(57)【要約】      （修正有）【課題】DNA依存性であり、生理的に穏和な条件下でDNAの凝縮及び脱凝縮を可逆的に行うことができ、生体適用に際する安全性の確保が容易であり、かつ、入手が容易な核酸凝縮剤を提供する。【解決手段】核酸凝縮剤として、プロテインキナーゼ活性及びＤＮＡ結合活性を有するＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（DNA-PKcs）を有効成分とする。かかる核酸凝集活性により、核酸依存的に、かつ、生理的に温和な条件下で核酸を可逆的に凝縮及び脱凝縮させることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
DNA依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（DNA-PKcs）を含有することを特徴とする核酸凝縮剤。
【請求項２】
DNA-PKcsが配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の核酸凝縮剤。
【請求項３】
DNA凝縮剤である、請求項１又は２に記載の核酸凝縮剤。
【請求項４】
DNA-PKcsを含有する核酸凝縮剤の製造方法であって、以下の工程：
（１）DNA-PKcs含有細胞から、細胞核抽出液を得る工程、
（２）該細胞核抽出液を、弱アニオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核抽出物画分を得る工程、及び
（３）該核抽出物画分を濾過し、塩濃度を0.2M以下へ調節した後、変性DNA固定化セルロース樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核酸凝縮活性成分を得る工程
を含み、工程（２）〜（３）を同一の緩衝液の存在下で行うことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記工程（３）に続いて、以下の工程、
（３−２）工程（３）で得られた核酸凝縮活性成分を、塩濃度を0.1M以下へ調節した後、強アニオン交換樹脂を用いて更に濃縮する工程
を含み、該工程（３−２）を、前記同一の緩衝液の存在下で行う、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記同一の緩衝液が、Tris-HCl（pH 7.5）緩衝液に0.5mM EDTA及び1mM DTTを加えてなる緩衝液である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
DNA-PKcsを単離する方法であって、以下の工程：
（１）DNA-PKcs含有細胞から、細胞核抽出液を得る工程、
（２）該細胞核抽出液を、弱アニオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核抽出物画分を得る工程、
（３）該核抽出物画分を、濾過し、塩濃度を0.2M以下へ調節した後、変性DNA固定化セルロース樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核酸凝縮活性成分を得る工程、
（４）該核酸凝縮活性成分を、強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.16M〜0.21Mで溶出される画分を得る工程、
（５）該塩濃度0.16M〜0.21Mで溶出される画分を、高分離能強カチオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.15M〜0.21Mで溶出される画分を得る工程、及び
（６）該塩濃度0.15M〜0.21Mで溶出される画分を、塩濃度を0.1M以下へ調節した後、高分離能強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.18M〜0.20Mで溶出されるDNA-PKcs画分を得る工程
を含み、
工程（２）〜（６）を同一の緩衝液の存在下で行うことを特徴とする方法。
【請求項８】
前記工程（３）に続いて、以下の工程、
（３−２）工程（３）で得られた核酸凝縮活性成分を、塩濃度を0.1M以下へ調節した後、強アニオン交換樹脂を用いて更に濃縮する工程
を含み、該工程（３−２）を、前記同一の緩衝液の存在下で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記同一の緩衝液が、Tris-HCl（pH 7.5）緩衝液に0.5mM EDTA及び1mM DTTを加えてなる緩衝液である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
Ku因子を単離する方法であって、以下の工程：
（１）DNA-PKcs含有細胞から、細胞核抽出液を得る工程、
（２）該細胞核抽出液を、弱アニオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核抽出物画分を得る工程、
（３）該核抽出物画分を、濾過し、塩濃度を0.2M以下へ調節した後、変性DNA固定化セルロース樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核酸凝縮活性成分を得る工程、
（４）該核酸凝縮活性成分を、強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.22M〜0.25Mで溶出される画分を得る工程、
（５）該塩濃度0.22M〜0.25Mで溶出される画分を、塩濃度を0.1M以下へ調節した後、平衡化した高分離能強カチオン交換樹脂を通過させる工程、及び
（６）工程（５）で得られた画分を、塩濃度を0.1M以下へ調節した後、高分離能強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.20M〜0.22Mで溶出されるKu因子画分を得る工程
を含み、
工程（２）〜（６）を同一の緩衝液の存在下で行う
ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記工程（３）に続いて、以下の工程、
（３−２）工程（３）で得られた核酸凝縮活性成分を、塩濃度を0.1M以下へ調節した後、強アニオン交換樹脂を用いて更に濃縮する工程
を含み、該工程（３−２）を、前記同一の緩衝液の存在下で行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記同一の緩衝液が、Tris-HCl（pH 7.5）緩衝液に0.5mM EDTA及び1mM DTTを加えてなる緩衝液である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸を凝縮させる方法であって、
（１）DNA-PKcsを核酸に添加する工程、及び
（２）更にKu因子を添加する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
DNA-PKcsが配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ku因子が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するKu70と配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するKu80とのヘテロダイマーである、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
凝縮させる核酸がDNAである、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸凝縮剤及びその製造方法に関する。より詳しくは、DNA依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（DNA-PKcs）を含有する核酸凝縮剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸であるDNAを緻密に折り畳むことによりその高次構造を大きく変換させて凝縮させるDNA凝縮剤に関し、幾つかの報告がなされている。
しかしながら、報告されている従来のDNA凝縮剤は、作用するDNAの構造（特に、DNAの長さ）に対する特異性が低いため、当該凝縮剤による凝縮化によりDNAにどのような機能性が生じるのか（あるいは失われるのか）に関する十分な情報が得られなかった。そのため、従来のDNA凝縮剤には、汎用的な適用に際して多くの制約があった。
更に、従来のDNA凝縮剤の多くは、一旦凝縮したDNAを脱凝縮して元の状態に戻すことが困難であった。また、凝縮したDNAを脱凝縮することができるDNA凝縮剤であっても、脱凝縮後のDNAの利用を制限するような厳しい脱凝縮条件を必要としていた。更に、かかるDNA脱凝縮に際しては、煩雑な追加処理を余儀なくされていた。
【０００３】
DNAの凝縮は、DNAの細胞への導入効率を決定する一つの要因であると考えられている。DNA凝縮とDNA導入効率との関係が、DNA凝縮剤としてのポリアミン類を用いた研究で明らかされてきている。例えば、前記ポリアミン類の一つであるリポスペルミンは、高いDNA導入効率をもたらすことが示されており（例えば、非特許文献１を参照）、実際に遺伝子導入試薬（商品名：Transfectam）として商品化されている。
しかしながら、リポスペルミンによってDNAの導入効率を高め、かつ、導入したDNAの発現効率を高めるには、リポスペルミンとDNAとの複合体が、より高次に凝縮した構造体を形成することが重要であることが示されている（例えば、非特許文献２を参照）。また、リポスペルミンは化成品であるので、生体適用に際する安全性確保という課題がある。
また、スペルミンもDNA凝縮活性を有する物質であるが、スペルミンによって凝縮したDNAは細胞へ導入されてもDNA機能の発現が十分に起こらないことが示されている。
【０００４】
一方、精子核に豊富に存在する核タンパク質であるプロタミンも、DNA凝縮に寄与することが知られている（例えば、非特許文献３を参照）。プロタミンは、DNAと共にリポソームへ組み込まれたとき、プロタミン非存在下の場合と比較して、DNAを細胞内へ効率よく導入することが示されている（例えば、非特許文献４を参照）。しかしながら、プロタミンは通常の体細胞では発現しておらず、かつ、遺伝子発現を本質的に抑制する物質であるため、体細胞への適用には課題がある。
【０００５】
【非特許文献１】PNAS, 86; 6982-6986、PNAS, 92;1744-1748
【非特許文献２】FEBS, 396; 71-76
【非特許文献３】Science, 286; 120-123
【非特許文献４】Gene Therapy, 4; 961-968
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明は、作用する核酸（特にDNA）の構造（特に、DNAの長さ）に対する特異性が高く、生理的に穏和な条件下で核酸の凝縮及び脱凝縮を可逆的に行うことができ、生体適用に際する安全性の確保が容易であり、かつ、入手が容易な核酸凝縮剤及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者等は鋭意研究を行ったところ、プロテインキナーゼ活性及びDNA結合活性を有することが知られているDNA依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットが、これらの活性とは機能的に区別される核酸凝縮活性を有し、かかる核酸凝縮活性により、核酸依存的に、かつ、生理的に穏和な条件下で核酸を可逆的に凝縮及び脱凝縮させることができることを見出した。本発明は、この知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、
（ｉ）DNA依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（DNA-PKcs）を含有することを特徴とする核酸凝縮剤；
（ii）DNA-PKcsを含有する核酸凝縮剤の製造方法であって、以下の工程：
（１）DNA-PKcs含有細胞から、細胞核抽出液を得る工程、
（２）該細胞核抽出液を、弱アニオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核抽出物画分を得る工程、及び
（３）該核抽出物画分を濾過し、塩濃度を0.2M以下へ調節した後、変性DNA固定化セルロース樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核酸凝縮活性成分を得る工程
を含み、工程（２）〜（３）を同一の緩衝液の存在下で行うことを特徴とする方法；
（iii）DNA-PKcsを単離する方法であって、以下の工程：
（１）DNA-PKcs含有細胞から、細胞核抽出液を得る工程、
（２）該細胞核抽出液を、弱アニオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核抽出物画分を得る工程、
（３）該核抽出物画分を、濾過し、塩濃度を0.2M以下へ調節した後、変性DNA固定化セルロース樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核酸凝縮活性成分を得る工程、
（４）該核酸凝縮活性成分を、強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.16M〜0.21Mで溶出される画分を得る工程、
（５）該塩濃度0.16M〜0.21Mで溶出される画分を、高分離能強カチオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.15M〜0.21Mで溶出される画分を得る工程、及び
（６）該塩濃度0.15M〜0.21Mで溶出される画分を、塩濃度を0.1M以下へ調節した後、高分離能強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.18M〜0.20Mで溶出されるDNA-PKcs画分を得る工程
を含み、
