(57)【要約】【課題】増幅効率を向上させたＲＮＡ増幅方法を提供する。【解決手段】標的ＲＮＡを鋳型とし、標的ＲＮＡと相同的な第一のプライマーおよび標的ＲＮＡに相補的な第二のプライマーにより、プロモーター配列を有し、かつ前記特定塩基配列に相同又は相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能な２本鎖ＤＮＡを生成する工程、該２本鎖ＤＮＡを鋳型とし前記特定塩基配列に相同又は相補的な配列からなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、該ＲＮＡ転写産物が更に前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型として前記工程を連鎖的に繰り返される条件で実施することからなるＲＮＡ増幅工程において、１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を共存させる。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定塩基配列を含む試料中の標的ＲＮＡを増幅する方法であって、標的ＲＮＡを鋳型とし、標的ＲＮＡに相同的な第一のプライマーおよび標的ＲＮＡに相補的な第二のプライマー（ここで第一又は第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである）により、プロモーター配列を有し、かつ特定塩基配列に相同又は相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能な２本鎖ＤＮＡを生成する工程、２本鎖ＤＮＡを鋳型とし特定塩基配列に相同又は相補的な配列からなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、ＲＮＡ転写産物が更にＤＮＡ合成のための鋳型となり、ＲＮＡ転写産物を生成する工程が連鎖的に繰り返される条件で実施することからなるＲＮＡ増幅工程を、１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の共存下で実施することを特徴とする改良された核酸増幅方法。
【請求項２】
１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質がファージＴ４遺伝子３２タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の核酸増幅方法により増幅されたＲＮＡ転写産物を、相補的２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計されたインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブの蛍光特性の変化を測定することで検出する核酸検出方法。
【請求項４】
標的ＲＮＡを鋳型とする第一のプライマーおよび第二のプライマー、１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含むことを特徴とする、前記標的ＲＮＡの増幅試薬。
【請求項５】
請求項４の標的ＲＮＡの増幅試薬において、相補的２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計されたインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを含むことを特徴とする標的ＲＮＡの検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に属する。本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子混合物中に含まれると予想される、特定核酸配列を含む標的ＲＮＡの増幅を行う際に有用な、新規組成物を用いる核酸増幅方法に関するものである。本発明は遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用であり、更には、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋中等の環境中の微生物の定性又は定量を行う際に有用である。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、遺伝子診断や微生物の定量等では、試料中の核酸（ウィルスや微生物）が極微量であることが多いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現するために、信号強度を向上し高感度化する目的で、標的核酸を増幅する方法がとられる。
【０００３】
特定のＤＮＡ配列を増幅する方法として、ポリメレースチェーンリアクション（ＰＣＲ）法が知られている。この方法では、特定のＤＮＡの有無は判定できるが、該ＤＮＡの存在が生菌の存在と必ずしも一致しないため、生菌の有無を判断することは困難である。一方、感染症の遺伝子診断では、特定塩基配列を含むＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を増幅することで、体内で特定塩基配列を有する微生物が生存しているかどうかを判断可能である。以上の理由から、生菌の指標として有用な標的ＲＮＡを増幅する方法の重要性が高まってきている。
【０００４】
標的ＲＮＡの増幅法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法（特許文献１及び２、非特許文献１及び２参照）、３ＳＲ法（特許文献３、非特許文献３参照）等が知られている。
【０００５】
ＲＴ−ＰＣＲにおいては、１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を用いることで生体成分由来試料中の核酸増幅阻害物質の影響を低減させ、核酸増幅効率を向上させるという報告（特許文献４及び５、非特許文献４及び５参照）はあるが、該報告の方法はあくまで段階的に核酸を増幅させるＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲの場合のみ実現される。また、ＲＴ−ＰＣＲは基本的に逆転写（ＲＴ）とＰＣＲの２段階の工程が必要であり、操作の煩雑性や２次汚染の危険性が課題となる。
【０００６】
