(57)【要約】【課題】ヒトヒアルロニダーゼアイソザイムの内、ヒトヒアルロニダーゼ−２のみと特異的に反応する抗体の製造方法、それに用いることのできる新規ペプチド、及び前記製造方法により得られる抗体を提供する。【解決手段】前記ペプチドは、ヒトヒアルロニダーゼ−２のアミノ酸配列における第38番〜第48番のアミノ酸からなる配列からなる。前記製造方法では、前記ペプチドを動物に免疫することによって抗体を得る。前記抗体は、ヒトヒアルロニダーゼ−２と反応し、ヒトヒアルロニダーゼ−２以外のヒトヒアルロニダーゼアイソザイムと反応しない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／若しくはＣ末端に１若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
ヒトヒアルロニダーゼ−２と反応し、ヒトヒアルロニダーゼ−２以外のヒトヒアルロニダーゼアイソザイムと反応しないことを特徴とする、抗体又はその断片。
【請求項３】
ヒトヒアルロニダーゼアイソザイムである、ヒトヒアルロニダーゼ−１、ヒトヒアルロニダーゼ−３、ヒトヒアルロニダーゼ−４、及びヒトヒアルロニダーゼＰＨ−２０のいずれとも反応しない、請求項２に記載の抗体又はその断片。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドを動物に免疫することによって得られる抗体又はその断片。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドを動物に免疫することを特徴とする、抗体又はその断片の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチド、前記ペプチドに対する抗体、及び前記抗体の製造方法に関する。前記抗体は、ヒトヒアルロニダーゼ−２（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ−２；以下、ＨＹＡＬ−２と称する）に対する反応性を有する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸（以下、ＨＡと称する）は、Ｎ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸とが交互に結合した直鎖状の酸性ムコ多糖体であり、生体内では分子量数百万の高分子として結合組織中に普遍的に存在し、特に臍帯、関節液、眼球硝子体、又は皮膚などに多く存在する。細胞の増殖分化や細胞運動を調節したり、強い炎症などにより細胞が壊された時に細胞を修復する機能があると言われており、医薬品として関節内への注射剤、眼科用の点眼、やけどや傷に対する皮膚外用剤、また化粧品の保湿剤として広く利用されている。
【０００３】
このＨＡを代謝分解する酵素がＨＹＡＬであり、これまでに５種類のアイソザイムが報告され、それぞれＨＹＡＬ−１、ＨＹＡＬ−２、ＨＹＡＬ−３、及びＨＹＡＬ−４、並びにＰＨ−２０（ｓｐｅｒｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｈｙａｌｏｒｏｎｉｄａｓｅ）（非特許文献５）と命名されている。ＨＹＡＬ−１（非特許文献１）及びＨＹＡＬ−２（非特許文献２）は広く組織に分布し、ＨＹＡＬ−１は血清中に存在するＨＹＡＬ酵素活性の約８０％以上を占めている。ＨＹＡＬ−３（非特許文献３）は、骨髄及び睾丸に、ＨＹＡＬ−４（非特許文献４）は、胎盤及び骨格筋に存在することが報告されている。また、ＰＨ−２０（非特許文献５）は、精子頭部に存在することが確認されている。
【０００４】
ＨＡは前述のように種々の組織において様々な生理活性を持つが、ＨＹＡＬはＨＡの生理活性に対しキーとなる酵素であり、それぞれのＨＹＡＬアイソザイムはそれらの存在する組織において重要な機能を持つと考えられる。
例えば、非特許文献６では、マウス実験癌のアストロサイトマにＨＹＡＬ−２を過剰発現させると脳内での癌の増殖が劇的に促進されることを報告している。すなわち、脳の細胞外マトリックスの主たる成分はヒアルロン酸であり、ＨＹＡＬ−２を多く発現している癌は脳での増殖が早い可能性や脳に転移しやすい可能性を示すもので、例えば、原発摘出癌組織のＨＹＡＬ−２量を調べることにより、脳への転移性や悪性度を把握することができる可能性が考えられる。
【０００５】
一方で特異的な抗体はその認識するタンパク質の研究等において非常に有用なツールとなるが、それぞれのＨＹＡＬアイソザイムのアミノ酸配列はデーターベースから約４０％以上の相同性があり、これまでアイソザイム特異的な抗体の報告はない。血清由来のＨＹＡＬ及び大腸菌組換え体ＨＹＡＬ−２を免疫抗原として得られた抗体が報告されている（非特許文献７）ものの、各アイソザイムを区別することができるものは得られていない。また、ヒトの組織中のＨＹＡＬアイソザイムは含有量が少なく、安定性も悪いことから、抗原として充分量のＨＹＡＬを精製することや交叉反応性を調べることも容易ではない。
