(57)【要約】【課題】  現在用いられている動物モデルに関連する制約を解消することを目的とする。【解決手段】  ウサギの耳の中心動脈に経皮的にアクセスする方法論が、その動脈に損傷を生み出し、損傷を治療し、損傷を評価して損傷の病理および治療の安全性および効能を求めるために用いられる可能性がある。ウサギの耳の中心動脈はヒトの冠動脈の形態に類似している。したがって、ウサギの耳の中心動脈を研究することで生物学に関する有益な情報が得られ、再狭窄、アテローム硬化症、および傷つきやすいプラークの新たな治療が特定されるであろう。【選択図】    図１
2006075150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウサギの耳の中心動脈の病理を評価する方法であって、
ウサギの耳の前記中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する過程と、
前記損傷に関連する病理を評価する過程と、
を有する、ウサギの耳の中心動脈の病理評価方法。
【請求項２】
ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する前記過程が、経皮的にバルーンカテーテルを導入しバルーンを膨らませて血管内の損傷を形成する過程を含む、請求項１記載の病理評価方法。
【請求項３】
ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する前記過程が、経皮的にステントを導入し配備して血管内の損傷を形成する過程を含む、請求項１記載の病理評価方法。
【請求項４】
ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する前記過程が、少なくとも一つの薬剤を経皮的に導入して血管内の損傷を形成する過程を含む、請求項１記載の病理評価方法。
【請求項５】
ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で損傷を血管内に形成する前記過程が、エネルギートランスデューサを経皮的に導入し配備して血管内の損傷を形成する過程を含む、請求項１記載の病理評価方法。
【請求項６】
前記損傷に関連する病理を評価する前記過程が、組織学的研究を行う過程を含む、請求項１記載の病理評価方法。
【請求項７】
前記損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、分子学的研究を行う過程を含む、請求項１記載の病理評価方法。
【請求項８】
前記損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、肉眼および顕微鏡検査による病理学的研究を行う過程を含む、請求項１記載の病理評価方法。
【請求項９】
前記損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、細胞周期の分析を行う過程を含む、請求項１記載の病理評価方法。
【請求項１０】
前記損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、マーカ発現の分析を行う過程を含む、請求項１記載の病理評価方法。
【請求項１１】
ウサギの耳の中心動脈の治療を評価する方法であって、
ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する過程と、
前記損傷が形成された動脈を治療する過程と、
治療された前記損傷が形成された動脈に関連する病理および前記治療の効能を評価する過程と、
を有する、ウサギの耳の中心動脈の治療評価方法。
【請求項１２】
ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する前記過程が、経皮的にバルーンカテーテルを導入しバルーンを膨らませて血管内の損傷を形成する過程を含む、請求項１１記載の治療評価方法。
【請求項１３】
ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する前記過程が、経皮的にステントを導入し配備して血管内の損傷を形成する過程を含む、請求項１１記載の治療評価方法。
【請求項１４】
ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する前記過程が、少なくとも一つの薬剤を経皮的に導入して血管内の損傷を形成する過程を含む、請求項１１記載の治療評価方法。
【請求項１５】
ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する前記過程が、エネルギートランスデューサを経皮的に導入し配備して血管内の損傷を形成する過程を含む、請求項１１記載の治療評価方法。
【請求項１６】
前記損傷が形成された動脈を治療する前記過程が、一つまたは複数の治療薬を局所的に導入する過程を含む、請求項１１記載の治療評価方法。
【請求項１７】
前記損傷が形成された動脈を治療する前記過程が、一つまたは複数のステントを植え込む過程を含む、請求項１１記載の治療評価方法。
