(57)【要約】【課題】  非特異吸着を抑制したバイオセンサー用検出表面を提供すること。【解決手段】  疎水性高分子でコーティングされた金属表面あるいは金属膜からなり、バイオセンサーの表面の一部が、生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーを用いて修飾されているバイオセンサー。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性高分子でコーティングされた金属表面あるいは金属膜からなり、バイオセンサーの表面の一部が、生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーを用いて修飾されているバイオセンサー。
【請求項２】
バイオセンサーの表面に少なくとも２種類以上の修飾がされており、生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーを用いて少なくとも１種の修飾がされている、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーが、親水性リンカーである、請求項１又は２に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端が、イミノ二酢酸（IDA）又はニトリロ三酢酸（NTA）である、請求項１から３の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項５】
金属表面あるいは金属膜が、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである、請求項１から４の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項６】
金属膜の厚さが５オングストローム以上５０００オングストローム以下である、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項７】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さが１オングストローム以上５０００オングストローム以下である、請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項８】
非電気化学的検出に使用される、請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項９】
表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項１から８の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、上記誘電体ブロックと上記金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている上記の測定チップに形成されている、請求項１から９の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
金属表面あるいは金属膜を疎水性高分子化合物でコーティングする工程、及び生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーを用いてバイオセンサーの表面の一部を修飾する工程を含む、請求項１から１０の何れかに記載のバイオセンサーの製造方法。
【請求項１２】
生理活性物質が金属との結合により表面に結合している、請求項１から１０の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
請求項１から１０の何れかに記載のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を金属との結合により結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法。
【請求項１４】
生理活性物質が金属との結合により表面に結合している請求項１から１０の何れかに記載のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
【請求項１５】
生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。
【０００６】
一方、生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定する場合、検体物質は必ずしも単一成分ではなく、例えば細胞抽出液中などのような不均一系で検体物質を測定することも要求される。その場合、種々の蛋白質、脂質などの夾雑物が検出表面に非特異的な吸着を起こすと、測定検出感度が著しく低下する。上記の検出表面では、非特異吸着が極めて起こりやすく問題があった。
【０００７】
この問題を解決するためにいくつかの方法が検討されている。例えば、金属表面にリンカーを介し、親水性のハイドロゲルを固定化することで、物理吸着を抑制する方法も使用されてきた（特許文献１、特許文献３及び特許文献４を参照）。しかしながら、この方法でも非特異吸着の抑制性は十分なレベルではなかった。
【０００８】
また、特許文献５には、生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と固定化部位以外のバックグラウンド部を有する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用バイオチップであり、２．５ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）溶液と接触させたのちに、分子量が２０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のヒスチジンタグを有する蛋白質が濃度０．１μｇ／ｍｌで溶解しているｐＨ７．２のＨｅｐｅｓ緩衝液が３０℃にてチップ表面に５分間接触させた後に、該緩衝液で３分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するニッケルとヒスチジンタグ付蛋白質によって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であることを特徴とするＳＰＲ測定用バイオチップが記載されており、具体例の一つとして、固定化部位に導入されている官能基がニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基であるバイオチップが記載されている。しかしながら、この方法でも非特異吸着の抑制性は十分なレベルではなかった。
【０００９】
【特許文献１】特許第２８１５１２０号
【特許文献２】特開平９−２６４８４３号
【特許文献３】米国特許第５４３６１６１号
【特許文献４】特開平８−１９３９４８号公報
【特許文献５】特開２００４−１２５４６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、非特異吸着を抑制したバイオセンサー用検出表面を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、金属表面あるいは金属膜の表面を疎水性高分子化合物でコーティングし、さらにその表面の一部を、生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーを用いて修飾することによって、非特異吸着を抑制したバイオセンサーを提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明によれば、疎水性高分子でコーティングされた金属表面あるいは金属膜からなり、バイオセンサーの表面の一部が、生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーを用いて修飾されているバイオセンサーが提供される。