【０００６】
【非特許文献１】フロスト・ジー・アイ（Frost G.I.）ら，「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical & Biophysical Research Communications）」，（米国），1997年，236巻， p.10-15
【非特許文献２】レパーギンガー・ジー（Lepperginger G）ら，「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（Journal of Biological Chemistry）」，（米国），19998年，273巻，p.22466-22470
【非特許文献３】フラネリー・シー・アール（Flannery C.R.）ら，「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical & Biophysical Research Communications）」，（米国），1998年，251巻，p824-829
【非特許文献４】フローマン・エム・エイ（Frohman, M.A.）ら，「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイティッド・ステート・オブ・アメリカ（Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America）」，（米国），1988年，85巻，p8898-9002
【非特許文献５】プリマコフ・ピー（Primakoff,P）ら，「セルラー・バイオロジー（Cellular Biology）」，（米国），1985年，101巻，p2239-2244
【非特許文献６】ノバック・ユー（Novak, U）ら、「キャンサー・リサーチ（Cancer Research）」，（米国），1999年，59巻，p6246-6250
【非特許文献７】ギュンター・エル（Gunter, L）ら、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）」，（米国），1998年，273巻，p22466-22470
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ヒトＨＹＡＬ−２と反応性を有する抗体を生産する場合に、ヒトＨＹＡＬ−２の代わりに抗原として使用することができるヒトＨＹＡＬ−２のアミノ酸配列の一部分に対応した新規ペプチドを提供すること、また、動物に免疫することによって、ヒトＨＹＡＬ−２と反応性を有する抗体、特には、ヒトＨＹＡＬアイソザイムの内、ヒトＨＹＡＬ−２のみと特異的に反応する抗体を生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、前記課題を解決するために、ヒトＨＹＡＬ−２に特異的なアミノ酸配列（すなわち、ヒトＨＹＡＬ−２のアミノ酸配列には存在するが、ヒトＨＹＡＬ−２以外のヒトＨＹＡＬアイソザイムのアミノ酸配列には存在しないアミノ酸配列）に対応する種々のペプチドを合成し、それらを免疫抗原として抗体を調製し、得られた抗体のヒトＨＹＡＬ−２との反応性を繰り返し検討した結果、本発明のペプチドを動物に免疫することによって、ヒトＨＹＡＬ−２と抗原抗体反応する抗体、特には、ヒトＨＹＡＬアイソザイムの内、ヒトＨＹＡＬ−２のみと特異的に反応する抗体を生産することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
前記課題は、本発明による、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／若しくはＣ末端に１若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドにより解決することができる。
また、本発明は、ヒトヒアルロニダーゼ−２と反応し、ヒトヒアルロニダーゼ−２以外のヒトヒアルロニダーゼアイソザイムと反応しないことを特徴とする、抗体又はその断片に関する。
本発明の抗体又はその断片の好ましい態様によれば、ヒトヒアルロニダーゼアイソザイムである、ヒトヒアルロニダーゼ−１、ヒトヒアルロニダーゼ−３、ヒトヒアルロニダーゼ−４、及びヒトヒアルロニダーゼＰＨ−２０のいずれとも反応しない。
【００１０】
また、本発明は、前記ペプチドを動物に免疫することによって得られる抗体又はその断片に関する。
更に、本発明は、前記ペプチドを動物に免疫することを特徴とする、抗体又はその断片の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のペプチドによれば、ヒトＨＹＡＬアイソザイムの内、ヒトＨＹＡＬ−２のみと特異的に反応する抗体を取得することができる。前記抗体は、ヒトＨＹＡＬ−２の生化学的研究やヒトＨＹＡＬ−２とヒアルロン酸が関与する病態との関連を調べる目的の研究などに有用な試薬となるだけでなく、ヒトＨＹＡＬ−２とヒアルロン酸が関与する病態の診断（例えば、癌の脳への転移性や悪性度の把握）にも用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
