(57)【要約】      （修正有）【課題】  細胞膜透過性促進剤等の細胞の損傷・死滅を生じさせる試薬を用いることなく、より簡便かつ効率よく細胞内の負の超らせんＤＮＡを検出する手段の提供。【解決手段】  次の一般式（１）2006151939.tif 000008（式中、Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ同一又は異なって、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子又はアミノ基を示し、Ｘは標識体の残基を示し、Ａは塩基性アミノ酸に富むオリゴペプチドを示し、ｎは１〜４の数を示す）で表されるソラレン誘導体及びこれを含有する細胞内の負の超らせんＤＮＡ検出用試薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（１）
【化１】
2006151939.tif 000007
（式中、Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ同一又は異なって、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子又はアミノ基を示し、Ｘは標識体の残基を示し、Ａは塩基性アミノ酸に富むオリゴペプチドを示し、ｎは１〜４の整数を示す）
で表されるソラレン誘導体。
【請求項２】
前記オリゴペプチドが、塩基性アミノ酸５０％以上含むオリゴペプチドである請求項１記載のソラレン誘導体。
【請求項３】
前記オリゴペプチドが、
ｉ）Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（配列番号１）又は当該配列のＣ末
端にLysを有する配列、
ii）Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Gln-Arg-Arg-Met-Lys-Lys-Trp-Lys（配列番号２）又は当
該配列のＣ末端にLysを有する配列、
iii）Tyr-Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（配列番号３）又は当該配列のＣ末
端にLysを有する配列、
iv）Arg-Gln-Ile-Arg-Ile-Trp-Gln-Arg-Arg-Met-Arg-Arg-Trp-Arg（配列番号４）又は当
該配列のＣ末端にLysを有する配列、
ｖ）Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg（配列番号５）又は当該配列のＣ末端にLysを有する配列、
で表されるオリゴペプチドである請求項１又は２記載のソラレン誘導体。
【請求項４】
標識体の残基がビオチン残基である請求項１〜３のいずれか１項に記載のソラレン誘導体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のソラレン誘導体を含有する細胞内の負の超らせんＤＮＡ検出用試薬。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のソラレン誘導体を細胞に導入し、当該細胞に長波長紫外線を照射した後、発色性、蛍光性又は化学発光性の標識類を反応させ、次いで当該細胞の発色、蛍光又は発光を測定することを特徴とする細胞内の負の超らせんＤＮＡの検出法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のソラレン誘導体を細胞に導入し、当該細胞に長波長紫外線を照射した後、発色性、蛍光性又は化学発光性の標識類を反応させ、次いで当該細胞の発色、蛍光又は発光を測定することを特徴とする負の超らせんＤＮＡ含有細胞の検出法。
【請求項８】
細胞が、真核生物細胞である請求項６又は７記載の検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内の負の超らせんＤＮＡを簡便かつ効率よく検出することのできる検出用試薬に関する。
【０００２】
ＤＮＡは平均１０．５塩基対毎に一回転する２重らせん構造をしているが、ＤＮＡの末端を拘束した状態で、らせんのピッチをきつくする、あるいは緩める方に回転させると超らせんを生じ、それぞれを正および負の超らせん構造という。当該ＤＮＡの超らせん構造は、転写や複製に重要な役割を担っていると考えられている。特に真核生物における負の超らせんＤＮＡは、転写が活発に起こっている細胞に多く蓄積され、がん細胞などの転写活性の高い細胞で多く存在することが指摘されている。従って、超らせんＤＮＡの検出は、がんの検出等の転写活性の高いＤＮＡの検出に有用であると考えられている。
【０００３】
このような超らせんＤＮＡ検出法として、ソラレンが負の超らせんＤＮＡに選択的に結合する性質を利用した方法が知られている（非特許文献１〜５参照）。しかし、この方法は、ステップが多く煩雑であること、細胞を破壊しないと検出が不可能なこと等の問題があった。
そこで本発明者らは、先にビオチン化ソラレン類を細胞に導入し、当該細胞に長波長紫外線を照射した後、発色性、蛍光性又は化学発光性の標識アビジン類を反応させ、次いで当該細胞の発色、蛍光又は発光を測定することにより細胞内の負の超らせんＤＮＡがそのまま可視化できることを見出している（非特許文献６参照）。
【０００４】
しかしながら、この検出法では、ビオチン化ソラレンを細胞に導入する際、その導入効率を高めるためにジギトニン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等の細胞膜透過性促進剤を用いる必要があり、これらの界面活性剤の使用により、細胞の損傷、死滅等が起こり易いという問題があった。
