(57)【要約】      （修正有）【課題】ステロイド性骨疾患に関連するＳＮＰを容易に検知することが出来るキットの開発が求められている。【解決手段】本発明は、ヒトから採取した生体試料中に含むゲノムＤＮＡにおける遺伝子多型（ＳＮＰ）を検出するキットであって、少なくとも特定のＤＮＡ配列からなる第１のプローブ群を含んでなる遺伝子多型検出キットを提供する。該遺伝子多型検出キットを用いた測定の結果により、ステロイド投与の後に将来人がステロイド性骨疾患になる可能性を予測できる【選択図】図１
2006014653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトから採取した生体試料中に含むゲノムＤＮＡにおける遺伝子多型（ＳＮＰ）を検出するキットであって、少なくとも配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群を含んでなる遺伝子多型検出キット。
【請求項２】
少なくとも下記の（i）または(ii)のプローブ群を含んでなる請求項１に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群。
【請求項３】
少なくとも下記の（i）〜（v）のプローブ群を含んでなる請求項１に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号５のＤＮＡおよび配列番号６のＤＮＡからなる第３のプローブ群：
（iv）配列番号７のＤＮＡ、配列番号８のＤＮＡおよび配列番号９のＤＮＡからなる第４のプローブ群：
（v）配列番号１０のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第５のプローブ群。
【請求項４】
プローブ群が坦体表面上に固定化された検出ストリップを含んでなる請求項１に記載の遺伝子多型検出キット。
【請求項５】
坦体が、ビニル系ポリマーまたはポリエステルである請求項４に記載の遺伝子多型検出キット。
【請求項６】
坦体が、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンまたはポリエチレンテレフタレートである請求項４に記載の遺伝子多型検出キット。
【請求項７】
少なくとも配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対を含んでなる請求項１に記載の遺伝子多型検出キット。
【請求項８】
少なくとも下記の(i)および(ii)を含んでなる請求項７に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第２のプライマー対。
【請求項９】
少なくとも下記の（i）〜（v）のＤＮＡを含んでなる請求項７に記載の遺伝子多型検出キット：
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号５のＤＮＡおよび配列番号６のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１６のＤＮＡおよび配列番号１７のＤＮＡからなる第３のプライマー対：
（iv）配列番号７のＤＮＡ、配列番号８のＤＮＡおよび配列番号９のＤＮＡからなる第４のプローブ群、ならびに配列番号１８のＤＮＡおよび配列番号１９のＤＮＡからなる第４のプライマー対：
（v）配列番号１０のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第５のプローブ群、ならびに配列番号２０のＤＮＡおよび配列番号２１のＤＮＡからなる第５のプライマー対。
【請求項１０】
配列番号１２〜２１のＤＮＡ、配列番号１２、１４、１６、１８および２０のＤＮＡ、または配列番号１３、１５、１７、１９および２１のＤＮＡに、蛍光物質または放射性同位体を修飾した請求項９に記載の遺伝子多型検出キット。
【請求項１１】
配列番号１２〜２１のＤＮＡ、配列番号１２、１４、１６、１８および２０のＤＮＡ、または配列番号１３、１５、１７、１９および２１のＤＮＡの５’末端に、ビオチンを修飾した請求項９に記載の遺伝子多型検出キット。
【請求項１２】
さらに、ストレプトアビジン、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ  ｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を含む請求項１１に記載の遺伝子多型検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトから採取したゲノムＤＮＡにおけるビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）遺伝子の遺伝子多型（ＳＮＰ）の検出を簡便に行うことが出来る遺伝子多型検出キット関する。好ましくは、エストロゲン受容体（ＥＲ）遺伝子のＳＮＰと同時に検出する遺伝子多型検出キットであり、さらに好ましくは、多剤耐性（ＭＤＲＩ）遺伝子のエクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目およびエクソン２６の３４３５番目のＳＮＰをも同時に検出することができる遺伝子多型検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、特定の病気には特定の薬剤を投与するのが主であるが、患者によって薬剤の効果に差がある上に、場合によっては副作用が発生する可能性もある。