［１］本発明のペプチド
本発明のペプチドには、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、並びに
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に１又は数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチド（以下、改変ペプチドと称する）
が含まれる。
【００１３】
配列番号１で表されるアミノ酸配列（V-A-W-D-V-P-T-Q-D-C-G）は、ヒトＨＹＡＬ−２のアミノ酸配列における第38番〜第48番のアミノ酸からなる配列であり、ヒトＨＹＡＬ−２以外のヒトＨＹＡＬアイソザイム、例えば、ＨＹＡＬ−１、ＨＹＡＬ−３、ＨＹＡＬ−４、及びＰＨ−２０の各アミノ酸配列には存在しない配列である（Antonei,B.C.ら, Genomics, 1999年, 60巻, p356-361）。
【００１４】
ヒトＨＹＡＬ−２に特異的なアミノ酸配列（すなわち、ヒトＨＹＡＬ−２のアミノ酸配列には存在するが、ヒトＨＹＡＬ−２以外のヒトＨＹＡＬアイソザイムのアミノ酸配列には存在しないアミノ酸配列）としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列以外にも、
配列番号２で表されるアミノ酸配列（ヒトＨＹＡＬ−２のアミノ酸配列における第437番〜第447番のアミノ酸からなる配列；Q-C-Q-W-D-H-R-Q-A-A-G）、配列番号３で表されるアミノ酸配列（ヒトＨＹＡＬ−２のアミノ酸配列における第161番〜第170番のアミノ酸からなる配列；S-R-H-P-D-W-P-P-D-R）が存在する。
【００１５】
後述の実施例に示すように、これらのアミノ酸配列からなる各種ペプチドを化学合成し、これらの合成ペプチドをウサギに免疫し、各合成ペプチドに対する抗血清を取得してそれらの反応性を検討したところ、ヒトＨＹＡＬ−２と反応する抗血清を得られたペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドだけであった。
【００１６】
これまで各ヒトＨＹＡＬアイソザイムを区別することのできる抗体は報告されておらず、ヒトＨＹＡＬ−２とそれ以外のヒトＨＹＡＬアイソザイムとを区別することのできる抗体も報告されていなかった。また、ヒトＨＹＡＬアイソザイムの各アミノ酸配列は公知であり、ヒトＨＹＡＬ−２に特異的なアミノ酸配列を検索可能な状態にあったが、それらのアミノ酸配列からなる各種合成ペプチドを免疫原として用いても、ほとんどの合成ペプチドにおいて、所望の抗体を取得することはできなかった。
【００１７】
本発明の改変ペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に１又は数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、免疫原として用いた場合に、ヒトＨＹＡＬ−２に特異的な抗体を得ることのできるペプチドである限り、特に限定されるものではない。
【００１８】
前記の付加アミノ酸は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端のいずれか一方に、あるいは、Ｎ末端及びＣ末端の両方に付加することができる。
また、付加するアミノ酸の数（Ｎ末端及びＣ末端の両方に付加する場合は、それらの合計数）は、５個以下であることが好ましく、３個以下であることがより好ましく、２個以下であることが更に好ましく、１個であることが特に好ましい。
【００１９】
［２］本発明の抗体及びその製造方法
本発明の抗体は、
（１）ヒトヒアルロニダーゼ−２と反応し、
（２）ヒトヒアルロニダーゼ−２以外のヒトヒアルロニダーゼアイソザイム（例えば、ヒトヒアルロニダーゼ−１、ヒトヒアルロニダーゼ−３、ヒトヒアルロニダーゼ−４、又はヒトヒアルロニダーゼＰＨ−２０）と反応しない。
本発明による抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。
本発明によるモノクローナル抗体は、免疫用抗原及びスクリーニング用抗原として、ヒトヒアルロニダーゼ−２のアミノ酸配列に特異的なアミノ酸配列からなるペプチド、好ましくは本発明によるペプチドを用いることを除いて、それ自体公知の手段により得ることができる。
【００２０】
例えば、前記免疫用抗原を用いてマウスを免疫し、そのマウスから取得した脾臓細胞と、マウス骨髄腫細胞とを、Nature, 256, 495(1975)に記載の細胞融合法、あるいは、J.Immunol.Method, 100, 181-189(1987)に記載の電気細胞融合法を用いて細胞融合し、前記スクリーニング用抗原を用いてスクリーニングすることにより、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【００２１】
