(57)【要約】【課題】新規なポリペプチドの提供。【解決手段】単離されたポリペプチドであって、配列番号２の細胞外Ｎ−末端、aa 20-107 ；第１トランスメンブラン領域、aa 107-126；第１細胞質ループ、aa 127-157；第２トランスメンブラン領域、aa 158-179；第１細胞外ループ、aa 180-435；第３トランスメンブラン領域、aa 436-454；第２細胞質ループ、aa 455-480；第４トランスメンブラン領域、aa 481-503；第２細胞外ループ、aa 504-792；第５トランスメンブラン領域、aa 793-816；又は細胞質Ｃ−末端aa 817-865のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、配列番号２の細胞外Ｎ−末端、aa 20-107 ；第１トランスメンブラン領域、aa 107-126；第１細胞質ループ、aa 127-157；第２トランスメンブラン領域、aa 158-179；第１細胞外ループ、aa 180-435；第３トランスメンブラン領域、aa 436-454；第２細胞質ループ、aa 455-480；第４トランスメンブラン領域、aa 481-503；第２細胞外ループ、aa 504-792；第５トランスメンブラン領域、aa 793-816；又は細胞質Ｃ−末端aa 817-865のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞及び前駆細胞(progenitor cell) により発現された抗原、及びそのような抗原を、特に細胞分離及び精製のために使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類血液細胞の高い交代速度 (turnover) は、他の血液細胞系統を生ぜしめることができる造血幹細胞の供給を必要とする。造血幹細胞の直子孫は、前駆細胞と呼ばれ、そして１又は複数の系統、すなわちエリスロイド、ミエロイド及びリンパ系統内の種々の細胞型を生ぜしめることができる。幹細胞及び前駆細胞集団は、骨髄、胎児肝臓、等における全細胞数の数％のみを構成する。それらの集団は、造血系をもとの集団にもどす (repapulate) それらの能力のために、非常に興味あるものである。
【０００３】
造血幹細胞及び前駆細胞集団の精製又は富化のための多くの方法が、文献に記載されて来た。造血前駆細胞は多くの臨床的用途を有するので、それらの方法にかなりの商業的関心がよせられている。前駆細胞移植が、白血病、乳癌及び他の腫瘍の治療のために化学療法及び放射線と組合わせて現在使用されている。ときおり、移植片拒絶の危険性を回避するために自己由来の移植物が使用されているが、しかし移植細胞集団における腫瘍細胞の存在のために、病気再発の高い危険性が存在する。従って、より精製された前駆細胞源の移植が好ましい。
【０００４】
遺伝子療法のためのビークルとしての造血前駆細胞の使用にも興味がもたれている。臨床的にはまだ証明されてはいないが、造血幹細胞の寿命、及び脈管構造におけるそれらの子孫(progeny) の散在性(disseminity) は所望の特徴である。多くのベクター、たとえば造血幹細胞をトランスフェクトすることができる、いくつかのレトロウィルス及びアデノウィルスに基く構造体が記載されて来た。
【０００５】
造血幹細胞及び前駆細胞集団上に見出される、タンパク質及び他の細胞表面マーカーは、それらがそれらの集団の同定、分離及び単離のための試薬の調製、及びそれらの重要な細胞のさらなる特徴化において有用であるので、非常に興味あるものである。幹細胞の同定及び分離（陽性及び陰性）において使用され得るいくつかの抗原、たとえば幹細胞上に見出されるが、しかし成熟血液細胞上には見出されないCD34抗原が現在、知られているが、他の抗原、特に所望のクラス及びサブクラスの細胞、特に造血幹細胞及び前駆細胞の精製及び分離を単純にすることができる抗原の開発が常に必要とされている。
【０００６】
背景文献
アメリカ特許第 5,061,620号は、実質的に均質なヒト造血幹細胞組成物及びそのような組成物を得る態様を記載する。ストロマ細胞関連の造血が、Paulなど．(1991) Blood 77 : 1723-1733 により記載されている。ローダミン染色による幹細胞の表現型の同定が、Spangrnde and Johnson (1990) P.N.A.S. 87 : 7433-7437に論じられている。造血における細胞表面抗原発現が、Strauss など．(1983) Blood 61 : 1222-1231 及びSieff など. (1982) Blood 60 : 703-713 に論じられている。
【０００７】
多能性造血細胞の記載が、McNiece など.(1989) Blood 74 : 609-612 及びMoore など. (1979) Blood Cells 5 : 297-311に見出される。幼若細胞−含有コロニーをインビトロで形成できるヒト造血前駆細胞の特徴化が、Gordonなど. (1987) J. Cell. Physiol. 130 : 150-156及びBrandtなど. (1988) J. Clin. Invest. 82 : 1017-1027に見出される。移植への前駆細胞の使用が、Toなど. Progenitor Threshold in Transplantation (ISBN 1-880854 17-1) pp.15-20 に論じられている。前記方法を用いて得られる細胞組成物の利用性及び本発明の組成物が、中でもそれらの出版物に記載されている。
【０００８】
ヒト造血前駆細胞の単離のための高いグラジエントの磁気分離の使用が、Thomas and Landsdorp (1992) Advances in Bone Merrow Purging pp.537-544；及びKato and Radbrach (1993) Cytometry 14 : 384-392 に記載されている。ヒト造血前駆細胞についての磁気選択の他の方法が、Bigas など. (1992) Advances in Bone Merrow Purging pp.545-551 ; Oku など. (1992) Advances in Bone Merrow Purging pp.553-560 ; 及びHardwickなど. (1992) Advances in Bone Merrow Purging pp.583-589 に記載されている。高いグラジエントの磁気細胞分類が、Miltenyiなど. (1990) Cytometry 11 :231-238 に記載されている。Moldayのアメリカ特許第 4,452,773号は、磁気性鉄−デキストラン微小球の分離を記載し、そして生物学的材料への結合のために適切な粒子の種々の調製手段を記載する要約を提供する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の要約
ヒト造血前駆体及び幹細胞の富化及び特徴化のための方法及び組成物が提供される。幹細胞及び前駆細胞上に存在し、そして造血細胞の生物学的（又は他の）源に存在する莫大な数の細胞からのそれらの重要な細胞の同定及び／又は選択のために使用され得る、本明細書においてAC133 抗原として言及される抗原が同定された。それら、たとえば抗体と反応する新規抗原組成物及び試薬が、本発明の方法への使用のために、並びに造血前駆体及び幹細胞生物学のさらなる研究のために供給される。たとえば、造血細胞は、種々の源、たとえば胎児及び成人骨髄、サイトカイン可動化(mobilized) 末梢血液細胞、及び胎児肝臓から得られ、そして本発明の試薬及び方法を用いて分離され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ヒト造血幹細胞及び／又は前駆細胞の富化及び／又は特徴決定に使用される方法及び組成物が提供される。本命最初においては“前駆”細胞と呼ばれる、造血幹細胞の直子孫(immediate progeny) は、１又は複数の系統(lineage) 内に種々の細胞型を生じさせることができる。本発明においては、幹細胞及び／又は前駆細胞のサブセット（すなわち、短期移植(short ingraftment) のために必要とされる CFU−GM細胞）が、それらの細胞に対して高い特異性を有するAC133 抗原（Ag）として本明細書で言及される新しく発見された抗原に特異的に結合する試薬の使用を通して同定され、又は選択され得る。
【００１１】
AC133 抗原発現の高い組織特異性は、高く精製された前駆細胞集団についての富化の間、特に好都合である。 AC133−陽性細胞集団は、前駆細胞活性、特に CFU−GM活性を測定するアッセイにおいて活性的である細胞について高度に富化される。AC133 陰性であり、且つCD34陽性である細胞サブセットは、 BFU−Ｅ活性、すなわちエリトロイド−コミッテッド(committed) 前駆細胞活性の測定のために富化される。
【００１２】
AC133 抗原に対して特異的に結合する試薬は、生理学的リガンド、合成リガンド、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を包含する。AC133 モノクローナル抗体は、ヒト骨髄、胎児骨髄及び肝臓、臍帯血及び成人末梢血液に由来する造血前駆細胞上に発現されるAC133 細胞抗原と特異的に相互作用するいづれかのモノクローナル抗体である。AC133 に対して向けられる抗体により認識される前駆細胞のサブセットは、CD34ｂｒｉｇｈｔであり、そしてCD34＋  サブセット（及び前駆細胞の収集において収集されるまだ幹細胞である細胞）に存在する実質的にすべての CFU−GM活性を含む。移植のためには、 CFU−GMにおいて活性な細胞は、それらが好中球の生成を提供するので、特に興味あるものである。
【００１３】
AC133 抗体の使用は、造血前駆細胞集団の陽性免疫選択、及びフローサイトメトリーを用いての前駆細胞集団の表現型分析を可能にする。特に、AC133 に対する抗体は、短期移植及び敗血症からの保護のために必要とされる CFU−GM細胞のみならず、さらに、長期の移植のために必要である原始的な長期のもとの集団にもどる細胞 (primitive long-term re-populuting cells)を認識する。次に、AC133 抗原の発現について選択される細胞は、他の造血幹細胞及び前駆細胞マーカーについての選択によりさらに精製され、そして／又は選択され得る。
【００１４】
下記に詳細に記載されるように、本発明の種々の方法における興味ある分子は、AC133 抗原それ自体、AC133 又はそのフラグメントに対して特異的に結合する試薬、AC133 抗原をコードする核酸配列、及びAC133 抗原又はそのいづれかのフラグメントを発現する細胞集団を包含する。AC133 抗原は、天然源から単離され、又は組換えDNA 技法を用いて製造され得る。核酸は、cDNA，RNA 、ゲノム配列、又はコード配列を単独で、又は転写調節領域、及び発現及び／又はクローニングベクターに見出される他の配列と組合して含んで成る合成配列であり得る。AC133 Ag自体は、当業界において知られているアフィニティー結合法を用いてAC133 抗体結合により陽性として同定され得る細胞からの単離により精製された形で得られる。陽性同定は、細胞膜タンパク質のタンパク質分解消化、及び図12に示されるAC133 についてのタンパク質配列に対する配列の比較により入手できる。
【００１５】
mAb AC133 は、明るい (bright) CD34＋  細胞上に発現される新規の細胞表面抗原に対する特異性を有する抗体である。前記抗原は、ヒト骨髄、胎児骨髄及び肝臓、臍帯血、及び成人末梢血液に由来する造血前駆細胞のサブセット上に発現される。mAb AC133 は、可能性ある治療利点、及びフローサイトメトリーを用いての前駆細胞集団の表現型分析をもたらす、造血前駆細胞集団を免疫選択するために磁気ビーズシステムに使用され得る。
【００１６】
この新規分子の性質をさらに特長づけるために、AC133 抗原がイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。AC133 抗原は、約 120KDの減じられた分子量を有する一本鎖ポリペプチドから成り、そして約20KDa のＮ−グリコシド結合多糖類と共に糖タンパク質を含んで成る。還元されたAC133 抗原はmAb AC133 により認識され、これは線状エピトープ又は糖エピトープを示唆する。
【００１７】
そのような分子は、類似性が同じ出発ペプチド構造体からの合成のために、AC133 分子の収集において、糖構造体間に確かに存在するが、ペプチド合成のために存在する鋳型（すなわち、メッセンジャー RNA）なしに存在する正確に同一の糖構造体を、糖合成の酵素性質のために有することが予測されないことが、糖タンパク質の分野におけるそれらの実験により認識されるであろう。従って、“AC133 抗原”は、グリコシル化部位に付加される糖構造と共に図12（下記で論ぜられる）に示されるペプチド構造を有するタンパク質を意味する。
【００１８】
糖構造における天然の変動のために、グリコシル化された分子のための広範囲の分子量がまた、予測され、そして本発明の範囲内にある。AC133 抗原の場合、他の既知のタンパク質に比較して、結合される糖残基の構造及び大きさにおいて比較的低い変動性が存在すると思われる。AC133 の分子量は典型的には、分子量を測定するために、使用される実験技法の詳細には無関係に、 115〜127KD の範囲にあることが見出されている。
【００１９】
精製されたAC133 抗原は、リシルエンドペプチダーゼにより消化されてペプチドが生成され、これは逆相HPLCにより単離され、そしてEdman 分解により配列決定された。それらのペプチドは、WERI−Rb−１cDNAライブラリー鋳型を用いてのポリメラーゼ連鎖反応に使用される縮重オリゴヌクレオチドを設計するために使用される。この技法は、次に、 1.7KBの明白な配列を生成し、これは完全なcDNAクローンを単離するために使用された。このcDNAは、2598個のヌクレオチドの単一の読取り枠をコードし、そして解鎖を除去した抗原について見出される約90KDa の分子量に対応する、96.8KDa の分子量を有する 865個のアミノ酸タンパク質を予測せしめる。疎水度及びトランスメンブランらせん度の分析は、２つの大きな細胞外ループをもたらす、５つのトランスメンブランドメインの存在を示唆する。