近年、患者の体質や環境、病態などを調べ、複数存在する薬剤のうちどの薬剤が最も効果的であるか、または薬剤投与後の副作用が将来起こる可能性があるかどうかを、薬剤投与前に予測し、患者に最適な医療を提供するテーラーメイド医療が注目を浴びている。特に、高血圧や癌、糖尿病など、生活習慣病の３〜４割は、遺伝的な要因によるものであるとされている。このような遺伝的な要因として、ヒトの遺伝子において塩基配列が個人によって異なる箇所が存在することが挙げられる。このような個人による特定の箇所の遺伝子配列の差は遺伝子多型と呼び、特に１箇所のみの塩基配列がことなることを一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、以下ＳＮＰ）と呼ぶ。
【０００３】
ステロイド剤は、効能の強さゆえに膠原病や皮膚炎など様々な分野で治療薬として使用される。特に臓器移植や一部の膠原病の治療などの際に大量に投与する。その反面、易感染、糖尿病、高血圧、緑内障などのさまざまな副作用が生じる可能性も高く、使用においては厳重な注意が必要とされる。
これらの副作用の一つとして、ステロイド性の骨疾患があげられる。ステロイド投与による続発性の骨粗鬆症は、ステロイド性骨粗鬆症と呼ばれ、患者数は１００万人ともいわれている。
また、大腿骨頭壊死症の半数も、ステロイド投与の副作用が原因といわれている。
骨粗鬆症・大腿骨頭壊死症などは、寝たきり・歩行不能などの症状を伴い、深刻な社会問題となっている。
【０００４】
原発性の骨粗鬆症とＳＮＰ検知によるテーラーメイド医療の研究としては、骨粗鬆症の治療薬の選択方法が挙げられる。骨粗鬆症の治療薬には、ビタミンＤ、ビタミンＫおよびエストロゲンなど複数存在する。これらの薬剤のうち、どの薬剤が骨粗鬆症の治療の際に最も効果的であるかを予測する方法が開示されている（特許文献１〜５）。
【０００５】
一方で、ステロイド性骨粗鬆症に関するテーラーメイド医療の研究は、これからの領域であるが、ＭＤＲ１遺伝子や、ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型などが候補としてあげられている。（特許文献６）
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−０７８７７３号公報
【特許文献２】特開２０００−０７８７９８号公報
【特許文献３】特開２００１−０２９０８８号公報
【特許文献４】特開２００１−３３３７９８号公報
【特許文献５】特開２００１−３３３７９９号公報
【特許文献６】特開２００４−０２４１４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上の問題より、ステロイド性骨疾患に対するテーラーメイド医療は非常に有効である。上記ステロイド性骨疾患に関連するＳＮＰの候補は幾つか存在し、具体的には、ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ切断部位におけるＳＮＰが近年注目されており、他にはエストロゲン受容体（ＥＲ）遺伝子のＸｂａ−Ｉ切断部位におけるＳＮＰ、多剤耐性（ＭＤＲ１）遺伝子の１２３６番目、２６７７番目および３４３５番目のＳＮＰなども参考にすることができる。
したがって、上記ＳＮＰ、主にＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ切断部位におけるＳＮＰを容易に検知することが出来るキットの開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
（１）  ヒトから採取した生体試料中に含むゲノムＤＮＡにおける遺伝子多型（ＳＮＰ）を検出するキットであって、少なくとも配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群を含んでなる遺伝子多型検出キット、
（２）  少なくとも下記の（i）または(ii)のプローブ群を含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群、
（３）  少なくとも下記の（i）〜（v）のプローブ群を含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号５のＤＮＡおよび配列番号６のＤＮＡからなる第３のプローブ群：
（iv）配列番号７のＤＮＡ、配列番号８のＤＮＡおよび配列番号９のＤＮＡからなる第４のプローブ群：
（v）配列番号１０のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第５のプローブ群。
（４）  プローブ群が坦体表面上に固定化された検出ストリップを含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット、
（５）  坦体が、ビニル系ポリマーまたはポリエステルである（４）に記載の遺伝子多型検出キット。
（６）  坦体が、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンまたはポリエチレンテレフタレートである（４）に記載の遺伝子多型検出キット、
（７）  少なくとも配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対を含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット、