工程（２）〜（６）を同一の緩衝液の存在下で行うことを特徴とする方法；
（iv）Ku因子を単離する方法であって、以下の工程：
（１）DNA-PKcs含有細胞から、細胞核抽出液を得る工程、
（２）該細胞核抽出液を、弱アニオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核抽出物画分を得る工程、
（３）該核抽出物画分を、濾過し、塩濃度を0.2M以下へ調節した後、変性DNA固定化セルロース樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核酸凝縮活性成分を得る工程、
（４）該核酸凝縮活性成分を、強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.22M〜0.25Mで溶出される画分を得る工程、
（５）該塩濃度0.22M〜0.25Mで溶出される画分を、塩濃度を0.1M以下へ調節した後、平衡化した高分離能強カチオン交換樹脂を通過させる工程、及び
（６）工程（５）で得られた画分を、塩濃度を0.1M以下へ調節した後、高分離能強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.20M〜0.22Mで溶出されるKu因子画分を得る工程
を含み、
工程（２）〜（６）を同一の緩衝液の存在下で行う
ことを特徴とする方法；並びに
（ｖ）核酸を凝縮させる方法であって、
（１）DNA-PKcsを核酸に添加する工程、及び
（２）更にKu因子を添加する工程
を含むことを特徴とする方法；
に関するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の核酸凝縮剤は、後述する実施例に示されるように、安全性の確保が容易でありかつ入手が容易な材料から得られ、かつ、生理的に穏和な条件下で核酸の凝縮及び脱凝縮を可逆的に行うことができる。したがって、本発明は、核酸であるDNAを細胞へ導入するに際し、導入DNAを凝縮することによって細胞内への導入効率を高めるDNA導入補助剤として有利に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の核酸凝縮剤は、DNA依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットを含有することを特徴とする。
DNA依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit（以下、DNA-PKcsとする））は、大きさ470kDaの核タンパク質である。
例えば、ヒト由来細胞から得られたDNA-PKcsは下記のアミノ酸配列を有していることが知られている。
【００１０】
DNA-PKcs
Met Ala Gly Ser Gly Ala Gly Val Arg Cys Ser Leu Leu Arg Leu Gln Glu Thr Leu Ser Ala Ala Asp Arg Cys Gly Ala Ala Leu Ala Gly His Gln Leu Ile Arg Gly Leu Gly Gln Glu Cys Val Leu Ser Ser Ser Pro Ala Val Leu Ala Leu Gln Thr Ser Leu Val Phe Ser Arg Asp Phe Gly Leu Leu Val Phe Val Arg Lys Ser Leu Asn Ser Ile Glu Phe Arg Glu Cys Arg Glu Glu Ile Leu Lys Phe Leu Cys Ile Phe Leu Glu Lys Met Gly Gln Lys Ile Ala Pro Tyr Ser Val Glu Ile Lys Asn Thr Cys Thr Ser Val Tyr Thr Lys Asp Arg Ala Ala Lys Cys Lys Ile Pro Ala Leu Asp Leu Leu Ile Lys Leu Leu Gln Thr Phe Arg Ser Ser Arg Leu Met Asp Glu Phe Lys Ile Gly Glu Leu Phe Ser Lys Phe Tyr Gly Glu Leu Ala Leu Lys Lys Lys Ile Pro Asp Thr Val Leu Glu Lys Val Tyr Glu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Glu Val His Pro Ser Glu Met Ile Asn Asn Ala Glu Asn Leu Phe Arg Ala Phe Leu Gly Glu Leu Lys Thr Gln Met Thr Ser Ala Val Arg Glu Pro Lys Leu Pro Val Leu Ala Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ser Ser Leu Leu Cys Asn Phe Thr Lys Ser Met Glu Glu Asp Pro Gln Thr Ser Arg Glu Ile Phe Asn 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Cys Asp Glu Leu Leu Leu Gly His Glu Lys Ala Pro Ala Phe Arg Asp Tyr Val Ala Val Ala Arg Gly Ser Lys Asp His Asn Ile Arg Ala Gln Glu Pro Glu Ser Gly Leu Ser Glu Glu Thr Gln Val Lys Cys Leu Met Asp Gln Ala Thr Asp Pro Asn Ile Leu Gly Arg Thr Trp Glu Gly Trp Glu Pro Trp Met （配列番号１）
【００１１】
DNA-PKcsは、タンパク質を構成する特定のアミノ酸残基をリン酸化するプロテインキナーゼ活性を有することが既に知られているタンパク質である。また、DNAへの結合活性を有することも知られている。本発明は、本発明者が初めて見出したDNA-PKcsの核酸凝縮活性と脱凝縮活性とを利用するものである。尚、後述するように、DNA-PKcsの核酸凝縮活性は、核酸結合活性に依存するが、プロテインキナーゼ活性からは独立している。一方、核酸脱凝縮活性はプロテインキナーゼ活性に依存的である。
【００１２】
本発明のDNA-PKcsを含有する核酸凝縮剤は、以下の工程：
（１）DNA-PKcs含有細胞から、細胞核抽出液を得る工程、
（２）該細胞核抽出液を、弱アニオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核抽出物画分を得る工程、及び
（３）該核抽出物画分を濾過し、塩濃度を0.2M以下へ調節した後、変性DNA固定化セルロース樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核酸凝縮活性成分を得る工程
を含み、
工程（２）〜（３）を同一の緩衝液の存在下で行うことを特徴とする方法により製造することができる。以下、各工程を説明する。
【００１３】
工程（１）
DNA-PKcsを含有する細胞としては、ヒト細胞、マウス細胞、ウシ細胞、トリ細胞、カエル細胞等が挙げられる。これらのなかでは、ヒト細胞、マウス細胞及びトリ細胞由来のDNA-PKcsに関する研究が積極的に行われており、特にヒト細胞由来のDNA-PKcsについては知見が豊富であるので、本発明でも好適に利用することができる。
利用可能なヒト由来細胞としては、ヒト胎盤組織由来細胞、正常ヒトリンパ系細胞、がん組織由来細胞、及びES細胞が挙げられる。また、公正な手続きを経て取得された人体組織も、安全性が確保される限りにおいて利用可能である。これらの中では、ヒト胎盤組織由来細胞及び正常ヒトリンパ系細胞が好ましく、DNA-PKcsの収率及び精製度が高く、生体適用に際しての安全性の確保が容易であり、かつ、DNA-PKcs の豊富な産生量や夾雑タンパク質の少なさ、入手の容易さにおいてヒト胎盤組織由来細胞が特に利用価値がある。
DNA-PKcs含有細胞は、胎盤組織等の生体組織から採取したものをそのまま使用してもよく、採取後に培養して得られるものを使用してもよい。また、DNA-PKcs含有細胞は生細胞でもよく、凍結保存細胞でもよい。
DNA-PKcs含有細胞として胎盤組織から採取した細胞をそのまま使用する場合、細胞核抽出液は、胎盤組織を細かく切り分けた後、公知の方法（例えば、Dignam, J.D., Lebovitz, R.M. and Roeder, R.G. (1983) Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res., 11, 1475-1489. の方法）にしたがい得ることができる。
DNA-PKcs含有細胞として培養細胞を使用する場合、細胞核抽出液は、公知の方法（例えば、上記のDignam 法）にしたがい得ることができる。尚、DNA-PKcs含有細胞は、公知の方法（例えば、TISSUE CULTURE Methods and Application, (1973) eds. Paul F. Kruse and M. K. Patterson (ACADEMIC PRESS, NY) に記載の方法）にしたがい培養することができる。
【００１４】
工程（２）
弱アニオン交換樹脂とは、「pH6.5〜7.5のみにおいて完全な解離状態を示すアミノ基」をイオン交換基として有する樹脂をいう。
「pH6.5〜7.5のみにおいて完全な解離状態を示すアミノ基」の具体例としてはジエチルアミノ基が挙げられる。
イオン交換基を結合させる樹脂としては、デキストラン樹脂（例えば、セファデックス（Sehadex））及びアガロース樹脂（例えば、セファロース（Sepharose））を使用することができる。本工程では、強度及び流速特性に優れる架橋度６％の高度架橋のデキストラン樹脂及びセファロース樹脂を好適に使用することができる。また、樹脂は多孔性であり、かつ、均一な球状粒子であることが好ましい。本工程では、市販されている平均粒子径が90μmの樹脂を使用することができる。
弱アニオン交換樹脂の具体例としては、DEAE-セファロース樹脂（イオン交換基：ジエチルアミノエチル基、樹脂：多孔性のアガロース樹脂、樹脂の形状：球状、平均粒子径：90μm）（Amersham Biosciences）が挙げられる。
弱アニオン交換樹脂は、抽出操作の効率を高めるために、対イオンとして機能する塩化物イオン（Cl-）を含む塩を含有する中性域緩衝液を用いて予め平衡化させておくことが好ましい。塩化物イオンを含む塩としてはNaCl及びKCl等が挙げられ、NaClが好ましい。中性域緩衝液としては、分子生物学的試験で一般的に使用されるもの、例えばTris-HClや、HEPES-NaOH系緩衝液や、Tris-HCl（pH 7.5）緩衝液に0.5mM EDTA及び1mM DTT（ジチオスレイトール）を加えてなる緩衝液（以下、緩衝液Rという）へ更に0.5M NaClを添加したもの等を使用することができる。本工程では、緩衝液Rを好適に用いることができる。
工程（１）で得た細胞核抽出液と、弱アニオン交換樹脂とを混合して、核酸成分を弱アニオン交換樹脂へ吸着させる。ここで、核酸成分とは、DNA及びRNAをいう。
次いで、混合物を遠心分離に付し、上澄みを核抽出物画分として得る。
【００１５】
工程（３）
変性DNA固定化セルロース樹脂とは、DNA鎖切断酵素により部分的にニックを入れ、更に高温で熱変性させたDNAを固定化してなるセルロース樹脂をいう。
固定化させるDNAとしては、高純度で調製することが容易なサケ精子や仔牛胸腺由来のゲノムDNA等が挙げられる。また、合成DNAも使用可能である。
DNA鎖切断酵素としては、例えば、種々の哺乳動物に由来する Pancreatic DNase等が挙げられる。
セルロース樹脂としては、例えば市販のWhatman CF-1 cellulose等が挙げられる。
変性DNA固定化セルロース樹脂は、例えばAlberts等の方法（Alberts, B. 及びHerrick, G.The Methods in Enzymology, 21, 198-217 (1971)）にしたがい調製することができる。
また、市販されているDNA-Cellulose (denatured DNA)（Amersham Biosciences）を使用することもできる。
核抽出物画分は、変性DNA固定化セルロース樹脂へロードするに先立ち、フィルターで濾過する。濾過することにより夾雑物を十分に除去できるので、変性DNA固定化セルロース樹脂カラムの目詰まりを防止することができる。
濾過に用いるフィルターの孔径は0.45μm以下、好ましくは0.22μm以下、特に好ましくは0.2μmである。
次いで、画分の塩濃度を、緩衝液を用いて0.2M以下、好ましくは0.1M〜0.2M、特に好ましくは0.2Mへと調節する。緩衝液を用いて塩濃度を0.2M以下へと調節することにより、0.2M以下の塩存在下において樹脂に結合する活性画分を効果的に保持することができる。塩濃度の調節に用いる緩衝液としては、分子生物学的試験で一般的に使用されるもの、例えばTris-HClや、HEPES-NaOH系緩衝液や、緩衝液R等を使用することができる。本工程では、緩衝液Rを好適に用いることができる。
工程（２）で得られた核抽出物画分を、濾過及び塩濃度を調節した後、変性DNA固定化セルロース樹脂を充填したカラムへロードして、核酸凝縮活性成分を変性DNA固定化セルロース樹脂へ吸着させる。核酸凝縮活性成分とは、DNA-PKcs及び後述するKu因子をいう。
次いで、吸着した核酸凝縮活性成分を、塩を含有する緩衝液を用いて溶離することにより核酸凝縮活性成分を得る。塩としてはNaCl及びKCl等が挙げられ、NaClが好ましい。緩衝液としては、分子生物学的試験で一般的に使用されるもの、例えばTris-HClや、HEPES-NaOH系緩衝液や、緩衝液R等を使用することができる。本工程では、緩衝液Rを好適に用いることができる。
【００１６】
本発明では、上記（１）〜（３）の工程に続いて以下の工程：