【００２０】
Ｎ−結合されるグリコシル化の部位のための合計８個のコンセンサス配列が存在し、そのすべてが、２つの大きな細胞外ループ及び50個のアミノ酸のＣ−末端細胞質テイルを有する本発明者が提案した構造モデルを支持する２つの大きな(260及び 290個のa.a.）ループ上にある。前記細胞質末端を失ったAC133 抗原の末端切除されたものはまだ、mAb AC133 により認識される。その生理学的リガンドとの受容体の相互作用に関与し得る、両細胞外ループにロイシンジッパーモチーフ (leucine zipper motif) のためのコンセンサス配列が存在する。図13に示されるように、AC133 抗原は、細胞外Ｎ−末端及び細胞質Ｃ−末端を有する５−トランスメンブランタンパク質（“５TMタンパク質”）として現われる。
【００２１】
４MT（また、テトラスパンとも呼ばれる）、７TM及び11TMタンパク質のファミリーは、文献に特徴づけられている。テトラスパンファミリーの機能は知られていないが、７TMタンパク質は一般的に、走化性アゴニストを結合するＧ−タンパク質結合の受容体結合であると思われ、そして11TMはイオン−チャンネル受容体のファミリーを表わす。しかしながら、５TM分子はこれまで記載されておらず、そしてAC133 抗原の構造は、分子量及び細胞外ループの大きさに関して、既知の７TM種類のメンバーと著しく異なる。さらに、AC133
抗原は４TM又は７TMタンパク質と配列相同性を共有しないが、該TMメンバーは、特にトランスメンブランドメイン内でお互いと有意な相同性を共有する。
【００２２】
AC133 遺伝子の短いフラグメントは、EST(発現された配列標識）、たとえば成人の網膜、ランゲルハンス島及び胎児の脳として、Genbank に存在する。しかしながら、AC133 抗原の発現は、原始造血幹細胞及びいくつかの神経冠由来の組織に限定されると思われる。AC133 抗原はまた、NT−２奇形癌細胞上に発現され；しかしながら、発現は、それらの細胞が最終的にニューロンに分化するにつれて失なわれる。AC133 抗原（受容体）と生理学的リガンドとの相互作用は、細胞内シグナルを供給することができる。
【００２３】
AC133 抗原に対する発見された元のモノクローナル抗体は、CD34brightヒト造血幹細胞及び前駆細胞上に選択的に発現される、約 120,000Mrの新規抗原を定義する抗体のパネルの１つである。CD34bright細胞は長期のＢ細胞リンパ球産生及び骨髄造血をインビトロで支持し、そしてＴ，Ｂ、骨髄単球及び巨核球のもとの集団へのもどりをインビボで仲介する。CD34dim 細胞は、インビトロ又はインビボで、長期の造血活性を付与しなかった。CD34bright集団は、すべての原始幹細胞活性を含み、そして従って、造血幹細胞移植及び遺伝子療法におけるさらなる研究のために選択される集団である。
【００２４】
AC133 抗体は、造血幹細胞及びコミッテット(committed) 前駆細胞のサブセットの陽性選択及び表現型分析のための手段を提供する。最初の特異的抗体AC133 、すなわちネズミIgG１抗体は、精製されたCD34+ヒト前駆細胞により免疫化されたマウスから誘導された。AC133 陽性細胞の正確な抗原表現型を決定するために、AC133 及びCD34二重陽性細胞が、３及び４色FACS分析を用いて、胎児肝臓、胎児及び成人骨髄、臍帯血及び末梢血液において試験された。すべての組織においてAC133 抗体により認識されるサブセットは、CD34bright、CD38-/+， HLA−DR+/-である。CD90+，CD117+及び CD109+幹細胞集団は、AC133 陽性集団内に含まれる。
【００２５】
典型的には、AC133はすべてのCD34+細胞の20〜60％を染色し、その集団は系統に付されていない(non-lineage committed) CD34+集団及び顆粒球／半球路に付された(committed) CD34+細胞のすべてを含む。AC133 抗原の発現は、標準のFACS法により、末梢血液単核細胞、顆粒球、血小板又は臍帯静脈由来の内皮細胞上で示されない。50人のヒト細胞系のパネルに対するFACS分析は、わずか２種の網膜芽腫細胞系、すなわちＹ79.1及びWERI−Rb−１が、NT−２奇形癌細胞と共にAC133 抗原を発現することを示す。
【００２６】
羊胎児へのAC133 陽性細胞の移植は、選択された細胞の移植能力を示しており、そしてその胎児の羊骨髄に入ったヒト細胞が収穫され、そして二次受容体に移植することが示され、これは選択された細胞の長期のもとの集団へのもどりの能力を提供する。AC133 遺伝子は、96.8KDa の予測されるサイズを有する、865個のaaから成るポリペプチドをコードする。このタンパク質は、膜を５回横切るユニークな構造を有する。従って、AC133 抗原は、哺乳類５TM膜タンパク質の新しいクラスを定義する。それらのデータは一緒になって、AC133 が造血幹細胞の同定及び分離のためのもう１つの抗原システムを提供することを示す。
【００２７】
幹細胞及び／又は前駆細胞に選択的に結合する抗体は、特に興味あるものである。AC133 Agに対する抗体は、ヒト造血前駆細胞により異種移植免疫担当哺乳類宿主（たとえば、ネズミ、ゲッ歯動物、ウサギ、羊、ブタ又はウシ宿主）を免疫化することによって得られる。免疫化のための適切な前駆細胞集団は、サイトカイン−可動化末梢血液、骨髄、胎児肝臓、又は他の前駆細胞源からCD34+細胞を単離することによって得られる。細胞は、免疫原としてのそれらの使用の前、フィトヘマグルチニンと共にインキュベートされ得る。
【００２８】
免疫化は従来の技法に従って行なわれ、ここで細胞は宿主中に、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内注射され得る。通常、約106〜108個の細胞が使用され、これは１回又はそれ以上の回数の注射〜通常、約８回を越えない回数の注射に分けられ、そして約１〜32週間の期間に及ぶ。この注射はアジュバントを伴って又はそれを伴わないで行なわれ得；アジュバントの例は完全又は不完全フロイントアジュバント、スペコール（specol) 及びミョウバンを包含する。
【００２９】
好ましい態様においては、対側性免疫化 (contralateral immunization) が、下記例に記載のようにして使用される。この方法は、抗原刺激の部位に向かう免疫リンパ球の自由に往来する能力による。動物は、身体の片側、たとえば左支脚皿上の局部で、免疫優性であるが、しかし無関係な多くの抗原を発現する細胞により予備免疫化される。種々の造血細胞がこの目的のために使用され得る。注目の免疫原が、動物の反対側上の局部で注射される。無関係の抗原により予備免疫化され、そしてその抗原に対して応答するリンパ球が左側の流入リンパ節におびき寄せられ、そして注目の免疫原に応答するリンパ球が支脚皿注射のために、右側の流入リンパ節、たとえば膝窩リンパ節に存在するであろう。この膝窩リンパ節は、融合のために細胞源として使用され得る。
【００３０】
免疫化スケジュールの完結の後、抗血清が、AC133 Agを包含する造血前駆細胞の表面膜タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗血清を供給するために、従来の技法に従って収穫され得る。次に、リンパ球が適切なリンパ組織、たとえば脾臓又は流出リンパ節から収穫され、そして適切な融合パートナー、通常、骨髄腫系により融合せしめられ、特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが生成される。興味ある抗原特異性についてのハイブリドーマのクローンのスクリーニングが、従来の方法に従って行なわれ得る。
【００３１】
特に次のものが興味あるものである：下記例に記載される特異的モノクローナル抗体AC133 ; AC133 抗原に結合する他の抗体（モノクローナル及びポリクローナルの両者）、特に交差反応性抗体（すなわち、同じエピトープに結合し、そして同時結合を実質的に阻害するもの）；その種類似体；その結合フラグメント；及びその接合体。AC133 抗原に対する抗体を発現するネズミハイブリドーマ細胞系の寄託は、1997年４月23日、American Type Cultuce Collection, 1230) Parklawn Drivo, Rockville MD 20852で行なわれ、そしてATCC受託番号を与えられた。それらの抗体は、注目の造血細胞サブセットについて免疫選択することができる。
【００３２】
抗体が通常のマルチ構造の代わりに一本鎖として生成され得ることは知られている。一本鎖抗体は、Jostなど. (1994) J.B.C. 269: 26267-73、及び多くの他の文献に記載されている。Ｈ鎖の可変領域及びＬ鎖の可変領域をコードするDNA 配列は、グリシン及び／又はセリンを包含する、少なくとも約４個のアミノ酸の小さな中性アミノ酸をコードするスペーサーに連結される。この融合体によりコードされるタンパク質は、機能的可変領域のアセンブルを可能にし、そして元の抗体の特異性及び親和性を保持する。
【００３３】
抗体をヒト化する方法もまた、当業界において知られている。ヒト化抗体は、トランスジェニックヒト免疫グロブリン−不変領域遺伝子を有する動物の生成物であり得る（たとえば、国際特許出願WO90/10077及びWO90/04036を参照のこと）。他方では、注目抗体は、CH１，CH２，CH３、ヒンジドメイン及び／又は骨格残基をその対応するヒト配列により置換する組換えDNA 技法により構築され得る（WO92/02190を参照のこと）。
【００３４】
キメラ免疫グロブリン遺伝子の構成へのIg cDNA の使用は、当業界において知られている（Liu など. (1987) P.N.A.S. 84 : 3439及び（1987）J. Immunol. 159 : 3521) 。それらの技法においては、mRNAが抗体を生成するハイブリドーマ又は他の細胞から単離され、そしてcDNAを生成するために使用される。注目のcDNAは、特異的プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅され得る（アメリカ特許第 4,683,195号及び第 4,683,202号）。
【００３５】
他方では、ライブラリーが製造され、そして注目配列を単離するためにスクリーンされ得る。次に、抗体の可変領域をコードするDNA 配列が、ヒト不変領域配列に融合される。ヒト不変領域遺伝子の配列は、Kabatなど. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H.公開番号91−3242に見出され得る。ヒトＣ領域遺伝子は、既知のクローンから容易に入手できる。次に、ヒト化されたキメラ抗体が従来の方法により発現され得る。
【００３６】
抗体フラグメント、たとえばFv，Ｆ(ab')2及びFab フラグメントは、たとえばプロテアーゼ又は化学的分解により注目抗体の切断により調製され得る。あるいは、切断された遺伝が設計され得る。たとえば、Ｆ(ab')2フラグメントの部分をコードするキメラ遺伝子は、切断された抗体フラグメントを生成するために、Ｈ鎖のCH１ドメイン及びヒンジ領域をコードするDNA 配列、続いて、翻訳停止コドンを含む。
【００３７】
AC133 抗原に対する抗体は、約 120KDの見掛け分子量（市販の標準に基づいて、還元 SDS−PAGEゲルからのウェスターンブロット条件下で）を有し、そして一般的には、約 115〜127KD の範囲であるように見えるタンパク質に結合する。AC133 抗体がツニカマイシン−処理されたWERI−Rb−１細胞から免疫沈殿され得ないので、抗体は糖エピトープを認識すると思われる。AC133 抗原は、CD34+細胞のサブセット上に発現されるが、しかし内皮細胞及び線維芽細胞上には不在である。HLA−DR+，CD90+及び CD117+前駆細胞は、AC133−陽性細胞の集団に包含される（CD90+としてこれまで知られている抗原は現在、CD90+として知られており；DR陽性及び陰性、並びにCD38陽性及び陰性細胞はこの集団に包含される）。この集団は、造血細胞のCD34+サブセットに存在する実質的にすべての造血幹活性を含む。
【００３８】
AC133 抗原に特異的に結合する試薬は、抗体に制限されない。１つの種の他の種への結合を検出する当業界において知られている多くの方法のいづれかが、AC133 抗原−結合試薬の存在についてアッセイするために使用され得る。１つの普遍的に適合できるアッセイは、放射性ラベルされた試験化合物、及び固相に結合されるAC133抗原を用いて検出され得る、溶解相と固相との間の放射能の分布を包含する。AC133 抗原は、たとえばカラムにおける固相に結合され得、そして生理学的緩衝液におけるチタン−又は１４Ｃ−ラベルされた試験化合物がそのカラムに通され得る。
【００３９】
結合された放射能は、カラム上で直接的に、又は適用された放射能から、カラムを通して通過する溶解相における放射能を引き算することにより検出され得る。結合親和性は、結合のために十分な時間、平衡化を可能にした後、試験化合物の種々の濃度での結合された放射能のレベルを測定することによって検出され得る。AC133 に対する結合の特異性は、AC133 に結合する試験化合物が成熟血液細胞上に存在する抗原（又は予備選択されたアッセイ媒体における興味ある他の抗原）にまた結合するかどうかを決定することによって検出され得る。
【００４０】
特に好ましいリガンドは、成熟血液細胞上に存在するいづれかの抗原と10％以下、好ましくは５％以下の交差反応性をもって、AC133 に対して選択的であるものである。交差反応性は、いづれかの標準技法により測定され得、そして好ましくは、純粋なAC133 抗原、試験されるべきリガンド、及び予測される交差反応性抗原間での競争結合アッセイにより、一定濃度のAC133 抗原及び試験リガンド（ここで、リガンドの半分がAC133 に対する結合を飽和する）を用いて測定される。最とも好ましくは、交差反応性は、抗体が50ng/100μｌの濃度で存在する場合、その半分がモノクローナル抗体を飽和するAC133 抗原の一定濃度で測定される。
【００４１】