（８）  少なくとも下記の(i)および(ii)を含んでなる（７）に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第２のプライマー対、
（９）  少なくとも下記の（i）〜（v）のＤＮＡを含んでなる（７）に記載の遺伝子多型検出キット：
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号５のＤＮＡおよび配列番号６のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１６のＤＮＡおよび配列番号１７のＤＮＡからなる第３のプライマー対：
（iv）配列番号７のＤＮＡ、配列番号８のＤＮＡおよび配列番号９のＤＮＡからなる第４のプローブ群、ならびに配列番号１８のＤＮＡおよび配列番号１９のＤＮＡからなる第４のプライマー対：
（v）配列番号１０のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第５のプローブ群、ならびに配列番号２０のＤＮＡおよび配列番号２１のＤＮＡからなる第５のプライマー対、
（１０）  配列番号１２〜２１のＤＮＡ、配列番号１２、１４、１６、１８および２０のＤＮＡ、または配列番号１３、１５、１７、１９および２１のＤＮＡに、蛍光物質または放射性同位体を修飾した（９）に記載の遺伝子多型検出キット。
（１１）  配列番号１２〜２１のＤＮＡ、配列番号１２、１４、１６、１８および２０のＤＮＡ、または配列番号１３、１５、１７、１９および２１のＤＮＡの５’末端に、ビオチンを修飾した（９）に記載の遺伝子多型検出キット、
（１２）  さらに、ストレプトアビジン、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ  ｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を含む（１１）に記載の遺伝子多型検出キットに関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ切断部位におけるＳＮＰの検知を容易に可能とするとともに、好ましくは、エストロゲン受容体（ＥＲ）遺伝子のＸｂａ−Ｉ切断部位におけるＳＮＰとの計２箇所同時検出、さらに好ましくは多剤耐性（ＭＤＲ１）遺伝子の１２３６番目、２６７７番目および３４３５番目のＳＮＰを含めた計５箇所同時検出が可能であり、ステロイド投与の後に将来人がステロイド性骨疾患になる可能性を予測できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ヒトから採取した生体試料中に含むゲノムＤＮＡにおけるＳＮＰを検出するキットである。本発明における生体試料とは、血液、唾液または毛髪などが挙げられ、好ましくは、血球細胞、表皮細胞および粘膜細胞などの各種ヒト細胞である。これらの生体試料からＤＮＡを抽出する方法は、公知の方法で行うことができ、例えばフェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法等が公知である。
【００１１】
本発明の遺伝子多型検出キットは、少なくとも配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群を含んでなる。該プローブは、市販されているＤＮＡ／ＲＮＡ合成機などによって合成することができ、その合成方法は限定されるものではなく、以下に説明する全てのプローブおよびプライマーも同様である。
【００１２】
配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡは、ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型を検出するためプローブである。ＶＤＲ遺伝子は、第１２染色体上に存在する。Ｆｏｋ−Ｉとは、塩基配列ＧＧＡＴＧを認識する公知の制限酵素であり、ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型とは、ＶＤＲ遺伝子におけるエクソン２のＦｏｋ−Ｉ認識部位（ＧＧＡＴＧ）を含むＤＮＡと、該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＦｏｋ−Ｉでは認識されない配列（ＧＧＡＣＧ）を含むＤＮＡの２種類が存在することを意味する。配列番号１のＤＮＡプローブは、Ｆｏｋ−Ｉ認識部位（ＧＧＡＴＧ）を含むＤＮＡを検知できるものであり、配列番号２のＤＮＡプローブは、該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＦｏｋ−Ｉでは認識されない配列（ＧＧＡＣＧ）を含むＤＮＡを検知できるものである。以下、本明細書では、配列番号１のＤＮＡプローブで認識できるＤＮＡ、つまり、Ｆｏｋ−Ｉ認識部位（ＧＧＡＴＧ）を含み、Ｆｏｋ−Ｉで切断されるＤＮＡを「ｆ」、配列番号２のＤＮＡプローブで認識できるＤＮＡ、つまり、該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＦｏｋ−Ｉでは認識されない配列（ＧＧＡＣＧ）を含み、Ｆｏｋ−Ｉで切断されないＤＮＡを「Ｆ」と略す。そして、ヒトの染色体は二量体であることから、ＦＦ型、Ｆｆ型およびｆｆ型の３タイプのＳＮＰが存在する。
