(57)【要約】【課題】  個人が、喘息および／またはアレルギー性鼻炎の素因を有するか否かを評価するための方法を提供すること。【解決手段】  染色体5q33領域上に存在するcytoplasmic FMRP Interacting Proteins 2（CYFIP2）遺伝子の、所定の位置の遺伝子多型の遺伝子型を決定し、特定のアレルの場合に、個人が、喘息および／またはアレルギー性鼻炎の素因を有すると評価する。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
個人が、喘息および／またはアレルギー性鼻炎の素因を有するか否かを評価するための方法であり、染色体5q33領域上に位置するcytoplasmic FMRP Interacting Proteins 2（CYFIP2）遺伝子の、ポジション156682854の多型（CY-In1-4A/T）、ポジション156688843の多型（CY-In1-8T/C）、ポジション156690209の多型（CY-In1-9G/A）、ポジション156690921の多型（CY-In1-10A/G）、ポジション156695032の多型（IVS3+20G/A）、ポジション156734152の多型（c.2061C/T）から選ばれる少なくとも1つの遺伝子多型の遺伝子型を決定し、CY-In1-4Aアレル、CY-In1-8Tアレル、CY-In1-9Gアレル、CY-In1-10Aアレル、IVS3+20Gアレル、c.2061Cアレルの場合に、個人が、喘息および／またはアレルギー性鼻炎の素因を有すると評価することを特徴とする方法。
【請求項２】
喘息および／またはアレルギー性鼻炎に対する薬剤を設計するための方法であり、CYFIP2を疾患関連遺伝子として標的にして設計することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個人が、喘息および／またはアレルギー性鼻炎の素因を有するか否かを評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎などのアトピー性疾患は特に先進国において罹患者が多く、今なお増加の一途をたどっていることからその対策は急務であると考えられている（非特許文献3,4）。喘息罹患者は世界で1億5千万人以上といわれている（非特許文献5）。喘息は、遺伝要因と環境要因が相互に作用して発症する複雑疾患であり、これまでに、いくつかの喘息感受性遺伝子座が、全ゲノム解析により見出されている（非特許文献1,6-11）。また、いくつかの連鎖解析により、染色体5q領域が、喘息および喘息関連形質と連鎖していることが確認されている（非特許文献1,6,10,12）。本発明者らは、ダニ反応性アトピー性喘息患者を発端者とする家系を用いて全ゲノム解析を行い、マーカーD5S820がアトピー性喘息と強く連鎖していることを報告した（非特許文献1）。
【０００３】
本発明者らが見出した連鎖領域は、マウスの気道過敏性をコントロールする領域、すなわち、Epsin 4（EPN4）, a disintegrin and metalloproteinase domain 19（ADAM19）, Sry-box 30（SOX30）, cytoplasmic FMRP Interacting Proteins 2（CYFIP2）, cofactor required for sp1 transcriptional activation, subunit 9（CRSP9）, interleukin（IL）-2 inducible tyrosine kinase（ITK）, hepatitis virus cellular receptor 1（HAVcr-1または T-cell immunoglobulin- and mucin-domain-containing molecule 1, TIM1）, HAVcr-2（TIM3）（非特許文献2）のヒト相同領域を含んでいる。HAVcr-1とHAVcr-2は、Tヘルパー細胞タイプＩ（Th-1）やTh-2への分化や、マウスの気道過敏性に関連することが報告されており、これらの遺伝子が喘息をはじめとするアレルギー性疾患の制御に重要な役割を果たしていることが示唆されている（非特許文献2）。また、最近の研究ではHAVcr-1コード領域のinsertion/deletion多型がA型肝炎抗体陽性者のみにおいてアトピー形質と関連することが報告されている（非特許文献13）。本発明者らは、HAVcr-1とHAVcr-2の多型のスクリーニングを行い、HAVcr-1とHAVcr-2のそれぞれにおいて、2つのinsertion/deletion多型を含む合計7個の多型を検出した。しかし、本発明者らはこれらの多型とヒト喘息発症との関連性については見出すことができなかった（非特許文献14）。また、本発明者らが見出した連鎖領域はInterleukin-12B遺伝子（IL12B）を含む。IL-12は、Tリンパ球応答を調節し、アレルギー性炎症を抑制するサイトカインである。本発明者らは、IL12Bの変異検索を行い、4個の変異（-4475-4insG, Glu186Asp, Ser226Asnおよび1188A/C）を見出したが、IL12Bの多型のいずれもアトピー性喘息発症と関連していなかった（非特許文献15）。
【非特許文献１】Yokouchi, Y. et al. Significant evidence for linkage of mite-sensitive childhood asthma to chromosome 5q31-q33 near the interleukin 12 B locus by a genome-wide search in Japanese families. Genomics 66, 152-60 (2000).
