(57)【要約】【課題】  哺乳動物由来のものよりも信頼性が高く、かつ、資源の有効利用に貢献することが可能な、新規なトリプシンとその代表的な利用技術とを提供する。【解決手段】  本発明にかかるポリペプチドは、トリプシン活性を有しており、Ｃａ2+を必要とせず、最適温度が５０℃付近である。このポリペプチドはイトマキヒトデの幽門盲のうから見出され、２６４残基のアミノ酸からなり、成熟型トリプシンは２３７残基のアミノ酸からなる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプシン活性を有するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
トリプシン活性を有するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
トリプシン活性を有するポリペプチドであって：
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または、
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターを導入してなる形質転換体。
【請求項７】
請求項４に記載のポリヌクレオチドにおける少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いる遺伝子検出器具。
【請求項８】
請求項１〜３の何れか１項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項９】
請求項１〜３の何れか１項に記載のポリペプチドを含有する薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規トリプシンおよびその代表的な利用に関するものであり、具体的には、イトマキヒトデの幽門盲のう由来の新規トリプシンと、この新規トリプシンの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
トリプシンは、トリプシノーゲンとして膵臓腺房細胞において合成され、膵管を通り十二指腸に分泌され、限定分解により活性型トリプシンとなる。トリプシンは膵臓で生合成される他の消化酵素前駆体型を活性化型に変換することから、消化におけるkey enzymeとして位置付けられる。それゆえ、トリプシンは古くから研究されている酵素であり、かつ、構造および機能に関する分子レベルでの研究が最も進んでいる酵素の一つである。
【０００３】
上記トリプシンの用途としては、各種生化学用の試薬等として広く用いられているだけでなく、医薬・医療用途にも用いられている。具体的には、トリプシンは膵臓特異性が高いため、急性膵炎、慢性膵炎、膵臓癌等の膵臓疾患が疑われる場合には、これら疾患の鑑別に利用されている。また、トリプシンをブロメラインと混合した酵素製剤は、製品名キモタブ（登録商標）として炎症による腫れを和らげる治療薬として用いられている。
【０００４】
これまで市販されているトリプシンとしては、ウシ膵臓、ブタ膵臓、ヒト膵臓由来のものが存在する。また、海産生物由来のトリプシンとしては、カペリン（非特許文献１参照）、カタクチイワシ（非特許文献２参照）、大西洋タラ（非特許文献３参照）、大西洋サケ（４参照）由来のものが知られている。これらは何れも寒冷な地域に生息可能な魚類（低温適応魚）であり、これら低温適用魚のトリプシンは、哺乳動物トリプシンより触媒活性が高いことが示されている。
【０００５】
ところで、ヒトデ類は養殖ホタテガイやカキの食害生物として問題となっており、北海道だけでも年間約５０００トンのヒトデ類が駆除されている。駆除されたヒトデ類は肥料として一部が利用されている程度で、その大部分は未利用の状態にある。つまり、ヒトデ類は重要な未利用のバイオマスであるため、例えば有用成分の回収等のように利用分野を開拓することが求められている。
【０００６】
ここで、本発明者らは、ヒトデ類の一種であるイトマキヒトデについて研究した結果、イトマキヒトデの幽門盲のう由来トリプシンが独特の性質を有していることを独自に見出している（非特許文献５・６参照）。具体的には、イトマキヒトデの幽門盲のう由来トリプシンは、酵素の活性化および安定性にＣａイオンを必要としていないため、脊椎動物トリプシンとはその性質を異にしている。また、本発明者らは、上記トリプシンのＮ末端アミノ酸配列についても検討している（非特許文献７参照）。
【非特許文献１】Hjelmeland and Raa, Comp.Biochem.Physiol., 71B, 557-562, 1982
【非特許文献２】Martinez and Serra, Comp.Biochem.Physiol., 93B, 61-66 1989
【非特許文献３】Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem., 180, 85-94, 1989
【非特許文献４】Smalas et al., Proteins, 20, 149-166, 1994
【非特許文献５】H. Kishimura & K. Hayashi; Comp.Biochem.Physiol. 132B, 485-490, 2002
【非特許文献６】岸村，林：日本水産学会誌，55(8), 1415-1420, 1989
【非特許文献７】H. Kishimura & K. Hayashi; Fisheries Science, 69, 867-869, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記哺乳動物由来のトリプシンは、近年、牛海綿状脳症の影響から哺乳動物の臓器を由来とする成分は敬遠される傾向にあるため、利用は困難な状況となっている。それゆえ、哺乳動物の臓器等を由来としない、より信頼性の高いトリプシンの開発が期待されている。
【０００８】
一方、上述した低温適用魚由来のトリプシンは、当該低温適用魚が食用に代表されるように海洋資源として広く利用されているため、哺乳動物由来のものに比べるとより信頼性が高い。ただし、近年、世界的に見て海洋魚類の乱獲、およびそれを一因とする漁獲量の減少が一部で問題化しつつある。例えば、上記カタクチイワシやマイワシは乱獲による資源量の減少が報告されている海洋魚類の一つとして挙げることができる。
【０００９】
それゆえ、上記ヒトデ類のように、未だ資源として利用されていないバイオマスからトリプシンを取得することが可能となれば、信頼性が高く、かつ、資源を有効利用することができるため、非常に好ましいと考えられる。しかしながら、ヒトデ類に代表されるような未利用のバイオマスからトリプシンを有効に取得する技術はこれまで知られていなかった。
【００１０】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、哺乳動物由来のものよりも信頼性が高く、かつ、資源の有効利用に貢献することが可能な、新規なトリプシンとその代表的な利用技術とを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ヒトデ類の一種であるイトマキヒトデにおいて、トリプシン活性を有するポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチドを初めて見出すことに成功し、この知見に基づいて、バイオマスとしてのイトマキヒトデの利用だけでなく、分子生物学的な技術を利用した信頼性の高いトリプシンの生産にも道筋をつけることを可能にし、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のポリペプチドを包含する。
（１）トリプシン活性を有するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなることを特徴とするポリペプチド。
（２）トリプシン活性を有するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることを特徴とするポリペプチド。
（３）トリプシン活性を有するポリペプチドであって：
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または、
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることを特徴とするポリペプチド。
【００１３】
