作用により脳虚血‐再潅流による記憶障害を予防する（非特許文献１０）が、神経幹細胞増殖作用と神経幹細胞分化作用はない（非特許文献１１）。従って、Sal・Ａは抗酸化作用により脳虚血‐再潅流による記憶障害を予防するにしても、神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病に対しては効果が期待できず、Sal・Bも同様に期待できないと考えられた。
【０００６】
一方、胎児性及び成人性神経幹細胞は既に齧歯類の中枢神経系からのみならず、ヒトの中枢神経系からから分離されている。神経幹細胞は神経細胞、アストロサイト、オリゴデントロサイトに分化し、興奮性神経シナプスと抑制性神経シナプスに分化し、活性の神経系ネットワークを形成する（非特許文献１２）。
ラットの脳動脈を一時的に止めて脳虚血にして海馬の神経細胞に傷害を与えると、一旦神経幹細胞が脳内に出現するが、神経細胞等に分化する前に死滅する。神経成長因子（ＮＧＦ）を注入すると、神経幹細胞が増殖分化して、失われた神経細胞の4割が回復するという報告がある（非特許文献１３）。
又、機能を失った組織に対して、神経幹細胞を移植し、個々の生体機能を発現する細胞へ特異的に分化させることにより、当該病態を改善・治療する試みが行われている。例えば、パーキンソン病に関し、神経幹細胞を線条体内部へ移植すると、細胞が生き残り臨床効果を得（非特許文献１４）、脳梗塞の関し、神経幹細胞の移植により脳梗塞の改善が見られる（非特許文献１５）。
これらデーターは脳内神経幹細胞とその分化細胞を保護しつつ、脳内神経幹細胞を増殖及び／又は分化することにより、或は神経幹細胞の分化細胞の脳内移植により、或は神経幹細胞の脳内移植とそれに続く脳内での神経幹細胞の分化により、神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病が治療できることを示している。
【０００７】
しかし、神経幹細胞の増殖、分化に関し、多くの特許が出願され、公開されているが、いずれも、生物学的因子を用いる方法であり、実際の使用に当たり、解決すべき課題を残している。実際の使用に当たり、解決すべき課題の少ない非高分子の神経幹細胞増殖剤としてはベンゼン環縮合５員複素環式化合物（特許文献２）、又は薬用人参中のサポニン類のギンセノシドＲｇ１（英語名：Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ  Ｒｇ１）（特許文献３，４，５）が報告されているに過ぎない。また、Sal・Bの抽出源の一つである丹参の薬効に関する特許も多いが、その多くは丹参の主薬効から類推可能な血管系に関する薬効である。痴呆薬に関する特許公開公報が存在するが、丹参の他、種々の生薬の配合剤に関する特許出願である（特許文献６）。
【０００８】
以下に先行文献を特許文献と非特許文献に分けて表示する。
【特許文献１】特開平１−２６８６８２号公報
【特許文献２】特開２００３−８１９５９号公報
【特許文献３】特開２０００−１９１５３９号公報
【特許文献４】特開２０００−３０２７９８号公報
【特許文献５】特開２００１−１３９４８３号公報
【特許文献６】特開平６−５６６８４号公報
【非特許文献１】Ｃ．Ｂ．Ａｉら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．１９８８年５１巻１号１４５頁‐１４９頁
【非特許文献２】Ｌ．Ｎ．Ｌｉら、Ｊ．Ｃｈｉｎｅｓｅ・Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ・Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９７年６巻２号５７頁‐６４頁
【非特許文献３】Ｚ．Ｆｅｎｇら、Ｊ．Ａｃｔａ・Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ・Ｓｉｎｉｃａ、２０００年３５巻１２号８８１頁‐８８５頁
【非特許文献４】Ｍ．Ｋ．Ｔａｎｇら、Ａｃｔａ・Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ・Ｓｉｎｉｃａ、２０００年３５巻１２号８８１頁‐８８５頁
【非特許文献５】Ｍ．Ｋ．Ｔａｎｇら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００２年８８巻４号４２２頁‐４４７頁
【非特許文献６】Ｙ．Ｈ．Ｃｈｅｎら、Ａｃｔａ・Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ・Ｓｉｎｉｃａ、２０００年２１巻５号４６３頁‐４６６頁
【非特許文献７】Ｇ．Ｈ．Ｄｕら、Ｊ．Ａｓｉａｎ・Ｎａｔｕｒａｌ・Ｐｒｏｄｕｃｔｓ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００年２巻２号１４５頁‐１５２頁
【非特許文献８】Ｍ．Ｋ．Ｔａｎｇら、Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００２年９巻５号４０５頁‐４０９頁
【非特許文献９】Ｇ．Ｔ．Ｌｉｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ・Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１９９２年４３巻２号１４７頁‐１５２頁
【非特許文献１０】Ｇ．Ｈ．Ｄｕら、Ａｃｔａ・Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ・Ｓｉｎｉｃａ、１９９５年３０巻３号１８４頁‐１９０頁
【非特許文献１１】Ｌ．Ｈ．Ｓｈｅｎら、Ａｃｔａ・Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ・Ｓｉｎｉｃａ、２００３年３８巻１０号７３５頁‐７３８頁
【非特許文献１２】Ｓ．Ｋ．Ｍｉｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００２年９９巻１６２１頁‐１６２６頁
【非特許文献１３】Ｈ．Ｎａｋａｔｏｍｉら、Ｃｅｌｌ、２００２年１１０巻４号４２９頁‐４４１頁
【非特許文献１４】Ｐ．Ｈａｇｅｌｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００１年６６巻８号７４１頁‐７５２頁
【非特許文献１５】Ｔ．Ｖｅｉｚｏｖｉｃら、Ｓｔｒｏｋｅ、２００１年３２巻４号１０１２頁‐１０１９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、「神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療剤」を提供することにあり（課題１）、そのために、当該治療剤の有効成分として、「脳内の神経幹細胞又は神経幹細胞及びその分化細胞からなる神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化する神経系細胞の作用剤」（課題２）と「神経系細胞含有液」（課題３）、その中で特に「移植可能な神経系細胞含有液」（課題４）を提供することにあり、そのために、「神経系細胞含有液の調整法」（課題５）、その中で特に「移植可能な神経系細胞含有液の調整法」（課題６）を提供することにあり、そのために、「体外で神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化する神経系細胞作用法」（課題７）、その中で特に、「移植可能な神経系細胞含有液の製法に必要な神経系細胞作用法」（課題８）を提供することにあり、そのために、その作用法に使用する作用剤として、「体外で神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化する神経系細胞の作用剤」を提供することにあり（課題９）、更に、「より安定な当該治療剤、脳内神経系細胞作用剤、神経系細胞含有液、移植可能な神経系細胞含有液、神経系細胞含有液調整法、移植可能な神経系細胞含有液調整法、神経系細胞作用法、移植可能な神経系細胞作用法、体外神経系細胞作用剤」を提供することにあり（課題１０）、更に、「神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療法」を提供することにある（課題１１）。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで、本発明者は先ず、体外で神経幹細胞を増殖する非高分子化合物を探索したところ、驚くべきことに、Ｓａｌ・Ａの作用からの予想と異なり、Ｓａｌ・Ｂに増殖作用を見出し、更に種々研究した結果、サルビアノール酸Bを有効成分とする神経幹細胞増殖剤の発明を完成し、特許出願した（特願２００４−２６４０１６）。本発明者は、更により良い効果が期待される体外で神経幹細胞又は神経幹細胞及びその分化細胞からなる神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化する非高分子化合物を探索したところ、驚くべきことに、Ｓａｌ・Ａの作用からの予想と異なり、Ｓａｌ・Ｂに当該作用を見出し、更に種々研究した結果、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、課題９「体外で神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化する神経系細胞の作用剤の提供」として、（１）「サルビアノール酸B及びその光学又は幾何異性体でサルビアノール酸Bと同様の作用を有するもの及びそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物又はそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物を有効成分とし、神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化することを特徴とする神経系細胞の作用剤」を提供する。
【００１２】
更に、本発明は、課題７「体外で神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化する作用法の提供」として、（２）「上記（１）に記載する作用剤を要すれば賦活化後体外で神経系細胞に投与することを特徴とする体外での神経系細胞作用法」を提供する。
【００１３】
更に、本発明は、課題８「移植可能な神経系細胞含有液の製法に必要な作用法の提供」として、（３）「他家又は異種の血清、塩基性繊維芽細胞増殖因子及び神経成長因子を含まない培養液を用いることを特徴とする上記（２）に記載する作用法」を提供する。
【００１４】
更に、本発明は、課題５「神経系細胞含有液の調整法の提供」として、（４）「上記（２）と（３）に記載する作用法で処理することを特徴とする神経系細胞含有液の調整法」を提供する。
【００１５】
更に、本発明は、課題６「移植可能な神経系細胞含有液の調整法の提供」として、（５）「上記（４）において、上記（３）に記載する作用法で処理することを特徴とする移植可能な神経系細胞含有液の調整法」を提供する。
【００１６】
更に、本発明は、課題３「神経系細胞含有液の提供」として、（６）「上記（４）と（５）に記載する調整法で調整された神経系細胞含有液」を提供する。
【００１７】
更に、本発明は、課題４「移植可能な神経系細胞含有液の提供」として、（７）「上記（６）において、（５）に記載する調整法で調整された移植可能な神経系細胞含有液」を提供する。
【００１８】
更に、本発明は、課題２「脳内の神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化する神経系細胞の作用剤の提供」として、（８）「上記（１）に記載する作用剤と同一の作用剤」を提供する。
【００１９】
更に、本発明は、課題１「神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療剤の提供」として、（９）「上記（８）に記載する作用剤及び上記(７)に記載する移植可能な神経系細胞含有液の少なくとも一つから選ばれるものを有効成分とすることを特徴とする神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療剤」を提供する。
【００２０】