【非特許文献２】McIntire, J.J. et al. Identification of Tapr (an airway hyperreactivity regulatory locus) and the linked Tim gene family. Nat Immunol 2, 1109-16. (2001).
【非特許文献３】Worldwide variation in prevalence of symptoms of asthma, allergic rhinoconjunctivitis, and atopic eczema: ISAAC. The International Study of Asthma and Allergies in Childhood (ISAAC) Steering Committee [see comments]. Lancet 351, 1225-32 (1998).
【非特許文献４】Gergen, P.J. & Weiss, K.B. The increasing problem of asthma in the United States [editorial; comment]. Am Rev Respir Dis 146, 823-4 (1992).
【非特許文献５】Hoffjan, S. & Ober, C. Present status on the genetic studies of asthma. Curr Opin Immunol 14, 709-17. (2002).
【非特許文献６】A genome-wide search for asthma susceptibility loci in ethnically diverse populations. The Collaborative Study on the Genetics of Asthma (CSGA). Nat Genet 15, 389-92. (1997).
【非特許文献７】Daniels, S.E. et al. A genome-wide search for quantitative trait loci underlying asthma. Nature 383, 247-50. (1996).
【非特許文献８】Dizier, M.H. et al. Genome screen for asthma and related phenotypes in the French EGEA study. Am J Respir Crit Care Med 162, 1812-8. (2000).
【非特許文献９】Laitinen, T. et al. A susceptibility locus for asthma-related traits on chromosome 7 revealed by genome-wide scan in a founder population. Nat Genet 28, 87-91. (2001).
【非特許文献１０】Ober, C. et al. Genome-wide search for asthma susceptibility loci in a founder population. The Collaborative Study on the Genetics of Asthma. Hum Mol Genet 7, 1393-8 (1998).
【非特許文献１１】Wjst, M. et al. A genome-wide search for linkage to asthma. German Asthma Genetics Group. Genomics 58, 1-8 (1999).
【非特許文献１２】Xu, J. et al. Major genes regulating total serum immunoglobulin E levels in families with asthma. Am J Hum Genet 67, 1163-73. (2000).
【非特許文献１３】McIntire, J.J. et al. Immunology: hepatitis A virus link to atopic disease. Nature 425, 576. (2003).
【非特許文献１４】Noguchi, E. et al. Insertion/deletion coding polymorphisms in hHAVcr-1 are not associated with atopic asthma in the Japanese population. Genes Immun 4, 170-3. (2003).
【非特許文献１５】Noguchi, E. et al. Identification of missense mutation in the IL12B gene: lack of association between IL12B polymorphisms and asthma and allergic rhinitis in the Japanese population. Genes Immun 2, 401-3. (2001).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、喘息および／またはアレルギー性鼻炎に関する新規関連遺伝子多型の遺伝子型を決定することにより、個人が、喘息および／またはアレルギー性鼻炎の素因を有するか否かを評価するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の点に鑑みてなされた本発明の、個人が、喘息および／またはアレルギー性鼻炎の素因を有するか否かを評価するための方法は、請求項1記載の通り、染色体5q33領域上に位置するcytoplasmic FMRP Interacting Proteins 2（CYFIP2）遺伝子の、ポジション156682854の多型（CY-In1-4A/T）、ポジション156688843の多型（CY-In1-8T/C）、ポジション156690209の多型（CY-In1-9G/A）、ポジション156690921の多型（CY-In1-10A/G）、ポジション156695032の多型（IVS3+20G/A）、ポジション156734152の多型（c.2061C/T）から選ばれる少なくとも1つの遺伝子多型の遺伝子型を決定し、CY-In1-4Aアレル、CY-In1-8Tアレル、CY-In1-9Gアレル、CY-In1-10Aアレル、IVS3+20Gアレル、c.2061Cアレルの場合に、個人が、喘息および／またはアレルギー性鼻炎の素因を有すると評価することを特徴とする。