【００１３】
好ましくは、バイオセンサーの表面に少なくとも２種類以上の修飾がされており、生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーを用いて少なくとも１種の修飾がされている。
【００１４】
好ましくは、生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーは、親水性リンカーである。
好ましくは、生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端は、イミノ二酢酸（IDA）又はニトリロ三酢酸（NTA）である。
【００１５】
好ましくは、金属表面あるいは金属膜は、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである。
好ましくは、金属膜の厚さは５オングストローム以上５０００オングストローム以下である。
好ましくは、疎水性高分子化合物のコーティング厚さは１オングストローム以上５０００オングストローム以下である。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、非電気化学的検出に使用され、特に好ましくは表面プラズモン共鳴分析に使用される。
【００１６】
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、上記誘電体ブロックと上記金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている上記の測定チップに形成されている。
【００１７】
本発明の別の側面によれば、金属表面あるいは金属膜を疎水性高分子化合物でコーティングする工程、及び生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーを用いてバイオセンサーの表面の一部を修飾する工程を含む、本発明のバイオセンサーの製造方法が提供される。
【００１８】
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が金属との結合により表面に結合している、上記した本発明のバイオセンサーが提供される。
【００１９】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を金属との結合により結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法が提供される。
【００２０】
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が金属との結合により表面に結合している本発明のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質は、非電気化学的方法により検出または測定され、さらに好ましくは表面プラズモン共鳴分析により検出または測定される。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、非特異吸着を抑制したバイオセンサー用検出表面を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明のバイオセンサーは、疎水性高分子でコーティングされた金属表面あるいは金属膜からなり、バイオセンサーの表面の一部が、生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーを用いて修飾されていることを特徴とするバイオセンサーである。
【００２３】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００２４】
本発明で用いる疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００２５】
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００２６】
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００２７】
本発明では、フッ素原子で置換されたアルキル基を有する疎水性高分子化合物を用いることもできる。フッ素原子で置換されたアルキル基を有する疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００２８】
フッ素原子で置換されたアルキル基を有する疎水性高分子化合物は、フッ素化アルキル基をエステルとして分子内に持つことが好ましい。特に、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステルが好ましい。
【００２９】
フッ素化アルキル基は、炭素数１以上であって、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよい（以下、フッ素原子で置換されたアルキル基を「Ｒｆ」という）。
【００３０】
Ｒｆは、炭素数１以上の少なくとも１つのフッ素原子で置換されたアルキル基であり、Ｒｆは少なくとも１つのフッ素原子で置換されていればよく、直鎖状、分岐状および環状のいずれの構造であってもよい。また、フッ素原子以外の置換基でさらに置換されていてもよいし、フッ素原子のみで置換されていてもよい。
【００３１】
Ｒｆのフッ素原子以外の置換基としては、アルケニル基、アリール基、アルコキシル基、フッ素以外のハロゲン原子、カルボン酸エステル基、カルボンアミド基、カルバモイル基、オキシカルボニル基、燐酸エステル基等が挙げられる。
【００３２】
Ｒｆとしては、炭素数１〜１６のフッ素置換アルキル基が好ましく、炭素数１〜１２がより好ましく、炭素数４〜１０がさらに好ましい。Ｒｆの好ましい例を以下に示す。
【００３３】
【化１】
2006084282.tif 000002
【００３４】
Ｒｆとしてさらに好ましくは、末端がトリフルオロメチル基で置換された炭素数４〜１０のアルキル基であり、特に好ましくは−（ＣＨ2）n1−（ＣＦ2）n2Ｆで表される炭素数３〜１０のアルキル基である（ｎ1は１〜６の整数を表す。ｎ2は３〜８の整数を表す）。具体的には、−ＣＨ2−（ＣＦ2）2Ｆ、−（ＣＨ2）6−（ＣＦ2）4Ｆ、−（ＣＨ2）3−（ＣＦ2）4Ｆ、−ＣＨ2−（ＣＦ2）3Ｆ、−（ＣＨ2）2−（ＣＦ2）4Ｆ、−（ＣＨ2）3−（ＣＦ2）4Ｆ、−（ＣＨ2）6−（ＣＦ2）4Ｆ、−（ＣＨ2）2−（ＣＦ2）6Ｆ、−（ＣＨ2）3−（ＣＦ2）6Ｆ、−（ＣＨ2）2−（ＣＦ2）6Ｆ等が挙げられる。これらの中でも、特に、−（ＣＨ2）2−（ＣＦ2）4Ｆおよび−（ＣＨ2）2−（ＣＦ2）6Ｆが最も好ましい。
【００３５】
フッ素原子で置換されたアルキル基を有する疎水性高分子化合物は、その他のモノマーとの共重合体でもよい。その場合、共重合体の例としては、メチルメタクリレートなどのメタクリル酸エステル、メチルアクリレートなどのアクリル酸エステル、もしくはスチレンが好ましい。
【００３６】
