(57)【要約】【課題】L-フェニルアラニン、L-ロイシン、L-バリン、L-イソロイシンおよびL-メチオニンに対して基質特異性が広いアミノ酸脱水素酵素を作出することによって、これらアミノ酸の血中異常濃度が確認されている先天性代謝異常症および前記アミノ酸の血中異常濃度が確認され得る疾病の検出あるいは1次スクリーニングの手法として適当な手段を提供する。【解決手段】フェニルアラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.20)のメチオニンに対する基質特異性を改善するように、少なくとも1つのアミノ酸が修飾された改変酵素、およびそれをコードするDNA。このDNAを複合材料ねベクターで形質転換した形質転換体を培養し、培養物からフェニルアラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.20)のメチオニンに対する基質特異性を改善するように、少なくとも1つのアミノ酸が修飾された改変酵素を採取する改変酵素の調製方法。前記改変酵素またはタンパク質を用いて、被検試料に含まれるL-メチオニンを分析する方法。【選択図】図6
2006271379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェニルアラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.20)のメチオニンに対する基質特異性を改善するように、少なくとも1つのアミノ酸が修飾された改変酵素。
【請求項２】
前記修飾が、フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列中のスレオニン(Thr)グリシン(Gly)の連続した配列(但し、前記グリシン(Gly)は114〜125番目の範囲にある)におけるグリシン(Gly)のセリン（Ser）への置換である請求項1に記載の改変酵素。
【請求項３】
前記修飾が、フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列中のグルタミン (Gln)バリン (Val)の連続した配列(但し、前記バリン (Val)は297 〜310 番目の範囲にある)におけるバリン (Val)のセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）への置換である請求項1または2に記載の改変酵素。
【請求項４】
フェニルアラニン脱水素酵素が、Bacillus badius IAM11059、Bacillus sphaericus R79a、Sporosarcina ureae R04、Bacillus halodurans、Geobacillus kaustophilus、Oceanobacillus iheyensis、Rhodococcus sp. M-4またはThermoactinomyces intermediusに由来する請求項1〜3のいずれか１項に記載の改変酵素。
【請求項５】
Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号2に記載)の123番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
【請求項６】
Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号2に記載)の123番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換し、且つ309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換した改変酵素。
【請求項７】
Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号4に記載)の124番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
【請求項８】
Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号4に記載)の124番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換し、且つ310番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換した改変酵素。
【請求項９】
Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号6に記載)の125番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
【請求項１０】
Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号6に記載)の125番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換し、且つ308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換した改変酵素。
【請求項１１】
Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号8に記載)の122番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
【請求項１２】
Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号8に記載)の122番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換し、且つ308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換した改変酵素。
【請求項１３】
Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号10に記載)の123番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
【請求項１４】
Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号10に記載)の123番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換し、且つ309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換した改変酵素。
【請求項１５】
Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号12に記載)の122番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
【請求項１６】
Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号12に記載)の122番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換し、且つ308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換した改変酵素。
【請求項１７】
Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号14に記載)の117番目のアミノ酸（Gly）残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
【請求項１８】
Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号16に記載)の114番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
【請求項１９】
Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号16に記載)の114番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換し、且つ297番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換した改変酵素。
【請求項２０】
(A-1)Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号2に記載)の1〜122番目、
(A-2)Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号4に記載)の1〜123番目、
(A-3)Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号6に記載)の1〜124番目、
(A-4)Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号8に記載)の1〜121番目、
(A-5)Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号10に記載)の1〜122番目、
(A-6)Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号12に記載)の1〜121番目、
(A-7)Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号14に記載)の1〜116番目、および
(A-8)Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号16に記載)の1〜113番目
のいずれか1つにセリン（Ser）を介して、
(B-1)Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の124〜380番目、
(B-2)Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の125〜381番目、
(B-3) Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の126〜379番目
(B-4)Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123〜379番目
(B-5)Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の124〜380番目
(B-6)Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123〜379番目
(B-7)Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の118〜356番目
(B-8)Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の115〜366番目
をこの順に連結した改変酵素(但し、(A)と(B)の数字は異なる組み合せとする)。
【請求項２１】
(B-1)は、Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-2)は、Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の310番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-3)は、 Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-4)は、Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-5)は、Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-6)は、Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-8)は、Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の297番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列である、
請求項20に記載の改変酵素。
【請求項２２】
請求項1〜21のいずれか１項に記載の改変酵素のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列(但し、欠失及び／又は置換されるアミノ酸に、セリン（Ser）が114〜125番目の範囲にあるスレオニン(Thr) セリン（Ser）の連続した配列のセリン（Ser）、並びに(A)と(B)を連結するセリン（Ser）は含まない)を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列を有する改変酵素。
【請求項２３】
フェニルアラニンに対する相対活性を100としたときにメチオニンに対する相対活性が50以上である請求項1〜22のいずれか１項に記載の改変酵素。
【請求項２４】
フェニルアラニンに対する相対活性を100としたときにメチオニンに対する相対活性が100以上である請求項1〜22のいずれか１項に記載の改変酵素。
【請求項２５】
フェニルアラニンに対する相対活性を100としたときにメチオニンに対する相対活性が500以上である請求項1〜22のいずれか１項に記載の改変酵素。
【請求項２６】
請求項1〜25のいずれか１項に記載の酵素のN末端側に1〜12個のヒスチジンからなるオリゴペプチド(ヒスチジン・タグ)を融合したタンパク質。
【請求項２７】
下記いずれかのDNA。
(1) 配列表の配列番号1に記載の塩基配列を有するDNAであって、367〜369番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(2) 配列表の配列番号3に記載の塩基配列を有するDNAであって、370〜372番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(3) 配列表の配列番号5に記載の塩基配列を有するDNAであって、373〜375番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(4) 配列表の配列番号7に記載の塩基配列を有するDNAであって、364〜366番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(5) 配列表の配列番号9に記載の塩基配列を有するDNAであって、367〜369番目のggc(グアニン・グアニン・シトシン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(6) 配列表の配列番号11に記載の塩基配列を有するDNAであって、364〜366番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(7) 配列表の配列番号13に記載の塩基配列を有するDNAであって、349〜351番目のgga(グアニン・グアニン・アデニン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(8) 配列表の配列番号15に記載の塩基配列を有するDNAであって、340〜342番目のgga(グアニン・グアニン・アデニン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(9) (1)〜(8)の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素をコードする塩基配列を有するDNA、
(10) (1)〜(9)のDNAに相補的な塩基配列を有するDNA。
【請求項２８】
下記いずれかのDNA。
(1) 配列表の配列番号1に記載の塩基配列を有するDNAであって、367〜369番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)、且つ925〜927番目のgta（グアニン・チミン・アデニン）がtct（チミン・シトシン・チミン）、tcc（チミン・シトシン・シトシン）、tca（チミン・シトシン・アデニン）、tcg（チミン・シトシン・グアニン）、agt（アデニン・グアニン・チミン）、agc（アデニン・グアニン・シトシン）、act（アデニン・シトシン・チミン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、aca（アデニン・シトシン・アデニン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、gct（グアニン・シトシン・チミン）、gcc（グアニン・シトシン・シトシン）、gca（グアニン・シトシン・アデニン）またはgcg（グアニン・シトシン・グアニン）であるDNA、
(2) 配列表の配列番号3に記載の塩基配列を有するDNAであって、370〜372番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン) 、且つ928〜930番目のgtt（グアニン・チミン・チミン）がtct（チミン・シトシン・チミン）、tcc（チミン・シトシン・シトシン）、tca（チミン・シトシン・アデニン）、tcg（チミン・シトシン・グアニン）、agt（アデニン・グアニン・チミン）、agc（アデニン・グアニン・シトシン）、act（アデニン・シトシン・チミン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、aca（アデニン・シトシン・アデニン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、gct（グアニン・シトシン・チミン）、gcc（グアニン・シトシン・シトシン）、gca（グアニン・シトシン・アデニン）またはgcg（グアニン・シトシン・グアニン）であるDNA、
(3) 配列表の配列番号5に記載の塩基配列を有するDNAであって、373〜375番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン) 、且つ922〜924番目のgtg（グアニン・チミン・グアニン）がtct（チミン・シトシン・チミン）、tcc（チミン・シトシン・シトシン）、tca（チミン・シトシン・アデニン）、tcg（チミン・シトシン・グアニン）、agt（アデニン・グアニン・チミン）、agc（アデニン・グアニン・シトシン）、act（アデニン・シトシン・チミン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、aca（アデニン・シトシン・アデニン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、gct（グアニン・シトシン・チミン）、gcc（グアニン・シトシン・シトシン）、gca（グアニン・シトシン・アデニン）またはgcg（グアニン・シトシン・グアニン）であるDNA、
(4) 配列表の配列番号7に記載の塩基配列を有するDNAであって、364〜366番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン) 、且つ922〜924番目のgta（グアニン・チミン・アデニン）がtct（チミン・シトシン・チミン）、tcc（チミン・シトシン・シトシン）、tca（チミン・シトシン・アデニン）、tcg（チミン・シトシン・グアニン）、agt（アデニン・グアニン・チミン）、agc（アデニン・グアニン・シトシン）、act（アデニン・シトシン・チミン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、aca（アデニン・シトシン・アデニン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、gct（グアニン・シトシン・チミン）、gcc（グアニン・シトシン・シトシン）、gca（グアニン・シトシン・アデニン）またはgcg（グアニン・シトシン・グアニン）であるDNA、
(5) 配列表の配列番号9に記載の塩基配列を有するDNAであって、367〜369番目のggc(グアニン・グアニン・シトシン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン) 、且つ925〜927番目のgtg（グアニン・チミン・グアニン）がtct（チミン・シトシン・チミン）、tcc（チミン・シトシン・シトシン）、tca（チミン・シトシン・アデニン）、tcg（チミン・シトシン・グアニン）、agt（アデニン・グアニン・チミン）、agc（アデニン・グアニン・シトシン）、act（アデニン・シトシン・チミン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、aca（アデニン・シトシン・アデニン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、gct（グアニン・シトシン・チミン）、gcc（グアニン・シトシン・シトシン）、gca（グアニン・シトシン・アデニン）またはgcg（グアニン・シトシン・グアニン）であるDNA、
(6) 配列表の配列番号11に記載の塩基配列を有するDNAであって、364〜366番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン) 、且つ922〜924番目のgtt（グアニン・チミン・チミン）がtct（チミン・シトシン・チミン）、tcc（チミン・シトシン・シトシン）、tca（チミン・シトシン・アデニン）、tcg（チミン・シトシン・グアニン）、agt（アデニン・グアニン・チミン）、agc（アデニン・グアニン・シトシン）、act（アデニン・シトシン・チミン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、aca（アデニン・シトシン・アデニン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、gct（グアニン・シトシン・チミン）、gcc（グアニン・シトシン・シトシン）、gca（グアニン・シトシン・アデニン）またはgcg（グアニン・シトシン・グアニン）であるDNA、
(7) 配列表の配列番号15に記載の塩基配列を有するDNAであって、340〜342番目のgga(グアニン・グアニン・アデニン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン) 、且つ889〜891番目のgtg（グアニン・チミン・グアニン）がtct（チミン・シトシン・チミン）、tcc（チミン・シトシン・シトシン）、tca（チミン・シトシン・アデニン）、tcg（チミン・シトシン・グアニン）、agt（アデニン・グアニン・チミン）、agc（アデニン・グアニン・シトシン）、act（アデニン・シトシン・チミン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、aca（アデニン・シトシン・アデニン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、gct（グアニン・シトシン・チミン）、gcc（グアニン・シトシン・シトシン）、gca（グアニン・シトシン・アデニン）またはgcg（グアニン・シトシン・グアニン）であるDNA、
(8) (1)〜(7)の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素をコードする塩基配列を有するDNA、
(9) (1)〜(8)のDNAに相補的な塩基配列を有するDNA。
【請求項２９】
下記いずれかのDNA。