【非特許文献１】Methods Enzymol., 212:319-335 (1992)
【非特許文献２】Methods Enzymol., 212:242-262 (1992)
【非特許文献３】EMBO J. 12: 1067-1075 (1993)
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:6055-6059 (1992)
【非特許文献５】Biochemistry, 36:3151-3158 (1997)
【非特許文献６】第２５回日本分子生物学会年会  プログラム・講演要旨集  １Ｐ−０５４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞膜透過性促進剤等の細胞の損傷・死滅を生じさせる試薬を用いることなく、より簡便かつ効率よく細胞内の負の超らせんＤＮＡを検出する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、種々検討した結果、ソラレン類に塩基性アミノ酸に富むオリゴペプチドを結合させた化合物を用いることにより、何ら界面活性剤を使用することなく、該化合物を細胞内へ導入できることを見出した。また、該化合物を細胞に導入し、当該細胞に長波長紫外線を照射した後、発色性、蛍光性又は化学発光性の標識類を反応させ、次いで当該細胞の発色、蛍光又は発光を直接測定すると、負の超らせんＤＮＡの染色が従来のビオチン化ソラレンに比べて鮮明で、より明確に可視化できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の一般式（１）
【０００８】
【化１】
2006151939.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ同一又は異なって、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子又はアミノ基を示し、Ｘは標識体の残基を示し、Ａは塩基性アミノ酸に富むオリゴペプチドを示し、ｎは１〜４の整数を示す）
で表されるソラレン誘導体を提供するものである。
また、本発明は、上記ソラレン誘導体を含有する細胞内の負の超らせんＤＮＡ検出用試薬を提供するものである。
また、本発明は、当該検出用試薬を細胞に導入し、当該細胞に長波長紫外線を照射した後、発色性、蛍光性又は化学発光性の標識類を反応させ、次いで当該細胞の発色、蛍光又は発光を測定することを特徴とする細胞内の負の超らせんＤＮＡの検出法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の負の超らせんＤＮＡ検出用試薬は、界面活性剤を用いなくても細胞内に効率よく透過するため、これを用いれば、細胞を損傷・死滅させることなく細胞内の負の超らせんＤＮＡを簡便かつ効率良く検出できる。また、該検出用試薬は細胞に対する毒性が少なく、あらゆる細胞への適用が可能である。さらにまた、ビオチン化ソラレン類と比べ、より染色が鮮明となり、負の超らせんＤＮＡの細胞内での局在が明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のソラレン誘導体は、次の一般式（１）
【００１２】
【化２】
2006151939.tif 000003
【００１３】
（式中、Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ同一又は異なって、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子又はアミノ基を示し、Ｘは標識体の残基を示し、Ａは塩基性アミノ酸に富むオリゴペプチドを示し、ｎは１〜４の整数を示す）
で表される。
一般式（１）中、Ｒ1〜Ｒ5のハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。また、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシカルボニル基におけるアルキル又はアルコキシ部分の炭素数は１〜４が好ましく、特に１が好ましい。Ｒ1〜Ｒ5における基としては水素原子、メチル基又はメトキシ基が特に好ましい。
【００１４】
本発明における塩基性アミノ酸に富むオリゴペプチドは、７〜２０のアミノ酸からなるオリゴペプチドで、アルギニンやリジン等の塩基性アミノ酸リッチが好ましい。さらに塩基性アミノ酸５０％以上、好ましくは５０％〜１００％、より好ましくは６０％〜１００％含むオリゴペプチドが好ましい。すなわち、６０％〜１００％がリジン及び／又はアルギニンである７〜２０、より好ましくは１０〜２０のアミノ酸からなるオリゴペプチドがより好ましい。特に、HIV-1  Tat蛋白質、Antennapedia（Antp）由来の細胞通過ドメインのアミノ酸配列、ｉ）Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（配列番号１）又
は当該配列のＣ末端にLysを有する配列、ii）Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Gln-Arg-Arg-Me
t-Lys-Lys-Trp-Lys（配列番号２）又は当該配列のＣ末端にLysを有する配列、iii）Tyr-
Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（配列番号３）又は当該配列のＣ末端にLysを有する配列、iv）Arg-Gln-Ile-Arg-Ile-Trp-Gln-Arg-Arg-Met-Arg-Arg-Trp-Arg（配列
