(57)【要約】【課題】  高速に且つ高精度に試料中の蛍光標識の測定を行うことのできる蛍光検出装置を提供する。【解決手段】  蛍光標識物質の加えられた試料が流される流路に励起光を照射して蛍光検出を行う蛍光検出装置１である。そして、励起光となるレーザ光を出力するＳＨＧ・ＹＡＧレーザ１０と、試料にレーザ光を集束させて照射するとともに試料から発せられる蛍光を受ける対物レンズ１６と、対物レンズ１６を駆動するレンズ駆動手段２０と、ビームスプリッタ１２により分離された蛍光を検出するＡＰＤ１４と、ＳＨＧ・ＹＡＧレーザ１０の出力をモニタする光センサ１３と、光センサ１３の出力を参照してＡＰＤ１４の出力信号の利得を制御する利得制御回路１９とを備え、レンズ駆動手段２０の駆動によりレーザ光の焦点が流路中をジグザグに移動して試料に励起光の照射がなされる構成とした。【選択図】        図１
2006242726.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識物質の加えられた試料が流される流路に励起光を照射して蛍光検出を行う蛍光検出装置であって、
前記励起光となるレーザ光を出力するＳＨＧ・ＹＡＧレーザと、
前記試料にレーザ光を集束させて照射するとともに該試料から発せられる蛍光を受ける開口数が０．３以上の対物レンズと、
前記対物レンズをレーザ光の焦点方向および前記流路を横断する方向に駆動するレンズ駆動手段と、
前記ＳＨＧ・ＹＡＧレーザから対物レンズ側へ進行するレーザ光と前記対物レンズ側から逆行してくる蛍光とを分離するビームスプリッタと、
このビームスプリッタにより分離された蛍光を検出するアバランシェ・フォトダイオードからなる第１光センサと、
前記ＳＨＧ・ＹＡＧレーザの出力を検出する第２光センサと、
この第２光センサの出力を参照して前記第１光センサの出力信号の利得を制御する利得制御回路とを備え、
前記レンズ駆動手段の駆動により前記レーザ光の焦点が前記流路中を前記焦点方向と横断方向とにジグザグに移動して前記試料に励起光の照射がなされるように構成されていることを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
蛍光標識物質の加えられた試料が流される流路に励起光を照射して蛍光検出を行う蛍光検出装置であって、
前記励起光となるレーザ光を出力するレーザ出力手段と、
前記レーザ光を集束させて前記試料に照射するとともに該試料から発せられる蛍光を受ける対物レンズと、
前記対物レンズ側へ進行する前記レーザ光と前記対物レンズ側から逆行してくる蛍光とを分離するビームスプリッタと、
このビームスプリッタにより分離された蛍光を検出する第１光センサと、
前記対物レンズをレーザ光の焦点方向および前記流路を横断する方向に駆動するレンズ駆動手段とを備え、
前記レンズ駆動手段の駆動により前記レーザ光の焦点が前記流路中をジグザグに移動して前記試料に励起光の照射がなされるように構成されていることを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項３】
蛍光標識物質が加えられた試料に励起光を照射して蛍光検出を行う蛍光検出装置であって、
前記励起光となるレーザ光を出力するレーザ出力手段と、
前記試料にレーザ光を集束させて照射するとともに該試料から発せられる蛍光を受ける対物レンズと、
前記レーザ出力手段から前記対物レンズ側へ進行するレーザ光と前記対物レンズ側から逆行してくる蛍光とを分離するビームスプリッタと、
このビームスプリッタにより分離された蛍光を検出する第１光センサと、
前記レーザ出力手段の出力を検出する第２光センサと、
この第２光センサの出力を参照して前記第１光センサの出力信号の利得を制御する利得制御回路と、
を備えていることを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項４】
前記レーザ出力手段はＳＨＧ・ＹＡＧレーザであることを特徴とする請求項２又は３に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記対物レンズの開口数が０．３以上であることを特徴とする請求項２〜４の何れかに記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記第１光センサはアバランシェ・フォトダイオード又はＰＩＮ型フォトダイオードであることを特徴とする請求項２〜５の何れかに記載の蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、蛍光標識物質を加えた試料を用いて生体系の高分子等を検出する蛍光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