フッ素原子で置換されたアルキル基を有する疎水性高分子化合物の具体例としては以下のものが挙げられる。
【００３７】
【化２】
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【００３８】
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布（スピンコート法）、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。上記のうち、スピン塗布（スピンコート法）と浸漬法についてさらに詳細に説明する。
【００３９】
スピンコート法とは、回転する円盤上等の基板に、溶液を滴下し、薄膜を製造する方法であり、溶液の濃度、円盤の回転数、溶剤の蒸気圧等により膜厚を制御する方法である。
【００４０】
スピンコート法において使用される溶液中の疎水性高分子化合物の濃度は、0.001重量％以上50重量％以下が好ましく、0.01重量％以上10重量％以下がより好ましく、0.1重量％以上5重量％以下がさらに好ましい。
【００４１】
スピンコート時の円盤の回転数は、10rpm以上10,000rpm以下が好ましく、50rpm以上7500rpm以下がより好ましく、100rpm以上5000rpm以下がさらに好ましい。
【００４２】
スピンコート法において使用される溶剤は、スピンコートによる薄膜製造時の環境温度における蒸気圧が0.1kPa以上100kPa以下であることが好ましく、0.5kPa以上50kPa以下がより好ましく、1kPa以上30kPa以下がさらに好ましい。使用できる溶剤の具体例としては、メタノール、エタノール、i-プロパノール、n-ブタノール、t-ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、などが挙げられる。
【００４３】
本発明のバイオセンサーの製造方法は、円盤上に保持されている基板表面に塗布液を滴下した後、円盤を回転させることが好ましい。
【００４４】
また、塗布液を基板表面に滴下する際、基板表面に対する被覆率が８０％以上１００％以下であることが好ましく、９０％以上１００％以下であることがより好ましい。
【００４５】
浸漬法は、基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させた後に、前記疎水性高分子化合物溶液を含まない液に接触させる方法でコーティングを行う。好ましくは、疎水性高分子化合物溶液の溶剤と疎水性高分子化合物を含まない液の溶剤とは、同一の溶剤である。
【００４６】
浸漬法では、疎水性高分子化合物のコーティング用溶剤を適切に選択することで、基板の凹凸、曲率、形状などに依らず基板表面に均一なコーティング厚みの疎水性高分子化合物層が得られる。
【００４７】
浸漬法のコーティング用溶剤は特に限定されず、疎水性高分子化合物の一部を溶解すれものであれば任意の溶剤を用いることができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のホルムアミド系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、フェノキシエタノール等のアルコール系溶剤、２−ブタノン等のケトン系溶剤、トルエン等のベンゼン系溶剤などを使用することができるが、これらに限定されない。
【００４８】
基板に接触させる疎水性高分子化合物の溶液は、疎水性高分子化合物が完全に溶解しても、疎水性高分子化合物の不溶解成分を含む懸濁液でもよい。液温は、疎水性高分子化合物の一部が溶解する液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を疎水性高分子化合物の溶液に接触させている間に液温を変動させても良い。溶液の疎水性高分子化合物濃度に特に制限はないが、好ましくは０．０１％以上３０％以下、さらに好ましくは０．１％以上１０％以下である。
【００４９】
固体基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。
【００５０】
疎水性高分子化合物を含まない液としては、溶剤自身のＳＰ値（単位：(Ｊ／ｃｍ3)1/2）と疎水性高分子化合物のＳＰ値との差が、１以上２０以下であることが好ましく、３以上１５以下であることがさらに好ましい。ＳＰ値は、分子間の凝集エネルギー密度の平方根で表され、溶解度パラメーターとも呼ばれる。本発明では、ＳＰ値δは下記式で算出した。各官能基の凝集エネルギーＥｃｏｈとモル容積Ｖは、Ｆｅｄｏｒｓが規定した値を使用した（Ｒ．Ｆ．Ｆｅｄｏｒｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．、１４（２）、Ｐ１４７、Ｐ４７２（１９７４））。
δ＝（ΣＥｃｏｈ／ΣＶ）1/2
疎水性高分子化合物および溶剤のＳＰ値の例を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（１：１）：２１.０に対する溶剤２−フェノキシエタノール：２５.３、ポリメチルメタクリレート：２０.３に対する溶剤アセトニトリル：２２.９、ポリスチレン：２１.６に対する溶剤トルエン：１８.７である。
【００５１】
基板を、疎水性高分子化合物を含まない液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。液温は、溶剤が液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を溶剤に接触させている間に液温を変動させてもよい。揮発させにくい溶剤を使用する場合、溶剤を除去する目的で、該溶媒に接触させた後、互いに溶解する揮発性溶剤で置換してもよい。
【００５２】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは１オングストローム以上５０００オングストローム以下であり、特に好ましくは１０オングストローム以上３０００オングストローム以下である。
【００５３】
本発明のバイオセンサーは、金属表面又は金属膜を疎水性高分子化合物でコーティングしたものである。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００５４】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。
【００５５】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００５６】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００５７】
本発明のバイオセンサーの表面の一部は、生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーを用いて修飾されている。より具体的には、本発明のバイオセンサーの表面には少なくとも２種類以上の修飾がされており、生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーを用いて少なくとも１種の修飾がされている。
【００５８】
本発明で言う、生理活性物質と親和性を有する金属（リンカーとキレートを形成できる金属）の具体例としては、Ni、Fe、Ca、Mg、Al、Cuなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。上記の中で特に好ましい金属は、Niである。
【００５９】