また、本発明の、喘息および／またはアレルギー性鼻炎に対する薬剤を設計するための方法は、請求項2記載の通り、CYFIP2を疾患関連遺伝子として標的にして設計することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、個人が、喘息および／またはアレルギー性鼻炎の素因を有するか否かを評価するための方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明者らが得た知見の概要を説明するが、本発明は以下の記載に何ら限定して解釈されるものではないことに留意すべきである。
【０００８】
まず、本発明者らは、5q33連鎖領域の喘息疾患感受性遺伝子を同定することを目的として、D5S2013とD5S211の間に存在する27個のマイクロサテライトマーカーを用いて23.6Mb領域のdense mapを作成した（図1a）。その結果、D5S487とD5S422の間の領域が、喘息発症と強く連鎖しており（最大LODスコア5.28）、これらの結果から95%の確率で喘息疾患感受性遺伝子がD5S2077とD5S1955のマーカー間に存在することが示唆された。なお、D5S2077とD5S1955間の距離は9.4Mbである。本発明者らは、D5S2077とD5S1955間に存在する26個の遺伝子の遺伝子変異スクリーニングを行い、アトピー性喘息患者を発端者とする155家系の538人の、マイナーアレル頻度が0.05以上の90の遺伝子多型に対して遺伝子型判定を行った。伝達不平衡テスト（TDT）の結果を図1bに示す。その結果、CYFIP2における2個の多型（c.2061C/TとIVS3+20G/A）は、喘息発症と強い関連性を示した（伝達28 vs 非伝達5, p=0.000075, オッズ比5.9）。また、これらの2個の多型は、完全連鎖不平衡にあった（D’and r2=1）（表1）。このうち、c.2061CアレルとIVS3+20Gアレルが、喘息児に有意に高頻度で伝達されていた。また、CYFIP2の周辺の多型に関する連鎖不平衡地図から連鎖不平衡がITKの一部とCYFIP2に及んでいることがわかった（図1c）。
【０００９】
c.2061C/T多型とIVS3+20G/A多型が他のアレルギー性疾患で関連しているかどうかを検討するために、本発明者らは、カモガヤ花粉症（季節性アレルギー性鼻炎）家系サンプルを用いて遺伝子型判定を行った。その結果2つの多型、c.2061C/TとIVS3+20G/Aは、カモガヤ花粉症においても関連していることが認められた（伝達8 vs 非伝達3, p=0.032, オッズ比2.8）（表1）。カモガヤ花粉症児に有意に高く伝達されたアレルはc.2061CとIVS3+20Gであり、喘息発症と関連するアレルと同一であった。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
IVS3+20G/A多型とc.2061C/T多型が遺伝子スプライシングに影響するかどうかを検討するためにRT-PCRを行った。IVS3+20G/A多型とc.2061C/T多型は、それぞれイントロン3とエクソン18に位置している。本発明者らはエクソン2とエクソン4のプライマーペアと、エクソン16とエクソン20のプライマーペアを設計し、IVS3+20G、2061Cホモ接合対の被験者およびヘテロ接合体の被験者から採取されたリンパ球由来のRNAを用いてRT-PCRを行ったがスプライス変異体は検出されなかった。
【００１２】
本発明者らは喘息家系の複数の遺伝子座と疾患発症との関連を検討するハプロタイプ解析を行い、いくつかのハプロタイプと喘息発症との関連は認められたが、最も強い関連は単一多型関連解析において認められた（以上の結果についてのデータは示さない）。
【００１３】
CYFIP2領域の喘息疾患感受性遺伝子多型を見出すために、転写開始点から2kb上流の領域とイントロン1全領域について変異検索を行い。イントロン1に19個の新規多型を見出した。そのうちの4つ（CY-In1-4A/T, CY-In1-8T/C, CY-In1-9G/AおよびCY-In1-10A/G）は、c.2061C/TとIVS3+20G/Aと完全連鎖不平衡にあった。CYFIP2多型のTDTの結果を表1に示す。CYFIP2の計6個の多型が、完全連鎖不平衡にあり、喘息と強く関連していた（p=0.000075）。
【００１４】
本発明者らは、CY-In1-8T/C, CY-In1-9G/A, CY-In1-10A/Gのそれぞれのいずれかの領域を含むルシフェラーゼレポーターベクターを作製した。CY-In1-4A/Tについては、AAAAAATTTTTTTからAAAAATTTTTTTTへの1塩基対の変化により機能的差異が現れる可能性は低いと考えられたため検討しなかった。各ベクターのルシフェラーゼ活性はK562細胞株を用いて分析した。内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化されたホタルルシフェラーゼ活性（Relative Luciferase Activity）を図2に示す。CY-In1-9Gを含むレポーターベクターは、CY-In1-9Aを含むレポーターベクターよりも転写活性が有意に高値であった（p<0.0001）。また、CY-In1-10Gを含むレポーターベクターは、CY-In1-10Aを含むレポーターベクターよりも転写活性が高かった（p=0.0014）。一方、CY-In1-8Cを含むレポーターベクターとCY-In1-8Tを含むレポーターベクターの間には転写活性の違いは認められなかった（p>0.1）。U937核抽出物を用いたゲルシフトアッセイにおいては多型を含むオリゴと核抽出物が結合したときは移動度の遅いバンドとして検出されるが、CY-In1-9Gアレルにおいてバンドが観察されたがCY-In1-9Aアレルにおいては認められなかった（図3のレーン3のバンドa）。バンドは、CY-In1-10の両アレルにも観察された（図3のバンドb）が、CY-In1-10Gアレルのバンド強度は、CY-In1-10Aアレルと比較して強く認められた（図3のレーン5と7）。
