(57)【要約】【課題】  オリゴヌクレオチドを損傷させることなく、オリゴヌクレオチド分子間に架橋結合を形成する。【解決手段】  芳香族基を有するリンカーを介してオリゴヌクレオチドに導入された少なくとも１個の架橋形成基と、該オリゴヌクレオチドと同一又は異なるオリゴヌクレオチドに含まれる少なくとも１個の反応性官能基との間で共有結合を形成する方法。【選択図】  図６
2006075082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族基を有するリンカーを介してオリゴヌクレオチドに導入された少なくとも１個の架橋形成基と、該オリゴヌクレオチドと同一又は異なるオリゴヌクレオチドに含まれる少なくとも１個の反応性官能基との間で共有結合を形成する方法。
【請求項２】
芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも１個導入されたオリゴヌクレオチド１と、該オリゴヌクレオチド１にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチド１にハイブリダイズしたときに該架橋形成基と近接する位置に、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも１個含むオリゴヌクレオチド２とを反応させ、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する方法。
【請求項３】
架橋形成基が導入されたオリゴヌクレオチド１と、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基が導入されたオリゴヌクレオチド２とが、さらなる架橋で結合されている、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ハイブリダイズすることによってループを形成しうるオリゴヌクレオチドであって、芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも１個導入されており、かつハイブリダイズしてループを形成したときに該架橋形成基と近接する位置に、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも１個含む該オリゴヌクレオチドにおいて、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する方法。
【請求項５】
芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも末端に導入されたオリゴヌクレオチド１と、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも末端に含むオリゴヌクレオチド２と、オリゴヌクレオチド１及び２にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド３とを反応させ、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する方法。
【請求項６】
ループを形成しうるオリゴヌクレオチドであって、芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも１個導入されており、かつ該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも１個含む該オリゴヌクレオチドにおいて、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、オリゴヌクレオチドの架橋方法。
【請求項７】
芳香族基が置換又は無置換の１〜５環性芳香族炭化水素基である請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
芳香族基を有するリンカーを介して導入された架橋形成基が、オリゴヌクレオチドの末端に導入されており、その構造が一般式１：
Ｂ−Ｄ−（１）
（式中、Ｂは架橋形成基を表し、Ｄは少なくとも１つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Ｄはオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合する）
で表される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
Ｄが一般式２：
【化１】
2006075082.tif 000018
（式中、Ｌは芳香族基を表し、Ｒ１は水素原子又は置換基を表し、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す）で表されるか、又は一般式２’：
【化２】
2006075082.tif 000019
（式中、Ｌは二価の芳香族基を表し、Ｒ１’は水素原子又は置換基を表し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表し、Ｒ１５は水酸基又は水酸基の保護された形態を表す）で表される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
芳香族基を有するリンカーを介して導入された架橋形成基が、オリゴヌクレオチドの鎖中に導入されており、その構造が一般式３：
【化３】
2006075082.tif 000020
（式中、Ｂ’は架橋形成基を表し、Ｄ’は少なくとも１つの芳香族基を有する三価の有機基を表し、オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合する）
で表される、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
Ｄ’が一般式４：
【化４】
2006075082.tif 000021
（式中、Ｌは二価の芳香族基を表し、Ｒ２５は水素原子又は置換基を表し、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３及びＲ２４はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す）
で表される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項２〜５のいずれか１項記載の方法によって形成される二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも末端に導入されたオリゴヌクレオチドと、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも末端に含むオリゴヌクレオチドとが、該架橋形成基と該反応性官能基との間の共有結合で結合されてなるオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又は請求項１３記載のオリゴヌクレオチドが固定化された担体。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法を実施するためのキットであって、一般式１０：
【化５】
2006075082.tif 000022
（式中、Ｂは架橋形成基又はその保護された形態を表し、Ｄは少なくとも１つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Ｏは酸素原子を表し、Ｐはリン原子を表し、Ｎは窒素原子を表し、Ｒ８はリン酸保護基を表し、Ｒ９及びＲ１０は有機基であり、それらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成していてもよい）で表される中間体化合物、
及び／又は一般式１１：
【化６】
2006075082.tif 000023
（式中、Ｂ’は架橋形成基又はその保護された形態を表し、Ｄ’は少なくとも１つの芳香族基を有する三価の有機基を表し、Ｏ、Ｐ及びＮは上記と同義であり、Ｅは水酸基保護基を表し、Ｒ８’はリン酸保護基を表し、Ｒ９’及びＲ１０’は有機基であり、それらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成していてもよい）で表される中間体化合物を含む該キット。
【請求項１６】
請求項１２記載の二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、二本鎖オリゴヌクレオチドと生体分子との相互作用を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドを架橋する方法、及び該方法によって架橋されてなる二本鎖オリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ及びＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドは相補的な塩基対の形成によって互いに結合し、二本鎖を形成する。この二本鎖オリゴヌクレオチドとタンパク質とは相互作用することが報告されており、そうした相互作用は、個々の遺伝子の転写又は抑制に、そしてその結果、対応する生物の表現型に、重大な影響を及ぼすと考えられている。また、有糸分裂又は減数分裂における遺伝性因子類の複製、ウイルス核酸の制限、又は染色体中の真核生物核酸のパッケージング及びアンパッケージングも、タンパク質及びオリゴヌクレオチドの複雑な相互作用により制御される生細胞中の重要なプロセスである。従って、そうした相互作用を検出するための有効な方法の開発が望まれている。
【０００３】
しかしながら、二本鎖オリゴヌクレオチドの結合は水素結合であり、加熱や水素結合阻害剤などの添加によって二本鎖は容易に解離する。そのため、二本鎖オリゴヌクレオチドを過酷な条件に曝したまま研究用試料として用いる場合、解離を抑制する必要がある。そこで、形成された二本鎖オリゴヌクレオチド間を共有結合によって架橋する方法が知られている。
【０００４】
そのような架橋方法として、チオール基間にＳ−Ｓ結合を形成する方法（非特許文献１）、アミノ基若しくはホスホロチオエート基と、活性エステル基若しくはハロアルカンとを結合する方法（非特許文献２）、又は光架橋形成反応を用いる方法などが知られている。Ｓ−Ｓ結合による架橋反応は可逆的であり、還元条件下ではその結合が破壊されるため、二本鎖オリゴヌクレオチドは解離する。光架橋形成反応においては光を照射するため、オリゴヌクレオチド塩基部又は糖部が損傷するおそれがあり好ましくない。アミノ基若しくはチオール基と特異的に反応する活性エステル基を用いる方法においては、溶液中の水分子によって活性エステル基が不活性化され、反応効率が低下するという問題がある。
【０００５】
一方、オリゴヌクレオチド同士を架橋させないで、二本鎖を安定化させる方法もある。例えば、二本鎖の鎖長を長くし、塩基対の数を増加させることによって二本鎖を安定化させ、解離を抑制する方法である。しかしながら、この方法の場合、長鎖オリゴヌクレオチドを合成する必要があり、コストと収率の観点から汎用手段としては不適切である。短いオリゴヌクレオチドを用いて二本鎖を形成させた後、ＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼなどの酵素を用い、オリゴヌクレオチド鎖を伸長し長鎖二本鎖オリゴヌクレオチドを作製する方法もある（非特許文献３）。この方法も、酵素を用いるためにコストと収率の観点から問題がある。また、反応系内中の全てのオリゴヌクレオチドにおいて、二本鎖の伸長反応が同程度に進行していることを保証することが困難であり、種々の塩基長の中間体混合物が生成するという問題がある。
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｓ．Ｙ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１５，１５８５−１５８６（１９９３）
【非特許文献２】Ｘｕ，Ｙ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９，１４８−１５２（２００１）．
【非特許文献３】Ｂｕｌｙｋ，Ｍ．Ｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７，５７３−５７７（１９９９）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、オリゴヌクレオチドを損傷させることなく、オリゴヌクレオチド分子間に架橋結合を形成することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、オリゴヌクレオチド分子に芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基を導入し、オリゴヌクレオチド中の反応性官能基と共有結合を形成させることにより、オリゴヌクレオチド分子において効率的に架橋結合を形成できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）芳香族基を有するリンカーを介してオリゴヌクレオチドに導入された少なくとも１個の架橋形成基と、該オリゴヌクレオチドと同一又は異なるオリゴヌクレオチドに含まれる少なくとも１個の反応性官能基との間で共有結合を形成する方法。
【００１０】
（２）芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも１個導入されたオリゴヌクレオチド１と、該オリゴヌクレオチド１にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチド１にハイブリダイズしたときに該架橋形成基と近接する位置に、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも１個含むオリゴヌクレオチド２とを反応させ、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する方法。
【００１１】
（３）架橋形成基が導入されたオリゴヌクレオチド１と、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基が導入されたオリゴヌクレオチド２とが、さらなる架橋で結合されている、（２）記載の方法。
【００１２】