（３−２）工程（３）で得られた核酸凝縮活性成分を、塩濃度を0.1M以下へ調節した後、強アニオン交換樹脂を用いて更に濃縮する工程
を含んでいてもよい。工程（３−２）により、混入物が少ない核酸凝縮活性成分を得ることができる。
【００１７】
工程（３−２）
強アニオン交換樹脂とは、「pH1〜14において完全に解離する４級アミノ基」をイオン交換基として有する樹脂をいう。
「pH1〜14において完全に解離する４級アミノ基」の具体例としては-N+(CH3)3基が挙げられる。
かかるイオン交換基を有する強アニオン交換樹脂は、pHの変化に対する安定性が高く（pHが変化してもイオン交換基の解離状態が変化しない）、サンプルとイオン交換基との非特異的な相互作用（分解能を低下させる）が少ないので、タンパク質の精密な分画が可能となる。
イオン交換基を結合させる樹脂としては、強度や流速特性に優れる単分散系親水性ポリエーテル樹脂（例えば、MonoBeads）を好適に使用することができる。また、樹脂は多孔性であり、かつ、均一な球状粒子であることが好ましい。本工程では、市販されている平均粒子径が10μmの樹脂を使用することができる。
強アニオン交換樹脂の具体例としては、Mono Q（イオン交換基：-N+(CH3)3基、樹脂：多孔性の単分散系親水性ポリエーテル樹脂、樹脂の形状：球状、平均粒子径：10μm）（Amersham Biosciences）が挙げられる。
工程（３）で得られた核酸凝縮活性成分は、強アニオン交換樹脂へ付するに先立ち、その塩濃度を、緩衝液を用いて0.1M以下、好ましくは0.05M〜0.1M、特に好ましくは0.1Mへと調節する。塩濃度を0.1M以下へと調節することにより、タンパク質の活性を保持しつつ、凝縮活性タンパク質の強アニオン交換樹脂への吸着量を最適化することができる。塩濃度の調節に用いる緩衝液としては、分子生物学的試験で一般的に使用されるもの、例えばTris-HClや、HEPES-NaOH系緩衝液や、緩衝液R等を使用することができる。本工程では、緩衝液Rを好適に用いることができる。
工程（３）で得られた核酸凝縮活性成分を、塩濃度を調節し、強アニオン交換樹脂を充填したカラムへロードした後、塩を含有する緩衝液を用いて溶離することにより濃縮された核酸凝縮活性成分を得る。塩としてはNaCl及びKCl等が挙げられ、NaClが好ましい。塩濃度の調節に用いる緩衝液としては、分子生物学的試験で一般的に使用されるもの、例えばTris-HClや、HEPES-NaOH系緩衝液や、緩衝液R等を使用することができる。本工程では、緩衝液Rを好適に用いることができる。
【００１８】
本発明の核酸凝縮剤の製造方法では、吸着樹脂カラムを用いる工程（２）〜（３）（工程（３−２）を行う場合は、当該工程を含む）を同一の緩衝液、好ましくは、Tris-HCl、HEPES-NaOH系緩衝液及び緩衝液R、特に好ましくは緩衝液Rの存在下で行う。これにより、従来技術では必要とされていた煩雑な緩衝液交換の省略及び操作時間の短縮が可能となり、かつ、蛋白質の不活性化や回収ロスを低減することができる。
【００１９】
上記の製造方法により得られる核酸凝縮剤は、DNA-PKcsの他に後述するKu因子を含んでいる。そこで、DNA-PKcsの単離は、以下の工程：
（１）DNA-PKcs含有細胞から、細胞核抽出液を得る工程、
（２）該細胞核抽出液を、弱アニオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核抽出物画分を得る工程、
（３）該核抽出物画分を、濾過し、塩濃度を0.2M以下へ調節した後、変性DNA固定化セルロース樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核酸凝縮活性成分を得る工程、
（４）該核酸凝縮活性成分を、強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.16M〜0.21Mで溶出される画分を得る工程、
（５）該塩濃度0.16M〜0.21Mで溶出される画分を、高分離能強カチオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.15M〜0.21Mで溶出される画分を得る工程、及び
（６）該塩濃度0.15M〜0.21Mで溶出される画分を、塩濃度を0.1M以下へ調節した後、高分離能強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.18M〜0.20Mで溶出されるDNA-PKcs画分を得る工程
を含む方法により行うことができる。以下、各工程を説明する。
【００２０】
工程（１）〜（３）
工程（１）〜（３）は、前述の核酸凝縮剤の製造方法の工程（１）〜（３）と同様に行うことができる。また、混入物が少ない核酸凝縮活性成分を得るために、（１）〜（３）の工程に続いて前述の核酸凝縮剤の製造方法の工程（３−２）を行ってもよい。
【００２１】
工程（４）
本工程で用いる強アニオン交換樹脂としては、前述の工程（３−２）で用いるものと同様のものが使用可能である。
工程（３）で得た核酸凝縮活性成分を、強アニオン交換樹脂を充填したカラムへロードした後、塩濃度0.1M〜1.0Mの塩を含む緩衝液を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する。塩濃度勾配クロマトグラフィーに用いることができる塩としては、NaCl及びKCl等が挙げられる。これらの塩のうち、機能試験への容易な適用性からNaClが特に好ましい。緩衝液としては、分子生物学的試験で一般的に使用されるもの、例えばTris-HClや、HEPES-NaOH系緩衝液や、緩衝液R等を使用することができる。本工程では、緩衝液Rを好適に用いることができる。
回収した画分のうち、塩濃度0.16M〜0.21Mで溶出される画分を次工程に用いる。前記塩濃度0.16M〜0.21Mで溶出される画分は、溶離液の紫外吸収域（280nm）における検出モニターで最大のピークを含む画分として特定することができる。
【００２２】
工程（５）
本工程で用いる高分離能強カチオン交換樹脂とは、「pH1〜14において完全に解離するスルホン酸基」をイオン交換基として有し、無孔性であり、かつ、真球状である樹脂をいう。
「pH1〜14において完全に解離するスルホン酸基」の具体例としてはメチルスルフォン酸基(-CH2SO3-)が挙げられる。
イオン交換基を結合させる樹脂としては、強度や流速特性に優れる単分散系合成ポリマー樹脂を好適に使用することができる。また、3μmの平均粒子径を有している樹脂を好適に使用することができる。
かかる構成を有することにより、樹脂表面上でカチオン交換反応を効率よく行うことができる。
高分離能強カチオン交換樹脂の具体例としては、Mini S（イオン交換基：メチルスルフォン酸基(-CH2SO3-)、樹脂：無孔性の単分散系合成ポリマー樹脂、樹脂の形状：真球状、平均粒子径：3μm）（Amersham Biosciences）が挙げられる。
工程（４）で得た塩濃度0.16M〜0.21Mで溶出される画分は、高分離能強カチオン交換樹脂へロードするに先立ち、前述の緩衝液Rを用いて画分の塩濃度を0.1Mへと調節しておくことが好ましい。
また、高分離能強カチオン交換樹脂は、抽出操作の効率を高めるために、対イオンとして機能するナトリウムイオン（Na+）やカリウムイオン（K+）を含む塩を含有する中性域緩衝液を用いて予め平衡化させておくことが好ましい。
工程（４）で得た塩濃度0.16M〜0.21Mで溶出される画分を、塩濃度を調節し、高分離能強カチオン交換樹脂を充填したカラムへロードした後、塩濃度0.1M〜1.0Mの塩を含む緩衝液を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する。塩濃度勾配クロマトグラフィーに用いることができる塩としては、NaCl及びKCl等が挙げられる。これらの塩のうち、機能試験への容易な適用性からNaClが特に好ましい。緩衝液としては、分子生物学的試験で一般的に使用されるもの、例えばTris-HClや、HEPES-NaOH系緩衝液や、緩衝液R等を使用することができる。本工程では、緩衝液Rを好適に用いることができる。
回収した画分のうち、塩濃度0.15M〜0.21Mで溶出される画分を次工程に用いる。前記塩濃度0.15M〜0.21Mで溶出される画分は、溶離液の紫外吸収域（280nm）における検出モニターで最大のピークを含む画分として特定することができる。
【００２３】
工程（６）
本工程で用いる高分離能強アニオン交換樹脂とは、「pH1〜14において完全に解離する４級アミノ基」をイオン交換基として有し、無孔性であり、かつ、真球状である樹脂をいう。
「pH1〜14において完全に解離する４級アミノ基」の具体例としては-N+(CH3)3基が挙げられる。
イオン交換基を結合させる樹脂としては、強度や流速特性に優れる単分散系合成ポリマー樹脂、好ましくは単分散系親水性ポリエーテル樹脂（例えば、MonoBeads）を使用することができる。また、３μmの平均粒子径を有している樹脂を好適に使用することができる。
かかる構成を有することにより、樹脂表面上でアニオン交換反応を効率よく行うことができる。
高分離能強アニオン交換樹脂の具体例としては、Mini Q（イオン交換基：-N+(CH3)3基、樹脂：無孔性の単分散系親水性ポリエーテル樹脂、樹脂の形状：真球状、平均粒子径：3μm）（Amersham Biosciences）が挙げられる。
工程（５）で得た塩濃度0.15M〜0.21Mで溶出される画分は、高分離能強アニオン交換樹脂へロードするに先立ち、緩衝液を用いて塩濃度を0.1M以下、好ましくは0.05M〜0.1M、特に好ましくは0.1Mへと調節する。塩濃度を0.1M以下へと調節することにより、タンパク質の活性を保持しつつ、凝縮活性タンパク質の高分離能強アニオン交換樹脂への吸着量を最適化することができる。塩濃度の調節に用いる緩衝液としては、分子生物学的試験で一般的に使用されるもの、例えばTris-HClや、HEPES-NaOH系緩衝液や、緩衝液R等を使用することができる。本工程では、緩衝液Rを好適に用いることができる。
工程（５）で得た塩濃度0.15M〜0.21Mで溶出される画分を、塩濃度を調節後、高分離能強アニオン交換樹脂を充填したカラムへロードし、塩濃度0.1M〜1.0Mの塩を含む緩衝液を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィー工程に付する。塩濃度勾配クロマトグラフィーに用いることができる塩としては、NaCl及びKCl等が挙げられる。これらの塩のうち、機能確認の試験への容易な適用性からNaClが特に好ましい。緩衝液としては、分子生物学的試験で一般的に使用されるもの、例えばTris-HClや、HEPES-NaOH系緩衝液や、緩衝液R等を使用することができる。本工程では、緩衝液Rを好適に用いることができる。
回収した画分のうち、塩濃度0.18M〜0.20Mで溶出される画分ををDNA-PKcs画分として得ることができる。前記塩濃度0.18M〜0.20Mで溶出される画分は、溶離液の紫外吸収域（280nm）における検出モニターで最大のピークを示す画分として特定することができる。
【００２４】
本発明の核酸凝縮剤の製造方法では、吸着樹脂カラムを用いる工程（２）〜（６）（工程（３−２）を行う場合は、当該工程を含む）を同一の緩衝液、好ましくは、Tris-HCl、HEPES-NaOH系緩衝液及び緩衝液R、特に好ましくは緩衝液Rの存在下で行う。これにより、従来技術では必要とされていた煩雑な緩衝液交換の省略及び操作時間の短縮が可能となり、かつ、蛋白質の不活性化や回収ロスを低減することができる。
【００２５】
DNA-PKcsとしては、前述の方法にしたがい生体組織から得た天然物を好適に使用することができるが、これに限定されるものではなく、例えば遺伝子組み換え製品を使用することもできる。
【００２６】
本発明の核酸凝縮剤を用いて核酸を凝縮するとき、DNA-PKcsの核酸凝縮活性を促進するために、Ku70とKu80とのヘテロダイマーであるKu因子を添加することができる。但し、Ku因子はDNA-PKcsを添加した後に添加する必要がある。
Ku因子は、DNA-PKcsのプロテインキナーゼ活性を調節することが知られている核タンパク質である。Ku因子は、Ku70とKu80とのヘテロダイマーである。
Ku因子の構成成分であるKu70及びKu80は、それぞれ大きさ70kDa及び80kDaであり、細胞中又は試験管内において安定なヘテロダイマーを形成し、DNA切断末端ヘ特異的に結合することが知られているタンパク質である。
ヒト由来細胞から得られたKu70及びKu80は、それぞれ下記のアミノ酸配列を有していることが知られている。
【００２７】
Ku70