また、本発明には、上記何れかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、当該発現ベクターを導入してなる形質転換体、上記ポリヌクレオチドにおける少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いる遺伝子検出器具、上記ポリペプチドに特異的に結合する抗体、上記ポリペプチドを含有する薬学的組成物も包含される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明では、以上のように、これまで知られていない新規なアミノ酸配列を有するポリペプチドと、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを見出したものである。特に、本発明にかかるポリペプチドは、これまでに知られているウシ膵臓由来トリプシンのものとは異なるアミノ酸配列を有しており、最適温度が哺乳動物トリプシンよりも低いだけでなく、トリプシン活性を発揮するためにＣａイオンを必要としないことが明らかとなった。それゆえ、本発明では、これまでに無い新規かつ信頼性の高いトリプシンを提供できるとともに、バイオマスとして利用されていなかったヒトデ類を有効に利用することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１６】
〔１〕ポリペプチド
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明にかかるポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え的に生成されてもよい。
【００１７】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００１８】
本発明にかかるポリペプチドは、天然の精製産物、および真核生物宿主（例えば、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明にかかるポリペプチドは、グリコシル化され得る。さらに、本発明にかかるポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００１９】
本発明にかかるポリペプチドとしては、トリプシン活性を有し、公知のトリプシンに存在するＣａ2+結合に関与するアミノ酸残基が置換または欠失しており、さらに、最適温度が５０℃付近であるポリペプチドを挙げることができる。このポリペプチドはイトマキヒトデの幽門盲のう由来であり、好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列を有している（後述する実施例参照）。本明細書中で使用される場合、「トリプシン活性」は、タンパク質中のＡｒｇまたはＬｙｓのカルボキシ末端側のペプチド結合を特異的に分解する活性が意図される。
【００２０】
一実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。このポリペプチドは、後述するように配列番号１に示されるアミノ酸配列においてシグナル配列を除いた成熟型のトリプシンである（実施例参照）。
【００２１】
別の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありかつトリプシン活性を有するポリペプチドが好ましい。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、配列番号２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされ、シグナル配列（配列番号２に示される塩基配列の１〜８１位によってコードされる配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜２７位）を含む。トリプシン活性を有する成熟型のポリペプチドは、当該シグナル配列が切断された形態（配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）であるが、本明細書中で使用される場合、「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」に包含される。
【００２３】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかしながら通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００２４】
ポリペプチドのアミノ酸配列中においていくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に対して有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００２５】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明にかかるポリペプチドのトリプシン活性を変化させない。
【００２６】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸を別のアミノ酸へ置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００２７】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Bowie, J.U.ら「Deciphering the Message in Protein Sequences：Tolerance to Amino Acid Substitutions」，Science 247：1306-1310 (1990)（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【００２８】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法（変異誘発法）に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のトリプシン活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００２９】
それゆえ、本実施形態にかかるポリペプチドとしては、トリプシン活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなるポリペプチドであることが好ましい。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００３０】
他の局面において、本実施形態にかかるポリペプチドは、トリプシン活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【００３１】
別の局面において、本実施形態にかかるポリペプチドは、トリプシン活性を有するポリペプチドであって、
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【００３２】
ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。
【００３４】
さらに別の局面において、本実施形態にかかるポリペプチドは、トリプシン活性を有するポリペプチドであって、
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【００３５】
例えば、「本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照（QUERY）塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」によって，対象塩基配列が、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり５つまでの不一致（mismatch）を含み得ることを除いて、参照配列に同一である、ということが意図される。換言すれば、参照塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドを得るために、参照配列における塩基の５％までが、欠失され得るかまたは別の塩基で置換され得るか、あるいは参照配列における全塩基の５％までの多くの塩基が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの不一致は、参照塩基配列の５’または３’末端位置または参照配列における塩基中で個々にかまたは参照配列内の１以上の隣接した群においてのいずれかで分散されて、これらの末端部分の間においてどこでも起こり得る。この参照配列は、本明細書中で記載されるように、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、改変体、誘導体またはアナログであり得る。
【００３６】