(11a) 配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列であって、123番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(11b) 配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列であって、123番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ309番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）
またはアラニン（Ala）のいずれかであるアミノ酸配列をコードするDNA、
(12a) 配列表の配列番号4に記載のアミノ酸配列であって、124番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(12b) 配列表の配列番号4に記載のアミノ酸配列であって、124番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ310番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）
またはアラニン（Ala）のいずれかであるアミノ酸配列をコードするDNA、
(13a) 配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列であって、125番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(13b) 配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列であって、125番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ308番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）
またはアラニン（Ala）のいずれかであるアミノ酸配列をコードするDNA、
(14a) 配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配列であって、122番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(14b) 配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配列であって、122番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ308番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）
またはアラニン（Ala）のいずれかであるアミノ酸配列をコードするDNA、
(15a) 配列表の配列番号10に記載のアミノ酸配列であって、123番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(15b) 配列表の配列番号10に記載のアミノ酸配列であって、123番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ309番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）
またはアラニン（Ala）のいずれかであるアミノ酸配列をコードするDNA、
(16a) 配列表の配列番号12に記載のアミノ酸配列であって、122番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(16b) 配列表の配列番号12に記載のアミノ酸配列であって、122番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ308番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）
またはアラニン（Ala）のいずれかであるアミノ酸配列をコードするDNA、
(17) 配列表の配列番号14に記載のアミノ酸配列であって、117番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(18a) 配列表の配列番号16に記載のアミノ酸配列であって、114番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(18b) 配列表の配列番号16に記載のアミノ酸配列であって、114番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ297番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）
またはアラニン（Ala）のいずれかであるアミノ酸配列をコードするDNA、
(19) (11a)〜(18b)のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA、および
(20) (11a)〜(19b)のDNAに相補的な塩基配列を有するDNA。
【請求項３０】
(a-1)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の1〜366の配列を有するDNA、
(a-2)配列表の配列番号3に記載の塩基配列の1〜369の配列を有するDNA、
(a-3)配列表の配列番号5に記載の塩基配列の1〜372の配列を有するDNA、
(a-4)配列表の配列番号7に記載の塩基配列の1〜363の配列を有するDNA、
(a-5)配列表の配列番号9に記載の塩基配列の1〜366の配列を有するDNA、
(a-6)配列表の配列番号11に記載の塩基配列の1〜363の配列を有するDNA、
(a-7)配列表の配列番号13に記載の塩基配列の1〜348の配列を有するDNA、および
(a-8)配列表の配列番号15に記載の塩基配列の1〜339の配列を有するDNA、
のいずれか1つの配列とセリン(Ser)をコードする塩基配列agt、agc、tct、tcc、tcaまたはtcgと
(b-1)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の370〜1143の配列を有するDNA、
(b-2)配列表の配列番号3に記載の塩基配列の373〜1146の配列を有するDNA、
(b-3)配列表の配列番号5に記載の塩基配列の376〜1140の配列を有するDNA、
(b-4)配列表の配列番号7に記載の塩基配列の367〜1140の配列を有するDNA、
(b-5)配列表の配列番号9に記載の塩基配列の370〜1143の配列を有するDNA、
(b-6)配列表の配列番号11に記載の塩基配列の367〜1140の配列を有するDNA、
(b-7)配列表の配列番号13に記載の塩基配列の352〜1071の配列を有するDNA、および
(b-8)配列表の配列番号15に記載の塩基配列の343〜1101の配列を有するDNA、
のいずれか1つの配列からなる塩基配列をこの順に連続したDNA(但し、(a)と(b)の数字は異なる組み合せとする)。
【請求項３１】
請求項30に記載のDNAの塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素をコードする塩基配列を有するDNA。
【請求項３２】
(A-1)Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列1〜122番目、
(A-2)Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列1〜123番目、
(A-3)Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜124番目、
(A-4)Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜121番目、
(A-5)Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜122番目、
(A-6)Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜121番目、
(A-7)Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜116番目、および
(A-8)Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜113番目
のいずれか1つにセリン（Ser）を介して、
(B-1)Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列124〜380番目、
(B-2)Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列125〜381番目、
(B-3)Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の126〜379番目
(B-4)Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123〜379番目
(B-5)Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の124〜380番目
(B-6)Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123〜379番目
(B-7)Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の118〜356番目
(B-8)Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の115〜366番目
をこの順に連結した改変酵素(但し、(A)と(B)の数字は異なる組み合せとする)のアミノ酸配列をコードするDNA。
【請求項３３】
(B-1)は、Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-2)は、Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の310番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-3)は、 Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-4)は、Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-5)は、Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-6)は、 Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-8)は、Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の297番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列である、
請求項32に記載のDNA。
【請求項３４】
請求項33に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA。
【請求項３５】
請求項27〜34のいずれか１項に記載のDNAに相補的な塩基配列を有するDNA。
【請求項３６】
請求項27〜35のいずれか１項に記載のDNAを含むベクター。
【請求項３７】
請求項27〜35のいずれか１項に記載のDNAのいずれかの末端側に1〜12個のヒスチジンからなるオリゴペプチドをコードするDNAをさらに含む請求項36に記載のベクター。
【請求項３８】
請求項36または37に記載のベクターで宿主を形質転換した形質転換体。
【請求項３９】
請求項38に記載の形質転換体を培養し、培養物からフェニルアラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.20)のメチオニンに対する基質特異性を改善するように、少なくとも1つのアミノ酸が修飾された改変酵素を採取する改変酵素の調製方法。
【請求項４０】
前記修飾が、フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列中のスレオニン(Thr)グリシン(Gly)の連続した配列(但し、前記グリシン(Gly)は114〜125番目の範囲にある)におけるグリシン(Gly)のセリン（Ser）への置換である請求項39に記載の調製方法。
【請求項４１】
前記修飾が、フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列中のグルタミン（Gln）、バリン（Val）の連続した配列（但し、前記バリン（Val）は297〜310番目の範囲にある）におけるバリン（Val）のセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）への置換である請求項39または40に記載の調製方法。
【請求項４２】
請求項1〜26のいずれか1項に記載の改変酵素またはタンパク質を用いて、被検試料に含まれるL-メチオニンを分析する方法。
【請求項４３】
L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリンおよびL-フェニルアラニンの少なくとも1つを併せて分析する請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
被検試料をレサズリン、ジアホラーゼおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）と混合し、蛍光発色を検出することを含む、請求項42または43に記載の方法。
【請求項４５】
被検試料とレサズリン、ジアホラーゼおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）との混合をマイクロプレートのウェル中で行う請求項42〜44のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
被検試料が血液試料である請求項42〜45のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェニルアラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.20)のメチオニンに対する基質特異性を改善するように、少なくとも1つのアミノ酸が修飾された改変酵素に関する。さらに本発明は、この改変酵素を用いる、生体試料中に含まれるL-メチオニン等のアミノ酸の分析方法に関する。
【０００２】
本発明者らによれば、特に、先天性代謝異常症であるホモシスチン尿症、フェニルケトン尿症およびメープルシロップ尿症等の疾患において、早期発見のための新生児マス・スクリーニング、あるいは当該患者の定期健康診断について利用可能な検査方法を提供できる。さらに、本発明の分析方法は、食品あるいは環境中に含まれるL-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-ロイシン、L-イソロイシンあるいはL-バリンなどの検出、定量に用いることもできる。
【背景技術】
【０００３】
先天性代謝異常症の早期発見を目的とする新生児マス・スクリーニングの世界的な普及は、フェニルケトン尿症（Phenylketonuria; PKU）の治療法の発見と、乾燥ろ紙血液中のL-フェニルアラニン（L-Phe）の半定量法がGuthrieら（Pediatrics, Vol. 32, p. 338-343 (1963)、非特許文献1）によって開発されたことに始まる。先天性代謝異常症は現在までに約500種類もの症例が報告されており、中でも特に治療法が確立され適切な治療が行われることによって正常な生育が期待される疾患7種から22種類の症例について全国的に新生児に対してマス・スクリーニングが行われている。
【０００４】
フェニルケトン尿症のスクリーニングについては、酵素法（Screening, Vol. 1, p. 63 (1992)、非特許文献2、医学と薬学、Vol. 31, p. 1237 (1994)、非特許文献3）あるいはマイクロプレート蛍光法（Clinical Chemistry, Vol. 35, p. 1962 (1989)、非特許文献4）と呼ばれる酵素反応とそれに続く蛍光反応をマイクロプレートで行い、蛍光強度から検体中のL-フェニルアラニンを定量するキットが開発された（医学と薬学、Vol. 37, p. 1211 (1997)、非特許文献5）。また、メープルシロップ尿症のスクリーニングについても、前記フェニルケトン尿症のスクリーニング方法と同様にL-ロイシン特異的脱水素酵素を用いたマイクロプレート蛍光法が開発された。
【０００５】
一方、ホモシスチン尿症のスクリーニング方法については、Methionine γ-lyaseを用いるホモシスチン尿症のマス・スクリーニング法の開発（平成5年度厚生省心身障害研究「マス・スクリーニングシステムの評価方法に関する研究」pp. 237-240 (1993)、非特許文献6）が報告されている。本法は、L-Methionine γ-lyaseの酵素反応によってL-メチオニンから遊離されるアンモニア（NH3）を、o-フタルアルデヒド(OPA)と2-メルカプトエタノール(2ME)の中性域での特異蛍光を利用して測定する方法である。
【０００６】
これらのマイクロプレート蛍光定量法は、検体処理能力の高さに加え、従来法では困難とされていた検査結果の客観的判定である定量化や記録化が容易にできる利点を有している。さらに、検体の前処理を含めて3時間程度で検査結果を得ることが可能であり、迅速性や利便性、さらに作業効率などの点でも従来法に比べて大幅に改善されている。
【非特許文献１】Pediatrics, vol. 32, p. 338 (1963)
【非特許文献２】Screening, vol. 1, p. 63 (1992)
【非特許文献３】医学と薬学、vol. 31, p. 1237 (1994)
【非特許文献４】Clinical Chemistry, vol. 35, p. 1962 (1989)
【非特許文献５】医学と薬学、vol. 37, p. 1211 (1997)
【非特許文献６】平成5年度厚生省心身障害研究「マス・スクリーニングシステムの評価方法に関する研究」pp. 237-240 (1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ホモシスチン尿症以外の重要先天性代謝異常症疾患（フェニルケトン尿症、ガラクトース血症およびメープルシロップ尿症等）のマイクロプレートを用いた酵素蛍光法によるマス・スクリーニングでは、各測定項目に特異的な脱水素酵素を用い、測定の手順、試薬組成および検出蛍光波長等において共通しており、多検体同時測定が可能なシステムとなっている。一方、前記ホモシスチン尿症のスクリーニング法、すなわちL-メチオニン γ-リアーゼを用いたアンモニアの蛍光定量による間接的血中メチオニンの定量法では、測定手順、試薬組成および検出蛍光波長等において他の先天性代謝異常症疾患の測定方法とは大きく異なっている。また、この方法では、環境中のアンモニアなどによる試料の汚染等に敏感であり、細心の注意を払う必要があった。このため、診断項目毎に検体を分別しなければならないことから、スクリーニングを行う際の作業効率を改善する必要性があった。
【０００８】
本発明では、ホモシスチン尿症以外の重要先天性代謝異常症疾患と同様にL-メチオニン特異的な脱水素酵素を進化分子工学的手法により作出し、血液試料中のL-メチオニン濃度を酵素蛍光法により定量できるようにするとともに、測定手順、試薬組成および検出蛍光波長等において他の先天性代謝異常症疾患の診断キットと同様な仕様にすることでスクリーニング作業効率の大幅な改善を提供することを目的とする。
【０００９】
より具体的には、本発明の目的は、L-メチオニンに対して基質特異性を有するフェニルアラニン脱水素酵素を進化分子工学的手法により作出するとともに、被検試料（血液試料）に含まれるL-メチオニンをレサズリン、ジアホラーゼ、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）を含む反応液とともにインキュベーションし、反応液の蛍光発色を検出することを含む、被検試料に含まれるL-メチオニンの分析方法を提供することにある。さらに本発明は、メチオニンの酵素蛍光定量法に適した機能改変アミノ酸脱水素酵素を提供することも目的とする。
【００１０】
また、本発明ではL-フェニルアラニン、L-ロイシン、L-バリン、L-イソロイシンおよびL-メチオニンに対して基質特異性が広いアミノ酸脱水素酵素を作出することによって、これらアミノ酸の血中異常濃度が確認されている先天性代謝異常症および前記アミノ酸の血中異常濃度が確認され得る疾病の検出あるいは1次スクリーニングの手法として適当な手段を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するための本発明は以下の通りである。
[1]フェニルアラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.20)のメチオニンに対する基質特異性を改善するように、少なくとも1つのアミノ酸が修飾された改変酵素。
[2]前記修飾が、フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列中のスレオニン(Thr)グリシン(Gly)の連続した配列(但し、前記グリシン(Gly)は114〜125番目の範囲にある)におけるグリシン(Gly)のセリン（Ser）への置換である[1]に記載の改変酵素。
[3]前記修飾が、フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列中のグルタミン (Gln)バリン (Val)の連続した配列(但し、前記バリン (Val)は297 〜310 番目の範囲にある)におけるバリン (Val)のセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）への置換である[1]または[2]に記載の改変酵素。
[4]フェニルアラニン脱水素酵素が、Bacillus badius IAM11059、Bacillus sphaericus R79a、Sporosarcina ureae R04、Bacillus halodurans、Geobacillus kaustophilus、Oceanobacillus iheyensis、Rhodococcus sp. M-4またはThermoactinomyces intermediusに由来する[1]〜[3]のいずれかに記載の改変酵素。
[5]Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号2に記載)の123番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
[6]Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号2に記載)の123番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換し、且つ309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換した改変酵素。
[7]Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号4に記載)の124番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