更に、本発明は、課題１０「より安定な当該治療剤、脳内神経系細胞作用剤、神経系細胞含有液、移植可能な神経系細胞含有液、神経系細胞含有液調整法、移植可能な神経系細胞含有液調整法、神経系細胞作用法、移植可能な神経系細胞作用法、体外神経系細胞作用剤の提供」として、（１０）「サルビアノール酸B、亜硫酸塩及びビタミンＣ以外の薬学的に許容することのできる抗酸化剤から選ばれる抗酸化剤を少なくとも１種類を添加することを特徴とする上記（９）に記載する治療剤、上記（８）に記載する脳内神経系細胞作用剤、上記（６）に記載する神経系細胞含有液、上記（７）に記載する移植可能な神経系細胞含有液、上記（４）に記載する神経系細胞含有液の調整法、上記（５）に記載する移植可能な神経系細胞含有液の調整法、上記（２）に記載する神経系細胞作用法、上記（３）に記載する移植可能な神経系細胞作用法、上記（１）に記載する体外神経系細胞作用剤」を提供する。
【００２１】
更に、本発明は、課題１１「神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療法の提供」として、（１１）「上記（９）と（１０）に記載する治療剤を投与することを特徴とする神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療法」を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の神経系細胞作用剤は、（１）「体外で神経幹細胞又は神経幹細胞及びその分化細胞からなる神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化する神経系細胞作用剤」として有用であり、（２）「体外で神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化する神経系細胞作用法に用いる主たる薬剤」として有用であり、（３）「移植可能な神経系細胞含有液の製法に必要な神経系細胞作用法に用いる主たる薬剤」として有用であり、（４）「神経系細胞含有液の調製法に用いる主たる薬剤」として有用であり、（５）「移植可能な神経系細胞含有液の調製法に用いる主たる薬剤」として有用であり、（６）「脳内の神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化する神経系細胞作用剤」として有用であり、（７）「神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療剤の有効成分」として有用であり、（８）「神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療法に用いる治療剤の主たる有効成分」として有用である。
【００２３】
本発明の体外での神経系細胞作用法は、（１）「体外で神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化する神経系細胞作用法」として有用であり、（２）「神経系細胞含有液の調整法の工程」として有用であり、更に、当該作用法の中で、他家又は異種の血清、塩基性繊維芽細胞増殖因子及び神経成長因子を含まない培養液を用いる神経系細胞作用法は、（３）「移植可能な神経系細胞含有液の調整法中の工程」として有用である。
【００２４】
本発明の神経系細胞含有液の調整法は、（１）「神経系細胞の供給源として有用な神経系細胞含有液の調整法」として有用であり、更に、当該調整法の中で、他家又は異種の血清、塩基性繊維芽細胞増殖因子及び神経成長因子を含まない培養液を用いる神経系細胞含有液の調整法は、（２）「移植可能な神経系細胞含有液の調整法」として有用である。
【００２５】
本発明の神経系細胞含有液は、（１）「神経系細胞の供給源」として有用であり、更に、当該神経系細胞含有液の中で、移植可能な神経系細胞含有液は（２）「神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療剤の有効成分」として有用である。
【００２６】
本発明の治療剤は、「神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療剤」として有用ある。
【００２７】
本発明の抗酸化剤を添加する体外神経系細胞作用剤、神経系細胞作用法、移植可能な神経系細胞作用法、神経系細胞含有液調整法、移植可能な神経系細胞含有液調整法、神経系細胞含有液、移植可能な神経系細胞含有液、脳内神経系細胞作用剤、神経細胞の退化等起因疾病治療剤、は、より安定な当該作用剤、作用法、調整法、細胞含有液、治療剤として有用である。
【００２８】
本発明の治療法は「神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療法」として有用ある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の１つは体外又は脳内で神経幹細胞又は神経幹細胞及びその分化細胞からなる神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化することを特徴とする神経系細胞の作用剤である。本発明の作用剤の有効成分はSal・B及びその光学又は幾何異性体でSal・Bと同様の神経系細胞作用を有するもの及びそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物又はそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物である。Sal・Bの光学又は幾何異性体の中で、Sal・Bと同様の神経系細胞作用を有しないものは、本発明の神経系細胞作用剤の有効成分として用いることはできない。これに対し、Sal・Bと同様の神経系細胞作用を有するSal・Bの光学又は幾何異性体は本発明の神経系細胞作用剤の有効成分として用いることができる。しかし、Sal・B及びその光学又は幾何異性体でSal・Bと同様の神経系細胞作用を有するものの中でSal・Bに関するデーターが一番蓄積されているので、Sal・B及びそのプロドラッグ、ならびに薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物がより好ましく、Sal・B及び薬学的に許容することのできるその塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物が更により好ましい。
【００３０】
Sal・Bは、シソ科の植物の１種である丹参（学名：Ｓａｌｖｉａ・ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ・Ｂｕｎｇｅ）、テン丹参（学名：Ｓａｌｖｉａ・ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ・Ｃ．Ｈ．Ｗｒｉｇｈｔ）、血盆草（学名：Ｓａｌｖｉａ・ｃａｖａｌｅｒｉｅｉ・Ｌｅｖｌ．ｖａｒ．ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｅｌｉａ・Ｐｅｔｅｒ‐Ｓｔｉｂａｌ）、アキノタムラソウ（学名：Ｓａｌｖｉａ・ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ・Ｂｅｎｔｈ）、サルビア・カバレリエイ・レブル（学名：Ｓａｌｖｉａ・ｃａｖａｌｅｒｉｅｉ・Ｌｅｖｌ．）、サルビア・フラバ・フォレスト・エクス・ディールス（学名：Ｓａｌｖｉａ・ｆｌａｖａ・Ｆｏｒｒｅｓｔ・ｅｘ・Ｄｉｅｌｓ）、サルビア・ボウレヤナ・ドゥン（学名：Ｓａｌｖｉａ・ｂｏｗｌｅｙａｎａ・Ｄｕｎｎ）、サルビア・プリオニティス・ハンセ（学名：Ｓａｌｖｉａ・ｐｒｉｏｎｉｔｉｓ・Ｈａｎｃｅ）（Ｌ．Ｎ．Ｌｉら、Ｊ．Ｃｈｉｎｅｓｅ・Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ・Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９７年６巻２号５７頁‐６４頁）等から水、熱湯、メタノール‐水溶液等で抽出後、カラムクロマトグラフィーやカウンター・カレント・クロマトグラフィーで精製される。例えば、丹参の抽出液をｐＨ２−４に調整した後、これをカラムクロマトグラフィーにかけてSal・Bを吸着させ、これに酢酸マグネシウム、又は酢酸カルシウム等の酢酸塩水溶液を流した後、メタノール溶液を用いて溶出した区分を分取し、さらにこれを精製する（特開平１−２６８６８２号公報）か、丹参の熱湯抽出物を樹脂カラムに吸着させ、５０％‐９５％エタノールで溶離する（米国特許２００１年６，２９９，９１０号公報）か、抽出液丹参のエタノール・水溶液抽出物をノルマル‐ヘキサン・エチル酢酸・エタノール・水（３：７：１：９容量／容量）からなる二層溶媒系の高速カウンター・カレント・クロマトグラフィーで精製する（Ｈ．Ｂ．Ｌｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．２００２年９４３巻２号２３５頁‐２３９頁）等して得られる。取得したSal・Bの品質管理は、例えば、Sal・B試料を分析用オー・ディ・エス・カラム（ＯＤＳ・ｃｏｌｕｍｎ）に吸着させ、メタノール・５％酢酸溶液（３５：６５容量／容量）で溶離する高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を２８１ナノメーターの波長で検出する（Ｑ．Ｗ．Ｚｈａｎｇら、Ｚｈｏｎｇｇｕｏ・Ｚｈｏｎｇ・Ｙａｏ・Ｚａ・Ｚｈｉ、２００１年２６巻１２号８４８頁‐８４９頁）か、Sal・B試料２０マイクロリットルをディスカバリーＣ１８（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ・Ｃ１８、４．６ミリメーターＸ２５センチメーター）カラムに吸着させ、メタノール‐水‐氷酢酸（４０：６０：２、容量／容量）で流速０．５ミリリットル／分で溶離するＨＰＬＣを２８６ナノメーターの波長で検出する（曲桂武ら、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｄｃｅｎｔｅｒ．ｃｏｍ．ｃｎ／ｔｏｎｇｘｕｎ／２／ｑｕｇｕｉｗｕ１．ｐｄｆ．）等して行う。しかし、これらの植物以外のSal・B含有植物があれば、その植物から分離してもよく、合成が可能な場合は合成品でもよい。現在Sal・Bは中国（景天生物工程有限公司）と米国（Ｉｖｙ・Ｆｉｎｅ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ・Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）等で市販されている。Sal・Bは単離精製物の他、単離したが精製が十分で���いもの、単離未精製物、未単離物等他の化合物が混在する場合でも、その混在する化合物が、本発明の目的を阻害しない限り、用いることができる。Sal・B含有植物も用いることができる。単離精製物、単離したが精製が十分でないもの、単離未精製物、未単離物、Sal・B含有植物の順に有用である。
【００３１】
Sal・B及びその光学又は幾何異性体でSal・Bと同様の神経系細胞作用を有するもののプロドラッグは加水分解等分解を受けてSal・B又はその光学又は幾何異性体に成るものであれば、薬学的に許容することのできる限り、どのようなものでもよい。当該プロドラッグの一つとしてSal・B分子中のカルボキシル基でのメチル又はエチルエステル誘導体やSal・B分子中のフェノール基でのアセチル誘導体等が挙げられるが、それらに限らない。将来合成されるものでも差し支えない。
【００３２】
Sal・Bの塩及びその光学又は幾何異性体でSal・Bと同様の神経系細胞作用を有するものの塩、及びそれらのプロドラッグの塩は薬学的に許容することのできる塩に限られる。薬学的に許容することのできる塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等のアンモニウム塩、トリエチルアミン、リジン、アルギニン等の有機アミンの塩、塩酸、臭化水素酸、硫酸等鉱酸との酸付加塩等が挙げられるが、それらに限らない。薬学的に許容することのできる塩であればよく、薬学的に許容することのできる限り、将来合成される有機化合物との塩でも差し支えない。
【００３３】
Sal・B及びその光学又は幾何異性体でSal・Bと同様の神経系細胞作用を有するもの及びそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物又はそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩の水和物も本発明の神経系細胞作用剤の有効成分として用いることができる。
【００３４】
本発明の神経系細胞作用剤は酸素及び湿気のない状態では比較的安定である。しかし、抗酸化作用を有するので、空中及び水溶液中で比較的不安定である。水溶液中のSal・Bは高温で不安定で、摂氏８０度で72時間加温すると３５％変化し、チオ硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ヒドロ亜硫酸ナトリウム、システイン塩酸塩、ＥＤＴＡ２ナトリウム塩を添加しても一部変化し、ビタミンＣを添加した時のみ摂氏８０度で72時間加温しても安定である（曲桂武ら、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｄｃｅｎｔｅｒ．ｃｏｍ．ｃｎ／ｔｏｎｇｘｕｎ／２／ｑｕｇｕｉｗｕ２．ｐｄｆ．）。