【請求項１８】
前記損傷が形成された動脈を治療する前記過程が、血管周囲を治療する過程を含む、請求項１１記載の治療評価方法。
【請求項１９】
前記損傷が形成された動脈を治療する前記過程が、全身的に治療薬を導入する過程を含む、請求項１１記載の治療評価方法。
【請求項２０】
前記治療された損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、組織学的研究を行う過程を含む、請求項１１記載の治療評価方法。
【請求項２１】
前記治療された損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、分子学的研究を行う過程を含む、請求項１１記載の治療評価方法。
【請求項２２】
前記治療された損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、肉眼および顕微鏡検査による病理学的研究を行う過程を含む、請求項１１記載の治療評価方法。
【請求項２３】
前記治療された損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、細胞周期の分析を行う過程を含む、請求項１１記載の治療評価方法。
【請求項２４】
前記治療された損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、マーカ発現の分析を行う過程を含む、請求項１１記載の治療評価方法。
【請求項２５】
ウサギの耳の中心動脈の病理を評価する方法であって、
ウサギの耳の中心部の動脈内の少なくとも一つの位置でアテローム硬化症／炎症性の病変を形成する過程と、
前記病変に関連する病理を評価する過程と、
を有する、ウサギの耳の中心動脈の病理評価方法。
【請求項２６】
ウサギの耳の中心動脈の治療を評価する方法であって、
ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置でアテローム硬化症／炎症性の病変を形成する過程と、
病変が形成された前記動脈を治療する過程と、
治療された前記病変が形成された動脈に関連する病理および治療の効能を評価する過程と、
を有する、ウサギの耳の中心動脈の治療評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は哺乳動物の動脈を評価する方法およびシステムに関し、より詳しく言うとウサギの耳（耳介）の中心動脈の病理および治療を評価する方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
さまざまなモデルシステムが血管の損傷後の再狭窄を減らす場合の薬剤の安全性および効能を評価するために開発されてきた。例えば頚動脈、腸管動脈、大動脈のようなさまざまな動物の脈管動脈が再狭窄を防止する可能性のある治療法を評価するのに広く用いられてきた。しかし、これらの動脈は本質的に弾性で、同心状の弾性層で区分された平滑筋細胞の別個の層を含んでいる。しかし、冠動脈は本質的に筋性であり、動脈の中膜内の同心状の複数の弾性層を含んでいない。
【０００３】
ウサギの耳の中心動脈すなわち耳介の中心動脈はヒトの冠動脈と同様の約１．５ｍｍから２．５ｍｍまでの直径であり形態学的に筋性の血管であるという特徴を共有している。さらに、耳の中心動脈の血管内へのアクセスはカニューレ挿入およびカテーテルの導入が透視検査を必要とせずに直視のみを必要とするので非常に簡単である。研究者はウサギの耳の中心動脈を、耳の中心動脈の上および下の皮膚に直接圧力を加えて血管の外側の損傷に対する血管の反応を研究するためのモデルとして用いてきた。さらに、研究者はこの血管の外側に損傷を与える方法を用いて再狭窄を防止する可能性のある治療法を評価してきた。しかし、いずれの研究者もウサギの耳の中心の動脈の内腔の表面に損傷を与える、または内腔の表面に治療薬／器具を適用するために血管を通して施された器具を使用することは記載していない。
【０００４】
したがって、ウサギの耳の中心動脈で血管内の損傷を生み出すため、および効能の期待できる治療薬および器具を血管内に適用するための、経皮的なアクセスの方法および経皮的なアクセス器具が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は簡単に上述された現在用いられている動物モデルに関連する制約を解消することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ある態様では、本発明はウサギの耳の中心動脈の病理を評価する方法を指向している。その方法はウサギの耳の中心動脈の少なくとも一つの位置で血管内の損傷を形成する過程と、損傷に関連する病理を評価する過程とを有する。
【０００７】
別の態様では、本発明はウサギの耳の中心動脈の治療を評価する方法を指向している。その方法はウサギの耳の中心動脈の少なくとも一つの位置で血管内の損傷を形成する過程と、損傷を受けた動脈を治療する過程と、損傷後に治療された動脈に関連する病理および治療の効能を評価する過程とを有する。