[8]Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号4に記載)の124番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換し、且つ310番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換した改変酵素。
[9]Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号6に記載)の125番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
[10]Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号6に記載)の125番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換し、且つ308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換した改変酵素。
[11]Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号8に記載)の122番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
[12]Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号8に記載)の122番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換し、且つ308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換した改変酵素。
[13]Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号10に記載)の123番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
[14]Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号10に記載)の123番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換し、且つ309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換した改変酵素。
[15]Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号12に記載)の122番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
[16]Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号12に記載)の122番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換し、且つ308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換した改変酵素。
[17]Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号14に記載)の117番目のアミノ酸（Gly）残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
[18]Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号16に記載)の114番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素。
[19]Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号16に記載)の114番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換し、且つ297番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換した改変酵素。
[20](A-1)Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号2に記載)の1〜122番目、
(A-2)Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号4に記載)の1〜123番目、
(A-3)Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号6に記載)の1〜124番目、
(A-4)Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号8に記載)の1〜121番目、
(A-5)Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号10に記載)の1〜122番目、
(A-6)Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号12に記載)の1〜121番目、
(A-7)Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号14に記載)の1〜116番目、および
(A-8)Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列(配列表の配列番号16に記載)の1〜113番目
のいずれか1つにセリン（Ser）を介して、
(B-1)Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の124〜380番目、
(B-2)Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の125〜381番目、
(B-3)Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の126〜379番目
(B-4) Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123〜379番目
(B-5)Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の124〜380番目
(B-6)Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123〜379番目
(B-7)Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の118〜356番目
(B-8)Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の115〜366番目
をこの順に連結した改変酵素(但し、(A)と(B)の数字は異なる組み合せとする)。
[21](B-1)は、Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-2)は、Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の310番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-3)は、 Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-4)は、Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-5)は、Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-6)は、Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-8) は、Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の297番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列である、
[20]に記載の改変酵素。
[22][1]〜[21]のいずれかに記載の改変酵素のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列(但し、欠失及び／又は置換されるアミノ酸に、セリン（Ser）が114〜125番目の範囲にあるスレオニン(Thr) セリン（Ser）の連続した配列のセリン（Ser）、並びに(A)と(B)を連結するセリン（Ser）は含まない)を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列を有する改変酵素。
[23]フェニルアラニンに対する相対活性を100としたときにメチオニンに対する相対活性が50以上である[1]〜[22]のいずれかに記載の改変酵素。
[24]フェニルアラニンに対する相対活性を100としたときにメチオニンに対する相対活性が100以上である[1]〜[22] のいずれかに記載の改変酵素。
[25]フェニルアラニンに対する相対活性を100としたときにメチオニンに対する相対活性が500以上である[1]〜[22] のいずれかに記載の改変酵素。
[26][1]〜[25]のいずれかに記載の酵素のN末端側に1〜12個のヒスチジンからなるオリゴペプチド(ヒスチジン・タグ)を融合したタンパク質。
[27]下記いずれかのDNA。
(1) 配列表の配列番号1に記載の塩基配列を有するDNAであって、367〜369番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(2) 配列表の配列番号3に記載の塩基配列を有するDNAであって、 370〜372番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(3) 配列表の配列番号5に記載の塩基配列を有するDNAであって、 373〜375番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(4) 配列表の配列番号7に記載の塩基配列を有するDNAであって、 364〜366番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(5) 配列表の配列番号9に記載の塩基配列を有するDNAであって、 367〜369番目のggc(グアニン・グアニン・シトシン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(6) 配列表の配列番号11に記載の塩基配列を有するDNAであって、 364〜366番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(7) 配列表の配列番号13に記載の塩基配列を有するDNAであって、 349〜351番目のgga(グアニン・グアニン・アデニン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(8) 配列表の配列番号15に記載の塩基配列を有するDNAであって、 340〜342番目のgga(グアニン・グアニン・アデニン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(9) (1)〜(8)の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素をコードする塩基配列を有するDNA、
(10) (1)〜(9)のDNAに相補的な塩基配列を有するDNA。
[28]下記いずれかのDNA。
(1) 配列表の配列番号1に記載の塩基配列を有するDNAであって、367〜369番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン)、且つ925〜927番目のgta（グアニン・チミン・アデニン）がtct（チミン・シトシン・チミン）、tcc（チミン・シトシン・シトシン）、tca（チミン・シトシン・アデニン）、tcg（チミン・シトシン・グアニン）、agt（アデニン・グアニン・チミン）、agc（アデニン・グアニン・シトシン）、act（アデニン・シトシン・チミン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、aca（アデニン・シトシン・アデニン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、gct（グアニン・シトシン・チミン）、gcc（グアニン・シトシン・シトシン）、gca（グアニン・シトシン・アデニン）またはgcg（グアニン・シトシン・グアニン）であるDNA、
(2) 配列表の配列番号3に記載の塩基配列を有するDNAであって、 370〜372番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン) 、且つ928〜930番目のgtt（グアニン・チミン・チミン）がtct（チミン・シトシン・チミン）、tcc（チミン・シトシン・シトシン）、tca（チミン・シトシン・アデニン）、tcg（チミン・シトシン・グアニン）、agt（アデニン・グアニン・チミン）、agc（アデニン・グアニン・シトシン）、act（アデニン・シトシン・チミン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、aca（アデニン・シトシン・アデニン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、gct（グアニン・シトシン・チミン）、gcc（グアニン・シトシン・シトシン）、gca（グアニン・シトシン・アデニン）またはgcg（グアニン・シトシン・グアニン）であるDNA、
(3) 配列表の配列番号5に記載の塩基配列を有するDNAであって、 373〜375番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン) 、且つ922〜924番目のgtg（グアニン・チミン・グアニン）がtct（チミン・シトシン・チミン）、tcc（チミン・シトシン・シトシン）、tca（チミン・シトシン・アデニン）、tcg（チミン・シトシン・グアニン）、agt（アデニン・グアニン・チミン）、agc（アデニン・グアニン・シトシン）、act（アデニン・シトシン・チミン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、aca（アデニン・シトシン・アデニン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、gct（グアニン・シトシン・チミン）、gcc（グアニン・シトシン・シトシン）、gca（グアニン・シトシン・アデニン）またはgcg（グアニン・シトシン・グアニン）であるDNA、
(4) 配列表の配列番号7に記載の塩基配列を有するDNAであって、 364〜366番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン) 、且つ922〜924番目のgta（グアニン・チミン・アデニン）がtct（チミン・シトシン・チミン）、tcc（チミン・シトシン・シトシン）、tca（チミン・シトシン・アデニン）、tcg（チミン・シトシン・グアニン）、agt（アデニン・グアニン・チミン）、agc（アデニン・グアニン・シトシン）、act（アデニン・シトシン・チミン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、aca（アデニン・シトシン・アデニン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、gct（グアニン・シトシン・チミン）、gcc（グアニン・シトシン・シトシン）、gca（グアニン・シトシン・アデニン）またはgcg（グアニン・シトシン・グアニン）であるDNA、
(5) 配列表の配列番号9に記載の塩基配列を有するDNAであって、 367〜369番目のggc(グアニン・グアニン・シトシン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン) 、且つ925〜927番目のgtg（グアニン・チミン・グアニン）がtct（チミン・シトシン・チミン）、tcc（チミン・シトシン・シトシン）、tca（チミン・シトシン・アデニン）、tcg（チミン・シトシン・グアニン）、agt（アデニン・グアニン・チミン）、agc（アデニン・グアニン・シトシン）、act（アデニン・シトシン・チミン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、aca（アデニン・シトシン・アデニン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、gct（グアニン・シトシン・チミン）、gcc（グアニン・シトシン・シトシン）、gca（グアニン・シトシン・アデニン）またはgcg（グアニン・シトシン・グアニン）であるDNA、
(6) 配列表の配列番号11に記載の塩基配列を有するDNAであって、 364〜366番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン) 、且つ922〜924番目のgtt（グアニン・チミン・チミン）がtct（チミン・シトシン・チミン）、tcc（チミン・シトシン・シトシン）、tca（チミン・シトシン・アデニン）、tcg（チミン・シトシン・グアニン）、agt（アデニン・グアニン・チミン）、agc（アデニン・グアニン・シトシン）、act（アデニン・シトシン・チミン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、aca（アデニン・シトシン・アデニン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、gct（グアニン・シトシン・チミン）、gcc（グアニン・シトシン・シトシン）、gca（グアニン・シトシン・アデニン）またはgcg（グアニン・シトシン・グアニン）であるDNA、
(7) 配列表の配列番号15に記載の塩基配列を有するDNAであって、 340〜342番目のgga(グアニン・グアニン・アデニン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)またはtcg(チミン・シトシン・グアニン) 、且つ889〜891番目のgtg（グアニン・チミン・グアニン）がtct（チミン・シトシン・チミン）、tcc（チミン・シトシン・シトシン）、tca（チミン・シトシン・アデニン）、tcg（チミン・シトシン・グアニン）、agt（アデニン・グアニン・チミン）、agc（アデニン・グアニン・シトシン）、act（アデニン・シトシン・チミン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、aca（アデニン・シトシン・アデニン）、acg（アデニン・シトシン・グアニン）、gct（グアニン・シトシン・チミン）、gcc（グアニン・シトシン・シトシン）、gca（グアニン・シトシン・アデニン）またはgcg（グアニン・シトシン・グアニン）であるDNA、
(8) (1)〜(7)の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素をコードする塩基配列を有するDNA、
(9) (1)〜(8)のDNAに相補的な塩基配列を有するDNA。
[29]下記いずれかのDNA。
(11a)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列であって、123番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(11b) 配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列であって、123番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ309番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）
またはアラニン（Ala）のいずれかであるアミノ酸配列をコードするDNA、
(12a) 配列表の配列番号4に記載のアミノ酸配列であって、124番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(12b) 配列表の配列番号4に記載のアミノ酸配列であって、124番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ310番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）
またはアラニン（Ala）のいずれかであるアミノ酸配列をコードするDNA、
(13a) 配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列であって、125番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(13b) 配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列であって、125番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ308番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）
またはアラニン（Ala）のいずれかであるアミノ酸配列をコードするDNA、
(14a) 配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配列であって、122番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(14b) 配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配列であって、122番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ308番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）
またはアラニン（Ala）のいずれかであるアミノ酸配列をコードするDNA、
(15a) 配列表の配列番号10に記載のアミノ酸配列であって、123番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(15b) 配列表の配列番号10に記載のアミノ酸配列であって、123番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ309番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）
またはアラニン（Ala）のいずれかであるアミノ酸配列をコードするDNA、
(16a) 配列表の配列番号12に記載のアミノ酸配列であって、122番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(16b) 配列表の配列番号12に記載のアミノ酸配列であって、122番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ308番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）
またはアラニン（Ala）のいずれかであるアミノ酸配列をコードするDNA、