【００１５】
組織におけるCYFIP2の発現について、PCR方法を用いて分析した（図4）。その結果、CYFIP2は脳（brain）、腎臓（kidney）、リンパ節（lymph node）、リンパ球（lymphocytes）、胸腺（thymus）において強く発現し、骨格筋（skeletal muscle）において弱く発現していることを確認した。
【００１６】
近年の研究のより、隣接する遺伝子ペアの発現量が相関することが知られている（Cohen, B.A., Mitra, R.D., Hughes, J.D. & Church, G.M. A computational analysis of whole-genome expression data reveals chromosomal domains of gene expression. Nat Genet 26, 183-6. (2000).）。そこで、CYFIP2とその近傍に位置するITK、CRSP9、ADAM19遺伝子の発現レベルを、25人のドナーから得た末梢血リンパ球由来のRNAを用いて、リアルタイム定量的PCR法により検討した。CYFIP2の発現レベルと、CYFIP2に隣接する遺伝子の発現レベルとの相関を図5に示す。CYFIP2とITKの発現レベルは強く相関していた（r=0.73, p<0.0001, 図5a）が、CYFIP2とCRSP9の発現レベルに相関性は認められなかった（r=0.12, p=0.56, 図5b）。なお、ADAM19はリンパ球における発現レベルが低いため、CYFIP2とADAM19の発現レベルの相関性は検討できなかった。
【００１７】
本発明者らのデータは、染色体5q33領域上のCYFIP2遺伝子の多型が、小児アトピー性喘息とアレルギー性鼻炎に関連すること、CYFIP2とITKの発現レベルは強く相関していることを示すものであり、CYFIP2とITKは、アトピー性疾患の疾患感受性遺伝子であることが示唆された。
【００１８】
CYFIP2は、当初p53とp53変異体である121Fによって誘導される蛋白質として報告された（Saller, E. et al. Increased apoptosis induction by 121F mutant p53. Embo J 18, 4424-37. (1999).）。CYFIPファミリーには2個の蛋白質、CFYIP1とCYFIP2が存在する。CFYIP1とCYFIP2は、88%のアミノ酸相同性を示し、その配列は異なる種においても高度に保存されている。CYFIP2は、様々な組織、例えば、脳、肝臓、腎臓、リンパ節、リンパ球などで発現しており、骨格筋における転写は低い。Schenckらは、CYFIP2がfragile X mental retardation protein（FMRP）と相互作用していることを報告している（Schenck, A., Bardoni, B., Moro, A., Bagni, C. & Mandel, J.L. A highly conserved protein family interacting with the fragile X mental retardation protein (FMRP) and displaying selective interactions with FMRP-related proteins FXR1P and FXR2P. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 8844-9. Epub 2001 Jul 3. (2001).）。また、CYFIPは、シナプス形成と軸索形成に関連し、軸索の成長や分枝に影響を及ぼすことが知られている（Schenck, A. et al. CYFIP/Sra-1 controls neuronal connectivity in Drosophila and links the Rac1 GTPase pathway to the fragile X protein. Neuron 38, 887-98. (2003).）。免疫反応におけるCYFIP2の役割はいまだ不明な点が多いが、Mayneらは、CYFIP2がRac-1が介在するT細胞の接着に関連すること、多発性硬化症患者由来のT細胞でCYFIP2が増加しており、T細胞の接着性の増大していることを報告している（Mayne, M. et al. CYFIP2 is highly abundant in CD4+ cells from multiple sclerosis patients and is involved in T cell adhesion. Eur J Immunol 34, 1217-27. (2004).）。喘息やアレルギー疾患の発症は多発性硬化症と逆相関することが知られている（Tremlett, H.L., Evans, J., Wiles, C.M. & Luscombe, D.K. Asthma and multiple sclerosis: an inverse association in a case-control general practice population. Qjm 95, 753-6 (2002).