任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号３に示される塩基配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix（登録商標）, Genetics Computer Group, University Research Park，575 Science Drive, Madison, WI 53711)）を使用して決定され得る。Bestfitは、SmithおよびWatermanの局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も良好な相同性セグメントを見出す（Advances in Applied Mathematics 2：482-489 (1981)）。Bestfitまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定する場合は、同一性のパーセントが参照塩基配列の全長にわたって計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
【００３７】
特定の実施形態では、参照（QUERY）配列（本発明にかかる配列）と対象配列との間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Brutlagらのアルゴリズム（Comp. App. Biosci. 6：237-245 (1990)）に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。％同一性を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Matrix＝Unitary、k-tuple＝４、Mismatch Penalty＝１、Joining Penalty＝３０、Randomization Group Length＝０、Cutoff Score＝１、Gap Penalty＝５、Gap Size Penalty＝０．０５、Window Size＝５００または対象塩基配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態にしたがって、対象配列が、５’または３’欠失に起因して（内部の欠失が理由ではなく）QUERY配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを算定する場合に、対象配列の５’短縮化および３’短縮化を考慮しないという事実を考慮して、手動の補正が結果に対してなされる。QUERY配列と比較して５’末端または３’末端が短縮化された対象配列については、同一性パーセントは、一致／整列していない、対象配列の５’および３’であるQUERY配列の塩基数を、QUERY配列の総塩基のパーセントとして計算することにより補正される。ヌクレオチドが一致／整列しているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。
【００３８】
次いで、このパーセントが、指定されたパラメーターを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的で使用されるものである。QUERY配列と一致／整列していない対象配列の５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、ＦＡＳＴＤＢ整列に示されるように、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で計算される。
【００３９】
例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩基のQUERY配列と整列される。その欠失は、対象配列の５’末端で生じ、したがってＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端における最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（整合していない５’末端および３’末端での塩基の数／QUERY配列中の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全に整合する場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００塩基のQUERY配列と比較される。
【００４０】
この場合、その欠失は内部欠失であり、そのためQUERY配列と整合／整列しない対象配列の５’末端または３’末端の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再度、QUERY配列と整合／整列しない対象配列の５’末端および３’末端の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。
【００４１】
さらなる実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、糖鎖が付加されていることが好ましい。本実施形態にかかるポリペプチドは、特定の糖鎖が付加されていることによって、物理化学的に安定でありかつ生物活性が高い。好ましい糖鎖としては、ハイマンノース型Ｎ結合、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ、シアル酸、またはβ結合ガラクトースが挙げられる。
【００４２】
本発明にかかるポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００４３】
また、本発明にかかるポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００４４】
また、本発明にかかるポリペプチドは、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製されてもよい。
【００４５】
他の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明にかかるポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。
【００４６】
本実施形態にかかるポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）にＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Qiagen, Inc.）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：821-824 (1989) （本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Wilsonら、Cell 37：767 (1984) （本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態にかかるポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
【００４７】
別の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されてもよい。
【００４８】
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行うことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行うことができる。
【００４９】
このように、本発明にかかるポリペプチドは、トリプシン活性を有するポリペプチドであって、少なくとも、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるかまたはその活性を保持した変異体であればよいといえる。すなわち、上記ポリペプチドと特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とが連結されたポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、上記ポリペプチドと特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とは、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。
【００５０】
つまり、本発明の目的は、トリプシン活性を有する新規なポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるトリプシン活性を有するポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００５１】
〔２〕ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
１つの局面において、本発明は、トリプシン活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号３に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号３の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。なお、本明細書中では、略号等と明確に区別する目的で、適宜、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴのヌクレオチドについて正式名称を付記する場合がある（例えば、Ａ（アデニン）等）。