（４）ハイブリダイズすることによってループを形成しうるオリゴヌクレオチドであって、芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも１個導入されており、かつハイブリダイズしてループを形成したときに該架橋形成基と近接する位置に、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも１個含む該オリゴヌクレオチドにおいて、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する方法。
【００１３】
（５）芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも末端に導入されたオリゴヌクレオチド１と、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも末端に含むオリゴヌクレオチド２と、オリゴヌクレオチド１及び２にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド３とを反応させ、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する方法。
【００１４】
（６）ループを形成しうるオリゴヌクレオチドであって、芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも１個導入されており、かつ該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも１個含む該オリゴヌクレオチドにおいて、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、オリゴヌクレオチドの架橋方法。
【００１５】
（７）芳香族基が置換又は無置換の１〜５環性芳香族炭化水素基である（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）芳香族基を有するリンカーを介して導入された架橋形成基が、オリゴヌクレオチドの末端に導入されており、その構造が一般式１：
Ｂ−Ｄ−（１）
（式中、Ｂは架橋形成基を表し、Ｄは少なくとも１つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Ｄはオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合する）
で表される、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
【００１６】
（９）Ｄが一般式２：
【化１】
2006075082.tif 000003
（式中、Ｌは芳香族基を表し、Ｒ１は水素原子又は置換基を表し、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す）で表されるか、又は一般式２’：
【００１７】
【化２】
2006075082.tif 000004
（式中、Ｌは二価の芳香族基を表し、Ｒ１’は水素原子又は置換基を表し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表し、Ｒ１５は水酸基又は水酸基の保護された形態を表す）で表される、（８）記載の方法。
（１０）芳香族基を有するリンカーを介して導入された架橋形成基が、オリゴヌクレオチドの鎖中に導入されており、その構造が一般式３：
【００１８】
【化３】
2006075082.tif 000005
（式中、Ｂ’は架橋形成基を表し、Ｄ’は少なくとも１つの芳香族基を有する三価の有機基を表し、オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合する）
で表される、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
【００１９】
（１１）Ｄ’が一般式４：
【化４】
2006075082.tif 000006
（式中、Ｌは二価の芳香族基を表し、Ｒ２５は水素原子又は置換基を表し、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３及びＲ２４はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す）
で表される、（１０）記載の方法。
【００２０】
（１２）（２）〜（５）のいずれかに記載の方法によって形成される二本鎖オリゴヌクレオチド。
（１３）芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも末端に導入されたオリゴヌクレオチドと、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも末端に含むオリゴヌクレオチドとが、該架橋形成基と該反応性官能基との間の共有結合で結合されてなるオリゴヌクレオチド。
（１４）（１２）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又は（１３）記載のオリゴヌクレオチドが固定化された担体。
【００２１】
（１５）（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、一般式１０：
【化５】
2006075082.tif 000007
（式中、Ｂは架橋形成基又はその保護された形態を表し、Ｄは少なくとも１つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Ｏは酸素原子を表し、Ｐはリン原子を表し、Ｎは窒素原子を表し、Ｒ８はリン酸保護基を表し、Ｒ９及びＲ１０は有機基であり、それらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成していてもよい）で表される中間体化合物、
及び／又は一般式１１：
【００２２】
【化６】
2006075082.tif 000008
（式中、Ｂ’は架橋形成基又はその保護された形態を表し、Ｄ’は少なくとも１つの芳香族基を有する三価の有機基を表し、Ｏ、Ｐ及びＮは上記と同義であり、Ｅは水酸基保護基を表し、Ｒ８’はリン酸保護基を表し、Ｒ９’及びＲ１０’は有機基であり、それらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成していてもよい）で表される中間体化合物を含む該キット。
【００２３】
（１６）（１２）記載の二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、二本鎖オリゴヌクレオチドと生体分子との相互作用を検出する方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、オリゴヌクレオチドを損傷させることなく、効率的かつ簡便に、オリゴヌクレオチド間に安定な架橋結合を形成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、芳香族基を有するリンカーを介してオリゴヌクレオチドに導入された少なくとも１個の架橋形成基と、該オリゴヌクレオチドと同一又は異なるオリゴヌクレオチドに含まれる少なくとも１個の反応性官能基との間で共有結合を形成することを特徴とする。
【００２６】
本発明においてオリゴヌクレオチドは、天然のものでも合成のものでもよく、ポリヌクレオチドをも包含する。また、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸、ならびにオリゴヌクレオチド誘導体を包含する。ＰＣＲ産物も包含される。オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホアミダイト結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−メトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、及びオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等を挙げることができる。
【００２７】
架橋形成基とは、反応性官能基と反応して共有結合を形成しうる基を意味する。例えば、反応性官能基としては、活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イソチオシアネート基又はイソシアネート基などが挙げられ、これらと共有結合しうる架橋形成基としては、アミノ基などが挙げられる。また、反応性官能基としては、マレイミド基又はジスルフィド基なども挙げられ、これらと共有結合しうる架橋形成基としては、メルカプト基などが挙げられる。好ましい架橋形成基としては、メルカプト基及びアミノ基、特に１級アミノ基が挙げられる。アミノ基と共有結合を形成しうる反応性官能基としては、アルデヒド基が好ましい。反応性官能基は、オリゴヌクレオチド中に存在するものでもよく、導入したものでもよい。反応性官能基の導入は、当技術分野において通常用いられる方法によって実施できる。例えば、アルデヒド基の導入は、１，２−ジオールを含む化合物を酸化することによって得ることができる。このとき用いられる酸化剤としては、過ヨウ素酸などが挙げられる。また、核酸塩基部位を脱グリコシル化することによっても得ることができる。
【００２８】
芳香族基としては、特に制限されないが、置換又は無置換の単環性芳香族基、置換又は無置換の多環性芳香族基が挙げられる。ただし、本発明において芳香族基には核酸塩基は含まれない。本明細書において、複素原子には、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、ケイ素原子又はリン原子が含まれる。
【００２９】
芳香族基の置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選ばれるハロゲン原子、ヒドロキシル基、置換又は無置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルキル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルケニル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のシクロアルキル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルコキシ基、置換又は無置換のアルコキシカルボニル基及びカルボキシル基等を挙げることができる。
【００３０】
置換又は無置換の単環性芳香族炭化水素基としては、置換又は無置換のフェニル基、具体的には、２−フルオロフェニル基、３−フルオロフェニル基、４−フルオロフェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、２，３−ジフルオロフェニル基、２，５−ジフルオロフェニル基、３，５−ジフルオロフェニル基、２，３−ジクロロフェニル基、２，５−ジクロロフェニル基、３，５−ジクロロフェニル基、２−メチルフェニル基、３−メチルフェニル基、４−メチルフェニル基、２−エチルフェニル基、３−エチルフェニル基、４−エチルフェニル基、２，３−メチレンジオキシフェニル基、３，４−メチレンジオキシフェニル基、２，３−エチレンジオキシフェニル基、及び３，４−エチレンジオキシフェニル基、ならびにこれらの二価の基を挙げることができる。
【００３１】
置換又は無置換の単環性芳香族複素環基としては、置換又は無置換のチエニル基、フリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、イソチアゾリル基、イソキサゾリル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基及びピリダジニル基、具体的には、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、３−ピリダジニル基、４−ピリダジニル基、２−ピリミジニル基、４−ピリミジニル基、５−ピリミジニル基、ピラジニル基、２−フリル基、３−フリル基、２−チエニル基、３−チエニル基、２−ピロリル基、３−ピロリル基、２−メチル−３−ピリジル基、６−メチル−３−ピリジル基、２−クロロ−３−ピリジル基、６−クロロ−３−ピリジル基、２−メトキシ−３−ピリジル基、６−メトキシ−３−ピリジル基、２，６−ジクロロ−３−ピリジル基及び２，６−ジメトキシ−３−ピリジル基、ならびにこれらの二価の基を挙げることができる。好ましい置換又は無置換の単環性芳香族複素環基としては、フリル基及びピロリル基、ならびにこれらの二価の基が挙げられる。
【００３２】
置換又は無置換の多環性芳香族炭化水素基としては、置換又は無置換のナフチル基、フェナントリル基、フルオレニル基、アントリル基、インダニル基、インダセニル基、インデニル基、フェナレニル基、ピレニル基、トリフェニレニル基、クリセニル基、ナフタセニル基、テトラヒドロナフチル基、ピセニル基、ペンタセニル基及びペリレニル基、具体的には、１−ナフチル基、２−ナフチル基、４−フルオロ−１−ナフチル基、４−クロロ−１−ナフチル基、２−メチル−１−ナフチル基、４−メチル−１−ナフチル基、２−メトキシ−１−ナフチル基、５−メトキシ−１−ナフチル基、６−メトキシ−１−ナフチル基、７−メトキシ−１−ナフチル基、２−エトキシ−１−ナフチル基、５−エトキシ−１−ナフチル基、６−エトキシ−１−ナフチル基、７−エトキシ−１−ナフチル基、１−メトキシ−２−ナフチル基、３−メトキシ−２−ナフチル基、５−メトキシ−２−ナフチル基、６−メトキシ−２−ナフチル基、１−エトキシ−２−ナフチル基、３−エトキシ−２−ナフチル基、５−エトキシ−２−ナフチル基、４−インダニル基、５−インダニル基、５−テトラヒドロナフチル基、６−テトラヒドロナフチル基及び６−エトキシ−２−ナフチル基、ならびにこれらの二価の基が挙げられる。
【００３３】
置換又は無置換の多環性芳香族複素環基としては、チアントレニル基、イソベンゾフラニル基、クロメニル基、キサンテニル基、フェノキサチイニル基、インドリジニル基、インドリル基、イソインドリル基、インダゾリル基、プリニル基、キノリル基、イソキノリル基、フタラジニル基、ナフチリジニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、シノリニル基、プテリジニル基、カルバゾリル基、カルボリニル基、フェナントリジニル基、アクリジニル基、ペリミジニル基、フェナントロリニル基及びフェノキサジニル基、具体的には、２−クロロ−５−キノリル基、ならびにこれらの二価の基などが挙げられる。