一方、１段階のＲＮＡ増幅方法であるＮＡＳＢＡ、３ＳＲ等は、標的ＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマーと逆転写酵素及びリボヌクレエースＨを用いて、プロモーター配列を含む１本鎖ＤＮＡを生成し、１本鎖ＤＮＡに相補的な配列を有するプライマーと逆転写酵素により、標的ＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡを転写可能な２本鎖ＤＮＡを生成し、ＲＮＡポリメレースにより、特定塩基配列を含むＲＮＡを生成する。以後は、生成されたＲＮＡを、前記プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型とする連鎖反応を生じさせるものである。
【０００７】
これら１段階のＲＮＡ増幅方法においては、操作の煩雑性および２次汚染の危険性という課題を解決し、一定温度、１段階での反応が可能であるため、自動化へ適用が容易である。
【０００８】
【特許文献１】特許第３２４１７１７号
【特許文献２】特許第２６５０１５９号
【特許文献３】特許第３１５２９２７号
【特許文献４】特開２００３−１４４１６９号公報
【特許文献５】特開２０００−３４２２８７号公報
【特許文献６】特開２０００−１４４００号公報
【非特許文献１】Ｃｏｍｐｔｏｎ  Ｊ．  Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）  Ｍａｒ  ７；３５０（６３１３)：９１−２
【非特許文献２】Ｒｏｍａｎｏ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．（１９９６）  Ｍａｒ；１６（１）:８９−１０３
【非特許文献３】Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９９０）  Ｍａｒ;８７（５）:１８７４−８
【非特許文献４】Ｋｒｅａｄｅｒ  Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.（１９９６）  Ｍａｒ;６２（３）:１１０２−６
【非特許文献５】Ｈｕａｎｇ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９６）Ｊｕｌ;１５(７):５８９−９４
【非特許文献６】Ｓｏｎｇ  Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ.（１９８７）Ａｕｇ  ３１；２２１（１）：１６７−７１
【非特許文献７】Ｉｓｈｉｇｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ  Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.（２００３）  ３１４  ：７７−８６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＲＮＡの増幅法において、試料中に存在する極微量の標的ＲＮＡをより高感度かつ再現性良く検出するため、簡便に増幅効率を向上できる方法が望まれている。ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ等のＲＮＡの増幅法は、３５℃から６５℃という比較的低温かつ一定温度、１段階での反応を実施するため、前記したように非常に好ましいＲＮＡ増幅方法である。しかし、増幅効率を低下させる一つの原因と考えられるプライマーダイマー等に由来する非特異産物が生成しやすいという課題が存在するため、これを解決できればさらに増幅効率を向上できるものと思われる。また、至適条件の異なる複数の酵素を使用することから、最適な増幅系構築のためには、プライマー配列の微調整や反応温度、塩濃度等反応条件の微調整および厳密な制御が必要となることが課題である。
【００１０】
そこで本発明は、試料中の標的ＲＮＡの高効率な核酸増幅方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、標的ＲＮＡを鋳型として、プロモーター配列を有し特定塩基配列又は前記特定塩基配列と相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能な２本鎖ＤＮＡを生成し、ＲＮＡポリメレースによって前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列に相補的な配列からなるＲＮＡ転写産物を生成し、更に、該ＲＮＡ転写産物を鋳型として前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程を、１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の共存下で実施することによって、ＲＮＡ増幅の促進に効果があることを見出した。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、特定塩基配列を含む試料中の標的ＲＮＡを増幅する方法である。標的ＲＮＡを鋳型とし、標的ＲＮＡに相同的な第一のプライマーおよび標的ＲＮＡに相補的な第二のプライマー（ここで第一又は第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列が付加されたプライマーである）の存在下で逆転写反応を実施すると、第二のプライマーが標的ＲＮＡの特定塩基配列に結合し、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメレース活性を持つ酵素によりｃＤＮＡ合成が行われる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドはリボヌクレエースＨ活性を有する酵素によってＲＮＡ部分が分解され、解離することによって第一のプライマーが前記ｃＤＮＡに結合する。
【００１４】
引き続いて、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメレース活性を持つ酵素によりプロモーター配列を有し、かつ前記特定塩基配列に相同又は相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能な２本鎖ＤＮＡが生成される。該２本鎖ＤＮＡを鋳型としＲＮＡポリメレース活性を持つ酵素によって前記特定塩基配列に相同又は相補的な配列からなるＲＮＡ転写産物が生成される。該ＲＮＡ転写産物は更に前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となり、ＲＮＡ転写産物を生成する工程が連鎖的に繰り返される。本発明は、これら一連のＲＮＡ増幅工程を、１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の共存下で実施することを特徴とする改良された核酸増幅方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は前記核酸増幅方法により増幅されたＲＮＡ転写産物を、ＲＮＡ転写産物と相補的２本鎖を形成可能な核酸プローブとインターカレーター性蛍光色素、もしくは、インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブで、かつ標的核酸と形成した相補的２本鎖部分に前記インターカレーター性蛍光色素部分がインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの、蛍光特性の変化を測定することで検出する核酸検出法も提供する。