【００５２】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００５３】
また本発明にかかるポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに融合され得る。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個（または数百個以上）結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、合成されてもよい。
【００５５】
本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、例えば、配列番号３に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号３に示される塩基配列が提供されるので、当業者は、配列番号３に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Applied Biosystems Incorporated (ABI, 850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404) ３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【００５６】
別の局面において、本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体にハイブリダイズすることが好ましい。「変異体」は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上における所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００５７】
別の局面において、本発明は、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体のフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００５８】
本発明にかかるオリゴヌクレオチドがトリプシン活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、本発明にかかるポリヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして本発明にかかるポリペプチドを作製するために使用され得ることを容易に理解する。本発明にかかるポリペプチドをコードしない本発明にかかるオリゴヌクレオチドの他の用途としては、以下が挙げられる：（ｉ）ｃＤＮＡライブラリー中のトリプシン遺伝子またはその対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離；（ii）トリプシン遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Vermaら，Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988) に記載される）；および（iii）特定の組織におけるトリプシン遺伝子のｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。
【００５９】
本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術によって、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察される。本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００６０】
本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法としては、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離する種々の公知の方法が挙げられる。例えば、本発明にかかるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製して、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすれば、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得することができる。このようなプローブとしては、本発明にかかるポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）であればよい。このようなハイブリダイゼーションによって選択されるポリヌクレオチドとしては、天然のポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。
【００６１】
本発明にかかるポリヌクレオチドを取得する別の方法として、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。このＰＣＲ増幅方法は、例えば、本発明にかかるポリヌクレオチドのｃＤＮＡの５’側および／または３’側の配列（またはその相補配列）を利用してプライマーを調製する工程、これらのプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等をテンプレートにしてＰＣＲ増幅する工程を包含することを特徴としており、本方法を使用すれば、本発明にかかるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
【００６２】
本発明にかかるポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物体としては、ヒトデ類、特にイトマキヒトデ（学名：Asterina pectinifera）を挙げることができ、より具体的には、ヒトデ類の場合、例えば、幽門盲のうのような生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。
【００６３】
本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いれば、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出することによって、トリプシン活性を有するポリペプチドを発現する生物を容易に検出することができる。
【００６４】
本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、トリプシン活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたはトリプシン活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、トリプシン活性を有するポリペプチドを発現する生物または組織を容易に検出することができる。なお、さらに、上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用して、上記生物体またはその組織もしくは細胞におけるトリプシン活性を有するポリペプチドの発現を抑制することができる。
【００６５】
つまり、本発明の目的は、トリプシン活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるトリプシン活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００６６】
〔３〕本発明にかかるポリペプチドまたはポリヌクレオチドの利用
（Ａ）ベクター
本発明は、トリプシン活性を有するポリペプチドを産生するために使用されるベクターを提供する。本発明にかかるベクターは、上述した本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば特に限定されるものではなく、公知の発現ベクター等を用いることができる。また、例えば、トリプシン活性を有するポリペプチド（シグナル配列を含んでも含まなくてもよい）をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００６７】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明にかかるポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明にかかるポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００６８】