【００１３】
さらに、本発明の遺伝子多型検出キットは、ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型に加え、ＥＲ遺伝子のＸｂａ−Ｉ多型も同時に検出できることが好ましい。ＥＲ遺伝子は、第６染色体上に存在する。Ｘｂａ−Ｉとは、塩基配列ＴＣＴＡＧＡを認識する公知の制限酵素であり、ＥＲ遺伝子のＸｂａ−Ｉ多型とは、ＥＲ遺伝子におけるエクソン１およびエクソン２の間のイントロン領域におけるＸｂａ−Ｉ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）を含むＤＮＡと、該Ｘｂａ−Ｉ認識部位の配列がＸｂａ−Ｉでは認識されない配列（ＴＣＴＡＧＡ）を含むＤＮＡの２種類が存在することを意味する。
【００１４】
したがって、本発明の遺伝子多型検出キットは、上記の第１のプローブ群に加えて、配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群を含んでなる。
配列番号３のＤＮＡは、Ｘｂａ−Ｉ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）を含むＤＮＡを検知できるものであり、配列番号４のＤＮＡは、該Ｘｂａ−Ｉ認識部位の配列がＸｂａ−Ｉでは認識されない配列（ＴＣＣＡＧＡ）を含むＤＮＡを検知できるものである。以下、本明細書では、配列番号３のＤＮＡプローブで認識できるＤＮＡ、つまり、Ｘｂａ−Ｉ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）の配列を有するＤＮＡを「ｘ」、配列番号２のＤＮＡプローブで認識できるＤＮＡ、つまり、該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＸｂａ−Ｉでは認識されない配列（ＴＣＣＡＧＡ）を含むＤＮＡを「Ｘ型」と略す。そして、ヒトの染色体は二量体であることから、ＸＸ型、Ｘｘ型およびｘｘ型の３タイプのＳＮＰが存在する。
【００１５】
さらに、本発明の遺伝子多型検出キットは、上記のＳＮＰに加え、ＭＤＲ１遺伝子における３箇所のＳＮＰも検出するキット、つまり、５箇所同時に検出するキットであることが好ましい。上記ＭＤＲ１遺伝子における３箇所のＳＮＰとは、エクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目またはエクソン２６の３４３５番目の塩基の多型である。
【００１６】
エクソン１２の１２３６番目の塩基は、チミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、ＴＴ型、ＴＣ型およびＣＣ型の３タイプのＳＮＰが存在する。配列番号５のＤＮＡプローブは、エクソン１２の１２３６番目の塩基がシトシン（Ｃ）の場合に検出することができ、配列番号６のＤＮＡプローブは、エクソン１２の１２３６番目の塩基がチミン（Ｔ）の場合に検出することができる。したがって、配列番号５のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＣＣ型、配列番号６のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＴＴ型、配列番号５および６のＤＮＡプローブの両方で検出される場合はＣＴ型であると容易に検知することができる。
【００１７】
エクソン２１の２６７７番目のＳＮＰを検出することができる。エクソン２１の２６７７番目の塩基は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）もしくはチミン（Ｔ）であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、ＧＧ型、ＡＡ型、ＴＴ型、ＧＡ型、ＧＴ型およびＡＴ型の６タイプのＳＮＰが存在する。配列番号７のＤＮＡプローブは、エクソン２１の２６７７番目の塩基がグアニン（Ｇ）の場合に検出することができ、配列番号８のＤＮＡプローブは、エクソン２１の２６７７番目の塩基がアデニン（Ａ）の場合に検出することができ、配列番号９のＤＮＡプローブは、エクソン２１の２６７７番目の塩基がチミン（Ｔ）の場合に検出することができる。したがって、配列番号７のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＧＧ型、配列番号８のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＡＡ型、配列番号９のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＴＴ型、配列番号７および８のＤＮＡプローブで検出される場合はＧＡ型、配列番号７および９のＤＮＡプローブで検出される場合はＧＴ型、配列番号８および９のＤＮＡプローブで検出される場合はＡＴ型であると容易に検知することができる。
【００１８】