Sal・Bを保存する時は酸素や湿気の無い状態で保存することが好ましい。長期保存を考慮に入れると、本発明の神経系細胞作用剤又は当該疾病治療剤には有効成分の安定のため、他の抗酸化剤を添加することが好ましい。抗酸化剤としては薬学的に許容することのできる抗酸化剤に限られる。薬学的に許容することのできる抗酸化剤としては、アルファ・カロチン、ベータ・カロチン、リコペン、ルテイン、フラボノイド、カテキン、リザベラトール、イソフラボン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、セレン、亜鉛、補酵素Ｑ１０、グルタチオン、エンゾジノール等が挙げられる。これらの抗酸化剤は高温の水溶液中のSal・Bの変化を抑える。亜硝酸塩はSal・Bの変化を完全には抑えない。したがって、亜硝酸塩は、単独では安定剤としては不十分である。ビタミンＣはSal・Bの変化を抑える。したがって、ビタミンＣはSal・B等の安定剤として使用は可能であるが、ビタミンＣ自体が空中及び水溶液中で比較的不安定であり、ビタミンＣを多量に添加するか他の抗酸化剤との併用が必要になる。
【００３５】
本発明の神経系細胞作用剤は、「体外又は脳内で神経幹細胞又は神経幹細胞及びその分化細胞からなる神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化することを特徴とする神経系細胞の作用法」に用い、又、「神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療剤」の有効成分としても用いる。本作用剤を体外での当該作用法に用いる場合は、通常、Ｓａｌ・Ｂ換算で０．００１から１００マイクロモル濃度、好ましくは、０．０１〜１０マイクロモル濃度、より好ましくは、０．０２から０．０７マイクロモル濃度の範囲で用いるが、目的により、本作用剤の濃度を適宜変えても目的を達する限りよい。例えば、本作用剤を連続的に添加する場合は、より低濃度でも作用する。脳内での神経系細胞作用剤として用いる場合又は当該治療剤の有効成分として用いる場合は、本作用剤が脳内に到達して、神経幹細胞又は神経幹細胞及びその分化細胞に作用するに十分な濃度になるような量が必要である。脳内到達量は当該脳内作用剤及び当該治療剤の経口剤、静脈内注射剤、脳内注射剤等剤型によって異なるが、目安として、体重６０キログラム当たり、０．０１〜１０００ミリグラム、好ましくは、０．１〜１００ミリグラムの範囲で、１日量を１日１回、あるいは２〜４回に分けて投与する。なお、週齢又は年齢、目的又は症状により適宜増減する。経口投与、静脈内投与、脳内投与の順に投与量は少なくなる。特に、脳内連続投与の場合は、体外での神経系細胞作用剤の項で述べた濃度で投与する。
【００３６】
本発明のもう１つは、体外又は脳内で神経幹細胞又は神経幹細胞及びその分化細胞からなる神経系細胞を保護しつつ、神経幹細胞を増殖及び／又は分化することを特徴とする神経系細胞の作用法である。
【００３７】
本発明の体外での神経系細胞作用法は、前述の本発明の神経系細胞作用剤を用いることを特徴とする。本作用法に用いる神経幹細胞及びその分化細胞は、使用目的によって限定の度合いが異なる。動物用の場合は、移植対象の動物と同じ系統の動物の胎児の脳より無菌的に採取した神経幹細胞及びその分化細胞を用いる。移植可能なヒト神経系細胞含有液の調製に用いる場合は、治療対象の患者又はその患者と主要組織適合抗原が実質的に同じ、又は非常に類似するヒト胎児の脳内より無菌的に採取した神経幹細胞及びその分化細胞を用いる。倫理的問題を考慮すると治療対象の患者の脳内より無菌的に採取するのが一番好ましい。前述したように、脳梗塞や脳出血を起きた場合に、脳内に一時的に神経幹細胞が出現するので、脳梗塞や脳出血に対する外科的治療の際に、この出現した神経幹細胞を採取するとよい。他の疾病の場合は、神経幹細胞の出現が少ないので、場合によっては、脳内の重要性のより低い局所での人工的虚血等による神経幹細胞の出現を利用することも考えられる。
【００３８】
本発明の作用剤を前述の濃度になるように加えた細胞培養液に神経幹細胞及びその分化細胞からなる神経系細胞を懸濁するか、当該細胞含有細胞培養液に本発明の作用剤を前述の濃度になるように加える。摂氏３５度から摂氏３９度、より好ましくは、摂氏３６度から摂氏３８度の範囲内で、４％から６％の炭酸ガス含有培養器内で２，３時間から１０日間、より好ましくは、目的によるが、通常３日から５日間培養する方法により作用する。神経幹細胞の増殖を目的とする場合は、通常、培養液１ミリリットル当たり、神経幹細胞を１Ｘ１０の４乗個から８Ｘ１０の４乗個程度細胞培養液に懸濁して当該作用剤を作用させる。その間、要すれば、１日から３日おきに、細胞培養液を当該作用剤を当該濃度含む新しい細胞培養液と取り替えて作用させる。神経幹細胞の分化を目的とする場合は、通常、培養液１ミリリットル当たり、神経幹細胞を５Ｘ１０の５乗個から５Ｘ１０の６乗個程度細胞培養液に懸濁するか、前述の作用により増殖した神経幹細胞含有細胞培養液を摂氏３５度から摂氏４０度、より好ましくは、摂氏３６度から摂氏３８度の範囲内で、炭酸ガスインキュベーター内で更に数時間から１０日間、より好ましくは、通常２日から５日間培養する方法により作用する。
【００３９】
本作用法に用いる細胞培養液は、本作用剤を用いる他は、例えば、下記に示す２％の培養用サプルメントＮ２含有ダルベッコ修正イーグル最少必須培地（ＤＭＥＭ）／ハムＦ１２培地（ＤＭＥＭとF12を１：１で混合したもの）の無血清培養液等公知の基本培養液を用いることができる。先行文献ではこれらの無血清培地に神経幹細胞増殖剤として、胎児性牛血清（ＦＢＳ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＮＧＦ等神経細胞等のたんぱく質性の生体因子を添加する。本発明はこれらの血清又は生体因子の代わりに、本作用剤を用いるところに特徴がある。もちろん、目的によってはこれらの血清や生体因子を添加しても良いが、移植可能な神経系細胞含有液を調整する場合は、基本培養液にこれらの血清や生体因子を加えてはならない。他家又は異種の血清、塩基性繊維芽細胞増殖因子及び神経成長因子を含まない培養液を用いることが肝要である。
【００４０】
基本培養液の１例として、培養用サプルメントＮ２、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２培地等の組成を示す。神経系細胞を保護し、かつ神経幹細胞を増殖及び／又は分化する限り、組成は変更してもかまわない。
培養用サプルメントＮ２の組成（ミリグラム／リットル）：インスリン：５、ヒトトランスフェリン：１００、プロゲステロン：０．００６３、プトレッシン１６．１１、亜セレン酸塩：０．００５２．
ＤＭＥＭの組成（ミリグラム／リットル）：塩化カルシウム：２００、硝酸鉄（三価）９水和物：０．１、塩化カリウム：４００、硫酸マグネシウム：９７．６、塩化ナトリウム：６，４００、リン酸二水素ナトリウム２水和物：１２５、Ｌ‐アルギニン塩酸塩：８４、Ｌ‐シスチン２塩酸塩：６２．６、Ｌ‐グルタミン：５８４、Ｌ‐グリシン：３０、Ｌ‐ヒスチジン塩酸塩１水和物：４２、Ｌ‐イソロイシン：１０４．８、Ｌ‐ロイシン：１０４．８、Ｌ‐リジン塩酸：１４６．２、Ｌ‐メチオニン：３０、Ｌ‐フェニルアラニン：６６、Ｌ‐セリン：４２、Ｌ‐スレオニン：９５．２、Ｌ‐トリプトファン：１６、Ｌ‐チロシン二ナトリウム塩：８９．５、Ｌ‐バリン：９３．６、パントテン酸カルシウム：４、コリン酒石酸水素塩：７．２、葉酸：４、イノシトール：７．２、ニコチンアアミド：４、ピリドキサール塩酸塩：４、リボフラビン：０．４、チアミン塩酸塩：４、デキストロース：１，０００、ピルビン酸ナトリウム：１１０、フェノール・レッド：５。
培養用サプルメントＢ２７の成分（Ｇ．Ｊ．Ｂｒｅｗｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１９９３年３５巻５６７頁‐５７６頁）（Ｂ２７の組成は開示されていないので、Ｂ２７そのものを使用する場合は市販品を購入せざるを得ないが、開示されている成分より、似たような効果を有する培養用サプルメントを作ることは可能である）：ビオチン、Ｌ‐カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、Ｄ（＋）ガラクトース、還元型グルタチオン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレッシン、レチニル酢酸、セレン、トリオド‐ｌ‐チロミン、ビタミンＥ、ビタミンＥ酢酸塩、ウシアルブミン、カタラーゼ、インスリン、スーパーオキシド・ジスムターゼ、トランスフェリン。
ハムＦ１２培地の組成：塩化カルシウム：３３．３、硫酸銅（ニ価）５水和物：０．００２５、硫酸鉄（ニ価）７水和物：０．８３４、塩化カリウム：２２４、塩化マグネシウム：５７．１、塩化ナトリウム：７，６００、リン酸水素二ナトリウム：１４２、硫酸亜鉛７水和物、Ｌ‐アラニン：８．９、Ｌ‐アルギニン塩酸塩：２１１、Ｌ‐アスパラギン１水和物：１５．０、Ｌ‐アスパラギン酸：１３．３、Ｌ‐システイン塩酸塩１水和物：３５．１、Ｌ‐グルタミン酸：１４．７、Ｌ‐グルタミン：１４６、Ｌ‐グリシ：７．５、Ｌ‐ヒスチジン塩酸塩１水和物：２１．０、Ｌ‐イソロイシン：３．９４、Ｌ‐ロイシン：１３．１、Ｌ‐リジン塩酸塩：３６．５、Ｌ‐メチオニン：４．４８、Ｌ‐フェニルアラニン：４．９６、Ｌ‐プロリン：３４．５、Ｌ‐セリン：１０．５、Ｌ‐スレオニン：１１．９、Ｌ‐トリプトファ：２．０４、Ｌ‐チロシン：５．４４、Ｌ‐バリン：１１．７、ビオチン：０．００７３、パントテン酸カルシウム：０．４７７、塩化コリン：１４．０、シアノコバラミン：１．３５５、葉酸：１．３２４、イノシトール：１８．０、リポ酸：０．２０６、ニコチンアミド：０．０３６６、ピリドキシン塩酸塩：０．０６１７、リボフラビン：０．０３７６、チアミン塩酸塩：０．３３７、デキストロース：１，８０２、ヒポキサンチン：４．０８、リノレイン酸：０．０８４１、ピルビン酸ナトリウム：１１０、チミジン：０．７２７、プトレッシン２塩酸塩：０．６１、フェノール・レッド：１．２４２。
【００４１】
なお、本発明の作用法に本作用剤としてプロドラッグを用いる場合には、プロドラッグによっては、培養中の細胞によりマスクが除かれ、活性体になるので、賦活化の必要が無い場合もあるが、プロドラッグによっては培養細胞により活性体にならない場合もある。したがって、要すれば、投与前に賦活化する必要がある。プロドラッグの性質に応じて、アルカリ処理又は酸処理して、マスクを外し、中和した後に、この作用剤を用いる。
【００４２】
本発明の脳内での神経系細胞作用法は、動物又はヒトに本発明の作用剤を前述の投与量を経口投与、静脈内投与、脳内投与等して行う。
【００４３】
本発明の更にもう1つは、神経幹細胞又は神経幹細胞及びその分化細胞含有液の調整法である。本発明の神経系細胞作用法を用いることを特徴とする。その他は先行文献と同じである。即ち、海馬、線条体と大脳皮質を胎児ないし、２、３週齢の動物、又は堕胎したヒト胎児の脳から取り出す。これらを直ちにＤ‐ハンクス液等の緩衝液の中に入れ、０．１から０．２％のトリプシンと混合させ、これらを静かにピペットで吸い込み、吐き出す方法で、個々の細胞にし、網でろ過する。ろ過した細胞を１分当たり４００回転から１，０００回転の回転速度で５分ないし１０分間遠心分離して、沈殿した細胞を分離し、分離した細胞を１％から３％の培養用サプルメントＮ２等神経細胞用サプルメンと１リットル当たり１０から３０マイクログラムのｂＦＧＦ又はＮＧＦと１ミリリットル当たり５０から１５０単位のペニシリンと５０から１５０マイクログラムのストレプトマイシンを含むダルベッコ修正イーグル最少必須培地等の最少必須培地とハムＦ１２培地等アミノ酸等付加培地を例えば１：１で混合したものからなるの無血清培養液で洗浄後、当該培養液中に、１ミリリットル当たり４ないし６Ｘ１０の４乗個の細胞密度になるように懸濁し、この懸濁した細胞を摂氏３６度から３８度で、４％から６％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で培養し、２日毎に培養液の半量を新しい培養液で置き換え、１週間後に形成した球形の最初の細胞塊を集め、これらをピペットで吸い込み、吐き出す方法で機械的に個々の細胞にばらし、前述の培養液で、１ミリリットル当たり４ないし６Ｘ１０の４乗個の細胞密度で、再び培養する。５日後に再び形成する球形細胞塊を同様の操作により再び培養する。この操作を繰り返し、第５次の球形細胞塊を得、トリプシン処理により個々の細胞に分離された動物又はヒトの神経幹細胞を得る。神経幹細胞同定はネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）免疫蛍光染色試験等による神経幹細胞特異マーカーの存否等公知の方法で行う。