【０００８】
別の態様では、本発明はウサギの耳の中心動脈の病理を評価する方法を指向している。その方法はウサギの耳の中心動脈の少なくとも一つの位置でアテローム硬化／炎症性の病変を形成する過程と、病変に関連する病理を評価する過程とを有する。
【０００９】
別の態様では、本発明はウサギの耳の中心動脈の治療を評価する方法を指向している。その方法はウサギの耳の中心部の少なくとも一つの位置の血管にアテローム硬化／炎症性の病変を形成する過程と、病変が形成された動脈を治療する過程と、病変が形成された後に治療された動脈に関連する病理および治療の効能を評価する過程とを有する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、透視検査を必要とせずに、ウサギの耳の中心動脈で経皮的に血管内の損傷を生み出すこと、およびウサギの耳の中心動脈に経皮的に薬剤および／または器具を導入することができる。ウサギの耳の中心動脈を用いることで、さらに筋性のヒトの冠動脈の形態がモデル化される。本発明は典型的なブタのモデルに比べてより迅速な処理能力およびより低いコストを提供する。これらの技術を組み合わせることによって、血管再生手術後の再狭窄の主な要因である新たな血管内膜の過形成の阻止するための局所的な薬剤療法の期待される治療上の利点、および、傷つきやすいプラークを含むアテローム硬化の病変の治療の両方を評価できるようになり、局所的すなわち局部的に適用された薬剤が血管壁に影響を及ぼすメカニズムである、細胞レベルまたは分子レベルでのメカニズムを理解できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の上記のおよびその他の特徴および利点は添付の図面に例示された本発明の好ましい実施の形態の以下のより詳しい説明から明らかになるであろう。
【００１２】
本発明は、ウサギの耳の中心動脈に経皮的に／経管的に適用されたステントなどの器具、および／または、ステントまたは注入バルーンカテーテルのような導入カテーテルによって導入された治療薬の効果を評価する方法論またはモデルを指向している。この方法論またはモデルは、再狭窄および傷つきやすいプラークなどの血管の疾病を治療するための治療薬を評価する手段として役立つ可能性があり、正常なまたはアテローム硬化症の筋性動脈に関連して血管内に適用されたさまざまな治療薬の安全性および効能の試験をモデル化するために役立つ可能性もある。本質的には、本発明は、血管内に損傷を生み出し、生み出された損傷を治療するための効果が期待される治療器具および治療薬の適用し、そして治療の安全性および効能を評価するための経皮的アクセス器具を用いる。血管内の損傷は治療食、プロ催炎物質（proinflammatory agents）の血管周囲への注入、および／または、薬剤の全身的な導入などの別の手段によって生み出されてもよい。さらに、血管造影、血管内超音波撮像、組織学的、分子学的、および細胞学的終点を含む、標準的な終点（endpoint）の評価や生存中の顕微鏡検査が、本発明に基づくウサギの耳の中心動脈内への経皮的なアプローチと共に用いられることもありうる。
【００１３】
本発明の方法論は複数の手順または過程を有する。本発明の方法論は本明細書に記載された特定の器具、治療薬、および／またはその他の本明細書に記載された薬剤に限定されると理解されてはならない。例示的な方法論がワタナベウサギ（Watanabe rabbit）について記載されるが、その他のウサギが用いられてもよい。
【００１４】
本発明の方法論の最初の過程は、ウサギの前処理を含む。ウサギは好ましくは実際の手順の前に、手順によって形成される血管の損傷によって誘導される血管痙攣を予防するための、例えばベラパミルなどのカルシウムチャネル遮断薬を用いて前処理される。前処理は実際の手順の約６時間から１２時間前に実行されることもある。ウサギの耳の周縁部の静脈を用いて、１００μｇ／ｋｇ／分のニトロプルシドおよび／または０．２５ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇの例えばプラゾシンなどの可逆性のアルファ１受容体拮抗薬が血管の損傷によって誘導される血管痙攣をさらに予防するために実際の手順が行われるときに投与されることもある。ウサギは血管内の損傷に反応した動脈の血栓症の血小板成分を調節するためにクロピドグレル（clopidogrel）を伴ってまたは伴わずに、例えばアスピリンなどの抗血栓薬で前処理されることもある。動脈の損傷に続く血栓症に関連した体液性の要因が実際の手順の前にヘパリンを投与して調整されることもある。
【００１５】
次に、ウサギが麻酔される。ウサギは複数の麻酔薬を用いて麻酔されることもある。例えば、ウサギは神経弛緩薬（例えばアセプロマジン）を伴うまたは伴わないケタミン(ketamine)およびキシラジンの混合物のような注射用麻酔薬、またはハロタンなどの適切な吸入麻酔薬で麻酔されることもある。次にウサギは約３７℃の体温に維持するように加温パッドセットに載せられることが好ましい。ウサギの一方または両方の耳の背面が剃毛されエタノールまたはイソプロピルアルコールを綿棒で塗られ、耳の中心動脈が殺菌され拡張される。
