(57)【要約】【課題】  非ウイルスベクターの効率を向上させる際に大きな障壁となっている一つの要因に外部遺伝子の核内移行が挙げられる。そこで核内移行を促進することでトランスフェクション効率を向上させるプラスミドDNAの導入法を提供する。【解決手段】  安価に容易に調製可能な糖修飾カチオンポリマーとプラスミドＤＮＡの複合体を用い、核内移行を促進することでトランスフェクション効率を向上させる外部遺伝子導入用ベクターおよびその利用法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の核内に導入されるべき遺伝子を含む核酸物質と、糖質で修飾されたポリカチオンポリマーとから形成された複合体から成ることを特徴とする外部遺伝子導入用ベクター。
【請求項２】
ポリカチオンポリマーを修飾する糖質が二糖類であることを特徴とする請求項１の外部遺伝子導入用ベクター。
【請求項３】
ポリカチオンポリマーが１級アミノ基を含むポリアミン類であり、ポリカチオンポリマーを修飾する糖質が還元アミノ化により導入されたものであることを特徴とする請求項１または２の外部遺伝子導入用ベクター。
【請求項４】
糖修飾されたポリカチオンポリマーが分枝状ポリエチレンイミン（PEI）であることを特徴とする請求項３の外部遺伝子導入用ベクター。
【請求項５】
ポリカチオンポリマーを修飾する糖質の導入率（修飾率）がPEIの全窒素原子数に対し5〜50％であることを特徴とする請求項４の外部遺伝子導入用ベクター。
【請求項６】
ポリカチオンポリマーを修飾する糖質の導入率（修飾率）がPEIの全窒素原子数に対し25〜30％であることを特徴とする請求項５の外部遺伝子導入用ベクター。
【請求項７】
ポリカチオンポリマーを修飾する糖質がラクトースであることを特徴とする請求項６の外部遺伝子導入用ベクター。
【請求項８】
核内に導入される核酸分子がプラスミドDNAであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの外部遺伝子導入用ベクター。
【請求項９】
細胞に遺伝子を導入し発現させる方法であって、該細胞を請求項１で定義される外部遺伝子導入用ベクターと接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の核内に導入されるべき遺伝子を含む核酸物質と糖修飾されたカチオンポリマーとの複合体（核酸構造体）から成る外部遺伝子導入用ベクターおよびその利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、非ウイルスベクターの効率を向上させる際に大きな障壁となっている一つに外部遺伝子の核内移行が挙げられる。この問題点を解決するためにこれまでに真核細胞内における核タンパクの核内移行システム利用が活発に取り組まれてきた。
【０００３】
つまり、核タンパクは一般に核内移行シグナル（NLS）という荷札を有しており、NLSペプチドに輸送体との仲介役としてのインポーティンαが結合し、最終的に輸送担体本体のインポーティンβとの三元複合体が形成され、核膜に存在する核膜孔をエネルギー依存的かつ選択的に輸送される。
【非特許文献１】Goerlich, D., Vogel, F., Mills, A.D., Hartmann, E., and Laskey, R. A., 377, 246-248,(1995).
【非特許文献２】Rexach, M., and Blobel,G., Cell 83, 683-692, (1995).
【非特許文献３】Yoneda, Y., J. Biochem.Tokyo 121, 811-817 (1996).
【０００４】
そこでこれまで、外部遺伝子とNLSペプチドを複合化することで、核内移行を促進し、ひいては発現効率をも向上させるべく多くの研究がなされてきた。しかし、NLSの効果が確認されたケースも有れば、発現効率に対する有意義な効果が否定された報告もあり、現在のところ方法論は確立していない。この原因の一つとして三元複合体を形成させることが二段階の反応であり効率を低下させている可能性がある。
【非特許文献４】Zanta, M. A., Belguise-Valladier,P., and Behr, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.96, 91-96 (1999).
【非特許文献５】Collas, P., and Alestrom,P., Biochem. Cell. Biol., 75, 633-640（1997）
【特許文献１】特許公表平11-506935
【特許文献２】特許公表平2002-514892
【特許文献３】特許公表平2002-533088
【非特許文献６】Nagasaki, T., Myohoji,T., Tachibana, T., and Tamagaki, S., Bioconjugate Chem., 14, 282-286 (2003).