【００１６】
１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＰＣＲにおいて生体成分由来試料中の核酸増幅阻害物質の影響を低減させ、核酸増幅効率を向上させるという報告（特許文献４及び５、非特許文献４及び５参照）はあるが、該報告の方法はあくまで段階的に核酸を増幅させるＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲの場合のみ実現される。本発明中の１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が一定温度、１段階での連鎖的なＲＮＡ増幅効率を向上させる詳細な機構は不明であるが、相補的結合による２本鎖構造を不安定化させる機能を有するため、プライマーダイマー等に由来する非特異産物を低減させ、結果として増幅効率を向上させる可能性が挙げられる。さらには標的ＲＮＡの高次構造形成を低減しプライマーのプライミング効率を向上させることも期待される。この目的としては１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質ならば特に限定されず、大腸菌１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４ファージ遺伝子３２タンパク質等既知の１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が使用可能である。１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の添加量は反応条件によって適切に設定する必要はあるものの特に限定されるわけではない。また、１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質はＲＮＡの増幅反応に共存していればよく、単独で添加することや、標的ＲＮＡを含む試料や増幅試薬等にあらかじめ添加することが可能であり、特に限定されるわけではない。
【００１７】
本発明中の特定塩基配列とは標的ＲＮＡの少なくとも一部の配列あるいは該配列の相補配列からなり、第一のプライマーおよび第二のプライマーによって規定される領域の配列を有する。したがって、特定塩基配列が標的ＲＮＡに対して相補的である場合は、第一のプライマーとＲＮＡ依存ＤＮＡポリメレース活性を持つ酵素によりｃＤＮＡ合成が行われ、得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドはリボヌクレエースＨ活性を有する酵素によってＲＮＡ部分が分解され、解離することによって第二のプライマーが前記ｃＤＮＡに結合し、２本鎖ＤＮＡが合成される。
【００１８】
本発明のＲＮＡ増幅工程において、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、リボヌクレエースＨ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素が必要となる。各酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよいし、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。
【００１９】
本発明の一態様は、標的ＲＮＡを含む試料と、いずれかにプロモーター配列を有する第一のプライマーおよび第二のプライマー、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、リボヌクレエースＨ活性、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を合わせ持つ逆転写酵素、ＲＮＡポリメレース、さらにＴ４ファージ遺伝子３２タンパク質を含む増幅反応試薬とを混合し、３５℃〜６５℃の範囲で設定された一定温度で反応させることからなる。前記増幅反応試薬は、逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースを機能させるための既知の成分、すなわち少なくとも、基質であるデオキシリボヌクレオチド三リン酸およびリボヌクレオチド三リン酸、緩衝剤、マグネシウム塩、必要に応じてリボヌクレエースＨ、カリウム塩、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の有機溶剤を含むことはいうまでもない。
【００２０】
本発明中のプロモーター配列とはＲＮＡポリメレースの認識・結合部位配列で、特定のＲＮＡポリメレースによって転写開始できる配列ならば特に限定されない。通常、汎用されるのは、Ｔ７  ＲＮＡポリメレース、Ｔ３  ＲＮＡポリメレース、ＳＰ６  ＲＮＡポリメレースで、それぞれに特異的なプライマー配列が既知であり、該配列を本発明で使用することが可能である。本発明中の逆転写酵素は既知の逆転写酵素、すなわちＡＭＶ逆転写酵素、ＲＡＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素等が使用可能である。
【００２１】
Ｔ４ファージ遺伝子３２タンパク質の添加量は特に限定されないが、終濃度が１０〜２００μｇ／ｍｌの範囲となるように添加することが好ましく、さらに好適には３０〜６０μｇ／ｍｌの範囲となるように添加することが好ましい。なお、Ｔ４ファージ遺伝子３２タンパク質は標的ＲＮＡを含む試料に添加しておくことも可能である。
【００２２】