【００１６】
十分に準備された後に、対象のカテーテルから容易に分離できるようにするための長手方向に延在するスリットを備えた１６ゲージから１８ゲージまでのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製の導入器チューブが、適切な１６ゲージから１８ゲージまでの皮下注射針に被せられて、耳の中心動脈の損傷、治療、および評価の位置の遠位の側で目標の耳の中心動脈に経皮的に導入される。導入器チューブの内腔を通して、個々の手順に応じて血管形成用バルーンカテーテル、バルーン薬剤導入カテーテル、またはステント導入バルーンカテーテルのこともあるバルーンカテーテルが耳の中心動脈内を近位の向きに進められる。耳の中心動脈の寸法は、２．５ｃｍから３．０ｃｍまでの全長で１．５ｍｍから２．０ｍｍまでに拡張する器具を理論上収容できるであろう。配置された後に、バルーンは膨らまされて、治療薬が導入され、および／または、ステントが配備される。以下により詳しく記載されるように、個々の手順は個々の用途に応じて異なる。次にバルーンが萎まされる。バルーンの膨張は、血管壁に対して最適な損傷形成、薬剤導入、および／または、ステント配備が確かに達成されるまで繰り返されることもある。図１はウサギの耳１０８の中心動脈１０６内でステント導入カテーテル１０４によって配備されたステント１０２を示している。次にカテーテル１０４が引き抜かれて、出血が直接圧力を加えて調節される。ｎ−ブチルシアノアクリレート組織接着剤であるベトボンド（Vetbond）またはその等価物が経皮的な創傷部位からの出血を調節するために用いられることもある。上記の手順は一方の耳または両方の耳に行われる。上記の手順に続いて、ウサギは回復ケージに移送されてウサギが意識を取り戻すまで破綻出血またはその他の手術後の問題が観察される。次にウサギはその飼育ケージに戻されて６ヶ月までに亘ってさらに回復させられる。回復期間は手順および実行される最終評価に応じて変わる。今度は図２を参照すると、ステントが挿入されたウサギの耳の中心動脈の低倍率の顕微鏡写真が示されている。動脈は参照符号２０２で示されていて、ステントの支柱（ストラット）は参照符号２０４で示されている。顕微鏡写真からも分かるように、ステントの形跡が動脈の壁に残され埋め込まれていて、動脈が配備されたステントの形をとる実質的に丸い形をなしている。
【００１７】
上述されたように、個々の手順は用途に応じて変わる。例えば、手順が最初の損傷を形成するためのものである場合には、バルーンが導入されて複数回膨張および収縮されて損傷が形成される。手順が血管にステントを挿入するためのものである場合には、バルーン拡張ステントまたは自己拡張式ステントが用いられることもある。手順が薬剤を導入するためのものである場合には、一つまたは複数の薬剤と共にステントが導入されることもあり、または、灌流バルーンが用いられて直接一つまたは複数の薬剤が導入されることもある。手順がさまざまな検査を行うためのものである場合には、血管造影カテーテルまたはその他の経皮的に導入される器具が用いられることもある。さらに、これらの全ての異なる手順、器具、および薬剤は組み合わされて用いられることもある。別の例示的な実施の形態では、エネルギーに基づくカテーテルによって導入されたシステムが血管内に損傷を生み出すために用いられることもある。例えば、超音波トランスデューサーが無線周波数装置と同様に用いられることもある。
【００１８】
これも上述されているように、損傷は別の手段によって生み出されてもよい。例えば、傷つきやすいプラークが研究されることもある。傷つきやすいプラークを研究するためには、傷つきやすいプラークの病変が形成されなければならない。病変は例えば高脂肪／高コレステロールの内容物などの食事、および／または、全身的または局所的な薬剤の導入によって形成されることもある。例えば、リポポリ多糖類（内毒素）などのプロ炎症性薬剤を皮下注射して病変が形成されることもある。病変が形成されると、本発明の方法論が病変の性質、すなわち脂質コアおよび薄い繊維性キャップを研究し、および／または、病変を治療するために用いられることもある。この手順を用いる場合、アテローム硬化および傷つきやすいプラークが接近して配置されていることもあり、さまざまな治療が研究されることもある。さらに、その疾病の作用が研究されることもある。
【００１９】
好ましい例示的な実施の形態では、アテローム硬化プラークおよび傷つきやすいアテローム硬化プラークは以下のようにして生み出されることもある。最初に、穏やかな損傷が正常なまたはアテローム硬化症のウサギの個体群（ワタナベウサギ）に対してウサギの耳の中心動脈に外部から圧力を加えて、または血管内でバルーン／ステントによって損傷を与えて形成される。次に耳の中心動脈が血管の周囲でマクロファージを漸増する薬剤にさらされ、例えば大腸菌由来のリポポリ多糖類（内毒素）が血管の周囲に注入される。次にその結果の血管の病変の病理がある時間に亘って観察される。このモデルは傷つきやすいプラークの特性を表すこともあり、血管内の、血管周囲の、または全身的な治療アプローチに合わせて修正できることもある。