番号４）又は当該配列のＣ末端にLysを有する配列、ｖ）Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg（配列番号５）又は当該配列のＣ末端にLysを有する配列、を含むものが好ましい。なお、上記iii）とiv）のアミノ酸配列は、ｉ）とii）のリ
ジンをアルギニンに置換したものである。さらに、配列番号１のアルギニンをリジンに置換したもの、配列番号２のアルギニンをリジンに置換したもの、配列番号５のアルギニンをリジンに置換したものも良好な例として挙げることができる。
【００１５】
本発明における標識体は、プローブ標識に用いられる標識体や免疫組織化学的染色方法に用いられる標識体等特に制限されず、例えば、ビオチン又はその誘導体、ジゴキシゲニン、ウサギIgG等のタンパク質、フルオレセインイソチオシアナート、Alexa Fluor ３５０、同４３０、同４８８、同５３２、同５４６、同５６８、同５９４、同６３３、同６６０、同６８８、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミンの蛍光標識体等が挙げられ、特にビオチンが好ましい。
【００１６】
本発明において、特に好ましいソラレン誘導体としては、Ｎ−（２，５，９−トリメチル−７−オキソ−７Ｈ−フロ〔３，２−ｇ〕クロメン−３−イルメチル）−スクシニル−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫビオチンアミン（R1=R3=H、R2=R4=R5=CH3、X=ビオチン、A=ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫ、n=２）、又はＮ−（２，５，９−トリメチル−７−オキソ−７Ｈ−フロ〔３，２−ｇ〕クロメン−３−イルメチル）−スクシニル−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫビオチンアミン（R1=R3=H、R2=R4=R5=CH3、X=ビオチン、A=ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫ、n=２）が挙げられる。
【００１７】
一般式（１）で表されるソラレン誘導体は、例えば以下の製造方法により得ることが出来る。
【００１８】
【化３】
2006151939.tif 000004
【００１９】
（式中、Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ同一又は異なって、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子又はアミノ基を示し、Ｘは標識体の残基を示し、Ａは塩基性アミノ酸に富むオリゴペプチドを示し、Halはハロゲン原子を示し、ｎは１〜４の整数を示す）
で表される。
すなわち、トリオキサレン（２）にハロゲンエーテルを反応させて化合物（３）を得、この化合物（３）にフタルイミドを反応させて化合物（４）を得る。次いで化合物（４）を還元して化合物（５）とした後、無水ジカルボン酸と反応させて化合物（６）を得る。この化合物（６）と別途自動ペプチド合成機により合成した標識オリゴペプチド鎖とを縮合させて本発明化合物（１）を得ることができる。
以下、上記各反応工程毎に説明する。
【００２０】
トリオキサレン（２）とハロゲンエーテルの反応は、トリオキサレンを酢酸等の溶媒に溶解し、クロロメチルメチルエーテル等のハロゲンエーテルを加え室温で２４〜４８時間攪拌して反応させることにより行なわれる。この反応混合物を氷冷し、析出した結晶を濾取、洗浄すれば化合物（３）が得られる。
【００２１】
化合物（３）とフタルイミドとの反応は、両化合物を無水ＤＭＦ、無水ＴＨＦ等の溶媒に溶解し、５０〜１２０℃で数時間攪拌して反応させることにより行なわれる。反応後、溶媒を除去し、洗浄後、精製することにより化合物（４）が得られる。
【００２２】
化合物（４）から化合物（５）を得るには、化合物（４）をエタノール等の溶媒に懸濁させ、抱水ヒドラジン・一水和物を加え２〜８時間還流すればよい。反応液を冷却後、溶媒を除去し、洗浄、精製することにより化合物（５）が得られる。
【００２３】
化合物（５）と無水ジカルボン酸の反応は、両化合物を無水ＤＭＦ、無水ＴＨＦ等の溶媒に溶解し、数時間還流すればよい。ここで、ジカルボン酸としては、コハク酸、マロン酸、グルタル酸等が挙げられる。
この化合物（６）のカルボキシル基と別途合成した標識オリゴペプチド鎖のＮ末端アミノ基とを結合させて本発明化合物（１）を得ることができる。
【００２４】
標識オリゴペプチドの合成は、固相法で行うことができる。すなわち、Fmoc-NH-SAL-PEG-樹脂を出発原料として、脱Fmoc化、DMF洗浄後、o-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラ-メチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩試薬を用いて、相当するFmoc-アミノ酸誘導体の縮合反応を行い、順次Ｃ末端よりペプチド鎖を延長させ、最後に化合物（６）を同様な方法でペプチド鎖に導入し、保護トリメチルソラレン-デリバリーペプチド-1樹脂を得る。この保護ペプチド樹脂の樹脂を濾過後、濾液を分取用逆相HPLCで精製し、精製トリメチルソラレン-デリバリーペプチドを得ることができる。
ここで、Fmoc-NH-SAL-PEG-樹脂に最初に縮合させるFmoc-アミノ酸誘導体は、一般式（１）中のＣ末端アミノ酸に標識体を結合させた標識Fmoc-アミノ酸誘導体であり、例えば、Ｘ＝ビオチンの場合、リジンのε−アミノ基とビオチンのカルボキシル基を予め結合させたFmoc-アミノ酸誘導体である。また、このとき、リジンのカルボキシル基はアミド（CONH2）にしておくのが好ましい。