本発明にかかる発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法にしたがって行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法にしたがって行うことができる。
【００６９】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）にしたがって、目的タンパク質を回収、精製することができる。
【００７０】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはネオマイシン、Zeocin、ジェネティシン、ブラストシジンＳ、ハイグロマイシンＢなどの薬剤耐性遺伝子、およびE. coliおよび他の細菌における培養については、カナマイシン、Zeocin、アクチノマイシンＤ、セフォタキシム、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリンまたはアンピシリンなどの薬剤耐性遺伝子が挙げられる。
【００７１】
上記選択マーカーを用いれば、本発明にかかるポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明にかかるポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）をマーカーとして用い、本発明にかかるポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
【００７２】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、線虫（Caenorhabditis elegans）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞、動物細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびBowes黒色腫細胞）などを挙げることができる。
【００７３】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明にかかるポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【００７４】
本発明にかかるベクターを使用して上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入すれば、当該生物または細胞中にトリプシン活性を有するポリペプチドを発現させることができる。
【００７５】
なお、本発明の目的は、本発明にかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得した発現ベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００７６】
（Ｂ）形質転換体
本発明は、上述したトリプシン活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。
【００７７】
本発明にかかる形質転換体は、上述したトリプシン活性を有するポリペプチドが発現される。本発明にかかる形質転換体は、トリプシン活性を有するポリペプチドが安定的に発現することが好ましい。
【００７８】
（Ｃ）ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明にかかるポリペプチドを生産する方法を提供する。本発明にかかるポリペプチドの生産方法を用いれば、トリプシン活性を有するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することが可能となる。また、本発明にかかるポリペプチドの生産方法を用いれば、トリプシン活性を有するポリペプチドを容易に生産することが可能となる。
【００７９】
一実施形態において、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるベクターを用いる方法を挙げることができる。
【００８０】
本実施形態の１つの局面において、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、真核生物宿主を用いる組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明にかかるポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【００８１】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【００８２】
別の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドを天然または組換え的に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することが好ましい。本発明にかかるポリペプチドは、成熟形態で細胞から分泌されるので、本発明にかかるポリペプチドを天然または組換え的に発現する細胞の培養上清から回収することができる。また、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上述したポリペプチドを精製する工程をさらに包含してもよい。
【００８３】
本発明にかかるポリペプチドの生産方法は、本発明にかかるポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００８４】
つまり、本発明の目的は、真核生物宿主を用いてトリプシン活性を有するポリペプチドを生産する方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００８５】
（Ｄ）抗体
本発明は、本発明にかかるポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。より詳細には、本発明にかかる抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドには結合するがヒトや他の哺乳動物由来のトリプシンには結合しない。一実施形態において、本発明にかかる抗体は、トリプシン活性を阻害することができる。好ましくは、本実施形態にかかる抗体は、モノクローナル抗体である。なお、本発明にかかる抗体の生産方法は特に限定されるものではなく公知の方法を好適に用いることができる。
【００８６】
（Ｅ）具体的な利用分野
本発明は、本発明にかかるポリペプチドを有効成分として含有する薬学的組成物を提供する。具体低には、配列番号１（好ましくは配列番号３）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有しており、各種試薬や医薬品等として用いることが可能な薬学的組成物を提供する。前述したように、本発明にかかるポリペプチドは、哺乳動物トリプシンと比較して信頼性が高く、かつ、未利用バイオマスであるヒトデ類を原料とすることができる。しかも、最適温度が５０℃付近であり、Ｃａ2+を必要としないという特性を有しているので、これまでのトリプシンでは用いることのできなかった分野への利用が可能である。
【００８７】
なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００８８】
本発明について、以下の実施例、並びに図１ないし図５に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【００８９】
〔Ｉ．イトマキヒトデ幽門盲のうからの全ＲＮＡの調製〕
インビトロジェン社の商品名：TRIZOLを使用して次のステップでイトマキヒトデの幽門盲のうから全ＲＮＡを調製した。
【００９０】
まず、幽門盲のう１４１ｍｇに、TRIZOL試薬１．５ｍｌを加え、ホモジナイズ後、クロロホルム０．３ｍｌを加え、手で強く振って撹拌し、室温で３分間静置した。次に、12,000×ｇ、１５分間、４℃の条件で遠心分離した。次に、上層を別のチューブにとり、イソプロパノール０．７５ｍｌを加え、室温で１０分間静置した。次に、遠心分離（12,000×g, 10分間、4℃）し、上清を除いた。得られた沈殿（全ＲＮＡ）に、冷却した７５％エタノール１．５ｍｌを加えて、軽く撹拌した。次に、10,000×ｇ、１０分間、４℃の条件で遠心分離し、上清を除いた。得られた沈殿（全ＲＮＡ）に、冷却した７５％エタノール１ｍｌを加え、軽く撹拌した。次に、10,000×ｇ、１０分間、４℃遠心分離し、上清を除いた。沈殿を軽く乾燥した後、１２５μｌの蒸留水で溶解した。溶解した全ＲＮＡの一部を電気泳動およびＵＶ吸収測定に供し、全ＲＮＡの性状を確認するとともに濃度を測定した。
【００９１】
上記の結果、ＲＮＡの電気泳動結果は、図４に示すようになり、２８Ｓと１８Ｓが主成分であった。また、幽門盲のう全ＲＮＡの収量は、幽門盲のう１００ｍｇ当たり０．２４２ｍｇであった。
【００９２】