【００２０】
本発明の方法論により、かなりの量の情報が収集できる。ヒトの冠動脈に類似した動脈は透視検査を必要とせずに経皮的にアクセスされることもある。この経皮的なアクセスによって、動脈は損傷を受けることがあり、その損傷が治療されて最後に損傷および治療が評価されることもある。最後の評価は肉眼で見る検査であることもあり、または、細胞レベルまたは分子レベルの研究であることもある。任意のさまざまな治療薬が局部的、局所的、または全身的に適用されて治療薬の効果が研究されることもある。例えば、再狭窄、アテローム硬化、傷つきやすいプラークのような疾病の状態が研究されることもある。さらに、例えばラパマイシン（rapamycin）などのさまざまな治療薬または再狭窄の作用および効能が本発明の方法論を用いて研究されることもある。任意のさまざまな条件、疾病、および治療が研究されることに注目することが重要である。血管周囲の器具および治療法が本明細書に記載された血管内の器具に加えて用いられことに注目することも重要である。例えば、血管周囲のラップが治療薬を導入するのに用いられることもある。
【００２１】
単独でまたは植え込み可能な医療装置と共に用いられることもある治療薬および薬剤の部分的なリストには、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン（vinorelbine））、パクリタキセル、エピジポドフィロトキシン（epidipodophyllotoxins）（例えば、エトポシド、テニポシド（teniposide））、抗生物質（ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン、およびイダルビシン（idarubicin））、アントラサイクリン、ミトザントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（plicamycin）（ミトラマイシン）、およびミトマイシン、酵素（Ｌ−アスパラギンを全身的に代謝しそれ自身のアスパラギンを合成する能力のない細胞を拒絶するＬ−アスパラギナーゼ）のような天然生成物などを含む抗増殖薬／抗有糸分裂薬;Ｇ（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａインヒビターおよびビトロネクチン受容体拮抗薬のような抗血小板薬；ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよびその類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレニミン（ethylenimines）およびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソ尿素類（カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、トリアゼン（triazenes）−ダカルバジン（ＤＴＩＣ）のような抗増殖性／抗有糸分裂性のアルキル化薬；葉酸類似体（メトトレキサート）、ピリミジン類似体（フルオロウラシル、フロクスウリジン、およびシタラビン）、プリン類似体および関連する阻害因子（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン（cladribine）））のような抗増殖性／抗有糸分裂性の代謝拮抗薬；プラチナ配位化合物（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトーテン、アミノグルテチイミド；ホルモン（例えばエストロゲン）；抗凝固薬（ヘパリン、合成ヘパリン塩、およびその他のトロンビン阻害因子）；フィブリン溶解性薬剤（組織プラスミノゲン賦活剤、ストレプトキナーゼ、およびウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン（ticlopidine）、クロピドグレル（clopidogrel）、アブシキシマブ；抗遊走薬（antimigratory）、抗分泌薬（antisecretory）（ブレベルジン：breveldin）；副腎皮質ステロイド（コルチソル、コルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、６α−メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、およびデキサメタゾン）、非ステロイド剤（例えばアスピリンのようなサリチル酸誘導体；例えばアセトアミノフェンのようなパラ−アミノフェノール誘導体；インドール酢酸およびインデン酢酸（インドメタシン、スリンダク、およびエトダラク（etodalac））、ヘトロアリール酢酸（トルメチン、ジクロフェナク、およびケトロラク）、アリールプロピオン酸（イブプロフェンおよび誘導体）、アントラニル酸（メフェナム酸、およびメクロフェナム酸）、エノール酸（ピロキシカム、テノキシカム（tenoxicam）、フェニルブタゾン、オキシフェンタトラゾン（oxyphenthatrazone））、ナブメトン（nabumetone）、金化合物（オーラノフィン、金チオグルコース、金チオリンゴ酸ナトリウム）のような抗炎症薬；免疫抑制剤：（シクロスポリン、タクロリムス（tacrolimus：ＦＫ−５０６）、シロリムス（sirolimus：ラパマイシン（rapamycin））、アザチオプリン（azathioprine）、マイコフェノレート・モフェチル（mycophenolate