【００２５】
本発明の検出法に用いられる細胞は、真核生物の細胞であればよく、例えばヒト、ラット、マウス等の哺乳類はもとよりショウジョウバエ等の昆虫由来の細胞であってもよい。これらの細胞は、真核生物の組織、体液を利用することができる。ヒトの場合には、培養細胞やがんが疑われる組織、細胞等を用いて検体とすればよい。
【００２６】
本発明のソラレン誘導体は、ソラレンと同様に、負の超らせんをもつＤＮＡの塩基対と塩基対の間へ選択的に挟まりこむ性質を有する。長波長紫外線、例えば３６５nmの光で励起すると、ＤＮＡに取り込まれたソラレン誘導体は共有結合によりＤＮＡを架橋（クロスリンク）する。従って、細胞内において、長波長紫外線照射により超らせんＤＮＡに固定化されたソラレン誘導体に発色性、蛍光性又は化学発光性標識類を反応させて、当該固定化されたソラレン類部分の発色、蛍光又は発光を測定すれば、細胞内における超らせんＤＮＡ部分のみが選択的に検出できる。
【００２７】
本発明のソラレン誘導体を細胞内に導入するには、細胞含有液にソラレン誘導体を添加すればよく、ソラレン誘導体の濃度は、細胞数にもよるが、０．０１〜１００ng／ml、特に０．０５〜５０ng／mlが好ましい。ここで、本発明のソラレン誘導体は、界面活性剤等の非存在下で、効率良く細胞膜を通過し、細胞内に侵入する。ここで、細胞含有液としては、通常の生理食塩液、培地成分等を用いることができる。
【００２８】
ソラレン誘導体の励起に用いる長波長紫外線としては、紫外部の長波長領域（３２０〜４００nm）であればよいが、３４０〜３８０nm、特に３６５nm付近が好ましい。
【００２９】
紫外線照射により負の超らせんＤＮＡに固定化されたソラレン誘導体に反応させる発色性、蛍光性又は化学発光性の標識類としては、標識体に結合できるものであれば特に制限されず、例えばストレプトアビジン、アビジン等のアビジン類、抗ジゴキシゲニン抗体、抗ウサギＩｇＧ抗体等が挙げられ、特にストレプトアビジンが好ましい。
【００３０】
発色性標識体としては、酵素標識が挙げられる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼが挙げられる。これらの酵素標識類を用いた場合には、さらに、３，３′−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、３，３′−（３，３′−ジメトキシ−４，４′−ビフェニレン）ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム  クロライド］（ＮＢＴ）等の発色剤を組み合せることにより発色させることができる。これらの発色性標識体を用いた場合には染色体上でソラレンによってクロスリンクされた部位を茶色又は紫色の色素の沈着として検出することができる。
【００３１】
蛍光標識体としては、フルオレセインイソチオシアナート、Alexa Fluor ３５０、同４３０、同４８８、同５３２、同５４６、同５６８、同５９４、同６３３、同６６０、同６８８、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン等が挙げられる。これらの蛍光標識類を用いた場合には、蛍光顕微鏡により観察でき、かつ容易に画像化できるので特に好ましい。
【００３２】
化学発光標識体としては、ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メイチルアクリジニウム  ナイトレート）、アクリジニウム  エステル、アダマンチル１，２−ジオキセタンアリルリン酸、ナイトリック  オキサイド、ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキサレート等が挙げられる。これらの化学発光標識アビジン類を用いた場合には、Ｘ線フィルム上にシグナルを直接記録することが可能である。
【００３３】
かくして発色、蛍光又は化学発光を測定すれば、細胞からＤＮＡを抽出する操作をすることなく、ゲノムのどの領域に負の超らせんＤＮＡが存在するかを検出できる。また、負の超らせんＤＮＡを有する細胞を検出することもできる。
【００３４】
さらにまた、本発明においては、ソラレン誘導体でクロスリンクした負の超らせんＤＮＡを定量することができる。ソラレン誘導体で負の超らせんＤＮＡをクロスリンクした後、ＤＮＡをフェノールあるいはクロロホルム等を用いたＤＮＡ抽出に一般的に用いられる方法により抽出し、得られたＤＮＡを、例えば超音波処理により断片化する。ソラレン誘導体でクロスリンクしたＤＮＡ断片は、ソラレン誘導体の標識体に結合できる標識類、例えばストレプトアビジン等を用いて特異的に回収することができる。回収したＤＮＡ断片からアルカリ処理によりクロスリンクをはずした後、ＤＮＡを定量することができる。ＤＮＡの定量は一般的に用いられる方法、例えば定量的ＰＣＲ法により測定することができる。
【実施例】
【００３５】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００３６】
実施例１
Ｎ−（２，５，９−トリメチル−７−オキソ−７Ｈ−フロ〔３，２−ｇ〕クロメン−３−イルメチル）−スクシニル−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫビオチン−ＮＨ2（Ｒ1＝Ｒ3＝Ｈ、Ｒ2＝Ｒ4＝Ｒ5＝ＣＨ3、Ｘ＝ビオチン、Ａ＝ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫ、ｎ＝２）の合成