前記ハイブリドーマを培養する培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Dulbecco’s modified Eeagle’s minimum essential medium）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸、及び抗生物質（ペニシリンＧ及びストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。
前記ハイブリドーマの培養は、培地中で行なう場合には、５％ＣＯ２濃度且つ３７℃の条件下で約３日間で行なうことができる。また、マウスの腹腔内で培養する場合には、約１４日間で行なうことができる。
【００２２】
このようにして得られた培養液又はマウスの腹水から、タンパク質の単離及び精製に一般的に用いられる方法により、前記モノクローナル抗体を分離及び精製することが可能である。
このような方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができる。
【００２３】
また、本発明のポリクローナル抗体も、免疫用抗原及びスクリーニング用抗原として、ヒトヒアルロニダーゼ−２のアミノ酸配列に特異的なアミノ酸配列からなるペプチド、好ましくは本発明によるペプチドを用いることを除いて、それ自体公知の方法、例えば、以下に示す方法により調製することができる。すなわち、抗原を含む生理食塩水を等量のフロイント氏完全アジュバンド若しくは不完全アジュバンド、又はその等価物、例えば、Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ  ＴｉｔｅｒＭａｘＴＭ（フナコシ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＹＴ００１−００，東京，日本）と乳化混合して、哺乳動物（特にはウサギ又はヤギ等）の皮下、腹腔内、又は筋肉内などのいずれかに投与する（初回免疫）。以後、２〜４週間の間隔で同様の操作を行い、数回免疫する。最終免疫から１〜２週間後に哺乳動物の頚動脈又は心臓から血液を採取して血清を硫酸アンモニウムによって塩析することにより調製することができる。
【００２４】
本発明のペプチドを免疫用抗原として用いる場合には、前記ペプチドをそのまま免疫用抗原として用いることもできるが、前記ペプチドをハプテンとして使用し、前記ハプテンに免疫原性を付与することのできる適当な担体との複合体として使用することが好ましい。
【００２５】
前記担体としては、例えば、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、又はヒトイムノグロブリンＧ等を挙げることができる。
ペプチドと担体との結合は、公知の方法、例えば、活性化エステル法（A.E.KARU et al., J.Agric.Food Chem., 42, 301-309, 1994）、又は混合酸無水物法（B.F.Erlanger et al., J.Biol.Chem., 234, 1090-1094, 1954）等によって行うことができる。
【００２６】
本発明による抗体断片は、本発明の抗体（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む）の部分断片であって、しかも、元の抗体と同じ反応特異性を有する限り、特に限定されるものではない。本発明による抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを挙げることができる。本発明の抗体フラグメントは、例えば、本発明のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タンパク質の分離及び精製の常法に従って得ることができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００２８】
《実施例１：合成ペプチドの作製》
ペプチド自動合成装置（アプライド・バイオシステム社製）を用いて固相法により、ヒトＨＹＡＬ−２のアミノ末端側アミノ酸配列に相当する１１個のアミノ酸残基からなる合成ペプチドV-A-W-D-V-P-T-Q-D-C-G（配列番号１）を作製した。ポリマー性の固相支持体へ前記ペプチドのＣ末端側からそのアミノ酸残基に対応したＬ−体のアミノ酸を順次ペプチド結合によって結合した。そのようにして得られた合成ペプチドはトリフルオロメタンスルホン酸などを用いて固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。合成ペプチドの精製純度は約９５％で、そのアミノ酸配列はアミノ酸シーケンサー（アプライド・バイオシステム社製）により確認した。
【００２９】