mofetil））；血管由来の薬剤：血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、アンギオテンシン受容体遮断薬；酸化窒素ドナー；オリゴヌクレオチドおよびそれらの組み合わせ；細胞周期抑制因子、ｍＴＯＲ抑制因子、および増殖因子受容体シグナル導入キナーゼ抑制因子（growth factor receptor signal transduction kinase inhibitors）、レテノイド（retenoids）；サイクリン／ＣＤＫ阻害薬；ＨＭＧコエンザイムレダクターゼ阻害薬（スタチン）；プロテアーゼ阻害薬などが含まれている。
【００２２】
適切な回復期間の後にウサギは二酸化炭素に過剰にさらされて安楽死させられる。耳の中心動脈を囲む処理された部分および／または対照の処理されていない部分が摘出されホルマリンなどの固定剤中に配置される。ウサギは現場で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）固定するために心臓を通して灌流が行われることもある。固定が望まれない場合には、ウサギの耳の中心動脈が回収されることもあり、凍結されるか凍結されずに処理されて、細胞の周期およびアポトーシスの判定を含めた血管のｍＲＮＡ、たんぱく質の発現（組織学的にまたはＥＬＩＳＡによって）、またはＦＡＣの分析などの終点が評価される。
【００２３】
上述されたように、耳の中心動脈は任意のさまざまな検査を行われることがある。耳の中心動脈は損傷または疾病の病理および／またはさまざまな治療の効能を判定するために検査または評価されることもある。検査の種類は肉眼で見える物理的な実験から細胞および分子レベルの検査にまで及ぶ。耳の中心動脈には標準的な組織学的準備および染色手順が施されることもある。そのような手順には、例えばエイチ・アンド・イー（Ｈ＆Ｅ）の弾性フェルフォフ・ファン・ガイソン（Verhoff van Geison）染色のような弾性版染色、およびコラーゲン染色などがある。耳の中心動脈には、血管の、新たな内膜の、中膜の、および外膜の表面積の定量化、組織病理学的実験、炎症性反応の評価、免疫組織化学（細胞の増殖およびアポトーシスは抗増殖細胞核抗原（anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen : PCNA）およびターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼが添加されたｄＵＴＤニック末端ラベリング（Terminal deoxynucleotide transferase-mediated dUTP nick-End Labeling : TUNEL）免疫組織化学を用いて評価される。）またはその他の方法によるアポトーシスおよび増殖反応の評価、または細胞外マトリクスの変化の定量化などが行われる。
【００２４】
血管の細胞周期を評価するために、耳の中心動脈が術後１日から１０日までの間に、好ましくは術後３日から７日までの間に安楽死させられたウサギから回収される。次に耳の中心動脈は手術バサミを用いて入念に切り刻まれてＤＭＳＯ／クエン酸塩／スクロース寒冷保護溶液中に入れられる。次に切り刻まれた断片は次の分析のためにスナップ凍結（snap-frozen）されマイナス８０℃で保存される。分析時には、切り刻まれた断片は断片から効果的に細胞核を抽出するトリプシン／洗浄溶液で処理される。次に消化（digestion）が終了され、懸濁液が遠心分離されてその結果として得られた細胞核の懸濁液がヨウ化ナトリウムで処理されて細胞核のＤＮＡとの蛍光錯体が形成される。ヨウ化ナトリウムで染色された細胞核の懸濁液は次に蛍光強度を定量化するために破片（デブリ）および二重の細胞核を除去するようにゲートが設けられた血球計算器を通して流される。その結果得られた蛍光強度は各細胞核のＤＮＡの量に比例している。約１２，０００から２０，０００の事象がその後の細胞周期ヒストグラムの分析のために得られる。細胞周期の分析はＤＮＡヒストグラムを得た後にＭＯＤＦＩＴ細胞周期分析アルゴリズムを用いて実行される。その代わりに、その他の細胞マーカが切り刻まれた耳の動脈の全ての組織標本から血球計算器を用いて分析されることもある。全ての細胞の組織標本には平滑筋α−アクチン、ＰＣＮＡ、ＢｒｄＵ、Ｍａｃ−１、インテグリン、および細胞表面の受容体（レセプター）などが含まれていることもある。
【００２５】