エクソン２６の３４３５番目の塩基は、チミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、ＴＴ型、ＴＣ型およびＣＣ型の３タイプのＳＮＰが存在する。配列番号１０のＤＮＡプローブは、エクソン２６の３４３５番目の塩基がチミン（Ｔ）の場合に検出することができ、配列番号１１のＤＮＡプローブは、エクソン２６の３４３５番目の塩基がシトシン（Ｃ）の場合に検出することができる。したがって、配列番号１０のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＣＣ型、配列番号１１のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＴＴ型、配列番号６および１０のＤＮＡプローブ、または配列番号１１のＤＮＡプローブで検出される場合はＣＴ型であると容易に検知することができる。
【００１９】
したがって、本発明の遺伝子多型検出キットは、少なくとも下記の（i）〜（v）の全てのプローブ群を含むものである。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号５のＤＮＡおよび配列番号６のＤＮＡからなる第３のプローブ群：
（iv）配列番号７のＤＮＡ、配列番号８のＤＮＡおよび配列番号９のＤＮＡからなる第４のプローブ群：
（v）配列番号１０のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第５のプローブ群。
【００２０】
本発明は、上記のＤＮＡプローブ群を、坦体表面上に物理的または化学的に固定されることで検出ストリップを含む。
坦体は、ビニル系ポリマーまたはポリエステル、より詳しくは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートもしくはニトロセルロースなどの有機材料、ガラスもしくはシリカなどの無機材料、金もしくは銀などの金属材料などが挙げられ、特に限定されるものではないが、成型加工性が容易である有機材料が好ましく、さらに好ましくは、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類である。これらの坦体は、発色法での検知において、その発色を見やすくするために白色であることが好ましい。
【００２１】
これらの坦体表面にＤＮＡプローブを物理的に固定化する方法として、例えば、ポリリジンなどのポリカチオン性の高分子を坦体表面に被覆することで、ポリアニオンであるＤＮＡプローブとの静電相互作用により、固定化の効率を上げることができる、また、プローブＤＮＡに無関係な塩基配列（ポリチミン鎖など）を付加し、ＤＮＡの分子量を増大させることにより固定化の効率をあげることもできる。さらに、担体表面がガラスなどの場合、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤など、担体表面が金などの場合、２−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで坦体表面を処理することで、ポリアニオンであるＤＮＡプローブとの静電相互作用により、固定化の効率が良くなることが知られている。
【００２２】
一方で、プローブＤＮＡに官能基を導入して化学的に固定化する方法としては、例えば、担体の材料がガラス、シリコンなどの無機材料の場合には、核酸検出用プローブの末端にトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基を修飾し、その溶液に２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することによることもできる。または、ガラス、シリコンなどの無機材料坦体上に、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することで、坦体の表面をアミノ化し、末端にカルボン酸を導入したプローブＤＮＡとアミノカップリング反応させることで、固定化する方法などがある。さらに、担体の材料が金、銀などの金属材料の場合、核酸検出用プローブの末端にチオール基、ジスルフィド基などの金属と結合可能な官能基を修飾し、その溶液に２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄し、固定化することができる。
【００２３】
また、合成されたＤＮＡプローブを固定するのでなく、リソグラフィー技術を利用して、望む配列を固定表面上で直接ＤＮＡプローブを合成する方法も知られており、本発明においてもこの方法も含む。
【００２４】
ＳＮＰの検出において十分な感度を有するために、予め検出すべきＳＮＰを含むＤＮＡを増幅する必要がある。核酸の増幅は、ヒトの生体試料から抽出されたＤＮＡを公知の方法、例えばＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法またはＩＣＡＮ法等により行うことができ、好適にはＰＣＲ法により行うことができる。
【００２５】
上記ＰＣＲ法に用いるプライマーは、ＶＤＲ遺伝子におけるエクソン２のＦｏｋ−Ｉ認識部位（ＧＧＡＴＧ）を含むＤＮＡおよび／または該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＦｏｋ−Ｉでは認識されない配列（ＧＧＡＣＧ）を含むＤＮＡを増幅することができれば特に限定されるものではないが、増幅すべき核酸の塩基数が１００〜４００塩基対、好ましくは１５０〜３００塩基対である。該プライマーは、市販されているＤＮＡ／ＲＮＡ合成機などによって合成することができ、その合成方法は限定されるものではない。本発明におけるＶＤＲ遺伝子におけるエクソン２のＦｏｋ−Ｉ認識部位（ＧＧＡＴＧ）を含むＤＮＡおよび／または該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＦｏｋ−Ｉでは認識されない配列（ＧＧＡＣＧ）を含むＤＮＡを増幅するプライマーとしては、配列番号１２および配列番号１３のＤＮＡが好ましい。