【００４４】
細胞の分離や細胞の洗浄に用いる緩衝液の１例としてＤ‐ハンクス液、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、デルベッコのＰＢＳ（ＤＰＢＳ）等の組成を示す。後の操作に悪い影響を与えない限り、これ以外の緩衝液も用いることができる。
Ｄ‐ハンクス液の組成（ミリグラム／リットル）：塩化カルシウム：１８５．５、塩化カリウム：４００、リン酸二水素カリウム：６０、硫酸マグネシウム：９７．７、塩化ナトリウム：８，０００、リン酸水素二ナトリウム：４７．５、Ｄ‐グルコース：１，０００。
ＰＢＳの組成（ミリグラム／リットル）：塩化カルシウム：１３２．５、塩化カリウム：２００、リン酸二水素カリウム：２００、硫酸マグネシウム：５９．２、塩化ナトリウム：８，０００、リン酸水素二ナトリウム：１１５０。
ＤＰＢＳの組成（ミリグラム／リットル）：塩化カルシウム：１００、塩化カリウム：２００、リン酸二水素カリウム：２００、塩化マグネシウム：１００、塩化ナトリウム：８，０００、リン酸水素二ナトリウム：１１５０。
ＲＰＭＩ１６４０の組成（ミリグラム／リットル）：硝酸カルシウム：６９．５、塩化カリウム：４００、硫酸マグネシウム：４８．８、塩化ナトリウム：６，０００、リン酸水素二ナトリウム：８０１、Ｌ‐アルギニン：２００、Ｌ‐アスパラギン１水和物：５６．８、Ｌ‐アスパラギン酸：２０、Ｌ‐システイン２塩酸塩：６５．２、Ｌ‐グルタミン酸：２０、Ｌ‐グルタミン：３００、Ｌ‐グリシ：１０、Ｌ‐ヒスチジン：１５、Ｌ‐ヒドロキシプロリン：２０、Ｌ‐イソロイシン：５０、Ｌ‐ロイシン：５０、Ｌ‐リジン塩酸塩：４０、Ｌ‐メチオニン：１５、Ｌ‐フェニルアラニン：１５、Ｌ‐プロリン：２０、Ｌ‐セリン：３０、Ｌ‐スレオニン：２０、Ｌ‐トリプトファ：５、Ｌ‐チロシン：２０、Ｌ‐バリン：２０、ｐ‐アモノ安息香酸：１、パラビオチン：０．２、パントテン酸カルシウム：０．２５、塩化コリン：３、シアノコバラミン：０．００５、葉酸：１、イノシトール：３５、ニコチンアミド：１、ピリドキシン塩酸塩：１、リボフラビン：０．２、チアミン塩酸塩：１、デキストロース：２，０００、還元型グルタチオン：１、フェノール・レッド：５。
２０倍ＳＳＣの組成（モル／リットル）：塩化ナトリウム：３、クエン酸ナトリウム：０．３。
【００４５】
得られた神経系細胞を前述の神経系細胞培養液に懸濁し、本発明の作用法で神経系細胞を培養する。培養した神経系細胞を１分当たり４００回から８００回の回転速度で５分から１０分間遠心し、上清を捨て、細胞を分離する。トリプシン処理をして細胞を個々の細胞にばらし、ＤＰＢＳで洗浄し、目的の液、例えば、本発明の移植可能な神経系細胞含有液又は本発明の治療剤の有効成分である神経系細胞含有液を調整する場合は、移植又は治療対象の動物又は患者の血液に、１マイクロリットル当たり目的の細胞密度、例えば、移植や治療剤の目的の場合は、１マイクロリットル当たり３から７Ｘ１０の４乗個の細胞密度になるように懸濁し、神経系細胞含有液を得る。
【００４６】
ところで、体外で増殖及び／又は分化した神経系細胞含有液は神経系細胞培養液としてどのような培養液を用いたか、或いは神経系細胞の作用剤としてどのような作用剤を用いたかにより、その質が異なる。例えば、神経系細胞培養液として血清含有培養液を用いた場合、或いは神経系細胞作用剤としてｂＦＧＦやＮＧＦを加えて培養した場合は、調整した神経系細胞含有液に血清やｂＦＧＦやＮＧＦが混入する。本発明の神経系細胞作用法で調整する神経系細胞含有液には本発明の神経系細胞作用剤が混入している。移植免疫の問題があるので、血清やｂＦＧＦやＮＧＦ等が混入する神経系細胞含有液は、移植に適さない。従って、神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療剤に用いることはできない。
【００４７】
公知の無血清の神経幹細胞培養液には血清は存在しないが、一般に、神経幹細胞増殖剤としてｂＦＧＦやＮＧＦはは添加する。従って、移植可能な神経系細胞含有液調整法では、そのための、神経系細胞作用法を用いることが肝要である。神経系細胞含有液調整の最終工程ではこれらの因子を添加した培養液を用いないとが肝要である。前述の培養用サプルメントＮ２中にたんぱく質としてインスリンとヒトトランスフェリンが存在する。インスリン又はヒトトランスフェリン投与によりインスリン抗体やヒトトランスフェリン抗体が出現するものの、臨床上の抗原抗体反応としてはあまり問題にならない。もし、インスリンとヒトトランスフェリンの混入が問題になる場合は、本発明方法で培養した後に、培養液を捨て、インスリンとヒトトランスフェリンを除いたＮ２サプルメントと本発明の細胞系細胞作用剤を添加した細胞培養液で１日間培養することにより、混入するインスリンとヒトトランスフェリンを消化し尽くす方法を取ればよい。いずれにしろ、本発明の神経系細胞含有液に本発明の神経系細胞作用剤が混入するが、本発明の神経系細胞作用剤はSal・B及びその光学又は幾何異性体でSal・Bと同様の神経系細胞作用を有するもの及びそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物又はそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物を含有するが、これらは抗原性は無い。
【００４８】
本発明の更にもう1つは、神経系細胞含有液である。上述の本発明の神経系細胞含有液調整法によって得られる。移植可能な神経系細胞含有液は、前述したように、その調整において、少なくとも最終工程では他家又は異種の血清、塩基性繊維芽細胞増殖因子及び神経成長因子を含まない培養液を用いる必要がある。調整した神経系細胞含有液は、１次抗体として、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）等神経幹細胞特異マーカー、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）等神経細胞特異マーカー、グリア繊維性酸性たんぱく質（ＧＦＡＰ）等アストロサイト特異マーカー等に対する特異抗体を用い、２次抗体として、これら特異マーカー特異抗体に対する蛍光色素標識した特異抗体を用いて、公知のネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）免疫蛍光染色試験、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）免疫蛍光染色試験、グリア繊維性酸性たんぱく質（ＧＦＡＰ）等を行い、神経幹細胞特異マーカー、神経細胞特異マーカー、アストロサイト特異マーカー等の存否等を検定する。本発明の神経系細胞含有液は可能な限り使用直前に調整することが好ましい。短期保存の場合は、移植又は治療対象が決まっている場合は、その対象患者の血液に懸濁して保存する。移植又は治療対象が決まっていない場合は、本発明の神経系細胞作用剤を含む無血清培地に懸濁して保存する。長期保存する必要がある場合は、本発明の神経系細胞作用剤を含むヒト胎児血清含有血清培地に懸濁し、ＤＭＳＯ等氷結保護剤を加えて、摂氏−８０度で保存し、使用直前に、この保存細胞を用いて本発明の調整法により神経系細胞含有液を調整して治療剤として使用する。
【００４９】
本発明の更にもう1つは、神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療剤である。本発明の神経系細胞含有液を含有することを特徴とする治療剤と、本発明の神経系細胞作用剤を含有することを特徴とする治療剤とそれらの混合剤の３種類存在する。
【００５０】
神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病としては、例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、小脳変性症、交通性水頭症、ハンチントン病、前頭葉への照射後疾病、多発性硬化症、正常圧水頭症、パーキンソン病、ピック病、進行性多巣性白質脳症、進行性核上麻痺、拳闘家痴呆、脳外傷、外科手術、脳腫瘍、慢性硬膜下血腫起因疾病、脳卒中（脳梗塞又は脳出血）起因疾病、脳血管性痴呆、ウィルソン病細菌性心内膜炎起因疾病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、HIV関連疾病、神経梅毒、結核性及び真菌性髄膜炎起因疾病、ウイルス性脳炎起因疾病、無酸素症、B１２欠乏症、慢性的な薬物-アルコール-栄養性乱用起因疾病、葉酸欠乏症、副甲状腺機能亢進症に伴う高カルシウム血症、低血糖起因疾病、甲状腺機能低下起因疾病、肝性脳症、肺性脳症、尿毒素性脳症等の臓器系不全、ペラグラ等、繊維化、免疫反応、血管傷害、栄養と酸素欠乏、感染等により、神経細胞が退化、減少、細胞死し、又は傷害、除外されることにより、組織や臓器がその機能を失い発症する疾病が挙げられるが、これに限らない。神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病であればよい。
【００５１】
更に、本発明の治療剤の中で、神経系細胞作用剤含有治療剤は、神経幹細胞及びその分化細胞を保護する作用も有するので、神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失する可能性がある疾病の神経細胞保護のため、予防的に投与することも含まれる。
【００５２】
本発明の神経系細胞作用剤含有治療剤は、前述したように、有効成分が非高分子であることから、体外投与は勿論、経口投与又は非経口投与（筋肉内、皮下、静脈内、脳内、坐薬など）のいずれでも投与できる。体内投与の場合は体内でプロドラッグが活性化するので、体外での神経系細胞作用法の場合と異なり、プロドラッグを予め活性化しておく必要は少ない。
【００５３】
経口用製剤を調製する場合、賦形剤、さらに必要に応じて、抗酸化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により、錠剤、被服錠剤、顆粒剤、カプセル剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、油性又は水性の懸濁液剤などとする。賦形剤としては、例えば、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルーロスなどが挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００５４】
崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン未、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストラン、ペクチンなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが挙げられる。着色剤としては、医薬品に添加することが許可されているものが使用できる。矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ油、竜脳、桂皮末などが使用できる。これらの錠剤は、顆粒剤には、糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングしてもよい。
【００５５】
注射剤を調製する場合、必要により、グルコースや生理的食塩水等の等調液、pH調整剤、緩衝剤、抗酸化剤及びその他の安定化剤、保存剤などを添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内、脳内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に収納後、凍結乾燥などによって、固形製剤として、用事調製の製剤としてもよい。また、一投与量を容器に収納してもよく、また、多投与量を同一の容器に収納してもよい。溶液の場合、酸素や湿気を遮断する方がよい。そのため、場合によってはアンプル型の容器に入れ、空気を抜くか、窒素ガス等で空気を置換しておく方がよい。公知の方法でよい。
【００５６】