【００３７】
【化４】
2006151939.tif 000005
【００３８】
Ｎ−（２，５，９−トリメチル−７−オキソ−７Ｈ−フロ〔３，２−ｇ〕クロメン−３−イルメチル）−スクシニル−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫビオチン-ＮＨ2（Ｒ1＝Ｒ3＝Ｈ、Ｒ2＝Ｒ4＝Ｒ5＝ＣＨ3、Ｘ＝ビオチン、Ａ＝ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫ、ｎ＝２）の合成は次に示した経路で行った。
【００３９】
【化５】
2006151939.tif 000006
【００４０】
（１）４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ｂ）の合成
トリオキサレン（ａ）1.0gを酢酸115mLに溶解し、クロロメチルメチルエーテル7.6mLを加え室温で２４時間攪拌した。さらにクロロメチルメチルエーテル7.6mLを追加し、室温で２４時間攪拌した。反応混合物を氷冷し、析出した結晶を濾取、結晶をヘキサン：エーテル＝３：１、ついでエーテルで洗浄し、４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ｂ）を0.93g得た。
【００４１】
（２）４’−Ｎ−フタルイミドメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ｃ）の合成
４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ｂ）0.87g、フタルイミドカリウム塩0.80gを無水ＤＭＦ55mLに加え、１００℃で６時間攪拌後、溶媒を留去、残渣にクロロホルムを加え蒸留水で３回洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、溶媒を留去、残渣をシリカゲルカラム（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製し、４’−Ｎ−フタルイミドメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ｃ）を0.86g得た。
【００４２】
（３）４’−Ｎ−アミノメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ｄ）の合成
４’−Ｎ−フタルイミドメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ｃ）0.8gを９５％エタノール95mLに懸濁させ、これに抱水ヒドラジン・一水和物0.5mLを加え２時間還流した。４時間後、さらに抱水ヒドラジン・一水和物0.5mLを加え２時間還流した。冷却後、溶媒を留去、残渣に０．１Ｎ  ＮａＯＨ  170mLを加え、クロロホルムで３回抽出した。クロロホルム層を合わせ、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥、溶媒を留去、残渣をシリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝８：１）で精製し、４’−Ｎ−アミノメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ｄ）を294mg得た。
【００４３】
（４）Ｎ−（２，５，９−トリメチル−７−オキソ−７Ｈ−フロ［３，２−ｇ］−クロメン−３−イルメチル）−コハク酸（ｅ）の合成
４’−Ｎ−アミノメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ｄ）283mg及び無水コハク酸110mgを無水ＴＨＦ15mL中で５時間還流した。冷後、蒸留水を加え固化、固体を濾取、乾燥した。さらに固体をヘキサン：エーテル＝２：１、ついでエーテル：メタノール＝２：１で洗浄し、Ｎ−（２，５，９−トリメチル−７−オキソ−７Ｈ−フロ［３，２−ｇ］−クロメン−３−イルメチル）−コハク酸（ｅ）を367mg得た。
【００４４】
（５）トリメチルソラレン−デリバリーペプチド−１：Ｎ−（２，５，９−トリメチル−７−オキソ−７Ｈ−フロ〔３，２−ｇ〕クロメン−３−イルメチル）−スクシニル−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫビオチン−ＮＨ2（７）の合成
トリメチルソラレン−デリバリーペプチド−１：Ｎ−（２，５，９−トリメチル−７−オキソ−７Ｈ−フロ〔３，２−ｇ〕クロメン−３−イルメチル）−スクシニル−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫビオチン−ＮＨ2（７）の合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社  Ｐｉｏｎｅｅｒ型自動ペプチド合成機による連続フロー方式を用いる固相法で行った。すなわち、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ−ＰＥＧ−樹脂0.1mmolを出発原料として、２０％ピペリジン／ＤＭＦによる脱Ｆｍｏｃ化、ＤＭＦ洗浄後、o-(7−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラーメチルウロニウムーヘキサフルオロリン酸塩試薬を用いて標識Ｆｍｏｃ−リジン誘導体との縮合反応を行い、順次Ｃ末端よりペプチド鎖を延長させた。標識Ｆｍｏｃ−リジン誘導体の標識はビオチンを用い、予めリジンのα−アミノ基をＦｍｏｃ化して保護したビオチン化リジン（リジンのε−アミノ基とビオチンのカルボキシル基を結合させたもの）を用いた。