(17) 配列表の配列番号14に記載のアミノ酸配列であって、117番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(18a) 配列表の配列番号16に記載のアミノ酸配列であって、114番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(18b) 配列表の配列番号16に記載のアミノ酸配列であって、114番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ297番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）
またはアラニン（Ala）のいずれかであるアミノ酸配列をコードするDNA、
(19)(11a)〜(18b)のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA、および
(20)(11a)〜(19b)のDNAに相補的な塩基配列を有するDNA。
[30](a-1)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の1〜366の配列を有するDNA、
(a-2)配列表の配列番号3に記載の塩基配列の1〜369の配列を有するDNA、
(a-3)配列表の配列番号5に記載の塩基配列の1〜372の配列を有するDNA、
(a-4)配列表の配列番号7に記載の塩基配列の1〜363の配列を有するDNA、
(a-5)配列表の配列番号9に記載の塩基配列の1〜366の配列を有するDNA、
(a-6)配列表の配列番号11に記載の塩基配列の1〜363の配列を有するDNA、
(a-7)配列表の配列番号13に記載の塩基配列の1〜348の配列を有するDNA、および
(a-8)配列表の配列番号15に記載の塩基配列の1〜339の配列を有するDNA、
のいずれか1つの配列とセリン(Ser)をコードする塩基配列agt、agc、tct、tcc、tcaまたはtcgと
(b-1)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の370〜1143の配列を有するDNA、
(b-2)配列表の配列番号3に記載の塩基配列の373〜1146の配列を有するDNA、
(b-3)配列表の配列番号5に記載の塩基配列の376〜1140の配列を有するDNA、
(b-4)配列表の配列番号7に記載の塩基配列の367〜1140の配列を有するDNA、
(b-5)配列表の配列番号9に記載の塩基配列の370〜1143の配列を有するDNA、
(b-6)配列表の配列番号11に記載の塩基配列の367〜1140の配列を有するDNA、
(b-7)配列表の配列番号13に記載の塩基配列の352〜1071の配列を有するDNA、および
(b-8)配列表の配列番号15に記載の塩基配列の343〜1101の配列を有するDNA、
のいずれか1つの配列からなる塩基配列をこの順に連続したDNA(但し、(a)と(b)の数字は異なる組み合せとする)。
[31][30]に記載のDNAの塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素をコードする塩基配列を有するDNA。
[32](A-1)Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列1〜122番目、
(A-2)Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列1〜123番目、
(A-3)Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜124番目、
(A-4)Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜121番目、
(A-5)Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜122番目、
(A-6)Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜121番目、
(A-7)Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜116番目、および
(A-8)Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜113番目
のいずれか1つにセリン（Ser）を介して、
(B-1)Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列124〜380番目、
(B-2)Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列125〜381番目、
(B-3)Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の126〜379番目
(B-4)Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123〜379番目
(B-5)Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の124〜380番目
(B-6)Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123〜379番目
(B-7)Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の118〜356番目
(B-8)Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の115〜366番目
をこの順に連結した改変酵素(但し、(A)と(B)の数字は異なる組み合せとする)のアミノ酸配列をコードするDNA。
[33](B-1) は、Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-2) は、Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の310番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-3) は、 Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-4) は、Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-5) は、Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-6) は、 Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-8) は、Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の297番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列である、
[32]に記載のDNA。
[34][33]に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA。
[35][27]〜[34]のいずれかに記載のDNAに相補的な塩基配列を有するDNA。
[36][27]〜[35]のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
[37][27]〜[35]のいずれかに記載のDNAのいずれかの末端側に1〜12個のヒスチジンからなるオリゴペプチドをコードするDNAをさらに含む[36]に記載のベクター。
[38][36]または[37]に記載のベクターで宿主を形質転換した形質転換体。
[39][38]に記載の形質転換体を培養し、培養物からフェニルアラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.20)のメチオニンに対する基質特異性を改善するように、少なくとも1つのアミノ酸が修飾された改変酵素を採取する改変酵素の調製方法。
[40]前記修飾が、フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列中のスレオニン(Thr)グリシン(Gly)の連続した配列(但し、前記グリシン(Gly)は114〜125番目の範囲にある)におけるグリシン(Gly)のセリン（Ser）への置換である[39]に記載の調製方法。
[41]前記修飾が、フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列中のグルタミン（Gln）、バリン（Val）の連続した配列（但し、前記バリン（Val）は297〜310番目の範囲にある）におけるバリン（Val）のセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）への置換である[39]または[40]に記載の調製方法。
[42][1]〜[26]のいずれかに記載の改変酵素またはタンパク質を用いて、被検試料に含まれるL-メチオニンを分析する方法。
[43]L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリンおよびL-フェニルアラニンの少なくとも1つを併せて分析する[42]に記載の方法。
[44]被検試料をレサズリン、ジアホラーゼおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）と混合し、蛍光発色を検出することを含む、[42]または[43]に記載の方法。
[45]被検試料とレサズリン、ジアホラーゼおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）との混合をマイクロプレートのウェル中で行う[42]〜[44]のいずれかに記載の方法。
[46]被検試料が血液試料である[42]〜[45]のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、L-メチオニンに対して基質特異性を有するフェニルアラニン脱水素酵素の改変酵素を提供でき、かつこの改変酵素を用いることで、被検試料に含まれるL-メチオニンの分析をレサズリン、ジアホラーゼ、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）を用いる蛍光発色法により行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、フェニルアラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.20)のメチオニンに対する基質特異性を改善するように、少なくとも1つのアミノ酸が修飾された改変酵素に関する。本発明において、改変の対象であるフェニルアラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.20)は、L-フェニルアラニンのアミノ基に対して、特異的に酸化的脱アミノ化反応を触媒する酵素である。フェニルアラニン脱水素酵素の例としては、例えば、Bacillus badius IAM11059、Bacillus sphaericus R79a、Sporosarcina ureae R04、Bacillus halodurans、Geobacillus kaustophilus、Oceanobacillus iheyensis、Rhodococcus sp. M-4またはThermoactinomyces intermediusに由来するフェニルアラニン脱水素酵素を挙げることができる。
【００１４】
Bacillus badius IAM11059由来するフェニルアラニン脱水素酵素は、L-フェニルアラニンに対する基質特異性が極めて高く、フェニルケトン尿症の血中L-フェニルアラニン濃度の定量に最適な酵素として同疾患のマス・スクリーニングにおいてマイクロプレートを用いた酵素蛍光定量法の酵素剤として用いられている。また、本酵素は、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型；NAD+）を要求する。本酵素による酸化反応は可逆的であり、中性付近から弱アルカリ性のpH領域においてアンモニウムイオンとニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型；NADH）存在下で還元的アミノ化反応も触媒する酵素である。Bacillus badius IAM11059由来するフェニルアラニン脱水素酵素の塩基配列およびアミノ酸配列は、Yamada A, Dairi T, Ohno Y, Huang XL and Asano Y. Nucleotide sequencing of phenylalanine dehydrogenase gene from Bacillus badius IAM 11059 Biosci. Biotechnol. Biochem. 59(10). 1994-1995 (1995)に記載され、配列番号１および２として記載する。
【００１５】
Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.20）は、L-フェニルアラニンあるいはL-チロシンのアミノ基に対して、特異的に酸化的脱アミノ化反応を触媒する酵素である。本酵素は、L-フェニルアラニンとともにL-チロシンに対しても基質特異性が高く、L-アミノ酸の酵素的合成反応において利用されている。また、本酵素は、補酵素として前記B. badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素同様にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）を要求する。本酵素による酸化反応は可逆的であり、中性付近から弱アルカリ性のpH領域において前記Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素と同様にアンモニウムイオンとニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型；NADH）の存在下で還元的アミノ化反応も触媒する酵素である。Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素の塩基配列およびアミノ酸配列は、N. Okazaki, Y. Hibino, Y. Asano, M. Ohmori, N. Numao and K. Kondo. Cloning and nucleotide sequencing of phenylalanine dehydrogenase gene of Bacillus sphaericus. Gene. 63. 337-341 (1988) に記載され、配列番号３および４として記載する。
【００１６】
Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素の塩基配列およびアミノ酸配列は、DDBJ/EMBL/GenBank databases(Accession No. AB001031)に記載され、配列番号５および６として記載する。
【００１７】
Bacillus haloduransに由来するフェニルアラニン脱水素酵素の塩基配列およびアミノ酸配列は、GenBank Database(Accession No. NC_002570)およびNCBI Protein Database(Accession No. NP_241084)に記載され、配列番号７および８として記載する。
【００１８】
Geobacillus kaustophilusに由来するフェニルアラニン脱水素酵素の塩基配列およびアミノ酸配列は、GenBank Database(Accession No. BA000043.1)およびNCBI Protein Database(Accession No. BAD76316)に記載され、配列番号９および１０として記載する。
【００１９】
Oceanobacillus iheyensisに由来するフェニルアラニン脱水素酵素の塩基配列およびアミノ酸配列は、GenBank(Accession No. BA000028)およびNCBI Protein Database(Accession No. BAC14834)に記載され、配列番号１１および１２として記載する。
【００２０】
Rhodococcus sp. M-4に由来するフェニルアラニン脱水素酵素の塩基配列およびアミノ酸配列は、以下の文献に記載され、配列番号１３および１４として記載する。
Brunhuber N. M., Banerjee A., Jacobs W. R. Jr., Blanchard J. S. Cloning, sequencing, and expression of Rhodococcus L-phenylalanine dehydrogenase. Sequence comparisons to amino-acid dehydrogenases. J. Biol. Chem., 269. 16203-16211 (1994)
【００２１】
Thermoactinomyces intermediusに由来するフェニルアラニン脱水素酵素の塩基配列およびアミノ酸配列は、以下の文献に記載され、配列番号１５および１６として記載する。
Takada H., Yoshimura T., Ohshima T., Esaki N., Soda K. Thermostable phenylalanine dehydrogenase of Thermoactinomyces intermedius; cloning, expression, and sequencing of its gene. J. Biochem., 109. 371-376 (1991)
【００２２】
野生型のフェニルアラニン脱水素酵素は、Ｌ−フェニルアラニンに対する基質特異性が高い。図１にBacillus badius IAM11059、Bacillus sphaericus R79aおよびSporosarcina ureae R04に由来するフェニルアラニン脱水素酵素のＬ−トリプシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−メチオニンおよびＬ−バリンに対する基質特異性を相対活性によって示す。図１に示すように、上記３つのフェニルアラニン脱水素酵素は、Ｌ−フェニルアラニンに対する相対活性を１００とすると、Ｌ−フェニルアラニン以外のアミノ酸に対する相対活性は低く、特に、Ｌ−メチオニンに対する相対活性は１０以下である。
【００２３】
本発明においては、上記のように、Ｌ−メチオニンに対する基質特異性が、Ｌ−フェニルアラニンに対する基質特異性に比べて格段に低いフェニルアラニン脱水素酵素を改変し、メチオニンに対する基質特異性を改善したものであり、具体的には、野生型酵素の少なくとも1つのアミノ酸をメチオニンに対する基質特異性を改善するように修飾した改変酵素である。基質特異性の改善は、例えば、フェニルアラニンに対する相対活性を100としたときにメチオニンに対する相対活性が50以上であることが好ましく、100以上であることがより好ましく、500以上であることがさらに好ましい。
【００２４】
メチオニンに対する基質特異性を改善する修飾は、具体的には、野生型フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の114〜125番目の範囲にあるスレオニン(Thr)グリシン(Gly)の連続した配列 (但し、前記グリシン(Gly)が114〜125番目の範囲にある)におけるグリシン(Gly)のセリン（Ser）への置換である。野生型フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列中のスレオニン(Thr)グリシン(Gly)の連続した配列(グリシン(Gly)が114〜125番目の範囲にある)におけるグリシン(Gly)の位置は酵素の由来によって異なり、以下の表に示す位置にある。
【００２５】
【表１】
2006271379.tif 000003
*スレオニン(Thr)グリシン(Gly)の連続した配列におけるグリシン(Gly)の位置
**野生型酵素の配列
【００２６】
さらにメチオニンに対する基質特異性を改善する修飾は、具体的には、野生型フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の297〜310番目の範囲にあるグルタミン（Gln）バリン（Val）の連続した配列 (但し、前記バリン（Val）が297〜310番目の範囲にある)におけるバリン（Val）のセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）への置換である。野生型フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列中のグルタミン（Gln）バリン（Val）の連続した配列(バリン（Val）が297〜310番目の範囲にある)におけるバリン（Val）の位置は酵素の由来によって異なり、以下の表に示す位置にある。
【００２７】
【表２】
2006271379.tif 000004
*グルタミン（Gln）バリン（Val）の連続した配列におけるバリン（Val）の位置
**野生型酵素の配列
【００２８】
本発明の改変酵素の具体例は、
（１ａ）Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素、
（１ｂ）Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、且つ309番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）のいずれかに置換した改変酵素、
（２ａ）Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の124番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素、
（２ｂ）Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の124番目のアミノ酸残基をセリン（Ser））、且つ310番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）のいずれかに置換した改変酵素、
（３ａ）Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素、
（３ｂ）Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、且つ308番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）のいずれかに置換した改変酵素、
（４ａ）Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の122番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素、
（４ｂ）Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の122番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、且つ308番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）のいずれかに置換した改変酵素、
（５ａ）Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素、
（５ｂ）Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、且つ309番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）のいずれかに置換した改変酵素、