Met Ser Gly Trp Glu Ser Tyr Tyr Lys Thr Glu Gly Asp Glu Glu Ala Glu Glu Glu Gln Glu Glu Asn Leu Glu Ala Ser Gly Asp Tyr Lys Tyr Ser Gly Arg Asp Ser Leu Ile Phe Leu Val Asp Ala Ser Lys Ala Met Phe Glu Ser Gln Ser Glu Asp Glu Leu Thr Pro Phe Asp Met Ser Ile Gln Cys Ile Gln Ser Val Tyr Ile Ser Lys Ile Ile Ser Ser Asp Arg Asp Leu Leu Ala Val Val Phe Tyr Gly Thr Glu Lys Asp Lys Asn Ser Val Asn Phe Lys Asn Ile Tyr Val Leu Gln Glu Leu Asp Asn Pro Gly Ala Lys Arg Ile Leu Glu Leu Asp Gln Phe Lys Gly Gln Gln Gly Gln Lys Arg Phe Gln Asp Met Met Gly His Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Ser Glu Val Leu Trp Val Cys Ala Asn Leu Phe Ser Asp Val Gln Phe Lys Met Ser His Lys Arg Ile Met Leu Phe Thr Asn Glu Asp Asn Pro His Gly Asn Asp Ser Ala Lys Ala Ser Arg Ala Arg Thr Lys Ala Gly Asp Leu Arg Asp Thr Gly Ile Phe Leu Asp Leu Met His Leu Lys Lys Pro Gly Gly Phe Asp Ile Ser Leu Phe Tyr Arg Asp Ile Ile Ser Ile Ala Glu Asp Glu Asp Leu Arg Val His Phe Glu Glu Ser Ser Lys Leu Glu Asp Leu Leu Arg Lys Val Arg Ala Lys Glu Thr Arg Lys Arg Ala Leu Ser Arg Leu Lys Leu Lys Leu Asn Lys Asp Ile Val Ile Ser Val Gly Ile Tyr Asn Leu Val Gln Lys Ala Leu Lys Pro Pro Pro Ile Lys Leu Tyr Arg Glu Thr Asn Glu Pro Val Lys Thr Lys Thr Arg Thr Phe Asn Thr Ser Thr Gly Gly Leu Leu Leu Pro Ser Asp Thr Lys Arg Ser Gln Ile Tyr Gly Ser Arg Gln Ile Ile Leu Glu Lys Glu Glu Thr Glu Glu Leu Lys Arg Phe Asp Asp Pro Gly Leu Met Leu Met Gly Phe Lys Pro Leu Val Leu Leu Lys Lys His His Tyr Leu Arg Pro Ser Leu Phe Val Tyr Pro Glu Glu Ser Leu Val Ile Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ser Ala Leu Leu Ile Lys Cys Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Cys Arg Tyr Thr Pro Arg Arg Asn Ile Pro Pro Tyr Phe Val Ala Leu Val Pro Gln Glu Glu Glu Leu Asp Asp Gln Lys Ile Gln Val Thr Pro Pro Gly Phe Gln Leu Val Phe Leu Pro Phe Ala Asp Asp Lys Arg Lys Met Pro Phe Thr Glu Lys Ile Met Ala Thr Pro Glu Gln Val Gly Lys Met Lys Ala Ile Val Glu Lys Leu Arg Phe Thr Tyr Arg Ser Asp Ser Phe Glu Asn Pro Val Leu Gln Gln His Phe Arg Asn Leu Glu Ala Leu Ala Leu Asp Leu Met Glu Pro Glu Gln Ala Val Asp Leu Thr Leu Pro Lys Val Glu Ala Met Asn Lys Arg Leu Gly Ser Leu Val Asp Glu Phe Lys Glu Leu Val Tyr Pro Pro Asp Tyr Asn Pro Glu Gly Lys Val Thr Lys Arg Lys His Asp Asn Glu Gly Ser Gly Ser Lys Arg Pro Lys Val Glu Tyr Ser Glu Glu Glu Leu Lys Thr His Ile Ser Lys Gly Thr Leu Gly Lys Phe Thr Val Pro Met Leu Lys Glu Ala Cys Arg Ala Tyr Gly Leu Lys Ser Gly Leu Lys Lys Gln Glu Leu Leu Glu Ala Leu Thr Lys His Phe Gln Asp（配列番号２）
【００２８】
Ku80
Met Val Arg Ser Gly Asn Lys Ala Ala Val Val Leu Cys Met Asp Val Gly Phe Thr Met Ser Asn Ser Ile Pro Gly Ile Glu Ser Pro Phe Glu Gln Ala Lys Lys Val Ile Thr Met Phe Val Gln Arg Gln Val Phe Ala Glu Asn Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Leu Phe Gly Thr Asp Gly Thr Asp Asn Pro Leu Ser Gly Gly Asp Gln Tyr Gln Asn Ile Thr Val His Arg His Leu Met Leu Pro Asp Phe Asp Leu Leu Glu Asp Ile Glu Ser Lys Ile Gln Pro Gly Ser Gln Gln Ala Asp Phe Leu Asp Ala Leu Ile Val Ser Met Asp Val Ile Gln His Glu Thr Ile Gly Lys Lys Phe Glu Lys Arg His Ile Glu Ile Phe Thr Asp Leu Ser Ser Arg Phe Ser Lys Ser Gln Leu Asp Ile Ile Ile His Ser Leu Lys Lys Cys Asp Ile Ser Leu Gln Phe Phe Leu Pro Phe Ser Leu Gly Lys Glu Asp Gly Ser Gly Asp Arg Gly Asp Gly Pro Phe Arg Leu Gly Gly His Gly Pro Ser Phe Pro Leu Lys Gly Ile Thr Glu Gln Gln Lys Glu Gly Leu Glu Ile Val Lys Met Val Met Ile Ser Leu Glu Gly Glu Asp Gly Leu Asp Glu Ile Tyr Ser Phe Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Cys Val Phe Lys Lys Ile Glu Arg His Ser Ile His Trp Pro Cys Arg Leu Thr Ile Gly Ser Asn Leu Ser Ile Arg Ile Ala Ala Tyr Lys Ser Ile Leu Gln Glu Arg Val Lys Lys Thr Trp Thr Val Val Asp Ala Lys Thr Leu Lys Lys Glu Asp Ile Gln Lys Glu Thr Val Tyr Cys Leu Asn Asp Asp Asp Glu Thr Glu Val Leu Lys Glu Asp Ile Ile Gln Gly Phe Arg Tyr Gly Ser Asp Ile Val Pro Phe Ser Lys Val Asp Glu Glu Gln Met Lys Tyr Lys Ser Glu Gly Lys Cys Phe Ser Val Leu Gly Phe Cys Lys Ser Ser Gln Val Gln Arg Arg Phe Phe Met Gly Asn Gln Val Leu Lys Val Phe Ala Ala Arg Asp Asp Glu Ala Ala Ala Val Ala Leu Ser Ser Leu Ile His Ala Leu Asp Asp Leu Asp Met Val Ala Ile Val Arg Tyr Ala Tyr Asp Lys Arg Ala Asn Pro Gln Val Gly Val Ala Phe Pro His Ile Lys His Asn Tyr Glu Cys Leu Val Tyr Val Gln Leu Pro Phe Met Glu Asp Leu Arg Gln Tyr Met Phe Ser Ser Leu Lys Asn Ser Lys Lys Tyr Ala Pro Thr Glu Ala Gln Leu Asn Ala Val Asp Ala Leu Ile Asp Ser Met Ser Leu Ala Lys Lys Asp Glu Lys Thr Asp Thr Leu Glu Asp Leu Phe Pro Thr Thr Lys Ile Pro Asn Pro Arg Phe Gln Arg Leu Phe Gln Cys Leu Leu His Arg Ala Leu His Pro Arg Glu Pro Leu Pro Pro Ile Gln Gln His Ile Trp Asn Met Leu Asn Pro Pro Ala Glu Val Thr Thr Lys Ser Gln Ile Pro Leu Ser Lys Ile Lys Thr Leu Phe Pro Leu Ile Glu Ala Lys Lys Lys Asp Gln Val Thr Ala Gln Glu Ile Phe Gln Asp Asn His Glu Asp Gly Pro Thr Ala Lys Lys Leu Lys Thr Glu Gln Gly Gly Ala His Phe Ser Val Ser Ser Leu Ala Glu Gly Ser Val Thr Ser Val Gly Ser Val Asn Pro Ala Glu Asn Phe Arg Val Leu Val Lys Gln Lys Lys Ala Ser Phe Glu Glu Ala Ser Asn Gln Leu Ile Asn His Ile Glu Gln Phe Leu Asp Thr Asn Glu Thr Pro Tyr Phe Met Lys Ser Ile Asp Cys Ile Arg Ala Phe Arg Glu Glu Ala Ile Lys Phe Ser Glu Glu Gln Arg Phe Asn Asn Phe Leu Lys Ala Leu Gln Glu Lys Val Glu Ile Lys Gln Leu Asn His Phe Trp Glu Ile Val Val Gln Asp Gly Ile Thr Leu Ile Thr Lys Glu Glu Ala Ser Gly Ser Ser Val Thr Ala Glu Glu Ala Lys Lys Phe Leu Ala Pro Lys Asp Lys Pro Ser Gly Asp Thr Ala Ala Val Phe Glu Glu Gly Gly Asp Val Asp Asp Leu Leu Asp Met Ile（配列番号３）
【００２９】
Ku因子の単離は、以下の工程：
（１）DNA-PK含有細胞から、細胞核抽出液を得る工程、
（２）該細胞核抽出液を、弱アニオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核抽出物画分を得る工程、
（３）該核抽出物画分を、濾過し、塩濃度を0.2M以下へ調節した後、変性DNA固定化セルロース樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、核酸凝縮活性成分を得る工程、
（４）該核酸凝縮活性成分を、強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.22M〜0.25Mで溶出される画分を得る工程、
（５）該塩濃度0.22M〜0.25Mで溶出される画分を、塩濃度を0.1以下へ調節した後、平衡化した高分離能強カチオン交換樹脂を通過させる工程、及び
（６）工程（５）で得られた画分を、塩濃度を0.1M以下へ調節した後、高分離能強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付して、塩濃度0.20M〜0.22Mで溶出されるKu因子画分を得る工程
を含む方法により行うことができる。以下、各工程を説明する。
【００３０】
工程（１）〜（３）
工程（１）〜（３）は、前述の核酸凝縮剤の製造方法の工程（１）〜（３）と同様に行うことができる。また、混入物が少ない核酸凝縮活性成分を得るために、（１）〜（３）の工程に続いて前述の核酸凝縮剤の製造方法の工程（３−２）を行ってもよい。
【００３１】
工程（４）
強アニオン交換樹脂としては、前述のDNA-PKcs単離方法の工程（４）で用いるものと同様のものが使用可能である。
工程（３）で得た核酸凝縮活性成分を、強アニオン交換樹脂を充填したカラムへロードした後、塩濃度0.1M〜1.0Mの塩を含む緩衝液を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する。塩濃度勾配クロマトグラフィーに用いることができる塩及び緩衝液としては、前述のDNA-PKcs単離方法の工程（４）で用いるものと同様のものが使用可能である。
回収した画分のうち、塩濃度0.22M〜0.25Mで溶出される画分を次工程に用いる。前記塩濃度0.22M〜0.25Mで溶出される画分は、溶離液の紫外吸収域（280nm）における検出モニターで第二のピーク高を示す画分として特定することができる。
【００３２】
工程（５）
高分離能強カチオン交換樹脂としては、前述のDNA-PKcs単離方法の工程（５）で用いるものと同様のものが使用可能である。
工程（４）で得たKu70及びKu80を含む画分は、高分離能強カチオン交換樹脂へロードするに先立ち、緩衝液を用いて0.1M以下、好ましくは0.05M〜0.1M、特に好ましくは0.1Mへと調節する。塩濃度を0.1M以下へと調節することにより、タンパク質の活性を保持しつつ、凝縮活性タンパク質の強アニオン交換樹脂への吸着量を最適化することができる。塩濃度の調節に用いる緩衝液としては、分子生物学的試験で一般的に使用されるもの、例えばTris-HClや、HEPES-NaOH系緩衝液や、緩衝液R等を使用することができる。本工程では、緩衝液Rを好適に用いることができる。