〔II．イトマキヒトデ幽門盲のう全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡの調製〕
インビトロジェン社の商品名：SUPERSCRIPT IIを使用してイトマキヒトデの幽門盲のう全ＲＮＡから次のステップで一本鎖ｃＤＮＡを調製した。
【００９３】
上記Ｉで得られた幽門盲のう全ＲＮＡ２μｇに、逆転写用プライマーＲＴＲＡＣＥ（１０μＭ）１μｌを加え、蒸留水で全量を１１μｌとすることによって、全ＲＮＡとプライマーとの混合液を調製した。なお、上記逆転写用プライマーＲＴＲＡＣＥの塩基配列を次に示す。
【００９４】
ＲＴＲＡＣＥ：GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACT TTT TTT TTT TTT TT（配列番号４）
ＲＮＡの高次構造を壊すために、７０℃で１０分間加熱した後、急冷して５分間保持した。５×1st. スタンダードバッファーを４μｌ、０．１ＭのＤＴＴを２μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰを１μｌ、ＲＮａｓｅインヒビターを１μｌ加え、４２℃で５分間のプレインキュベーションした。逆転写酵素SUPERSCRIPT IIを１μｌ添加して全量を２０μｌとし、４２℃で５０分間逆転写反応を行った。７０℃で１５分間加熱して、逆転写反応を停止した。これにより一本鎖ｃＤＮＡを調製した。
【００９５】
〔III．イトマキヒトデ幽門盲のうトリプシン遺伝子の部分的増幅〕
データベースに登録されている各種動物トリプシンのアミノ酸配列のアラインメントに基づき、イトマキヒトデ幽門盲のうトリプシン遺伝子の部分的増幅に必要な相同性の高い配列を見出し、ディジェネレート型センスプライマー（ＴＲ２）およびアンチセンスプライマー（ＴＲ４）を合成した。なお、これらプライマーの塩基配列を次に示す。
【００９６】
ＴＲ２：CAC TTC TGY GGW GSN TCY HT（配列番号５）
ＴＲ４：GAR TCH CCC TGR CAN GAR TC（配列番号６）
上記IIで調製した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、上記ＴＲ２およびＴＲ４を用いたＰＣＲを行った。なお、このＰＣＲの反応組成は、×１０バッファーを２μｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ2 を２μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰを２μｌ、１０μＭのＴＲ２を２μｌ、１０μＭのＴＲ４を２μｌ、上記一本鎖ｃＤＮＡを０．３μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（５unit／μｌ）を０．１４μｌとし、蒸留水で全量を２０μｌとした。上記ＤＮＡポリメラーゼとしては、Applied Biosystems社製の商品名：AmpliTaq Gold DNA Polymeraseを用いた。
【００９７】
また、ＰＣＲの反応条件としては、Applied Biosystems社製の商品名：GeneAmp PCR System 2400を用い、まず９５℃９分間加熱した後、９４℃１５秒間、５４℃３０秒間、７２℃１分間を１サイクルとして、このサイクルを４５回行い、最後に、７２℃で７分間加熱し、１０℃に冷却して反応を終了させる条件とした。
【００９８】
上記ＰＣＲを終了させた後の試料を、１．２％アガロースゲル電気泳動（トリス・酢酸・ＥＤＴＡ緩衝液、終濃度５０μｇ／１００ｍｌのエチジウムブロマイド含有）に供した。その結果、図５に示すように、サイズ４９０ｂｐのトリプシン遺伝子産物の生成が確認された。
【００９９】
〔IV．イトマキヒトデ幽門盲のうトリプシン遺伝子塩基配列の決定〕
上記IIIで得られたトリプシン遺伝子産物の塩基配列を、次のステップのシーケンス反応により決定した。
【０１００】
まず、上記IIIで得られたＰＣＲ反応物を、ゲル濃度２%の低融点アガロースゲル電気泳動に供し、メスで目的バンドを切り取った。プロメガ社製の商品名：Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、切り取ったゲル片からｃＤＮＡを溶出した。濃度既知のＤＮＡマーカーとともに、１．２％アガロースゲル電気泳動に供することにより、溶出したｃＤＮＡの濃度を決定した。
【０１０１】
溶出したｃＤＮＡの塩基配列をダイデオキシ法で決定した。その反応組成は、ｃＤＮＡ鋳型９ｎｇに、ターミネーターを２μｌ、×５バッファーを３μｌ、センス鎖の塩基配列を読むためにはセンスプライマーＴＲ２（１０μＭ）を０．３２μｌ、アンチセンス鎖の塩基配列を読むためにはアンチセンスプライマーＴＲ４（１０μＭ）を０．３２μｌ加え、蒸留水で全量２０μｌとした。また、ＰＣＲの反応条件は、Applied Biosystems社製の商品名：GeneAmp PCR System 2400を用い、９６℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃４分間を１サイクルとして、このサイクルを２５回行い、１０℃に冷却して反応を終了させた。
【０１０２】
ＰＣＲ終了後、反応液に３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を２μｌ、１００%エタノール５０μｌを加え、遠心分離（条件：14,000rpm、２０分間、室温）によって反応産物を沈殿として回収した。その後、７０％エタノール２５０μｌで沈殿を軽く洗浄した後、遠心分離（条件：14,000rpm、１０分間、室温）し、上清のエタノールを取り除き、軽く乾燥した。その後、ホルムアミド２０μｌを加えて沈殿を溶解させ、９５℃３分間加熱した後、急冷してパーキンエルマー社製、商品名：ABI PRISM（登録商標） 3100 Genetic Analyzerで分析した。
【０１０３】
得られた塩基配列の情報をＢＬＡＳＴサーチに供し、イトマキヒトデ幽門盲のうトリプシン遺伝子の塩基配列を決定した。
【０１０４】
〔Ｖ．イトマキヒトデ幽門盲のうトリプシン遺伝子の３’ＲＡＣＥ〕
上記IIで調製した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として３’ＲＡＣＥを行った。
【０１０５】
上記IVで得られたイトマキヒトデ幽門盲のうトリプシン遺伝子の塩基配列から、３’ＲＡＣＥ用のセンスプライマーＴＲ６を合成した。センスプライマーＴＲ６の塩基配列を次に示す。
【０１０６】
ＴＲ６：CCT ACC CTT ACG AAC TCA GAC AG（配列番号７）
上記IIで調製した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、上記センスプライマーＴＲ６とＲＡＣＥとを用いてＰＣＲを行った。なお、ＲＡＣＥの塩基配列を次に示す。
【０１０７】
ＲＡＣＥ：GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC（配列番号８）
ＰＣＲの反応組成としては、×１０バッファーを２μｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ2 を２μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰを２μｌ、１０μＭのＴＲ６を０．８μｌ、１０μＭのＲＡＣＥを０．８μｌ、一本鎖ｃＤＮＡを０．３μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（５unit／μｌ）を０．１４μｌとし、蒸留水で全量を２０μｌとした。上記ＤＮＡポリメラーゼとしては、Applied Biosystems社製の商品名：AmpliTaq Gold DNA Polymeraseを用いた。また、ＰＣＲの反応条件としては、Applied Biosystems社製の商品名：GeneAmp PCR System 2400を用い、まず９５℃９分間加熱した後、９４℃１５秒間、５８℃３０秒間、７２℃１分間を１サイクルとして、このサイクルを４５回行い、最後に、７２℃で７分間加熱し、１０℃に冷却して反応を終了させる条件とした。
【０１０８】
得られたＰＣＲ反応物をゲル濃度２％の低融点アガロースゲル電気泳動に供し、メスで８５０ｂｐの目的バンドを切り取り、プロメガ社製の商品名：Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、切り取ったゲル片からｃＤＮＡを溶出した。濃度既知のＤＮＡマーカーと共に、１．２％アガロースゲル電気泳動に供し、溶出したｃＤＮＡの濃度を決定した。ｃＤＮＡ濃度は７．６ｎｇ／μｌであった。
【０１０９】