AC133 に特異的に結合する試薬が同定されると、その試薬（放射能ラベルされた形での、もう１つのラベルを含むように変性された非放射能形での、又はラベルされていない形での一定の使用での）は、AC133 への試薬の結合を要する種々のアッセイ又は生物学的使用、たとえば螢光染色、細胞分離、又は細胞識別に、インビボ及びインビトロで使用され得る。たとえば、AC133 に対する抗体による免疫選択は、造血前駆細胞及び造血幹細胞を精製する手段を提供する。抗体はまた、造血細胞を検出し又は数えるために診断に、CD34陽性集団を機能的に異るサブ集団に分割することに、前駆細胞の単離に、及び成熟血液細胞を生成する前駆体の調製にも使用される。生物学的サンプル（たとえば、血液又はその誘導体、生検、及び滑液）は、対象抗体により結合される表面分子を発現する細胞の存在についてアッセイされ得る。たとえば、アッセイは、細胞溶解物、損なわれていない細胞、又は凍結物に対して、異なった細胞型を区別するために実施され得る。
【００４２】
AC133 に特異的に結合する対象の抗体及び他の試薬は、実質的に純粋なヒト造血前駆細胞及び造血幹細胞の調製のために有用である。前駆細胞のサブセットがAC133 結合に基づいて他の造血細胞から分離され得、そして当業界において知られている他の表面マーカーに結合することによって、さらに相互に分離され得る。造血細胞源は、胎児又は成人骨髄；胎児肝臓；臍帯血；及び末梢血液、特にサイトカインで可動化された末梢血液を包含する（たとえば、Camposなど. (1993) Leukemia 7 : 1409-15 及びGrigg など. (1993) Bone Marrow Transplant ”，Suppl 2 : 23-9を参照のこと）。
【００４３】
ヒト幹細胞は、表現型CD34bright； HLA−DR+；CD38dim/negative；CD117(ｃ−kit)dim；CD90 (Thy-1)+を有し、そして種々の系統特異的マーカー、たとえばCD３，CD４，CD７，CD８，CD14，CD15及びCD19の発現を欠いていることが報告されている。Negativeの表示は、染色のレベルがイソタイプ−適合の陰性対照の明るさで又はそれ以下で存在することを示す。dim の表示は、染色のレベルが陰性染色のレベル近くで存在するが、しかしまた、イソタイプ適合の対照よりも明るいことを示す。
【００４４】
分離のための方法は、抗体被覆された磁気ビーズを用いての磁気分離、及び固体マトリックス（たとえば相）に結合される抗体を用いてのアフィニティークロマトグラフィー又は“パンニング”を包含する。正確な分離を提供する技法は、種々の程度の洗練性を有する、たとえば複数のカラーチャンネル、低角度及び鈍感な光分散検出チャンネル、又はインピーダンスチャンネルを有する螢光活性化された細胞ソーターを包含する。死亡細胞は、死亡細胞に関連する色素（たとえばヨウ化プロピジウム、LDS)による選択により排除され得る。赤血球細胞は、傾瀉、溶血又はFicoll−Paque グラジエントにより除去され得る。選択された細胞の生存性に対して過度に有害でないいづれかの技法が使用され得る。
【００４５】
便利には、抗体は、多くの異なった目的のために次のラベルにより接合され得る：たとえば特定の細胞型の分離を容易にする磁気ビーズ；アビジン又はストレプタビジンに対して高い親和性で結合するビオチン；螢光活性化された細胞ソーターにより使用され得る螢光色素；ハプテン；及び同様のもの。多色分析がFACSと共に又は免疫磁気分離及び流動細胞計測を組合して使用され得る。多色分析は、次の複数の表面抗原に基づいての細胞の分離のために興味あるものである：たとえば AC133+，CD90+又は CD117+， AC113-、又はCD34+。多色分析に使用される螢光色素は、フィコビリタンパク質、例えばフィコエリトリン及びアロフィコシアニン；フルオレセイン；及びテキサスレッドを包含する。
【００４６】
本発明の１つの態様においては、抗−AC133 抗体は、磁気試薬、たとえば超常磁性微小粒子（微小粒子）に直接的に又は間接的に接合される。磁気粒子への直接的な接合は、当業界において知られているような種々の化学的結合基の使用により達成される。たとえば、抗体は、側鎖アミノ又はスルフヒドリル基及び異種機能性架橋試薬を通して微小粒子に結合され得る。多数の異種機能化合物が存在物に対して結合するために利用できる。抗体上の反応性スルフヒドリル基及び磁気ビーズ上の反応性アミノ基との好ましい結合基は、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（SPDP) 又は４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（SMCC) である。
【００４７】
他方では、抗−AC133 抗体は、磁気粒子に間接的に結合される。その抗体はハプテンに直接的に結合され、そしてハプテン特異的な第２段階の抗体がその粒子に結合される。適切なハプテンは、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、FITC、ジニトロフェニル、ニトロフェニル、アビジン、及びビオチンを包含する。タンパク質へのハプテンの結合のための方法は当業界において知られており、そしてそのような結合のためのキットは市販されている。
幹細胞又は前駆細胞の分離又は同定のためには、抗体が造血細胞サンプルに添加される。特定の細胞サブセットを結合するのに必要な抗−AC133 抗体は、試験分離及び分析を行なうことによって実験的に決定される。細胞及び抗−AC133 Abは、複合体が形成されるのに十分な時間、通常少なくとも約５分、より通常には少なくとも約10分、及び通常には、１時間以下、より通常には約30分以下の時間インキュベートされる。
【００４８】
さらに、細胞は、造血前駆細胞又は造血幹細胞上に存在するか又は不在であることが知られている細胞表面マーカーに対して特異的な抗体又は結合分子と共にインキュベートされ得る。たとえば、CD90，CD117 及び HLA−DRは、幹細胞の陽性選択において有用である。幹細胞上に不在であることが知られている種々のマーカー、たとえばCD３，CD４，CD８，CD14，CD15及びCD19は、陰性選択のために使用され得る。ラベルされた細胞は、特異的抗体調製法に従って分離される。螢光色素−ラベルされた抗体はFACS分離のために、そして磁気粒子は免疫磁気選択又は特に高いグラジエントの磁気選択（HGMS) のために有用である。典型的な磁気分離装置は、WO90/07380, PCT/US96/00953及びEP 438,520（それらは引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。
【００４９】
精製された細胞集団は、いづれか適切な培地に集められ得る。種々の培地；たとえばダルベッコの改変イーグル培地（DMEM) 、ハンクスの基本塩溶液（HBSS) 、ダルベッコのリン酸緩衝溶液（DPBS）、RPMI, Isove の変性ダルベッコ培地（IMDM）、及び５mMのEDTAを含むリン酸緩衝液（それらはいづれも、ウシ胎児血清(FCS) 、ウシ血清アルブミン(BSA) 、又はヒト血清アルブミン(HSA) により補充され得る）は、市販されており、そして使用され得る。
【００５０】
ヒト造血前駆細胞及び／又は造血幹細胞のために非常に富化された組成物（細胞源に依存する）は、この態様においては、単一の段階で達成される。所望の細胞は、細胞組成物中に約80％で又はそれ以上で存在し、そして好ましくは、細胞組成物中に約90％で又はそれ以上で存在する。注目の特定集団は、CD34bright及び HLA−DR+/-として特徴づけられる AC133+細胞を含む。この集団はさらに、CD90+，CD117+及び／又はCD38dimであるそれらの細胞のために選択され得る。機能的に、それらの細胞は、 CFU−GM活性のために及び長期のもとの集団にもどった細胞について高く富化される。興味あるもう１つの集団は、 BFU−Ｅ活性について富化された CD133-及びCD34+である。AC133 がより制限された細胞集団により発現されるので、精製への対象の抗体の使用はCD34の使用に比べて好都合であり、それにより、注目の特定の活性のためにより富化されたサブセットを可能にする。
【００５１】
所望の細胞が単離されるとすぐに、それらは、基質細胞からのならし培地において増殖し、そのような基質細胞と共に同時培養し、又はそのような前駆細胞の増殖を支持する維持因子、たとえば幹細胞因子又はインターロイキンの組合せを含んで成る培地において増殖することによって成長せしめられ得る。細胞を培養するために使用される培地は、便利には、定義された富化培地、たとえばIMDM、又はIMDMとRPMI1640との混合物であり、そして一般的には、塩、アミノ酸、ビタミン、５×10-5Mのβ−メルカプトエタノール、ストレプトマイシン／ペニシリン及び10％ウシ胎児血清から構成され、そして時間から時間に、一般的には週当たり少なくとも１〜２度、変えられ得る。
【００５２】
対象の細胞組成物は種々の手段で使用される。それらは、照射された宿主及び／又は化学療法下にある宿主を再構成するために使用され得る。特定の異なった成長因子を通して１又は複数の選択された系統への成熟、増殖及び分化を付与することによって、前駆細胞は委託された系統に付された(committed) 細胞源として使用され得る。エリトロポエチン、コロニー刺激因子（たとえば、GM−CSF ，Ｇ−CSF 、又はＭ−CSF)、インターロイキン（たとえば、IL−１，−２，−３，−４，−５，−６，−７，−８，−９、又は−10）、又は同様のもののような因子又は基質細胞が、前駆細胞の増殖及び分化に影響を及ぼすために使用され得る。
【００５３】
前記細胞はまた、造血細胞の分化及び成熟に関与する因子、たとえばAC133 抗原に特異的に結合する試薬の単離及び評価にも使用され得る。従って、前記細胞は、培地、たとえばならし培地の活性を測定するために；成長因子活性又は関与について流体を評価するために；又は同様のことを行なうためにアッセイにおいて使用され得る。
【００５４】
前記細胞は、遺伝的疾病の治療のために使用され得る。造血細胞に関連する遺伝的疾病は、遺伝的欠損を補正し、又は疾病、たとえばHIV に対しての保護のために治療するために自己由来の又は同種異系の幹細胞の遺伝的修飾により治療され得る。たとえば、疾病、たとえばβ−サラセミア、鎌状赤血球血症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、組換え酵素(recombinase) 欠損症、又は組換え酵素調節遺伝子欠損症は、相同又はランダム組換えのいづれかにより、対象細胞中への野生型遺伝子の導入により補正され得る。他方では、正常な同種異系前駆細胞が移植され得る。造血細胞に関連する疾病以外の疾病もまた、その疾病が特定の分泌される生成物、たとえばホルモン、酵素、インターフェロン、因子又は同様のものの欠乏に関係している場合、治療され得る。
【００５５】
前記細胞は液体窒素温度で凍結され、そしてそれらが融解され、そして再使用されるように、長期間、貯蔵され得る。細胞は通常、５％ DMSO 及び95％ウシ血清アルブミンにおいて貯蔵されるであろう。融解されるとすぐに、細胞は幹細胞増殖及び分化に関連する成長因子又は基質細胞の使用により拡張され得る。
【００５６】
AC133 抗原は、天然源から又は組換え技法により実質的に純粋な形で得られる。天然源からは、抗原陽性細胞が溶解され、そして抗−AC133 モノクローナル抗体のアフィニティーカラムに通される。造血前駆細胞が、従来の分離技法により天然源から単離され得、又は実験セクションに記載される細胞系が抗原源として使用され得る。アフィニティー精製されたタンパク質は、適切な塩溶液、又は通常、低い酸濃度、たとえば 0.1〜１％のトリフルオロ酢酸の存在下で、水性／有機グラジエント、たとえばアセトニトリル又はエタノールにより、アフィニティーカラムから溶離される。次に、その溶離されたタンパク質は、従来の技法に従って、クロマトグラフィー、電気泳動、又は同様のものによりさらに精製される。
【００５７】
下記例は、95％以上の純度のAC133 抗原をもたらすアフィニティークロマトグラフィーによりAC133 抗原を精製するためへのモノクローナル抗体の使用を記載する。そのような精製された調製物中のペプチドが配列分析のために調製され、そして単離され、その結果として、核酸プローブがAC133 遺伝子配列の単離のために企画され得る。本明細書に示されるAC133 の遺伝子配列（図12）は、組換え技法による抗原の獲得を可能にする。たとえば、全RNA が、標的化されたタンパク質を発現するよう抗体結合により示された細胞から単離される。残留DNA は、従来の技法に従って除去され、そしてポリアデニル化されたRNA は、たとえばオリゴ−dTセファロース上で又はゲルクロマトグラフィーによりさらに精製され得る。次に、cDNAが、逆転写酵素を用いて従来の技法に従って調製される（Sambrookなど.,前記及び下記例を参照のこと）。
【００５８】
次に、前記cDNAが、cDNAが発現される適切なクローニングシステム、たとえばλgtll中に導入される。次に、ファージプラークが、対象の抗体を用いて、又はポリクローナル抗血清を用いることによってスクリーンされ得る。他方では、AC133 抗原タンパク質配列に由来する核酸配列によるプローブを可能にするクローニングシステムが使用され得る。次に、そのcDNA挿入物は、所望により、他のベクター中にサブクローン化される。cDNAは、完全な転写体のためのcDNAライブラリーのさらなるプロービングのために使用され得る。他方では、そのcDNA配列は、対象のタンパク質をコードするゲノム遺伝子を同定するためのゲノムライブラリーをプローブするために使用され得る（たとえば、Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, CSHL, Cold Spring Harbor, NY,1989を参照のこと）。
【００５９】
本発明のDNA は、AC133 タンパク質又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列、及び前記遺伝子によりコードされるタンパク質の発現の調節に関与する隣接する５’及び３’非コードヌクレオチド配列を包含し、そして成熟mRNA又はゲノムDNA の長さをほぼ含むであろう。従って、本発明は、単離された核酸分子を供給し、ここで前記分子は、