【非特許文献７】Tanimoto, M., Kamiya,H., Minakawa, N., Matsuda, A., and Harashima, H., BioconjugateChem., 14, 1197-1202 (2003).
【０００５】
一方で最近、核内で機能する物質の核内移行メカニズムには三元複合体形成を必要とせず、直接輸送担体本体であるインポーティンβと複合体を形成することで多くの物質が核内に輸送されていることが明らかとなってきた。
【非特許文献８】Jakel, S., and Gorlich,D., EMBO J., 17, 4491（1998）
【非特許文献９】Truant, R.,and Cullen, B. R., Mol. Cell Biol., 19, 1210（1999）
【非特許文献１０】Nagoshi, E., Imamoto, N., Sato,R., and Yoneda, Y., Mol. Biol. Cell, 10, 2221 (1999).
【０００６】
我々は既に外部遺伝子の核内移行には核タンパク質輸送に関わる特定の細胞内因子に被導入遺伝子を結合させる手段が非常に有効であることを明らかとした。
【特許文献４】特願2004-039322
【特許文献５】特願2004-204286
【特許文献６】特願2004-332892
【０００７】
しかし、核タンパク質輸送に関わる特定の細胞内因子に被導入遺伝子を結合させる手段は細胞質から核内への移行には非常に有効であるが、核タンパク質輸送に関わる特定の細胞内因子の調製はスケールやコストの面で問題点が残る。
【０００８】
一方、近年カチオン性ポリマーに糖鎖を修飾することで、細胞毒性を低減化したり、導入発現効率を向上できることが報告されている。
【非特許文献１１】Diebold, S.S., Kursa,M., Wagner, E., Cotton, M., and Zenke, M., J. Biol.Chem., 27, 19087（1999）
【非特許文献１２】Fajac, I., Grosse, S., Briand, P., and Monsigny, M.,Gene Ther., 9, 740（2002）
【非特許文献１３】Roche, A. C.,Fajac, I., Grosse, S., Frison, N., Rondanino, C., Mayer, R., and Monsigny,M., Cell. Mol. Life Sci., 60, 288（2003）
【０００９】
特に、ラクトース修飾カチオンポリマーの遺伝子導入発現効率向上は細胞内挙動に影響を与えていることが指摘されており、ポリ-L-リジンでは核内移行が促進されることが報告されている。
【非特許文献１４】Klink, D. T.,Chao, S., Glick, M. C., and Scanlin,T. F., Mol. Ther., 3, 831（2001）
【００１０】
しかし、PEIを用いた場合では核内移行されるラクトース修飾は５％未満であり、その機構は未だ明らかではない。
【非特許文献１５】Frosse, S., Aron,Y., Honore, I, Thevenot,G., Danel, C., Roche, A-C., Monsigny,M., and Fajac, I., J. Gene Med., 6, 345（2004）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、安価に容易に調製可能であり、核内移行を促進してトランスフェクション効率を向上させる外部遺伝子導入ベクターおよびその利用法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
糖修飾カチオンポリマーを合成する方法にはカチオンポリマーの反応活性基であるアミノ基に対して、グリコシルフェニルチオカルバミル基として導入する方法、グリコシルピログルタミル基として導入する方法などが知られているが、これらは反応剤を調製する必要がある。一方、還元末端をもつ糖に対する還元アミノ化によるグリシチル基の導入は、糖をそのまま使用でき、反応操作も簡便であり有利な点が多い。
【００１３】
一方、カチオン性ポリマーの中で、PEI（ポリエチレンイミン）はin vitro, in vivo において高い遺伝子導入効率を有し、安価で入手しやすい化合物であるが、トランスフェクション時に細胞毒性が問題となることが指摘されている。また、糖修飾、特にラクトースを修飾することで、遺伝子導入効率が向上することが知られているが、その機構は未だ明らかではない。