溶出したｃＤＮＡの塩基配列をダイデオキシ法で決定した。ＰＣＲの反応組成としては、ｃＤＮＡ鋳型１１ｎｇにターミネーターを２μｌ、×５バッファーを３μｌ、１０μＭのＴＲ６を０．１６μｌ加え、蒸留水で全量を２０μｌとした。また、ＰＣＲの反応条件としては、Applied Biosystems社製の商品名：GeneAmp PCR System 2400を用い、まず９５℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃４分間を１サイクルとして、このサイクルを２５回行い、１０℃に冷却して反応を終了させる条件とした。
【０１１０】
ＰＣＲ反応を終了した後、反応液に３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を２μl、１００％エタノールを５０μｌ加え、遠心分離（14,000ｒｐｍ、２０分間、室温）によって反応産物を沈殿として回収した。沈殿を７０％エタノール２５０μｌにより軽く洗浄した後、再度遠心分離を行った（14,000ｒｐｍ、１０分間、室温）。上清のエタノールを取り除き、軽く乾燥した後、ホルムアミド２０μｌを加えて沈殿を溶解した。次いで、９５℃３分間加熱した後、急冷してパーキンエルマー社製、商品名：ABI PRISM（登録商標） 3100 Genetic Analyzerで分析した。
【０１１１】
得られた塩基配列の情報をＢＬＡＳＴサーチに供し、イトマキヒトデ幽門盲のうトリプシン遺伝子の塩基配列を決定した。センスプライマーＴＲ６およびＲＡＣＥプライマーによって増幅されたイトマキヒトデ幽門盲のうトリプシン遺伝子の３’ＲＡＣＥ産物は８５０ｂｐであった。また、３’ＲＡＣＥ産物の全塩基配列を決定するために、シーケンスプライマーであるＴＲ６によって得られた塩基配列に基づき、新たなシーケンスプライマーＴＲ９を合成し、シーケンス反応を行った。なお、プライマーＴＲ９の塩基配列を次に示す。
【０１１２】
ＴＲ９：AAG GCT TAT CAG ACA CTC GG（配列番号９）
〔VI．イトマキヒトデ幽門盲のうトリプシン遺伝子の３’ＲＡＣＥ産物のサブクローニング〕
ダイレクトシーケンスで多型（波形の重なり）が観察される場合には、サブクローニングを行ってシーケンスの決定を行わなければならない。最も簡単にサブクローニングできる方法として、ＴＡクローニングがある（参考文献：『バイオ実験イラストレイテッド』、3+本当にふえるＰＣＲ、６７〜６８ページおよび７３〜８４ページ参照）。
【０１１３】
上記イトマキヒトデ幽門盲のうトリプシン遺伝子の３’ＲＡＣＥ産物（ＴＲ６／ＲＡＣＥ、８５０ｂｐ）をダイレクトシーケンスした結果、多型が認められた。そこで、プロメガ社製、商品名：pGEM-T Easy Vector Systemを用いてサブクローニングを行った。一般に、ＰＣＲ産物の３’末端にはＡ（アデニン）が１塩基だけ突出した構造をとることが多いので、３’側にＴ（チミン）が１塩基突出したベクター（今回の場合、pGEM-T Easy Vector）を用いてライゲーションすることにより、ＰＣＲ産物をベクターに組み込んだ。
【０１１４】
まず、トリプシン遺伝子３’ＲＡＣＥ産物（ＴＲ６／ＲＡＣＥ、８５０ｂｐ）２７ｎｇに、×２ラピッドライゲーションバッファーを５μｌ、pGEM-T Easy vectorを２５ｎｇ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを３unit加え、蒸留水で全量を１０μｌとして、４℃で一晩インキュベーションした。
【０１１５】
次に、ライゲーション産物２．５μｌを、コンピテント細胞（E. coli ＪＭ１０９）５０μｌに加え、軽く混合し、氷上で３０分間インキュベーションした。その後、４２℃４５秒間の条件でヒートショックを施した後、氷上で２分間インキュベーションした。次に、ＭｇＣｌ2 ・ＭｇＳＯ4 ・グルコース含有ＳＯＣ培地を０．４５ｍｌ加え、３７℃で１時間振とう培養した。
【０１１６】
次に、スプレッダーで培養菌液７０μｌを、Ｘ-galおよびＩＰＴＧを含有した寒天培地プレート全体に塗布し、３７℃で一晩インキュベーションした。生育したコロニーのうち、白色を呈しているコロニーを単離した。
【０１１７】
上記白色コロニーから、プロメガ社製、商品名：Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systemを用いてプラスミドを調製した。まず、アンピシリン含有ＬＢ培地４ｍｌ中で、単離した白色コロニーを３７℃で一晩振とう培養した。得られた培養液２．５ｍｌを11,000ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離した。沈殿として回収した菌体からアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを回収した。
【０１１８】
次に、プラスミドの塩基配列を、ダイデオキシ法で決定した。まず、プラスミド３００ｎｇに、ターミネーターを２μｌ、×５バッファーを３μｌ、センス鎖の塩基配列を読むためには１０μＭのプライマーＴ７を０．１６μｌ、アンチセンス鎖の塩基配列を読むためには１０μＭのプライマーＳＰ６を０．１６μｌ加え、蒸留水で全量を２０μｌとした。なお、ＰＣＲの反応条件およびシーケンスの解析方法は、ダイレクトシーケンスと同様に行った。また、プライマーＴ７およびＳＰ６の塩基配列を次に示す。
【０１１９】
Ｔ７：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG（配列番号１０）
ＳＰ６：TAT TTA GGT GAC ACT ATA G（配列番号１１）
〔VII．イトマキヒトデ幽門盲のうで発現する全遺伝子の５’ＲＡＣＥ〕
イトマキヒトデ幽門盲のうで発現する全遺伝子について、クローンテック社製、商品名：BD SMART RACE cDNA Amplification Kitを用いて５’ＲＡＣＥを行った。
【０１２０】
まず、幽門盲のう全ＲＮＡ１μｇに対して、１０μＭの５’ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡ合成プライマーを１μｌ、１０μＭの商品名：BD SMART II A Oligoを１μｌ加え、蒸留水で全量を５μｌとした。なお、５’ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡ合成プライマーおよびBD SMART II A Oligoの塩基配列を次に示す。
【０１２１】
５’ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡ合成プライマー：5'-(T)25N-1V-3'（ただし、N=A, C, G, or T，V=A, G, or C）（配列番号１２）
BD SMART II A Oligo：5'-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTA CGC GGG-3'（配列番号１３）
次に、ＲＮＡの高次構造を壊すために、７０℃で２分加熱した後、２分間急冷した。次に、逆転写酵素BD PowerScript Reverse Transcriptaseを用いて逆転写反応を行った。反応組成は、5×1st. スタンダードバッファーを２μｌ、２０ｍＭのＤＴＴを１μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰを１μｌ、逆転写酵素BD PowerScript Reverse Transcriptaseを１μｌとし、蒸留水で全量を１０μｌとした。また、反応条件は、４２℃で９０分間とし、１０ｍＭのトリシン−ＥＤＴＡバッファーを１００μｌ添加した後、７２℃で７分間加熱して、逆転写反応を停止した。なお、上記逆転写反応に用いたBD SMART II A Oligoの塩基配列を次に示す。
【０１２２】
ここで、上記５’ＲＡＣＥで用いられているＳＭＡＲＴ法の原理を説明する。全ＲＮＡ中における種々のｍＲＮＡのポリＡ配列に、５’ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡ合成プライマーのオリゴＴがアニールし、逆転写酵素によって１本鎖ｃＤＮＡが合成される。この反応は各ｍＲＮＡの５’末端まで進行する。各ｍＲＮＡの５’末端までの１本鎖ｃＤＮＡが合成された後、各１本鎖ｃＤＮＡの３’末端に３〜５個のＣ（シトシン）が付加する。次いで、図１に示すように、BD SMART II A Oligo（配列番号１３）の３’側のＧＧＧが、各１本鎖ｃＤＮＡ（配列番号１４）の３’末端に付加している３〜５個のＣ（シトシン）とアニールする。逆転写反応により、各１本鎖ｃＤＮＡの３’末端のＣＣＣに、BD SMART II A Oligoの相補鎖が合成される。
【０１２３】
重要な点は、ＳＭＡＲＴ法では、理論上すべてのｍＲＮＡの５’ＲＡＣＥ用鋳型が合成されることである。
【０１２４】
〔VIII．イトマキヒトデ幽門盲のうトリプシン遺伝子の５’ＲＡＣＥ〕
上記IVで得られたイトマキヒトデ幽門盲のうトリプシン遺伝子の塩基配列から、５’ＲＡＣＥ用のアンチセンスプライマーＴＲ８を合成した。アンチセンスプライマーＴＲ８の塩基配列を次に示す。