また、高分離能強カチオン交換樹脂は、抽出操作の効率を高めるために、対イオンとして機能するナトリウムイオン（Na+）やカリウムイオン（K+）を含む塩を含有する中性域緩衝液を用いて予め平衡化させておく。
平衡化に用いる塩としてはNaCl及びKCl等が挙げられ、NaClが好ましい。中性域緩衝液としては、分子生物学的試験で一般的に使用されるものを使用することができる。本工程では、0.1M NaClを含有する緩衝液Rを好適に用いることができる。
工程（４）で得た塩濃度0.22M〜0.25Mで溶出される画分を、平衡化した高分離能強カチオン交換樹脂カラムを通過させる。これにより、Ku因子と共存するタンパク質（特にDNA-PKcs）が高分離能強カチオン交換樹脂カラムへ吸着するので、Ku因子の分離を十分なものとすることができる。
【００３３】
工程（６）
本工程で用いる高分離能強アニオン交換樹脂としては、前述のDNA-PKcs単離方法の工程（６）で用いるものと同様のものが使用可能である。
工程（５）で得た画分は、高分離能強アニオン交換樹脂へロードするに先立ち、緩衝液を用いて0.1M以下、好ましくは0.05M〜0.1M、特に好ましくは0.1Mへと調節する。塩濃度を0.1M以下へと調節することにより、タンパク質の活性を保持しつつ、凝縮活性タンパク質の強アニオン交換樹脂への吸着量を最適化することができる。塩濃度の調節に用いる緩衝液としては、分子生物学的試験で一般的に使用されるもの、例えばTris-HClや、HEPES-NaOH系緩衝液や、緩衝液R等を使用することができる。本工程では、緩衝液Rを好適に用いることができる。
工程（５）で得た画分を、塩濃度を調節後、高分離能強アニオン交換樹脂を充填したカラムへロードし、塩濃度0.1M〜1.0Mの塩を含む緩衝液を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する。塩濃度勾配クロマトグラフィーに用いることができる塩及び緩衝液としては、前述のDNA-PKcs単離方法の工程（４）で用いるものと同様のものが使用可能である。
回収した画分のうち、塩濃度0.20M〜0.22Mで溶出されるピーク画分をKu因子画分として得ることができる。前記塩濃度0.20M〜0.22Mで溶出される画分は、溶離液の紫外吸収域（280nm）における検出モニターで最大のピークを含む画分として特定することができる。
【００３４】
本発明のKu因子の製造方法では、吸着樹脂カラムを用いる工程（２）〜（６）（工程（３−２）を行う場合は、当該工程を含む）を同一の緩衝液、好ましくは、Tris-HCl、HEPES-NaOH系緩衝液及び緩衝液R、特に好ましくは緩衝液Rの存在下で行う。これにより、従来技術では必要とされていた煩雑な緩衝液交換の省略及び操作時間の短縮が可能となり、かつ、蛋白質の不活性化や回収ロスを低減することができる。
【００３５】
Ku因子としては、前述の方法にしたがい生体組織から得た天然物を好適に使用することができるが、これに限定されるものではなく、例えば遺伝子組み換え製品を使用することもできる。
【００３６】
本発明の核酸凝縮剤のターゲットとなる物質は、有効成分であるDNA-PKcsが結合できる多価のコロイド高分子である。具体的には、DNA及びRNAが挙げられる。本発明の核酸凝縮剤は、特にDNAに対して好適に使用することができる。
【００３７】
本発明において、核酸の凝縮化とは、伸展した線状構造から緻密な球状構造への形態的な変化をいう。
かかる核酸の形態的変化について、光学顕微鏡を用いた観察が可能であるときは、溶液中における核酸のランダムコイル状態からグロビュール状態への相変化として観察することができる。
また、溶液中で形成される核酸の凝縮構造は、溶液を取り除いて乾燥させた後にも安定に保持される。したがって、核酸の分子形態をナノスケールで詳細に確認することのできる電子顕微鏡やAFM（原子間力顕微鏡）等を用いて、凝縮化の状態を知ることも可能である。この場合、DNA上へのDNA-PKcs蛋白質の集積とそれに伴うDNA 鎖の折り畳み構造の出現をもって凝縮化を判断することになる。更に、これらの技術を用いると凝縮の程度や質的な変化を評価することも可能である。
より簡易には、遠心分離によって凝集沈降性の構造体が形成されるかどうかによって判定することもできる。但しこの方法では、沈降の有無のみを検査するので、部分凝縮した構造の挙動には注意が必要であり、あらためて形態観察を行う必要がある。遠心分離による凝集沈降性を用いる利点は、核酸の大きさや形状に関わらず凝縮化の是非、特に完全な凝縮化がおこる条件を迅速に推定しうることにある。
【００３８】
以下に実施例を示して具体的に説明するが、本発明は実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
［実施例１］  胎盤組織からのDNA-PKcsの単離
（１）胎盤組織由来のDNA-PKcs含有細胞から細胞核抽出液を得る工程
DNA-PKcs含有細胞の材料として、正常人由来のヒト胎盤組織（一般産婦人科医院より入手）を用いた。前準備として、胎盤組織の一部（90g）を、繊維質を減少させるために可能な限り細かく切り分けた後、得られた組織断片をポリプロピレン製容器へ移した。以下の抽出工程は、当該容器内で行った。また、抽出工程はDignamら（Dignam, J.D., Lebovitz, R.M. 及び Roeder, R.G. (1983) Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res., 11, 1475-1489.）の方法にしたがい行った。
氷冷した低張性の緩衝液A（10mM HEES-KOH, pH 7.9, 1.5mM MgCl2, 10mM KCl, 0.5m ジチオスレイトール（DTT）, 0.5mM フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF））の100mlをポリプロピレン製容器に添加し、氷上で金属さじを用いて圧力を加えながら組織塊をより小さな塊へと分散させて15分間の細胞破砕を行った。容器内で組織塊が十分に分散したことをもって細胞破砕が完了したと判断した。次いで、上澄みを除去した後、50mlの緩衝液Aを再度添加して細胞破砕物をリンスした。同じ操作を１回繰り返した（リンスの際、上澄みへ混入した細胞（核）塊は、遠心分離によって回収した後、次工程に用いた）。次いで、緩衝液C（20mM HEES-KOH, pH 7.9, 0.5M NaCl, 1.5mM MgCl2, 0.2mM EDTA, 0.5m DTT, 0.5mM PMSF, 25% グリセロール）をポリプロピレン製容器へ150ml添加し、氷上で30分間静置した。次いで遠心分離（製品名：KUBOTA KR/702、製造者名：久保田製作所、2,500gで10分間）を行い、得られた上澄みを細胞核抽出液とした。
【００４０】
（２）細胞核抽出液から核抽出物画分を得る工程
工程（１）で得た細胞核抽出液を、0.5M NaClを含有する緩衝液Rで平衡化した弱アニオン交換樹脂であるDEAEセファロース樹脂（イオン交換基：ジエチルアミノエチル基、樹脂：多孔性のアガロース樹脂、樹脂の形状：球状、平均粒子径：90μm）（Amersham Biosciences）と混合して、核酸成分をDEAE-セファロース樹脂へ吸着させた。次いで、混合物を 10,000gで10 分間の遠心分離に付し、上澄みを核抽出物画分として得た。
【００４１】
（３）核抽出物画分から核酸凝縮活性成分を得る工程
工程（２）で得た核抽出物画分を、フィルター（製品名：Minisalt-plus、製造者：Sartorius 社、孔径：0.2μm）で濾過し、前述の緩衝液Rを用いて塩濃度を0.2Mへと調節した。次いで、変性DNA固定化セルロース樹脂（固定化させたDNA：変性仔牛胸腺由来DNA、使用したDNA鎖切断酵素：Pancreatic DNase、セルロース樹脂の種類：Whatman CF-1 cellulose、商品名：DNA-Cellulose (denatured)（Amersham Biosciences））を充填したカラムへロードし、核酸凝縮活性成分を変性DNA固定化セルロース樹脂へ吸着させた。0.5M NaClを含有する緩衝液Rを用いた溶離により、核酸凝縮活性成分を得た。
【００４２】
（３−２）核酸凝縮活性成分を濃縮する工程
工程（３）で得た核酸凝縮活性成分を、前述の緩衝液Rを用いて塩濃度を0.1Mへと調節した。次いで、強アニオン交換樹脂であるMono Q（イオン交換基：-N+(CH3)3基、樹脂：多孔性の単分散系親水性ポリエーテル樹脂、樹脂の形状：球状、平均粒子径：10μm）（Amersham Biosciences）を充填したカラムへロードし、0.5MのNaClを含有する緩衝液Rで溶離して、より濃縮された核酸凝縮活性成分を得た。
【００４３】
（４）核酸凝縮活性成分を、強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する工程
工程（３）で得た核酸凝縮活性成分を、強アニオンイオン交換樹脂であるMono Q（イオン交換基：-N+(CH3)3基、樹脂：多孔性の単分散系親水性ポリエーテル樹脂、樹脂の形状：球状、平均粒子径：10μm）（Amersham Biosciences）を充填したカラムへロードし、塩濃度0.1M〜1.0MのNaClを含む緩衝液Rを用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付した。回収した画分のうち、塩濃度0.16M〜0.21Mで溶出される最大のピーク画分（溶離液の紫外吸収域（280nm）における検出モニターによる）を次工程に用いた。
【００４４】
（５）工程（４）で得た画分を、高分離能強カチオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する工程
工程（４）で得た塩濃度0.16M〜0.21Mで溶出される画分を、前述の緩衝液Rを用いて塩濃度を0.1Mへと調節した。次いで、高分離能強カチオン交換樹脂であるMini S（イオン交換基：メチルスルフォン酸基(-CH2SO3-)、樹脂：無孔性の単分散系合成ポリマー樹脂、樹脂の形状：真球状、平均粒子径：3μm）（Amersham Biosciences）を充填したカラムへロードし、塩濃度0.1M〜1.0MのNaClを含む緩衝液Rを用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付した。回収した画分のうち、塩濃度0.15M〜0.21Mで溶出される最大のピーク画分（溶離液の紫外吸収域（280nm）における検出モニターによる）を次工程に用いた。
【００４５】
（６）工程（５）で得た画分を、高分離能強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する工程
工程（５）で得た塩濃度0.15M〜0.21Mで溶出される画分を、前述の緩衝液Rを用いて塩濃度を0.1Mへと調節した。次いで、高分離能強アニオン交換樹脂であるMini Q（イオン交換基：-N+(CH3)3基、樹脂：無孔性の単分散系親水性ポリエーテル樹脂、樹脂の形状：真球状、平均粒子径：3μm）（Amersham Biosciences）を充填したカラムへロードし、塩濃度0.1M〜1.0MのNaClを含む緩衝液Rを用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付した。回収した画分のうち、塩濃度0.18M〜0.20Mで溶出される最大のピーク画分（溶離液の紫外吸収域（280nm）における検出モニターによる）をDNA-PKcs画分として得た。
【００４６】
得られたDNA-PKcs画分をSDS-PAGEにより解析したところ、大きさ〜400kDaのタンパク質が含まれていた。このタンパク質の一次構造を、プロテインシーケンサ（製品名：Procise プロテインシーケンサ Model 492、製造者：Applied Biosystems 社）と質量分析計（Q-TOF Hybrid MS、ジャスコインタナショナル社）により決定した。決定されたアミノ酸配列を以下に示す。