【非特許文献１６】Boussif, O., Lezoualc’h, F., Zanta, M.A., Mergny, M. D., Scherman,D., Demeneix, B., and Behr, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 7997(1995)
【非特許文献１７】Remy, J. S.,Abdallah, B., Zanta, M. A.,Boussif, O. Behr, J. P., and Demeneix,B., Adv. Drug Deliv. Rev. 30, 85(1998)
【非特許文献１８】Godbey, W. T., Wu, K. K., and Mikos, A. G., J. Control. Release 60, 149 (1999)
【非特許文献１９】Kiecheis, R., Wightman, L., andWagner, E., Adv. Drug Deliv. Rev. 53, 341 (2001)
【００１４】
本発明者は、被導入遺伝子を含む核酸物質と、糖修飾されたカチオンポリマーとを組み合わせることにより、動物細胞への遺伝子導入発現効率に優れ、その原因が核内移行促進を伴うことで優れたトランスフェクションシステムとして機能することを見出した。
【００１５】
かくして、本発明は、細胞の核内に導入されるべき遺伝子を含む核酸物質と糖修飾されたカチオンポリマーからなる複合体（核酸構造体）を用いることを特徴とする、核内移行促進を伴う細胞内への外部遺伝子導入用ベクターおよびその利用法を提供するものであり、本発明の特に好ましい態様に従えば、カチオンポリマーとしてポリエチレンイミン(PEI)を、糖としてラクトースを使用し、PEIの全アミノ基の25〜30％にラクトシル基を導入する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法によれば、プラスミドDNAと容易かつ安価に調製される糖修飾されたカチオンポリマーからなる核酸構造体を用い、核内移行を促進することでプラスミドDNAを効率よく動物細胞内に導入することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の各構成要素に沿って本発明の実施の形態を説明する。
既述のように、本発明において、細胞に導入される核酸物質は核内で機能する核酸類で有ればどのような形態でも良く、RNA、オリゴDNA、プラスミドDNA、１本鎖核酸、２本鎖核酸が導入可能である。好ましくは、プラスミドDNAが好適であり、プラスミドDNAは発現するタンパクをプロモーターの下流にコードするもので、その具体的な塩基配列については目的タンパクによって異なる。
【００１８】
本発明において核酸物質と複合体を形成させるカチオンポリマーとしては１級アミノ基を含むポリアミン類であればいずれも使用でき、キトサン、ポリアルキレンイミン（PEI、ポリプロピレンイミン、分岐状、直鎖状など）、ポリリジン、ポリアミドアミンデンドリマーなどが使用可能である。好ましくは、分枝状PEIであり、その分子量は15,000〜36,000Da、例えば、25000Daのものが良い。
【００１９】
本発明においてポリカチオンポリマーを修飾する糖質としては、還元末端を有している糖類のうち、単糖類、二糖類、オリゴ糖であり、特に好ましいのは二糖類である。オリゴ糖としてマルトトリオース、パノース、イソマルトトリオース、乳汁オリゴ糖など、二糖類として、ラクトース、マルトース、イソマルトース、マンノビオース、ゲンチオビース、ラミナリビオース、セロビオース、メリビオース、キトビオースなど、単糖類として、グルコース、ガラクトース、マンノース、タロース、アロース、アルトース、グロース、イドース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソースなどを使用できる。
【００２０】
また、プラスミドＤＮＡを導入される細胞も限定されるものではなく、疾患の治療用、クローン用などの目的に応じてあらゆる種類の動物細胞を対象とすることができる。
【００２１】
カチオンポリマーの糖修飾化は図３に反応スキームを示すような還元アミノ化により行うのが好ましい。すなわち、カチオンポリマーのアミノ基と還元末端カルボニル基とのシッフ塩基形成後、シアノボロハイドライドによる還元反応をおこない、アミノ基への糖修飾を容易に入手できる原料からワンポット合成で効率的に得た。
還元アミノ化に際しては、糖質の導入率が重要であり、例えば、分子量25,000のPEIの場合一分子あたりの導入数は二糖の場合、29〜290、好ましくは145〜174とし、これによって、PEIの全窒素原子に対して5〜50%、好ましくは25〜30%の導入率（修飾率）が得られる。