本発明で用いる生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーは、好ましくは親水性リンカーであり、例えば、ポリエチレングリコールから成るリンカーなどが挙げられる。
【００６０】
また、生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端の具体例としては、イミノ二酢酸（IDA）又はニトリロ三酢酸（NTA）などが挙げられる。
【００６１】
本発明で用いられるイミノ二酢酸（IDA）は、下記構造を持つものが好ましく用いられる。本発明で用いられるニトリロ三酢酸（NTA）は、下記構造を持つものが好ましく用いられる。Ｒは、水素原子又は各種の官能基（例えば、アミノ基など）が挙げられる。例えば、Ｒがアミノ基である化合物は、AB-NTAとして（株）同仁化学研究所より入手することができる。
【００６２】
【化３】
2006084282.tif 000004
【００６３】
本発明で用いられるイミノ二酢酸（IDA）、ニトリロ三酢酸（NTA）末端を持つリンカーは、疎水性ポリマー膜にリンカーを反応させた後、逐次でIDA化又はNTA化してもよいし、あるいはリンカーとIDA又はNTAを先に反応させておき、次いで疎水性ポリマー膜にリンカーを反応させてもよい。
【００６４】
上記のようにして、生理活性物質と親和性を有する金属とキレートを形成できる末端を持つリンカーを、金属表面又は金属膜に固定化した後に、生理活性物質と親和性を有する金属を基板に接触させて上記リンカーに金属をキレートさせ、その後、生理活性物質を接触させることにより、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。即ち、本発明では、リンカーとキレートを形成した金属に生理活性物質を結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００６５】
本発明のバイオセンサー用表面上に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００６６】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００６７】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００６８】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００６９】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００７０】
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質である場合、生理活性物質にポリヒスチジンタグを予め付けておき、そのポリヒスチジンタグとニッケル等の金属との親和性を利用することによって、バイオセンサーの表面に生理活性物質を固定化することができる。
【００７１】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００７２】
即ち、本発明によれば、生理活性物質が固定化された本発明のバイオセンサーを用いて、これに被験物質を接触させることにより、該バイオセンサーに固定化されている生理活性物質と相互作用する物質を検出及び／又は測定する方法が提供される。
被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。
【００７３】
本発明では、バイオセンサー用表面に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００７４】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００７５】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００７６】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００７７】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００７８】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００７９】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００８０】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００８１】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００８２】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００８３】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００８４】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００８５】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００８６】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００８７】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００８８】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００８９】
本発明では、前記誘電体ブロックは、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されており、前記金属膜が疎水性高分子化合物でコーティングされていることが好ましい。
【００９０】
本発明では、具体的には、特開２００１−３３０５６０号公報記載の図１〜図３２で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置、特開２００２−２９６１７７号公報記載の図１〜図１５で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置を好ましく用いることができる。特開２００１−３３０５６０号公報および特開２００２−２９６１７７号公報に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。
【００９１】
例えば、特開２００１−３３０５６０号公報記載の表面プラズモン共鳴測定装置としては、例えば、誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる薄膜層、およびこの薄膜層の表面上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる複数の測定ユニットと、これら複数の測定ユニットを支持した支持体と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、表面プラズモン共鳴による全反射減衰の状態を検出する光検出手段と、前記複数の測定ユニットの各誘電体ブロックに関して順次前記全反射条件および種々の入射角が得られるように、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、各測定ユニットを順次前記光学系および光検出手段に対して所定位置に配置する駆動手段とを備えてなることを特徴とする表面プラズモン共鳴測定装置が挙げられる。