Met Ala Gly Ser Gly Ala Gly Val Arg Cys Ser Leu Leu Arg Leu Gln Glu Thr Leu Ser Ala Ala Asp Arg Cys Gly Ala Ala Leu Ala Gly His Gln Leu Ile Arg Gly Leu Gly Gln Glu Cys Val Leu Ser Ser Ser Pro Ala Val Leu Ala Leu Gln Thr Ser Leu Val Phe Ser Arg Asp Phe Gly Leu Leu Val Phe Val Arg Lys Ser Leu Asn Ser Ile Glu Phe Arg Glu Cys Arg Glu Glu Ile Leu Lys Phe Leu Cys Ile Phe Leu Glu Lys Met Gly Gln Lys Ile Ala Pro Tyr Ser Val Glu Ile Lys Asn Thr Cys Thr Ser Val Tyr Thr Lys Asp Arg Ala Ala Lys Cys Lys Ile Pro Ala Leu Asp Leu Leu Ile Lys Leu Leu Gln Thr Phe Arg Ser Ser Arg Leu Met Asp Glu Phe Lys Ile Gly Glu Leu Phe Ser Lys Phe Tyr Gly Glu Leu Ala Leu Lys Lys Lys Ile Pro Asp Thr Val Leu Glu Lys Val Tyr Glu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Glu Val His Pro Ser Glu Met Ile Asn Asn Ala Glu Asn Leu Phe Arg Ala Phe Leu Gly Glu Leu Lys Thr Gln Met Thr Ser Ala Val Arg Glu Pro Lys Leu Pro Val Leu Ala Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ser Ser Leu Leu Cys Asn Phe Thr Lys Ser Met Glu Glu Asp Pro Gln Thr Ser Arg Glu Ile Phe Asn 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Thr Leu Lys Asp Leu Leu Leu Asn Thr Met Ser Gln Glu Glu Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Asp Pro Arg Ala Pro Pro Cys Glu Tyr Lys Asp Trp Leu Thr Lys Met Ser Gly Lys His Asp Val Gly Ala Tyr Met Leu Met Tyr Lys Gly Ala Asn Arg Thr Glu Thr Val Thr Ser Phe Arg Lys Arg Glu Ser Lys Val Pro Ala Asp Leu Leu Lys Arg Ala Phe Val Arg Met Ser Thr Ser Pro Glu Ala Phe Leu Ala Leu Arg Ser His Phe Ala Ser Ser His Ala Leu Ile Cys Ile Ser His Trp Ile Leu Gly Ile Gly Asp Arg His Leu Asn Asn Phe Met Val Ala Met Glu Thr Gly Gly Val Ile Gly Ile Asp Phe Gly His Ala Phe Gly Ser Ala Thr Gln Phe Leu Pro Val Pro Glu Leu Met Pro Phe Arg Leu Thr Arg Gln Phe Ile Asn Leu Met Leu Pro Met Lys Glu Thr Gly Leu Met Tyr Ser Ile Met Val His Ala Leu Arg Ala Phe Arg Ser Asp Pro Gly Leu Leu Thr Asn Thr Met Asp Val Phe Val Lys Glu Pro Ser Phe Asp Trp Lys Asn Phe Glu Gln Lys Met Leu Lys Lys Gly Gly Ser Trp Ile Gln Glu Ile Asn Val Ala Glu Lys Asn Trp Tyr Pro Arg Gln Lys Ile Cys Tyr Ala Lys Arg Lys Leu Ala Gly Ala Asn Pro Ala Val Ile Thr Cys Asp Glu Leu Leu Leu Gly His Glu Lys Ala Pro Ala Phe Arg Asp Tyr Val Ala Val Ala Arg Gly Ser Lys Asp His Asn Ile Arg Ala Gln Glu Pro Glu Ser Gly Leu Ser Glu Glu Thr Gln Val Lys Cys Leu Met Asp Gln Ala Thr Asp Pro Asn Ile Leu Gly Arg Thr Trp Glu Gly Trp Glu Pro Trp Met （配列番号１）
【００４７】
配列番号１のアミノ酸配列は、データベース（SWISS-PROT）にアクセッションナンバーP78527として登録されているDNA-PKcsのアミノ酸配列と同一であった。したがって、本実施例で得られたタンパク質はDNA-PKcsであると同定した。
【００４８】
［実施例２］  培養細胞からのDNA-PKcsの単離
（１）DNA-PKcs含有細胞培養物から細胞核抽出液を得る工程
細胞：WI-L2-NS(CRL8155)（入手先：The Japanese Cancer Research Resoures Bank）を、文献（TISSUE CULTURE Methods and Application, (1973) eds. Paul F. Kruse, JR. and M. K. Patterson, JR. (ACADEMIC PRESS, NY)）記載の方法により対数増殖期まで培養（2x109 Cells: 1x106 Cells/ml）した。培養細胞と、packed cell volumeの3容量に相当する量の緩衝液Aとを混合して、氷上で15分間細胞破砕処理を行った。次いで、混合物をダウンス型ホモジナイザー（製品名：ダウンス型ホモジナイザー、製造者名：Wheaton 社）へ移し、20回ストローク処理して完全に細胞を破砕した。細胞破砕物を遠心管へ移し、2,500gで10分間遠心分離して、細胞核を沈殿成分として集めた。上澄みを除去した後、packed cell volumeの３容量の緩衝液Aを添加して細胞核を洗浄し、2,500gで10分間の遠心分離に付した。同じ操作を１回繰り返した後、得られた沈殿物に、packed nucleiの3容量に対する緩衝液Cを添加し、氷上で30分間処理した。次いで、2,500gで10分間の遠心分離を行い、得られた上澄みを細胞核抽出液とした。
（２）細胞核抽出液から核抽出物画分を得る工程
実施例１の工程（２）と同一の手順により行った。
【００４９】
（３）核抽出物画分から核酸凝縮活性成分を得る工程
実施例１の工程（３）と同一の手順により行った。
【００５０】
（３−２）核酸凝縮活性成分を濃縮する工程
実施例１の工程（３−２）と同一の手順により行った。
（４）核酸凝縮活性成分を、強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する工程
実施例１の工程（４）と同一の手順により行った。
【００５１】
（５）工程（４）で得た画分を、高分離能強カチオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する工程
実施例１の工程（５）と同一の手順により行った。
【００５２】
（６）工程（５）で得た画分を、高分離能強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する工程
実施例１の工程（６）と同一の手順により行った。
得られたDNA-PKcs画分から実施例１と同様にして大きさ〜400kDaのタンパク質を得た。このタンパク質を実施例１と同様にして分析したところ、DNA-PKcsであると同定された。
【００５３】
［実施例３］  胎盤組織からのKuの単離
【００５４】
（１）胎盤組織由来のDNA-PKcs含有細胞から細胞核抽出液を得る工程
実施例１の工程（１）と同一の手順により行った。
【００５５】
（２）細胞核抽出液から核抽出物画分を得る工程
実施例１の工程（２）と同一の手順により行った。
【００５６】
（３）核抽出物画分から核酸凝縮活性成分を得る工程
実施例１の工程（３）と同一の手順により行った。
【００５７】
（３−２）核酸凝縮活性成分を濃縮する工程
実施例１の工程（３−２）と同一の手順により行った。
【００５８】
（４）核酸凝縮活性成分を、強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する工程
工程（３）で得た核酸凝縮活性成分を、強アニオン交換樹脂であるMono Q（イオン交換基：-N+(CH3)3基、樹脂：多孔性の単分散系親水性ポリエーテル樹脂、樹脂の形状：球状、平均粒子径：10μm）（Amersham Biosciences）を充填したカラムへロードし、塩濃度0.1M〜1.0MのNaClを含む緩衝液Rを用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付した。回収した画分のうち、塩濃度0.22M〜0.25Mで溶出される第二のピーク画分（溶離液の紫外吸収域（280nm）における検出モニターによる）を次工程に用いた。
【００５９】
（５）工程（４）で得た画分を、高分離能強カチオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する工程
工程（４）で得た塩濃度0.22M〜0.25Mで溶出される画分を、前述の緩衝液Rを用いて塩濃度を0.1Mへと調節した。次いで、0.1MのNaClを含む緩衝液Rで平衡化した強カチオン性イオン交換樹脂であるMini S（イオン交換基：メチルスルフォン酸基(-CH2SO3-)、樹脂：無孔性の単分散系合成ポリマー樹脂、樹脂の形状：真球状、平均粒子径：3μm）（Amersham Biosciences）を充填したカラムへロードし、塩濃度0.1MのNaClを含む緩衝液Rを用いて、カラムを通過した画分を次工程に用いた。
【００６０】
（６）工程（５）で得た画分を、高分離能強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する工程
工程（５）で得た画分を、前述の緩衝液Rを用いて塩濃度を0.1Mへと調節した。次いで、高分離能強アニオン交換樹脂であるMini Q（イオン交換基：-N+(CH3)3基、樹脂：無孔性の単分散系親水性ポリエーテル樹脂、樹脂の形状：真球状、平均粒子径：3μm）（Amersham Biosciences）を充填したカラムへロードし、塩濃度0.1M〜1.0MのNaClを含む緩衝液Rを用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付した。回収した画分のうち、塩濃度0.20M〜0.22Mで溶出される最大のピーク画分（溶離液の紫外吸収域（280nm）における検出モニターによる）をKu因子画分として得た。
【００６１】
得られたKu因子画分をSDS-PAGEにより解析したところ、大きさ70kDa及び80kDaの２種類のタンパク質が含まれていた。各タンパク質の一次構造を、プロテインシーケンサ（製品名：Procise プロテインシーケンサ Model 492、製造者：Applied Biosystems 社）と質量分析計（Q-TOF Hybrid MS、ジャスコインタナショナル社）により決定した。決定されたアミノ酸配列を以下に示す。
70kDaのタンパク質
Met Ser Gly Trp Glu Ser Tyr Tyr Lys Thr Glu Gly Asp Glu Glu Ala Glu Glu Glu Gln Glu Glu Asn Leu Glu Ala Ser Gly Asp Tyr Lys Tyr Ser Gly Arg Asp Ser Leu Ile Phe Leu Val Asp Ala Ser Lys Ala Met Phe Glu Ser Gln Ser Glu Asp Glu Leu Thr Pro Phe Asp Met Ser Ile Gln Cys Ile Gln Ser Val Tyr Ile Ser Lys Ile Ile Ser Ser Asp Arg Asp Leu Leu Ala Val Val Phe Tyr Gly Thr Glu Lys Asp Lys Asn Ser Val Asn Phe Lys Asn Ile Tyr Val Leu Gln Glu Leu Asp Asn Pro Gly Ala Lys Arg Ile Leu Glu Leu Asp Gln Phe Lys Gly Gln Gln Gly Gln Lys Arg Phe Gln Asp Met Met Gly His Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Ser Glu Val Leu Trp Val Cys Ala Asn Leu Phe Ser Asp Val Gln Phe Lys Met Ser His Lys Arg Ile Met Leu Phe Thr Asn Glu Asp Asn Pro His Gly Asn Asp Ser Ala Lys Ala Ser Arg Ala Arg Thr Lys Ala Gly Asp Leu Arg Asp Thr Gly Ile Phe Leu Asp Leu Met His Leu Lys Lys Pro Gly Gly Phe Asp Ile Ser Leu Phe Tyr Arg Asp Ile Ile Ser Ile Ala Glu Asp Glu Asp Leu Arg Val His Phe Glu Glu Ser Ser Lys Leu Glu Asp Leu Leu Arg Lys Val Arg Ala Lys Glu Thr Arg Lys Arg Ala Leu Ser Arg Leu Lys Leu Lys Leu Asn Lys Asp Ile Val Ile Ser Val Gly Ile Tyr Asn Leu Val Gln Lys Ala Leu Lys Pro Pro Pro Ile Lys Leu Tyr Arg Glu Thr Asn Glu Pro Val Lys Thr Lys Thr Arg Thr Phe Asn Thr Ser Thr Gly Gly Leu Leu Leu Pro Ser Asp Thr Lys Arg Ser Gln Ile Tyr Gly Ser Arg Gln Ile Ile Leu Glu Lys Glu Glu Thr Glu Glu Leu Lys Arg Phe Asp Asp Pro Gly Leu Met Leu Met Gly Phe Lys Pro Leu Val Leu Leu Lys Lys His His Tyr Leu Arg Pro Ser Leu Phe Val Tyr Pro Glu Glu Ser Leu Val Ile Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ser Ala Leu Leu Ile Lys Cys Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Cys Arg Tyr Thr Pro Arg Arg Asn Ile Pro Pro Tyr Phe Val Ala Leu Val Pro Gln Glu Glu Glu Leu Asp Asp Gln Lys Ile Gln Val Thr Pro Pro Gly Phe Gln Leu Val Phe Leu Pro Phe Ala Asp Asp Lys Arg Lys Met Pro Phe Thr Glu Lys Ile Met Ala Thr Pro Glu Gln Val Gly Lys Met Lys Ala Ile Val Glu Lys Leu Arg Phe Thr Tyr Arg Ser Asp Ser Phe Glu Asn Pro Val Leu Gln Gln His Phe Arg Asn Leu Glu Ala Leu Ala Leu Asp Leu Met Glu Pro Glu Gln Ala Val Asp Leu Thr Leu Pro Lys Val Glu Ala Met Asn Lys Arg Leu Gly Ser Leu Val Asp Glu Phe Lys Glu Leu Val Tyr Pro Pro Asp Tyr Asn Pro Glu Gly Lys Val Thr Lys Arg Lys His Asp Asn Glu Gly Ser Gly Ser Lys Arg Pro Lys Val Glu Tyr Ser Glu Glu Glu Leu Lys Thr His Ile Ser Lys Gly Thr Leu Gly Lys Phe Thr Val Pro Met Leu Lys Glu Ala Cys Arg Ala Tyr Gly Leu Lys Ser Gly Leu Lys Lys Gln Glu Leu Leu Glu Ala Leu Thr Lys His Phe Gln Asp（配列番号２）