より具体的な細胞の核内に導入されるべき遺伝子を含む核酸物質と糖修飾されたカチオンポリマーからなる核酸構造体の調製法、キャラクタリゼーションおよびin vitro試験における核内移行促進評価に関しては、以下の実施例において詳細に例示する。なお、本発明はこれら実施例にその技術的範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２２】
二糖修飾PEIの調製  PEI（Aldrich社製、分枝状、25,000Da）と二糖をそれぞれ200mMのK2HPO4aqに溶かして混合し、還元剤としてNaBH3CNを加え80℃オイルバス中で振とうした。1晩毎に合計で糖の２倍等量のNaBH3CNを加え3日間反応させた。反応溶液を30,000の限外濾過フィルター（Centricon Plus-20）を用いて1M NaCl aq 4mlで5回洗浄した後、Milli Q 4mlで5回洗浄し、凍結乾燥後、目的の化合物を得た。元素分析よって糖の修飾率を算出した。その結果を表１に示す。
なお、LacPEI(300)を例として元素分析値(C,
46.98；N, 12.67%)からの修飾率算出方法を示せば次のようになる。
LacPEI(300)の構造式は以下の通り表される。
ここで、分子量25000DaのPEIの繰り返し単位の数581個のうちラクトシル化残基数をXとする。
C/N＝[(581X12.011)＋(12X x 12.011)]／[581 14.0067]＝46.98/12.67
X＝160.9となり(160.9/581)x100＝27.7％となる。
【００２３】
【化１】
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【００２４】
二糖−PEI複合体の合成には、結合様式・構成糖の異なる8種の還元性二糖を用いて、PEIに対して60、200、300、500、1500等量の二糖を反応させ、修飾率の異なる二糖−PEI複合体を合成した。
今後二糖修飾PEIの略号は使用した二糖の略と修飾反応時のPEIのモル数に対する二糖のモル数比を示す数字（カッコ内）で表記する。例えば、修飾反応時にマルトースをPEIのモル数の60等量添加して得られた化合物はMalPEI(60)と表す。なお「substitution
degree」と表記しているのが修飾率（導入率）である。
【００２５】
【表１】
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【実施例２】
【００２６】
DNA親和性評価（アガロースゲル電気泳動）  0.8%アガロースゲルを使い、500ngのpDNA（pGL3-control, Promega社製）と糖修飾PEIを各N/P（ポリエチレンイミンの窒素原子数とプラスミドDNAのリン酸基数の比で定義され、カチオン／アニオン比に対応する）で混合しpolyplex（本発明の複合体）を形成させ電気泳動を行い、エチジウムブロミドで染色し、DNA親和性評価を行った。代表的例として、LacPEI(300)を用いたときの結果を図１に示す。
N/P＞３、すなわちレーン（lane）7〜12においてLacPEI(300)を用いた際に遊離のプラスミドDNAのバンドは認められず完全にプラスミドDNAと複合化していることが分かる。
【実施例３】
【００２７】
二糖修飾PEIの細胞毒性  合成した二糖修飾PEIの細胞毒性は、WSTアッセイによって代謝率の増減を測定する事で評価した。
96wellプレートに細胞を1×104 cells/wellで撒き、1×DMEM培地中37℃、5% CO2で24時間培養した。その後、培地を抜き取り、1.25×DMEM培地を40μlを加え、pDNA（pGL-3）0.2μg/wellと二糖−PEI溶液を各N/Pで混合しpolyplexを形成させ、10μlを各wellに加え、37℃、5% CO2で3時間培養した。3時間後polyplexを含む培地を除き、1×DMEM培地を110μl/wellで加え、37℃で45時間培養した。45時間後、Cell-Counting Kit8(DOJINDO)を10μl/wellで加え、37℃で3時間培養した。3時間後、吸光度を測定し、細胞生存率を算出し、細胞毒性を評価した。細胞にはCOS-1（アフリカ緑ザル腎細胞）とA549（ヒト肺ガン細胞）を用いた。結果を図２に示す。
トランスフェクション実験時と同条件下（N/P=10）においては未修飾PEIよりも細胞生存率の低い場合は無く、糖修飾することで細胞毒性が低下することが分かる。
【実施例４】
【００２８】