損傷を受けた、損傷を受けていない、および／または、治療された耳の中心動脈からの断片はＲＮＡ抽出が施され、それに続いて定量的ＲＴ−ＰＣＲおよび／または遺伝子チップ分析を用いて遺伝子発現が評価されることもある。遺伝子発現はその場でのハイブリダイゼーションとそれに続くフィルムオートラジオグラフィ、エマルジョンオートラジオグラフィ、または蛍光（ＦＩＳＨ）を用いて、スナップ凍結された治療された／損傷を受けたおよび／または損傷を受けていない耳の中心動脈の寒冷部分でも評価されることもある。蛋白発現が免疫組織化学によってまたはＥＬＩＳＡの検定またはその他の検定を用いて、切り刻まれた治療された／損傷を受けたおよび／または損傷を受けていない耳の中心動脈の蛋白の抽出によって評価されることもある。
【００２６】
複数の組織学的終点への局所的薬剤導入の効果が標準的な組織学的な組織標本、免疫組織化学の組織標本、および遺伝子発現（ｍＲＮＡまたは蛋白）を用いて評価されることもある。標準的な組織学的な組織標本の例として、細胞間マトリックス、浸潤する白血球、内皮細胞、血管周囲の結合組織などの血管のコンポーネントへの染色、および、染色パターンおよび細胞の形態に基づく細胞の数、例えば白血球数、内皮細胞数、マトリックスの表面積、およびそれらの類似物の数などの定量化などがある。免疫組織化学の組織標本の例には、例えばＭａｃ−１マクロファージマーカ、平滑筋α−アクチン、チューブリン、内皮細胞マーカ、脂質、増殖およびアポトーシスのマーカなどの細胞マーカの発現の免疫組織化学的な評価などがある。遺伝子発現の評価の例として、定量的なＲＴ−ＰＣＲまたは遺伝子チップ分析を用いる切り刻まれた治療された／損傷を受けたまたは損傷を受けていない血管から抽出されたＲＮＡの評価などがある。蛋白の発現はＥＬＩＳＡまたはその他の定量的な蛋白検定を用いる、治療された／損傷を受けたまたは損傷を受けていない血管から蛋白を抽出して評価されることもある。
【００２７】
上述されたように、損傷、疾病、および治療は本発明の方法論を用いて評価されることもある。したがって、ラパマイシンなどのさまざまな薬剤の効能が安全かつ効果的に研究されることもある。したがって、本発明により疾病の状態および疾病の治療を安全かつ効果的に分析することができる。
【００２８】
最も現実的で好ましい実施の形態であると確信される実施の形態が例示され記載されたが、記載された具体的な構造および方法からの発展が当業者の念頭に浮かび本発明の真髄および範囲から逸脱すすることなく用いられることもあることが明らかである。本発明は記載され図示された特定の構造に限定されず、特許請求の範囲に記載された範囲に包含される全ての変形と首尾一貫しているように構成されていなければならない。
【００２９】
この発明の具体的な実施態様は以下の通りである。
（１）ウサギの耳の中心動脈の病理を評価する方法であって、
ウサギの耳の前記中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する過程と、
前記損傷に関連する病理を評価する過程と、
を有する、ウサギの耳の中心動脈の病理評価方法。
（２）ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する前記過程が、経皮的にバルーンカテーテルを導入しバルーンを膨らませて血管内の損傷を形成する過程を含む、前記実施態様（１）記載の病理評価方法。
（３）ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する前記過程が、経皮的にステントを導入し配備して血管内の損傷を形成する過程を含む、前記実施態様（１）記載の病理評価方法。
（４）ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する前記過程が、少なくとも一つの薬剤を経皮的に導入して血管内の損傷を形成する過程を含む、前記実施態様（１）記載の病理評価方法。
（５）ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で損傷を血管内に形成する前記過程が、エネルギートランスデューサを経皮的に導入し配備して血管内の損傷を形成する過程を含む、上記実施態様（１）記載の病理評価方法。
【００３０】
（６）前記損傷に関連する病理を評価する前記過程が、組織学的研究を行う過程を含む、前記実施態様（１）記載の病理評価方法。
（７）前記損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、分子学的研究を行う過程を含む、前記実施態様（１）記載の病理評価方法。
（８）前記損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、肉眼および顕微鏡検査による病理学的研究を行う過程を含む、前記実施態様（１）記載の病理評価方法。
（９）前記損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、細胞周期の分析を行う過程を含む、前記実施態様（１）記載の病理評価方法。