本発明は、さらに別の一態様として、前記ＲＮＡ増幅工程を、インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブで、かつ標的核酸と形成した相補的２本鎖部分に前記インターカレーター性蛍光色素部分がインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下で実施し、経時的に蛍光特性の変化を測定することによって試料中の標的ＲＮＡ量を測定する方法を提供する。この態様の場合、測定試薬に含まれる全ての試料を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的に標的ＲＮＡを増幅し検出することができる。この容器は、試料を分注した後に密閉することが可能であればコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。また、この態様のＲＮＡ増幅・測定方法は、１段階、一定温度で実施可能であるため、ＲＴ−ＰＣＲに比べて簡便で自動化に適した方法であるといえる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によってはじめて、増幅された試料中の特定塩基配列を含む標的ＲＮＡが再び増幅反応の鋳型となり、連鎖的に生じるＲＮＡ増幅法の増幅効率を、１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を共存させることで向上させ、一定温度、１段階の反応による標的ＲＮＡの高感度検出が可能になった。また、本発明の一態様として、標的ＲＮＡの増幅反応において相補的２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計されたインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブ存在下で実施することで、経時的な蛍光特性の変化を測定する核酸検出方法の検出効率を増加する方法を提供した。
【００２４】
さらに、本発明においては１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質をＲＮＡ増幅反応系内に共存させることのみで増幅効率を向上できるため、従来必要であったプライマー設計ソフトおよび手作業による煩雑なプライマー設計、配列微調整、評価や、高額な装置による厳密な反応条件制御なしにＲＮＡ増幅効率を向上させることが可能となった。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定される物ではない。
実施例１  Ｔ４ファージ遺伝子３２タンパク質の添加によるＲＮＡ増幅の効率向上
（１）使用した標準ＲＮＡは、ｍｅｃＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の細胞壁合成酵素ＰＢＰ２’遺伝子配列（非特許文献６参照）を含む２１８３塩基のＲＮＡ）。この標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で１０００コピー／５μｌになるように調製しＲＮＡ試料とした。
（２）以下の組成のｍｅｃＡ増幅用反応液２０μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、上記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。これを基本試薬組成とする。
【００２６】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
（特許文献６、非特許文献７参照）
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１８．７ｍＭ  塩化マグネシウム
１２０ｍＭ  塩化カリウム
６Ｕ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
１．０μＭの第一のオリゴヌクレオチド（Ｔ７ＲＮＡポリメレース・プロモーター配列含有第一のプライマー：配列番号１に記載）
１．０μＭの第二のオリゴヌクレオチド（第二のプライマー：配列番号２に記載）
０．１６μＭの第三のオリゴヌクレオチド（３’末端をアミノ基修飾：配列番号３に記載）
１３％  ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）基本組成試薬にＴ４ファージ遺伝子３２タンパク質４ｍｇ／ｍｌ(ニッポンジーン)を１μｇ（最終反応液量３０μｌにおける重量）添加したｍｅｃＡ増幅用反応液２０μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブに分注し、上記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
（４）上記の反応液を４３℃で５分間保温後、以下の組成の酵素液５μｌを添加した。
【００２７】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
１．７％  ソルビトール
３．６μｇ  牛血清アルブミン
１７０．４Ｕ  Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ギブコ製）
８Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製）
１Ｕ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＨ
容量調整用蒸留水
（５）引き続き上記ＰＣＲチューブを４３℃で３０分間保温し、ＲＮＡ増幅反応を行った。
（６）上記溶液の、それぞれ２μｌをアガロースゲルで電気泳動を行った後、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩＩで染色し、デンシトメーターで増幅産物ＲＮＡのバンド濃度を定量した。
【００２８】
アガロースゲル電気泳動で増幅産物量を数値化した結果、基本試薬組成における産物ＲＮＡ量に対して、Ｔ４ファージ遺伝子３２タンパク質を添加した試薬では、産物ＲＮＡ量が２倍量以上得られた。（図１、２）
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】基本試薬組成およびそれにＴ４ファージ遺伝子３２タンパク質を添加した試薬それぞれに酵素液を加えて標準ＲＮＡを増幅し、各ＲＮＡ増幅産物のアガロースゲル電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩＩで染色したゲルにＵＶを照射したものの写真である。
【図２】図１の染色ゲルで認められたバンドを、デンシトメーターで数値化したものである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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