本発明の神経系細胞作用剤含有治療剤の投与量は、脳内で神経系細胞作用剤の項で述べたように、経口剤、静脈内注射剤、脳内注射剤等剤型によって異なるが、ヒトの場合、成人１日当たり通常０．０１〜１０００ミリグラム、好ましくは、０．１〜１００ミリグラムの範囲で、１日量を１日１回、あるいは２〜４回に分けて投与する。なお、年齢、症状により適宜増減する。経口投与、静脈内投与、脳内投与の順に投与量は少なくてよい。特に、脳内連続投与の場合は、Ｓａｌ・Ｂ換算当たり、体外での神経系細胞作用剤の項で述べた濃度で投与する。
【００５７】
本発明の治療剤の中で、神経系細胞含有液含有治療剤は、前述の神経系細胞作用剤含有治療剤と異なり、より好ましくは、治療対象患者別に、使用直前に作られたものを使用する。即ち、移植可能な神経系細胞含有液の項で説明した様に、治療対象患者が決まった後に、本発明の移植可能な神経系細胞含有液調整法によって、本発明の移植可能な神経系細胞含有液を調整する。最終的には、当該移植可能な神経系細胞を１マイクロリットル当たり、１Ｘ１０の３乗から１Ｘ１０の５乗個、より好ましくは、１Ｘ１０の４乗から８Ｘ１０の４乗個を患者の血液に懸濁した治療剤、より好ましくは、これに本発明の作用剤がＳａｌ・Ｂ換算で０．０２から０．０４マイクロリットル含有しているものを調整する。
【００５８】
本発明の神経幹細胞含有液含有治療剤は神経幹細胞を含有しているため、動脈内注射剤、静脈内注射剤、又は脳内注射剤に限られる。この中で、静脈内注射が一番安全性に優れている。但し、動静脈投与は脳障害直後又は脳炎症中等脳血管バリアが壊れている時か、将来、人工的に中等脳血管バリアを壊した場合に限られる。脳内注射の場合は、そのような制限はない。中枢神経系に移植するのに適切であるように様々な方法で投与されうる。これに限定されるわけではないが、くも膜下腔投与、脳室内投与及び黒質内投与等が挙げられる。通常、患者の脳内に脳内血管の外壁に接触しないように注意して、１マイクロリットルから１ミリリットル投与する。病状により、適宜増減する。投与した治療剤中の自家血液が刺激になって、内在性の神経幹細胞が発生する場合は、効果が倍増する。しかし、この自家血が脳内血管の外壁に接触した場合、血管がレン縮する可能性もある。その危険を避けるためには、神経系細胞を自家血に懸濁した治療剤の代わりに、無血清培地に懸濁した治療剤を用いるか、又は、脳梗塞や脳内出血等で脳血管関門が壊れている患者に対しては、自家血に懸濁した治療剤を静脈内又は動脈内投与することも可能である。
【００５９】
本発明の治療剤を神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病患者に投与すると、（１）神経系細胞含有液含有治療剤の場合は、治療剤に含有される神経系細胞が疾病により失われた神経細胞部位に移動し、神経細胞又はアストロサイト又はオリゴデントロサイトの場合は直接、神経幹細胞の場合は移動先の環境により、神経細胞又はアストロサイト又はオリゴデントロサイトに分化した後、失われた神経細胞等が補充されることにより病状が改善され、（２）神経系細胞作用剤含有治療剤の場合は、その治療剤に含まれる神経系細胞作用剤が体内に内在する神経幹細胞の存在部位に浸透し、その内在神経幹細胞又は神経幹細胞及びその分化細胞を保護しつつ神経幹細胞を増殖及び／又は分化する。即ち、内在神経幹細胞は増殖しつつ、失われた神経細胞部位に移動し、その移動先の環境により、神経細胞又はアストロサイト又はオリゴデントロサイトに分化する。これにより、失われた神経細胞等が補充され、病状が改善される。後者の治療剤の方が前者の治療剤の方より患者に対する負担が少ないので、通常、先ず、後者を投与して有効かどうかを調べ、無効の場合に前者の神経系細胞含有液含有治療剤を投与する方がよい。
【００６０】
既に述べたように、本発明の細胞系細胞作用剤、細胞系細胞作用法、細胞系細胞含有液調整法、細胞系細胞含有液、細胞系細胞作用剤含有治療剤、細胞系細胞含有液含有治療剤、細胞系細胞作用剤含有治療法、細胞系細胞含有液含有治療法は、いずれも、有効成分として、或は、その工程に使用する主たる薬剤として、Ｓａｌ・Ｂ及びその光学又は幾何異性体でＳａｌ・Ｂと同様の作用を有するもの及びそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物又はそれらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる化合物を用い、特別の目的のためには最終工程で他家又は異種の血清、塩基性繊維芽細胞増殖因子及び神経成長因子を含む培養液を用いないことに特徴がある。
【００６１】
この特徴以外の試薬や操作や工程は公知の操作や工程でよく、それらは多くの先行文献に開示されている。例えば、齧歯類の胎児性神経幹細胞の分離技術はＫ．Ｋ．Ｊｏｈｅらにより、Ｇｅｎｅｓ・Ｄｅｖ．１９９６年１０巻３１２９頁に、齧歯類の成人性神経幹細胞の分離技術はＡ．Ｇｒｉｔｔｉらにより、Ａｍ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９６年１６巻１０９１頁に、更にＴ．Ｄ．Ｐａｌｍｅｒらにより、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７年８巻３８９頁に、ヒトの胎児性神経幹細胞の分離技術はＯ．Ｂｒｕｓｔｌｅらにより、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９８年１６巻１０４０頁に、更にＣ．Ｎ．Ｓｖｅｎｄｓｅｎらにより、Ｂｒａｉｎ・Ｐａｔｈｏｌ．１９９９年９巻４９９頁に、ヒトの成人性神経幹細胞の分離はＶ．Ｇ．Ｋｕｋｅｋｐｖらにより、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９９９年１５６巻３３３頁に、更にＡ．Ｆ．Ｐａｇａｎｏらにより、Ｓｔｅｍ・ｃｅｌｌｓ、２０００年１８巻２９５頁に、神経幹細胞からの神経、アストロサイト、オリゴデントロサイトへの分化技術と興奮性神経シナプスと抑制性神経シナプスへの分化技術はＣ．Ｖｉｃａｒｉｏ‐Ａｂｅｊｏｎらにより、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０００年１２巻６７７頁に、更にＨ．Ｔｏｄａらにより、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０００年１６５巻６６頁に、神経幹細胞の移植技術はＰ．Ｈａｇｅｌｌらにより、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２００１年６０巻７４１頁に、更にＯ．Ｉｓａｃｓｏｎらにより、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２００３年５３巻ｓ１３５頁に、１‐メチル‐４‐フェニル‐１，２，３，６‐テトラヒドロピリジン起因パーキンソン病のマウスの作り方と当該マウスの脳への神経幹細胞の移植技術はＸ．Ｌｉらにより、Ａｃｔ・Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ、２００３年２４巻１１９２頁に、脳梗塞患者への神経幹細胞の移植技術はＴ．Ｖｅｉｚｏｖｉｃらにより、Ｓｔｒｏｋｅ、２００１年３２巻１０１２頁に開示されている。神経細胞や神経幹細胞の培養法は各試薬メーカーの当該細胞培養試薬の使用説明書に、免疫染色方法は各試薬メーカーの当該免疫染色試薬の使用説明書に開示されている。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６２】
海馬、線条体と大脳皮質を２週齢のスプラグ‐ダウレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ））系の雄のラットの脳から取り出した。これらを直ちにＤ‐ハンクス液（ＨｙＣｌｏｎｅ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ・Ｉｎｃ社製）の中に入れ、０．１２５％のトリプシンと混合させ、これらを静かにピペットで吸い込み、吐き出す方法で、迅速に4回もみほぐして組織を個々の細胞にし、もみほぐした細胞を、最初網目の大きさが１８０マイクロメーターのナイロン性の網でろ過し、次いで網目の大きさが７５マイクロメーターのナイロン性の網でろ過した。ろ過した細胞を回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心分離して、沈殿した細胞を分離し、分離した細胞を２％の培養用サプルメントＮ２（ＧＩＢＣＯ社製）と１リットル当たり２０マイクログラムのｂＦＧＦ（ＰＥＰＲＯ・ＴＥＣＨ社製）と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリン（ＳＩＧＭＡ社製）と１００マイクログラムのストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含むダルベッコ修正イーグル最少必須培地／ハムＦ１２培地（ＤＭＥＭとF12を１：１で混合したもの、ＧＩＢＣＯ社製）の無血清培養液で洗浄後、当該培養液中に、１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、この懸濁した細胞を摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で培養し、２日毎に培養液の半量を新しい培養液で置き換えた。１週間後に球形の最初の細胞塊が形成された。この第１次球形細胞塊を集め、これらをピペットで吸い込み、吐き出す方法で機械的に個々の細胞にばらし、前述の培養液で、１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度で、再び培養した。５日後に再び球形細胞塊が形成された。この操作を繰り返し、第５次の球形細胞塊を得た。
【実施例２】
【００６３】
実施例１で得られた第５次の球形細胞塊の性質を調べるために、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）免疫蛍光染色試験を行った。ネスチンは神経幹細胞に発現し、神経細胞には発現しない。したがって、この球形細胞塊がネスチン免疫蛍光染色試験陽性であれば、神経幹細胞を取得したことを意味する。そこで、得られた第５次の球形細胞塊を前述の方法により個々の細胞にばらし、その一部を５％の胎児性牛血清（ＦＢＳ）を含む前述のＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で１ミリリットル当たり２００，０００個の細胞密度になるように懸濁し、スライドグラスの上の中央に１００マイクロリットルだけ小分けし、２時間放置したところ、細胞がスライドグラスに付着した。この付着細胞を、付着した状態で、Ｄ‐ハンクス液で洗浄し、洗浄後の付着細胞を４％パラホルムアルデヒド含有０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（フナコシ社製）１００マイクロリットルに摂氏４度で３０分間浸す方法で固定した。この固定した細胞をＰＢＳに室温で３０分間浸す方法で３回洗浄した後、自然に乾燥させた。この乾燥させた固定化細胞に１ミリリットル当たり０．０５マイクログラムのタンパク分解酵素を加え、摂氏３７度で２分反応させた。引き続き、タンパク分解酵素処理をした固定化細胞を０．５％トリトン・エックス１００（ｔｒｉｔｏｎＸ１００）と５％ヤギ正常血清含有Ｄ‐ハンクス液（Ｄ‐ハンクスＴＳ液）１５０マイクロリットルで摂氏３７度で３０分間浸した。次にこの固定した細胞に同液で１００倍に希釈したマウスの抗ラットネスチン抗体（大日本製薬製）を加え、摂氏４度で一晩放置した。翌日、第１次抗体反応をさせた固定化細胞をＤ‐ハンクスＴＳ液で室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この固定した細胞を同液に１ミリリットル当たり１０マイクログラムの第２次抗体であるビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で、室温で２時間浸した。この第２次抗体処理した固定化細胞をＤ‐ハンクスＴＳ液で室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この洗浄した固定化細胞を使用直前にアビジン‐ビオチン複合体（Ａｖｉｄｉｎ‐Ｂｉｏｔｉｎ・Ｃｏｍｐｌｅｘ）溶液（Ｖｅｃｔｏｒ社のＶｅｃｔａｓｔａｉｎ・Ｅｌｉｔｅ・ＡＢＣ・Ｋｉｔ・Ｓｔａｎｄａｒｄ使用）用の溶液Ａ（アビジン）１０マイクロリットルと溶液Ｂ（ビオチン）１０マイクロリットルとＰＢＳ５００マイクロリットルを混合した液に室温で１時間浸し、直ちにＰＢＳで3回洗浄した。このＡＢＣ処理した固定化細胞を０．０５％３，３‘‐ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（３，３’‐ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ・ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＤＡＢ、ＤｏｊｉｎＤｏ社製）と０．１％過酸化水素を含むＰＢＳ２００マイクロリットルで室温で１０分間反応させた。ＤＡＢ処理をした固定化細胞をＰＢＳで室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この固定した細胞を７０度のエチルアルコールに浸し、８０度、９０度、９５度、１００度のエチルアルコールに順次浸し、固定化細胞を脱水させた。キシレン１、キシレン２で各１０分処理した後にエンテラン及びカバーグラスで細胞を封入し、標本を作製した。この標本を共焦点レーザー走査顕微鏡で観察し、標本が陽性に染色していることより、神経幹細胞��分離したことを確認した。一方、実施例１で得られた第５次の球形細胞塊について、前述の１ミリリットル当たり１０マイクログラムの第２次抗体であるビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の代わりに、１ミリリットル当たり５マイクログラムの第２次抗体であるインドカルボシアニン（Ｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ：Ｃｙ３）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、Ｃｙ‐３標識免疫染色も行った。