（１０）前記損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、マーカ発現の分析を行う過程を含む、上記実施態様（１）記載の病理評価方法。
【００３１】
（１１）ウサギの耳の中心動脈の治療を評価する方法であって、
ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する過程と、
前記損傷が形成された動脈を治療する過程と、
治療された前記損傷が形成された動脈に関連する病理および前記治療の効能を評価する過程と、
を有する、ウサギの耳の中心動脈の治療評価方法。
（１２）ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する前記過程が、経皮的にバルーンカテーテルを導入しバルーンを膨らませて血管内の損傷を形成する過程を含む、前記実施態様（１１）記載の治療評価方法。
（１３）ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する前記過程が、経皮的にステントを導入し配備して血管内の損傷を形成する過程を含む、前記実施態様（１１）記載の治療評価方法。
（１４）ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する前記過程が、少なくとも一つの薬剤を経皮的に導入して血管内の損傷を形成する過程を含む、前記実施態様（１１）記載の治療評価方法。
（１５）ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置で血管内に損傷を形成する前記過程が、エネルギートランスデューサを経皮的に導入し配備して血管内の損傷を形成する過程を含む、前記実施態様（１１）記載の治療評価方法。
【００３２】
（１６）前記損傷が形成された動脈を治療する前記過程が、一つまたは複数の治療薬を局所的に導入する過程を含む、前記実施態様（１１）記載の治療評価方法。
（１７）前記損傷が形成された動脈を治療する前記過程が、一つまたは複数のステントを植え込む過程を含む、前記実施態様（１１）記載の治療評価方法。
（１８）前記損傷が形成された動脈を治療する前記過程が、血管周囲を治療する過程を含む、前記実施態様（１１）記載の治療評価方法。
（１９）前記損傷が形成された動脈を治療する前記過程が、全身的に治療薬を導入する過程を含む、前記実施態様（１１）記載の治療評価方法。
（２０）前記治療された損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、組織学的研究を行う過程を含む、前記実施態様（１１）記載の治療評価方法。
【００３３】
（２１）前記治療された損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、分子学的研究を行う過程を含む、前記実施態様（１１）記載の治療評価方法。
（２２）前記治療された損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、肉眼および顕微鏡検査による病理学的研究を行う過程を含む、前記実施態様（１１）記載の治療評価方法。
（２３）前記治療された損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、細胞周期の分析を行う過程を含む、前記実施態様（１１）記載の治療評価方法。
（２４）前記治療された損傷に関連する前記病理を評価する前記過程が、マーカ発現の分析を行う過程を含む、前記実施態様（１１）記載の治療評価方法。
（２５）ウサギの耳の中心動脈の病理を評価する方法であって、
ウサギの耳の中心部の動脈内の少なくとも一つの位置でアテローム硬化症／炎症性の病変を形成する過程と、
前記病変に関連する病理を評価する過程と、
を有する、ウサギの耳の中心動脈の病理評価方法。
（２６）ウサギの耳の中心動脈の治療を評価する方法であって、
ウサギの耳の中心動脈内の少なくとも一つの位置でアテローム硬化症／炎症性の病変を形成する過程と、
病変が形成された前記動脈を治療する過程と、
治療された前記病変が形成された動脈に関連する病理および治療の効能を評価する過程と、
を有する、ウサギの耳の中心動脈の治療評価方法。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は疾病の状態および疾病の治療を安全かつ効果的に分析するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明に基づくウサギの耳の中心動脈へ経皮的に導入されたステントの模式図である。
【図２】本発明に基づくステントが導入されたウサギの耳の中心動脈の低倍率の顕微鏡写真を示す図である。
【符号の説明】
【００３６】
１０２  ステント
１０４  ステント導入カテーテル
１０６  動脈
１０８  ウサギの耳
２０２  動脈
２０４  ステントの支柱
【図１】
2006075150.tif 000003
【図２】
2006075150.tif 000004
【外国語明細書】
2006075150000001.pdf