（１）図１に示されるようなAC133 のためのアミノ酸コード領域を有する第１配列（配列番号１）；
（２）前記第１配列のサブ配列であり、そして少なくとも14個、好ましくは少なくとも17又は20個、より好ましくは少なくとも25個の長さのヌクレオチドである第２配列；
（３）前記第１又は第２配列の少なくとも１つのヌクレオチドが異なったヌクレオチドにより置換されている第３配列；又は
（４）前記第１、第２又は第３配列のいづれかに対して相補的な第４配列を含んで成り、但し、
【００６０】
（ｉ）前記分子がRNA 分子である場合、Ｕが前記分子中の前記配列においてＴを置換し、
（ii）前記第３配列が前記第１又は第２配列に対して少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％同一であり、そして
（iii ）前記第２配列が、配列番号１のヌクレオチド 347−667 ，1564−1696又は2110−2386でない。
【００６１】
また、本発明のDNA として、イントロンを包含するその対応するゲノム配列が包含される。それらの非コード配列は、ターミネーター及びポリアデニル化配列、調節タンパク質結合配列、転写配列、及び同様の配列を包含する。十分な長さのAC133cDNA配列を含む分子は、結果物の源として、又はAC133 分子自体の調製のための出発材料として有用である。
【００６２】
“サブ配列（subsequence)”とはcDNA配列からの連続するヌクレオチドのグループである。それらの配列のいづれかが、AC133 遺伝子の存在（又は不在）、又はAC133 抗原をコードするmRNAの発現の同定に使用され得る。そのようなサブ配列は、出発ヌクレオチドからの化学的合成（自動遺伝子合成機におけるように）により、又は十分な長さの配列の生化学的操作（たとえば、フラグメントを調製するために制限エンドヌクレアーゼを用いて、任意には、続いて、（１）末端ヌクレオチドの切断及びエキソヌクレアーゼ及び／又は（２）所望する配列を選択するためにサイズソーティング及び／又は親和性捕獲による）により調製され得る。
【００６３】
使用される条件下で存在する他の核酸間でユニークである十分な長さの配列番号１に記載されるAC133 配列のいづれかのサブ配列は、ゲノムAC133 遺伝子のすべて又は一部のポリメラーゼ鎖反応(PCR) 増幅に使用される２つのプライマーの１つとして有用である。所望の標的配列とユニークにハイブリダイズするのに必要なサブ配列の長さは、使用される特定の方法により変化し、そしてその長さの選択は遺伝子材料の日常の同定を行なう当業者の範囲内である。好ましいサブ配列は、少なくとも15の長さのnt、より好ましくは少なくとも18のnt、さらにより好ましくは少なくとも19, 20, 21, 25又は30の長さのntから、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の全長さまで、好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブとして使用される場合、200nt 以下の長さ、又はPCR プライマーとして使用される場合、50nt以下の長さである。
【００６４】
配列番号１のコード領域内の３個のサブ配列は、機能未知のEST's としてGenbank にこれまで記録されている。従って、それらのGenbank サブ配列、すなわちヌクレオチド 347−667 ，1564−1696及び2010−2386は、本発明のサブ配列としては請求されていない。さらに、配列番号１の３’非翻訳領域からの、又は機能未知の、特にヌクレオチド2684−3332及び3408−3804の領域における多くのESTがGenbank に存在する。それらの２つの領域からのサブ配列は、本発明の一部として請求されていない。Genbank 配列の１又は複数の配列を含む、配列番号１として示される完全な配列の長い方のサブ配列、及び１又は複数のGenbank 配列の一部を含むが、しかし配列番号１に示される新しく同定されたヌクレオチドをも含むサブ配列は、本発明の一部として見なされる。
【００６５】
本発明の核酸組成物は、対象タンパク質のすべて又は一部をコードするゲノム又はcDNA配列であり得る。従来の方法に従って、たとえば制限酵素消化又はPCR 増幅によりオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによって、cDNA又はゲノム配列のフラグメントが得られる。多くの場合、フラグメントは、少なくとも12個のnt、より通常には少なくとも18個のnt、又は上記の他の長さの１つのものであろう。好ましいフラグメントは、機能的エピトープを含むであろう。機能的エピトープを供給する配列は、前記配列の発現、及び従来のイムノアッセイによる特異的抗体とのその発現生成物の反応性についてのアッセイにより決定され得る。
【００６６】
本発明の典型的なアミノ酸及びDNA 配列は、下記配列番号１及び２に示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸についての標準の略語が本明細書において使用される。天然のAC133 抗原に由来するポリペプチドは本発明の特に好ましい態様であるが、しかしそれらのポリペプチドの特定の配列に基づく変動もまた、本発明の一部である。
【００６７】
その広い観点においては、本発明は（それはポリペプチド自体に関係する場合）、
（１）配列番号２に示されるAC133 の第１アミノ酸配列；
（２）第１配列のサブ配列であり、そして少なくとも６個、好ましくは８個、より好ましくは10個の長さのアミノ酸である第２アミノ酸配列；又は
（３）前記第１又は第２配列中の少なくとも１つのアミノ酸が異なったアミノ酸により置換されている第３配列から成る群から選択されたいづれかのポリペプチドを包含し、但し、ここで前記アミノ酸置換は他の残基と１つの酸性残基との、他の残基と１つの塩基性残基との、他の残基と１つの非極性残基との、他の残基と１つの荷電されていない極性残基との、又は他の残基との１つの芳香族残基との置換であり、そして前記第３配列は、前記第１又は第２配列に対して少なくとも90％、好ましくは95％の同一性を有する。
【００６８】
２種のアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的な又は完全な同一性が存在する場合、相同である。たとえば、85％の相同性とは、それらの２種の配列が最大の適合性をもって一直線に並べられる場合にアミノ酸の85％が同一であることを意味する。ギャップ（適合される２種の配列のいづれかにおける）は、最大の適合性で可能にされる。５又はそれ以下のギャップが好ましく、そして２又はそれ以下のギャップがより好ましい。
【００６９】
あるいは、そして好ましくは、２種のタンパク質配列（又は少なくとも30個の長さのアミノ酸の配列に由来するポリペプチド配列）は、それらが、突然変異データマトリックスと共に整列プログラムを用いての５以上（標準偏差単位において）の一列整列評点（alignment score)、及び６又はそれ以上のギャップペナルティ(gap penalty) を有する場合、相同である（Duyhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, 1972, vol. 5, National Biomedical Rosearch Foundation, pp.101-110 、及び補足２，pp.1-10)。それらの２種の配列又はその一部は、より好ましくは、それらのアミノ酸が、整列プログラムを用いて最適に一列整列される場合、50％以上の又は50％の同一性を有する場合、相同である。
【００７０】
配列番号２に示される天然のアミノ酸配列からのマイナーなアミノ酸の変動は予期され；特に保存性アミノ酸置換が予期される。ある種類のアミノ酸内で生じるそれらのアミノ酸の保存性置換は、それらの側鎖に関連している。遺伝子的にコードされたアミノ酸は一般的に、次の４種の種類に分けられる：（１）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性：リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）荷電されていない極性：グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは時々、芳香族アミノ酸として分類される。
【００７１】
たとえば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるトレオニンの単離された置換、又は構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の類似する置換は、特にその置換が、AC133 又はその誘導体とAC133に対して特異的に結合する試薬との相互作用に関連する結合部位としてアミノ酸を含まない場合、得られる分子の結合特性に対して主要な効果を有さないであろうことを予測することが道理に合っている。アミノ酸の変化が機能的ペプチドに影響をもたらすかどうかは、そのペプチド誘導体の特異的結合性質をアッセイすることによって容易に決定され得る。
【００７２】
図13に示されるように、AC133 のペプチド構造体に異なる機能を有する多くの領域が存在する。それらの領域は、細胞外Ｎ−末端、第１トランスメンブラン領域、第１細胞質ループ、第２トランスメンブラン領域、第１細胞外ループ、第３トランスメンブラン領域、第２細胞質ループ、第４トランスメンブラン領域、第２細胞外ループ、第５トランスメンブラン及び細胞質Ｃ−末端として（アミノ末端により開始して）記載され得る。前記領域のおおよそのサイズが図13に示されており、そして異なる領域に存在するアミノ酸の最良の見積りは次の通りである：細胞外Ｎ−末端、aa 20-107 ; 第１トランスメンブラン領域、aa 107-126；第１細胞質ループ、aa 127-157；第２トランスメンブラン領域、aa 158-179；第１細胞外ループ、aa 180-435；第３トランスメンブラン領域、aa 436-454；第２細胞質ループ、aa 455-480；第４トランスメンブラン領域、aa 481-503；第２細胞外ループ、aa 504-792；第５トランスメンブラン、aa 793-816；及び細胞質Ｃ−末端、aa 817-865。コードされたペプチドのアミノ末端で切断可能なシグナル配列（aa 1-19)が存在するように思え、この配列は、図13に示される領域の一部としては含まれないが、しかし合成的に生成されたAC133 ペプチドに存在するであろう。
【００７３】
また、AC133 抗原及びグリコシル化部位（結合の点で“Ｙ”により示される）の構造を確かめるために同定された短いペプチドセグメント（Ｐ１−Ｐ４）のおおよその位置が図13に示される。図12はまた、グリコシル化部位（アミノ酸配列がボックスで囲まれている）及びトランスメンブラン領域（下線が引かれている）を示す。２つのグリコシル化部位はオーバーラップ（NNTS、オーバーラップするNNT 及びNTS から成る）し、そして点線により大きなボックスで示されており、これは個々のコンセンサスグリコシル化部位を示す。
【００７４】
DNA 配列は、実質的な純度で得られ、そして損なわれていない染色体の配列以外の単離された分子として得られる。通常、DNA は他の核酸化合物を実質的に含まないで得られ、一般的には、少なくとも約50％、通常少なくとも約90％の純度であり、そして典型的には、“組換え”であり、すなわち天然の染色体上で通常関連しない１又は複数のヌクレオチドを両端に有する。
【００７５】
DNA 配列は種々の手段で使用される。それらは同じか又は他の種における関連する表面タンパク質を同定するためのプローブとして使用され得る。DNA はまた、対象の遺伝子を発現する細胞又は器官を同定するためにも使用され得る。特定のヌクレオチド配列、特にDNA, mRNA 又はcDNAの存在について細胞をプローブする技法は、文献において十分に確立されており、そして本明細書においては詳しく記載する必要はない。便利には、mRNAはDNA を有さないで単離され得、そして逆転写酵素及び特定のプライマーによるPCR を用いることによって、興味ある対象のDNA が拡張され、ゲル電気泳動上で分離され、そして次に、サザンブロット又は配列決定を用いてプローブされ得る。他の技法もまた、使用され得る。
【００７６】
相同配列は、本発明内に含まれるAC133 抗原配列に対して実質的な配列類似性を有するものであり、すなわち対象のDNA 配列のヌクレオチド配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する。配列類似体は、大きな配列のサブセットである対照配列、たとえば保存されたモチーフ、コード領域又はフランキング領域に基づいて計算される。対照配列は通常、少なくとも約18個の長さのnt、より通常には少なくとも約30個の長さのntであり、そして比較される完全な配列に延長することができる。そのような相同核酸配列は、低い緊縮条件下で、たとえば50℃及び10×SSC (0.9ＭのNaCl／0.09Ｍのクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションにより検出され、そして１×SSC による55℃での洗浄にゆだねられる場合、結合されたまま存続する。
【００７７】
発現のためには、DNA 配列が適切な発現ベクター中に挿入され、ここで生来の転写開始領域又は外来性転写開始領域が使用され得る。プロモーターは、インビトロ組換え法により、又は染色体中への配列の相同組込みの結果として導入され得る。広範囲の種類の転写開始領域が広範囲の種類の発現宿主のために知られており、ここで発現宿主は、原核生物又は真核生物、特にＥ．コリ（E. coli)、Ｂ．サブチリス（B. subtilis)、哺乳類細胞、たとえばCHO 細胞、サル腎細胞、リンパ球、特にヒト細胞系、及び同様のものを包含する。
【００７８】