【００９２】
なお、上記の測定装置においては、例えば前記光学系および光検出手段が静止状態に保たれるものとされ、前記駆動手段が、前記支持体を移動させるものとされる。
【００９３】
その場合、前記支持体は、回動軸を中心とする円周上に前記複数の測定ユニットを支持するターンテーブルであり、また前記駆動手段は、このターンテーブルを間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、この支持体を前記複数の測定ユニットの並び方向に間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。
【００９４】
一方、上記とは反対に、前記支持体が静止状態に保たれるものであり、前記駆動手段が、前記光学系および光検出手段を移動させるものであっても構わない。
【００９５】
その場合、前記支持体は、円周上に前記複数の測定ユニットを支持するものであり、前記駆動手段は、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。
【００９６】
他方、前記駆動手段が、その回動軸を支承するころがり軸受けを有するものである場合、この駆動手段は、該回動軸を一方向に回動させて前記複数の測定ユニットに対する一連の測定が終了したならば、この回動量と同量だけ該回動軸を他方向に戻してから、次回の一連の測定のためにこの回動軸を前記一方向に回動させるように構成されることが望ましい。
【００９７】
また上記の測定装置においては、前記複数の測定ユニットが連結部材により１列に連結されてユニット連結体を構成し、前記支持体が、このユニット連結体を支持するように構成されていることが望ましい。
【００９８】
また上記の測定装置においては、前記支持体に支持されている複数の測定ユニットの各試料保持機構に、自動的に所定の試料を供給する手段が設けられることが望ましい。
【００９９】
さらに上記の測定装置においては、前記測定ユニットの誘電体ブロックが前記支持体に固定され、測定ユニットの薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが上記誘電体ブロックに対して交換可能に形成されていることが望ましい。
【０１００】
そして、このような測定チップを適用する場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、前記誘電体ブロックと組み合う状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。
【０１０１】
あるいは、測定ユニットの誘電体ブロック、薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが前記支持体に対して交換可能に形成されてもよい。
【０１０２】
測定チップをそのような構成とする場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、支持体に支持される状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。
【０１０３】
他方、前記光学系は、光ビームを誘電体ブロックに対して収束光あるいは発散光の状態で入射させるように構成され、そして前記光検出手段は、全反射した光ビームに存在する、全反射減衰による暗線の位置を検出するように構成されることが望ましい。
【０１０４】
また上記光学系は、光ビームを前記界面にデフォーカス状態で入射させるものとして構成されることが望ましい。そのようにする場合、光ビームの上記界面における、前記支持体の移動方向のビーム径は、この支持体の機械的位置決め精度の１０倍以上とされることが望ましい。
【０１０５】
さらに上記の測定装置において、測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光源は前記支持体より上の位置から下方に向けて前記光ビームを射出するように配設され、前記光学系は、前記下方に向けて射出された前記光ビームを上方に反射して、前記界面に向けて進行させる反射部材を備えていることが望ましい。
【０１０６】
また、上記の測定装置において、前記測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光学系は、前記光ビームを前記界面の下側から該界面に入射させるように構成され、前記光検出手段は前記支持体よりも上の位置で光検出面を下方に向けて配設されるとともに、前記界面で全反射した光ビームを上方に反射して、前記光検出手段に向けて進行させる反射部材が設けられることが望ましい。
【０１０７】
他方、上記の測定装置においては、前記支持体に支持される前および／または支持された後の前記測定ユニットを、予め定められた設定温度に維持する温度調節手段が設けられることが望ましい。
【０１０８】
また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された測定ユニットの試料保持機構に貯えられた試料を、前記全反射減衰の状態を検出する前に撹拌する手段が設けられることが望ましい。
【０１０９】
また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された複数の測定ユニットの少なくとも１つに、前記試料の光学特性と関連した光学特性を有する基準液を供給する基準液供給手段が設けられるとともに、前記光検出手段によって得られた、試料に関する前記全反射減衰の状態を示すデータを、前記基準液に関する前記全反射減衰の状態を示すデータに基づいて補正する補正手段が設けられることが望ましい。
【０１１０】
そのようにする場合、試料が被検体を溶媒に溶解させてなるものであるならば、前記基準液供給手段は、基準液として前記溶媒を供給するものであることが望ましい。
【０１１１】
さらに、上記の測定装置は、測定ユニットの各々に付与された、個体識別情報を示すマークと、測定に使用される測定ユニットから前記マークを読み取る読取手段と、測定ユニットに供給される試料に関する試料情報を入力する入力手段と、測定結果を表示する表示手段と、この表示手段、前記入力手段および前記読取手段に接続されて、各測定ユニット毎の前記個体識別情報と前記試料情報とを対応付けて記憶するとともに、ある測定ユニットに保持された試料について求められた測定結果を、その測定ユニットに関して記憶されている前記個体識別情報および前記試料情報と対応付けて前記表示手段に表示させる制御手段とを備えることが望ましい。
【０１１２】
上記した測定装置を用いて生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する場合、前記測定ユニットの１つにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出した後、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、別の測定ユニットにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出し、その後前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、前記１つの測定ユニットにおける試料に関して、再度全反射減衰の状態を検出することにより測定を行うことができる。