【００２６】
したがって、本発明の遺伝子多型検出キットは、少なくとも配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対を含んでなる。配列番号１２および１３のＤＮＡは、それぞれＶＤＲ遺伝子におけるエクソン２のＦｏｋ−Ｉ認識部位（ＧＧＡＴＧ）を含むＤＮＡおよび／または該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＦｏｋ−Ｉでは認識されない配列（ＧＧＡＣＧ）を含むＤＮＡを増幅するフォワードプライマーおよびリバースプライマーである。
【００２７】
さらに、本発明の遺伝子多型検出キットにおいてＥＲ遺伝子のＸｂａ−Ｉ多型を同時に検知する場合は、ＥＲ遺伝子におけるエクソン１およびエクソン２の間のイントロン領域におけるＸｂａ−Ｉ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）を有するＤＮＡおよび／または該Ｘｂａ−Ｉ認識部位の配列がＸｂａ−Ｉでは認識されない配列（ＴＣＣＡＧＡ）を含むＤＮＡを増幅できるプライマーを含むことが好ましい。該プライマーは、配列番号１４および配列番号１５のＤＮＡが好ましい。
【００２８】
したがって、本発明の遺伝子多型検出キットは、少なくとも以下の（i）および（ii）のＤＮＡを含んでなる。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群、配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第２のプライマー対。
ここで、配列番号１４および１５のＤＮＡは、それぞれＥＲ遺伝子におけるエクソン１およびエクソン２の間のイントロン領域におけるＸｂａ−Ｉ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）を有するＤＮＡおよび／または該Ｘｂａ−Ｉ認識部位の配列がＸｂａ−Ｉでは認識されない配列（ＴＣＣＡＧＡ）を含むＤＮＡを増幅するフォワードプライマーおよびリバースプライマーである。
【００２９】
さらに、本発明の遺伝子多型検出キットにおいてＭＤＲ１遺伝子のＳＮＰを検知する場合は、エクソン１２の１２３６番目の塩基、エクソン２１の２６７７番目の塩基およびエクソン２６の３４３５番目の塩基を含むＤＮＡを増幅できるプライマーを含むことが好ましい。該プライマーは、特に配列番号１６〜２１のＤＮＡが好ましい。
【００３０】
したがって、本発明における遺伝子多型検出キットは少なくとも下記の（i）〜（v）の全てを含む。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号５のＤＮＡおよび配列番号６のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１６のＤＮＡおよび配列番号１７のＤＮＡからなる第３のプライマー対：
（iv）配列番号７のＤＮＡ、配列番号８のＤＮＡおよび配列番号９のＤＮＡからなる第４のプローブ群、ならびに配列番号１８のＤＮＡおよび配列番号１９のＤＮＡからなる第４のプライマー対：
（v）配列番号１０のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第５のプローブ群、ならびに配列番号２０のＤＮＡおよび配列番号２１のＤＮＡからなる第５のプライマー対。
ここで、配列番号１６および１７のＤＮＡは、それぞれエクソン１２の１２３６番目の塩基を含むＤＮＡを増幅できるフォワードプライマーおよびリバースプライマーであり、配列番号１８および１９のＤＮＡは、それぞれエクソン２１の２６７７番目の塩基を含むＤＮＡを増幅できるフォワードプライマーおよびリバースプライマーであり、配列番号２０および２１のＤＮＡは、それぞれエクソン２６の３４３５番目の塩基を含むＤＮＡを増幅できるフォワードプライマーおよびリバースプライマーである。
【００３１】
上記ＰＣＲ法は公知の手法により核酸を増幅することができる。例えば、（１）２本鎖ゲノムＤＮＡを約９２〜９５℃、約３０秒〜１分間の反応条件で熱処理することにより１本鎖にする変性工程、該１本鎖ＤＮＡのそれぞれに約５０〜６５℃を約２０秒〜１分間の反応条件で、（２）少なくとも２種類の増幅プライマーを結合させることによりＰＣＲの反応開始点となる２本鎖部分を作製するアニール工程、（３）約７０〜７５℃を約２０秒〜５分間の反応条件でＤＮＡポリメラーゼを用いて反応させる鎖伸張工程の（１）〜（３）の工程を通常の方法により２０〜４０回繰り返すことで核酸を増幅することができる。
【００３２】
上記の方法によって増幅した核酸は、ＤＮＡプローブを固定化した坦体表面に接触させ、ＤＮＡハイブリダイゼーションにより反応させる。このハイブリダイゼーション反応によって目的のＤＮＡを検知する。検知の方法としては、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などを用いて検出することができ、これらの検出を容易に行うためには、リバースプライマーに標識したものを用いる。
【００３３】
