(57)【要約】    【課題】本発明は、複数の遺伝子配列の機能をハイスループット解析する方法に関する。具体的には、核酸配列を発光甲虫に由来する3種類の異なる発光酵素遺伝子を有するプラスミドベクターにクローニングし、解析用プラスミドベクターを構築するステップと、前記プラスミドベクターを一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞を用いて、核酸配列のプロモーター活性を測定するステップに関する。    【解決手段】標的遺伝子配列のクローニングに、Tプラスミドベクターを用いることで解析用プラスミドベクター構築のステップをハイスループット化する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の核酸配列の機能をハイスループット解析する方法であって、核酸配列を発光甲虫に由来する異なる発光酵素遺伝子を有する複数のプラスミドベクターの少なくとも１種にクローニングし、解析用プラスミドベクターを構築するステップと、前記プラスミドベクターを一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞を用いて、核酸配列のプロモーター活性を測定するステップを含む上記方法。
【請求項２】
複数の核酸配列の機能をハイスループット解析する方法であって、発光甲虫に由来する異なる発光波長スペクトルを有する発光酵素遺伝子を含む２種以上のTプラスミドベクターに２種以上の遺伝子配列を各々クローニングし、解析用プラスミドベクターを構築するステップと、前記プラスミドベクターを一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞を用いて、核酸配列のプロモーター活性を測定するステップを含む、方法。
【請求項３】
発光酵素遺伝子が、鉄道虫由来ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来ルシフェラーゼ、及びそれらの変異体からなる群より選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
発光甲虫に由来する少なくとも１種の発光酵素遺伝子が最大発光波長600nm以上を有する赤色発光酵素遺伝子であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
発光甲虫に由来する異なる発光波長スペクトルを有する少なくとも１種の発光酵素遺伝子は、定常発現プロモーターの制御下に置かれ、これ以外の２種類以上の発光酵素遺伝子は２種以上の核酸配列と連結されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
核酸配列が、発光甲虫に由来する発光酵素遺伝子を含むTプラスミドベクターにクローニングされることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
核酸配列が、発光甲虫に由来する発光酵素遺伝子を含むTプラスミドベクター及びDNAリガーゼを含むTAクローニングキットを使用してクローニングされることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
(A)  複数の標的遺伝子配列をPCR増幅する工程、（B）PCR増幅した各々の標的遺伝子配列をTAクローニング法にて発光甲虫に由来する異なる発光酵素遺伝子に連結し、解析用プラスミドベクターを構築する工程、（C）構築した解析用プラスミドベクターを宿主細胞に形質転換し、増殖させた後、解析用プラスミドベクターを抽出・精製する工程、（D）前記プラスミドベクターを一過性または安定発現するように哺乳類細胞へ導入する工程、（E）前記哺乳類細胞を用いて標的遺伝子配列のプロモーター活性を測定する工程を含むことを特徴とする、複数の標的遺伝子配列の機能をハイスループット解析する方法。
【請求項９】
上記(A)〜（E）工程の少なくとも１つが、オートメーションによって実施または支援されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の核酸配列の機能をハイスループット解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子解析は疾患研究において有用な技術であるが、これまでは少数の遺伝子マーカーの利用や比較的単純な遺伝子疾患の研究に限られていた。しかし、ヒトゲノムのドラフトシークエンス解読が完了し、複数遺伝子の関与する複雑な疾患や患者個人に対応した治療を行うための臨床診断法の開発、新規の医薬品ターゲット同定に関与する遺伝的要因の解析へと研究範囲は拡大している。