一般的に、発現宿主において作動する選択マーカーが存在するであろう。プロモーター、翻訳可能なmRNA転写体を生成するために、興味ある遺伝子のコード配列に操作可能的に連結され得る。発現ベクターは、異種タンパク質をコードする核酸配列を挿入するためにプロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を有する。適切な発現ベクターにおけるプロモーターは、構成的又は誘導的のいづれかであり得る。外来性融合タンパク質が追加の機能性、たとえば高められたタンパク質合成、安定性、定義された抗血清との反応性、又は酵素マーカー、たとえばβ−ガラクトシダーゼを供給する、融合タンパク質の生成のためのプロモーターが特に興味あるものである。
【００７９】
内因性又は外因性エンハンサー配列を包含するエンハンサー配列を有するか又はそれを有さない、構成的又は誘導的であり得る転写開始領域、AC133 遺伝子又はそのフラグメント、及びポリＡ配列の結合のためのシグナルを操作可能的に有する転写終結領域を含んで成る発現カセットが調製され得る。遺伝子は、生来のイントロンを包含するゲノム、又はcDNA遺伝子、又はその一部であり得る。機能的エピトープの発現を可能にする配列、通常少なくとも約24個の長さのヌクレオチド、より通常には少なくとも約48個の長さのヌクレオチド、及び前記遺伝子中の完全な読取り枠までの配列の使用が特に興味あるものである。
【００８０】
DNA の導入の後、前記構造物を含む細胞が選択マーカーにより選択され、前記細胞が拡張され、そして次に、発現のために使用され得る。分泌が所望される場合、シグナルペプチドが、対象のタンパク質をコードする配列又はそのフラグメントに連結され、それにより、前記タンパク質が発現され、細胞膜を通してトランスロケートされ、そしてシグナルペプチドを除くために加工される。
【００８１】
発現カセットは種々のベクター中に導入され得、ここで前記ベクターは通常、発現ベクターを含んで成る細胞の選択を付与する能力により特徴づけられるであろう。ベクターは、特に、真核細胞における細菌又はウィルス中のプラスミドとして、染色体外維持を、又は特に哺乳類細胞における組込みを提供することができる。染色体外維持が所望される場合、元の配列は、低い−又は高い−コピーのプラスミドであり得るプラスミドの複製を提供するであろう。広範囲の種類のマーカー、特に毒素に対して、より特定には抗体に対して保護するマーカーが、選択のために利用できる。選択される特定のマーカーは、宿主の性質に従って選択され、ここで多くの場合、相補性が栄養要求宿主、たとえば酵母により使用され得る。DNA 構造体の導入は、いづれか便利な手段、たとえばカルシウム−沈殿されたDNA 、エレクトロポレーション、融合；トランスフェクション、又はウィルスベクターによる感染によるものであり得る。
【実施例】
【００８２】
次の例は、例示的であって、本発明を限定するものではない。
例
体側性免疫化 (Contralateral Immunization) によりAC133 モノクローナル抗体の合成
５匹のNew Zealand Black (NZB) マウスを、フィトヘマグルチニン（植物凝集素)(PHA)  (Gibco/BRL) によりプレインキュベートされた、精製されたCD34陽性ヒト前駆細胞により、足肉趾経路を通して、20日間にわたって合計７回、接種した。
【００８３】
マウスを、多くの免疫優性ではあるが無関係の抗原を発現する細胞により、左脚の肉趾に３日目に予備免疫化した。この場合、末梢血液単核細胞（PBMC) を、それらが多くの抗原、たとえばクラスIHLA 抗原、 HLA−DR，CD15，CD26, CD29, CD31，CD36, CD44, CD45，CD58、等（また、造血幹細胞上に発現される）を発現するように、無関係の細胞として使用した。０日目、PBMCを、左脚肉趾中に再注射し、そして精製された幹細胞を右脚肉趾中に注射した。PBMC及び精製された幹細胞を、PHA と共に10分間、プレインキュベートし、そして注射の前、PBS により洗浄した。前駆細胞を、免疫磁気ビーズを用いて、サイトカイン可動化されたドナーの白血球搬出パックから単離した。この処置は、非特異的アジュバント効果を付与し、そして必要なアジュバント、たとえばフロイントアジュバントを不必要にする。マウスに、３日間隔で合計５〜８回、そのような注射を行なう。
【００８４】
最後の注射の後の１日目、すなわち21日目、マウス右手膝窩リンパ節を除去した。リンパ球懸濁液を調製し、そして細胞を、Kohler and Milstein (1975) Nature 256 : 495-497 により始めに記載された方法の変法を用いて、SP２／OAg14 骨髄腫細胞に融合せしめた。細胞を、10−４Ｍのヒポキサンチン及び２μｇ／mlのアザセリンと共に、DMEM及び20％ウシ胎児血清を含む96ウェルプレート上にプレートした（Buckなど. (1984) Monoclonal Antiboudies and Functional Cell Lines, Kennet など. eds., Planum Press, New York pp.275-309)。10日目、確認できるハイブリドーマコロニーが明白であった。ハイブリドーマを含むウェルからの上清液（ｓ／ｎ）を、２色流動細胞計測アッセイを用いて、15％までのCD34＋  細胞を含む胎児細胞調製物に対する結合についてスクリーンした。
【００８５】
試験細胞へのマウスIgを含むｓ／ｎの結合性を、フィコエリトリンに接合されるラット抗−マウス−Ig（IgPE) により追跡し、そして既知のマウス抗−CD34抗体(AC101) 接合体により対比染色した。図１は、AC133 上清液を用いてのこの２色FACS分析からの結果を示す。AC133 は、胎児肝臓調製物において明るいCD34陽性細胞のみを染色することが示される。AC133 ハイブリドーマ細胞は、IgG1／カッパ抗体を分泌することが示された。前記細胞を培養において拡張し、そしてストックを液体窒素により凍結した。AC133 細胞を制限希釈分析によりサブクローン化し、そして一連の陽性分泌サブクローンをまた、液体窒素により凍結した。
【００８６】
抗体の精製及び接合
AC133 細胞を、ヌードマウスにおいて腹水腫瘍として最初に増殖せしめ、そして抗体に富む腹水を集めた。つい最近、AC133 細胞は、中空繊維培養装置（Cellmax QUAD artificial copillary system, Cellco Inc., Germantown, MD)において、非常に高い密度に増殖されている。純粋なIgG 抗体を、中空繊維培養物又は腹水からプロテインＡクロマトグラフィーにより調製した。純粋な抗体を0.01％アジ化ナトリウムを含む0.01Ｍのリン酸緩衝溶液(PBS) に４℃で貯蔵した。この純粋な抗体ストックを用いて、フルオレセインイソチオシアネート（FI TC) (Wofsy など. (1980) Selected Methods in Cellular Immunology, Mishelland Shiigi eds., W.H. Freeman and Co., San Francisco. pp.294-295)、フィコクリトリン（PE) (Hardy (1986) Handbook of Experimental Immunology, Weir など., eds. Blackwell Scientific Press, Oxford. p.31) 、又は磁気ビーズ接合体を、標準方法に従って調製した。
【００８７】
正常組織及び細胞系でのAC133 発現
標準的FACS染色法を用いては、末梢血液単核細胞、顆粒球又は血小板、又はヒト臍帯静脈内皮細胞に、AC133 抗体により検出できる染色は存在しなかった。FACS分析によるヒト細胞系のパネルの試験（データは表１に示される）は、試験された３種のみの細胞系、すなわち網膜芽腫細胞系Ｙ79.1及びWERI−Rb−１及び奇形癌細胞系NT−２が検出できるレベルのAC133 抗原を発現することを示した。
【００８８】
【表１】
2006246898.tif 000002
【００８９】
PMA によるＹ79.1細胞の活性化は、AC133 抗原の発現を高めることが見出された（図２に示される）。しかしながら、いくつかの他の細胞系のPMA 活性化、又はヒトPBMCのPHA 活性化は、AC133 抗原の発現を誘発できなかった（データは表２に示される）。AC133 抗原の発現は、試験されたCD34＋  細胞系上では検出できなかった。Ｙ79.1細胞系上でのCD34発現の欠失（図３に示される）と共に、この発見は、AC133 がCD34抗原に向けられる可能性を除外する。AC133抗原の発現は、内皮及び線維芽細胞上でまた発現されるCD34抗原とは異なって、初期幹及び前駆細胞に制限される（Krauseなど. (1996) Blood 87 : 1-13) 。
【００９０】
AC133 抗原は、胎児及び成人骨髄、胎児肝臓、臍帯血、白血球搬出（LP）パック、及びサイトカイン移動された血液からのLPパックから単離されたヒト前駆細胞系のCD34ｂｒｉｇｈｔ集団上で発現される。典型的には、それはそれらの集団におけるすべてのCD34＋  細胞の30〜50％を染色する。
【００９１】
【表２】
2006246898.tif 000003
【００９２】
AC133 陽性細胞の表現型決定
AC133 及びCD34二重陽性細胞の表現型決定を、前駆細胞上に発現することが知られている細胞表面構造体に向けられる接合された抗体のパネルを用いる２及び３色FACS分析を用いて行なった。胎児肝臓、胎児及び成人骨髄、臍帯血及び末梢血液を用いて、AC133 陽性細胞の正確な表現型を決定した。それらの組織のすべてに見出されるAC133 細胞は、CD34bright，CD38-/+、及び HLA−DR-/+である。データは図４に示される。CD90(Thy1)+及びCD117(ｃ−kit)+幹細胞は、図５に示されるようにAC133 陽性集団に包含される。
【００９３】
AC133 免疫磁気精製胎児肝臓細胞により行なわれた一連の実験においては、CD38−FITC接合抗体は、AC133 精製細胞の74.5％を染色し、そして残りの24.8％はCD38陰性であった。予測されるように、 HLA−DRは細胞の大部分を染色した(81.14％）。CD90は、27.4％を染色することが示され、そしてCD117 は90％を染色した。初期（再集団化する）の造血幹細胞はCD34bright，CD38dim/+， HLA−DR+，CD117dim及びCD90+の表現型を有すると一般的に思われる。従って、AC133 抗体は、ヒト造血前駆細胞の表現型的に重要な集団を認識する。
【００９４】
AC133 抗原の免疫沈殿
免疫沈殿実験は、AC133 抗原が 120KDの分子量を有することを示した。ビオチン（Pierce) ラベルされた、活性化Ｙ79.1及びWeri−RB−１細胞を次の成分を含む溶解緩衝液により溶解した： 2.5％のBrij (Sigma)、25mMのトリス−HCl, pH8.0, 125mM のNaCl, 2.5mM
のEDTA , 2.2μｇ／mlのアプロチニン(Sigma) 及び１mMのPMSF(Sigma) 。前記溶解物をAC133 及び対照抗体と共に、安全性を前もって保証した後にインキュベートした。免疫複合体をスタフィロコーカスアウレウス(Staphylococcus aureus) 細胞(Cal Biochem) に対して集め、そして１％の２−メルカプトエタノールを含む SDS−PAGEサンプル緩衝液において95℃で５分間、加熱した。免疫沈殿物を SDS−PAGEにより分離し、そしてニトロセルロース膜(Novex) に移した。
【００９５】
ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP) (Amersham) 及びSupersignal(Ｌ−HRP 基質システム（Pierce) に対して結合されるストレプタビジンを用いて可視化せしめた。CD49d, CD71 及びCD98を対照として用い、そして 133KD，92KD及び80／40KDのそれらの予測されるバンドをそれらの対応するバンドにおいて観察した。AC133による免疫沈殿は、 120KDの分子量に対応する明確なバンドを示した。このバンドは、抗−CD34、抗体 AC101, HPCA１及びHPCA２により免疫沈殿されたサンプルにおいては不在であり、このことは、CD34がＹ79.1細胞系において発現されないことを示唆する。これはFACSデータと一致する。
【００９６】
さらなる実験からのデータが図６に示されており、ここで、ビオチンによりラベルされたＹ79.1及びKG1a細胞が同じゲル上でCD34及びAC133 沈殿物を比較することによってAC133 分子量データを確めた。この実験においては、CD34及びＹ79.1抗原は、隣接するレーンにおける、ビオチル化されたKG1a（CD34+）及びＹ79.1溶解物から沈殿せしめられた。前記結果は、１）個々の抗体がそれ自体の明確な抗原を沈殿せしめ、２）それらの２種の抗原の分子量が明らかに異なっており、それぞれ110 及び 127KDであることを明白に示す。
【００９７】
対照レーン６及び８においては、HPCA２及び16D11(抗−CD34）は、KG1a溶解物からの 110KDのバンドを沈殿せしめるが、しかしＹ79.1溶解物からのいづれのバンドも沈殿せしめない（レーン７及び９）。AC133 はＹ79.1溶解物からの 120KDタンパク質を沈殿せしめるが（レーン10）、しかしレーン11においてKG1aの溶解物からのいづれも沈殿せしめなかった。レーン12において、KG1a及びＹ79.1溶解物は混合され、そしてAC133 Ag及びCD34は同時沈殿せしめられた。それらの結果は、２種の抗原が異なった分子量のものであることを示す。
【００９８】
AC133 磁気ビーズ接合
精製されたAC133 抗体を、４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（SMCC) についての標準のプロトコールを用いて磁気アミノ−デキストランビーズに接合せしめた。AC133 抗体を、OD450単位当たり５μｇで、SMCC活性化されたビーズに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。反応を、β−メルカプトエタノール及びNEM の添加により停止せしめた。接合体を、磁場の存在下で２つのカラム上で精製し、そして溶離した。濃度をOD450＝10に調整し、そしてOPG を安定化のために添加した。PBS 及び 0.1％アジ化ナトリウムにおける接合体を 0.2μｍのフィルターを通して濾過し、そして４℃で貯蔵した。