（６ａ）Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の122番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素、
（６ｂ）Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の122番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、且つ308番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）のいずれかに置換した改変酵素、
（７）Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の117番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素、および
（８ａ）Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の114番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）に置換した改変酵素、
（８ｂ）Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の114番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、且つ297番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）のいずれかに置換した改変酵素である。
【００２９】
さらに本発明は、由来の異なる２つのフェニルアラニン脱水素酵素を、上記114〜125番目の範囲にあるスレオニン(Thr)グリシン(Gly)の連続した配列におけるグリシン(Gly)を境にして、組み換えたキメラ改変酵素であることができる。具体的には、１つのフェニルアラニン脱水素酵素の上記範囲にあるグリシン(Gly)の直前までのアミノ酸配列とこのフェニルアラニン脱水素酵素とは由来が異なる別のフェニルアラニン脱水素酵素の上記範囲にあるグリシン(Gly)の直後から最後までのアミノ酸配列とをセリン（Ser）を介してこの順に連結したキメラ改変酵素である。
【００３０】
本発明のキメラ改変酵素は、下記(A)のグループのいずれか1つのアミノ酸配列と(B)のグループのいずれか1つのアミノ酸とを、 セリン（Ser）を介してこの順に連続したタンパク質である。但し、(B)は(A)とは異なる起源の酵素のアミノ酸配列から選択する。即ち、(A)と(B)の数字は異なる組み合せとする。
【００３１】
(A)のグループ
(A-1)Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列1〜122番目、
(A-2)Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列1〜123番目、
(A-3)Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜124番目、
(A-4)Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜121番目、
(A-5)Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜122番目、
(A-6)Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜121番目、
(A-7)Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜116番目、および
(A-8)Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜113番目
【００３２】
(B)のグループ
(B-1)Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列124〜380番目、
(B-2)Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列125〜381番目、
(B-3)Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の126〜379番目
(B-4)Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123〜379番目
(B-5)Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の124〜380番目
(B-6) Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123〜379番目
(B-7)Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の118〜356番目
(B-8)Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の115〜366番目
【００３３】
(B)のグループのアミノ酸は、以下のアミノ酸配列であっても良い。
(B-1)は、Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-2)は、Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の310番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-3)は、 Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-4)は、Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-5)は、Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-6)は、 Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-8)は、Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の297番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列。
【００３４】
キメラ改変酵素の具体例としては、以下のものを挙げることができる。
（１）Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列1〜122番目にセリン（Ser）を介して、Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列125〜381番目をこの順に連結した改変酵素、
（２）Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列1〜122番目にセリン（Ser）を介して、Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列126〜379番目をこの順に連結した改変酵素、
（３）Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列1〜123番目にセリン（Ser）を介して、Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列124〜380番目をこの順に連結した改変酵素、
（４）Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列1〜123番目にセリン（Ser）を介して、Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列126〜379番目をこの順に連結した改変酵素、
（５）Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列1〜124番目にセリン（Ser）を介して、Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列124〜380番目をこの順に連結した改変酵素、
（６） Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列1〜124番目にセリン（Ser）を介して、Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列125〜379番目をこの順に連結した改変酵素。
【００３５】
上記以外も、上記表1または２に示した8種類のフェニルアラニン脱水素酵素のいずれかの2つを組み合わせることでキメラ改変酵素を作製することができる。
【００３６】
さらに本発明は、本発明の改変酵素のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列を有する改変酵素を包含する。但し、欠失及び／又は置換されるアミノ酸に、セリン（Ser）が114〜125番目の範囲にあるスレオニン(Thr) セリン（Ser）の連続した配列のセリン（Ser）は含まない)。あるいは、前記本発明のキメラ改変酵素において、欠失及び／又は置換されるアミノ酸に(A)と(B)を連結するセリン（Ser）は含まない。置換、挿入または欠落をさらに有する改変酵素は、野生型酵素に比べて、メチオニンに対する基質特異性を改善したものであり、基質特異性の改善は、例えば、フェニルアラニンに対する相対活性を100としたときにメチオニンに対する相対活性が50以上であることが好ましく、100以上であることがより好ましい。
【００３７】
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。以下においても同様である。
【００３８】
以下に本発明の改変酵素の具体例（実施例に示す）の説明とフェニルアラニンに対する相対活性を100としたときにメチオニンに対する相対活性を一覧表にして示す。
【００３９】
【表３】
2006271379.tif 000005
【００４０】
本発明の改変酵素（タンパク質）の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質でもよい。改変酵素（組み換えタンパク質）を作製する場合には、先ず、後述するように、当該改変酵素（タンパク質）をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の改変酵素を産生することができる。発現系でのタンパク質の発現については本明細書中後記する。
【００４１】
本発明の改変酵素は、酵素タンパク質のメチオニン残基（１番目のアミノ酸）のN末端側に位置する１〜12個、好ましくは６〜９個の連続したヒスチジン残基を含むことが望ましい。本発明は、上記本発明の改変酵素(タンパク質)のN末端側に1〜12個のヒスチジンからなるオリゴペプチド(ヒスチジン・タグ)を融合したタンパク質を包含する。改変酵素(タンパク質)のN末端側に連結したヒスチジン・タグは、組換え体培養物からの酵素の精製を容易にするとともに、ニッケル（Ni2+）等の２価金属イオンを介したタンパク質の固定化などに有効である。
【００４２】
［本発明のDNA］
さらに本発明は、下記いずれかのDNAに関する。
(1) 配列表の配列番号1に記載の塩基配列を有するDNAであって、367〜369番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)あるいはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(2) 配列表の配列番号3に記載の塩基配列を有するDNAであって、370〜372番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)あるいはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(3) 配列表の配列番号5に記載の塩基配列を有するDNAであって、373〜375番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)あるいはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(4) 配列表の配列番号7に記載の塩基配列を有するDNAであって、364〜366番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)あるいはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(5) 配列表の配列番号9に記載の塩基配列を有するDNAであって、367〜369番目のggc(グアニン・グアニン・シトシン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)あるいはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(6) 配列表の配列番号11に記載の塩基配列を有するDNAであって、364〜366番目のggt(グアニン・グアニン・チミン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)あるいはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(7) 配列表の配列番号13に記載の塩基配列を有するDNAであって、349〜351番目のgga(グアニン・グアニン・アデニン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)あるいはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(8) 配列表の配列番号15に記載の塩基配列を有するDNAであって、340〜342番目のgga(グアニン・グアニン・アデニン)がagt(アデニン・グアニン・チミン)、agc(アデニン・グアニン・シトシン)、tct(チミン・シトシン・チミン)、tcc(チミン・シトシン・シトシン)、tca(チミン・シトシン・アデニン)あるいはtcg(チミン・シトシン・グアニン)であるDNA、
(9) (1)〜(8)の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素をコードする塩基配列を有するDNA、
(10)(1)〜(9)のDNAに相補的な塩基配列を有するDNA。
【００４３】
(1)〜(8)は、Bacillus badius IAM11059、Bacillus sphaericus R79a、Sporosarcina ureae R04、Bacillus halodurans、Geobacillus kaustophilus、Oceanobacillus iheyensis、Rhodococcus sp. M-4およびThermoactinomyces intermediusにそれぞれ由来するフェニルアラニン脱水素酵素の塩基配列の特定箇所のg(グアニン)をa(アデニン)に置換した配列であり、この塩基の置換は、アミノ酸では、グリシン(Gly)のセリン（Ser）への置換に相当する。
【００４４】
(9)のDNAは、(1)〜(8)の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素をコードする塩基配列を有するDNAである。メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素とは、前述と同義であり、フェニルアラニンに対する相対活性を100としたときにメチオニンに対する相対活性が50以上、好ましくは100以上であるようにメチオニンに対する基質特異性を改善したものであることが適当である。(10)のDNAは、(1)〜(9)の塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAである。
【００４５】
さらに本発明は、下記いずれかのDNAに関する。
(11a) 配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列であって、123番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(11b) 配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列であって、123番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ309番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(12a) 配列表の配列番号4に記載のアミノ酸配列であって、124番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(12b) 配列表の配列番号4に記載のアミノ酸配列であって、124番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ310番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(13a) 配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列であって、125番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(13b) 配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列であって、125番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ308番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(14a) 配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配列であって、122番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(14b) 配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配列であって、122番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ308番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(15a) 配列表の配列番号10に記載のアミノ酸配列であって、123番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(15b) 配列表の配列番号10に記載のアミノ酸配列であって、123番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ309番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(16a) 配列表の配列番号12に記載のアミノ酸配列であって、122番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(16b) 配列表の配列番号12に記載のアミノ酸配列であって、122番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ308番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(17) 配列表の配列番号14に記載のアミノ酸配列であって、117番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(18a) 配列表の配列番号16に記載のアミノ酸配列であって、114番目のアミノ酸がセリン（Ser）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
(18b) 配列表の配列番号16に記載のアミノ酸配列であって、114番目のアミノ酸がセリン（Ser）、且つ297番目のアミノ酸がセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）であるアミノ酸配列をコードするDNA、
【００４６】
(11a)〜(16a)、(17)、(18a)は、Bacillus badius IAM11059、Bacillus sphaericus R79a、Sporosarcina ureae R04、Bacillus halodurans、Geobacillus kaustophilus、Oceanobacillus iheyensis、Rhodococcus sp. M-4およびThermoactinomyces intermediusにそれぞれ由来するフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の特定箇所のグリシン(Gly)のセリン（Ser）への置換したアミノ酸配列をコードするDNAである。
【００４７】
(11b)〜(18b)は、Bacillus badius IAM11059、Bacillus sphaericus R79a、Sporosarcina ureae R04、Bacillus halodurans、Geobacillus kaustophilus、Oceanobacillus iheyensisおよびThermoactinomyces intermediusにそれぞれ由来するフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の特定箇所のグリシン(Gly)のセリン（Ser）への置換、および特定箇所のバリン(Val)のセリン（Ser）、スレオニン（Thr）あるいはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列をコードするDNAである。
【００４８】
(19)のDNAは、(11a)〜(18b)のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAである。メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素活性とは、前述と同義であり、フェニルアラニンに対する相対活性を100としたときにメチオニンに対する相対活性が50以上、好ましくは100以上、より好ましくは500以上であるようにメチオニンに対する基質特異性を改善したものであることが適当である。(20)のDNAは、(11a)〜(19)のDNAに相補的な塩基配列を有するDNAである。
【００４９】
さらに本発明は、下記(a)のグループのいずれか1つの塩基配列と下記(b)のグループのいずれか1つの塩基配列とをセリン（Ser）をコードする塩基配列agt、agc、tct、tcc、tcaあるいはtcgを間に介して、この順に連結した塩基配列を有するDNAに関する。但し、(a)と(b)とは異なる起源の酵素の塩基配列から選択する。即ち、(a)と(b)の数字は異なる組み合せとする。
【００５０】
(a)グループ
(a-1)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の1〜366の配列を有するDNA、
(a-2)配列表の配列番号3に記載の塩基配列の1〜369の配列を有するDNA、
(a-3)配列表の配列番号5に記載の塩基配列の1〜372の配列を有するDNA、
(a-4)配列表の配列番号7に記載の塩基配列の1〜363の配列を有するDNA、