【００６２】
80kDaのタンパク質
Met Val Arg Ser Gly Asn Lys Ala Ala Val Val Leu Cys Met Asp Val Gly Phe Thr Met Ser Asn Ser Ile Pro Gly Ile Glu Ser Pro Phe Glu Gln Ala Lys Lys Val Ile Thr Met Phe Val Gln Arg Gln Val Phe Ala Glu Asn Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Leu Phe Gly Thr Asp Gly Thr Asp Asn Pro Leu Ser Gly Gly Asp Gln Tyr Gln Asn Ile Thr Val His Arg His Leu Met Leu Pro Asp Phe Asp Leu Leu Glu Asp Ile Glu Ser Lys Ile Gln Pro Gly Ser Gln Gln Ala Asp Phe Leu Asp Ala Leu Ile Val Ser Met Asp Val Ile Gln His Glu Thr Ile Gly Lys Lys Phe Glu Lys Arg His Ile Glu Ile Phe Thr Asp Leu Ser Ser Arg Phe Ser Lys Ser Gln Leu Asp Ile Ile Ile His Ser Leu Lys Lys Cys Asp Ile Ser Leu Gln Phe Phe Leu Pro Phe Ser Leu Gly Lys Glu Asp Gly Ser Gly Asp Arg Gly Asp Gly Pro Phe Arg Leu Gly Gly His Gly Pro Ser Phe Pro Leu Lys Gly Ile Thr Glu Gln Gln Lys Glu Gly Leu Glu Ile Val Lys Met Val Met Ile Ser Leu Glu Gly Glu Asp Gly Leu Asp Glu Ile Tyr Ser Phe Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Cys Val Phe Lys Lys Ile Glu Arg His Ser Ile His Trp Pro Cys Arg Leu Thr Ile Gly Ser Asn Leu Ser Ile Arg Ile Ala Ala Tyr Lys Ser Ile Leu Gln Glu Arg Val Lys Lys Thr Trp Thr Val Val Asp Ala Lys Thr Leu Lys Lys Glu Asp Ile Gln Lys Glu Thr Val Tyr Cys Leu Asn Asp Asp Asp Glu Thr Glu Val Leu Lys Glu Asp Ile Ile Gln Gly Phe Arg Tyr Gly Ser Asp Ile Val Pro Phe Ser Lys Val Asp Glu Glu Gln Met Lys Tyr Lys Ser Glu Gly Lys Cys Phe Ser Val Leu Gly Phe Cys Lys Ser Ser Gln Val Gln Arg Arg Phe Phe Met Gly Asn Gln Val Leu Lys Val Phe Ala Ala Arg Asp Asp Glu Ala Ala Ala Val Ala Leu Ser Ser Leu Ile His Ala Leu Asp Asp Leu Asp Met Val Ala Ile Val Arg Tyr Ala Tyr Asp Lys Arg Ala Asn Pro Gln Val Gly Val Ala Phe Pro His Ile Lys His Asn Tyr Glu Cys Leu Val Tyr Val Gln Leu Pro Phe Met Glu Asp Leu Arg Gln Tyr Met Phe Ser Ser Leu Lys Asn Ser Lys Lys Tyr Ala Pro Thr Glu Ala Gln Leu Asn Ala Val Asp Ala Leu Ile Asp Ser Met Ser Leu Ala Lys Lys Asp Glu Lys Thr Asp Thr Leu Glu Asp Leu Phe Pro Thr Thr Lys Ile Pro Asn Pro Arg Phe Gln Arg Leu Phe Gln Cys Leu Leu His Arg Ala Leu His Pro Arg Glu Pro Leu Pro Pro Ile Gln Gln His Ile Trp Asn Met Leu Asn Pro Pro Ala Glu Val Thr Thr Lys Ser Gln Ile Pro Leu Ser Lys Ile Lys Thr Leu Phe Pro Leu Ile Glu Ala Lys Lys Lys Asp Gln Val Thr Ala Gln Glu Ile Phe Gln Asp Asn His Glu Asp Gly Pro Thr Ala Lys Lys Leu Lys Thr Glu Gln Gly Gly Ala His Phe Ser Val Ser Ser Leu Ala Glu Gly Ser Val Thr Ser Val Gly Ser Val Asn Pro Ala Glu Asn Phe Arg Val Leu Val Lys Gln Lys Lys Ala Ser Phe Glu Glu Ala Ser Asn Gln Leu Ile Asn His Ile Glu Gln Phe Leu Asp Thr Asn Glu Thr Pro Tyr Phe Met Lys Ser Ile Asp Cys Ile Arg Ala Phe Arg Glu Glu Ala Ile Lys Phe Ser Glu Glu Gln Arg Phe Asn Asn Phe Leu Lys Ala Leu Gln Glu Lys Val Glu Ile Lys Gln Leu Asn His Phe Trp Glu Ile Val Val Gln Asp Gly Ile Thr Leu Ile Thr Lys Glu Glu Ala Ser Gly Ser Ser Val Thr Ala Glu Glu Ala Lys Lys Phe Leu Ala Pro Lys Asp Lys Pro Ser Gly Asp Thr Ala Ala Val Phe Glu Glu Gly Gly Asp Val Asp Asp Leu Leu Asp Met Ile（配列番号３）
【００６３】
配列番号２及び３のアミノ酸配列は、データベース（SWISS-PROT）に、それぞれアクセッションナンバーP12956及びP13010として登録されているKu70及びKu80のアミノ酸配列と同一であった。したがって、本実施例で得られたタンパク質はKu70及びKu80からなるKu因子であると同定した。
【００６４】
［実施例４］  培養細胞からのKuの単離
（１）DNA-PKcs含有細胞培養物から細胞核抽出液を得る工程
実施例２の工程（１）と同一の手順により行った。
【００６５】
（２）細胞核抽出液から核抽出物画分を得る工程
実施例１の工程（２）と同一の手順により行った。
【００６６】
（３）核抽出物画分から核酸凝縮活性成分を得る工程
実施例１の工程（３）と同一の手順により行った。
【００６７】
（３−２）核酸凝縮活性成分を濃縮する工程
実施例１の工程（３−２）と同一の手順により行った。
【００６８】
（４）核酸凝縮活性成分を、強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する工程
実施例３の工程（４）と同一の手順により行った。
【００６９】
（５）工程（４）で得た画分を、高分離能強カチオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する工程
実施例３の工程（５）と同一の手順により行った。
【００７０】
（６）工程（５）で得た画分を、高分離能強アニオン交換樹脂を用いた塩濃度勾配クロマトグラフィーに付する工程
実施例３の工程（６）と同一の手順により行った。
得られたKu因子画分から実施例３と同様にして大きさ70kDa及び80kDaの２種類のタンパク質を得た。これらのタンパク質を実施例３と同様にして分析したところ、それぞれKu70及びKu80からなるKu因子であると同定された。
【００７１】
［実施例５］  光学顕微鏡を用いたDNA-PKcsのDNA凝縮活性の評価
本発明の核酸凝縮剤の有効成分であるDNA-PKcsと基質DNAとを、反応緩衝液中で混合して、その後の基質DNAの構造変化を光学顕微鏡下で観察した。
基質DNAとして、光学的に識別できる分子長を持つT4ファージの線状ゲノムDNA（166kbp）を用いた。また、光学顕微鏡を用いた観察を可能とするために、基質DNAを、核酸凝縮剤との反応を阻害しない濃度（0.25μM）のYOYO-1蛍光色素（製造者名: Molecular Probes）で蛍光染色した。
DNA-PKcsとして、実施例１のDNA-PKcs（0.5 O.D.280濃度に調整した標品）を用いた。
ATP（製造者名：Amersham Biosciences、濃度100mM）は、DNA-PKcsのプロテインキナーゼ活性におけるリン酸基供与体として用いた。
反応緩衝液（100μl 反応系）の組成は、20mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM MgCl2, 1mM DTTであった。反応緩衝液中の基質DNA濃度は0.05μMであった。
下記のサンプル（１）〜（４）について評価を行った。
2006271322.tif 000002
サンプル（１）は、試薬を添加しないサンプルである。
サンプル（２）は、1.0μlのDNA-PKcsを添加したサンプルである。
サンプル（３）は、1.0μlのDNA-PKcsを添加し、５分後、更に1.0μlのDNA-PKcsを添加したサンプルである。
サンプル（４）は、1.0μlのDNA-PKcsを添加し、５分後、更に1.0μlのDNA-PKcsを添加し、５分後、更に1.0μlのATPを添加したサンプルである。
DNA-PKcs添加による基質DNAの構造変化を、蛍光顕微鏡（製品名：Axiovert 135 TV microscope、製造者名：Carl Zeiss）に接続したSIT TV camera（浜松フォトニクス）によってリアルタイムビデオ画像として取得した。結果を図１（１）〜図１（４）に示す。
図１（１）は、サンプル（１）の基質DNAを示す図である。基質DNAはランダムコイル構造であった。
図１（２）は、サンプル（２）の基質DNAを示す図である。基質DNAは、DNA-PKcs添加により部分的に凝縮し、部分的グロビュール構造であった。
図１（３）は、サンプル（３）の基質DNAを示す図である。基質DNAは、更なるDNA-PKcs添加により更に凝縮し、グロビュール構造であった。
図１（４）は、サンプル（４）の基質DNAを示す図である。グロビュール構造の基質DNAは、ATP添加により脱凝縮し、ランダムコイル構造であった。
以上の結果より、DNA-PKcsはDNA凝縮活性を有し、核酸凝縮剤として使用できることが理解される。また、ATPを添加することにより凝縮DNAを容易に脱凝縮させることができることが理解される。
【００７２】
［実施例６］  遠心分離を用いたDNA-PKcsのDNA凝縮活性の評価
DNA凝縮活性のより簡便な評価方法について検討したところ、DNAは、凝縮が進むと凝集沈降性が増して、遠心分離により溶液中から容易に分離できることを見出した。そこで、本実施例では、凝集沈降性を指標としてDNA-PKcsのDNA凝縮活性を評価した。
基質DNAとして、T4ファージの線状ゲノムDNA（166kbp）を用いた。
DNA-PKcsとして、実施例１のDNA-PKcs（0.5 O.D.280濃度に調整した標品）を用いた。
ATP（製造者名：Amersham Biosciences）は、DNA-PKcsのプロテインキナーゼ活性におけるリン酸基供与体として用いた。