《実施例２：合成ペプチドとキャリアータンパク質との架橋》
合成ペプチドはハプテンとしてキャリアータンパク質との架橋物にして免疫抗原とした。キャリアータンパク質としてＫＬＨを使用した。その架橋方法は、合成ペプチド内のカルボキシル末端側にあるＣｙｓ残基を利用した。スルホ−ＳＭＣＣ（スルホサクシニミディル−４−Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート）を用いてＫＬＨに−ＳＨ基反応性のマレイミド基を導入し、活性化し、次に、その活性化されたマレイミド基とＣｙｓ−ＳＨ基を反応させ架橋した。
【００３０】
《実施例３：合成ペプチドに対する抗体の作成》
実施例２で作成した免疫原である合成ペプチド−ＫＬＨ架橋物（以下、単に合成ペプチドと称することがある）２ｍｇをＰＢＳ（リン酸緩衝液ｐＨ７．４）５００μＬに溶解し、フロイントの完全アジュバンド５００μＬと充分混合してエマルジョンとした。このエマルジョンをウサギ（日本白色種、メス、体重１．５ｋｇ〜２．０ｋｇ）の皮下に数箇所投与した。
更に、３週後、新たに前記の半量の合成ペプチド（１ｍｇ）をフロイントの不完全アジュバンドと充分混合してエマルジョンとし、皮下に数箇所投与した（２回目投与）。
更に、３週後、新たに前記２回目投与と同量の合成ペプチド（１ｍｇ）をフロイントの完全アジュバンドと充分混合してエマルジョンとし、ウサギの腰部筋肉内に２箇所投与した（３回目投与）。
３回目投与の１週後より耳静脈より大量採血を実施して約４０ｍＬの血清を得、以後４週間後まで週１回、約４０ｍＬを採血した。
【００３１】
《実施例４：抗血清力価評価》
採血した血清中に含有された抗体と免疫原として使用した合成ペプチドとの抗原抗体の反応を次に示すＥＬＩＳＡ（エンザイム・イムノソーベント・アッセイ）で検討した。
まず、９６ウエル平底ＥＬＩＳＡ−プレート（ＥＬＩＳＡ−ｐｌａｔｅ）の各ウエルに合成ペプチド溶液（１μｇ／ｍＬ、炭酸緩衝液ｐＨ９．６）を５０μＬずつ分注し、４℃で一晩静置した（この処置により合成ペプチドは、各ウエルの接触面に非特異的に吸着する）。
【００３２】
次に、それらの各ウエルを洗浄液（ホウ酸緩衝液ｐＨ８．３、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄した後、１．０％ウシ血清アルブミン溶液（ＰＢＳ−ｐＨ７．２、０．０５％ＮａＮ３）を各ウエルに１００μＬずつ分注し、室温で１時間静置した。これらの各ウエルを前記洗浄液で洗浄し、事前に測定した血清ＩｇＧ濃度をもとに４１ｎｇ／ｍＬ〜１００００ｎｇ／ｍＬに希釈（ＰＢＳ−ｐＨ７．２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）した抗血清を、各ウエルに５０μＬずつ分注し室温で１時間静置した。次に、前記の各ウエルを前記洗浄液で洗浄し、ウサギ免疫グロブリンに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体液を各ウエルに５０μＬずつ分注し、室温で１時間静置した。そして、これらの各ウエルを前記洗浄液で洗浄後、ｏ−フェニレンジアミン溶液（２０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン及び３５％Ｈ２Ｏ２１０μＬをｐＨ５．０の０．０５ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液５０ｍＬに溶解）を５０μＬずつ分注し、室温で１５分間反応後、２ｍｏｌ／Ｌ−Ｈ２ＳＯ４を５０μＬずつ分注して西洋ワサビペルオキシダーゼの反応を停止し、このＥＬＩＳＡ−プレートの各ウエルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３３】
なお、陰性対照試料は、２種類の合成ペプチドQ-C-Q-W-D-W-P-P-D-R-C-A（配列番号２）及びS-R-H-P-D-W-P-P-D-R-C-A（配列番号３）を前記実施例１〜３と同様に処置し、作成した抗血清を同様に希釈して使用した。なお、配列番号２で表されるアミノ酸配列は、ヒトヒアルロニダーゼ２のアミノ酸配列における第437番〜第447番のアミノ酸からなる配列であり、配列番号３で表されるアミノ酸配列はヒトヒアルロニダーゼ２のアミノ酸配列における第161番〜第170番のアミノ酸からなる配列である。本発明の合成ペプチドを免疫原に用いて作成された抗血清は、本発明で使用した合成ペプチドと抗原抗体反応することが判明した。
【００３４】
《実施例５：免疫抗原合成ペプチド特異性確認》
実施例４で使用したＥＬＩＳＡ−プレート（すなわち、各ウエルに３種類の合成ペプチドを吸着させた後、ウシ血清アルブミンで処理したＥＬＩＳＡ−プレート）に、一定の濃度に希釈した抗血清（３種類）と３種類の合成ペプチド（実施例１に記載の合成ペプチド及び実施例４に記載した陰性対照用合成ペプチド）をそれぞれ０．１３μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ添加し、４℃で１晩静置した。ウエル内の溶液を除去し、前記洗浄液で洗浄後、以下の二次抗体の添加及び発色反応は、実施例４と同様に実施した。