【０００３】
薬剤への反応は個人によって異なるが、こうした薬剤応答性の違いにも遺伝子が関与している。遺伝的要因が薬剤の効き目に影響するという臨床的知見は1950年代にはじめて報告され、これらの知見は統計的観察および薬物代謝に関する生化学的、分子生物学的な研究によって裏付けられている。医薬品および、その候補物質が薬剤応答性に関与する、もしくは関与が推測される遺伝子の発現に与える影響を解析し、理解を深めることは、副作用を最小限に抑えながら薬剤の効果の最適化をはかる上で非常に有効な手段である。
【０００４】
遺伝子発現制御機能を解析する手法として、レポーター遺伝子に連結されたシス作用性塩基配列要素（プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子発現制御配列或いはその候補）を含むベクターを適当な細胞に導入して、ある条件下において発現されるレポーター酵素の活性測定を行うレポーターアッセイが挙げられる。これまで、レポーター遺伝子として、大腸菌chloramphenicol acethyltransferase(CAT)、ヒトgrowth hormone、alkaline phosphatase、ホタル（Photinus Pyralis）ｌuciferase、大腸菌β-galactosidase、蛍光タンパク質（GFP）などが用いられてきたが、これらの中でluciferase遺伝子の発光を利用したシステムは感度が高く活性測定が簡便なことから、現在特に用いられている。
【０００５】
レポーターアッセイのサンプル間には、トランスフェクション効率、細胞死、細胞等によるバラツキなど、レポーターの発現量差をもたらす意図されていない要因が存在する。そのため、試験配列に連結されたレポーター遺伝子とあわせて、コントロールプロモーターに連結された基質特異性（反応性）の異なるレポーター分子を内部標準としてサンプル間を標準化する必要がある。このような場合を含め、2つ以上の遺伝子発現を同時に測定するには、上記の遺伝子を併用する、あるいは異なった基質特異性を示すウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase）を用いるなどの手段がとられて来た。
【０００６】
前記方法では、サンプル間を第２の内部標準用のレポータータンパク質活性で標準化し、サンプル間の第１のレポータータンパク質の活性を比較することによって、第１のレポーター遺伝子に連結されたシス作用性塩基配列要素の活性を解析する。しかしながら、このような比較では、複数のプロモーター活性の動態比較は間接的である。さらに、この比較の間には、実験操作のバラツキなどによる、擬陽性、擬陰性を含んでしまう可能性がある。
【０００７】
本発明者らは、特許文献1において、前記問題を克服した複数の核酸配列をより直接的に、かつ同時に比較解析するレポーターアッセイシステムとして、鉄道虫由来の赤色発光たんぱく質、イリオモテボタル由来の緑、橙色発光タンパク質を用いて、３つのプロモーター活性を同時に測定する方法を開示している。
【０００８】
遺伝子発現制御配列をレポーター遺伝子に連結する方法としては、制限酵素を用いたクローニングが用いられてきた。この方法を実施するためには、機能を調べたい遺伝子配列（標的遺伝子配列）の両端にプラスミドベクター中のマルチクローニング部位に存在する制限酵素認識配列と一致する配列が存在し、かつ遺伝子配列中には、同じ制限酵素認識配列が存在しないことが好ましい。標的遺伝子配列中に適当な制限酵素配列が存在しない場合には、リンカー等による制限酵素認識配列の付加、あるいは部位特異的変異導入法などによる不要な制限酵素認識配列の消去等の煩雑な操作が必要となる。しかし、これらの操作が標的遺伝子配列のプロモーター活性に影響を与える可能性もあり、好ましくない。特に、塩基配列が十分に分かっていない場合や、標的遺伝子配列の周辺配列がよく分からない場合に、クローニングに使用する制限酵素を決定し、実際にクローニングを行う際に、このような問題が生じやすい。
【０００９】
膨大な化学物質の中から、作用強度、安全性などに優れた新薬候補をスクリーニングするためには、複数の標的遺伝子をクローニング、あるいは１つずつ精査することが望ましいが、このような場合に前記方法では、目的の達成に多大な労力および時間を要する。
【特許文献１】WO2004/099421
【非特許文献１】Viviani V., Uchida, A., Suenaga, N., Ryufuku, M., and Ohmiya, Y.;Thr226 Is a Key Residue for Bioluminescene Spectra Determination in Beetle Luciferase.;Biochemical and Biophysical Research Communications. 2001;280, 1286-1291