タンパク発現実験  実施例１で調製した幾つかのベクターについてタンパク発現実験を行なった。ベクターの遺伝子導入・発現効率はルシフェラーゼアッセイにより評価した。
24wellプレートに細胞を1×104 cells/wellで撒き、1×DMEM培地中37℃、5% CO2で24時間培養した。その後、培地を抜き取り、1.25×DMEM培地を200μl加え、ルシフェラーゼをコードしたpDNA（pGL-3）1μg/wellと二糖-PEI溶液を各N/Pで混合しpolyplexを形成させ、50μlを各wellに加え、37℃、5% CO2で3時間培養した。3時間後polyplexを含む培地を除き、1×DMEM培地を1ml/wellで加え、37℃で48時間培養した。培地を除き、PBSで2回細胞を洗浄し、ルシフェラーゼアッセイで遺伝子発現を評価した。ルシフェラーゼ活性は、relative light units（RLU値）を化学発光を測定することで求めた。
細胞にはCOS-1（アフリカ緑ザル腎細胞）とA549（ヒト肺ガン細胞）を用いた。結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
未修飾PEIと比較し、LacPEI(300)はCOS-1, A549 両方の細胞に対して、非常に高いトランスフェクション効率を有することが分かる。これら二つの細胞は細胞表面にはガラクトースを認識するアシアロ糖タンパク認識レセプターを発現していることは知られておらず、このトランスフェクション効率の高さは細胞内への取り込み以外の要因が考えられる。
【実施例５】
【００３１】
ラクトース修飾率のトランスフェクションに及ぼす影響  ラクトース修飾PEIの活性の高さはLacPEI(300)とLacPEI(60)の結果の比較から導入されたラクトシル基の数に依存することが予想された。そこで、導入数の種々異なるラクトース修飾PEI（LacPEI(60)、LacPEI(300)、LacPEI(1500)）を用い、COS-1（アフリカ緑ザル腎細胞）とA549（ヒト肺ガン細胞）へのトランスフェクションを行った。結果を図４に示す。
COS-1、A549両方の細胞共にLacPEI(300)のトランスフェクション活性が高く、ラクトース修飾率の適正値が存在することが分かる。
【実施例６】
【００３２】
マイクロインジェクションによる核内移行促進確認  PLL-coatingガラスボトムデッシュにCOS-7（サル由来腎細胞）を10*104で撒き、37℃、5% CO2で24時間培養した。
Rhodamineで蛍光ラベル化したpDNA（pGL3-control、Rho-pDNA）、キャリアーとGST-GFPを各々0.45μlのフィルターにかけた後、Rho-pDNAとキャリアーをN/P=10で複合体を形成させ、同容量のGST-GFPを混合した。混合溶液を直ちに細胞の細胞質にインジェクションした。その後、37℃、5% CO2で20分間培養後、フェノールレッド不含の培地に培地交換し、蛍光観察を行った。ポリマーとしてLacPEI(300)とPEIを比較した。その結果を図５に示す。
LacPEI(300)ではプラスミドDNAが核内に局在しているのに対して、LacPEI(1500)と未修飾PEIでは細胞質に多くのプラスミドDNAが残存しており、LacPEI(300)がプラスミドDNAの核内移行を促進していることは明らかである（図５の中段の「Rho-pDA」参照）。なお、図５上段の「GST-GFP」とは、グルタチオンS-トランスフェラーゼと緑色蛍光タンパクの融合タンパクの略号であり、GST-GFPの存在場所がインジェクションした細胞の細胞質を示し、下段の「Phase」とは位相差顕微鏡図を示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
プラスミドDNAを用いる遺伝子治療用の非ウイルスベクターとして利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】アガロースゲル電気泳動によるプラスミドDNAとの複合体形成確認（実施例２）。
【図２】糖修飾PEIのN/P=10におけるCOS-1(a)、A549(b)細胞に対する毒性評価（実施例３）。
【図３】カチオンポリマーを糖修飾する還元アミノ化の反応スキーム。
【図４】ラクトース修飾率のトランスフェクション活性への影響（実施例５）。
【図５】COS-7細胞へのマイクロインジェクション（実施例６）。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図５】
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