【０１１３】
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１１４】
実施例１：
以下の方法で、本発明のセンサチップを作成した。
（１）プラスチックプリズム上への金製膜
ゼオネックス（日本ゼオン社製）を射出成型して得られたプラスチックプリズム（図１）の上面に以下の方法で金薄膜を製膜した。
【０１１５】
（１−１）金製膜
スパッタ装置の基板ホルダにプリズムを取付け、真空（ベースプレッシャー1×10-3Pa以下）に引いてからArガスを導入し（1Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、基板ホルダにRFパワー（0.5kW）を約9分間印加してプリズム表面をプラズマ処理する。次に、Arガスを止めて真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（10〜40rpm）させながら、8inchのCrターゲットにDCパワー（0.2kW）を約30秒間印加して2nmのCr薄膜を成膜する。次に。Arガスを止めて再び真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー（1kW）を約50秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜する。得られた試料をチップＡと呼ぶ。
【０１１６】
（２）ポリマー塗布
チップＡの金薄膜上に以下の方法でポリマー薄膜を製膜した。
【０１１７】
（２−１）ポリマー溶液Ａの調製
ポリマー(F-1) 1.5gを脱水MiBK 100mLに溶解し、孔径0.45μmのミクロフィルターで濾過する。脱水MiBKの含水率は20ppm。これをポリマー溶液Ａとする。
【０１１８】
【化４】
2006084282.tif 000005
【０１１９】
（２−２）スピンコート
チップＡをスピンコーター（SC-408S試料密閉型スピンコータ−、有限会社押鐘製）にセットする。チップＡはスピンコーターの中心から135mmの位置に図２に示すように固定する。ポリマー溶液Ａ 200μLをチップＡの金膜全面を覆うようにキャストする。次に、チップＡを完全に覆うように風よけカバーをセットする。その後、200rpmで60秒間スピンする。回転が停止した後、5分間そのまま静置する。
【０１２０】
（２−３）真空乾燥
ポリマーをスピンコートしたチップＡを16時間真空乾燥する。得られた試料をチップＢと呼ぶ。
【０１２１】
（３）ポリマー表面の加水分解
以下の方法で、チップＢのポリマー薄膜表面を加水分解して、最表面にCOOH基を発生させた。
【０１２２】
（３−１）加水分解
1N NaOH溶液にチップＢを浸漬し、60℃の恒温槽で16時間保管する。
【０１２３】
（３−２）洗浄
60℃の恒温槽から取り出した後、15分間自然冷却し、その後、超純水で洗浄する。得られた試料をチップＣと呼ぶ。
【０１２４】
（４）5アミノ吉草酸結合
以下の方法で、チップＣの表面に存在するCOOH基に5アミノ吉草酸反応を共有結合させた。
【０１２５】
（４−１）活性化液、5アミノ吉草酸溶液の調製
0.1M NHS溶液：  1.16gのNHSを超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液：  7.7gのEDCを超純水で溶解し100mLにする。
1M 5アミノ吉草酸溶液：  11.7gの5アミノ吉草酸を超純水80mLで溶解し、1N NaOHを用いてpH8.5に調整する。さらに超純水を加え100mLにする。
【０１２６】
（４−２）活性化
エアガンでチップＣの水切りを行う。チップＣを湿箱（濡れ布を敷いたタイトボックス、密封した状態で湿度90%RH以上に保つ）にセットし、0.1M NHS溶液100μLと0.4M EDC溶液100μLの混合液200μLをキャストする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのＰＥＴフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は26である。湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
【０１２７】
（４−３）洗浄
湿箱から取り出した試料からPETフイルムを取り外し、純水で洗浄する。得られた試料をチップＤと呼ぶ。
【０１２８】
（４−４）5アミノ吉草酸反応
5アミノ吉草酸反応は活性化反応終了後1時間以内に開始する。先ずエアガンでチップＤの水切りを行う。チップＤを湿箱にセットし、1M 5アミノ吉草酸溶液200μLをキャストする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのＰＥＴフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は24である。湿箱を密閉して、25℃で90分静置する。
【０１２９】
（４−５）洗浄
湿箱から取り出した試料からPETフイルムを取り外し、純水で洗浄する。得られた試料をチップＥと呼ぶ。
【０１３０】
（５）リガンド非結合部のパターン形成
以下の方法で、チップＥの表面に、リガンドが結合できない部分のパターンを形成した。具体的には、チップＥの特定の場所において、5アミノ吉草酸のCOOH基にPEG5000を共有結合させた。PEG5000の末端はメトキシ基なので、リガンドと共有結合を形成することができない。この部分は、アナライトの結合測定時にリファレンス部として計測される。
【０１３１】
（５−１）反応液の調製
20％ PEG5000溶液：  4.5gのPEG5000（α-アミノ-ω-メトキシ-ポリエチレングリコール）を超純水18.5mLと1N NaOH 4mLで溶解する。
0.2M NHS溶液：  2.32gのNHSを超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液：  7.7gのEDCを超純水で溶解し100mLにする。
【０１３２】
（５−２）パターン化反応
エアガンでチップＥの水切りを行い、武蔵エンジニアリング社製ディスペンサーの台座に固定する。次に、シリンジに20% PEG5000溶液1mLと0.2M NHS溶液１mLと0.4M EDC溶液2mLの混合液を投入する。チップＥに18mm間隔で15μLづつ6点、前記混合液をスポッティングする。液滴の直径は約4mmとなる。スポッティングを行ったチップＥを湿箱にセットし、湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
【０１３３】
（５−３）洗浄
湿箱から取り出した試料を1Nクエン酸水溶液で洗浄し、さらに純水で洗浄する。得られた試料をチップＦと呼ぶ。
【０１３４】
（６）PEGリンカー結合
以下の方法で、チップＦの表面に存在する5アミノ吉草酸のCOOH基にPEGリンカーを共有結合させた。PEGリンカーはパターン化した表面には結合しない。
【０１３５】
（６−１）活性化液、PEGリンカー溶液の調製
0.1M Sulfo-NHS溶液：  2.04gのNHS（N-hydroxysulfosuccinimide）を超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液：  7.7gのEDC（1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride）を超純水で溶解し100mLにする。