【非特許文献２】Arashi-Heese, N., Miwa, M., and Shibata, H.;XcmI Site-Containing Vector for Direct Cloning and In Vitro Transcription of PCR Product.;Molecular Biotechnology 1999;12, 281-283
【非特許文献３】Zhou MY.,Gomez-Sanchez C.;Universal TA Cloning.;Curr. Issues Mol. Biol. 2000;2(1), 1-7
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、複数の遺伝子配列の機能をハイスループット解析する方法を提供することである。具体的には、１種または２種以上の核酸配列を発光甲虫に由来する3種類以上（例えば３〜５種類、好ましくは３種類または４種類）の異なる発光酵素遺伝子のいずれかを有するプラスミドベクターにクローニングし、解析用プラスミドベクターをハイスループット構築するステップと、前記プラスミドベクターの少なくとも１種（好ましくは少なくとも２種）を一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞を用いて、核酸配列のプロモーター活性を測定するステップを含む方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、核酸配列のクローニングに、Tプラスミドベクターを用いることで解析用プラスミドベクターを構築するステップのハイスループット化が可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
本発明は以下のような構成から成る。
１．  複数の核酸配列の機能をハイスループット解析する方法であって、核酸配列を発光甲虫に由来する異なる発光酵素遺伝子を有する複数のプラスミドベクターの少なくとも１種にクローニングし、解析用プラスミドベクターを構築するステップと、前記プラスミドベクターを一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞を用いて、核酸配列のプロモーター活性を測定するステップを含む上記方法。
２．  複数の核酸配列の機能をハイスループット解析する方法であって、発光甲虫に由来する異なる発光波長スペクトルを有する発光酵素遺伝子を含む２種以上のTプラスミドベクターに２種以上の遺伝子配列を各々クローニングし、解析用プラスミドベクターを構築するステップと、前記プラスミドベクターを一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞を用いて、核酸配列のプロモーター活性を測定するステップを含む、方法。
３．  発光酵素遺伝子が、鉄道虫由来ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来ルシフェラーゼ、及びそれらの変異体からなる群より選択される項１または２に記載の方法。
４．  発光甲虫に由来する少なくとも１種の発光酵素遺伝子が最大発光波長600nm以上を有する赤色発光酵素遺伝子であることを特徴とする項１または２に記載の方法。
５．  発光甲虫に由来する異なる発光波長スペクトルを有する少なくとも１種の発光酵素遺伝子は、定常発現プロモーターの制御下に置かれ、これ以外の２種類以上の発光酵素遺伝子は２種以上の核酸配列と連結されていることを特徴とする項１〜４のいずれかに記載の方法。
６．  核酸配列が、発光甲虫に由来する発光酵素遺伝子を含むTプラスミドベクターにクローニングされることを特徴とする項１〜５のいずれかに記載の方法。
７．  核酸配列が、発光甲虫に由来する発光酵素遺伝子を含むTプラスミドベクター及びDNAリガーゼを含むTAクローニングキットを使用してクローニングされることを特徴とする項１〜６のいずれかに記載の方法。
８．  (A)  複数の標的遺伝子配列をPCR増幅する工程、（B）PCR増幅した各々の標的遺伝子配列をTAクローニング法にて発光甲虫に由来する異なる発光酵素遺伝子に連結し、解析用プラスミドベクターを構築する工程、（C）構築した解析用プラスミドベクターを宿主細胞に形質転換し、増殖させた後、解析用プラスミドベクターを抽出・精製する工程、（D）前記プラスミドベクターを一過性または安定発現するように哺乳類細胞へ導入する工程、（E）前記哺乳類細胞を用いて標的遺伝子配列のプロモーター活性を測定する工程を含むことを特徴とする、複数の標的遺伝子配列の機能をハイスループット解析する方法。