【実施例３】
【００６４】
実施例１で得られた球状細胞塊をピペットで静かに吸い込み、吐き出すやり方を繰り返して、機械的に個々の細胞にばらばらにし、この細胞（神経幹細胞）を０．０３５マイクロモル濃度のSal・Bと２％のＮ２と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含み、血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液（実験群）又は２％のＮ２と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含み、Sal・Bと血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液（対照群）に１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、１０枚の９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの中央の各２０穴（ｗｅｌｌ）に１００マイクロリットルずつ小分けした。
【実施例４】
【００６５】
神経幹細胞を小分けした実施例３の９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの１枚について対照群と実験群の培養前の神経幹細胞の細胞賦活評価試験（ＭＴＴアッセイ）を行った。ＭＴＴアッセイの原理は生きた細胞の糸粒体のコハク酸脱水素酵素が外来のＭＴＴを酸化して細胞中に蓄積して、水不溶のロイヤル・パープル色のフォルマザンを形成するのに対し、死んだ細胞ではそのような現象が絶対に起こらないことにある。そこで、この神経幹細胞を懸濁したばかりの９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートを回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心し、実験群と対照群各２０個の穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を沈殿させて、その上清の培養液を捨て、摂氏３７度に暖めたフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ‐１６４０液（フナコシ社製）で穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を洗浄した。１ミリリットル当たり０．５ミリグラムの濃度のメチルチアゾールテトラゾリウム（Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅｔｅｔｏｒａｚｏｌｉｕｍｕ：ＭＴＴ）１００マイクロリットルを洗浄後の各穴（ｗｅｌｌ）に加え、炭酸ガス細胞培養器で摂氏３７度で４時間反応させた。倒立顕微鏡で細胞を観察したところ、青みかかった紫色（ロイヤル・パープル色）の針状のフォルマザンが生きた細胞に見られた。そこで、９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートを回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心し、各穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を沈殿させて、その上清を捨て、ジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）を１００マイクロリットルずつ各穴（ｗｅｌｌ）に加え、各穴（ｗｅｌｌ）中でピペットで細胞とＤＭＳＯを吸い込み、吸い出すやり方で、細胞中の色素の結晶を溶解した。このプレートを回転速度１，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。各穴（ｗｅｌｌ）中の上清を新しい９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの各穴（ｗｅｌｌ）に移し、ムルティスカン（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ）プレート・リーダーを用いて、５７０ナノメーターの波長で各穴（ｗｅｌｌ）の溶液の吸光度を測定した。対照群の２０穴（ｗｅｌｌ）の吸光度と実験群の２０穴（ｗｅｌｌ）の吸光度は共に平均値が０．０６５で標準偏差がプラスマイナス０．００５であった。このことは、実験群２０穴（ｗｅｌｌ）と対照群２０穴（ｗｅｌｌ）に小分けした神経幹細胞の中で、生きた細胞は各穴（ｗｅｌｌ）に約同数存在することを示している。
【実施例５】
【００６６】
実施例４の培養前ＭＴＴアッセイ操作と並行して、神経幹細胞を小分けした実施例３の９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの別の４枚を摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で６日間培養した。６日間培養した細胞の形態は実験群と対照群共に球状で神経細胞状の突起は出ていなかった。３枚のプラスチックプレートの実験群と対照群各５つの穴（ｗｅｌｌ）の細胞につぃて、実施例２に記載の方法で、これらの細胞のネスチン陽性の有無を調べたところ、いずれも、ネスチン陽性であり、血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で培養した場合、神経幹細胞は神経細胞に分化せずに神経幹細胞として存在すること確認した。図３参照。
【実施例６】
【００６７】
実施例５で６日間培養した９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレート中の神経幹細胞の増殖の程度を測定するために、この培養した９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレーの１枚を用いて実施例４と同様の操作により、６日間培養した対照群と実験群の神経幹細胞のＭＴＴアッセイを行った。対照群の２０穴（ｗｅｌｌ）の吸光度が平均値が０．２０４で標準偏差がプラスマイナス０．０５９に対し、実験群の２０穴（ｗｅｌｌ）の吸光度は平均値が０．３７５で標準偏差がプラスマイナス０．０７０、両群間でｔ検定でＰが０．０１以下で有意に差が認められた。ＭＴＴアッセイ自体は生きた細胞の数を測定するに過ぎないが、培養前と培養後の細胞のＭＴＴアッセイをすることにより、細胞の増殖の度合いを測定することができる。本実施例の場合、培養後の対照群の吸光度は培養前に比べ、約３．１倍に増えたが、培養後の実験群の吸光度は培養前に比べ、約５．７倍に増えた。このことは、Ｎ２サプルメン添加培地により、神経幹細胞はある程度増殖するが、Sal・Bの添加により、増殖が促進したことを意味する。図３参照。これの実験と並行して、９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレーの１枚を用い、Ｎ２サプルメン添加培地の代わりに、Ｎ２サプルメンを添加しない培地を用いて、実施例４と同様の操作により、６日間培養した対照群と実験群の神経幹細胞のＭＴＴアッセイを行ったところ、培養前と比較して、対照群の生細胞数は減少していたが、実験群の生細胞数は減少していなかった。このことはＳａｌ・Ｂが神経幹細胞を保護する作用があることを意味する。
【実施例７】
【００６８】
Sal・Bの細胞増殖作用をＤＮＡの複製レベルで観測するために、実施例３と同様の操作により得られた２枚の神経幹細胞を小分けした９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートを摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で３日間培養した。その中の１枚のプラスチックプレートの各穴（ｗｅｌｌ）に静かに１０マイクロリットルの１ミリモル濃度のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）のＤＰＢＳ溶液を加え、他の１枚のプラスチックプレートの各穴（ｗｅｌｌ）には１０マイクロリットルのＤＰＢＳ溶液を加え、摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で４０分間培養した。プラスチックプレートを回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心し、各穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を沈殿させて、その上清捨て、各穴（ｗｅｌｌ）中の細胞を各穴（ｗｅｌｌ）中でＤＰＢＳ溶液で洗浄した。これらの細胞中のＢｒｄＵｒｄの取り込み量を抗ＢｒｄＵｒｄ抗体法で測定した。即ち、実施例２において、スライドグラスに付着した細胞の代わりに各穴（ｗｅｌｌ）の底に付着した洗浄細胞を用い、実施例２と同様の操作を行い、細胞を固定化し、タンパク質分解酵素処理をする代わりにＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）処理を行い、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１００倍に希釈したマウスの抗ラットネスチン抗体の代わりにＤ‐ハンクスＴＳ液で４００倍に希釈したマウスのフルオレセイン・イソチオシャネート（ＦＩＴＣ‐）標識アルファ‐抗ＢｒｄＵｒｄ抗体を用い、その他は実施例２と同様の操作を行い、細胞を免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察し、ＢｒｄＵｒｄの量を測定した。ＢｒｄＵｒｄを加えないプラスチックプレートについても同様の操作を行い、バックグランド値とした。実験群（Sal・B添加群）の細胞のＢｒｄＵｒｄの取り込み量は対照群（Sal・B無添加群）に比較し、約２倍多かった。
【実施例８】
【００６９】
実施例５で６日間培養したが、実施例６でＭＴＴアッセイに用いなかった２枚の９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの実験群の各穴（ｗｅｌｌ）の培養液を０．０３５マイクロモル濃度のSal・Bと２％のＮ２を含み、血清やｂＦＧＦを含まない新鮮なＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で入れ替えて、引続き炭酸ガス細胞培養器で摂氏３７度で１週間培養した。実験群の細胞は培養液中で浮遊したまま集まり、数十個から数百個の細胞の球状集落を形成した。この細胞の一部を実施例２と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、細胞はネスチン陽性であった。
【実施例９】
【００７０】