や、Tang, L., Benjaponpitak, S., DeKruyff, R.H. & Umetsu, D.T. Reduced prevalence of allergic disease in patients with multiple sclerosis is associated with enhanced IL-12 production. J Allergy Clin Immunol 102, 428-35 (1998).や、Solaro, C. et al. Prevalence of atopy in multiple sclerosis patients: a case-control study. J Neurol 248, 239-40 (2001).や、Oro, A.S., Guarino, T.J., Driver, R., Steinman, L. & Umetsu, D.T. Regulation of disease susceptibility: decreased prevalence of IgE-mediated allergic disease in patients with multiple sclerosis. J Allergy Clin Immunol 97, 1402-8 (1996).）。このことは、Th-2が主要な役割をはたす喘息やアレルギーとTh-1が介在する多発性硬化症との間に、共通する免疫プロセスが存在することを示唆している。CYFIP2は、Th-1とTh-2タイプの免疫応答の不平衡に関連しているのかもしれない。
【００１９】
ITKは、T細胞の発生と活性化に不可欠なTecファミリーに属するキナーゼである。ITKは、局在する発現パターンを有し、T細胞やナチュラルキラー細胞、肥満細胞において発現している。ITK欠損マウスにおいて、CD4陽性T細胞のTh-2細胞への分化能が低下することが知られている（Fowell, D.J. et al. Impaired NFATc translocation and failure of Th2 development in Itk-deficient CD4+ T cells. Immunity 11, 399-409. (1999).や、Schaeffer, E.M. et al. Mutation of Tec family kinases alters T helper cell differentiation. Nat Immunol 2, 1183-8. (2001).）。また、ITK欠損マウスでは、肺の炎症や、好酸球浸潤、アトピー性喘息に認められる気道粘膜の肥厚が著明に減少することが知られている（Mueller, C. & August, A. Attenuation of immunological symptoms of allergic asthma in mice lacking the tyrosine kinase ITK. J Immunol 170, 5056-63. (2003).）。T細胞の活性化には、抗原特異的CD3によるT細胞受容体（TCR）刺激が必要であり、その結果β1インテグリンまたはβ2インテグリンを介したT細胞の接着が増大する。ITKは、β1インテグリンが関与するT細胞接着に関連すること、ヒトT細胞の接着は、キナーゼ不活性型のITKによって阻害しうることが知られている（Woods, M.L. et al. A novel function for the Tec family tyrosine kinase Itk in activation of beta 1 integrins by the T-cell receptor. Embo J 20, 1232-44. (2001).）。
【００２０】
リンパ球におけるCYFIP2とITKの発現レベルは、リアルタイム定量的PCR法による検討で強くに相関していた。これらの2つの遺伝子は、互いに隣接しており、遺伝子間距離はわずか11kbである。組織における両者の発現パターンは異なるが、両者は細胞接着とT細胞移動のための役割を果たしている。Saccharomyces cerevisiaeの全ゲノム発現解析の結果から、多数の隣接する遺伝子ペアの発現が相関していること、また遺伝子機能が類似している遺伝子は、染色体上において隣接して存在する傾向があることが明らかにされている（前出のNat Genet 26, 183-6. (2000).）。隣接する遺伝子の発現が相関しているという傾向は、マウス、ラット、ヒトにおいて確認されている（Lercher, M.J., Urrutia, A.O. & Hurst, L.D. Clustering of housekeeping genes provides a unified model of gene order in the human genome. Nat Genet 31, 180-3 (2002).や、Fukuoka, Y., Inaoka, H. & Kohane, I.S. Inter-species differences of co-expression of neighboring genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics 5, 4 (2004).）。本発明者らの今回の研究は、隣接する遺伝子のペアであるCYFIP2とITKは、ヒトにおいて類似の発現パターンを有することを明らかにした。
【００２１】
発明者らのレポーターアッセイおよびゲルシフトアッセイにより、CY-In1-9G/Aを含むDNA配列と、CY-In1-10A/Gを含むDNA配列は、それぞれin vitroにおいて異なった転写活性を有しており、また核内蛋白質との結合性も異なっていることが示された。喘息および花粉症の家系解析の結果からこれらのCYFIP2多型と疾患発症が関連していることが示されている。これらの結果をあわせて考えると、CYFIP2の発現レベルがアトピー性疾患発症と関連することが示唆される。またCYFIP2発現は、隣接遺伝子であるITKの発現と強く相関しており、本発明者らのデータは、ITKの発現が、ヒトにおけるアトピー性疾患の疾患感受性に関連している可能性を示唆するものである。