上記検知方法の中で特に好ましいのは、比較的安価で容易に実施できるニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ  ｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）発色法である。具体的には、上記プライマーの３’または５’末端にアビジンを修飾したものを用いて、核酸を増幅する。５’にアビジンを有する増幅された核酸は、ＤＮＡハイブリダイゼーション後、ストレプイトアビジンに接触させることができ、次いでＮＢＴ、ＢＣＩＰと反応させることにより発光させることができる。
【００３４】
したがって、本発明は、配列番号１２〜２１のＤＮＡ、配列番号１２、１４、１６、１８および２０のＤＮＡ、または配列番号１３、１５、１７、１９および２１のＤＮＡに蛍光もしくはＲＩ標識を行う、または上記ＤＮＡの５‘末端にビオチンを修飾したプライマーを用いることが好ましい。
【００３５】
本発明の遺伝子多型キットを用いて検知された遺伝子多型から、ヒトのステロイド剤投与後の骨疾患（ステロイド性骨疾患）が起こる可能性を予想することができる。一般的に、
(a) ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型が、ＦＦおよびＦｆ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、ｆｆ型のヒトはＣＴおよびＴＴ型に比べて副作用が生じやすい。
(b) ＥＲ遺伝子のＸｂａ−Ｉ多型が、ｘｘ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、ＸＸおよびＸｘ型のヒトは他のＳＮＰに比べて副作用が生じやすい。
(c) ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目のＳＮＰが、ＣＴおよびＴＴ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、ＣＣ型のヒトはＣＴおよびＴＴ型に比べて副作用が生じやすい。
(d) ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１の２６７７番目のＳＮＰが、ＧＴ、ＧＡ、ＴＴ、ＴＡおよびＡＡ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、ＧＧ型のヒトは他のＳＮＰに比べて副作用が生じやすい。
(e) ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目のＳＮＰが、ＴＴ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、ＣＣ型およびＣＴ型のヒトはＴＴ型に比べて副作用が生じやすい。
と言われている。
【実施例】
【００３６】
以下に本発明を参考例および実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１：ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型の検出）
配列番号１および２に示されるＤＮＡプローブ（シグマジェノシスジャパン社提供）の５’末端をターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナル・トランスフェラーゼ（２０ｕｎｉｔ／μｌ）を４μｌ、チミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を１０μｌ、配列番号１もしくは２のＤＮＡプローブ（５０ｍＭ）を４μｌ、製品添付のＮＥＢｕｆｆｅｒ４を５μｌ、および製品添付のカコジル酸緩衝液を５μｌ含んだ精製水５０μｌを調製した後、３７℃で４時間反応させ、製品添付の２０＊ＳＳＣ緩衝液５０μｌを加えることで、ポリチミン付加された核酸プローブ２ｐｍｏｌ／μｌを得た。
その後、ポリチミン付加された配列番号１および２の核酸プローブは１．０ｐｍｏｌ／μｌとなるように、製品添付の１０＊ＳＳＣ緩衝液で希釈し、ポリエステル膜（４×０．４ｃｍ）上の別々の場所にそれぞれ０．５μＬずつ塗布し、３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して固定化することで、検出ストリップを作成した。
【００３８】
無作為に選んだ健常な日本人９人から血液を採取し、血球細胞を分画して、フェノール抽出法によりゲノムＤＮＡを抽出精製した。配列番号８に示された塩基配列を有するフォワードプライマーおよび９に示された塩基配列を有し、かつ５’末端にビオチンを結合させたリバースプライマー、およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いたＰＣＲ法によりＶＤＲ遺伝子におけるエクソン２のＦｏｋ−Ｉ認識部位（ＧＧＡＴＧ）を含むＤＮＡおよび／または該Ｆｏｋ−Ｉ認識部位の配列がＦｏｋ−Ｉでは認識されない配列（ＧＧＡＣＧ）を含むＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲの反応条件は、変性過程を９４℃、３０秒、アニール過程を５５℃、２０秒、鎖伸長過程を７２℃、２０秒とし、この工程を３０サイクルおこない増幅を行った。
【００３９】