Wortmannin（SIGMA、100μM）は、DNA-PKcsのプロテインキナーゼ活性における阻害剤として用いた。
反応緩衝液(100μl 反応系)の組成は、20mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM MgCl2, 1mM DTTであった。反応緩衝液中の基質DNA濃度は0.05μMであった。
下記のサンプル（１）〜（６）について評価を行った。
2006271322.tif 000003
サンプル（１）は、試薬を添加しないサンプルである。
サンプル（２）は、1.0μlのDNA-PKcsを添加したサンプルである。
サンプル（３）は、1.0μlのDNA-PKcsを添加し、５分後、更に1.0μlのDNA-PKcsを添加したサンプルである。
サンプル（４）は、1.0μlのDNA-PKcsを添加し、５分後、更に1.0μlのDNA-PKcsを添加し、５分後、更に1.0μlのATPを添加したサンプルである。
サンプル（５）は、2.0μlのDNA-PKcsと1.0μlのWortmanninとを予め５分間混合して得られたプロテインキナーゼ活性が抑制されたDNA-PKcsを含む溶液を、基質DNAを含む反応緩衝液へ添加したサンプルである。
サンプル（６）は、2.0μlのDNA-PKcsと1.0μlのWortmanninとを予め５分間混合して得られたプロテインキナーゼ活性が抑制されたDNA-PKcsを含む溶液を、基質DNAを含む反応緩衝液へ添加し、５分後、更に1.0μlのATPを添加したサンプルである。
遠心分離は、各サンプルにつき、所定の試薬添加5 分後に行った。遠心分離は、製品名：SAKUMA centrifuge M150-IV（製造者名：佐久間製作所）を用いて10,000gで10分間行った。
凝集沈降性は遠心分離処理によって溶液から相分離した沈殿産物であるDNA沈殿凝集物の百分率（DNA in pellet（％））により評価した。百分率値は式：
DNA沈殿凝集物（％）＝（沈殿したDNA量）／（添加したDNA量）×100
にしたがい算出した。結果を図２に示す。
【００７３】
サンプル（１）では、DNA凝縮が起こらず、DNA沈殿凝集物も生成しなかった。
サンプル（２）では、DNA凝縮が起こり、DNA沈殿凝集物が生成した。
サンプル（３）では、サンプル（２）よりもDNA凝縮が進行し、DNA沈殿凝集物の生成割合も増加した。
サンプル（４）では、ATP添加により脱凝縮が起きたものの、DNA沈殿凝集物の生成割合には大きな減少はみられなかった。そこで、サンプル（４）を蛍光顕微鏡観察したところ、ATP添加によりDNA脱凝縮が起きているが、DNA-PKcsは基質DNAから遊離せず緩く結合していることが明らかになった。サンプル（４）の高いDNA沈殿凝集物生成割合は、かかるDNA-PKcsと基質DNAとの結合状態に起因するものと考えられる。
サンプル（５）では、サンプル（３）と同レベルのDNA沈殿凝集物が生成した。
サンプル（６）では、サンプル（４）と同様に、ATP添加によるDNA沈殿凝集物の生成割合に大きな減少は見られなかった。
サンプル（５）及び（６）の結果は、DNA-PKcsのプロテインキナーゼ活性阻害剤であるWortmanninを用いた処理によって得られたプロテインキナーゼ活性が抑制されたDNA-PKcsがDNA凝縮を起こしたことを示している。かかる結果は、DNA-PKcsにおいてプロテインキナーゼ活性と核酸凝縮活性とが独立していることを明確に示すものである。
尚、基質DNAとして、T4ファージの線状ゲノムDNAに代えて、プラスミドpUC18-線状化DNA（2.7kbp）及び49bpの合成DNAを用いて本実施例と同様の手順を行ったところ、それぞれ本実施例と同様の結果が得られた。
以上の結果より、DNA-PKcsはDNA凝縮活性を有し、核酸凝縮剤として使用できることが理解される。また、ATPを添加することにより凝縮DNAを容易に脱凝縮させることができることが理解される。
【００７４】
［実施例７］  DNA凝縮のコントロール
DNA-PKcs及びその他の化合物（ATP、Ku及びwortmannin）を、種々の順番で基質DNAへ添加して、DNA凝縮の程度を評価した。
基質DNAとして、実施例５と同様にしてYOYO-1蛍光色素で蛍光染色したT4ファージの線状ゲノムDNA（166kbp）を用いた。
DNA-PKcsとして、実施例１のDNA-PKcs（0.5 O.D.280濃度に調整した標品）を用いた。
Ku因子（Ku70とKu80とのヘテロダイマー）（0.3 O.D.280濃度標品）は、実施例３に記載の方法にしたがい製造したものを用いた。
ATP（製造者名：Amersham Biosciences、100mM）は、DNA-PKcsのプロテインキナーゼ活性におけるリン酸基供与体として用いた。
wortmannin（SIGMA、100μM）は、DNA-PKcsのプロテインキナーゼ活性における阻害剤として用いた。
反応緩衝液(100μl 反応系)は、以下の組成：20mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM MgCl2, 1mM DTTを有していた。反応緩衝液中の基質DNA濃度は0.05μMであった。
下記のサンプル（１）〜（10）について評価を行った。
2006271322.tif 000004
サンプル（１）は、試薬を添加しないサンプルである。
サンプル（２）は、1.0μlのDNA-PKcsを添加したサンプルである。
サンプル（３）は、1.0μlのDNA-PKcsを添加した後、更に1.0μlのDNA-PKcsを添加したサンプルである。
サンプル（４）は、1.0μlのDNA-PKcsを添加し、更に1.0μlのDNA-PKcsを添加した後、1.0μlのATPを添加したサンプルである。
サンプル（５）は、2.0μlのKu因子を添加したサンプルである。
サンプル（６）は、1.0μlのDNA-PKcsを添加した後、2.0μlのKu因子を添加したサンプルである。
サンプル（７）は、1.0μlのDNA-PKcsを添加し、更に1.0μlのDNA-PKcsを添加した後、1.0μlのwortmanninを添加したサンプルである。
サンプル（８）は、2.0μlのKuを添加した後、1.0μlのDNA-PKcsを添加したサンプルである。
サンプル（９）は、1.0μlのDNA-PKcsを添加し、更に2.0μlのKuを添加した後、1.0μlのATPを添加したサンプルである。
サンプル（10）は、1.0μlのDNA-PKcsを添加し、更に1.0μlのDNA-PKcsを添加し、1.0μlのwortmanninを添加した後、1.0μlのATPを添加したサンプルである。
上記サンプルのうち、複数の試薬を添加したサンプルにおける各試薬を添加する時間間隔はいずれも５分であった。
【００７５】
試薬添加後の基質DNAの構造を、蛍光顕微鏡（製品名：Axiovert 135 TV microscope、製造者名：Carl Zeiss）に接続したSIT camera（浜松フォトニクス）によってリアルタイムビデオ画像として取得した。また、画像上の見かけのDNA長を、画像解析ソフト（製品名：Argus image processor、製造者名：浜松フォトニクス）を用いて計測した。
DNA凝縮の程度は、サンプル中の基質DNAの構造を３種類に分類することにより評価した。具体的には、ビデオ画像から取得した基質DNAの最長部の長さ（見かけのDNA長）を基準とし、その長さが3.2μm〜4.9μmである基質DNAをランダムコイル構造とし、2.2〜2.9μmである基質DNAを部分的グロビュール構造とし、1.1〜1.4μmである基質DNAをグロビュール構造とした（図３（１）〜（３））。各サンプルについて、各サンプル中の各構造の割合を、以下の各式にしたがい算出した。：
ランダムコイル構造の基質DNAの割合（％）＝ランダムコイル構造の基質DNAの数÷（ランダムコイル構造の基質DNAの数＋部分的グロビュール構造の基質DNAの数＋グロビュール構造の基質DNAの数）×100
部分的グロビュール構造の基質DNAの割合（％）＝部分的グロビュール構造の基質DNAの数÷（ランダムコイル構造の基質DNAの数＋部分的グロビュール構造の基質DNAの数＋グロビュール構造の基質DNAの数）×100
グロビュール構造の基質DNAの割合（％）＝グロビュール構造の基質DNAの数÷（ランダムコイル構造の基質DNAの数＋部分的グロビュール構造の基質DNAの数＋グロビュール構造の基質DNAの数）×100
なお各構造の割合の算出には、複数のビデオ画像フレームよりランダムに抽出した100個の基質DNAのデータを利用した。
【００７６】
結果を、各サンプルにおける各構造の分布を示すヒストグラムとして、それぞれ図４（１）〜図４（10）に示す。各図において、「c」はランダムコイル構造の基質DNAの割合を意味し、「pg」は部分的グロビュール構造の基質DNAの割合を意味し、「g」はグロビュール構造の基質DNAの割合を意味する。
DNA-PKcs濃度の増加に伴い、基質DNAの構造はランダムコイル構造→部分的グロビュール構造→グロビュール構造へと変化した（図４（１）〜（３））。また、かかるDNA-PKcsによる基質DNAの凝縮は、ATPの非存在下で起きた（図４（１）〜（３））。ATPはリン酸基供与体であり、DNA-PKcsのプロテインキナーゼ活性（タンパク質リン酸化活性）が機能を発揮するために必須の物質である。したがって、DNA-PKcsのプロテインキナーゼ活性が機能しないATPの非存在下でDNA凝縮が起きたことは、DNA-PKcsのDNA凝縮活性がプロテインキナーゼ活性から独立していることを示している。
かかるDNA-PKcsによるDNA凝縮について、特定の理論に拘束されるものではないが、DNA凝縮は、DNAへ結合したDNA-PKcs（タンパク質）に生じたタンパク質親和性によって起こると考えられる。すなわち、多数のDNA-PKcsがDNAへ結合すると各DNA-PKcs間のタンパク質親和性が大きくなってDNA-PKcsの密な集積が起こり、かかる集積に伴いDNA-PKcsへ結合したDNAの空間的なパッキングが起こるので、結果としてDNA凝縮が起こると考えられる。
【００７７】
DNA-PKcs添加後にKu因子を添加した場合、基質DNAの凝縮の程度が高くなった（図４（２）及び図４（６））。一方、Ku因子のみ添加では基質DNAの凝縮は起こらなかった（図４（５））。また、Ku因子添加後にDNA-PKcsを添加した場合も、基質DNAの凝縮は起こらなかった（図４（８））。これらの結果より、Ku因子は、DNA-PKcsのDNA凝縮を促進する機能を有すること、及び、そのためにはKu因子の添加をDNA-PKcs添加後に行う必要があることが理解される。
かかる添加の順番について、特定の理論に拘束されるものではないが、Ku因子をDNA-PKcsよりも先に核酸へ添加すると、凝縮を起こさないKu因子-核酸複合体が優先的に形成（Ku因子はDNA-PKcsよりも核酸結合親和性が高いため）してしまうためであると考えられる。一方、DNA-PKcsをKu因子よりも先に核酸へ添加した場合は、DNA-PKcsが核酸へ結合して形成したDNA-PKcs-核酸凝縮体の構造をKu因子が安定化させるので、結果としてDNA-PKcsによるDNA凝縮活性が促進されると考えられる。
【００７８】
また、Ku因子の添加の有無にかかわらず、凝縮した基質DNAはATPによって脱凝縮した（図４（４）及び図４（９））。かかるATPによる脱凝縮について、特定の理論に拘束されるものではないが、ATPの存在により、DNA-PKcsのプロテインキナーゼ活性（DNA-PKcsは、自身のリン酸化部位ではなく、共存する他のDNA-PKcsのリン酸化部位をリン酸化する）が機能して、DNA-PKcsはリン酸化され、かかるリン酸化によりDNA-PKcsが不活性化（DNAへ結合性の低下やDNA-PKcs同士の親和性の低下）したため、結果として脱凝縮が起きたと考えられる。
【００７９】
一方、凝縮した基質DNAにwortmanninを添加した場合、その後にATPを添加しても、基質DNAの脱凝縮の程度は小さかった（図４（４）と図４（１０）との対比）。wortmanninは、DNA-PKcsのC末端にあるキナーゼ活性ドメインに位置する特定のリジン残基に共有結合してプロテインキナーゼ活性を不可逆的に阻害する物質である。したがって、wortmannin添加後にATPを添加しても、もはやDNA-PKcsのプロテインキナーゼ活性は機能せず、リン酸化が起こらないので、結果としてDNA脱凝縮が起こらなかったと考えられる。
これらの結果より、DNA-PKcsによるDNA脱凝縮は、DNA-PKcsのプロテインキナーゼ活性に依存的であると考えられた。
以上より、Ku因子、ATP及びwortmanninを用いることによって、DNA-PKcsによるDNA凝縮をコントロールすることができることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、核酸凝縮剤として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、DNA-PKcs添加による基質DNAの構造変化を示すビデオ画像である。
【図２】図２は、遠心分離処理によって生成したDNA沈殿凝集物の百分率を示すグラフである。
【図３】図３は、基質DNAの構造を示すビデオ画像である。図３（１）はランダムコイル構造にある基質DNAを示し、図３（２）は部分的グロビュール構造にある基質DNAを示し、図３（３）はグロビュール構造にある基質DNAを示す。
【図４】図４は、サンプル（１）〜（10）の基質DNAの各構造の分布を示すヒストグラムである。
【図２】
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【図４】
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【図１】
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【図３】
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【配列表】
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