(a-5)配列表の配列番号9に記載の塩基配列の1〜366の配列を有するDNA、
(a-6)配列表の配列番号11に記載の塩基配列の1〜363の配列を有するDNA、
(a-7)配列表の配列番号13に記載の塩基配列の1〜348の配列を有するDNA、および
(a-8)配列表の配列番号15に記載の塩基配列の1〜339の配列を有するDNA。
【００５１】
(b)グループ
(b-1)配列表の配列番号1に記載の塩基配列の370〜1143の配列を有するDNA、
(b-2)配列表の配列番号3に記載の塩基配列の373〜1146の配列を有するDNA、
(b-3)配列表の配列番号5に記載の塩基配列の376〜1140の配列を有するDNA、
(b-4)配列表の配列番号7に記載の塩基配列の367〜1140の配列を有するDNA、
(b-5)配列表の配列番号9に記載の塩基配列の370〜1143の配列を有するDNA、
(b-6)配列表の配列番号11に記載の塩基配列の367〜1140の配列を有するDNA、
(b-7)配列表の配列番号13に記載の塩基配列の352〜1071の配列を有するDNA、および
(b-8)配列表の配列番号15に記載の塩基配列の343〜1101の配列を有するDNA。
【００５２】
さらはに本発明は、上記のDNAの塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素をコードする塩基配列を有するDNAを包含する。メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素活性とは、前述と同義であり、フェニルアラニンに対する相対活性を100としたときにメチオニンに対する相対活性が50以上、好ましくは100以上、より好ましくは500以上であるようにメチオニンに対する基質特異性を改善したものであることが適当である。(20)のDNAは、(11)〜(19)のDNAに相補的な塩基配列を有するDNAである。
【００５３】
さらに本発明は、下記(A)のグループのいずれか1つのアミノ酸配列と下記(B)のグループのいずれか1つのアミノ酸配列とをセリン（Ser）を介して、この順に連結した改変酵素のアミノ酸配列をコードするDNAに関する。但し、(A)と(B)とは異なる起源の酵素の塩基配列から選択する。即ち、(A)と(B)の数字は異なる組み合せとする。
【００５４】
グループ(A)
(A-1)Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列1〜122番目、
(A-2)Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列1〜123番目、
(A-3)Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜124番目、
(A-4)Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜121番目、
(A-5)Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜122番目、
(A-6)Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜121番目、
(A-7)Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜116番目、および
(A-8)Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の1〜113番目
グループ(B)
(B-1)Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列124〜380番目、
(B-2)Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列125〜381番目、
(B-3)Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の126〜379番目
(B-4)Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123〜379番目
(B-5)Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の124〜380番目
(B-6)Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の123〜379番目
(B-7)Rhodococcus sp. M-4由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の118〜356番目、および
(B-8)Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の115〜366番目
【００５５】
(B)のグループのアミノ酸は、以下のアミノ酸配列であっても良い。
(B-1)は、Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-2)は、Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の310番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-3)は、Sporosarcina ureae R04由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-4)は、Bacillus halodurans由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-5)は、Geobacillus kaustophilus由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の309番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-6)は、 Oceanobacillus iheyensis由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の308番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列であり、
(B-8)は、Thermoactinomyces intermedius由来のフェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列の297番目のアミノ酸残基をセリン（Ser）、スレオニン（Thr）またはアラニン（Ala）に置換したアミノ酸配列。
【００５６】
本発明は上記のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、メチオニンに対する基質特異性を改善したフェニルアラニン脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAを包含する。ただし、欠失及び／又は置換されるアミノ酸に(A)と(B)を連結するセリン（Ser）は含まない。置換、挿入または欠落をさらに有する改変酵素は、野生型酵素に比べて、メチオニンに対する基質特異性を改善したものであり、基質特異性の改善は、例えば、フェニルアラニンに対する相対活性を100としたときにメチオニンに対する相対活性が50以上であることが好ましく、100以上であることがより好ましく、500以上であることがさらに好ましい。本発明は、これらのDNAに相補的な塩基配列を有するDNAも包含する。
【００５７】
本発明のDNAの取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１から１６に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて前記で挙げたフェニルアラニン脱水素酵素を含む菌のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、本発明の遺伝子を発現している菌から常法により作製することができる。
【００５８】
ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。上記した菌由来のＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００５９】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００６０】
また、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、配糖化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；並びに配列表の配列番号５または６に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、配糖化酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を変異遺伝子と称する）については、配列番号１〜１６に記載のアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００６１】
例えば、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００６２】
［本発明のベクター］
本発明は、上記本発明のいずれかのDNAを含むベクターに関する。上記本発明ののいずれかのDNAを乗せるベクターは特に制限はないが、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００６３】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌の lac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられる。
【００６４】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
【００６５】
また、本発明のDNAは必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００６６】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００６７】
［本発明の形質転換体、それを用いた改変酵素の製造］
本発明のDNA（遺伝子）又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。本発明の遺伝子または組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００６８】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００６９】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００７０】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００７１】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。
【００７２】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００７３】
より具体的には、例えば、Bacillus badius IAM11059あるいはBacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素遺伝子（pdh）を鋳型として部位特異的変異プライマーを用いてPCR反応によって増幅された部位特異的変異導入遺伝子および／またはその相補配列を作製し、この部位特異的変異導入遺伝子および／またはその相補鎖を、例えば、大腸菌（Escherichia coli）あるいはその他の組換え可能な宿主細胞（例えば動物細胞、植物細胞、昆虫細胞など）で発現させて、本発明の改変酵素を得ることができる。
【００７４】
本発明は上記本発明の形質転換体を培養し、培養物からフェニルアラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.20)のメチオニンに対する基質特異性を改善するように、少なくとも1つのアミノ酸が修飾された改変酵素を採取する改変酵素の調製方法を包含する。
【００７５】
上記の形質転換体は、導入されたDNAの発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の改変酵素を単離精製するには、通常の改変酵素の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の改変酵素が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００７６】
［L-メチオニン分析方法］
本発明は、上記本発明の改変酵素またはタンパク質を用いて、被検試料に含まれるL-メチオニンを分析する方法に関する。
【００７７】
本発明のL-メチオニン分析法は、具体的には、被検試料をレサズリン、ジアホラーゼおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）と混合し、蛍光発色を検出することを含む。被検試料とレサズリン、ジアホラーゼおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）との混合は、例えば、マイクロプレートのウェル中で行うことができる。
【００７８】
さらに本発明のL-メチオニン分析法は、(1)被検試料とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）を混合し、還元されるNADHの吸光値の増大を測定すること、(2)フェナジンメトスルフェート（PMS）等の電子キャリヤーを媒体として被検試料と還元系発色試薬であるイント（INT）を混合し、フォルマザン生成発色を検出すること、あるいは(3)1-メトキシ-フェナジンメトスルフェート(1-Methoxy PMS)等の電子キャリヤーを介して金属イオン（例えばCo3+など）を還元し、キレート指示薬である5-Br-PAPS等と反応せしめ、発色した吸光値を測定して検出すること等の方法によっても実施することができる。上記(1)〜(3)の方法においても、試薬の混合は、マイクロプレートのウェル中で行うことかできる。
【００７９】
本発明において、被検試料は、例えば、血液試料であることができる。
【００８０】
本発明においては、L-メチオニン分析と並行して、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリンおよびL-フェニルアラニンの少なくとも1つも併せて分析することができる。これは、本発明の方法で用いる本発明の改変酵素またはタンパク質が、L-メチオニンのみならず、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリンおよびL-フェニルアラニンの少なくとも1つに対しても、基質特異性を有するからである。
【実施例】
【００８１】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８２】
本発明におけるL-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-ロイシン、L-イソロイシンあるいはL-バリンの酵素蛍光定量法とは、生体試料（乾燥ろ紙血液から抽出された抽出液あるいは血清など）に対し本発明で開発された機能改変アミノ酸脱水素酵素をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）の存在下においてアルカリ領域の緩衝液下で作用させ、基質のアミノ基を酸化的脱アミノ化するとともにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）を還元型（NADH）に変換し、第二の酵素であるジアホラーゼ（Clostridium kluyveri由来；オリエンタル酵母社製）を作用させてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（NADH）の酸化を利用して蛍光基質であるレサズリン（Avocado Research Chemicals Ltd.社製）を還元し、蛍光物質のレゾルフィンを生成させる過程を含む。生成された蛍光物質（レゾルフィン）の蛍光強度は、蛍光・吸光・発光マイクロプレートリーダーGENios（テカンジャパン社製）を用いて測定した。
【００８３】
実施例１
［キメラ酵素の構築］
（1；鋳型pdh遺伝子の調製）
鋳型として用いたBacillus badius IAM11059およびBacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素遺伝子（pdh）およびその相補配列を組み込んだ大腸菌（Escherichia coli JM109 / pPDH1およびpPDH-DBL；European Journal of Biochemistry, vol. 168. 153-159 (1987)およびGene, vol. 63. 337-341 (1988)）よりアルカリSDS法にてプラスミドDNA（pPDH1およびpPDH-DBL）を抽出した。Bacillus badius IAM11059由来pdh遺伝子配列およびアミノ酸配列を配列番号１および２に、またBacillus sphaericus R79a由来のpdh遺伝子配列およびアミノ酸配列を配列番号３と４にそれぞれ示した。得られたプラスミドDNA 0.1 mlに対し、5 mg/mlに調整したRNase溶液（SIGMA社製）を加えて処理した。前記処理反応液を定法に従いフェノール・クロロホルム処理した。前記処理反応液をポリエチレングリコール沈澱処理し、精製鋳型プラスミドDNA溶液（pPDH1およびpPDH-DBL）を得た。
【００８４】
（2；ベクターの調製pUC18His）
本発明で用いたベクターは、pRSET-BベクターDNA（インビトロジェン社製）のリボゾーム結合配列部位の上流にEcoRIの制限酵素認識配列を合成プライマー（北海道システムサイエンス社製）で付加し、BamHIの制限酵素認識配列までの配列をPCRで増幅させ、pUC18ベクターDNA（タカラバイオ株式会社製）のマルチクローニングサイトEcoRIおよびBamHIのそれぞれの制限酵素認識部位に挿入したものを用いた。本ベクターはpUC18ベクターDNAのもつlacプロモーターにて目的遺伝子を誘導し、pRSET-B由来の6個の連続したヒスチジン配列を発現タンパク質のN末端側に融合させた状態でタンパク質を発現する。なお、本発明において調製された機能改変アミノ酸脱水素酵素遺伝子の組換えおよび発現に関しては、前記調製ベクターDNAに限定することなく行える。例えば、pRSET-BベクターDNA、pUC18ベクターDNA、pET21(+)ベクターDNAなど一般に市販されているベクターDNAであっても構わない。
【００８５】
以下に本発明で使用したベクターDNAの調製手順を示す。
pRSET-BおよびpUC18ベクターDNAを組込んだ組換え大腸菌（Escherichia coli JM109）培養液より定法に従ってpRSET-BおよびpUC18ベクターDNAを調製し、フェノール・クロロホルム抽出およびPEG沈澱法によりベクターDNAプラスミドの精製を行った。
【００８６】
（2−1；pRSET-BのPCR）
前記で得られたpRSET-BベクターDNAを鋳型DNAとしてEcoRI認識部位（一重下線表記）を含む合成オリゴヌクレオチドプライマー1：5'- gccgaattcttaagaaggagatatacata -3'（北海道システムサイエンス社製）(配列番号21)およびBamHI認識部位（一重下線表記）を含む合成オリゴヌクレオチドプライマー2：5'- gctcggatccttatcgtcatcgtc -3'（北海道システムサイエンス社製）(配列番号22)を用いてPCR（Polymerase Chain Reaction）を行い約0.1 kbの断片を得た。前記PCRは以下に示す反応液組成にて行った。10 ngの鋳型DNAプラスミド（精製pRSET-BベクターDNA）、100 pmol / μlの前記合成オリゴヌクレオチドプライマーを各々0.5 μl、10× KOD PCR buffer（TOYOBO社製）を2.5 μl、2.5 mM dNTP mixture（タカラバイオ株式会社製）を2.5 μl、およびKOD-Plus-DNAポリメラーゼ（TOYOBO社製）0.5 μlを加えて反応液量を総量25 μlとした。PCRの反応条件は、94℃15秒、55℃30秒、68℃20秒の反応サイクルを35回繰り返した。PCRはPTC-200ペルチェ・サーマルサイクラー（MJリサーチ・ジャパン（株）社製）を用いて行った。前記PCR反応液を泳動し、得られた増幅目的産物（約0.1 kb）を紫外線照射下において切り出し、ゲル抽出キットGel-MTM Gel Extraction Kit（VIOGENE社製）にて抽出、精製し30 μlの精製産物を得た。前記精製産物29 μlに対して10( K buffer（タカラバイオ社製）を3.5 μl、EcoRIおよびBamHIを各0.8 μlおよび滅菌超純水0.9 μlを加えて総量35 μlとして37℃にて3時間反応させて精製PCR産物両端の制限酵素処理を行った。前記反応液を泳動し、目的の断片（約0.1 kb）のバンドをゲル抽出キットGel-MTM Gel Extraction Kit（VIOGENE社製）にて抽出、精製し30 μlのHis-tag配列を含む精製挿入断片を得た。
【００８７】
（2−2；pUC18ベクターDNAの調製）
上記プラスミド抽出において得られた精製pUC18ベクターDNAを 10 μg、10× K buffer（タカラバイオ社製）を2 μl、EcoRIおよびBamHIを各1 μlおよび滅菌超純水を加えて総量20 μlとして37℃にて3時間反応させた。反応液20 μlに10× SAP buffer（ベーリンガーマンハイム社製）5 μl、シュリンプ由来アルカリフォスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社製）2 μlおよび滅菌超純水23 μlを加えて総量50 μlとして50℃で1時間反応させた後、さらにアルカリフォスファターゼ1 μlを加えて50℃にて30分間反応させた。反応液はフェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈澱等の定法により精製し、TE溶液に溶解した脱リン酸化pUC18ベクターDNAを30 μl調製した。
【００８８】
（2−3；ライゲーション反応）
上記（2−1および2−2）で得られた精製挿入断片およびベクターDNAを下記の手順に従って連結させた。1 μlの脱リン酸化pUC18ベクターDNA、5 μlの前記精製挿入断片、1 μl の10× Reaction buffer（New England Biolabs社製）および0.5 μlのT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs社製）を混合し総量10 μlとして16℃にて10時間連結反応を行った。
【００８９】
（2−4；大腸菌Escherichia coli JM109の形質転換）