最後にＮ−（２，５，９−トリメチル−７−オキソ−７Ｈ−フロ［３，２−ｇ］−クロメン−３−イルメチル）−コハク酸（ｅ）を同様な方法でペプチド鎖に導入し、保護トリメチルソラレン−デリバリーペプチド−１樹脂0.60gを得た。この保護ペプチド樹脂は蒸留水0.25mLおよびトリイソプロピルシラン0.25mL存在下、トリフルオロ酢酸9.5mLとともに室温１２０分間処理した。樹脂を濾過後、濾液を留去し残渣にエーテルを加え、沈殿物を集め、粗ペプチド56mgを得た。ここに得られた粗製ペプチドを５０％酢酸5mLに溶解後、０．０１ＮＨＣｌ／ＣＨ3ＣＮ混合溶媒を用いＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−５（２０ｘ２５０ｍｍ）による分取用逆相ＨＰＬＣで精製し、精製トリメチルソラレン−デリバリーペプチド−１：Ｎ−（２，５，９−トリメチル−７−オキソ−７Ｈ−フロ〔３，２−ｇ〕クロメン−３−イルメチル）−スクシニル−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫビオチン−ＮＨ2（７）8.0mgを得た。
【００４５】
実施例２
Ｎ−（２，５，９−トリメチル−７−オキソ−７Ｈ−フロ〔３，２−ｇ〕クロメン−３−イルメチル）−スクシニル−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫビオチン−ＮＨ2（R1=R3=H、R2=R4=R5=CH3、X=ビオチン、A=ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫ、n=２）（８）の合成
実施例１で製造したソラレン誘導体（７）のペプチド部分（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）をアルギニンペプチド（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）に代えてペプチド鎖を延長させた以外は、実施例１（１）〜（５）と同様にして合成し、標記化合物（８）を得た。
【００４６】
実施例３
Ａ．材料と方法
（１）試薬
実施例１及び２で製造した本発明のソラレン誘導体（７）及び（８）、並びに比較としてビオチン化ソラレン（式（１）中、R1=R3=H、R2=R5=R6=CH3、X-A-CO-(CH2)n-CO-NH-の代わりにビオチン-NH(CH2)5CONH-(CH2)6NHCH2-、である化合物）を用いた。ジギトニンはCalbiochemから購入したものを用いた。α−アマニチン、ＢｒＵＴＰ（ブロモウリジン ５′−トリホスフェート）、４，５′，８−トリメチルソラレンはＳＩＧＭＡから購入した。制限酵素は宝酒造から購入した。
【００４７】
（２）熱ショック及びＸ線照射
キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster Oregon R）は１８℃で飼育した。必要に応じて３令幼虫をポリプロピレンチューブに入れて３７℃水浴に１０分間沈めて熱ショック処理した。唾腺は解剖バッファー（１０mM HEPES-KOH pH７．６、５mM MgCl2、５mM KCl、１３０mM NaCl、１％のポリエチレングリコール６０００）の中で幼虫を解剖し、得た。必要に応じて、約３Gy/min（TORREX CABINET X-RAY SYSTEMモデルTRX２８００、Faxitron）の線量率で６０分間唾腺をＸ線照射してＤＮＡにニック（nick）を導入した。
【００４８】
（３）唾腺染色体の染色
（３−１）ソラレン誘導体による唾腺染色体の染色
４−５対の唾腺を0.2ng/mlのソラレン誘導体を含む解剖バッファーで１０分間処理した。その後、唾腺を長波長（３６５nm）ＵＶランプ（ＵＶＰモデルＵＶＬ−２１）で照射し、ソラレン誘導体をクロスリンクした。解剖バッファーに3μg/mlのα−アマニチンを添加し、ＲＮＡポリメラーゼIIによる転写を阻害した。クロスリンクの後、唾腺を４０％の酢酸で固定し、スライドグラス上に唾腺染色体を展開した。
【００４９】
（３−２）ビオチン化ソラレンによる唾腺染色体の染色
４−５対の唾腺を０．０１％のジギトニンを含む解剖バッファー40μlで処理し、次に、ジギトニンを含まない解剖バッファーでリンスした。続けて0.2ng/mlのビオチン化ソラレンを含む解剖バッファーで１０分間処理した。その後、唾腺を長波長（３６５nm）ＵＶランプ（ＵＶＰモデルＵＶＬ−２１）で照射し、ビオチン化ソラレンをクロスリンクした。また、２mM ＢｒＵＴＰをジギトニン処理と同時に解剖バッファーに加え、伸長途上のｍＲＮＡを標識した。ジギトニン処理中に解剖バッファーに3μg/mlのα−アマニチンを添加し、ＲＮＡポリメラーゼIIによる転写を阻害した。クロスリンクの後、唾腺を４０％の酢酸で固定し、スライドグラス上に唾腺染色体を展開した。ＢｒＵＴＰは、抗ＢｒｄＵ単クローン抗体（Ｒｏｃｈｅ）及びローダミン標識抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。
【００５０】
ソラレン誘導体及びビオチン化ソラレンは、Ａｌｅｘａ４８８標識ストレプトアビジン（Molecular probe）で検出した。ＤＮＡはＤＡＰＩにより染色した。蛍光画像は、カール・ツァイスＡｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡及びＩＰ ｌａｂソフトウェアで解析した。
【００５１】
（４）サザン法によるクロスリンクの解析