【００９９】
AC133 磁気ビーズ接合体によるヒト造血前駆細胞の分離
AC133 直接的磁気ビーズ接合体を調製し、そして淡黄褐色被膜PBMC、胎児肝臓WC１、胎児骨髄及び成人骨髄に対して試験した。図８は、miniMACSを用いてAC133 ビーズ接合体により精製され、そしてグリコホリンＡ−FITC及びHCPA２−PEにより染色された胎児肝臓細胞のFACSドットプロットを示す。出発材料は 7.4％のCD34+細胞を含み、AC133 精製に続いて、90％以上のAC133 精製細胞は明るいCD34+であった。図９は、AC133 磁気接合体が、約26％のCD34+細胞を含む淡黄褐色被膜からのCD34+細胞の富化においても非常に効果的であったことを示す。最終の精製された集団は、HPCA２−PE染色により示されるように、CD34に対して64％の陽性であった。磁気精製システムにおける細胞の分離能力は、AC133 の機能的及び表現型的性質のさらなる研究を可能にする。
【０１００】
AC133 陽性細胞のクローン原性能力
白血球搬出パックから精製された、AC133 磁気ビーズ選択の細胞を、市販のキット（Stem Cell Technologies, Vancouver, B.C.)を用いてクローン原性アッセイにより試験した。組換えヒト成長因子を用いて、調節された成長環境を提供することによって、この培養アッセイは、CD34陽性細胞集団内の主要コロニー形成単位(CFU) を同定する。それは、特定の系統特異的分子に向けられる細胞の相対的百分率に関して、前駆細胞集団の比較に基づく情報を提供する。
【０１０１】
典型的には、末梢血液由来のCD34+細胞集団においては、 BFU−ｅ（バースト形成単位−エリトロイド）及び CFU−GM（コロニー形成単位−顆粒球マクロファージ）が、認識される有力なコロニーであり、３：１の比で存在する。図10は分離白血球搬出パックから得られたAC133 及びCD34精製された細胞を比較する典型的なクローン原性実験からの結果を示す。分別されていない対照細胞により得られたコロニーは典型的には主として BFU−Ｅ(29.34％）であり、そして CFU−GMは少数である（5.14％）。CD34精製された細胞は、23.3％ BFU−Ｅ及び5.58％の CFU−GMの類似する分布を示す。対照的に、AC133 精製された細胞は、13.1％の BFU−Ｅ及び10.2％の CFU−GMの異なったパターンを示す。計算は、58％の CFU−GMがAC133 精製された画分から回収され、そしてわずか13％のBFUEがその画分から回収されたことを示す。
【０１０２】
図11は、AC133 免疫磁気精製に続いて得られた類似するクロン原性アッセイからの結果を示す。この実験においては、AC133 細胞を陽性選択し、そして次に、CD34陽性細胞を、AC133 陰性の流れから陽性選択した。この企画は、 AC133+細胞（同じドナーからのものは除く）とCD34＋  との直接的な比較を示した。それらの結果は、 CFU−GM前駆体の93.8％がAC133 陽性画分に回収され、残りの 6.2％がCD34+／AC133-画分から回収されたことを示した。逆に言えば、CD34+ AC133-画分は BFU−ｅ前駆体の78.0％を含み、そして残りの22.0％が AC133+画分に得られた。
【０１０３】
上記実験結果は、抗−AC133 抗体がFc受容体に対する抗体であり、又は抗−AC133 抗体が、Fc受容体摂取を通して幹細胞に結合する可能性を除外する。さらなる実験は、AC133 抗体染色が遊離PEによる可能性を除外する。AC133 抗体は、RTK 、すなわち受容体チロシンキナーゼ、TIE 、すなわち、免疫グロブリン様ドメイン及び成長因子相同ドメインを含み、そして血管内皮細胞及び造血細胞において発現されるチロシンキナーゼに対する抗体のように挙動しない。AC133 抗体はまた、Ｐ−糖タンパク質、すなわち造血細胞においてまた発現される 170KDの複数薬物耐性生成物に対する抗体のように挙動しない。
【０１０４】
本発明者は、AC133 抗体が、骨髄、胎児肝臓及び末梢血液における明るいCD34+細胞上でのみ発現される抗原を認識することを示した。この抗体及びその抗原は、いづれか既知のCD抗原の分子量又は分布に適合しない。幹細胞は別として、AC133 抗体は、CD34発現のために陰性であるヒト網膜芽腫細胞と反応することが示された。さらに、AC133 抗原は、多くのCD34+細胞系上で発現されない。
【０１０５】
本発明は、初期幹細胞及び造血前駆細胞のサブセット上に見出される新規の抗原、及び前記抗原に対して特異的に結合する抗体を供給することが上記結果から明らかである。抗原の発現は高い組織特異性である。それは造血前駆細胞のサブセット上に単に検出され、そして CFU−GMアッセイにおいて活性的である実質的にすべての細胞上に存在する。AC133 抗原のこの高い特異的な分布は、ヒト造血前駆体及び幹細胞を単離し、そして特徴づけるための試薬として例外的に有用にする。
【０１０６】
C133 抗原の精製及び特徴づけ
AC133 抗原の精製及び特徴づけ、並びにcDNAクローンの単離が本明細書に記載される。この分子のタンパク質及び核酸配列分析は、AC133 抗原が、既知のＧ−タンパク質結合の７種のトランスメンブランメンバーに対して、もし存在したとしても、低い相同性を有する５種のトランスメンブランドメインを有する新しい種類のトランスメンブラン受容体の最初に記載されるメンバーであることを示す。
【０１０７】
抗体AC133 を、上記のようにして調製し、そして精製し、そしてCNBrにより活性化されたセファロースに接合した。CNBr活性化されたセファロースは、Pharmacia (Alameda, CA) から購入し、そしてmAB AC133 親和性樹脂を、25分間のリガンドカップリング反応を用いて、製造業者の方法により調製した。 COS−７及びWERI−Rb−１網膜芽腫細胞系を、American Type Culture Collection (Rockville, MD)から入手した。特注プライマーは、Operon Technologies (Alameda, CA) により合成した。
【０１０８】
AC133 抗原の精製
AC133 抗原を、96時間、PMA により活性化されたＹ79網膜芽腫細胞（例えば、ATCCから市販されている）から単離した。細胞（２×109）を、PBS により洗浄し、そして 0.125 MのNaCl，25mMのトリス、pH８，0.005％のNaN3, 2.5mM のEDTA及び 1.0mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF) 及び１mg当たり４：１のトリプシンインヒビター単位を含むアプロチニンの 2.2mg／ml溶液の１／1000希釈溶液(Sigma) を含む 2.5％の Brij 99／96（２：１）界面活性剤溶液により溶解した。
【０１０９】
細胞を室温で５分間、断続的に回転せしめ、そして次に20分間、氷上に放置した。細胞核及び残骸を、12,000×Ｇで10分間の遠心分離により除去した。溶解物上清液を、洗浄緩衝液(0.125ＭのNaCl，25mMのトリス、pH8.0 ，0.01％のNaN３,2.5mM の EDTA, 0.1％ Brij)により平衡化された 0.5mlのmAb AC133 親和性カラム上への負荷の前、 0.2μＭのフィルターを通して濾過した。カラムを洗浄緩衝液により広範に洗浄し、そして抗原を、50mMのエタノールアミン、pH11.5 , 0.1％のBrij, 0.01％のNaN３溶液に溶離した。
【０１１０】
pHをすぐに、HCl により中性に調節した。洗浄緩衝液により平衡化された 300μｌの層体積のDEAEカラム上への抗原溶離液の通過により、汚染性タンパク質の多くを除去し、そして上記のようなAC133 抗体カラムを用いての第２のアフィニティークロマトグラフィー処理段階は、タンパク質加水分解及びタンパク質配列決定分析に使用できる95％以上の純度のAC133 抗原をもたらした。AC133 抗原の純度及び同一性を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE) 及びウェスターン分析により確かめた (Towbin, H.,T. Staehelin, and J. Gordon (1979) PNAS 76, 4350-4354 ; Towbin, H. and J. Gordon (1984) J. Immunol. Meth. 7 : 313-340) 。
【０１１１】
精製されたAC133 抗原のエンドグリコナーゼ処理
１μｇのAC133 抗原を水50ml及び 0.1Ｍの２−メルカプトエタノール及び 0.5％ SDS溶液 125μｌに再懸濁した。タンパク質を５分間 100℃で変性した。変性された混合物 (35μｌ) を、 0.5Ｍのトリス（pH８）25μｌ、水10μｌ、10％のNP-40(10μｌ）と共に５本の管の個々に添加した。０〜0.1 単位のPNG アーゼＦ(Sigma) を個々の管に添加し、そしてそれらの管を30℃で一晩インキュベートした。解糖化された抗原を、銀染色されたSDS −ポリアクリルアミドゲル上で可視化した。
【０１１２】
AC133 抗原のリシルエンドペプチダーゼ消化及びペプチドの単離
AC133 抗原を、10％までのTCA の添加により2μg／mlの親和性カラム溶出液 1.4mlから沈殿せしめた。その沈殿された乾燥タンパク質を25μｌの消化緩衝溶液（８Ｍの尿素、 400mMのトリス、pH7.8)に懸濁し、これに45ｍのDTT 5μlを添加し、そしてその混合物を50℃で15分間インキュベートした。室温に冷却した後、 100mMのヨードアセトアミド５μｌを添加し、そしてその混合物をさらに15分間インキュベートした。蒸留水 (70μｌ) を添加し、尿素を２Ｍに希釈し、そして２ｐモルのリシルエンドペプチダーゼ、すなわちLysC (Wako Chemicals, USA から入手できる) を添加した。消化を37℃で24時間、行なった。ペプチドを、 0.1％のトリフルオロ酢酸(TFA) における４〜32％アセトニトリルグラジエントを有するVYDAC の狭い内孔のＣ18逆相カラム上でのHPLC分離により単離した。
【０１１３】
AC133 抗原ペプチドのタンパク質配列分析
Ｎ−末端配列分析を、Applied Biosystems 477A 又は473A液体パルスタンパク質配列決定機上で、Edman 化学 (Edman, P., Begg, G. (1967) Eur. J. Biochem. 1, 80-91 ; Huwick, R.M., Hunkapillar, M.W., Hood, L.E., and Dreyer, W.J. (1987) J. Biol. Chem. 256, p. 7990)を用いて決定した。PTH −アミノ酸を、Applied Biosystemsからの２〜４％のABI Premix Buffer 濃縮物の緩衝液Ｂ（アセトニトリル）への添加、12〜36％の緩衝液Ｂ線状グラジエントでの18分間にわたって、続いて36％Ｂでの13分間のイソクラティク(isocratic) 期間を伴って、緩衝液Ａ(3.5％のテトラヒドロフラン) において55℃でBrownlee C-18 逆相カラム(2.1mm×22cm) 上で分離した。
【０１１４】
AC133 抗原の単離及びタンパク質配列決定
120kDのAC133 抗原を、収穫する96時間前、PMA 活性化された網膜芽腫細胞系、すなわちＹ79からイムノアフィニティークロマトグラフィーにより単離した。連続的なアフィニティークロマトグラフィー及びDEAEクロマトグラフィーを用いて、SDS-PAGE及び銀染色により95％以上の純度のAC133 抗原を生成し、そしてAC133 抗原としてのその精製された分子の同一性をウェスターンブロットにより確かめた。Ｎ−末端糖を除去するためにPGN アーゼＦによる前記抗原の解糖は、約30kDの分子量が糖化によるものであることを示す。
【０１１５】
AC133 抗原のＮ−末端を配列決定するための反復された初期の試みは失敗しており、このことは、このタンパク質がアミノ末端ブロックされることを示唆する。しかしながら、リシルエンドペプチダーゼによる精製された抗原の消化、続く逆相HPLC処理は、12〜16個のアミノ酸の長さを有する４種のペプチド配列を生成した。前記ペプチド及び得られる変性オリゴヌクレオチド配列による主要タンパク質及び核酸データベスの研究は、AC133 抗原がいづれか記載される分子により同定され得なかったことを示した。（そのアミノ酸配列は、現在、cDNAクローニングから推定されており、そして図12に示される。)
【０１１６】
cDNAクローニング
全RNA をWERI-Rb-1 網膜芽腫細胞 (American Type Culture Collection, Rockville, MD から入手できる) から単離し、そしてポリ A+ RNA を、ポリ A+ Tract System (Promega Corp., Madison, WI) を用いて調製した。cDNAを、スーパスクリプト逆転写酵素 (GIBCO BRL., Gaithersburg, MD) 及びオリゴdTプライマーを用いて合成し (Guebler, U. and B.J. Hoffman (1983) Gene 25 : 263)。ブラント末端化されたcDNAを、非自己相補性Bst XIアダプターに連結し、そしてゲル精製し、連結されていないアダプター及び小さなフラグメントを除去した。
【０１１７】
次に、連鎖されたcDNAを、pcDNA-I 発現ベクター中にエレクトロポレートした (Invitrogen, San Diego, CA)中に連結し、そしてＥ．コリ株MC1061／P3 (Dower, W.J. (1990) Genetic Engineering V.12 Edited by J.K. Seflow, Plenum Press, New York 275-295.（細菌のエレクトロポレーション：遺伝子情報に対する一般的なアプローチ) ; Ausubel, F.M., R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith and K. Strahl.1987-1994 Current Protocols in Molecular Biology. John Wilest Surs ; N.Y.)。WERI-Rb-1 ライブラリーcDNA(100ng／反応）を、４種のAC133 抗原ペプチドのタンパク質配列から企画された 100ｐモルの個々の変性センス及びアンチセンスプライマーと共に、PCR鋳型として使用した。