９．  上記(A)〜（E）工程の少なくとも１つが、オートメーションによって実施または支援されることを特徴とする、項８に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明を実施することにより、迅速及び／また複数の標的遺伝子配列をレポーター遺伝子（発光甲虫に由来する発光酵素遺伝子）に連結した解析用プラスミドベクターを構築することが可能となる。さらに、前記プラスミドベクターを用いて、迅速及び／また複数の標的遺伝子配列の遺伝子制御機能を解析することが可能となる。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、(i)TAクローニングによるクローニングの簡便化、(ii)複数（２種以上）の発光酵素遺伝子を用いることによる複数の核酸配列の同時評価、の2点によって解析のハイスループット化を実現できた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は複数の遺伝子配列（核酸配列）の機能をハイスループット解析する方法である。具体的には、核酸配列を発光甲虫に由来する3種類以上の異なる発光酵素遺伝子を有する３種類以上のプラスミドベクターの少なくとも１種類（好ましくは少なくとも２種類）にクローニングし、解析用プラスミドベクターをハイスループット構築するステップと、前記プラスミドベクターを一過性または安定発現するように導入された哺乳類細胞を用いて、核酸配列のプロモーター活性を測定するステップを含む方法である。
【００１６】
レポーター遺伝子は、発光甲虫由来の異なる発光波長スペクトルを有する３種類またはそれ以上（３種類、４種類、または５種類、好ましくは３〜４種類）の発光酵素遺伝子を用いることが好ましく、それらは鉄道虫由来ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来ルシフェラーゼ、およびそれらの変異体からなる群より選択されることが好ましい。なお、３種類またはそれ以上の発光酵素遺伝子のうち少なくとも１種は最大発光波長600nm以上を有するルシフェラーゼであることが好ましい。発光甲虫由来のルシフェラーゼとしては、ホタル科、ホタルモドキ科、コメツキ科、ヒカリコメツキ科、イリオモテボタル科が挙げられる。中でも、ホタルモドキ科鉄道虫、とりわけPhrixothrix hirtus由来の赤色発光ルシフェラーゼを含むものが好ましい。前記ルシフェラーゼは現在までに見つかっている赤色ルシフェラーゼの中では最長の630nm付近に最大発光波長を有し、発光スペクトルはpHに対して安定である（非特許文献1）。
【００１７】
本発明における「核酸配列」とは、シス作用性塩基配列要素（プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子発現制御配列）、あるいはその可能性があると考えられる塩基配列である。Herpes simplex virus thymidine kinase (HSVｔｋ) 由来のプロモーターやCytomegalovirus (CMV) 由来のプロモーターの最小単位に連結されたシス作用性塩基配列であってもよい。前記プロモーターは、哺乳類またはウイルスのゲノムDNA、RNA、ライブラリーなどからクローニングされる。
【００１８】
３種類またはそれ以上の異なる発光酵素遺伝子の少なくとも１種類は、定常発現プロモーターに連結されるのが好ましい。定常発現プロモーターに連結されたレポータータンパク質（発光酵素）の活性は、サンプル間のトランスフェクション効率、細胞数、細胞の生育状態のバラツキを標準化するために用いることが望ましい。定常発現プロモーターとしては、ウイルス由来のHSVtkプロモーター、CMVプロモーター、SV40プロモーター、哺乳類細胞由来のハウスキーピング遺伝子プロモーターなどが用いられる。
【００１９】
標的遺伝子配列を得るために用いられる一般的な方法として、哺乳類またはウィルスのゲノムDNA、RNA、ライブラリーなどを鋳型としたPCR（Polymerase Chain Reaction）法が挙げられる。PCR法は試験管内で特定のDNA断片を指数関数的に増幅させることができる方法であり、耐熱性DNAポリメラーゼを用いることで可能となる。
【００２０】