【００３４】
二価の芳香族基としては、具体的には、置換又は無置換のフェニレン基、ピリジレン基、ピリダジニル基、ピリミジニレン基、ピラジニレン基、フリレン基、チエニレン基、ピロリレン基、イミダゾリレン基、チアゾリレン基、オキサゾリレン基、ナフチレン基、アントリレン基、ピレニレン基、インダニレン基、テトラヒドロナフチレン基、キノリレン基、イソキノリレン基、シンノリニレン基、キナゾリニレン基、キノキサリニレン基、ナフチリジニレン基、フタラジニレン基、インドリレン基、イソインドリレン基、ベンゾフリレン基、ベンゾチエニレン基、インダゾリレン基、ベンゾイミダゾリレン基、ベンゾチアゾリレン基が挙げられる。好ましくはナフチレン基、アントリレン基、フルオレニレン基、フェナントリレン基及びピレニレン基が挙げられる。これら二価の芳香族基は、上記置換基で置換されていてもよい。
【００３５】
本発明においては、架橋形成基と反応性官能基との反応効率を高める観点から、疎水性の高い芳香族基が好ましい。本発明において芳香族基は、好ましくは置換又は無置換の多環性芳香族基、より好ましくは置換又は無置換の多環性芳香族炭化水素基である。さらに好ましくは置換又は無置換の１〜５環性、より好ましくは２〜４環性の芳香族炭化水素基であり、特に好ましくは置換又は無置換のフェナントレン環、フルオレン環、ナフタレン環、アントラセン環又はピレン環を含む芳香族基である。
【００３６】
本発明においては、芳香族基を含み、オリゴヌクレオチドと架橋形成基とをつなぐリンカーは、芳香族基と架橋形成基との距離が近くなるようなものが好ましい。そのようなリンカーを用いることによって、架橋形成基と反応性官能基との反応効率を高めることができる。
【００３７】
本発明の第一実施形態は、芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも１個導入されたオリゴヌクレオチド１と、該オリゴヌクレオチド１にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチド１にハイブリダイズしたときに該架橋形成基と近接する位置に、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも１個含むオリゴヌクレオチド２とを反応させ、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する方法に関する。
【００３８】
上記架橋形成基は、芳香族基を有するリンカーを介してオリゴヌクレオチドに導入される。架橋形成基は、オリゴヌクレオチドの末端に導入されていてもよいし、オリゴヌクレオチドの鎖中に導入されていてもよい。芳香族基は、架橋形成基とオリゴヌクレオチドとをつなぐリンカーの主鎖中に存在していてもよいし、主鎖の側鎖として存在していてもよいし、分岐鎖中に存在していてもよいし、分岐鎖の側鎖として存在していてもよい。
【００３９】
架橋形成基が、オリゴヌクレオチドの末端に導入されている場合、その構造は、好ましくは、一般式１：
Ｂ−Ｄ−    （１）
（式中、Ｂは架橋形成基を表し、Ｄは少なくとも１つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Ｄはオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合する）で表される。
【００４０】
架橋形成基Ｂについては、すでに述べたとおりであり、好ましくは１級アミノ基である。リンカーＤは、芳香族基を有し、架橋形成基と反応性官能基との結合性及びオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを阻害するものでなければ特に制限されない。好ましくは複素原子を含んでいてもよい置換又は無置換の直鎖又は分岐の二価の炭化水素基である。
【００４１】
二価の炭化水素基としては、鎖員２〜５０、好ましくは鎖員３〜３０、より好ましくは鎖員３〜５のアルキレン基、鎖員２〜５０、好ましくは鎖員３〜３０、より好ましくは鎖員３〜５のアルケニレン基、鎖員２〜５０、好ましくは鎖員３〜３０、より好ましくは鎖員３〜１０の二価の脂環式炭化水素基等が挙げられる。上記炭化水素基においては、炭素の一部が複素原子で置換されていてもよい。
【００４２】
リンカーＤにおける置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選ばれるハロゲン原子、ヒドロキシル基、置換又は無置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、オキソ基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルキル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルケニル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のシクロアルキル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルコキシ基、置換又は無置換のアルコキシカルボニル基又はカルボキシル基等を挙げることができる。
【００４３】
上記複素原子を含んでいてもよい置換又は無置換の直鎖又は分岐の二価の炭化水素基において、芳香族基は、その主鎖中に存在していてもよいし、主鎖の側鎖として存在していてもよいし、分岐鎖中に存在してもよいし、又は分岐鎖の側鎖として存在していてもよい。
【００４４】
好ましい実施形態において、一般式１におけるリンカーＤは、一般式２：
【化７】
2006075082.tif 000009
（式中、Ｌは芳香族基を表し、Ｒ１は水素原子又は置換基を表し、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す）で表される。一般式２において、Ｒ２が架橋形成基Ｂと結合し、Ｒ４がオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合する。Ｒ４が直接結合の場合は、一般式２における炭素原子が、オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と直接結合する。Ｒ２が直接結合の場合は、一般式２における炭素原子が、架橋形成基Ｂと結合する。
【００４５】
芳香族基Ｌは、すでに述べたとおりであり、好ましくは置換又は無置換のナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、フルオレニル基及びピレニル基、特に１−ナフチル基及び９−アントリル基である。
【００４６】
Ｒ１は水素原子又は置換基であり、置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選ばれるハロゲン原子、ヒドロキシル基、置換又は無置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルキル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルケニル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のシクロアルキル基、置換又は無置換の炭素数１〜１０のアルコキシ基、置換又は無置換のアルコキシカルボニル基又はカルボキシル基等を挙げることができる。好ましくは水素原子である。
【００４７】
Ｒ２は、好ましくは、置換又は無置換の、鎖長１〜１０、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３の飽和炭化水素基である。
【００４８】
Ｒ３は、好ましくは、置換又は無置換の、鎖長１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５の飽和炭化水素基である。
【００４９】
Ｒ４は、好ましくは直接結合、又は置換若しくは無置換の、鎖長１〜３０、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０の飽和炭化水素基である。
【００５０】
上記飽和炭化水素基においては、炭素の一部が複素原子で置換されていてもよい。また、鎖長とは、一般式２のＲ２〜Ｒ４の構造において、それぞれ、炭素原子と、架橋形成基Ｂ、芳香族基Ｌ又はオリゴヌクレオチドとをつなぐ最短の経路を構成する原子の数を意味する。置換基としては、リンカーＤの置換基として記載したものが挙げられる。
【００５１】
一実施形態において、Ｒ２は、一般式５：
−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ５−（ＣＨ２）ｎ−    （５）
で表され、Ｒ３は好ましくは一般式６：
−（ＣＨ２）ｔ−Ｒ６−（ＣＨ２）ｗ−          （６）
で表され、Ｒ４は直接結合又は−Ｒ４’−（ＣＨ２）ｊ−で表される。
【００５２】
Ｒ２において、−（ＣＨ２）ｍが架橋形成基Ｂと結合し、Ｒ３において、（ＣＨ２）ｗ−が芳香族基Ｌと結合し、Ｒ４において（ＣＨ２）ｊ−がオリゴヌクレオチドと結合する。
【００５３】
Ｒ５、Ｒ６及びＲ４’は、それぞれ独立して、直接結合又は以下に示す基：
【化８】
2006075082.tif 000010
から選択される。Ｒ７は水素原子又はリン酸保護基を表す。リン酸保護基としては、特に限定されないが、メチル基、２−シアノエチル基、２−トリメチルシリルエチル基、４−オキシペンチル基などを好ましい基として挙げることができる。
【００５４】
Ｒ５は好ましくは直接結合であり、Ｒ６は好ましくは−Ｏ−であり、Ｒ４’は好ましくは直接結合又は−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−である。
【００５５】
ｍ＋ｔは、通常１〜１０、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３であり、ｊは通常１〜３０、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０であり、ｔ＋ｗは、通常１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５である。
【００５６】
別の好ましい実施形態において、一般式１におけるリンカーＤは、一般式２’：
【化９】
2006075082.tif 000011
（式中、Ｌは二価の芳香族基を表し、Ｒ１’は水素原子又は置換基を表し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の、二価の炭化水素基を表し、Ｒ１５は水酸基又は水酸基の保護された形態を表す）で表される。
【００５７】
一般式２’において、Ｒ１１が架橋形成基Ｂと結合し、Ｒ１４がオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合する。Ｒ１１が直接結合の場合は、芳香族基Ｌが架橋形成基Ｂと結合し、Ｒ１４が直接結合の場合は、一般式２’における炭素原子が、オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と直接結合する。
【００５８】
水酸基の保護された形態としては、特に限定されないが、例えば、アセチル基、５’−Ｏ−４，４’，４’’−トリス（４−ベンゾイルオキシ）トリチル基及びジメトキシトリチル基が挙げられ、ジメトキシトリチル基が好ましい。
【００５９】
芳香族基Ｌは、すでに述べたとおりである。好ましくは、置換又は無置換のフェナントリレン基、フルオレニレン基、ナフチレン基、アントリレン基又はピレニレン基、特にナフチレン基及びアントリレン基である。より具体的には、置換又は無置換の２，６−ナフチレン基、１，４−ナフチレン基、１，５−ナフチレン基、２，７−ナフチレン基、２，６−アントリレン基、１，８−アントリレン基、９，１０−アントリレン基、１，５−アントリレン基、２，７−フェナントリレン基、２，８−フェナントリレン基、１，５−フェナントリレン基、１，６−フェナントリレン基、１，７−フェナントリレン基、１，８−フェナントリレン基、１，７−９Ｈ−フルオレニレン基、１，６−９Ｈ−フルオレニレン基、２，７−ピレニレン基、２，６−ピレニレン基、又は１，８−ピレニレン基などが挙げられる。
【００６０】
Ｒ１’は水素原子又は置換基であり、上記Ｒ１と同様のものが挙げられる。好ましくは水素原子である。
【００６１】
Ｒ１１は、好ましくは、置換又は無置換の、鎖長１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５の飽和炭化水素基である。
【００６２】
Ｒ１２は、好ましくは、置換又は無置換の、鎖長１〜３０、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０の飽和炭化水素基である。
【００６３】
Ｒ１３は、好ましくは、直接結合、又は置換若しくは無置換の、鎖長１〜３０、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０の飽和炭化水素基である。
【００６４】
Ｒ１４は、好ましくは、直接結合、又は置換若しくは無置換の、鎖長１〜３０、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０の飽和炭化水素基である。
Ｒ１５は、好ましくは水酸基である。
【００６５】
上記飽和炭化水素基においては、炭素の一部が複素原子で置換されていてもよい。鎖長については上記のとおりである。置換基としては、リンカーＤの置換基として記載したものが挙げられる。
【００６６】
一実施形態において、Ｒ１１は、好ましくは、一般式７：
−（ＣＨ２）ａ−Ｒ５’−（ＣＨ２）ｂ−    （７）
で表され、Ｒ１２は好ましくは一般式８：
−（ＣＨ２）ｃ−Ｒ６’−（ＣＨ２）ｄ−    （８）
で表され、Ｒ１３は好ましくは、直接結合又は−（ＣＨ２）ｅ−であり、Ｒ１４は好ましくは、直接結合又は−（ＣＨ２）ｆ−である。
【００６７】
Ｒ１１において、−（ＣＨ２）ａが架橋形成基Ｂと結合し、Ｒ１２において、−（ＣＨ２）ｃ−が芳香族基Ｌと結合する。