【００２２】
Mclntireらはコンジェニックマウスによる研究から、マウスにおける気道過敏性とT細胞のIL-4とIL-13産生に関連する領域を見出し、この領域がヒト染色体5q23-35領域に対応していることを報告した（前出の非特許文献2）。このマウス気道過敏性の領域には、EPN4, ADAM19, SOX30, CYFIP2, CRSP9, ITK, HAVcr-1, HAVcr-3が含まれている。彼らはマウスHAVcr-1とHAVcr-3の非同義的置換を検出している。このマウス気道過敏性の領域は本発明者らが見出した日本人喘息連鎖領域と一致するが（前出の非特許文献1）、上記の遺伝子のうちCYFIP2を除いては、ヒト喘息発症との関連を見出せなかった。CYFIP2とITKは、マウス気道過敏性に関連する領域に位置するため、両者は、ヒトとマウスの両方において気道過敏性に影響する、種を越えて保存された遺伝子である可能性がある。
【００２３】
本発明者らのデータから、CYFIP2とITKは、ヒトにおけるアトピー性疾患の疾患感受性に関する役割を果たしている。ITKは喘息における遺伝子ターゲットとして有望であるといわれている（Kanner, S.B. & Perez-Villar, J.J. Altering T-cell activation by targeting the multidomain tyrosine kinase Itk. Trends Immunol 24, 249-53. (2003).）。CYFIP2とITKを創薬のターゲットとすることは、喘息や鼻炎などのアトピー性疾患創薬開発のための、より強力なモデルを提供しうる。
【実施例】
【００２４】
１．対象者
対象は筑波大学病院の小児アレルギー外来を受診した小児ダニ反応性喘息患者とその家族である。家族全員に面接を行い、この研究についての説明を口頭と書面で十分に行った後、インフォームドコンセントを得られた155家系538人を本研究の対象とした。本研究の対象となる喘息患者は、米国National Institutes of Healthの診断基準を満たし、かつダニに対する高免疫応答性（ダニRAST Score3以上）を有する3歳以上喘息児のみとした（Noguchi, E. et al. Association between a new polymorphism in the activation-induced cytidine deaminase gene and atopic asthma and the regulation of total serum IgE levels. J Allergy Clin Immunol 108, 382-6. (2001).）。
カモガヤ花粉症患者として、カモガヤが季節性アレルギー性鼻炎の主要な原因である日本中部の農作地域である長野県下伊那郡松川町の3つの小学校と1つの中学校で行われたアンケート調査からカモガヤ花粉症に罹患していると考えられる児童を抽出した。医師の面接により花粉症に罹患していることが確認された児童を対象とし、児童の家族と面接し研究に対する同意の得られた48家系（188人）をカモガヤ花粉症解析の対象とした（Yokouchi, Y. et al. A genome-wide linkage analysis of orchard grass-sensitive childhood seasonal allergic rhinitis in Japanese families. Genes Immun 3, 9-13. (2002).）。対象者の核酸試料の調製は、採血した静脈血の白血球中のDNAをフェノール法により抽出することで行った。なお、本研究は、筑波大学の倫理委員会の承認のもとに行った。
【００２５】
２．デンスマッピングとSNPの発見と遺伝子型判定
本発明者らは、D5S2013とD5S211の間に存在する27個のマイクロサテライトマーカーを用いて染色体5q33連鎖領域のdense mapを作製した。地図の位置とマーカー間の距離は、Marshfield human genetic map（http://marshmed.org/genetics/）とthe annotated human genome sequences（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）のbuild33のデータベースから抽出した。疾患感受性遺伝子の95%信頼区間は、Glidenらによる方法をもとに算出した（Glidden, D.V., Liang, K.Y., Chiu, Y.F. & Pulver, A.E. Multipoint affected sibpair linkage methods for localizing susceptibility genes of complex diseases. Genet Epidemiol 24, 107-17. (2003).）。95%信頼区間には26個の遺伝子が存在し、本発明者らはそれら26個すべての変異検索を行った。26遺伝子の全てのエクソン、エクソン-イントロン接合部、5'側領域を、16人の血縁関係のない喘息患者のゲノムDNAを用いてPCR法により増幅した。見出された変異のうちマイナーアレル頻度が0.05よりも大きい遺伝子多型は90個であった。本発明者らは、喘息とCYFIP2内の遺伝子多型の間に強い関連性を見出しているので、CYFIP2遺伝子のエクソン1の2kb上流と全イントロン1についてさらに変異検索を行った。c.2061C/Tと完全連鎖不平衡にある4個の多型を含めて計19個の多型をCYFIP2のイントロン1に検出した。マイナーアレル頻度が0.05よりも大きい105個の多型についてはタックマンアッセイオンデマンドタイピングシステム、蛍光相関分光法（Bannai, M. et al. Single-nucleotide-polymorphism genotyping for whole-genome-amplified samples using automated fluorescence correlation spectroscopy. Anal Biochem 327, 215-21. (2004).）またはダイレクトシークエンス法により遺伝子型判定を行った。