増幅したＤＮＡ溶液２０μＬに、水酸化ナトリウム（５Ｍ）、エチレンジアミン四酢酸（０．０５Ｍ）の溶液（２０μＬ）を加えてよく攪拌し、５分間放置して、増幅したＤＮＡを1本鎖に変性した。この試料溶液中に、ドデシル硫酸ナトリウム（０．０１ｗ／ｖ％）、塩化ナトリウム（１．８ｗ／ｖ％）、クエン酸ナトリウム（１．０ｗ／ｖ％）の溶液（１ｍＬ）および上記検出ストリップ１枚を加え、反応温度４５℃のもとで３０分間振とうして反応させた。その後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、さらにニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ  ｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を加えて、検出ストリップ上の各プローブと結合した試料に結合したアルカリホスファターゼを発色させた（図１）。また、図１における結果の判定の基準となる模式図を表１に示す。
【００４０】
【表１】
2006014653.tif 000003
１：発色の確認マーカー
２：Ｆ型検出部位
３：ｆ型検出部位
●：発色
【００４１】
図１の結果から試料Ｎｏ．１〜９は、それぞれ表２に示す遺伝子多型（ＳＮＰ）を有すると判定した。
【００４２】
【表２】
2006014653.tif 000004
【００４３】
また、試料Ｎｏ．１〜９を別途でシーケンサーによるＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型を測定した結果は、表２の結果と一致することから、本発明の遺伝子多型検出キットおよび方法は非常に有用であることが示された。
【００４４】
（実施例２：５箇所のＳＮＰの同時検出）
次に、配列番号１〜１１のＤＮＡプローブを固定化した検出ストリップ上を作成した。実施例１と同じ日本人９人の血液から、ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型、ＥＲ遺伝子のＸｂａ−Ｉ多型、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目、エクソン２６の３４３５番目の５箇所のＳＮＰの同時検知を行った。ＰＣＲ法におけるプライマーは、配列番号１２〜２１を用い、実施例１同様の条件で行った。検出は、それぞれの増幅したＤＮＡの溶液を２０μＬとした以外は実施例１と同様とした。その結果を図２に示す。また、図２おける結果の判定の基準となる模式図を表３に示す。
【００４５】
【表３】
2006014653.tif 000005
１：発色の確認マーカー
２：ＭＤＲ１遺伝子３４３５番目のＣ型検出部位
３：ＭＤＲ１遺伝子３４３５番目のＴ型検出部位
４：ＭＤＲ１遺伝子２６７７番目のＧ型検出部位
５：ＭＤＲ１遺伝子２６７７番目のＴ型検出部位
６：ＭＤＲ１遺伝子２６７７番目のＡ型検出部位
７：ＭＤＲ１遺伝子１２３６番目のＣ型検出部位
８：ＭＤＲ１遺伝子１２３６番目のＴ型検出部位
９：ＥＲ遺伝子のＸ型検出部位
１０：ＥＲ遺伝子のｘ型検出部位
１１：ＶＤＲ遺伝子のＦ型検出部位
１２：ＶＤＲ遺伝子のｆ型検出部位
●：発色
【００４６】
また、図４の結果から試料Ｎｏ．１〜９は、それぞれ表４に示すＳＮＰを有すると判定した。ここで、ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型の結果は、実施例１と一致したことを確認した。
【００４７】
【表４】
2006014653.tif 000006
【００４８】
一方、ＥＲ遺伝子のＸｂａ−Ｉ多型、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目、エクソン２６の３４３５番目それぞれを検知する検出ストリップを実施例１に従って作成し、同９検体の各ＳＮＰを検出した（図３〜６）。その結果は、表４の結果と一致し、同時検出が可能であることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の遺伝子多型キットは、ＳＮＰを容易に検知することができ、ステロイド投与の後に将来人がステロイド性骨疾患になる可能性を予測できる。そして、ステロイド性骨疾患になる可能性が低い場合は、ステロイド剤を投与し、ステロイド性骨疾患になる可能性が高い場合は、服用を避けることが出来るため、患者への負担を軽減できるのと同時に、医師の責任の追及を問われるケースが少なくなる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＶＤＲ遺伝子のＦｏｋ−Ｉ多型の検出の結果である。
【図２】５種類のＳＮＰの同時検出の結果である。
【図３】ＥＲ遺伝子のＸｂａ−Ｉ多型の検出の結果である。
【図４】ＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目のＳＮＰの検出の結果である。
【図５】ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１の２６７７番目のＳＮＰの検出の結果である。
【図６】ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目のＳＮＰの検出の結果である。
【図１】
2006014653.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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