【００６８】
Ｒ５’及びＲ６’は、それぞれ独立して、直接結合又は以下に示す基：
【化１０】
2006075082.tif 000012
から選択される。Ｒ５’は好ましくは−ＮＨ−ＣＯ−であり、Ｒ６’は好ましくは−ＣＯ−ＮＨ−である。
【００６９】
ｅ及びｆは、それぞれ独立して、１〜２０の整数を表し、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３の整数を表し、ａ＋ｂは通常１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５であり、ｃ＋ｄは通常１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５である。Ｒ１３及びＲ１４は、好ましくは−ＣＨ２−又は直接結合である。
【００７０】
芳香族基を有するリンカーを介して導入された架橋形成基が、オリゴヌクレオチドの鎖中に導入されている場合、その構造は、好ましくは一般式３：
【００７１】
【化１１】
2006075082.tif 000013
（式中、Ｂ’は架橋形成基を表し、Ｄ’は少なくとも１つの芳香族基を有する三価の有機基を表し、オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合する）で表される。
【００７２】
架橋形成基Ｂ’については、架橋形成基Ｂと同様であり、好ましくは１級アミノ基である。リンカーＤ’は、芳香族基を有し、架橋形成基と反応性官能基との結合性及びオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを阻害するものでなければ特に制限されない。好ましくは複素原子を含んでいてもよい置換又は無置換の三価の炭化水素基、より好ましくは複素原子を含んでいてもよい置換又は無置換の鎖員１〜４０、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０の三価の飽和炭化水素基である。リンカーＤ’における置換基は、リンカーＤにおける置換基と同様である。
【００７３】
リンカーＤ’において、芳香族基は、オリゴヌクレオチドをつなぐ鎖の主鎖又は側鎖に存在していてもよいし、架橋形成基Ｂ’につながる鎖の主鎖又は側鎖に存在していてもよい。
【００７４】
好ましい実施形態において、一般式３におけるリンカーＤ’は、一般式４：
【化１２】
2006075082.tif 000014
（式中、Ｌは二価の芳香族基を表し、Ｒ２５は水素原子又は置換基を表し、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３及びＲ２４はそれぞれ独立して、直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す）で表される。一般式４において、Ｒ２１が架橋形成基Ｂと結合し、Ｒ２３及びＲ２４がオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合する。Ｒ２１が直接結合の場合は、芳香族基Ｌが架橋形成基Ｂ’と結合し、Ｒ２３及びＲ２４が直接結合の場合は、一般式４における炭素原子が、オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と直接結合する。
【００７５】
Ｒ２１については上記Ｒ１１と同様であり、Ｒ２２についてはＲ１２と同様であり、Ｒ２３についてはＲ１３と同様であり、Ｒ２４についてはＲ１４と同様であり、Ｒ２５についてはＲ１’と同様である。ここで、Ｒ２１についてＲ１１と同様であるとは、Ｒ２１を、Ｒ１１について例示した基と同様の基から選択しうること、同様の基が好ましいことを意味するものであり、Ｒ２１とＲ１１が同じ基であることを意味するものではなく、２つの基は独立に選択される。
【００７６】
第１実施形態において、上記架橋形成基は、オリゴヌクレオチド１中に少なくとも１個導入されるが、オリゴヌクレオチド１の末端に導入されてもよく、オリゴヌクレオチド鎖中に導入されてもよく、双方に導入されてもよい。オリゴヌクレオチド２はオリゴヌクレオチド１とハイブリダイズしうるものであればよく、ハイブリダイズ可能である限りオリゴヌクレオチド１に対しミスマッチを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチド２は、好ましくは、ストリンジェントな条件下でオリゴヌクレオチド１とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、特定のオリゴヌクレオチドの領域に対し高い相同性（相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）を有するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、０．５〜１ＭのＮａＣｌ存在下４２〜６８℃で、又は５０％ホルムアミド存在下４２℃で、又は水溶液中６５〜６８℃で、ハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline sodium citrate）溶液を用いて室温〜６８℃でを洗浄することにより達成できる。オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２は、ハイブリダイズしうる領域をそれぞれ含んでいればよく、当該領域の塩基長は、通常１塩基以上、好ましくは３〜１００塩基、より好ましくは１０〜５０塩基である。オリゴヌクレオチド２は、最も好ましくは、オリゴヌクレオチド１の相補鎖である。
【００７７】
オリゴヌクレオチド１の塩基長は、特に限定されないが、通常１〜５００塩基、より好ましくは５〜２００塩基、より好ましくは１０〜１００塩基である。オリゴヌクレオチド２の塩基長は、オリゴヌクレオチド１とハイブリダイズしうる限り特に限定されないが、通常１〜５００塩基、より好ましくは５〜２００塩基、より好ましくは１０〜１００塩基である。
【００７８】
第一実施形態において、オリゴヌクレオチド２は、オリゴヌクレオチド１にハイブリダイズしたときに、架橋形成基と近接する位置に、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも１個含む。架橋形成基と近接する位置とは、オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２がハイブリダイズしたときに、各オリゴヌクレオチド中の架橋形成基と反応性官能基が共有結合を形成しうる位置にあることを意味する。従って、オリゴヌクレオチド１及び２がハイブリダイズした状態で、架橋形成基の位置と反応性官能基の位置に、通常１〜２０塩基、好ましくは１〜１０塩基、より好ましくは１〜５塩基のずれがあってもよい。反応性官能基の導入位置及び種類は、オリゴヌクレオチド１における架橋形成基の種類及び導入位置に依存して、両者が共有結合を形成できるように選択される。オリゴヌクレオチド１における架橋形成基の導入位置に対応するすべての位置に、反応性官能基が存在する必要はなく、対応する位置に少なくとも１個含んでいればよい。架橋形成基を芳香族基を有するリンカーを介して複数導入する場合、架橋形成基及び芳香族基は、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００７９】
第一実施形態においては、さらなるオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチド１又は２にハイブリダイズしてもよいし、本発明の方法によって架橋を形成してもよい。
本発明の第一実施形態の概念図を、図６のａ〜ｄに示す。
【００８０】
本発明の第二実施形態は、ハイブリダイズすることによってループを形成しうるオリゴヌクレオチドであって、芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも１個導入されており、かつハイブリダイズしてループを形成したときに該架橋形成基と近接する位置に、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも１個含む該オリゴヌクレオチドにおいて、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する方法である。
【００８１】
第二実施形態においては、第一実施形態とは異なり、１本鎖オリゴヌクレオチドが、分子内でハイブリダイズしてループを形成することにより、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する。従って、１本鎖オリゴヌクレオチドに、架橋形成基と反応性官能基の双方が存在する。ハイブリダイズすることによってループを形成するとは、一本鎖オリゴヌクレオチドが、その分子内に、互いにハイブリダイズしうる領域を含み、この領域同士がハイブリダイズして二本鎖を形成することを意味する。該領域の塩基長については、第一実施形態と同様である。
【００８２】
第二実施形態においても、第１実施形態と同様に、架橋形成基はオリゴヌクレオチドの末端に導入されていてもよく、オリゴヌクレオチドの鎖中に導入されていてもよく、双方に導入されていてもよい。架橋形成基と反応性官能基の存在位置及び種類についても第一実施形態と同様に、一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたときに、導入された架橋形成基と反応性官能基とが共有結合を形成しうるように、適宜選択される。オリゴヌクレオチドの末端又は鎖中に、芳香族基を有するリンカーを介して導入される架橋形成基、反応性官能基及びハイブリダイゼーション等については、第一実施形態について記載したのと同様である。
【００８３】
第二実施形態において、オリゴヌクレオチドの塩基長は、通常３〜２００塩基、好ましくは５〜１００塩基、より好ましくは１０〜５０塩基である。
【００８４】
第二実施形態においても、さらなるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしてもよいし、本発明の方法によって架橋を形成してもよい。
本発明の第二実施形態の概念図を、図６のｅに示す。
【００８５】
本発明の第三実施形態は、芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも末端に導入されたオリゴヌクレオチド１と、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも末端に含むオリゴヌクレオチド２と、オリゴヌクレオチド１及び２にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド３とを反応させ、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する方法である。
【００８６】
第三実施形態では、架橋形成基がオリゴヌクレオチド１の５’末端に導入される場合は、反応性官能基はオリゴヌクレオチド２の３’末端に存在し、架橋形成基がオリゴヌクレオチド１の３’末端に導入される場合は、反応性官能基はオリゴヌクレオチド２の５’末端に存在する。そしてオリゴヌクレオチド３にオリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２とをハイブリダイズさせ、架橋形成基と反応性官能基の間で共有結合を形成させることにより、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成させる。従って、オリゴヌクレオチド３にオリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２がハイブリダイズした状態で、オリゴヌクレオチド１の末端に導入された架橋形成基と、オリゴヌクレオチド２の末端に導入された反応性官能基が共有結合を形成しうる位置にある。すなわち、オリゴヌクレオチド３において、オリゴヌクレオチド１がハイブリダイズする領域と、オリゴヌクレオチド２がハイブリダイズする領域は、架橋形成基と反応性官能基の共有結合が形成可能な程度に近接している。好ましくはオリゴヌクレオチド３にハイブリダイズした状態で、オリゴヌクレオチド１の３’末端とオリゴヌクレオチド２の５’末端の距離、又はオリゴヌクレオチド１の５’末端とオリゴヌクレオチド２の３’末端の距離は、通常０〜２０塩基、好ましくは０〜１０塩基、より好ましくは０〜５塩基に相当する。
【００８７】
第三実施形態において、オリゴヌクレオチド１及び２の塩基長は、通常３〜２００塩基、好ましくは５〜１００塩基、より好ましくは１０〜５０塩基である。オリゴヌクレオチド３の塩基長は、通常６〜４００塩基、好ましくは１０〜２００塩基、より好ましくは２０〜１００塩基である。
【００８８】
オリゴヌクレオチド１及びオリゴヌクレオチド２は、その鎖中にさらなる架橋形成基又は反応性官能基を含んでいてもよく、その場合は、第一実施態様と同様に、オリゴヌクレオチド３の対応する位置に、共有結合を形成するための反応性官能基又は架橋形成基が導入されていてもよい。
【００８９】
芳香族基を有するリンカーを介して導入される架橋形成基、反応性官能基、及びハイブリダイゼーション等については、第一実施形態と同様である。
【００９０】
第三実施形態においても、さらなるオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド１〜３にハイブリダイズしてもよいし、本発明の方法によって架橋を形成してもよい。
本発明の第三実施形態の概念図を、図６のｆに示す。
【００９１】
本発明の第四実施形態は、ループを形成しうるオリゴヌクレオチドであって、芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも１個導入されており、かつ該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも１個含む該オリゴヌクレオチドにおいて、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、オリゴヌクレオチドの架橋方法である。
【００９２】