【００２６】
３．統計
染色体5q33上の多点連鎖解析は、GeneHunterプログラムを用いて行った（Kruglyak, L., Daly, M.J., Reeve-Daly, M.P. & Lander, E.S. Parametric and nonparametric linkage analysis: a unified multipoint approach. Am J Hum Genet 58, 1347-63 (1996).）。家系関連解析には、ASPEXプログラムを用いた（Risch, N. et al. A genomic screen of autism: evidence for a multilocus etiology. Am J Hum Genet 65, 493-507. (1999).）。ハプロタイプのTDTの分析は、UNPHASEDプログラムを用いた（Dudbridge, F. Pedigree disequilibrium tests for multilocus haplotypes. Genet Epidemiol 25, 115-21. (2003).）。多型間の連鎖不平衡は、D'を用いて表し、GOLDソフトウェアによって視覚化した（Abecasis, G.R. & Cookson, W.O. GOLD--graphical overview of linkage disequilibrium. Bioinformatics 16, 182-3. (2000).）。P値は多重比較を行っているため修正し、p<0.00048の場合に統計学的に有意であると判断した。
【００２７】
４．MTCパネルのPCRスクリーニング
様々な組織におけるCYFIP2の発現を検討するために、Human Multiple Tissue and Human Immune System cDNA Panels（Clontech, Palo Alto, CA, USA）を用いた。PCRに使用したプライマーは、5’-CATTGTCCTCGCCATAGAGG（配列番号1）と5’-ACGGTGGATACGGAATGATG（配列番号2）であり、予想された産物のサイズは467bpであった。
【００２８】
５．リアルタイム定量的PCR法
採血時にアレルギー症状のない25人の成人ドナーから得た静脈血からFicoll-PaqueTM gradient（Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）を用いて末梢血リンパ球を分離した。リンパ球の全RNAをRneasy（Qiagen, Valencia, CA）を用いて抽出し、TaqMan universal master mix and Assay-on-DemandTM gene expression kit（Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA）を用いて定量的リアルタイムPCR法により発現量を測定した。内部コントロールにはGAPDHを用いた。
【００２９】
６．ルシフェラーゼレポーターベクター
CYFIP2イントロン1のCY-In1-8T/C多型、CY-In1-9G/A多型、CY-In1-10A/G多型のそれぞれのいずれかを含む領域を、これらの多型のヘテロ接合体者由来のDNAを使用し、以下に示すプライマーを用いてPCR法により増幅した。
・  CY-In1-8（384bp）に対しては、5'-NNCGGGATCCAGAAGCAAAACCCTGTGTCC（配列番号3）と5'-NNCGGGATCCCATGCTACACCCCAGTGATG（配列番号4）
・  CY-In1-9（190bp）に対しては、5'-NNCGGGATCCCAGAAGGCAGAGGGGTAACA（配列番号5） と5'-NNCGGGATCCGGATCATGTGGGCAGGTC（配列番号6）
・  CY-In1-10（175bp）に対しては、5'-NNCGGGATCCGGAACCCAGGCATTGTGTTA（配列番号7） と5'-NNCGGGATCCAGGGCTCATGCTCACATTTT（配列番号8）である。
BamHIでPCR産物を37℃で一晩切断し、切断後のPCR産物を精製したのちpGL3-Promoter Vector（Promega, Madison, WI）のBamHIサイトに挿入した。CY-In1-8フラグメントはBamHIサイトを有しており、BamHIを用いて切断した産物の長さは204bpであった。pGL3-Promoter Vectorにサブクローニングされた配列はダイレクトシークエンス法により確認した。
【００３０】
７．トランスフェクション
CYFIP2発現の確認は、Jurkat, 293T, U937, HL60, K562, Eol3それぞれの細胞株を用いてRT-PCRにより行った。これらの細胞株のうち、Jurkat, 293T, U937, K562においてCYFIP2は発現していたが、HL60とEol3においては発現は認められなかった（データは示さない）。