実施例８で得られた球状細胞塊を集め、この細胞塊をピペットで静かに吸い込み、吐き出すやり方を繰り返して、機械的に個々の細胞にばらばらにし、この細胞（神経幹細胞）を１０％ＦＢＳと１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培養液に１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの中央の２０穴（ｗｅｌｌ）に１００マイクロリットルずつ小分けした。このプレートを摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で６日間培養した。最初は細胞集落を形成したが、細胞集落の幾つかは自然に穴（ｗｅｌｌ）の底に付着し、突起を出し、神経細胞やアストロサイト状の形態に変化した。１０％ＦＢＳと１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培養液の代わりに、ＳＡＬ・Ｂを０．０３５マイクロモル濃度含有し、１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含み、２％のＮ２サプルメントを含み、血清やｂＦＧＦを含まない新鮮なＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液を用い、神経幹細胞を１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁する代わりに４００，０００個の細胞密度になるように懸濁し、同様の操作を行い、細胞集落の幾つかは自然に穴（ｗｅｌｌ）の底に付着し、突起を出し、神経細胞やアストロサイト状の形態に変化することを確認した。
【実施例１０】
【００７１】
実施例９の１０％ＦＢＳ含有培地又は２％Ｎ２サプルメント含有培地で得られた神経細胞状の形態を有する細胞とアストロサイト状の形態を有する細胞について、実施例２と同様の操作により免疫染色し、顕微鏡及び共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、両者の細胞は共にネスチン陰性であった。このことは神経細胞状の形態を有する細胞はもはや神経幹細胞でないことを意味する。そこで、神経細胞状の形態を有する細胞につぃて、実施例２において、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１００倍に希釈したマウスの抗ラットネスチン抗体の代わりに、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で２００倍に希釈したマウスの抗ラット神経特異的エノラーゼ（ｎｅｕｒｏｎ・ｓｐｅｃｉｆｉｃ・ｅｎｏｌａｓｅ：ＮＳＥ）抗体を用い、その他は実施例２と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、当該細胞はＮＳＥ陽性であった。ＮＳＥは神経特異的マーカーである。したがって、この神経細胞状の形態を有する細胞は神経細胞であり、神経幹細胞が神経に分化したことを意味する。次に、アストロサイト状の形態を有する細胞について、実施例２において、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１００倍に希釈したマウスの抗ラットネスチン抗体の代わりに、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１，０００倍に希釈したウサギの抗ラットグリア繊維性酸性たんぱく質（ｇｌｉａｌ・ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ・ａｃｉｄｉｃ・ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＡＰ）抗体を用い、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の代わりに、ビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用い、その他は実施例２と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、当該細胞はＧＦＡＰ陽性であった。ＧＦＡＰはアストロサイト特異的マーカーである。したがって、このアストロサイト状の形態を有する細胞はアストロサイトであり、神経幹細胞がアストロサイトに分化したことを意味する。すなわち、Sal・Bで増殖した神経幹細胞は生体外で、１０％胎児性牛血清存在下又は高密度の状態で２％Ｎ２サプルメンとの存在下で神経細胞とアストロサイトに分化したことを意味する。神経細胞が生じた穴（ｗｅｌｌ）の培養液を捨て、０．０３５マイクロモル濃度のSal・Bと２％のＮ２と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含み、血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液又はSal・Bを含まない当該培養液を加え、２４時間摂氏３７度で培養し、ＭＴＴアッセイをしたところ、Sal・Bを含まない培養液中の細胞数が減少したが、Sal・Bを含む培養液中の細胞数は減少しなかった。
【実施例１１】
【００７２】
実施例１で得られた第５次の球形細胞塊で、未使用の細胞塊をピペットで静かに吸い込み、吐き出すやり方で個々の細胞に分散させ、この細胞（神経幹細胞）を実施例３に記載の０．０３５マイクロモル濃度のSal・Bと２％のＮ２と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含み、血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で６日間培養し、Sal・Bによる増殖神経幹細胞を得た。
【実施例１２】
【００７３】
実施例１１で得られたSal・Bによる増殖神経幹細胞を１０マイクロモル濃度のＢｒｄＵｒｄと０．０３５マイクロモル濃度のSal・Bと２％のＮ２と１ミリリットル当たり１００単位のペニシリンと１００マイクログラムのストレプトマイシンを含み、血清やｂＦＧＦを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に１ミリリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように懸濁し、摂氏３７度で、５％炭酸ガス中で炭酸ガス培養器で４日間培養した。培養プレートを回転速度８００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、細胞を分離した。トリプシン処理をして細胞を個々の細胞にばらし、ＤＰＢＳで洗浄し、１マイクロリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように０．０３５マイクロモル濃度のSal・Bを含有するＤＰＢＳに懸濁した。
【実施例１３】
【００７４】
実施例１２で得られたＢｒｄＵｒｄで標識した神経幹細胞を５マイクロリットル容量の２６ゲイジのメモリが付いたハミルトン注射器で細胞懸濁液１マイクロリットルを麻酔した大人の雌のＳＤラットの背面の海馬にゆっくりと注入した。細胞懸濁液注入後１、４、８、１２週間後にラットを３匹ずつ麻酔し、４％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝液で還流した。脳を取り出し、５０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ溶液中で摂氏６５度で２時間加温し、引続き、２モル濃度の塩酸中摂氏３７度で３０分反応させた後に、脳冠状凍結ミクロトームで、脳組織を２ミリメートル間隔で７等分の環状ブロックに切断した。前頭面で各切断ブロックから６マイクロメートルの厚さの切片を作成した。
【実施例１４】
【００７５】
実施例１０において、固定した神経細胞の代わりに、実施例１３で得られたラットの固定した脳切片を用い、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で２００倍に希釈したマウスの抗ラットＮＳＥ抗体の代わりに、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で４００倍に希釈したマウスのＦＩＴＣ‐アルファ‐抗ＢｒｄＵｒｄ抗体と２００倍に希釈したマウスの抗ラットＮＳＥ抗体を用い、その他は実施例１０における固定した神経細胞に対する操作と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、ＮＳＥ陽性でＦＩＴＣ陰性の神経細胞の他にＮＳＥとＦＩＴＣが共に陽性の神経細胞が観察された。ＮＳＥ陽性でＦＩＴＣ陰性の神経細胞は内在性の神経細胞であることを意味し、ＮＳＥとＦＩＴＣが共に陽性の神経細胞は外来性の神経細胞であること意味する。したがって、ＮＳＥとＦＩＴＣが共に陽性の神経細胞の存在は脳内に注入した神経幹細胞が脳内で神経細胞に分化したことを示している。
【実施例１５】
【００７６】
実施例１０において、固定したアストサイトの代わりに、実施例１３で得られたラットの固定した脳切片を用い、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で１，０００倍に希釈したウサギの抗ラットＧＦＡＰ抗体の代わりに、Ｄ‐ハンクスＴＳ液で４００倍に希釈したマウスの蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ‐）標識アルファ‐抗ＢｒｄＵｒｄ抗体と１，０００倍に希釈したウサギの抗ラットＧＦＡＰ抗体を用い、その他は実施例１０における固定したアストサイトに対する操作と同様の操作により免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察したところ、ＧＦＡＰ陽性でＦＩＴＣ陰性のアストロサイトの他にＧＦＡＰとＦＩＴＣが共に陽性のアストロサイトが観察された。ＧＦＡＰ陽性でＦＩＴＣ陰性の神経細胞は内在性のアストロサイトであることを意味し、ＧＦＡＰとＦＩＴＣが共に陽性の神経細胞は外来性のアストロサイトであること意味する。したがって、ＧＦＡＰとＦＩＴＣが共に陽性のアストロサイトの存在は脳内に注入した神経幹細胞が脳内でアストロサイトに分化したことを示している。神経幹細胞が神経細胞に分化するかアストロサイトに分化するかは、脳内の部位の環境によると思われる。
【実施例１６】
【００７７】
体重３００グラム前後の大人のＳＤラット１０匹を４％イソフルラン、６６％Ｎ２Ｏ、３０％酸素の混合ガスで麻酔し、１．５％のイソフルラン、６８．５％Ｎ２Ｏ、３０％酸素の混合ガスで麻酔を維持した。血圧、血液冲のガス分圧、血糖値を左の大腿骨動脈でモニターした。直腸温度、中大脳動脈閉塞の反対側の側頭筋温度を常時モニターして、加熱パッドで摂氏３７．０−３７．５度に維持した。左外頚動脈を６−０絹縫合糸で結び、遠位を切開し、左内頚動脈を分離し、迷走神経から離した。左内頚動脈の頭蓋外枝をその枝分れの根元のところで、６−０絹縫合糸で結んだ。円形チップの付いた３−０外科用単層ナイロン縫合糸を外頚動脈断片を通して左内頚動脈に導き、その頚動脈の枝分れ部分より２０ミリメートル過ぎたところで、９０分間結び、その後直ぐ解き、縫合糸による閉塞による中大脳動脈閉塞を起したラットを作成した。このラット１０匹に実施例１２で得られたＢｒｄＵｒｄ標識神経幹細胞をハミルトン注射器で細胞懸濁液１マイクロリットルを麻酔下で背面の海馬にゆっくりと注入した。
【実施例１７】
【００７８】
実施例１６でＢｒｄＵｒｄ標識神経幹細胞を海馬に注入した中大脳動脈閉塞ラットに対して、即日より殺す日まで毎日２ミリグラム／キログラムの割合でSal・Bを腹腔内投与した。対照として別のＢｒｄＵｒｄ標識神経幹細胞を海馬に注入した中大脳動脈閉塞ラット１０匹に対してSal・Bを投与しなかった。中大脳動脈閉塞後第１，３，７，１４日にこれらのラット２匹ずつをキシラジン１０ミリグラム／キログラムとケタミン８０ミリグラム／キログラムで麻酔して殺した。直ちに、生理的食塩水で還流し、続いて４％パラホルムアルデヒドで還流した。脳組織を２ミリメートル間隔で７等分の環状ブロックに切断した。前頭面で各切断ブロックから６マイクロメートルの厚さの切片を作成した。
【実施例１８】
【００７９】
実施例１４において、実施例１３で作成した切片の代わりに、実施例１７で作成した切片を用い、その他は実施例１４と同様の操作をして、ＮＳＥとＦＩＴＣに対する二重免疫標識した。Sal・Bを投与したラットは中大脳動脈閉塞後第２日に殺した群からＮＳＥとＦＩＴＣの二重陽性が認められ、日数に比例して二重陽性が強くなった。Sal・Bを投与しなかったラットは中大脳動脈閉塞後第２日に殺した群からＮＳＥとＦＩＴＣの二重陽性が認められなかったが、第４日になってＮＳＥとＦＩＴＣの二重陽性は確認できた。このことから、脳内に注入した神経幹細胞はSal・Bが存在しなくとも、脳内で神経細胞に分化するが、Sal・Bの投与により脳内で神経幹細胞が増殖し、その結果として神経幹細胞の神経への分化が促進されたと思われる。