前記反応液の一部をEscherichia coli JM109に形質転換した。生育した大腸菌のコロニーをアンピシリン塩を含むLB液体培地に植菌し、37℃12時間振とう培養した。培養液から定法にしたがってプラスミドDNAの精製を行った。前記精製プラスミドDNAの塩基配列解析は、LI-COR dNA Sequencer model 4000L（アロカ社製）を用いて行った。解析試料は、Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit（usb社製）を用いて同社プロトコルにしたがってPCRにより調製した。挿入断片の正しい配列が確認されたクローンをEscherichia coli JM109 / pUC18Hisとして本発明実験において使用した。
【００９０】
（3；キメラ挿入断片の調製）
pPDH1およびpPDH-DBLのpdhキメラ構築の概略を図２に示す。すなわち、pPDH1のPheDH由来N末端ドメイン（1番目のメチオニン（Met）から122番目のスレオニン（Thr）までを含むアミノ酸配列）とC末端ドメイン（124番目のスレオニン（Thr）から380番目のアスパラギン（Asn）までを含むアミノ酸配列）をPCRによりそれぞれ遺伝子断片として増幅した。ただし、ここで123番目のグリシン（Gly；ggt）に関しては、キメラ構築の際に異種酵素遺伝子との連結部位として用いるため、PCRに用いた合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列においてセリン（Ser；agt）となるように設計した。前記セリン（Ser）の塩基配列は、制限酵素ScaI（日本ジーン社製）の認識配列と一致するように設計した。前記同様にpPDH-DBLのPheDH由来N末端ドメイン（1番目のメチオニン（Met）から123番目のスレオニン（Thr）までを含むアミノ酸配列）とC末端ドメイン（125番目のスレオニン（Thr）から381番目のグルタミン酸（Glu）までを含むアミノ酸配列）をPCRによりそれぞれ遺伝子断片として増幅した。ただし、124番目のグリシン（Gly；ggt）に関してはセリン（Ser；agt）となるように合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
【００９１】
以下にキメラ構築の各ドメイン断片増幅に用いた合成オリゴヌクレオチドプライマー（北海道システムサイエンス社製）を示す。pPDH1のpdhキメラ断片増幅には、N末端ドメイン増幅用プライマーとしてfBBnch1: 5'- aaggatccgatgagcttagtagaaaaaaca -3'(配列番号23)、BBnScaI-2: 5'- cgtttctatacaagtactgat -3'(配列番号24)をそれぞれ用いた。また、C末端ドメイン増幅用プライマーとしてBBnScaI-1: 5'- cgtttctatacaagtactgat -3'(配列番号25)およびBBPstI: 5'- gatattcgcaactaactgcaggg -3'(配列番号26)をそれぞれ用いた。さらにpPDH-DBLのpdhキメラ断片増幅には、N末端ドメイン増幅用プライマーとしてfBSnch1: 5'- aaggatccgatggcaaaacagcttgaaaag -3'(配列番号27)とBSnScaI-4: 5'- gtcagtacttgtgtaaaatcg -3'(配列番号28)をそれぞれ用いた。C末端ドメイン増幅用プライマーとしてBSnScaI-3: 5'- cgattttacacaagtactgac -3'(配列番号29)とBSPstI: 5'- ccgctgcagttactcttttatg -3'(配列番号30)をそれぞれ用いた。
【００９２】
（3−1；キメラ断片のPCR増幅）
キメラ構築に用いる各ドメイン断片のPCRによる増幅反応は、次に示す手順ならびに方法に従って行った。前記（1）で調製したpPDH1およびpPDH-DBLプラスミドを鋳型DNAとして用いた。10 ngの鋳型DNA、100 pmol /μlの前記合成オリゴヌクレオチドプライマー（センス・プライマーおよびアンチセンス・プライマー）を各0.5 μl、10×PCR buffer（TOYOBO社製）を2.5μl、2.5 mM dNTP mixture（宝酒造社製）を2.5μlおよびKOD-Plus- DNAポリメラーゼを0.5μl加えて総量25μlとしてPCR反応を行った。また、PCRの反応条件は、94℃15秒、55℃30秒、68℃2分の反応サイクルを35回繰り返した。前記PCR反応液全量を1.5%アガロースゲルにて泳動し、得られた増幅目的産物（N末端ドメイン断片；約0.4 kb、C末端ドメイン断片；約0.7 kb）をゲル抽出キットGel-MTM Gel Extraction Kit（VIOGENE社製）にて抽出、精製し30μlの精製産物をそれぞれ得た。前記精製産物N末端ドメイン断片をBamHI（New England Biolabs社製）およびScaI（日本ジーン社製）の各制限酵素にて処理した。また、前記精製産物C末端ドメイン断片をScaIおよびPstI（MBI Fermentas社製）の各制限酵素にて処理した。前記反応液をそれぞれ泳動し、目的の断片（N末端ドメイン断片；約0.4 kb、C末端ドメイン断片；約0.7 kb）を切り出してゲル抽出キットGel-MTM Gel Extraction Kit（VIOGENE社製）にて抽出、精製しキメラドメイン断片を得た。
【００９３】
（3−2；キメラ酵素のライゲーションと形質転換）
前記精製キメラドメイン断片を用いてキメラ酵素の構築（連結反応）を行った。以下にその手順および方法を示す。ベクターDNAには、本発明実験で構築したpUC18HisベクターDNAを用い、予め定法に従ってベクターDNAをBamHIおよびPstIの両制限酵素にて消化し、脱リン酸化処理を施したものを用いた。Bacillus badius IAM11059由来pdhのN末端ドメインとBacillus sphaericus R79a由来pdhのC末端ドメインを連結反応させた。前記反応液を大腸菌（Escherichia coli JM109）に定法に従って形質転換した後、脱水素酵素活性を測定して選抜した。選抜されたクローンのDNAシーケンスを先述の方法に従って行い、目的のキメラ遺伝子およびその相補配列を有する菌株の選定を行った。得られたキメラ酵素遺伝子を含むプラスミドをpBBBS-14とした。また、Bacillus sphaericus R79a由来pdhのN末端ドメインとBacillus badius IAM11059由来pdhのC末端ドメインを用いてキメラ酵素を構築する場合も前記同様の手順で行い、得られたキメラ酵素遺伝子を含むプラスミドをpBSBB-32とした。得られたpBBBS-14の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号１７および１８に示し、pBSBB-32のキメラ酵素遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号１９および２０に示す。
【００９４】
（4；キメラ酵素のエラープローンPCR）
本発明において構築したキメラ酵素遺伝子（pdh-14およびpdh-32）を用い、エラープローンPCR法（Leung, D. W., Chen, E. および Goeddel, D. V. (1989) J. Methods Cell Mol. Biol. 1, 11-15）によるランダム変異導入酵素の構築およびスクリーニングを行った。すなわち、pBBBS-14およびpBSBB-32プラスミドDNAを鋳型としてPCR反応を行い、反応液中の塩基（アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）およびチミン（T））のそれぞれの添加濃度を調節し、かつ反応液中に添加する塩化マグネシウム（あるいは硫酸マグネシウムでもよい）および塩化マンガン（あるいは硫酸マンガンでもよい）の濃度を調節することによってDNA Taqポリメラーゼによる鋳型DNAの塩基配列読み取りの誤認識を誘発し、結果として鋳型DNAの無作為的な変異導入を引き起こすものである。
【００９５】
以下に本発明において行われたエラープローンPCRの条件を示す。本発明実験のPCRに用いた合成オリゴヌクレオチドプライマーは、センスプライマーとしてBBnch1；5'- aaggatccgatgagcttagta gaaaaaaca -3'(配列番号31)およびアンチセンスプライマーとしてBBPstI；5'- ccgctgcagttactcttttatg -3'(配列番号32)を用いた。PCRの反応液組成は、鋳型DNAプラスミド（pBBBS-14あるいはpBSBB-32の適当な濃度；例えば1〜100 ng好ましくは10〜50 ng）0.25 μl、マグネシウム無添加10× PCR buffer（宝酒造社製）2.5 μl、25 mM 塩化マグネシウム2.5 μl、2.5 mM dNTP mixture 2.5 μl、前記合成オリゴヌクレオチドプライマー各0.5 μl、5 mM 塩化マンガン10 μl、Taq polymerase 0.5 μl、および滅菌超純水5.75 μlの総量25 μlとした。 dNTP mixtureの濃度は、以下に示す濃度の組み合わせにより行った。（1）10 mM dATP、10 mM dCTP、5 mM dGTP、5 mM dTTP、（2）5 mM dATP、10 mM dCTP、5 mM dGTP、10 mM dTTP、（3）2 mM dATP、2 mM dCTP、10 mM dGTP、10 mM dTTP、および（4）10 mM dATP、10 mM dCTP、2 mM dGTP、2 mM dTTPである。
【００９６】
本発明実験において得られたキメラ酵素ランダム変異株のプラスミドは、pBBBS-14-4d7（前記（1）のdNTP mixture濃度セットにおいて得られた。）、pBBBS-14-16h3（前記（2）のdNTP mixture濃度セットにおいて得られた。）、pBBBS-14-92A3（前記（3）のdNTP mixture濃度セットにおいて得られた。）であった。pBBBS-14-4d7は、親株BBBS-14のアミノ酸配列において144番目のアミノ酸がアスパラギン（Asn）からリジン（Lsy）に変異していた。pBBBS-14-16h3では、親株のアミノ酸配列の100番目がアスパラギン酸（Asp）からバリン（Val）に、148番目のアミノ酸がグルタミン酸（Glu）からリジン（Lys）にそれぞれ変異していた。また、pBBBS-14-92A3においては親株アミノ酸配列の148番目のアミノ酸がグルタミン酸（Glu）からリジン（Lys）に、314番目のアミノ酸チロシン（Tyr）がヒスチジン（His）に、320番目のアミノ酸アルギニン（Arg）がトリプトファン（Trp）にそれぞれ変異していた。
【００９７】
（5；変異株の発現と酵素タンパク質の精製）
本発明で構築されたキメラ酵素遺伝子およびそのエラープローンPCRによるランダム変異導入酵素遺伝子の発現と発現酵素タンパク質の精製について以下に示す。本発明で構築されたキメラ酵素遺伝子を含むプラスミドpBBBS-14およびpBSBB-32によって形質転換された組換え大腸菌（Escherichia coli JM109 / pBBBS-14およびpBSBB-32）のコロニーを50 μg / mlのアンピシリン塩を含むLB培地（pH 7.5）4 mlが入った試験管にて37℃で12時間振とう培養した。前記培養液を50 μg / mlのアンピシリン塩を含むLB培地（pH 7.5）500 mlの入った2 リットル容坂口フラスコに植菌し37℃で12時間振とう培養し、0.5 M イソプロピル-β-D-ガラクトシド（IPTG；ナカライテスク社製）を終濃度0.5 mMとなるように添加し、培養温度を30℃に下げてさらに4時間振とう培養した。前記で得られた培養液を遠心分離（7,000 rpm、10分、4℃；日立高速冷却遠心機himac CR20F、日立社製）し、培養菌体を沈澱させ上清を除去した。前記得られた菌体を0.85%の生理的食塩水にて洗浄し、再度遠心分離（7,000 rpm、15分、4℃）にて菌体を集め、菌体湿潤重量に対して5倍容量の300 mM NaCl、5 mM 2-メルカプトエタノールおよび25 mM イミダゾールを含む20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0に懸濁させた後、超音波破砕装置（KUBOTA INSONATOR model 201M、久保田社製）を用いて200 W、20分、4℃にて菌体の破砕および酵素の抽出を行った。前記破砕液を遠心分離（15,000 rpm、20分、4℃；日立高速冷却遠心機himac CR20F）し、上清を無細胞抽出液として酵素タンパク質の精製に用いた。前記無細胞抽出液を予め0.1 M 硫酸ニッケル（NiSO4・6H2O；和光純薬工業社製）を充填し、結合緩衝液（300 mM NaCl、5 mM 2-メルカプトエタノールおよび25 mM イミダゾールを含む20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0）で平衡化したキレーティング・セファロース・ファスト・フロー樹脂（アマシャムバイオサイエンス社製）10 mlの充填されたカラムに添加した。カラム樹脂体積の15倍容量の洗浄用緩衝液（300 mM NaCl、5 mM 2-メルカプトエタノールおよび75 mM イミダゾールを含む20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0）にて樹脂の洗浄を行い、その後カラム樹脂体積の6倍容量の溶出用緩衝液（300 mM NaCl、5 mM 2-メルカプトエタノールおよび500 mM イミダゾールを含む20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0）にて結合した酵素タンパク質の溶出を行った。前記溶出画分を撹拌式限外ろ過濃縮装置（モデル8050；アミコン社製）を用いて濃縮し（限外ろ過膜PBQK：分画分子量50,000；ミリポア社製）、0.1 mM EDTAおよび5 mM 2-メルカプトエタノールを含む20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0に対して一晩透析した。透析を終えた試料は、予め0.1 mM EDTAおよび5 mM 2-メルカプトエタノールを含む20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0で平衡化した5 mlのHighQカラム（バイオ・ラッド社製）に低圧クロマトグラフィー・グラディエント・ポンプ（エコノ・グラディエント・ポンプ；バイオ・ラッド社製）を用いて添加し、同装置を用いて前記カラムを同上緩衝液にて洗浄した。カラム樹脂に結合した酵素タンパク質の溶出は、前記クロマトグラフィー・ポンプのプログラムを用い、同緩衝液中のNaCl濃度を0から0.75 Mまで連続濃度勾配させて溶出した。溶出画分は3 mlずつ試験管に分画し、各試験管のタンパク質濃度はGENiosマイクロプレートリーダーの280 nmフィルターを用いて牛血清アルブミンの所定濃度で作成した検量線をもとに算出し、酵素活性は同上マイクロプレートリーダーの340 nmの���ィルターを用いてカイネティック・モードにて340 nmにおける吸収の増加により確認した。精製酵素はドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により純度の確認を行った。得られた精製酵素を用いて本発明における実験を行った。
【００９８】
（6；酵素活性測定とタンパク質測定）
フェニルアラニン脱水素酵素活性およびキメラ酵素、ランダム変異酵素の活性測定は、浅野らの方法（Eur. J. Biochem. (1987)168(1), 153-159）に従ってダブルビーム分光光度計（HITACHI spectrophotometer model U-3210、日立社製）を用い、光路長1 cmのPMMA製キュベット（BRAND社製）で測定した。反応液の組成は以下のとおりとした。1 M Glycine-NaCl-NaOH buffer, pH 10.4を0.1 ml、25 mM NAD+（オリエンタル酵母社製）溶液を0.1 ml、0.1 M L-フェニルアラニン（日本理化学薬品社製）もしくはL-ロイシン（日本理化学薬品社製）あるいはL-メチオニン（日本理化学薬品社製）などの水溶液（酵素の性質によって基質特異性が異なるので、その都度適切な基質を選択する）を0.1 mlおよび適量の酵素溶液を加えて反応液総量を1.0 mlとした。補酵素NAD+の分子吸光係数（ε）は6,220 l・mol-1・cm-1とし、340 nmにおける吸光度の増加から単位時間（分）あたりの吸光度の変化率（Δ340 nm / min）を求め、活性を算出した。本発明における酵素活性１単位（U）は、1分間に1 μmolのNADHを生成する酵素量とした。比活性（U / mg）は、タンパク質1 mgあたりの酵素活性（U）として定義した。また、簡易酵素活性測定法として、上記反応液組成を総量200 μlとし、96穴UVプレート（グライナー社製）を用い、蛍光・吸光・発光マイクロプレートリーダーGENios（テカンジャパン社製）装置を用いて340 nmのフィルターにて吸光値の増加をカイネティック・モードで測定した。酵素溶液のタンパク質濃度は、Protein Assay Kit（バイオ・ラッド社製）により同社プロトコルにしたがって595 nmの吸光値から算出した。なお、標準タンパク質として牛血清アルブミン（シグマ社製）を用い任意の濃度を設定して検量線を作成した。
【００９９】
実施例２
［部位特異的変異酵素の作製］
（1；Bacillus badius IAM11059由来pdh遺伝子の部位特異的変異導入酵素の作出）
先述のキメラ構築機能改変アミノ酸脱水素酵素のアミノ酸配列において、pBBBS-14およびpBSBB-32由来いずれのPheDHにおいても各ドメインの連結部位においてグリシン（Gly）からセリン（Ser）への置換を行っており、本発明者らはこのアミノ酸置換がpdhの基質特異性の変化に重要であると考え、それぞれpPDH1およびpPDH-DBL由来のpdh遺伝子を鋳型DNAとして部位特異的変異導入（pPDH1由来pdhの123番目のアミノ酸およびpPDH-DBL由来pdhの124番目のアミノ酸）を行った。
【０１００】
以下にその手順を示す。部位特異的変異の導入は、QuikChange( Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE(社製）を用いてPCR反応により同社プロトコルに従って行った。変異導入に用いた合成オリゴヌクレオチドプライマーは、センスプライマーとして5'- cgtttctatacaagtactgatatggg -3'(配列番号33)を用い、アンチセンスプライマーとして5'- cccatatcagtacttgtatagaaacg -3'(配列番号34)をそれぞれ用いた。鋳型DNAとして精製pPDH1プラスミドを用いた。PCRの反応条件は、95℃30秒、55℃1分、68℃4分の工程を16回繰り返した。前記PCR反応終了後、先述のヒートショック法に従って形質転換した。前記形質転換体を含む培養液をLB培地寒天シャーレに塗布し、37℃で16時間静置培養した後、適当数のコロニーを選択してアンピシリンを含むLB試験管培地にて培養して部位特異的変異導入株培養液を得た。培養液は定法にしたがって処理し、精製プラスミドDNAを得た。挿入断片の正しい配列が確認されたクローンをEscherichia coli JM109 /pBB123Sとして本発明実験において使用した。また、本発明実験においてpBB123S以外に幾つかのアミノ酸置換が引き起こされた変異株が得られた。これらは本実験の意図しない偶発的な変異であったが、その変異株は218番目のアミノ酸がスレオニン（Thr；acg）がセリン（Ser；agc）にアミノ酸置換されたpBB123S218Sおよび218番目と287番目のアミノ酸がそれぞれセリン（Ser；agc）とグルタミン（Gln；cag）に置換されたpBB123S218S287Qが変異株として得られた。
【０１０１】
（2；Bacillus sphaericus R79a由来pdh遺伝子の部位特異的変異導入酵素の作出）
先述pBB123Sの作出と同様にBacillus sphaericus R79aのpdhにおいてもキメラ酵素構築時に連結部位（124番目のアミノ酸）にグリシン（Gly）からセリン（Ser）への置換を行っており、本アミノ酸置換の及ぼす基質特異性の変化について調べた。Bacillus sphaericus R79a由来pdh遺伝子を含むpPDH-DBLプラスミドを鋳型DNAとして用いた。部位特異的変異の導入は、QuikChange( Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE(社製）を用いてPCR反応により同社プロトコルに従って行った。変異導入に用いた合成オリゴヌクレオチドプライマーは、センスプライマーとして5'- cgattttacacaagtactgacatgggg-3'(配列番号35)を用い、アンチセンスプライマーとして5'- ccccatgtcagtacttgtgtaaaatcg-3'(配列番号36)をそれぞれ用い、以下先述同様の手順に従って行った。挿入断片の正しい配列が確認されたクローンをEscherichia coli JM109 /pBS124Sとして本発明実験において使用した。また、本発明実験とは意図しない部位特異的変異株が得られたが、その変異は124番目のグリシン（Gly）からセリン（Ser）へのアミノ酸置換以外に82番目のアミノ酸アラニン（Ala；gcc）がアルギニン（Arg；cgc）にアミノ酸置換された変異株pBS82R124Sが得られている。
【０１０２】
（2−1；部位特異的20種類アミノ酸置換）
Bacillus sphaericus R79a由来のpdhにおいて124番目のアミノ酸をグリシン（Gly；ggt）をセリン（Ser；agt）に置換することで親株の基質特異性を劇的に改変することができたので、124番目グリシン（Gly）をその他の20種類のアミノ酸（ただし終止コドンに置換されないこと）に置換して基質特異性の改変を試みた。部位特異的アミノ酸置換にあたっては、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い、QuikChange( Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE(社製）を用いたPCR反応により同社プロトコルに従って行った。変異導入に用いた合成オリゴヌクレオチドプライマーは、センスプライマー5'- cgattttacacannsactgacatgggg -3'(配列番号37)とアンチセンスプライマー5'- ccccatgtcagtsnntgtgtaaaatcg -3'(配列番号38)（n はアデニン（a）あるいはシトシン（c）あるいはグアニン（g）あるいはチミン（t）のいずれかの塩基である。s = c（シトシン）あるいはg（グアニン）のいずれかの塩基である。）をそれぞれ用いた。鋳型プラスミドDNAとして精製pPDH-DBLを用いた。前記PCR反応液を形質転換し、得られた形質転換体を培養した。遠心分離後、凍結融解法にて酵素液を抽出した。活性測定によりスクリーニングを行い、選抜菌株をアンピシリンを含むLB培地にて培養して部位特異的変異導入株培養液を得た。培養液は定法にしたがって処理し、精製プラスミドDNAを得、シーケンスによって変異が確認された菌株をEscherichia coli JM109 / pBS124Aとし、得られたプラスミドpBS124Aは、親株アミノ酸配列の124番目のアミノ酸がグリシン（Gly）からアラニン（Ala）に変異していた。
【０１０３】
（3；変異株の発現と酵素タンパク質の精製）
本発明で得られた部位特異的変異株遺伝子の発現と発現酵素タンパク質は先述の方法に従って行った。精製酵素はドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により純度の確認を行った。得られた精製酵素を用いて本発明における実験を行った。
【０１０４】
実施例３
［改変酵素の基質特異性］