CYFIP2の発現が確認されたK562細胞株（the Cell Resource Center for Biomedical Research, Tohoku University, Miyagi, Japan）を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。K562細胞を、10%胎児牛血清（FCS）（Sigma-Aldrich）を含むRPMI1640溶液で培養し、約1×106個の細胞に対し、2μgのルシフェラーゼレポーターベクターと25ngのpPL-TKベクター（Promega）をリポフェクション法（TransFast, Promega）により細胞導入した。導入後の細胞は、培養器で48時間培養後、500μlの溶解液（Promega）を添加して溶解した。20μlの溶解液中のルシフェラーゼ活性を、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）を用いて測定した。ホタルルシフェラーゼ活性を内部コントロールとして同時に測定したウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。レポーター活性の値は、3つの独立した値の平均値とした。
【００３１】
８．ゲルシフトアッセイ
U937細胞の核抽出物は、前に報告された方法にしたがって抽出した（Andrews, N.C. & Faller, D.V. A rapid micropreparation technique for extraction of DNA-binding proteins from limiting numbers of mammalian cells. Nucleic Acids Res 19, 2499. (1991).）。ゲルシフトアッセイに用いたプローブの配列は以下の通りである。
・CY-In1-8Tに対しては、5'-CATAAAGTTATAATTTTATTT（配列番号9）と5'-AAATAAAATTATAACTTTATG（配列番号10）
・CY-In1-8Cに対しては、5'-CATAAAGTTACAATTTTATTT（配列番号11）と5'-AAATAAAATTGTAACTTTATG（配列番号12）
・CY-In1-9Gに対しては、5'-GGGCAGTGTGGGGGAGGGAG（配列番号13）と5'-CTCCCTCCCCCACACTGCCC（配列番号14）
・CY-In1-9Aに対しては、5'-GGGCAGTGTAGGGGAGGGAG（配列番号15）と5'-CTCCCTCCCCTACACTGCCC（配列番号16）
・CY-In1-10Aに対しては、5'-TTGGTATGAAATAAACCTCCA（配列番号17）と5'-TGGAGGTTTATTTCATACCAA（配列番号18）
・CY-In1-10Gに対しては、5'-TTGGTATGAAGTAAACCTCCA（配列番号19）と5'-TGGAGGTTTACTTCATACCAA（配列番号20）
二本鎖オリゴヌクレオチドを、T4 polynucleotide kinase（Takara Bio, Otsu, Japan）を用いてγ-32P-dATPでラベルし、U937核抽出物とともに氷の上で30分反応させた。DNA-蛋白質複合体を5%ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、オートラジオグラフィーにより視覚化した。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、個人が、喘息および／またはアレルギー性鼻炎の素因を有するか否かを評価するための方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】（a）は、ダニ反応性喘息小児喘息患者を発端者とする喘息家系47家系を用いた5q33領域連鎖解析のマキシマムロッドスコアのプロットである。（b）は、155喘息家系を用いた連鎖伝達不平衡テスト（TDT）による関連解析の結果である。27マイクロサテライトマーカーによる連鎖解析の結果から95%の確率で喘息疾患感受性遺伝子が存在する領域を確定し、領域内に存在する26遺伝子105多型について解析した。Y軸は-log10（P値）に対応し、X軸は多型の染色体上の位置に対応する。（c）(b)で関連が認められたCYFIP2遺伝子多型周辺0.8Mb領域の連鎖不平衡値（D'）を示す。
【図２】K562細胞に導入されたレポーター遺伝子ベクター（ベクターにはCY-In1-8T/C, CY-In1-9G/A, CY-In1-10A/Gのそれぞれのいずれかを含む）のルシフェラーゼ活性を示す。各ベクターにおけるホタルルシフェラーゼ活性は、同時に細胞導入されたpRL-TKプラスミド（内部コントロールプラスミド）によるウミシイタケルシフェラーゼ活性を用いて標準化し、相対的ルシフェラーゼ活性として表した。棒グラフは3つの独立した値の平均値を示し標準偏差はエラーバーによって表した。統計解析はStudent'tテストによりおこなった。
【図３】イントロン1内のCYFIP2フラグメントのゲルシフトアッセイ。CY-In1-9G/A多型を含むフラグメントとCY-In1-10A/G多型を含むフラグメントをそれぞれ合成し、DNAプローブとして用いた。放射性標識していない100倍過剰量のオリゴヌクレオチドの存在下で反応させたもの（レーン2,4,6,8）と非存在下で反応させたもの（レーン1,3,5,7）をそれぞれ検討した。
【図４】様々な組織におけるCYFIP2の発現を示す。PCRはエクソン16とエクソン20の間のプライマーを設計して行った。PCR産物はほとんどの組織において認められた。
【図５】リンパ球におけるCYFIP2, ITK, CRSP9の発現の相関を示す。これらの遺伝子発現は、リアルタイム定量的PCR法により定量化した。CYFIP2の発現レベルは、ITKの発現レベルと強く相関していたが（r=0.73, p<0.0001, n=25）、CRSP9の発現レベルとは相関していなかった（r=0.12, p=0.56, n=25）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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