第四実施形態においては、第二実施形態と同様に１本鎖オリゴヌクレオチドが、分子内で架橋を形成するが、該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしなくてもよい態様である。従って、該オリゴヌクレオチドの塩基配列は制限されず、ハイブリダイズして二本鎖を形成することなく架橋を形成する場合も含まれる。１本鎖オリゴヌクレオチドに、架橋形成基と反応性官能基の双方が存在するが、その位置は制限されない。
【００９３】
第四実施形態においても、第１実施形態と同様に、架橋形成基はオリゴヌクレオチドの末端に導入されていてもよく、オリゴヌクレオチドの鎖中に導入されていてもよく、双方に導入されていてもよい。架橋形成基と反応性官能基の種類については、第一実施形態と同様に、導入された架橋形成基と反応性官能基とが共有結合を形成しうるように、適宜選択される。オリゴヌクレオチドの末端又は鎖中に、芳香族基を有するリンカーを介して導入される架橋形成基及び反応性官能基等については、第一実施形態について記載したのと同様である。
【００９４】
第四実施形態において、オリゴヌクレオチドの塩基長は、通常３〜２００塩基、好ましくは５〜１００塩基、より好ましくは１０〜５０塩基である。
【００９５】
第四実施形態においても、さらなるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしてもよいし、本発明の方法によって架橋を形成してもよい。
【００９６】
本発明において、オリゴヌクレオチドは、さらに、上記のものとは異なる架橋で結合されていてもよい。そのような架橋は、当技術分野で公知であり特に制限されないが、例えば、ジスルフィド架橋（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，２８５−２９２（１９９５））、スチルベン ジカルボキシアミド架橋、ルテニウム（Ｒｕ）複合体架橋（Ｌｅｗｉｓ，Ｆ．Ｄ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４，３２７（１９９９））、ヘキサエチレングリコール架橋（Ｄｕｒａｎｄ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，６３５３−６３５９（１９９０））、芳香族テレフタルイミド架橋（Ｓａｌｕｎｋｈｅ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，８７６８−８７７２（１９９２））、非分岐又は分岐ジオール架橋、及び分岐ホスホルアミダイト架橋などが挙げられる。
【００９７】
本発明において、架橋形成基をオリゴヌクレオチドの末端に導入する場合は、上記の芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が導入されたオリゴヌクレオチドの構造において、オリゴヌクレオチド部分がホスホロアミダイトになった構造を有する中間体化合物を用いて架橋形成基を導入することができる。
【００９８】
一般式１で表される架橋形成基の導入は、以下の一般式１０：
【化１３】
2006075082.tif 000015
（式中、Ｂ及びＤは上記と同義であり、Ｏは酸素原子を表し、Ｐはリン原子を表し、Ｎは窒素原子を表し、Ｒ８はリン酸保護基を表し、Ｒ９及びＲ１０は有機基であり、それらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成していてもよい）で表される中間体化合物を用いて導入することができる。
【００９９】
Ｒ９及びＲ１０は、特に制限されないが、好ましくは炭化水素基であり、より好ましくは炭素数１〜５のアルキル基である。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基が挙げられる。
【０１００】
あるいは、Ｒ９及びＲ１０は、それらが結合している窒素原子と一緒になって環基を形成していてもよい。該環はＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子の他にさらに複素原子を含んでいてもよい。そのような環は、好ましくは環員５〜８、好ましくは６の環であり、例えば、モルホリン環、ピペリジン環、ピペラジン環、チオモルホリン環等が挙げられ、好ましくはモルホリン環である。
【０１０１】
ここでリン酸保護基は、ホスホロアミダイト法に使用されるものであればどのようなものでもよいが、メチル基、２−シアノエチル基、２−トリメチルシリルエチル基、４−オキシペンチル基などを好ましい基として挙げることができる。
【０１０２】
例えば、Ｄが一般式２で表される一般式１の架橋形成基は、Ｄが一般式２で表される一般式１０の中間体化合物を使用して導入することができる。同様に、Ｄが一般式２’で表される一般式１の架橋形成基は、Ｄが一般式２’で表される一般式１０の中間体化合物を使用して導入することができる。
【０１０３】
本発明において、架橋形成基をオリゴヌクレオチドの鎖中に導入する場合は、上記の芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が導入されたオリゴヌクレオチドの構造において、一方のオリゴヌクレオチド部分がホスホロアミダイトになっており、他方のオリゴヌクレオチド部分が水酸基保護基になった構造を有する中間体化合物を用いて架橋形成基を導入することができる。
【０１０４】
一実施形態において、一般式３で表される架橋形成基の導入は、一般式１１：
【化１４】
2006075082.tif 000016
（式中、Ｂ’及びＤ’は上記と同義であり、Ｏ、Ｐ及びＮは上記と同義であり、Ｅは水酸基保護基を表し、Ｒ８’はリン酸保護基を表し、Ｒ９’及びＲ１０’は有機基であり、それらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成していてもよい）で表される中間体化合物を用いて実施できる。
【０１０５】
水酸基保護基としては、ＤＮＡ合成においてリボースの５’位の保護に使用される保護基を使用することができ、例えば、アセチル基、５’−Ｏ−４，４’，４’’−トリス（４−ベンゾイルオキシ）トリチル基及びジメトキシトリチル基が挙げられ、ジメトキシトリチル基が好ましい。Ｒ８’〜Ｒ１０’は、Ｒ８〜Ｒ１０とそれぞれ同様である。
【０１０６】
例えば、Ｄ’が一般式４で表される一般式３の架橋形成基は、Ｄ’が一般式４で表される一般式１１の中間体化合物を使用して導入することができる。
【０１０７】
本発明におけるオリゴヌクレオチドへの架橋形成基の導入は、上記中間体化合物をオリゴヌクレオチドと連結させることにより合成することができる。オリゴヌクレオチドへの中間体化合物の導入は、ＤＮＡ自動合成機上でオリゴヌクレオチド合成と同時に実施することができる。
【０１０８】
架橋形成基をオリゴヌクレオチドの末端に導入する場合は、ＤＮＡ合成において、３’末端又は５’末端に、一般式１０で表される中間体化合物を結合する。
【０１０９】
架橋形成基をオリゴヌクレオチド鎖中に導入する場合は、ＤＮＡ合成において、対応する中間体化合物を適宜結合させることにより、所望の位置に、所望の数で、芳香族基を有するリンカー基を介して架橋形成基を導入できる。例えば、一般式１１で表される中間体化合物をオリゴヌクレオチドに導入した後、オリゴヌクレオチド合成を行い、再び一般式１１で表される中間体化合物を導入することにより、複数の架橋形成基を導入することができる。オリゴヌクレオチドに導入される架橋形成基の数は特に限定されないが、通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個である。
【０１１０】
本発明はまた、上記の方法によって得られた二本鎖オリゴヌクレオチドに関する。本発明の方法によって得られた二本鎖オリゴヌクレオチドにおいては、ハイブリダイズによって二本鎖が形成されるとともに、架橋形成基と反応性官能基とが反応することによって共有結合を形成し、二本鎖が安定化されている。従って、本発明の方法によって得られる二本鎖オリゴヌクレオチドは、厳しい条件においても解離しにくい。
【０１１１】
本発明はまた、芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも末端に導入されたオリゴヌクレオチドと、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも末端に含むオリゴヌクレオチドとが、該架橋形成基と該反応性官能基との間の共有結合で結合されてなるオリゴヌクレオチドに関する。この結合型のオリゴヌクレオチドは、例えば、上記第三実施形態において、芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも末端に導入されたオリゴヌクレオチド１と、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも末端に含むオリゴヌクレオチド２と、オリゴヌクレオチド１及び２にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド３とを反応させ、該架橋形成基と該反応性官能基とを共有結合をさせて二本鎖オリゴヌクレオチドを形成させた後、オリゴヌクレオチド３を解離又は分解することにより得ることができる。オリゴヌクレオチド３の解離又は分解は、例えば、オリゴヌクレオチド１及び２がＤＮＡである場合、オリゴヌクレオチド３をＲＮＡとし、二本鎖形成後、ＲＮＡであるオリゴヌクレオチド３のみを分解することにより実施できる。
【０１１２】
このようにして得られた結合型オリゴヌクレオチドは、従来オリゴヌクレオチドの連結に使用されてきたリガーゼ等の酵素を使用することなく、オリゴヌクレオチドを化学的に連結するこにより得られる高分子量オリゴヌクレオチドである。酵素を使用しなくてもよいことからコストの点で有利であるとともに、反応条件も制限されないため広範に使用できる。
【０１１３】
架橋形成基と反応性官能基との間での共有結合の形成は、当技術分野で公知の方法に従って実施できる。例えば、架橋形成基としてのアミノ基と反応性官能基としてのアルデヒド基とを結合させる場合は、中性または弱塩基性条件下で行うことができる。このアミノ基とアルデヒド基の結合反応中または反応終了後に還元剤を添加することによって、アミノ基とアルデヒド基間で形成された結合を還元し、安定化させ、逆反応を阻害する。還元剤には水素化ホウ素ナトリウム又は水素化ホウ素シアノナトリムなどが挙げられる。
【０１１４】
本発明はまた、上記二本鎖オリゴヌクレオチド又は上記結合型オリゴヌクレオチドが固定化された担体に関する。該担体は、好ましくは、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドが有する架橋形成基又は反応性官能基と共有結合しうる官能基をその表面に有する。二本鎖オリゴヌクレオチドの担体への固定化は、当技術分野で通常用いられる方法により実施できる。
【０１１５】
担体の基材としては、例えば、石英ガラス、ホウ珪酸ガラス及びソーダライムガラスなどのガラス、シリコン、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂(Acrylonitrile Butadiene Styrene 樹脂)、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）が挙げられる。本発明においては、ガラス、シリコン、セラミックス、プラスチックを使用するのが好ましい。
【０１１６】
担体の形状は、特に制限されず、基盤状、糸状、球状、ビーズ状、多角形状、粉末状、多孔質状などが挙げられ、本発明においては基盤状が好ましい。
【０１１７】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ビオチン及び蛍光色素などの標識に結合させることができる。蛍光色素としては、例えば、Ｃｙ３及びＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、ＧＦＰなどが挙げられる。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドはまた、医薬に結合させることもできる。
【０１１８】
本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットに関する。該キットは、芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基をオリゴヌクレオチドに導入するための中間体化合物、具体的には、上記一般式１０で表される中間体化合物及び／又は一般式１１で表される中間体化合物を含む。本発明のキットにおいて、中間体化合物における架橋形成基Ｂ及びＢ’は、保護された形態でもよい。保護された形態とは、官能基の水素原子が保護基で置換された形態を意味する。アミノ基の保護基としては、特に制限されないが、アシル基、カルバメート基、トリアルキルシリル基、フタリル基、カルボキシアルキルカルボニル基、トシル基、トリチル基、トリフルオロアセチル基等が挙げられる。メルカプト基の保護基としては、特に制限されないが、ｔ−ブチル基、アラルキル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基及びアシル基等が挙げられる。
【０１１９】
本発明のキットは、さらに、反応液を構成するバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類（ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨなど）、校正用の標準試料などを含んでもよい。また、本発明のキットは、さらに、ハイブリダイゼーションバッファー、洗浄バッファー、マイクロプレート、ナイロンメンブレンなどを含んでもよい。
【０１２０】
本発明はまた、上記二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、二本鎖オリゴヌクレオチドと生体分子との相互作用を検出する方法に関する。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、安定であるため解離しにくく、生体分子と二本鎖オリゴヌクレオチドとの相互作用を研究する上で有用である。
【実施例】
【０１２１】
芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が導入されたオリゴヌクレオチドを合成するための中間体化合物（以下、アミダイト化合物と称する）を合成し、該中間体化合物を用いて得られたオリゴヌクレオチドの能力を評価した。