【０１２５】
ＴＲ８：CGG AGC CTG ACG ATG CAA TGC GGA TGG T（配列番号１５）
次に、上記VII．で調製した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、上記アンチセンスプライマーとＮＵＰとを用いてＰＣＲを行った。なお、ＮＵＰの塩基配列を次に示す。
【０１２６】
ＮＵＰ：AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GT（配列番号１６）
上記ＰＣＲの反応組成は、×１０バッファーを５μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰを５μｌ、１０μＭのＮＵＰを１μｌ、１０μＭのＴＲ８を１μｌ、一本鎖ｃＤＮＡを２．５μｌ、×５０ＤＮＡポリメラーゼを１μｌとし、蒸留水で全量を５０μｌとした。上記ＤＮＡポリメラーゼとしては、クローンテック社製、商品名：Advantage 2Polymerase mixを用いた。また、ＰＣＲの反応条件としては、Applied Biosystems社製の商品名：GeneAmp PCR System 2400を用い、まず９４℃１分間加熱した後、９４℃５秒間、６８℃１０秒間、７２℃２分間を１サイクルとして、このサイクルを３８回行い、最後に、７２℃で７分間加熱し、１０℃に冷却して反応を終了させる条件とした。
【０１２７】
得られたＰＣＲ反応物をゲル濃度２％の低融点アガロースゲル電気泳動に供し、メスで５００ｂｐの目的バンドを切り取り、プロメガ社製の商品名：Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、切り取ったゲル片からｃＤＮＡを溶出した。濃度既知のＤＮＡマーカーと共に、１．２％アガロースゲル電気泳動に供し、溶出したｃＤＮＡの濃度を決定した。ｃＤＮＡ濃度は１．７ｎｇ／μｌであった。
【０１２８】
〔IX．イトマキヒトデ幽門盲のうトリプシン遺伝子の５’ＲＡＣＥ産物のサブクローニング〕
上記VI．と同様にして、プロメガ社製、商品名：pGEM-T Easy Vector Systemを用いて、トリプシン遺伝子の５’ＲＡＣＥ産物のサブクローニングを行った。
【０１２９】
まず、トリプシン遺伝子５’ＲＡＣＥ産物（ＮＵＰ／ＴＲ８、５００ｂｐ）１０ｎｇに、×２ラピッドライゲーションバッファーを５μｌ、pGEM-T Easy vectorを２５ｎｇ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを３unit加え、蒸留水で全量を１０μｌとして、４℃で一晩インキュベーションした。
【０１３０】
次に、ライゲーション産物２．５μｌを、コンピテント細胞（E. coli ＪＭ１０９）５０μｌに加え、軽く混合し、氷上で３０分間インキュベーションした。その後、４２℃４５秒間の条件でヒートショックを施した後、氷上で２分間インキュベーションした。次に、ＭｇＣｌ2 ・ＭｇＳＯ4 ・グルコース含有ＳＯＣ培地を０．４５ｍｌ加え、３７℃で１時間振とう培養した。
【０１３１】
次に、スプレッダーで培養菌液７０μｌを、Ｘ-galおよびＩＰＴＧを含有した寒天培地プレート全体に塗布し、３７℃で一晩インキュベーションした。生育したコロニーのうち、白色を呈しているコロニーを単離した。
【０１３２】
上記白色コロニーから、プロメガ社製、商品名：Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systemを用いてプラスミドを調製した。まず、アンピシリン含有ＬＢ培地４ｍｌ中で、単離した白色コロニーを３７℃で一晩振とう培養した。得られた培養液２．５ｍｌを11,000ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離した。沈殿として回収した菌体からアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを回収した。
【０１３３】
次に、プラスミドの塩基配列を、ダイデオキシ法で決定した。まず、プラスミド３００ｎｇに、ターミネーターを２μｌ、×５バッファーを３μｌ、センス鎖の塩基配列を読むためには１０μＭのプライマーＴ７を０．１６μｌ、アンチセンス鎖の塩基配列を読むためには１０μＭのプライマーＳＰ６を０．１６μｌ加え、蒸留水で全量を２０μｌとした。なお、ＰＣＲの反応条件およびシーケンスの解析方法は、ダイレクトシーケンスと同様に行った。
【０１３４】
〔Ｘ．結果〕
得られたイトマキヒトデ幽門盲のうトリプシンの部分ｃＤＮＡ配列を配列番号３に示す。当該ｃＤＮＡのサイズはポリＡシグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を含む１２５８ｂｐであった。また、当該ｃＤＮＡにコードされているイトマキヒトデ幽門盲のうトリプシンのアミノ酸配列を配列番号１に示す。当該ｃＤＮＡは２６４残基のアミノ酸をコードしていた。
【０１３５】
得られたイトマキヒトデ幽門盲のうトリプシンと各種脊椎動物トリプシンとにおいて、そのシグナルおよび前駆体アミノ酸の配列を比較した結果を図２に示す。各種脊椎動物トリプシンは、開始コドンＭｅｔから疎水性アミノ酸に富むシグナルペプチドと塩基性アミノ酸に富む前駆体ペプチドを有し、前駆体ペプチドはＬｙｓ残基で終わっている。一方、イトマキヒトデ幽門盲のうトリプシンは開始コドンＭｅｔを確認することができなかったが、疎水性アミノ酸に富む長いシグナルペプチド様配列が確認された。しかしながら、塩基性アミノ酸に富みＬｙｓ残基で終わる前駆体ペプチドは確認されなかった。イトマキヒトデ幽門盲のうトリプシンは生きているイトマキヒトデから粗酵素を調製し、活性を測定した場合、最初から高いトリプシン活性が認められることから、前駆体ペプチドは存在しない可能性があると考えられる。
【０１３６】
その後、イトマキヒトデの成熟型トリプシンの全アミノ酸配列を決定した。そのアミノ酸配列を配列番号２および図３に示す。なお、図３では、ウシ膵臓トリプシンとの間でアミノ酸配列を比較している。イトマキヒトデ成熟型トリプシンは２３７残基のアミノ酸から成り、活性残基であるＨｉｓ５７、Ａｓｐ１０２、Ｓｅｒ１９５および基質特異性を決定するＡｓｐ１８９残基を有していた。また、Ｎ末端のＩｌｅとイオンペアを形成するＡｓｐ１９４も保存されていた。
【０１３７】
ウシ膵臓トリプシンにおいて、Ｃａ2+結合に関与するＧｌｕ７０、Ｖａｌ７５、Ｇｌｕ７７、およびＧｌｕ８０は、イトマキヒトデトリプシンにおいて置換または欠損していた。このことから、イトマキヒトデトリプシンの利用にあたっては、哺乳動物トリプシンのようにＣａ2+を必要としない。
【０１３８】
カペリン（非特許文献１）、カタクチイワシ（非特許文献２）、大西洋タラ（非特許文献３）、大西洋サケ（非特許文献４）のような低温適応魚のトリプシンは哺乳動物トリプシンより触媒活性が高いことが示されている。また、哺乳動物トリプシンはその最適作用温度が６０〜７０℃であり、熱に対して安定であるが、低温に生息するイトマキヒトデのトリプシンは最適温度が５０℃付近であり、熱に対する安定性も哺乳動物のものより低い。このことから、イトマキヒトデのトリプシンは低温で行われる食品加工などへの利用に特に適していると考えられる。
【０１３９】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、発明を実施するための最良の形態および実施例等に記載された、異なる技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
以上のように、本発明では、これまで知られていなかった新規なアミノ酸配列を有するイトマキヒトデ由来のトリプシンを見出した。そのため、本発明によれば、哺乳動物由来のものよりも信頼性が高く、かつ、未利用バイオマスであったヒトデ類の有効利用に貢献することが可能となる。それゆえ、本発明は、バイオマスを利用した試薬類や医薬品類に関わる分野に広くするにも応用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】実施例における５’ＲＡＣＥで用いられたＳＭＡＲＴ法の原理を説明する図である。
【図２】イトマキヒトデ幽門盲のうトリプシンと各種脊椎動物トリプシンとにおいて、そのシグナルおよび前駆体アミノ酸の配列を比較した結果を示す図である。
【図３】イトマキヒトデの成熟型トリプシンおよびウシ膵臓トリプシンのアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。
【図４】イトマキヒトデ幽門盲のうからの全ＲＮＡを調製した結果を示す電気泳動の図である。
【図５】イトマキヒトデ幽門盲のうトリプシン遺伝子を部分的に増幅した結果を示す電気泳動の図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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