10％ PEGリンカー溶液：  10gのPEGリンカー（α-アミノ-ω-カルボキシル-ポリエチレングリコール）を超純水80mLで溶解し、1N NaOHを用いてpH8.5に調整する。さらに超純水を加え100mLにする。
【０１３６】
（６−２）活性化
エアガンでチップＦの水切りを行う。チップＦを湿箱にセットし、0.1M Sulfo-NHS溶液100μLと0.4M EDC溶液100μLの混合液200μLをキャストする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのＰＥＴフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は26である。湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
【０１３７】
（６−３）洗浄
湿箱から取り出した試料からPETフイルムを取り外し、純水で洗浄する。得られた試料をチップＧと呼ぶ。
【０１３８】
（６−４）PEGリンカー反応
PEGリンカー反応は活性化反応終了後1時間以内に開始する。先ずエアガンでチップＧの水切りを行い、武蔵エンジニアリング社製ディスペンサーの台座に固定する。次に、シリンジに10%PEGリンカー溶液5mLを投入する。チップＧに18mm間隔で8μLづつ6点、10%PEGリンカー溶液をスポッティングする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのＰＥＴフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は90である。この試料を湿箱にセットし、湿箱を密閉して、25℃で16時間静置する。
【０１３９】
（６−５）洗浄
湿箱から取り出した試料を純水で洗浄する。得られた試料をチップＨと呼ぶ。
【０１４０】
（６−６）保管
エアガンでチップＨの水切りを行い保管する。
【０１４１】
（７）NTA結合
以下の方法で、チップＨの表面に存在するPEGリンカーのCOOH基にNTAを共有結合させた。NTAはパターン化した表面には結合しない。
【０１４２】
（７−１）活性化液、NTA溶液の調製
0.1M Sulfo-NHS溶液：  2.04gのSulfo-NHSを超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液：  7.7gのEDCを超純水で溶解し100mLにする。
1MNTA溶液：  3.24gのAB-NTA（（株）同仁化学研究所）を超純水を加え10mLにする。
【０１４３】
（７−２）活性化
エアガンでチップHの水切りを行う。チップHを湿箱にセットし、0.1M Sulfo-NHS溶液100μLと0.4M EDC溶液100μLの混合液200μLをキャストする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのＰＥＴフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は26である。湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
【０１４４】
（７−３）洗浄
湿箱から取り出した試料からPETフイルムを取り外し、純水で洗浄する。得られた試料をチップIと呼ぶ。
【０１４５】
（７−４）NTA反応
NTA反応は活性化反応終了後1時間以内に開始する。先ずエアガンでチップIの水切りを行い、武蔵エンジニアリング社製ディスペンサーの台座に固定する。次に、シリンジに1MNTA溶液5mLを投入する。チップIに18mm間隔で8μLづつ6点、1MNTA溶液をスポッティングする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのＰＥＴフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は90である。この試料を湿箱にセットし、湿箱を密閉して、25℃で16時間静置する。
【０１４６】
（７−５）洗浄
湿箱から取り出した試料を純水で洗浄する。得られた試料をチップJと呼ぶ。
【０１４７】
（７−６）保管
エアガンでチップJの水切りを行い保管する。
【０１４８】
比較例１
以下の方法で、比較のセンサチップを作成した。
（１）プラスチックプリズム上への金製膜
ゼオネックス（日本ゼオン社製）を射出成型して得られたプラスチックプリズム（図１）の上面に以下の方法で金薄膜を製膜した。
【０１４９】
（１−１）金製膜
スパッタ装置の基板ホルダにプリズムを取付け、真空（ベースプレッシャー1×10-3Pa以下）に引いてからArガスを導入し（1Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、基板ホルダにRFパワー（0.5kW）を約9分間印加してプリズム表面をプラズマ処理する。次に、Arガスを止めて真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（10〜40rpm）させながら、8inchのCrターゲットにDCパワー（0.2kW）を約30秒間印加して2nmのCr薄膜を成膜する。次に。Arガスを止めて再び真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー（1kW）を約50秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜する。得られた試料をチップＡと呼ぶ。
【０１５０】
（２）自己組織化膜（SAM）表面の作製
以下の方法で、金膜の表面に自己組織化膜を形成した。
16-メルカプトヘキサデカノン酸（アルドリッチ社製）28.8mgをエタノール100mlに溶解し、チップＡを16時間浸漬する。その後、エタノールで５回洗浄した後、超純水で５回洗浄する。得られた試料をチップKと呼ぶ。
【０１５１】
（３）リガンド非結合部のパターン形成
以下の方法で、チップKの表面に、リガンドが結合できない部分のパターンを形成した。具体的には、チップKの特定の場所において、5アミノ吉草酸のCOOH基にPEG5000を共有結合させた。PEG5000の末端はメトキシ基なので、リガンドと共有結合を形成することができない。この部分は、アナライトの結合測定時にリファレンス部として計測される。
【０１５２】
（３−１）反応液の調製
20％ PEG5000溶液：  4.5gのPEG5000（α-アミノ-ω-メトキシ-ポリエチレングリコール）を超純水18.5mLと1N NaOH 4mLで溶解する。
0.2M NHS溶液：  2.32gのNHSを超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液：  7.7gのEDCを超純水で溶解し100mLにする。
【０１５３】
（３−２）パターン化反応
エアガンでチップKの水切りを行い、武蔵エンジニアリング社製ディスペンサーの台座に固定する。次に、シリンジに20% PEG5000溶液1mLと0.2M NHS溶液１mLと0.4M EDC溶液2mLの混合液を投入する。チップKに18mm間隔で15μLづつ6点、前記混合液をスポッティングする。液滴の直径は約4mmとなる。スポッティングを行ったチップKを湿箱にセットし、湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
【０１５４】
（３−３）洗浄
湿箱から取り出した試料を1Nクエン酸水溶液で洗浄し、さらに純水で洗浄する。得られた試料をチップLと呼ぶ。