【０１２２】
オリゴヌクレオチドへ芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基を導入するための中間体化合物（アミダイト化合物：Ｙ３、Ｙ４）を、図１及び２に示す方法により合成した。Ｙ３は芳香族基としてナフチル基を有し、架橋形成基であるアミノ基と芳香族基との距離が近い。またＹ４はアミノ基が分岐のアルキル基にではなくナフチル基に結合している。
【０１２３】
アミダイト化合物Ｙ３、Ｙ４をオリゴヌクレオチドに導入した、２５又は３５塩基のオリゴヌクレオチドを合成した（図３）。芳香族基を有しないオリゴヌクレオチド（Ｘ１−Ｓｐ２５、Ｘ２−Ｓｐ２５）も比較例として合成した（図３）。Ｘ１−Ｓｐ２５及びＸ２−Ｓｐ２５は、市販品のＮ−モノメトキシトリチル−６−アミノヘキシルホスホロアミダイト化合物又はトリフルオロアセチル−６−アミノヘキシルホスホロアミダイト化合物（グレンリサーチ社）を用いてオリゴヌクレオチドにアミノ基を導入したものである。
【０１２４】
合成したオリゴヌクレオチドは、逆相カラムを用いて高純度に精製後、架橋反応（図４、図５）に供した。図４、図５に示す架橋反応では、芳香族基及び架橋形成基を有しない方のオリゴヌクレオチドの５’末端にフルオレセインを導入し、反応物と未反応物を分離し、その比率から架橋反応の効率を算出した。
【０１２５】
図４、図５の結果より、架橋形成基と芳香族基との距離が近い構造を有するオリゴヌクレオチドを用いることにより、より効率よく架橋反応を形成できることが示された。
【０１２６】
（実施例１）アミダイト化合物の合成
（２）アミダイト化合物（Ｙ３）の合成（図１）
（Ｓ）−１−アジド−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物ｇ）
アルゴン雰囲気下、（Ｒ）−１−Ｏ−（１−ナフチルメチル）グリセロール（化合物ｃ）１．９０ｇ（８．１８ｍｍｏｌ）をピリジン８０ｍｌに溶解し、塩化トシル２．３２ｇ（１．５当量）を加えて室温で４時間撹拌した。反応液にエタノール１０ｍｌを加えて過剰の試薬を分解した。減圧下溶媒を留去した後、残渣を酢酸エチル３００ｍｌに溶解し、水１００ｍｌで２回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１００ｍｌで１回、水１００ｍｌで１回、飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、得られたオイル状物質をアルゴン雰囲気下、ジメチルホルムアミド８０ｍｌに溶解し、アジ化ナトリウム１．６０ｇ（３当量）及び塩化アンモニウム１．７５ｇ（４当量）を加えて８０℃で２時間加熱撹拌した。反応液を室温まで冷ました後、酢酸エチル３００ｍｌを加えて、水１００ｍｌで５回、飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｇ）１．３０ｇ（収率６２％）を無色オイル状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6) δ: 8.11-8.06 (m, 1 H), 7.96-7.87 (m, 2 H), 7.59-7.44 (m, 4 H), 5.29 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 4.94 (s, 2 H), 3.83 (dddt, 1 H, J = 3.6, 5.3, 6.3, 6.4 Hz), 3.51 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.9 Hz), 3.46 (dd, 1 H, J = 6.3, 9.9 Hz), 3.29 (dd, 1 H, J = 3.6, 12.6 Hz), 3.21 (ddd, J = 6.4, 12.6 Hz).
【０１２７】
（Ｓ）−１−アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物ｈ）
（Ｓ）−１−アジド−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物ｇ）１．３０ｇ（５．０５ｍｍｏｌ）をエタノール６０ｍｌに溶解し、パラジウム−炭素（１０％）３３０ｍｇを加えて、常圧の水素雰囲気化、室温で１５時間撹拌した。パラジウム触媒をセライトろ過により除去した後、溶液を減圧下濃縮し、標記化合物（化合物ｈ）１．１７ｇ（収率１００％）を得た。当化合物は更なる精製をすることなく、後の反応に用いた。
【０１２８】
（Ｓ）−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリフルオロアセトアミドプロパン−２−オール（化合物ｉ）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−１−アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物ｈ）９００ｍｇ（３．８９ｍｍｏｌ）をメタノール５０ｍｌに溶解し、トリフルオロ酢酸エチル０．９３ｍｌ（２当量）及びトリエチルアミン１．０９ｍｌ（２当量）を加えて、室温で３時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｉ）８６０ｍｇ（収率６８％）を白色固体状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6) δ: 9.34 (br t, 1 H, J = 5.7 Hz), 8.12-8.08 (m, 1 H), 7.96-7.87 (m, 2 H), 7.59-7.45 (m, 4 H), 5.12 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 4.94 (s, 2 H), 3.83 (dddt, 1 H, J = 4.6, 5.3, 5.6, 7.7 Hz), 3.50 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.9 Hz), 3.45 (dd, 1 H, J = 5.6, 9.9 Hz), 3.32 (ddd, 1 H, J = 4.6, 5.7, 13.2 Hz), 3.17 (ddd, 1 H, J = 6.1, 7.7, 13.2 Hz).
【０１２９】
（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリフルオロアセトアミドプロパン（化合物ｊ）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリフルオロアセトアミドプロパン−２−オール（化合物ｉ）５１０ｍｇ（１．５６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ３８ｍｇ（０．２当量）をジメチルホルムアミド２０ｍｌに溶解し、１，１−カルボニルジイミダゾール１９０ｍｇ（０．７５当量）を加えて室温で撹拌した。２時間後、１，１−カルボニルジイミダゾール１９０ｍｇ（０．７５当量）を追加してさらに２時間撹拌した。この反応液に６−アミノ−１−ヘキサノール５５０ｍｇ（３当量）を加えて室温で２時間撹拌した。反応液に酢酸エチル１５０ｍｌを加えて、水５０ｍｌで４回、飽和食塩水５０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｊ）４８７ｍｇ（収率６７％）を白色固体状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6) δ: 9.48 (br s, 1 H), 8.09-8.06 (m, 1 H), 7.96-7.88 (m, 2 H), 7.59-7.44 (m, 4 H), 7.17 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 5.01 (m, 1 H), 4.97 (d, 1 H, J = 11.9 Hz), 4.91 (d, 1 H, J = 11.9 Hz), 4.33 (t, 1 H, J = 5.2 Hz), 3.68-3.57 (m, 2 H), 3.42-3.34 (m, 4 H), 2.93 (dt, 2 H, J = 5.6, 6.9 Hz), 1.42-1.33 (m, 4 H), 1.27-1.20 (m, 4H).
【０１３０】
（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリフルオロアセトアミドプロパン６’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物Ｙ３）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−３−（１−ナフチルメトキシ）−１−トリフルオロアセトアミドプロパン（化合物ｊ）１８８ｍｇ（０．４０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン８ｍｌに溶解し、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト０．１５ｍｌ（１．２当量）、１Ｈ−テトラゾールのアセトニトリル溶液０．９８ｍｌ（０．４５Ｍ，１．１当量）を加え、室温で２０分撹拌した。反応液にクロロホルム３０ｍｌを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍｌで１回、水１０ｍｌで１回、飽和食塩水１０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン−１％トリエチルアミン）により精製して標記化合物（化合物Ｙ３）１７０ｍｇ（収率６３％）を白色固体状物質として得た。
31P NMR (109 MHz, DMSO-d6) δ: 147.21.
【０１３１】
（３）アミダイト化合物（Ｙ４）の合成（図２）
（Ｒ）−１−Ｏ−トシル−３−Ｏ−ジメトキシトリチルグリセロール（化合物ｋ）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−（＋）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール（化合物ｂ）１．２４ｍｌ（１０．０ｍｍｏｌ）をピリジン５０ｍｌに溶解し、塩化トシル３．８１ｇ（２．０当量）を加えて室温で１７時間撹拌した。反応液に水１５ｍｌを加えて過剰の試薬を分解した。減圧下溶媒を留去した後、残渣を酢酸エチル３５０ｍｌに溶解し、水１００ｍｌで１回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１００ｍｌで１回、水１００ｍｌで１回、飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、得られたオイル状物質に８０％酢酸水溶液７０ｍｌを加えて溶解し、室温で２０時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後トルエンとの共沸により酢酸を除き、さらにピリジンと共沸した。アルゴン雰囲気下、この残渣をピリジン６０ｍｌに溶解し、塩化ジメトキシトリチル４．０７ｇ（１．２当量）を加え、室温で２時間撹拌した。エタノール１０ｍｌを加えて反応を止めた後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル３５０ｍｌに溶解し、水１００ｍｌで１回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１００ｍｌで１回、水１００ｍｌで１回、飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｋ）４．５１ｇ（収率８２％）を白色泡状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6)δ: 7.74 (m, 2 H), 7.45 (m, 2 H), 7.29-7.13 (m, 9 H), 6.88-6.84 (m, 4 H), 5.28 (d, 1 H, J = 5.6 Hz), 4.04 (dd, 1 H, J = 3.6, 9.6 Hz), 3.96 (dd, 1 H, J = 5.4, 9.6 Hz), 3.78 (m, 1 H), 3.74 (s, 6 H), 2.94 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.2 Hz), 2.83 (dd, 1 H, J = 6.9, 9.2 Hz), 2.39 (s, 3 H).
【０１３２】
（Ｒ）−３−ジメトキシトリチルオキシ−１−アジドプロパン−２−オール（化合物ｌ）
アルゴン雰囲気下、（Ｒ）−１−Ｏ−トシル−３−Ｏ−ジメトキシトリチルグリセロール（化合物ｋ）９３０ｍｇ（１．７０ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド２０ｍｌに溶解し、アジ化ナトリウム４４０ｍｇ（４当量）及び塩化アンモニウム４５５ｍｇ（５当量）を加えて８０℃で２時間加熱撹拌した。反応液を室温まで冷ました後、酢酸エチル１５０ｍｌを加えて、水５０ｍｌで４回、飽和食塩水５０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｌ）６９０ｍｇ（収率９６％）を黄色オイル状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6)δ: 7.41-7.18 (m, 9 H), 6.91-6.86 (m, 4 H), 5.31 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 3.81 (dtdd, 1 H, J = 3.6, 5.3, 6.3, 6.6 Hz), 3.73 (s, 6 H), 3.36 (dd, 1 H, J = 3.6, 12.5 Hz), 3.28 (dd, 1 H, J = 6.3, 12.5 Hz), 3.00 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.2 Hz), 2.88 (dd, 1 H, J = 6.6, 9.2 Hz).