代表的な耐熱性DNAポリメラーゼであるPolI型DNAポリメラーゼ、または、これを含む混合型DNAポリメラーゼを用いてPCR増幅されたDNA断片の多くは3’端にデオキシアデニン（dA）の突出を持つという特徴がある。DNA断片を挿入したいプラスミドベクターの3’端にdTの突出を作り、Tプラスミドベクター化することで、dAとdTの相補性を利用したクローニングが可能となる。この方法をTAクローニング法と言い、遺伝子配列のクローニング法として広く用いられている。
【００２１】
Tプラスミドベクター化の方法としては、XcmI、MboII、HphI、MnlI、AhdI、Eam1105Iなどの3’端に1塩基突出末端作製可能な制限酵素を用いて、3’dT突出末端を作製する方法（非特許文献2）と、AluI、DpnI、RsaI、AfeI、DraI、EcoRV、HaeIIIなどの平滑末端を作製可能な制限酵素で処理した後、Taq DNAポリメラーゼ、あるいはターミナルデオキシトランスフェラーゼのようなDNA断片の3’端へ塩基を付加する活性を有する酵素を用いて、3’dT突出末端を作製する方法（非特許文献3）が挙げられる。
【００２２】
PolI型DNAポリメラーゼとともに汎用されているα型DNAポリメラーゼによってPCR増幅されたDNA断片は3’端にdA突出を持たない平滑末端型DNA断片であるが、3’端にdAの突出を作製する処理を行うことでTAクローニング法によるクローニングは可能となる。
【００２３】
α型DNAポリメラーゼによりPCR増幅されたDNA断片の3’端にdA突出を作製する方法としては、Taq DNAポリメラーゼ、あるいはターミナルデオキシトランスフェラーゼのような遺伝子配列の3’端へ塩基を付加する活性を有する酵素で処理する方法が挙げられる。
【００２４】
TAクローニングを実施する際には、TプラスミドベクターのdTと標的遺伝子配列のdAを連結する酵素であるT4 DNAリガーゼが必要となる。より簡便かつ迅速にTAクローニングを行うため、TプラスミドベクターおよびT4 DNAリガーゼは、これらを含むTAクローニングキットとして供給されることが好ましい。また、前記キットにはT4 DNAリガーゼによる連結反応（ライゲーション反応）に適した組成の緩衝液、さらに、平滑末端型DNA断片の3’端にdAを付加する物質が含まれていてもよい。
【００２５】
本発明は（A）プロモーターなどの標的遺伝子配列（核酸配列）をPCR増幅すること、（B）PCR増幅した標的遺伝子配列をTAクローニング法にてレポーター遺伝子（発光甲虫に由来する発光酵素遺伝子）に連結し、解析用プラスミドベクターを構築すること、（C）構築した解析用プラスミドベクターを適当な宿主細胞に形質転換し、増殖させた後、解析用プラスミドベクターを抽出・精製すること、（D）前記プラスミドベクターを一過性または安定発現するように哺乳類細胞へ導入すること、（E）前記哺乳類細胞を用いて核酸配列のプロモーター活性を測定すること、を含んでなり、上記ステップの少なくとも１つが、オートメーションによって実施または支援されることが好ましい。
【００２６】
上記(A)〜(E)の工程は、ウェルを有するプレート上で全ての操作を行うことができるため、自動化に適しており、ハイスループット解析に適している。
【００２７】
解析した結果は、創薬などに利用されうる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
実施例１  ｃ−fosプロモーターのクローニング
ヒトゲノムDNA 20 ngを鋳型として、オリゴヌクレオチド1、2（PRORIGO）（配列番号1 、2）を用いて、5% DMSO存在下でc-fosプロモーターをKOD -Plus-（東洋紡績）によりPCR増幅した。SLR TA Cloning Kit for KOD（東洋紡績）を用いて、増幅断片と赤色発光ルシフェラーゼベクターpSLR-Tを連結した(pSLR-cfos1)。
実施例２  変異型（欠失型）ｃ−fosプロモーターのクローニング
pSLR-cfosを鋳型として、オリゴヌクレオチド3（PRORIGO）（配列番号3）及び2を用いて、KOD -Plus-(東洋紡績)によりPCR増幅した。SLO TA Cloning Kit for KOD（東洋紡績）を用いて、増幅断片と橙色発光ルシフェラーゼベクターpSLO-Tを連結した(pSLO-cfos2)。
実施例３  CHO-K1細胞へのトランスフェクション及び培養
CHO-K1細胞1×105 cellずつを12ウェルプレートへ播種し、Ham’s F12（日水製薬）＋10% FCS 中で培養した。翌日、各ウェルにpSLG-HSVtk 0.1μg（定常発現プロモーター制御下に緑色発光ルシフェラーゼを連結したベクター、東洋紡績）、pSLR-cfos1 0.5μg、pSLO-cfos2 0.4μg を100μl Opti-MEM(GIBCO)で希釈された3μl GeneJuice(Novagen社)と混合し、無血清培地Ham’s F12中でトランスフェクションした。翌日、未処理、1μM PMA (TPA、Sigma)、10% FCSを加え、さらに3時間培養した。