【実施例１９】
【００８０】
実施例１６と同様の操作により、中大脳動脈閉塞ラットを４０匹作成し、その中で２０匹の背面の海馬に実施例１２においてＢｒｄＵｒｄを添加せずに他は実施例１２と同様の操作をして得られたＢｒｄＵｒｄ非標識の神経幹細胞を１マイクロリットル当たり５０，０００個の細胞密度になるように、０．０３５マイクロモル濃度のSal・Bを含有するＤＰＢＳ（Sal・B投与群用）又はSal・Bを含有しないＤＰＢＳ（Sal・B非投与群用）に懸濁した神経幹細胞含有液１マイクロリットルを５マイクロリットル容量のハミルトン注射器でゆっくりと注入した。増殖神経幹細胞含有液を注入したラット１０匹と注入しないラット１０匹に毎日２ミリグラム／キログラムの割合でSal・Bを３ヶ月間腹腔内投与した。一方、残りの増殖神経幹細胞含有液を注入したラット１０匹と注入しないラット１０匹にはSal・Bを投与しなかった。このラットについて高架式十字迷路試験を行った。高架式十字迷路試験とは高架式の十字形の細長い平板の一方にラットの餌を置き、他方の一つにラットを放すと、ラットは最初は試行錯誤で十字路の一方の行き止まりまで行き、そこに餌が無いことを知って、十字路にもどり、別の道を行く、そうこうしているうちにラットが餌の置いてある端にたどりつく。もう一度実験をすると記憶力のあるラットは迷うことなく、餌がおいてある道を進み餌にありつく。しかし、記憶力の悪いラットは１回目と同様に試行錯誤を繰返す。この試験によりラットの記憶力が測定できる。神経幹細胞含有液もSal・Bも投与しなかった対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要し、記憶力が極度に低下していた。これに対し、Sal・Bだけを投与した群は餌にたどり着くまでの時間が短くなり、神経幹細胞含有液を注入した群は餌にたどり着くまでの時間が更に短くなり、神経幹細胞含有液注入後Sal・Bを投与し続けた群が餌にたどり着くまでの時間が一番短くなった。ラットが餌にたどり着くまでの時間が短くなったということは記憶力の回復を意味し、神経幹細胞含有液注入後Sal・Bを投与群、神経幹細胞含有液注入群、Sal・Bを投与群の順で神経細胞が再生し、かつ再生した神経細胞が機能していることを示している。
【実施例２０】
【００８１】
実施例１９において、中大脳動脈閉塞ラット４０匹の代わりに、２４ヶ月齢の老齢のラット４０匹を用いて同様の操作により、老齢のラットの記憶力を測定した。神経幹細胞含有液注入後Sal・Bを投与群、神経幹細胞含有液注入群、Sal・Bを投与群の順で記憶力が強かった。神経幹細胞含有液もSal・Bも投与しない対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要した。
【実施例２１】
【００８２】
実施例１９において、中大脳動脈閉塞ラット４０匹の代わりに、脳外傷のあるラット４０匹を用いて同様の操作により、脳外傷のあるラットの記憶力を測定した。神経幹細胞含有液注入後Sal・Bを投与群、神経幹細胞含有液注入群、Sal・Bを投与群の順で記憶力が強かった。神経幹細胞含有液もSal・Bも投与しない対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要した。
【実施例２２】
【００８３】
実施例１９において、中大脳動脈閉塞ラット４０匹の代わりに、１‐メチル‐４‐フェニル‐１，２，３，６‐テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）塩酸塩（Ｓｉｇｍａ社製）をキログラム当たり４０ミリグラムを１６時間間隔で２度投与して作成したパーキンソン病モデルラット４０匹を用いて同様の操作により、パーキンソン病モデルラットの記憶力を測定した。神経幹細胞含有液注入後Sal・Bを投与群、神経幹細胞含有液注入群、Sal・Bを投与群の順で記憶力が強かった。神経幹細胞含有液もSal・Bも投与しない対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要した。
【実施例２３】
【００８４】
実施例１９において、中大脳動脈閉塞ラット４０匹の代わりに、臭化水素酸スコポラミン（メルク社製）の０．９％食塩水を臭化水素酸スコポラミン換算でキログラム当たり２ミリグラムを投与して作成したアルツハイマー病モデルラット４０匹を用いて同様の操作により、アルツハイマー病モデルラットの記憶力を測定した。神経幹細胞含有液注入後Sal・Bを投与群、神経幹細胞含有液注入群、Sal・Bを投与群の順で記憶力が強かった。神経幹細胞含有液もSal・Bも投与しない対照群は餌にたどり着くまでに多くの時間を要した。
【実施例２４】
【００８５】
実施例３において、Sal・Bの代わりに、Sal・Bマグネシウム、Sal・Bエチルエステルをそれぞれ用い、その他は実施例３から実施例６と同様の操作を行い、Sal・Bについての結果と同様の結果を得た。
【実施例２５】
【００８６】
Sal・BのＰＢＳ溶液（１ミリグラム／２．５ミリリットル）を５０マイクロリットルずつ、９６穴（ｗｅｌｌ）プラスチックプレートの中央１６穴（ｗｅｌｌ）に入れ、更に各々０．２％のアルファ・カロチン、ベータ・カロチン、リコペン、ルテイン、フラボノイド、カテキン、リザベラトール、イソフラボン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、セレン、亜鉛、補酵素Ｑ１０、グルタチオン又はエンゾジノールのＰＢＳ溶液又は抗酸化剤が入ってないＰＢＳ溶液を５０マイクロリットルずつ加え、摂氏８０度で７２時間加温し、加温前後の穴（ｗｅｌｌ）中の溶液を２８６ナノメータで吸光度を測定した。抗酸化剤を加えたSal・Bの溶液の２８６ナノメータでの吸光度は加温前後で変化しなかったが、抗酸化剤を加えないSal・Bの溶液の吸光度は３０％減少した。
【実施例２６】
【００８７】
実施例３において、実施例１で得られたラット神経細胞塊の代わりに、正常ヒト神経前駆細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）１バイアルを用い、実施例３と同様の操作を行い、実施例４から実施例１０までにおいて、ラット神経幹細胞の代わりに、購入した正常ヒト神経前駆細胞の増殖細胞を用い、実施例４から実施例１０までと同様の操作を行い、正常ヒト神経前駆細胞もラット神経幹細胞と同様に、無血清培地中でSal・Bにより増殖し、血清培地中で神経細胞とアストロサイトに分化することを確認した。
【実施例２７】
【００８８】
アルツハイマー病に対する薬効評価。日本語で読み書きができ、自分の意志を医者に伝えることが可能であるがアルツハイマー病の可能性ありという臨床診断を受けている患者で、Sal・Bナトリウムに過敏症の既往歴がなく、腎機能と肝代謝が低下している疑いがなく、かつ妊娠又は妊娠している可能性のある人及び授乳婦以外の人に対して、下記ミニメンタルステート試験を行う。なお、患者は重症度の指標が２５以下であることを確認し、重症度の指標が２５以上の患者はいる場合は、重症度の指標が２５以下である患者と入れ替える。また、測定前４ヶ月以内に治験薬を使用していた患者は除外する。また、シメチジン、プロプラノロール等親油性６遮断剤やクロニジン、抗コリン作動薬、及び抗コリン活性を有する抗うつ剤、神経弛緩剤、推定認識力増強物質及び中枢神経刺激物質、又は半減期が長いベンゾジアゼピンは投与を禁止する。
【００８９】
ミニメンタルステート試験の内容：見当識（１．今の年は？１点、季節は？１点、曜日は？１点、日付は？１点、月は？１点、２．私たちが今いる県の名前は？１点、郡の名前は？１点、市／町の名前は？１点、階数は？１点、は？１点、住所／建物の名前は？１点）、記銘力（３．医師が３つの物の名前を書く秒かけて言う。医師が言った後で次に患者に３つ全部の名前を尋ねる。患者が３つ全てを正しく言えるまで答えを繰返させる。３点）、注意と計算（４．１００から続けて７を引かせる。正しい答え１つにつき１点与える。５回答えたところで終える。５点）、想起（５．質問３で覚えた３つの物の名前を尋ねる。正しい答え１つにつき１点与える。３点）、言語（６．医師が鉛筆と時計を指す。患者に医師が指した物の名前を言わせる。２点、７．患者に「いいえ、もし、そして、しかし」と言わせる。１点、８．患者に３段階の命令を与え、それにしたがってもらう。「右手で紙をつまみ上げてください。紙を半分に折ってください。紙を机の上に置いてください。」３点、９．患者に次の指示を読ませ、それにしたがってもらう。「目を閉じてください。」１点、１０．患者に自由に１つの文章を書いてもらう。文章には守護つと目的語１つを含み、しかも意味をなしている必要がある。得点には書字の誤りは考慮しない。１点、１１．１辺が約５センチメートルの２つの五角形が１頂点だけ重なった図形を見せ、患者に書き写させる。全ての角及び角度が保たれており、しかも交わった領域が四角形をなしていれば１点をあたえる。１点）、合計３０点。
【００９０】
医師の管理下に被験者にSal・Bナトリウム２ミリグラム錠を１日２回、６ヶ月間投与する。６ヵ月後にミニメンタルステート試験を行う。ミニメンタルステート試験によりSal・Bナトリウム投与による見当識、記銘力、注意と計算、想起、言語の改善を確認できる。
【実施例２８】
【００９１】
実施例２７において、アルツハイマー病が疑われる患者の代わりに、パーキンソン病、脳外傷、脳梗塞又は脳血管性痴呆が疑われる患者に対しても、実施例２７と同様な薬効評価を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の神経系細胞作用剤、神神経系細胞作用法、神経幹細胞含有液調整法、神経幹細胞含有液、神経細胞退化等起因疾病治療剤は、種々の産業に利用可能性があるが、特に、医療においては、当該治療剤はアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳卒中（脳梗塞又は脳出血）起因疾病等神経細胞の退化、減少、細胞死、傷害、除外による組織や臓器の機能低下又は喪失により発症する疾病の治療剤として、又はその有効成分として、又はその調整法として、又はその調整法の工程として適用される。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】Sal・Bの立体構造式。構造式中で三角形状の太い実線ないし一部が太い実線で示す結合は紙面の上に突き出た結合を表し、点線で示す結合は紙面の下に突き出た結合を表す。
【図２】Sal・B及びその関連化合物の化学構造式。図中、Ｒ＝Ｙの時の構造式１はサルビアノール酸Ａ、Ｒ＝Ｈの時の構造式１はサルビアノール酸Ｆ、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｙの時の構造式２はSal・B、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈの時の構造式２はプルゼワルスキン酸Ａ、Ｒ１＝Ｙ、Ｒ２＝Ｈの時の構造式２はリソスペルミン酸Ａ、Ｒ＝Ｙの時の構造式３はサルビアノール酸Ｃ、Ｒ＝Ｙの時の構造式４はサルビアノール酸Ｅ、Ｒ＝Ｙの時の構造式５はイソサルビアノール酸Ｃ、Ｒ＝Ｙの時の構造式６はサルビアノール酸Ｈ、Ｒ＝Ｙの時の構造式７はサルビアノール酸Ｉ、Ｒ＝Ｙの時の構造式８はサルビアノール酸Ｊ、Ｒ１＝Ｙ、Ｒ２＝ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｒ３＝Ｈの時の構造式９はサルビアノール酸Ｄ、Ｒ１＝Ｙ、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈの時の構造式９はロスマリン酸、Ｒ１＝Ｙ、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝Ｇｌｃの時の構造式９はサルビアフラシド、構造式１０はサルビアノール酸Ｇの化学構造式を表す。
【図３】実施例５において、０．０３５マイクロモル濃度のSal・Bにより増殖したスプラグ・ダウレイ（ＳＤ）ラット脳の神経幹細胞のネスチンに対するインドカルボシアニン（Ｃｙ３）標識標本の共焦点レーザー走査顕微鏡写真（倍率１００倍）。写真中央の明るい部分がネスチン陽性部分である。
【図４】実施例４と６において、０．０３５マイクロモル濃度のSal・Bを加えた群（実験群）と加えない群（対照群）の６日間培養前（実施例４）と培養後（実施例６）の神経幹細胞の細胞賦活評価試験値（ＭＴＴアッセイ）。縦軸は５７０ナノメーターにおける吸光度（ＯＤ）を示す。
【図１】
2006151835.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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