【０１３３】
（Ｒ）−３−ジメトキシトリチルオキシ−１−アミノプロパン−２−オール（化合物ｍ）
（Ｒ）−３−ジメトキシトリチルオキシ−１−アジドプロパン−２−オール（化合物ｌ）６２０ｍｇ（１．４８ｍｍｏｌ）をエタノール２０ｍｌに溶解し、パラジウム−炭素（１０％）１２０ｍｇを加えて、常圧の水素雰囲気化、室温で６時間撹拌した。パラジウム触媒をセライトろ過により除去した後、溶液を減圧下濃縮し、標記化合物（化合物ｍ）５４８ｍｇ（収率９４％）を白色泡状物質として得た。当化合物は更なる精製をすることなく、後の反応に用いた。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6)δ: 7.42-7.21 (m, 9 H), 6.90-6.86 (m, 4 H), 4.71 (br s, 1 H), 3.73 (s, 6 H), 3.55 (dddd, 1 H, J = 4.0, 5.3, 6.0, 6.9 Hz), 2.94 (dd, 1 H, J = 5.3, 8.9 Hz), 2.83 (dd, 1 H, J = 6.0, 8.9 Hz), 2.68 (dd, 1 H, J = 4.0, 12.8 Hz), 2.46 (dd, 1 H, J = 6.9, 12.8 Hz).
【０１３４】
６−｛Ｎ−［（Ｒ）−３’−ジメトキシトリチルオキシ−２’−ヒドロキシプロピル］カルバモイル｝ナフタレン−２−カルボン酸ペンタフルオロフェニルエステル（化合物ｏ）
アルゴン雰囲気下、２，６−ナフタレンジカルボン酸ジペンタフルオロフェニルエステル（化合物ｎ）８２２ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．７０ｍｌ（４．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン７０ｍｌに溶解し、この溶液に（Ｒ）−３−ジメトキシトリチルオキシ−１−アミノプロパン−２−オール（化合物ｍ）５２０ｍｇ（１．３２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍｌ）を１０分かけて滴下した。室温でさらに１時間撹拌した後、溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｏ）６６４ｍｇ（収率６７％）を白色泡状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6)δ: 9.01 (m, 1 H), 8.65 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 8.51 (m, 1 H), 8.32 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.26 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.19 (dd, 1 H, J = 1.7, 8.6 Hz), 8.02 (dd, 1 H, J = 1.7, 8.6 Hz), 7.45-7.42 (m, 2 H), 7.31-7.17 (m, 7 H), 6.87-6.83 (m, 4 H), 5.12 (d, 1 H, J = 5.6 Hz), 3.94 (m, 1 H), 3.69 (s, 3 H), 3.68 (s, 3 H), 3.56 (m, 1 H), 3.29 (m, 1 H), 3.05-2.96 (m, 2 H).
【０１３５】
６−｛Ｎ−［（Ｒ）−３’−ジメトキシトリチルオキシ−２’−ヒドロキシプロピル］カルバモイル｝−２−｛Ｎ−［Ｎ−（トリフルオロアセチル）−３’’−アミノプロピル］カルバモイル｝ナフタレン（化合物ｐ）
アルゴン雰囲気下、６−｛Ｎ−［（Ｒ）−３’−ジメトキシトリチルオキシ−２’−ヒドロキシプロピル］カルバモイル｝ナフタレン−１−カルボン酸ペンタフルオロフェニルエステル（化合物ｏ）６４０ｍｇ（０．８４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド２０ｍｌに溶解し、１，３−プロパンジアミン０．７０ｍｌ（１０当量）を加えて室温で３０分撹拌した。反応液に酢酸エチル１５０ｍｌを加えて水５０ｍｌで５回洗浄し、有機層を減圧下濃縮した。得られた残渣をアルゴン雰囲気下メタノール１５ｍｌに溶解し、トリフルオロ酢酸エチル０．５０ｍｌ（５当量）及びトリエチルアミン０．５９ｍｌ（５当量）を加えて、室温で１４時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物ｐ）４４０ｍｇ（収率７０％）を白色泡状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6)δ: 9.46 (br s, 1 H), 8.72 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 8.55 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 8.47 (m, 1 H), 8.41 (m, 1 H), 8.09-8.05 (m, 2 H), 7.99-7.91 (m, 2 H), 7.44-7.41 (m, 2 H), 7.31-7.16 (m, 7 H), 6.86-6.82 (m, 4 H), 5.10 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 3.93 (m, 1 H), 3.68 (s, 3 H), 3.67 (s, 3 H), 3.53 (m, 1 H), 3.41-3.23 (m, 5 H), 2.99 (m, 2 H), 1.81 (m, 2 H).
【０１３６】
６−｛Ｎ−［（Ｒ）−３’−ジメトキシトリチルオキシ−２’−ヒドロキシプロピル］カルバモイル｝−２−｛Ｎ−［Ｎ−（トリフルオロアセチル）−３’’−アミノプロピル］カルバモイル｝ナフタレン  ２’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物Ｙ４）
アルゴン雰囲気下、６−｛Ｎ−［（Ｒ）−３’−ジメトキシトリチルオキシ−２’−ヒドロキシプロピル］カルバモイル｝−２−｛Ｎ−［Ｎ−（トリフルオロアセチル）−３’’−アミノプロピル］カルバモイル｝ナフタレン（化合物ｐ）２９８ｍｇ（０．４０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト０．１５ｍｌ（１．２当量）、１Ｈ−テトラゾールのアセトニトリル溶液０．９８ｍｌ（０．４５Ｍ，１．１当量）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液にクロロホルム３０ｍｌを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１５ｍｌで２回、飽和食塩水１５ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン−１％トリエチルアミン）により精製して標記化合物（化合物Ｙ４）２５５ｍｇ（収率６８％）を白色泡状物質として得た。
31P NMR (109 MHz, DMSO-d6)δ: 149.20, 148,95.
【０１３７】
ＤＮＡ自動合成機によってオリゴヌクレオチドを合成後、最後にＹ３、Ｙ４アミダイト体を縮合させ、オリゴヌクレオチドＸｎ−Ｓｐ２５（ｎ＝３〜４）をそれぞれ得た。また芳香族基を有しないオリゴヌクレオチドとして、市販のアミノ基結合ホスホロアミダイト化合物（グレンリサーチ社）を用い、オリゴヌクレオチドの末端にアミノ基を導入したもの（Ｘ１−Ｓｐ２５）、オリゴヌクレオチドとアミノ基の間に芳香族基を有しない直鎖リンカーを導入したオリゴヌクレオチド（Ｘ２−Ｓｐ２５）も比較例として合成した。
【０１３８】
（実施例２）架橋形成基を導入したオリゴヌクレオチドの合成と精製
オリゴヌクレオチドの合成はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー上で行った。
【０１３９】
ＨＰＬＣにはＧｉｌｓｏｎの装置を用い、分析はＷａｔｅｒｓ９９６フォトダイオードアレイ検出器を用いて行った。逆相分析用カラムとしてμ−ボンダスフィアー（Ｃ−１８）カラムΦ３．９ｘ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製）、陰イオン交換分析用として東ソーＴＳＫ−ＧＥＬ  ＤＥＡＥ−２ＳＷ（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）を使用した。移動相として、逆相の場合には０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０）中アセトニトリル、陰イオン交換の場合には２０％アセトニトリル水中ギ酸アンモニウムの濃度勾配を用いた。
【０１４０】
オリゴヌクレオチドの合成
下記の各オリゴヌクレオチドを、デオキシヌクレオシド３’−ホスホロアミダイト（日本テクノサービス社より購入）を原料として、ＤＮＡ自動合成機（モデル３９４Ａ；（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業部製）で、０．２又は１μｍｏｌスケールで合成した。
Ｘｎ−Ｓｐ２５（ｎ＝１〜４）：５’−Ｘｎ−ＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣ−３’（配列番号１）
Ｆ−ＡＳＳｐ１６Ｚ：５’−Ｆ−ｄ（ＧＡＡＴＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＺ）−３’
Ｆ−ＡＳＳｐ１６ｒＧ：５’−Ｆ−ｄ（ＧＡＡＴＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴ）ｒＧ−３’
ＡＳＳｐ３２：５’−ｄ（ＧＡＡＴＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＣＴＴＧＣＴＴＡＡＡＧＴＣ）−３’
（Ｆはフルオレセインを示す）
【０１４１】
Ｘ１−Ｓｐ２５及びＸ２−Ｓｐ２５のオリゴヌクレオチドの５’末端に導入するアミノ基にはＮ−モノメトキシトリチル−６−アミノヘキシルホスホロアミダイト（グレンリサーチ社）を用いた。Ｘ３−Ｓｐ２５、Ｘ４−Ｓｐ２５のアミノ基の導入は、Ｙ３、Ｙ４のホスホロアミダイト化合物を用いて行った。合成したオリゴヌクレオチドの構造を図３に示す。
【０１４２】
合成終了後、オリゴヌクレオチドは以下のように処理し精製した。濃アンモニア水でＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ）よりオリゴヌクレオチドを切り出し、５０℃で１２時間加温後、溶媒を留去し、脱イオン水に溶解した。Ｘ１−Ｓｐ２５及びＸ２−Ｓｐ２５については、Ｃ１８（ウォーターズ社製）オープンカラムクロマトグラフィーを行なった（カラムサイズ０．８ｘ１８ｃｍ：５−５０％アセトニトリル、０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（以下「ＴＥＡＡ」という）水溶液の溶媒を用いた直線濃度勾配により溶出）。約３０％濃度のアセトニトリルで溶出されたフラクションを集め、濃縮し、２ｍｌの８０％酢酸水溶液を加え、６０分間攪拌し、モノメトキシトリチル基を除去した。酢酸を減圧下留去し、水層を酢酸エチルで洗浄した。溶媒を留去後、滅菌水１ｍｌに溶解した。
【０１４３】
（実施例３）１−デアザ−２’−デオキシグアノシンＣＰＧ樹脂結合体の合成
３−［２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−スクシニル−β−Ｄ−リボフラノシル］−５−（Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミジノ）アミノ−７−（Ｎ，Ｎ−ジフェニルカルバモイル）オキシイミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン
アルゴン雰囲気下、３−［２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−５−（Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミジノ）アミノ−７−（Ｎ，Ｎ−ジフェニルカルバモイル）オキシイミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．３１，７１７５−７１８８（２００３）に従って合成）２２０ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）をピリジン４ｍｌに溶解し、無水コハク酸７２ｍｇ（３当量）及びＤＭＡＰ２９ｍｇ（１当量）を加えて室温で２日間撹拌した。水０．５ｍｌを加えた後、減圧下溶媒を留去した。残渣をクロロホルム７０ｍｌに溶解し、飽和リン酸二水素カリウム水溶液２５ｍｌで２回、飽和食塩水２５ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル、溶出溶媒：エタノール−クロロホルム）により精製して標記化合物２１９ｍｇ（収率９２％）を白色泡状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6) δ: 8.44 (s, 1 H), 8.30 (s, 1 H), 6.65 (s, 1 H), 7.51-7.40 (m, 8 H), 7.31-7.26 (m, 4 H), 7.21-7.13 (m, 7 H), 6.78-6.72 (m, 4 H), 6.43 (t, 1 H, J = 6.5 Hz), 5.57 (m, 1 H), 4.11 (ddd, 1 H, J = 3.6, 4.0, 6.3 Hz), 3.67 (s, 3 H), 3.65 (s, 3 H), 3.43 (t, 2 H, J = 7.3 Hz), 3.24 (t, 2 H, J = 7.2 Hz), 3.31 (dd, 1 H, J = 6.3, 10.2 Hz), 3.16 (dd, 1 H, J = 3.6, 10.2 Hz), 2.55-2.47 (m, 6 H), 1.59-1.41 (m, 4 H), 1.28 (m, 2 H), 1.18 (m, 2 H), 0.90 (t, 3 H, J = 7.3 Hz), 0.82 (t, 3 H, J = 7.3 Hz).