実施例４  ルシフェラーゼ活性測定
細胞をPBS(-)でリンス後、ピッカジーン細胞溶解剤Lcβ（東洋インキ）で細胞を溶解し、発光基質（東洋インキ）を加え、緑色、橙色、赤色発光ルシフェラーゼの相対発光量を光分離機能付きルミノメーター、AB-2250型ルミネッセンサーMCA（アトー社）を用いて測定した。図2は、緑色ルシフェラーゼの相対発光量をもとにサンプル間を標準化し、未処理サンプルを1として、赤色ルシフェラーゼ（SLR）、橙色ルシフェラーゼ(SLO)の相対比を示したグラフであり、正常型プロモーターでは血清やPMAの添加に対する応答性が認められる同一サンプル内で、変異型（欠失型）プロモーターでは応答性が消失していることを示唆するグラフである。
実施例5  annexin6プロモーターのクローニング
ヒトゲノムDNA 20 ngを鋳型として、オリゴヌクレオチド4、5（PRORIGO）（配列番号4、5）を用いて、5% DMSO存在下でannexin6プロモーターをKOD -Plus-（東洋紡績）によりPCR増幅した。SLR TA Cloning Kit for KOD（東洋紡績）を用いて、増幅断片と赤色発光ルシフェラーゼベクターpSLR-Tを連結した(pSLR-annexin6)。
実施例６  CHO-K1細胞へのトランスフェクション及び培養
CHO-K1細胞1×105 cellずつを12ウェルプレートへ播種し、Ham’s F12（日水製薬）＋10% FCS 中で培養した。翌日、各ウェルにpSLG-HSVtk 0.1μg（定常発現プロモーター制御下に緑色発光ルシフェラーゼを連結したベクター、東洋紡績）、pSLR-annexin6 0.5μg、pSLO-cfos 0.4μg を100μl Opti-MEM(GIBCO)で希釈された3μl GeneJuice(Novagen社)と混合し、無血清培地Ham’s F12中でトランスフェクションした。翌日、未処理、10% FCSを加え、さらに3時間培養した。
実施例７  ルシフェラーゼ活性測定
細胞をPBS(-)でリンス後、ピッカジーン細胞溶解剤Lcβ（東洋インキ）で細胞を溶解し、発光基質（東洋インキ）を加え、緑色、橙色、赤色発光ルシフェラーゼの相対発光量を光分離機能付きルミノメーター、AB-2250型ルミネッセンサーMCA（アトー社）を用いて測定した。図3は、緑色ルシフェラーゼの相対発光量をもとにサンプル間を標準化し、未処理サンプルを1として、赤色ルシフェラーゼ（SLR）、橙色ルシフェラーゼ(SLO)の相対比を示したグラフであり、血清刺激応答型c-fosプロモーター(SLO)では血清の添加に対する応答性が認められる同一サンプル内で、血清刺激応答エレメントを含まない非応答型annexin-6プロモーターでは応答性が消失していることを示唆するグラフである。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
薬剤応答遺伝子などをクローニングすることでレポーターアッセイによる薬剤スクリーニング、未知試料中の刺激因子の存在の有無の検査などへの利用が可能であり、創薬などの産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】正常型c-fosプロモーター、欠失型c-fosプロモーターの配列上の比較図である。
【図２】緑色ルシフェラーゼの相対発光量をもとにサンプル間を標準化し、未処理サンプルを1として、赤色ルシフェラーゼ（SLR）、橙色ルシフェラーゼ(SLO)の相対比を示したグラフであり、正常型c-fosプロモーターでは血清やPMAの添加に対する応答性が認められる同一サンプル内で、多型（欠失型）プロモーターc-fos2では応答性が消失していることを示唆するグラフである。
【図３】緑色ルシフェラーゼの相対発光量をもとにサンプル間を標準化し、未処理サンプルを1として、赤色ルシフェラーゼ（SLR）、橙色ルシフェラーゼ(SLO)の相対比を示したグラフであり、血清刺激応答型c-fosプロモーター(SLO)では血清の添加に対する応答性が認められる同一サンプル内で、血清刺激応答エレメントを含まない非応答型annexin-6プロモーターでは応答性が消失していることを示唆するグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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