【０１５５】
（４）PEGリンカー結合
以下の方法で、チップLの表面に存在する5アミノ吉草酸のCOOH基にPEGリンカーを共有結合させた。PEGリンカーはパターン化した表面には結合しない。
（４−１）活性化液、PEGリンカー溶液の調製
0.1M Sulfo-NHS溶液：  2.04gのNHSを超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液：  7.7gのEDCを超純水で溶解し100mLにする。
10％ PEGリンカー溶液：  10gのPEGリンカー（α-アミノ-ω-カルボキシル-ポリエチレングリコール）を超純水80mLで溶解し、1N NaOHを用いてpH8.5に調整する。さらに超純水を加え100mLにする。
【０１５６】
（４−２）活性化
エアガンでチップLの水切りを行う。チップLを湿箱にセットし、0.1M Sulfo-NHS溶液100μLと0.4M EDC溶液100μLの混合液200μLをキャストする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのＰＥＴフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は26である。湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
【０１５７】
（４−３）洗浄
湿箱から取り出した試料からPETフイルムを取り外し、純水で洗浄する。得られた試料をチップMと呼ぶ。
【０１５８】
（４−４）PEGリンカー反応
PEGリンカー反応は活性化反応終了後1時間以内に開始する。先ずエアガンでチップMの水切りを行い、武蔵エンジニアリング社製ディスペンサーの台座に固定する。次に、シリンジに10％PEGリンカー溶液5mLを投入する。チップKに18mm間隔で8μLづつ6点、10％PEGリンカー溶液をスポッティングする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのＰＥＴフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は90である。この試料を湿箱にセットし、湿箱を密閉して、25℃で16時間静置する。
【０１５９】
（４−５）洗浄
湿箱から取り出した試料を純水で洗浄する。得られた試料をチップＮと呼ぶ。
（４−６）保管
エアガンでチップＮの水切りを行い保管する。
【０１６０】
（５）NTA結合
以下の方法で、チップＮの表面に存在するPEGリンカーのCOOH基にNTAを共有結合させた。NTAはパターン化した表面には結合しない。
（５−１）活性化液、NTA溶液の調製
0.1M Sulfo-NHS溶液：  2.04gのSulfo-NHSを超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液：  7.7gのEDCを超純水で溶解し100mLにする。
1MNTA溶液：  3.24gのAB-NTA（（株）同仁化学研究所）を超純水を加え10mLにする。
【０１６１】
（５−２）活性化
エアガンでチップMの水切りを行う。チップＮを湿箱にセットし、0.1M Sulfo-NHS溶液100μLと0.4M EDC溶液100μLの混合液200μLをキャストする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのＰＥＴフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は26である。湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
【０１６２】
（５−３）洗浄
湿箱から取り出した試料からPETフイルムを取り外し、純水で洗浄する。得られた試料をチップＯと呼ぶ。
【０１６３】
（５−４）NTA反応
NTA反応は活性化反応終了後1時間以内に開始する。先ずエアガンでチップＯの水切りを行い、武蔵エンジニアリング社製ディスペンサーの台座に固定する。次に、シリンジに1MNTA溶液5mLを投入する。チップＯに18mm間隔で8μLづつ6点、1MNTA溶液をスポッティングする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのＰＥＴフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は90である。この試料を湿箱にセットし、湿箱を密閉して、25℃で16時間静置する。
【０１６４】
（５−５）洗浄
湿箱から取り出した試料を純水で洗浄する。得られた試料をチップＰと呼ぶ。
【０１６５】
（５−６）保管
エアガンでチップＰの水切りを行い保管する。
【０１６６】
試験例１
本発明による実施例１のチップＪ、および比較例１のチップＰについて、流路を付けて以下の方法でタンパク固定能、及び非特異的吸着を評価した。非特異的吸着量は図３に示すSPR装置のリーダー部分を用いて測定した。
【０１６７】
（１）リガンド溶液の調製：  GFP（Green Fluorescent Protein）（アップステート社製）20μl及びBSA（ウシ血清アルブミン）（シグマ社製）30μgをHBS-EPバッファー300μlに溶解した。なお、HBS-EPバッファーの組成は、ＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid）0.01mol/l（ｐＨ7.4）、ＮａＣｌ0.15mol/l、ＥＤＴＡ 0.003mol/l、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０ 0.005重量％である。
（２）Ni活性化液：   10mM塩化ニッケル水溶液
【０１６８】
（３）SPR測定
流路をHBS-EPで満たし、ベースラインが安定するまで放置（約５分）し、測定をスタートさせる。
HBS-EPを1分間流した後、Ni活性化液を３分間流し、再度HBS-EPを30秒流した後、リガンド溶液を１０分間流す。その後、HBS-EPを１分間流し、初期値との差異及びリガンド固定部、リガンド非固定部の差異を求めた。結果を以下の表１に示す。
【０１６９】
（４）発光強度の測定
上記SPR測定に用いたチップの流路部分を外して、LAS1000（富士写真フイルム製）を用いて蛍光強度の測定を行った。測定は、蛍光測定モードで積分時間１分で行った。
蛍光強度は、流路以外の部分（リガンド溶液の触れていない部分）の蛍光強度をバックグラウンドとしてリガンド固定部の1mm×1mmの強度を数値化した。結果を以下の表１に示す。
【０１７０】
【表１】
2006084282.tif 000006
【０１７１】
比較例のサンプルは、結合信号は大きくでているが、その発光強度から、固定化されているGFP量は低く、リガンド非結合部との差異が本来の結合量を示していることがわかる。リガンド非結合部のSPR信号強度からも本発明の構成が非特異的吸着をよく抑えていることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】図１は、実施例で使用したプラスチックプリズムを示す。
【図２】図２は、実施例におけるスピンコートを行う際の位置を示す。
【図３】図３は、本発明のスクリーニング方法を行うためのＳＰＲシステムの一例を示す。
【図１】
2006084282.tif 000007
【図２】
2006084282.tif 000008
【図３】
2006084282.tif 000009