【０１４４】
３−［２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−５−（Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミジノ）アミノ−７−（Ｎ，Ｎ−ジフェニルカルバモイル）オキシイミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３’−Ｏ−スクシニル−ＣＰＧユニット
アルゴン置換したガラスバイアル中、３−［２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−スクシニル−β−Ｄ−リボフラノシル］−５−（Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミジノ）アミノ−７−（Ｎ，Ｎ−ジフェニルカルバモイル）オキシイミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン１４０ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）２７ｍｇ（１当量）をジメチルホルムアミド５ｍｌに溶解し、ＣＰＧ樹脂（ＣＰＧ  ｉｎｃ）４００ｍｇ（３６μｍｏｌ）を加え密栓して室温で５日間振盪した。ＣＰＧ樹脂をジメチルホルムアミド、ピリジン及び塩化メチレンで洗浄した後、室温で１時間減圧乾燥した。アルゴン置換したガラスバイアル中、乾燥したＣＰＧ樹脂にキャッピイング溶液（０．１ＭのＤＭＡＰを含むピリジン：無水酢酸（９：１）溶液）５ｍｌを加えて密栓し、室温で２時間振盪した。ＣＰＧ樹脂をピリジン及び塩化メチレンで洗浄して標記化合物（収量３２．５μｍｏｌ／ｇ）を得た。
【０１４５】
フルオレセイン結合オリゴヌクレオチドの合成
１−デアザ−２’−デオキシグアノシンＣＰＧ樹脂とグアノシンＣＰＧ樹脂を用い、３’末端に１−デアザ−２’−デオキシグアノシン又はグアノシンを有するオリゴヌクレオチド（Ｆ−ＡＳＳｐ１６Ｚ、Ｆ−ＡＳＳｐ１６ｒＧ）をＤＮＡ自動合成機により合成した。合成したオリゴヌクレオチドの５’末端に市販のフルオレセインのアミダイト体（グレンリサーチ社）を縮合させ、５’−フルオレセイン−３’−（１−デアザ−２’−デオキシグアノシン）オリゴヌクレオチド（Ｆ−ＡＳＳｐ１６Ｚ）及び５’フルオレセイン−３’−グアノシンオリゴヌクレオチド（Ｆ−ＡＳＳｐ１６ｒＧ）をそれぞれ合成した。
【０１４６】
精製
Ｘｎ−Ｓｐ２５（ｎ＝１〜４）、ＡＳＳｐ３２、Ｆ−ＡＳＳｐ１６Ｚ、Ｆ−ＡＳＳｐ１６ｒＧは、逆相ＨＰＬＣで分取し精製した。逆相ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。カラムにはμ−ボンダスフィアー（Ｃ−１８）カラムΦ３．９ｘ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製）を使用した。
【０１４７】
溶液１
Ａ溶液  ５％アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
Ｂ溶液  ５０％アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
【０１４８】
【表１】
2006075082.tif 000017
【０１４９】
カラム温度：５０℃
溶液２
Ａ溶液  ５％アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
Ｂ溶液  ２５％アセトニトリル／０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
カラム温度：５０℃
カラムＡ：μ−ボンダスフィアー（Ｃ−１８）カラムΦ３．９ｘ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製）
カラムＢ：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（Ｃ−１８）カラムΦ８．０ｘ３００ｍｍ（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅ社製）
【０１５０】
（実施例４）架橋反応
Ｆ−ＡＳＳｐ１６Ｚの脱グリコシル反応
Ｆ−ＡＳＳｐ１６Ｚ（１ｎｍｏｌ）を０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２；１００μＬ）に溶解し、４０℃で３０分間加温した。その後ＮＡＰ１０カラム（ファルマシア社）により脱塩し、溶出液を集めた。逆相ＨＰＬＣにより脱グリコシル化が進行したことを確認した。Ｆ−ＡＳＳｐ１６Ｚの３’末端の１−デアザ−２’−デオキシグアノシンの脱グリコシル化されたオリゴヌクレオチドを以下Ｆ−ＡＳＳｐ１６Ｚ（Ｈ＋）とする。
【０１５１】
オリゴヌクレオチドの架橋反応−１（図４ａ）
３’末端１−デアザ−２’−デオキシグアノシンが脱グリコシル化されたＦ−ＡＳＳｐ１６Ｚ（Ｈ＋）（１２ｐｍｏｌ）を、Ｘｎ−Ｓｐ２５（ｎ＝１〜３；２４ｐｍｏｌ）、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝溶液、５ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣＮＢＨ３（水素化ホウ素シアノナトリウム）と混合し（全反応容量３０μＬ）、３７℃で加温した。反応開始後一定時間後に反応停止溶液（５μＬ：１０Ｍ  尿素、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａ２、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノール）に反応液を一定量サンプリングして反応を停止させた。サンプリングした反応停止溶液を、８Ｍ  尿素を含む１５％ポリアクリルアミドゲルによって分析した。架橋反応によって生成したオリゴヌクレオチドと、未反応のＦ−ＡＳＳｐ１６Ｚ（Ｈ＋）の蛍光強度をバイオイメージングアナライザー（バイオラド社）によって測定し、架橋率を算出した。
【０１５２】
架橋反応−２（３’末端がＲＮＡであるオリゴヌクレオチドとの架橋反応；図４ｂ）
Ｆ−ＡＳＳｐ１６ｒＧ（１２ｐｍｏｌ）を５０ｍＭ  ＴＥＡＡ緩衝溶液（ｐＨ７）及び５〜４０μＭの過ヨウ素酸ナトリウムを含む反応溶液（２０μＬ）に溶解し、３７℃で加温し、Ｆ−ＡＳＳｐ１６ｒＧの３’末端の過ヨウ素酸酸化を行った。１時間後、Ｘｎ−Ｓｐ２５（２４ｐｍｏｌ：ｎ＝１〜４）、４００ｍＭ  水素化ホウ素シアノナトリウム（７．５μＬ）を加え、全量を３０μＬとし、３７℃で加温し架橋反応を行った。一定時間後に２．５μＬを反応液よりとり、反応停止溶液（５μＬ：１０Ｍ  尿素、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａ２、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノール）に加え反応を停止させた。生成物の分析と架橋率の算出は、Ｆ−ＡＳＳｐ１６Ｚと同様の方法で行った。
【０１５３】
オリゴヌクレオチドの架橋反応−３（Ｘ４−ＳＰ３５を用いた架橋反応：図４ｃ）
Ｆ−ＡＳＳｐ１６ｒＧ（１２ｐｍｏｌ）を５０ｍＭ  ＴＥＡＡ緩衝溶液（ｐＨ７）及び５〜４０μＭの過ヨウ素酸ナトリウムを含む反応溶液（２０μＬ）に溶解し、３７℃で加温し、Ｆ−ＡＳＳｐ１６ｒＧの３’末端の過ヨウ素酸酸化を行った。１時間後、Ｘ４−Ｓｐ３５（２４ｐｍｏｌ）、４００ｍＭ  水素化ホウ素シアノナトリウム（７．５μＬ）を加え、全量を３０μＬとし、３７℃で加温し架橋反応を行った。一定時間後に２．５μＬを反応液よりとり、反応停止溶液（５μＬ：１０Ｍ  尿素、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａ２、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノール）に加え反応を停止させた。生成物の分析と架橋率の算出は、Ｆ−ＡＳＳｐ１６Ｚと同様の方法で行った。
【０１５４】
オリゴヌクレオチドの架橋反応−４（図５）
３’末端１−デアザ−２’−デオキシグアノシンが脱グリコシル化されたＦ−Ｓｐ１７Ｚ（Ｈ＋）（１２ｐｍｏｌ）とＡＳ−Ｓｐ３２（２４ｐｍｏｌ）を滅菌水（１２μＬ）に溶解し、Ｘｎ−Ｓｐ２５（ｎ＝１〜３；２４ｐｍｏｌ）、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（３μＬ）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム（１．５μＬ）、４００ｍＭ  水素化ホウ素シアノナトリウム（７．５μＬ）と滅菌水を添加し（全反応容量３０μＬ）、３７℃で加温した。反応開始後一定時間後に反応停止溶液（５μＬ：１０Ｍ  尿素、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａ２、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノール）に反応液を一定量サンプリングして反応を停止させた。サンプリングした反応停止溶液を、８Ｍ  尿素を含む１５％ポリアクリルアミドゲルによって分析した。架橋反応によって生成したオリゴヌクレオチドと、未反応のＦ−Ｓｐ１７Ｚ（Ｈ＋）の蛍光強度をバイオイメージングアナライザー（バイオラド社）によって測定し、架橋率を算出した。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】アミダイト化合物（Ｙ３）の合成方法を示す。
【図２】アミダイト化合物（Ｙ４）の合成方法を示す。
【図３】合成したオリゴヌクレオチドの配列と構造を示す。Ａはオリゴヌクレオチド部分を示す。
【図４】架橋反応−１（ａ）、−２（ｂ）、−３（ｃ）を図示する。また、架橋反応−１の反応速度定数（ｄ）、架橋反応−２、−３の反応速度定数（ｅ）を示す。
【図５】架橋反応−４（ａ）とその反応の速度定数（ｂ）を示す。
【図６】本発明の架橋反応の概念図を表す。
【配列表フリーテキスト】
【０１５６】
配列番号１〜４：合成オリゴヌクレオチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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