【０１１８】
PCR 反応を、反応当たり５単位のTaq DNA ポリメラーゼ (Promega Corp, Madison, WI)により緩衝液（50mMのKCl、10mMのトリス、pH９、 0.1％のTriton X-100、1.5mMのMgCl、 0.2mMの（個々の）dNTP) において行なった。増幅を次の通りに、MJ研究 (データ) 装置において行なった：92℃で１分間、55〜37℃で１分間、72℃で３分間、35サイクル。増幅の後、その反応混合物を１％アガロースゲル上で試験し、個々のプライマー対照に出現しないユニークなバンドをゲル精製し、そしてTA Cloning Kit (Invitrogen, San Diego, CA)を用いてpCR2.1中にクローン化した。
【０１１９】
その遺伝子の５′及び３′末端を、一群の組のAC133 抗原遺伝子特異的プライマー及びライブラリー特異的プライマーを用いて、半−特異的PCR により単離した。20サイクルの一本鎖PCR を、５単位のTaqポリメラーゼを含むPCR 反応緩衝液 (上記) における 100ngのライブラリーcDNA及び10ｐモルの個々のプライマーと共に、50μｌの反応体積において個々の遺伝子特異的プライマーを用いて行なった。この反応混合物のアリコート (10μｌ) を除去し、そして遺伝子特異的プライマー及びライブラリー特異的プライマーの両者を用いて、第２の35サイクルPCR 反応のために鋳型として使用した。
【０１２０】
次に、このPCR 反応混合物のアリコート (５μｌ）を、一群のライブラリー及び遺伝子特異的プライマーを用いてのさらなる35サイクルの反応のために使用した。前記遺伝子の５′及び３′末端に対応するバンドをゲル精製し、そしてpCR2.1中にクローン化した。オーバーラップするcDNAクローンを、螢光色素ターミネーター及びABI 配列決定機 (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、ジデオキシ鎖反応により配列決定した。
【０１２１】
AC133 抗原のcDNAクローンの単離
このタンパク質のためのcDNAを単離するために、cDNAライブラリーを、PMA 活性化されたＹ79細胞よりも約10倍、よりAC133 抗原を発現するWERI-Rb-1 網膜芽腫細胞系から調製した。変性プライマーを、前記ライブラリーとの低い緊縮性、PCR 反応に使用し、５′末端でペプチド３の正しい配列及び３′プライム端でペプチド４の正しい配列を含む 1.7kbのフラグメントを生成した。さらに、ペプチド２の配列を、正しい読取り枠におけるフラグメント内に見出した。遺伝子特異的プライマー及びライブラリー特異的プライマーによる半−特異的PCR は、その遺伝子の５′及び３′末端に対応し、そして初期 1.7KBのクローンとオーバーラップする追加の 1.2KB及び２KBフラグメントを生成した。
【０１２２】
３種の部分的クローンの配列決定は、3.0KBの読取り枠を含み、そして遺伝子のポリＡ＋  部分と関係しているように見え、そして真核生物のコンセンサススプライス配列を含まない 128bpのイントロンをまた含む４KBのcDNAを生成した。イントロンを有さない、損なわれていない幹細胞由来のクローンを単離するために、 AC133＋  幹細胞を、mAb AC133 の磁気接合体、及びMiltenyi磁気分離システム (Miltenyi Biotech, GMBH) を用いて、胎児肝臓から単離した。全RNA をそれらの細胞から単離し、そしてRT-PCR反応のための鋳型として使用した。イントロンを拡張するよう企画されたプライマーは、ポリA+由来のcDNA鋳型を有する 582bpの一本鎖フラグメントを生成し、そして AC133+細胞系における全RNA からのイントロンを有さない 454bpの一本鎖フラグメントを生成し (図３）、この事は、スプライスされたmRNAが全RNA プール内の主要生成物であることを示唆する。
【０１２３】
RT-PCRを用いて、開始メチオニンの前で始まり、そして完全なcDNA配列を含むcDNAクローンを生成した。AC133 抗原をコードする十分な長さのcDNAは、96.8kDの分子量を有する 863個のアミノ酸のタンパク質を予測する (図４）。前記配列の疎水性の分析（図５）及びトランスメンプランヘリックスアルゴリズムは、タンパク質が、２種の大きな(255及び 280個のアミノ酸) 細胞外ループ及びＣ−末端細胞質末端の存在を示す細胞膜を合計５倍に拡張する（図６）ことを示す。タンパク質配列により提供される他の構造的特徴は、推定上の大きな細胞外ループ及びＮ−糖化のための６種のコンセンサス配列の両者におけるロイシンジッパーモチーフを包含する。
【０１２４】
トランスフェクトされたCOS-7 細胞におけるAC133 抗原の発現
AC133 陽性細胞（１×107)を、上記のようにして胎児肝臓から単離した。全RNA を、Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162, 156 に記載のようにして、RNAzol (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)を用いて単離した。RT-PCRを、10ngの全RNA 鋳型、及び開始メチオニンの前及び停止コドンの後に指図されたプライマーと共にPromega Access RT-PCR システム (Promega Corp, Madison, WI)を用いて実施した。
【０１２５】
遺伝子のコード領域に対応する 2.8kbのバンドを、CMV プロモーターを含むInvitrogen指図の真核TAクローニングベクター (pCR3.1) 中にクローン化した。副集密的COS-7細胞 (ATCC, Rockville, MD から入手できる) を、エレクトロポレーションを用いて、５μｇのクローン化されたDNA によりトランスフェクトし、そしてFASS分析の前、48時間インキュベートした。トランスフェクトされたCOS-7 細胞を、50ng／ 100μｌの試験mAb AC133-PEにより染色し、そしてBecton Dickerson (San Jose, CA) FACS走査により分析した。
【０１２６】
COS 細胞におけるAC133 抗原の発現
AC133 抗原遺伝子によりトランスフェクトされたCOS 細胞を、mAb AC133-PEにより染色し、そしてFACSにより分析した (図７）。AC133 抗原遺伝子によりトランスフェクトされたCOS 細胞はmAB AC133-PEにより明るく染色されたが、しかしながら、トランスフェクトされていない細胞、空のベクターによりトランスフェクトされた細胞、又はCD-8のための遺伝子はこの抗体により染色されない。
【０１２７】
種々のリンパ及び非リンパ細胞系におけるAC133 発現
種々の細胞系におけるAC133 抗原転写体の存在を、ノザン分析により評価した。ノザンブロット分析を、Clontech (Palo Alto, CA)複合組織ノザンブロットを用いることによって、及び１％アガロース−２Ｍのホルムアルデヒドゲル上にRNA サンプルを溶解し、そしてナイロン膜中に一晩、細管ブロットすることによって実施した。全RNA をTri 試薬により単離し、そしてその15μｇをレーン当たりに負荷した。メチレンブルーによるブロットの染色を、RNA 濃度をモニターするために使用した。cDNAの800bp EcoRＩフラグメントを、３２P-dGTPにより、ランダムプライミングを用いてラベルし、そしてプローブとして使用した。
【０１２８】
種々の細胞系におけるAC133 抗原転写体の存在を、ノザン分析により評価した。 4.4KBのmRNA転写体が、WERI-Rb-1 細胞及びＹ79細胞、並びにMACS−単離された AC133＋  胎児肝臓細胞に検出できた。AC133 抗原の発現はPMA 活性化に基づいてＹ79細胞において増強されるが、その対応するmRNAはダウンレギレーションされるように思える。正常な造血組織においては、AC133 抗原メッセージは、胎児鍛造に検出でき、そしてそれらの組織における AC133＋  細胞が少数で存在する事実により予測されるように、成人骨髄においては、弱く検出できる。AC133 抗原転写体がまた、非リンパ組織、特に膵臓、腎臓及び胎盤においても示された。弱いシグナルが肝臓、肺、脳及び心臓に観察された。すなわち、パラフィン組織断片の免疫組織化学染色に対比する場合、AC133 抗原の発現が骨髄においてのみ検出できた。
【０１２９】
類似する態様において、AC133 抗原に対して特異的である他の抗体が開発された。次の表は、抗体、免疫原、イソタイプ、及びそのような抗体パネルのための交差阻止を示す。
【０１３０】
【表３】
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【０１３１】
本明細書に引用されるすべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書に組込まれる。
前述の発明は、より理解を明確にするために例示的及び例的にいくらか詳細に記載されて来たが、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは、当業者に明らかであろう。
【０１３２】
発明の要約
１．配列番号２に示すアミノ酸配列を有するAC133 抗原に対して特異的に結合する抗体。
２．前記抗体が、ハイブリドーマ細胞系により生成されるモノクローナル抗体である（１）に記載の抗体。
３．前記抗体が、対側性免疫化を通して誘導される（１）に記載のモノクローナル抗体。
４．造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、又は両者の富化のための方法であって、
造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、又は両者を含んで成るヒト細胞の混合された集団と、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するAC133 抗原に対して特異的に結合する試薬とを組合せ；そして
前記試薬と結合する細胞を選択する；
ことを含んで成り、ここで前記選択された細胞が、前記ヒト細胞の混合された集団がそれぞれ、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、又は両者を含むかどうかに依存して、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞活性又は両活性について富化されることを特徴とする方法。
５．前記ヒト細胞の混合された集団と、細胞表面マーカーCD90，CD117 及びHLA-DRの少なくとも１つを特異的に認識する試薬とを組合せ；そして
前記細胞表面マーカーの少なくとも１つに対して陽性である細胞を選択する；
ことをさらに含んで成る（４）に記載の方法。
【０１３３】
６．前記試薬が抗体又は抗体混合物である（４）に記載の方法。
７．前記抗体の少なくとも１つが、螢光色素に接合されている（６）に記載の方法。
８．前記螢光色素に接合された抗体による前記選択がフローサイトメトリーによる（７）に記載の方法。
９．前記抗体の少なくとも１つが、磁気粒子に接合されている（６）に記載の方法。
10．前記磁気粒子接合された抗体による前記選択が高グラジエント磁気選択による（９）に記載の方法。
【０１３４】
11．配列番号２に示すアミノ酸配列を有するAC133 抗原に対して特異的に結合する試薬に対して結合される実質的に純粋な造血前駆細胞集団。
12．前記試薬がモノクローナル抗体である（11）に記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。
13．前記前駆細胞がヒト胎児肝臓から得られる（11）に記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。
14．前記前駆細胞がヒト末梢血液から得られる（11）に記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。
15．前記前駆細胞がヒト骨髄から得られる（11）に記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。
【０１３５】
16．前記骨髄が成人の骨髄である（15）に記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。
17．前記骨髄が胎児の骨髄である（15）に記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。
18．配列番号１に示されるAC133 のためのアミノ酸コード領域を有する配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る分子であって、但し前記分子がRNA 分子である場合、前記分子の配列においてＵがＴを置換している分子。
19．配列番号１に示されるAC133 のためのアミノ酸コード領域に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る分子であって、但し前記分子がRNA 分子である場合、前記分子の配列においてＵがＴを置換している分子。
20．配列番号１に示されるAC133 のためのアミノ酸コード領域のサブ配列であり、そして少なくとも14個の長さのヌクレオチドである配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る分子であって、但し、（ｉ）前記分子がRNA 分子である場合、前記分子の配列においてＵがＴを置換しており、そして（ii）前記配列が配列番号１のヌクレオチド347-667, 1564-1696又は2010-2386 でない分子。
【０１３６】