幼虫の熱ショックと解剖は染色の場合と同様に行った。２０対の唾腺をソラレンを含んでいる解剖バッファー中に１０分間入れた後、３６５nmの光線により、クロスリンクを行った。クロスリンクされたＤＮＡは、溶解バッファー（10mM Tris-Cl pH８．２、１００mM EDTA、０．５％のSDS）中で５５℃、４時間プロテイナーゼＫ処理した後、フェノール／クロロホルム及びクロロホルム抽出により精製した。精製されたＤＮＡは、制限酵素処理後、さらに精製した後、グリオキサール変性バッファー(１M グリオキサール、１０mMリン酸ナトリウムpH７．０、５０％ジメチルスルホキシド）に溶解し、５０℃、１時間加熱することにより変性した。グリオキサールにより変性したＤＮＡを１０mMリン酸ナトリウムバッファー（pH７．０）中の１％のアガロース・ゲル電気泳動によってクロスリンクされたＤＮＡとされていないＤＮＡに分画した。電気泳動は３．６ボルト/cmで１００分間行った。
【００５２】
電気泳動後、ゲルを変性液（０．５M NaOH、１．５M NaCl）中で６５℃、１００分間処理してソラレンによるＤＮＡクロスリンクを解除した。ゲル内のＤＮＡをナイロン膜（HybondN、Amersham）にブロットした。ランダムプライム法により３２P標識したプローブを作製し、ハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリダイゼーションのシグナルはX線フィルムにより検出した。プローブの鋳型としてプラスミドｐ５６Ｈ８ＲＩＡ（２６）からｈｓｐ７０ ＣＲ及びＤＤＳ領域を切り出した。
【００５３】
Ｂ．結果
（１）Ｊｕｐｅ等はシュナイダー細胞を用いてショウジョウバエゲノムの特定の領域についてソラレンのクロスリンクを定量する手法を開発した（非特許文献４）。唾腺染色体で負の超らせんＤＮＡを検出するため、我々はまず、Ｊｕｐｅ等の手法が唾腺のような組織に適用可能であるかどうか、確認した。
手短かに手法を述べると、熱ショック前、後の幼虫から唾腺を取り出し、様々の濃度のソラレンを含むバッファーに浸漬した後、３６５nmの光線を照射してクロスリンクを行った。ＤＮＡを精製した後、制限酵素処理を行い、グリオキサールにより変性させた。クロスリンクされたＤＮＡとされていないＤＮＡをゲル電気泳動により分画し、ゲルを６５℃でアルカリ処理した後、ナイロン膜にＤＮＡをブロットした。８７Ａ７に位置するｈｓｐ７０（図１、ＣＲ及びＤＤＳ）をプローブとしてサザン法により解析した。高温でのゲルのアルカリ処理はクロスリンクされたＤＮＡの検出に不可欠であり、この処理によりゲル内でのクロスリンクされたＤＮＡの自己アニーリングを防止し、シグナルを再現性良く検出できるようになった。我々はｈｓｐ７０コード領域のクロスリンクのソラレンに対する濃度依存性を確認した（図２）。幼虫を熱ショックすることにより、クロスリンクの頻度は上昇した（図２）。熱ショック後の幼虫から得た唾腺をＸ線照射処理し、ＤＮＡにニックを導入してからソラレンによるクロスリンクを試みた結果、クロスリンクされたＤＮＡはほとんど検出されなかった（図３（レーン３、レーン４））。対照として、ソラレンによるクロスリンクを行った後にＸ線を照射しても結果に変化は見られなかった（図３（レーン５、レーン２））。Ｘ線の照射量はおよそ３０kbに一箇所のニックをＤＮＡに導入すると予想されるので、Ｘ線照射により超らせんＤＮＡが弛緩されている領域はＣＲ領域（２kb）よりも大きいと考えられる。同様の結果は熱ショックをかけていない幼虫から得られた唾腺染色体についても得られた。対照的に、クロスリンクのレベルはｈｓｐ７０の下流の領域（ＤＤＳ）で低く、熱ショックによってもクロスリンクの頻度の変化は無かった（図３（レーン８、レーン９））。
【００５４】
これらの結果はシュナイダー細胞を使用して得られていた結果(非特許文献４）と一致し、ｈｓｐ７０領域における負の超らせんＤＮＡの蓄積とその熱ショックによる増加を示すものである。これらの結果より、我々はソラレンのクロスリンクによる解析は培養細胞だけでなく唾腺組織にも適用できると結論付けた。
興味深い事には、熱ショック後の染色体であっても、クロスリンク前にα−アマニチン処理を行うとクロスリンクのシグナルはほとんど検出されなかった（図３（レーン６、レーン７））。この結果はＲＮＡポリメラーゼIIによる転写を阻害した後、負の超らせんの蓄積は速やかに解消されることを示している。
【００５５】
（２）唾腺染色体上での負の超らせんＤＮＡ蓄積部位の可視化
我々は、ソラレンによるクロスリンクの手法を発展させ、本発明のソラレン誘導体（７）及び（８）、並びに比較としてビオチン化ソラレンを用い、唾腺染色体上でゲノム全体にわたって負の超らせんＤＮＡの蓄積部位の可視化を試みた。
唾腺をソラレン誘導体を含むバッファーに浸漬し、３６５nmの光線によりクロスリンクし、酢酸固定した後、スライドガラス上に染色体を展開した。
また、０．０１％ジギトニンにより処理した唾腺をビオチン化ソラレンを含むバッファーに浸漬し、３６５nmの光線によりクロスリンクし、酢酸固定した後、スライドガラス上に染色体を展開した。ソラレン誘導体及びビオチン化ソラレンはＡｌｅｘａ４８８標識したストレプトアビジンにより検出した。唾腺染色体上で、多くのシグナルがバンド状に検出された（図４Ａ及びＢ、図５）。図４及び図５に示すとおり、本発明のソラレン誘導体を用いたもの（図４Ｂ、図５）は、負の超らせんＤＮＡの染色が従来のビオチン化ソラレンを用いたもの（図４Ａ）に比べて鮮明で、より明確に可視化できることが確認された。このことは、本発明のソラレン誘導体は、細胞膜透過性促進剤を用いなくても、効率良く細胞膜を通過し細胞内に侵入することができるため、細胞の損傷・死滅を生じさせることなく負の超らせんＤＮＡを検出することができること、また、染色体上の負の超らせんＤＮＡの局在を明らかにすることができることを示している。