実施例４の結果同様、本発明の合成ペプチドを免疫原に用いて作成された抗血清は、液相反応においても本発明の合成ペプチドとのみ抗原抗体反応することが判明した。
【００３５】
《実施例６：ウエスタンブロット法による特異性確認》
ヒト線維芽細胞（ｄｅｔｒｏｉｔ５５１株）及びヒト表角化細胞（クラボウ）を７５ｃｍ２の培養ボトル（住友ベークライト）で培養し、細胞を集めた後、それぞれ０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣＬを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（抽出用緩衝液）で懸濁し、超音波処理で細胞を破砕した。その後遠心し、その上清を細胞抽出液として調整した。
【００３６】
それぞれの細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ノベックス）に電気的に転写した。５％スキムミルクで膜を室温にて３０分間ブロックした後、５００倍に希釈（５％スキムミルク）した抗血清を反応させた。洗浄後、２次抗体として抗ウサギ抗体で処理し、シグナルを検出した。
【００３７】
本発明の合成ペプチドを免疫原に用いて作成された抗血清は、報告されているＨＹＡＬ−２の分子量（５３．８ＫＤａ）と同様の位置に濃いシングルバンドが認められた。その結果を図１に示す。図１において、レーン１はヒト線維芽細胞の結果であり、レーン２はヒト表角化細胞の結果である。
一方、陰性対照用合成ペプチドを免疫原に用いて作成された抗血清は、ＨＹＡＬ−２の分子量と同様の位置にバンドは認められず、非特異的なバンドも多く検出された。
【００３８】
《実施例７：ＨＹＡＬ−２アンチセンス導入によるシグナル変化》
実施例６に記載されたヒト線維芽細胞にＨＹＡＬ−２アンチセンス及びミスマッチアンチセンスを導入した後、実施例６に記載の方法により、それぞれ培養した後、細胞抽出液を調製した。本発明の合成ペプチドを用いて作成された抗血清を用いて、実施例６に記載のウエスタンブロット法で分析すると、アンチセンス導入ヒト線維芽細胞は、コントロールの何も導入していないヒト線維芽細胞に比較し、顕著なシグナルの減少が認められたが、ミスマッチアンチセンスを導入ヒト線維芽細胞ではシグナルの減少は認められなかった。従って、本発明の合成ペプチドを用いて作成された抗血清より検出されるシグナルはヒトＨＹＡＬ−２であることが明らかである。その結果を図２に示す。図２において、レーン１はコントロール細胞の結果であり、レーン２はアンチセンス導入ヒト線維芽細胞の結果である。
一方、陰性対照用合成ペプチドを用いて作成された抗血清（２種類）では、アンチセンス導入ヒト線維芽細胞とコントロール細胞との間でシグナルの変化は認められず、これらの抗血清が認識しているバンドは、ヒトＨＹＡＬ−２でないことが判明した。
【００３９】
《実施例８：抗体固定担体への吸着試験》
実施例３で得られたウサギ抗血清よりＩｇＧ画分を精製し、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス）を用いて抗体を固定化し、抗体固定担体を作製した。実施例６に記載の角化細胞抽出液０．５ｍＬを抗体固定担体０．２ｍＬと混合し、室温で４時間、ゆっくりと攪拌した。その処理担体を抽出用緩衝液で洗浄後、グリシン／ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ２．８）で溶出した。溶出した画分を実施例６の方法により、ウエスタンブロット解析を行ったところ、ＨＹＡＬ−２相当の位置にシグナルが検出された。従って、本発明方法により得られたウサギ抗血清は、ＨＹＡＬ−２を認識し、結合することが判明した（図は示さず）。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明のペプチドは、抗ヒトＨＹＡＬ−２抗体の製造の用途に適用することができる。前記抗体は、研究試薬の用途に適用することができ、診断試薬の可能性も考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ヒト線維芽細胞及びヒト表角化細胞の各細胞抽出物を電気泳動した後、本発明の抗血清を用いるウエスタンブロッティングを実施した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２】コントロール細胞及びアンチセンス導入ヒト線維芽細胞の各細胞抽出物を電気泳動した後、本発明の抗血清を用いるウエスタンブロッティングを実施した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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