21．（18）〜（20）のいづれか１項記載の分子の配列に対して相補的な配列を含んで成る単離された核酸分子。
22．配列番号２に示されるAC133 のアミノ酸分子をコードするDNA から実質的に成る単離された核酸分子。
23．（18）〜（20）のいずれか１項に記載の核酸配列を含んで成る発現ベクター。
24．（23）に記載の分子によりトランスフェクトされた細胞。
25．単離されたポリペプチドであって；
（１）配列番号２に示されるAC133 の第１アミノ酸配列；
（２）前記第１配列のサブ配列であり、そして少なくとも10個のアミノ酸から成る長さを有する第２アミノ酸配列；又は
（３）前記第１又は第２配列中の少なくとも１つのアミノ酸が異なったアミノ酸により置換されている第３配列；
を含んで成り、但し、前記アミノ酸置換が１つの酸性残基ともう１つの残基、１つの塩基性残基ともう１つの残基、１つの非極性残基ともう１つの残基、１つの荷電されていない極性残基ともう１つの残基：又は１つの芳香族残基ともう１つの残基との置換であり、そして前記第３配列が前記第１又は第２配列に対して少なくとも90％の同一性を有することを特徴とするポリペプチド。
【０１３７】
26．前記ポリペプチドが前記第１配列を含んで成る（25）に記載の単離されたポリペプチド。
27．前記ポリペプチドが前記第２配列を含んで成る（25）に記載の単離されたポリペプチド。
28．前記ポリペプチドが前記第３配列を含んで成る（25）に記載の単離されたポリペプチド。
29．リガンドに対して複合体を形成する（25）に記載のポリペプチド。
30．前記リガンドが抗体である（29）に記載のポリペプチド複合体。
【０１３８】
31．単離されたポリペプチドであって、配列番号２の細胞外Ｎ−末端、aa 20-107 ；第１トランスメンブラン領域、aa 107-126；第１細胞質ループ、aa 127-157；第２トランスメンブラン領域、aa 158-179；第１細胞外ループ、aa 180-435；第３トランスメンブラン領域、aa 436-454；第２細胞質ループ、aa 455-480；第４トランスメンブラン領域、aa 481-503；第２細胞外ループ、aa 504-792；第５トランスメンブラン領域、aa 793-816；又は細胞質Ｃ−末端aa 817-865のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
32．ヒト造血幹細胞に対して結合するリガンドを同定するための方法であって、（25）に記載のポリペプチドにより前記リガンドの結合性を検出することを含んで成る方法。
33．（25）に記載のポリペプチドに対して特異的に結合する試薬。
34．前記試薬が、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体から成る群から選択される（33）に記載の試薬。
35．前記試薬が、生理学的リガンド又は合成リガンドである（33）に記載の試薬。
【０１３９】
36．前記ポリペプチドがグリコシル化されてない（25）に記載のポリペプチド。
37．前記ポリペプチドがグリコシル化されている（25）に記載のポリペプチド。
38．造血幹細胞上の抗原性マーカーに対するリガンドの選択的結合による幹細胞の同定に基づく細胞分離技法を用いて、前記幹細胞を単離するための方法であって；
前記抗原性マーカーとして、そのアミノ酸配列が配列番号２に示されているAC133 抗原を用いることを特徴とする方法。
39．前記リガンドが抗体である（38）に記載の方法。
40．前記リガンドが、前記AC133 抗原の細胞外領域に結合する（38）に記載の方法。
【０１４０】
41．前記細胞外領域が、配列番号２の細胞外Ｎ−末端、aa 20-107 ；第１細胞外ループ、aa 180-435；又は第２細胞外ループ、aa 504-792から選択されたアミノ酸を含んで成る（38）に記載の方法。
42．前記リガンドが、試験化合物群中の化合物が前記AC133 抗原に結合するかどうかを決定し、そして成熟血液細胞上に存在するいづれかの抗原と10％以下の交差反応性を有する、前記AC133 抗原に対して特異的に結合する化合物間から前記リガンドを選択することによって同定される（38）に記載の方法。
43．前記交差反応性が、前記リガンドがAC133 への結合性を半−飽和する、AC133 抗原及び前記リガンドの濃度を用いて、純粋なAC133 抗原、前記リガンド、及び前記推定される交差反応性抗原の間の競争結合アッセイにより測定される（38）に記載の方法。
44．（32）に記載の方法により同定されるAC133 のためのリガンド。
45．成熟血液細胞上に存在するいづれかの抗原と５％以下の交差反応性を有する、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するAC133 抗原に対して特異的に結合する試薬。
【０１４１】
46．前記試薬が、表面又は検出できるラベルに結合される（45）に記載の試薬。
47．前記ラベルが螢光ラベルである（45）に記載の試薬。
48．AC133陽性細胞の集団を選択する方法において、
細胞の混合された集団を、配列番号２のアミノ酸配列を有するAC133抗原に対して特異的な抗体と接触せしめ、そして
前記抗体に結合する細胞を選択する；
ことを含んで成る方法。
49．前記抗体がモノクローナル抗体である、（48）に記載の方法。
50．前記抗体が蛍光色素に結合されている、（48）に記載の方法。
【０１４２】
51．前記蛍光色素に結合した抗体による前記の選択が、フローサイトメトリーによる、（50）に記載の方法。
52．前記抗体が磁気粒子に結合されている、（48）に記載の方法。
53．前記磁気粒子に結合した抗体による前記選択が、高グラジエント磁気選択による、（52）に記載の方法。
54．前記細胞の混合された集団が、骨髄、胎児骨髄、肝臓、臍帯、血液、又はサイトカインで可動かされた血液に由来する、（48）に記載の方法。
55．AC133抗原を発現する細胞の同定方法において、細胞の集団を、配列番号２のアミノ酸配列を有するAC133抗原に対して特異的な抗体と接触せしめ；そして
前記抗体に結合した細胞を検出する；
ことを含んで成る方法。
【０１４３】
56．前記検出された細胞を単離する工程を更に含んで成る、（55）に記載の方法。
57．前記抗体がモノクローナル抗体である、（55）に記載の方法。
58．前記抗体が蛍光色素に結合されている、（56）に記載の方法。
59．前記蛍光色素に結合した抗体による前記の選択が、フローサイトメトリーによる、（58）に記載の方法。
60．前記抗体が磁気粒子に結合されている、（56）に記載の方法。
【０１４４】
61．前記磁気粒子に結合した抗体による前記選択が、高グラジエント磁気選択による、（60）に記載の方法。
62．前記細胞の混合された集団が、骨髄、胎児骨髄、肝臓、臍帯、血液、又はサイトカインで可動かされた血液に由来する、（55）に記載の方法。
63．AC133陽性細胞又はその子孫の実質的に純粋な集団であって、当該細胞が、
細胞の混合された集団を、配列番号２のアミノ酸配列を有するAC133抗原に対して特異的な抗体と接触せしめ；そして
前記抗体に結合した細胞を選択する；
ことを含んで成る、前記細胞集団の選択方法により得られたものである、
ことを特徴とする細胞集団。
64．前記抗体がモノクローナル抗体である、（63）に記載のAC133陽性細胞の集団。
65．前記抗体が蛍光色素に結合されている、（63）に記載のAC133陽性細胞の集団。
【０１４５】
66．前記蛍光色素に結合した抗体による前記の選択が、フローサイトメトリーによる、（64）に記載のAC133陽性細胞の集団。
67．前記抗体が磁気粒子に結合されている、（63）に記載のAC133陽性細胞の集団。
68．前記磁気粒子に結合した抗体による前記選択が、高グラジエント磁気選択による、（67）に記載のAC133陽性細胞の集団。
69．前記細胞の混合された集団が、骨髄、胎児骨髄、肝臓、臍帯、血液、又はサイトカインで可動かされた血液に由来する、（63）に記載のAC133陽性細胞の集団。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、胎児肝臓細胞の螢光活性化細胞分別(fluorescence activted cell sorting) (FACS) 分析からのドット−プロットを示す。ｙ軸はフィコエリトリン（PE）に接合されたAC133 抗体による細胞染色を示す。細胞は、HPCA２−FITC（抗−CD34）により対比染色された (counterstained) 。数字は、枠内に含まれる合計細胞の％を表わす。
【図２】図２は、ホルボールミリステートアセテート(PMA）活性化Ｙ79.1細胞上でのAC133 抗原発現のFACS分析を示すグラフである。
【図３】図３は、PMA 活性化Ｙ79.1細胞上でのAC133 抗原及びCD34発現のFACS分析を示すグラフである。
【図４Ａ】図4Aは、胎児肝臓細胞上での抗体 AC133，CD38及び HLA−DRの３色FACS分析からのドット−プロットを示す。図4A中のｘ軸は、 HLA−DR−FITCを表わし、そしてｙ軸は AC133−PEによる細胞染色を示す。
【図４Ｂ】4Bは、胎児肝臓細胞上での抗体 AC133，CD38及び HLA−DRの３色FACS分析からのドット−プロットを示す。図4B中のｘ軸はCD38−FITCを表わし、そしてｙ軸は AC133−PEによる細胞染色を表わす。
【図５Ａ】図5Aは、胎児肝臓から精製されたAC133陽性細胞上での抗体CD38， HLA−DR, CD90及びCD117 のFACS分析からのドット−プロットを示す。図5Aにおいて、ｘ軸はCD38−FITC染色を示し、そしてｙ軸はHPCA２−PE染色を示す。数字は、ボックスゲート内にある合計細胞の％を示す。
【図５Ｂ】図5Bは、胎児肝臓から精製されたAC133陽性細胞上での抗体CD38， HLA−DR, CD90及びCD117 のFACS分析からのドット−プロットを示す。図5Bにおいて、ｘ軸はHPCA２−FITCによる染色を示す。図5B中のｙ軸は抗−HLA−DR−PEによる細胞染色を表わす。数字は、ボックスゲート内にある合計細胞の％を示す。
【図５Ｃ】図5Cは、胎児肝臓から精製されたAC133陽性細胞上での抗体CD38， HLA−DR, CD90及びCD117 のFACS分析からのドット−プロットを示す。図5Cにおいて、ｘ軸はHPCA２−FITCによる染色を示す。図5C中のｙ軸は抗−CD90−PEによる細胞染色を表わす。数字は、ボックスゲート内にある合計細胞の％を示す。
【図５Ｄ】図5Dは、胎児肝臓から精製されたAC133陽性細胞上での抗体CD38， HLA−DR, CD90及びCD117 のFACS分析からのドット−プロットを示す。図5Dにおいて、ｘ軸はHPCA２−FITCによる染色を示す。図5D中のｙ軸は抗− CD117−PEによる細胞染色を表わす。数字は、ボックスゲート内にある合計細胞の％を示す。
【図６】図６は、AC133 抗体並びに細胞系KG1a及びＹ79.1による免疫沈殿の結果を示すゲルである。レーンは次の通りである：１）分子量マーカー；２）未沈殿KG1a溶解物の１：５希釈物；３）未沈殿Ｙ79.1溶解物の１：50希釈溶液；４）AC101 抗体（CD34）により沈殿したKG1a溶解物；５）AC101 抗体により沈殿したＹ79.1溶解物；６）HPCA２抗体（CD34）により沈殿したKG1a溶解物；７）HPCA２抗体により沈殿したＹ79.1溶解物；８）16D11 抗体（CD34）により沈殿したKG1a溶解物；９）16D11 抗体により沈殿したＹ79.1溶解物；10）AC133 抗体により沈殿したKG1a溶解物；11）AC133 抗体により沈殿したＹ79.1溶解物；12）AC133 及びHPCA２抗体の混合物により沈殿した、KG1a及びＹ79.1の混合物の溶解物；13）8A3(抗−CD109)抗体により沈殿したKG1a溶解物；14）15G5（抗−CD109)抗体により沈殿されたKG1a溶解物。
【図７Ａ】図7Aは、PMA 活性化された、ツニカマイシン処理された又は未処理のY79.1細胞上でのCD56抗原発現のFACS分析を示すグラフである。
【図７Ｂ】図7Bは、PMA 活性化された、ツニカマイシン処理された又は未処理のY79.1細胞上でのAC133 抗原発現のFACS分析を示すグラフである。
【図８】図８は、AC133 磁気精製された胎児肝臓細胞のHPCA２−PE（ｙ軸）染色のFACS分析を示すドット−プロットである。ｘ軸はグリコホリンＡ−FITC接合体による染色を示す。
【図９Ａ】図9Aは、AC133 磁気分離の前及び後の、バフィーコート末梢血液単核細胞のHPCA２染色のFACS分析を示すドット−プロットである。ｙ軸は、HPCA２−PEによる染色を示し、ｘ軸は抗−CD45及び抗−CD15−FITC接合抗体による染色を示す。
【図９Ｂ】図9Bは、AC133 磁気分離の前及び後の、バフィーコート末梢血液単核細胞のHPCA２染色のFACS分析を示すドット−プロットである。ｙ軸は、HPCA２−PEによる染色を示し、ｘ軸は抗−CD45及び抗−CD15−FITC接合抗体による染色を示す。
【図１０】図10は、クローン原性アッセイにおけるAC133 及びAC101 で精製された細胞のクローニング効率を示す棒グラフである。
【図１１】図11は、AC133 で精製された細胞、及びAC133 陰性，CD34陽性細胞のプート効率を示す棒グラフである。
【図１２−１】図12-1は、AC133 抗原についてのDNA 及びアミノ酸配列を示す化学式である。
【図１２−２】図12-2は、AC133 抗原についてのDNA 及びアミノ酸配列を示す化学式である。
【図１２−３】図12-3は、AC133 抗原についてのDNA 及びアミノ酸配列を示す化学式である。
【図１２−４】図12-1は、AC133 抗原についてのDNA 及びアミノ酸配列を示す化学式である。
【図１２−５】図12-5は、AC133 抗原についてのDNA配列を示す化学式である。
【図１３】図13は、AC133 抗原のトランスメンブラン領域及び他の領域の図解である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３】
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【配列表】
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