【００５６】
実施例４  負の超らせんＤＮＡの定量
（１）熱ショック及び唾腺の摘出
キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster Oregon R)は１８℃で飼育した。必要に応じて３令幼虫はポリプロピレンチューブに入れて３７℃水浴に１０分間沈めて熱ショック処理した。唾腺は解剖バッファー（10mM HEPES-KOH pH7.6, 5mM MgCl2、5mM KCl、130mM NaCl、1%ポリエチレングリコール6000）の中で幼虫を解剖し、得た。
【００５７】
（２）ソラレン誘導体の唾腺への取込みとクロスリンク
２０対の唾腺を0.2ng/mlのソラレン誘導体（８）を含む解剖バッファーで１０分間処理した。その後、唾腺を長波長(365nm)UVランプ（UVPモデルUVL-21）で照射し、ソラレン誘導体（８）をクロスリンクした。
【００５８】
（３）ＤＮＡの抽出と断片化
唾腺を溶解バッファー(10mM Tris-HCl pH8.2、100mM EDTA、0.5%SDS)に移して溶解させた後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム及びクロロホルム抽出し、イソプロパノール沈澱により回収してTE (10mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA)に溶解した。こうして精製したＤＮＡを音波処理し、約５００塩基対の大きさまで断片化した。
【００５９】
（４）ソラレン誘導体をクロスリンクしたＤＮＡ断片の特異的回収
ストレプトアビジンビーズまたはアビジンビーズ(SIGMA社)を結合用バッファー(10mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、100mM NaCl、0.4% Triton X-100)中で、250μg/mlのサケ精子ＤＮＡ（音波処理により断片化したもの）と混ぜ、非特異的なＤＮＡの結合をブロックした。クロスリンクしたＤＮＡ断片を30μg/mlの音波処理したサケ精子ＤＮＡを含む結合用バッファー中で、ブロック処理済ビーズと４℃で１６時間混ぜた。ビーズを結合用バッファーで洗浄して結合しなかったＤＮＡ断片を除いた後、0.5N NaOH、0.1% SDSでＤＮＡ断片をビーズからはずし、遠心してビーズを除いた。上清を６５℃５０分間保温し、クロスリンクをはずした。1/10容の5N HClを加えて中和後、遠心した上清からＤＮＡをエタノール沈澱で回収し、TEに溶解した。
【００６０】
（５）ＰＣＲによるＤＮＡの定量
回収したＤＮＡ断片と特定の遺伝子領域の配列をもつプライマーを用い、ライトサイクラー（ロシュダイアノスティクス社）で定量的ＰＣＲを行い、クロスリンクされたＤＮＡを定量した。異なる試料を比較するため、RP49遺伝子について得られた値に対する相対値で表わした。クロスリンク操作をしなかった試料で得られた値をブランクとして引いた値をクロスリンクされたＤＮＡ量とした。
熱ショック処理前と熱ショック処理後のｈｓｐ７０コード領域における負の超らせんＤＮＡを定量した結果を図６に示す。サザン法解析の結果と同様に、ｈｓｐ７０コード領域における負の超らせんＤＮＡは熱ショックにより増加することが判明した。なお、図はRP49遺伝子について得られた値を１００とした時の、RP49遺伝子に対する相対値で示す。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】８７Ａ７における遺伝子の位置関係とサザン法解析に用いた制限酵素サイトを示す図である。矢は遺伝子の転写方向を示す。８７Ａ７はｓｃｓ及びｓｃｓ’(specialized chromatin structure)に挟まれている。X、XbaI;E、EcoRI;B、BglII。
【図２】唾腺細胞の８７Ａ７のｈｓｐ７０遺伝子におけるソラレンによるクロスリンクのサザン法解析結果を示す図である。レーン１−７は、熱ショック後の唾腺をソラレン処理有り（レーン２−７）、無し（レーン１）の条件で解析した。クロスリンク処理の前（レーン３）及び後（レーン５）にＸ線照射を行った。レーン４はＸ線照射無しで同様の処理を行った。レーン６はソラレン処理の前にα−アマニチン処理を行った。レーン７はα−アマニチン処理を行っていない。
【図３】ソラレンクロスリンクに対するＤＮＡニッキング及び転写阻害結果を示す図である。レーン１〜７は図２と同じ。レーン８は熱ショック処理を行っていない。レーン９は熱ショック処理を行った。
【図４】唾腺染色体でのソラレンシグナルの可視化を示す図である。（Ａ）細胞膜透過性促進剤（界面活性剤）を用いて細胞に導入したビオチン化ソラレンのシグナルをＡｌｅｘａ４８８標識したストレプトアビジンで検出した（緑）。（Ｂ）細胞膜透過性促進剤を用いないで細胞に導入したソラレン誘導体（７）のシグナルをＡｌｅｘａ４８８標識したストレプトアビジンで検出した（緑）。
【図５】細胞膜透過性促進剤を用いないで細胞に導入した唾腺染色体でのソラレン誘導体（８）のシグナルをＡｌｅｘａ４８８標識したストレプトアビジンで検出した（緑）図である。
【図６】唾腺細胞の８７Ａ７のｈｓｐ７０遺伝子における熱ショック処理前と熱ショック処理後の負の超らせんＤＮＡを定量的ＰＣＲ法により定量した結果を示す図である。RP49遺伝子に対する相対値で表した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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