本発明実験で用いた親株Bacillus badius IAM11059およびBacillus sphaericus R79a由来フェニルアラニン脱水素酵素の基質特異性を図5に示す。Bacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素（European Journal of Biochemistry, vol. 168. 153-159 (1987)）はL-フェニルアラニンに対する基質特異性が最も高いのに対し、Bacillus sphaericus R79a由来のフェニルアラニン脱水素酵素（The Journal of Biological Chemistry, vol. 262. 10346-10354 (1987)）はL-フェニルアラニン以外にL-チロシンに対しても高い基質特異性を示す。本発明で得られたキメラ酵素（pBBBS-14およびpBSBB-32）、キメラ酵素の変異株酵素（pBBBS-14-4d7、pBBBS-14-16h3およびpBBBS-14-92A3）、部位特異的変異導入株酵素（pBB123S、pBB123S218S、pBB123S218S287Q、pBS124S、pBS82R124SおよびpBS124A）の各精製酵素を用いて基質特異性（特にL-フェニルアラニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-メチオニンおよびL-バリン）について調べた。その結果を図３（キメラ酵素の基質特異性）、図４（Bacillus badius IAM11059由来pdhの部位特異的変異酵素の基質特異性）および図５（Bacillus sphaericus R79a由来pdhの部位特異的変異酵素の基質特異性）にそれぞれ示す。
【０１０５】
図３に示すように、本発明で得られたキメラ酵素pBBBS-14はロイシンに対する特異性が最も高く、続いてイソロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニンの順であった。一方、キメラ酵素pBSBB-32においてはイソロイシンに対する特異性が最も高く、続いてロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニンの順であった。pBBBS-14-4d7では、イソロイシンが最も高く、メチオニン、ロイシン、バリン、フェニルアラニンの順であった。pBBBS-14-16h3では、イソロイシンが最も高く、続いてロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニンの順であった。pBBBS-14-92A3では、イソロイシンが最も高く、続いてメチオニン、バリン、フェニルアラニンの順であった。
【０１０６】
また、図４に示すように、部位特異的変異導入株の酵素pBB123S、pBB123S218SおよびpBB123S218S287Qでは、いずれもロイシンに対する特異性が最も高く、続いてイソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニンの順であった。すなわちBacillus badius IAM11059由来pdhのアミノ酸置換で基質特異性改変（ロイシン特異性）に最も重要なアミノ酸は123番目のアミノ酸であるグリシン（Gly）をセリン（Ser）に置換することである。
【０１０７】
さらには、図５に示すように、部位特異的変異導入株酵素pBS124Sではイソロイシンに対する特異性が最も高く、続いてメチオニン、フェニルアラニン、ロイシン、バリンの順であった。pBS82R124Sではフェニルアラニンに対する特異性が最も高く、続いてロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリンの順であった。また、pBS124Aでは、ロイシンに対する特異性が最も高く、続いてバリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニンの順であった。すなわち、Bacillus sphaericus R79a由来pdhの基質特異性改変には124番目のアミノ酸グリシン（Gly）のセリン（Ser）への置換以外にもアミノ酸置換が関与することが示唆された。
【０１０８】
なお、前記記載のアミノ酸以外への反応性については、いずれの変異株酵素についても低い特異性を示すにとどまるかあるいは検出できないほどの活性しか示さなかった。また、本発明で用いられるフェニルアラニン脱水素酵素遺伝子は、Bacillus badius IAM11059あるいはBacillus sphaericus R79a以外の菌（例えば、Sporosarcina ureae R04、Bacillus halodurans、Geobacillus kaustophilus、Oceanobacillus iheyensis、Rhodococcus sp.あるいはThermoactinomyces intermediusなど）のいずれの由来であっても構わない。例えば、Sporosarcina ureae R04であれば125番目のアミノ酸、Bacillus haloduransでは122番目のアミノ酸、Geobacillus kaustophilusでは123番目のアミノ酸、Oceanobacillus iheyensisでは122番目のアミノ酸、Rhodococcus sp. M-4では117番目のアミノ酸、あるいはThermoactinomyces intermediusでは114番目のアミノ酸（いずれも対応するアミノ酸はグリシン（Gly）である。）などである。
【０１０９】
実施例４
［ろ紙血液中L-メチオニンの定量］
標準試料として、所定濃度のL-メチオニンを染み込ませた標準ろ紙血液（札幌イムノダイアグノスティック・ラボラトリー社製）から抽出したものを用いた。標準ろ紙血液からの抽出は、以下に示す手順によって行った。ろ紙血液上のスポットを直径3 mmのディスク状に打ち抜き、96穴マイクロプレート（コーニング社製）の各ウェル内に設置した。各ウェル内に設置されたディスク状のろ紙血液に対し、固定液（アセトン：エタノール：超純水＝7 : 7 : 2 (v/v/v)）10 μlを滴下して染み込ませ、37℃の恒温装置（ADVANTEC INCUBATOR Cl-410、アドバンテック社製）に1時間静置した。その後、プレートを取り出し、各ウェルに対し緩衝液（40 μM レサズリン（Avocado Research Chemicals Ltd.社製）を含む50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.9）を100 μl加えて蒸発防止のためのシーリングを施して室温にて1時間静置し、ろ紙血液に含まれる成分の抽出を行った。得られた抽出液80 μlを新しい黒色96穴マイクロプレートに移し取り、酵素混合液（0.2 U / mlの精製酵素、0.2 mg /mlのジアホラーゼ、6 mMのNAD+）40 μlを加えてミキサーにて撹拌した後、室温で60分間静置して酵素反応を行った。前記プレートの蛍光は、励起波長545 nm、蛍光波長590 nmのフィルターを用いて蛍光マイクロプレートリーダーにて測定した。
【０１１０】
同様にしてL-フェニルアラニンを染み込ませた標準ろ紙血液（札幌イムノダイアグノスティック・ラボラトリー社製）から得られた抽出液を、Bacillus badius IAM11059由来の組替え体フェニルアラニン脱水素酵素にて定量した。また、L-ロイシンを染み込ませた標準ろ紙血液から得られた抽出液は、市販のBacillus stearothermophilus由来のロイシン脱水素酵素（ユニチカ株式会社社製；0.2 U / ml）を用いて定量した。
【０１１１】
その結果、本発明で得られた酵素とBacillus badius IAM11059由来のフェニルアラニン脱水素酵素およびBacillus stearothermophilus由来のロイシン脱水素酵素を組み合わせることによってL-フェニルアラニン、L-ロイシンおよびL-メチオニンの酵素蛍光定量が可能でることが分かった。
【０１１２】
実施例５
［フェニルアラニン脱水素酵素の分子モデリング］
Bacillus sphaericus R79a由来フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列（Swiss-Prot accession No. P23307）を鋳型とし、カナダCCG社製統合計算化学システムプログラム（MOE）を用いてタンパク質のホモロジーモデリングを行った。相同性タンパク質の検索を行い、幾つかのアミノ酸脱水素酵素タンパク質を抽出した。前記で得られたアミノ酸配列をもとに多重配列アラインメントを行った。立体構造既知のアミノ酸脱水素酵素で最も相同性の高い値を示したBacillus sphaericus由来ロイシン脱水素酵素の立体構造座標（PDB accession No. 1LEH、相同性：47.2％）を鋳型として構造保持領域解析を同上プログラムで行い、Bacillus sphaericus R79a由来フェニルアラニン脱水素酵素の予測立体構造を構築した。構築された予測立体構造をMOEプログラムに含まれるAMBER '89/'94、CHARMM22およびEngh-Huber力場の各理論によるエネルギー極小化計算を行うことによって立体構造の最適化を行った。
【０１１３】
［補酵素NADの座標抽出と転写］
フェニルアラニン脱水素酵素の結晶構造解析はRhodococcus sp. M4由来の酵素で報告されている（Biochemistry, 38. 2326-2339 (1999)、Biochemistry, 39. 9174-9187 (2000)）。Rhodococcus sp. M4由来フェニルアラニン脱水素酵素の立体構造解析では、酵素タンパク質、補酵素（NAD+）および反応生成物（フェニルピルビン酸）の複合体での座標が解析されている（PDB accession No. 1BW9）。NAD+の座標を前記PDBデータから抽出し、上記予測立体構造データに移植した。前記参考文献に記述されているNAD+とタンパク質の相互作用するアミノ酸残基をB. sphaericus由来フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列のアラインメントから探索し、アミノ酸残基195番目のバリン（Val）、214番目のアスパラギン酸（Asp）、254番目のアラニン（Ala）および277番目のアスパラギン（Asn）を抽出した。MOEプログラムを使って、前記アミノ酸残基とNAD+が相互作用する原子間距離に拘束をかけ、同上プログラムを用いてエネルギー極小化計算を行い、予測立体構造においてNAD+が最も安定する空間座標を導き出した。
【０１１４】
［基質L-フェニルアラニンの座標抽出と転写］
前記NAD+と同様にして、基質L-フェニルアラニンの座標をRhodococcus sp. M4の立体構造座標（PDB accession No. 1C1D）から抽出し、上記で構築したBacillus sphaericus R79a由来フェニルアラニン脱水素酵素の予測立体構造データの座標上に移植した。上記同様の手順に従って酵素タンパク質とL-Pheが相互作用するアミノ酸残基として53番目のグリシン、79番目のリジン、91番目のリジンおよび126番目のアスパラギン酸と基質L-フェニルアラニンの原子間距離に拘束をかけてエネルギー極小化計算を行い、予測立体構造においてL-Pheが最も安定する空間座標を導き出した。
【０１１５】
［変異アミノ酸残基候補の抽出］
前記で構築されたB. sphaericus由来フェニルアラニン脱水素酵素のタンパク質・NAD+・L-フェニルアラニン複合予測立体構造をPDBデータ形式で出力し、分子モデル表示ソフト（PyMOL, DeLano Scientific LLC, South San Francisco, CA, USA）を使って描画した。基質（L-フェニルアラニン）リガンドとタンパク質分子表面が接触可能なアミノ酸残基を描画した立体構造で確認しながら抽出した。Rhodococcus sp. M4由来フェニルアラニン脱水素酵素（非特許文献1，2）において基質と相互作用するアミノ酸残基をアミノ酸配列アラインメントによって、B. sphaericus由来フェニルアラニン脱水素酵素のアミノ酸配列から抽出した。前記操作により合計28個のアミノ酸残基を候補として選択した。選択したアミノ酸残基は以下の表4に示すとおりである。
【０１１６】
［飽和変異によるスクリーニング］
前記28個のアミノ酸残基候補に対し、各々20種類のアミノ酸に飽和変異させるためにプライマーを作成（表4参照）し、Stratagene社製のQuikChange( Multi Site-Directed Mutagenesis Kitを用い同社プロトコールに従ってPCR法によって変異を導入した。本実施例においては、表5に示すプライマーの組み合わせを用い、Bacillus sphaericus R79a由来フェニルアラニン脱水素酵素の野生株（pBS）と変異酵素（BS124S）をそれぞれ鋳型としてPCRを行った（セット(1)、セット(2)、セット(3)およびセット(4)）。得られたPCR反応液を定法に従ってE. coli JM109に形質転換し、50 μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して37℃、10時間培養した。得られたコロニーを96穴ディーププレート（NUNC社製、80 μg/mlのアンピシリンを含むLB培地；300 μL）に植菌し1000 rpm、37℃で12〜18時間培養した。前記培養液を集菌し、リゾチーム処理および凍結融解操作により無細胞抽出液を抽出した。前記抽出酵素液10 μLを用い、96穴UVマイクロプレートのウェル内で酵素反応させ、マイクロプレートリーダーを用いて340nmにおける吸光度の増加を経時的に観測し、L-フェニルアラニン、L-ロイシンおよびL-メチオニンの各基質に対する活性をスクリーニングした。反応液組成は表6のとおりとした。
【０１１７】
【表４】
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【０１１８】
【表５】
2006271379.tif 000007
【０１１９】
【表６】
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【０１２０】
［2次スクリーニング］
上記スクリーニングでL-メチオニンに対する活性が改善された菌株を3 mLのLB試験管培地（50 μg/mlのアンピシリンを含む）で培養した。培養液1 mLを集菌、超音波破砕（Bioruptor、コスモバイオ社製）し無細胞抽出液を抽出した。また、同上培養液1 mLからプラスミドを定法に従って抽出・精製し、アプライド・バイオシステムズ社製のDNAシークエンサー３１０Aにて塩基配列の確認を行った。
【０１２１】
［発現変異酵素の精製］
変異導入およびL-メチオニンに対する活性の改善が確認された変異株を50 μg/mlのアンピシリンを含む3ｍLのLB試験管培地に1コロニー植菌し、37℃10時間培養した。前記培養液を種菌として、400 mLのLB培地の入った2 L容三角フラスコに植菌し、37℃12時間回転培養した。最終濃度0.1 mMとなるようにIPTGを添加し、さらに4〜6時間30℃で回転培養した。定法により集菌洗浄し、菌体湿重量に対して5倍容量の5 mM イミダゾール、5 mM ２−メルカプトエタノールおよび300 mM NaClを含む20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）を加えて懸濁させ、超音波破砕した。遠心分離によって得られた無細胞抽出液を、予めニッケル飽和させ同上緩衝液で平衡化したChelating-Sepharose Fast Flowカラム（樹脂量：約10 ml）に添加し、75 mM イミダゾールを含む同上緩衝液にてカラムを洗浄した後、500 mMイミダゾールを含む同上緩衝液にて酵素タンパク質を溶出させた。溶出された酵素活性画分に対し３０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて１時間氷冷水中にて撹拌し、遠心分離（28,000 x g、２０分間、4℃）によって上澄み液を得た。前記で得られた上澄み液を、予め30％硫安飽和させた0.1 mM EDTAおよび5 mM 2-メルカプトエタノールを含む20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）で平衡化したButyl-TOYOPEARL 650Mカラム（φ1.5 cm x 4.5 cm）に添加し、同上緩衝液にてカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム飽和度を直線濃度勾配（30%から0%まで）で減少させることにより酵素タンパク質の溶出を行った。前記で得られた酵素活性画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にて確認し、0.1 mM EDTAおよび5 mM ２−メルカプトエタノールを含む20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）に対して透析した後、遠心濃縮器（Amicon CentriPrep YM-30）にて濃縮し、精製酵素とした。
【０１２２】
［基質特異性］
フェニルアラニン脱水素酵素の活性測定は、浅野らの方法（Eur. J. Biochem. (1987)168(1), 153-159）に従ってダブルビーム分光光度計（PharmaSpec UV-1700、島津社製）を用い、光路長1 cmのPMMA製キュベット（BRAND社製）で測定した。反応液の組成は以下のとおりとした。1 M Glycine-NaCl-NaOH buffer, pH 10.4を0.1 ml、25 mM NAD+（オリエンタル酵母社製）溶液を0.1 ml、0.1 M L-フェニルアラニン（日本理化学薬品社製）もしくはL-ロイシン（日本理化学薬品社製）あるいはL-メチオニン（日本理化学薬品社製）などの水溶液（酵素の性質によって基質特異性が異なるので、その都度適切な基質を選択する）を0.1 mlおよび適量の酵素溶液を加えて反応液総量を1.0 mlとした。補酵素NAD+の分子吸光係数（ε）は6,220 l・mol-1・cm-1とし、340 nmにおける吸光度の増加から単位時間（分）あたりの吸光度の変化率（Δ340 nm / min）を求め、活性を算出した。本発明における酵素活性１単位（U）は、1分間に1 μmolのNADHを生成する酵素量とした。比活性（U / mg）は、タンパク質1 mgあたりの酵素活性（U）として定義した。その結果を図６に示す。pBS124Sを鋳型として変異導入した変異株の酵素pBS124S310S、pBS124S310TおよびpBS124S310Aはいずれもフェニルアラニンに比べてメチオニンに対する相対活性が改善されていた。一方、これらの変異株酵素（pBS124S310S、pBS124S310TおよびpBS124S310A）の124番目のアミノ酸を野生株のグリシン（Gly）に修正した変異型酵素（pBS124G310S、pBS124G310TおよびpBS124G310A）では、いずれもフェニルアラニンに対する活性が回復し、メチオニンに対する活性が著しく減少した。
【０１２３】
実施例６
［変異型酵素のアミノ酸蛍光定量］
96穴ブラックマイクロプレートウェル内に既知濃度のL-フェニルアラニンおよびL-メチオニンをそれぞれ0.04ml分注し、40μMレサズリンを含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.9）0.08mlを加えて撹拌し、0.04mlの酵素混合溶液（10mU 変異型フェニルアラニン脱水素酵素（pBS124S310S）、4mM β-NAD+、0.03mg/mlジアホラーゼ（オリエンタル酵母社製）を含む）を加えて室温にて1時間インキュベーションした。得られた蛍光は蛍光・吸光・発光マイクロプレートリーダー（テカン社製、ジェニオス）を用いて励起波長545 nm、蛍光波長590 nmのフィルターにて測定した。得られたデータはLS-PATE manager2001（和光純薬工業社製）を用いて解析した。作成した検量線を図７および定量結果を表7にそれぞれ示す。pBS124S310Sを用いて作成した検量線から、コントロール中に含まれるL-メチオニン濃度を定量することができた。このとき、これまでの改変型酵素ではL-フェニルアラニン濃度の影響の為、L-メチオニンの定量は困難であったが、pBS124S310S酵素を用いることでL-フェニルアラニンの共雑濃度に関係なくL-メチオニンを定量することができた。
【０１２４】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明において得られた機能改変アミノ酸脱水素酵素を用いることで、L-フェニルアラニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリンおよびL-メチオニンを蛍光検出することが可能となる。また、既存のフェニルアラニン脱水素酵素やロイシン脱水素酵素あるいはバリン脱水素酵素と組み合わせることで前記アミノ酸の酵素蛍光法による定量が可能となる。このことは、先天性代謝異常症の早期発見につながる1次スクリーニングやその他のアミノ酸疾患診断においてこれまでにない効率性を生み出すことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】Bacillus badius IAM11059、Bacillus sphaericus R79aおよびSporosarcina ureae R04に由来するフェニルアラニン脱水素酵素のＬ−トリプシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−メチオニンおよびＬ−バリンに対する基質特異性を相対活性によって示す。
【図２】pPDH1およびpPDH-DBLのpdhキメラ構築の概略図。
【図３】キメラ酵素（pBBBS-14およびpBSBB-32）、およびキメラ酵素の変異株酵素（pBBBS-14-4d7、pBBBS-14-16h3およびpBBBS-14-92A3）の基質特異性（L-フェニルアラニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-メチオニンおよびL-バリン）。
【図４】部位特異的変異導入株酵素（pBB123S、pBB123S218S、pBB123S218S287Q）の基質特異性（L-フェニルアラニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-メチオニンおよびL-バリン）。
【図５】部位特異的変異導入株酵素(pBS124S、pBS82R124SおよびpBS124A）の基質特異性（L-フェニルアラニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-メチオニンおよびL-バリン）。
【図６】部位特異的変異導入株酵素（pBS124S310S、pBS124S310T、pBS124S310A、pBS124G310S、pBS124G310TおよびpBS124G310A）の基質特異性（L-フェニルアラニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-メチオニン、L-バリンおよびL-チロシン）。
【図７】部位特異的変異導入株酵素（pBS124S310S）を用いた酵素蛍光定量の検量線（L-メチオニンとL-フェニルアラニン）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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