以前より、生体系の高分子を検出する検出装置として、蛍光標識物質が加えられた試料に波長５３２ｎｍのＳＨＧ（Second Harmonic Generation：２次高調波発生）・ＹＡＧ（イットリウム・アルミニウム・ガーネット）レーザを照射して蛍光検出を行う蛍光検出装置が提案されている（例えば特許文献１〜３）。
【０００３】
また、試料に励起光を照射するとともに試料から発せられる蛍光をダイクロイックミラーで分光して観察する落射蛍光顕微鏡なども知られている（例えば特許文献４）。
【特許文献１】特開２００２−２９６１８４号公報
【特許文献２】特開２００３−９８０８７号公報
【特許文献３】特開２００３−２３２７３３号公報
【特許文献４】特開平１１−２２３７７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記従来の蛍光検出装置では、何れも試料を載せたステージを前後左右に移動させることで、励起光を試料の所定領域に当てて試料を走査するようになっており、この構成からもその検出速度は非常に遅いことが分かる。
【０００５】
そこで、本発明者らは、上記のような蛍光検出を高速（例えば従来の１０００倍以上）に行えないか検討した。また、高速化を実現する上で、蛍光の検出感度を十分に維持しつつ、蛍光標識の測定誤差をできるだけ減らして測定精度を高くする必要があると考えた。
【０００６】
特に、蛍光検出に用いられる高出力のレーザ（ＳＨＧ・ＹＡＧレーザ）は、その出力パワーが比較的大きく変動しやすいという特性を有しており、検出速度を上げることで、この出力パワーの揺らぎが蛍光標識の大きな測定誤差となって現れることが考えられた。
【０００７】
この発明の目的は、従来の１０００倍以上と云った高速な蛍光検出を可能とし、さらに高感度に且つ高精度に蛍光標識の測定を行うことのできる蛍光検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
また、本発明は、上記目的を達成するため、蛍光標識物質の加えられた試料が流される流路に励起光を照射して蛍光検出を行う蛍光検出装置であって、前記励起光となるレーザ光を出力するレーザ出力手段（例えばＳＨＧ・ＹＡＧレーザ）と、前記レーザ光を集束させて前記試料に照射するとともに該試料から発せられる蛍光を受ける対物レンズと、前記対物レンズ側へ進行する前記レーザ光と前記対物レンズ側から逆行してくる蛍光とを分離するビームスプリッタと、このビームスプリッタにより分離された蛍光を検出する第１光センサと、前記対物レンズをレーザ光の焦点方向および前記流路を横断する方向に駆動するレンズ駆動手段とを備え、前記レンズ駆動手段の駆動により前記レーザ光の焦点が前記流路中をジグザグに移動して（フォーカス方向と横断方向の両方向に振動させてジグザグに移動させても良いし、何れか一方向のみ振動させてジグザグに移動させても良い）前記試料に励起光の照射がなされる構成とした。
【０００９】
このような手段によれば、対物レンズを駆動させて励起光の焦点位置を変位させ流路中の試料を走査するので、非常に高速な試料の蛍光検出を実現することが出来る。また、対物レンズをフォーカス方向に移動させて試料の深さ方向にも走査を行えるので、より高精度な測定を行うことが出来る。なお、ＤＶＤなどの光ディスクの分野で用いられるレンズ駆動手段を用いることで、対物レンズは非常に高速に動かすことが可能であり、従来の試料ステージを動かして試料の走査を行うものに較べて、１０００倍以上の高速化が可能である。
【００１０】
また、本発明は、上記目的を達成するため、蛍光標識物質が加えられた試料に励起光を照射して蛍光検出を行う蛍光検出装置であって、前記励起光となるレーザ光を出力するレーザ出力手段（例えばＳＨＧ・ＹＡＧレーザ）と、前記試料にレーザ光を集束させて照射するとともに該試料から発せられる蛍光を受ける対物レンズと、前記レーザ出力手段から前記対物レンズ側へ進行するレーザ光と前記対物レンズ側から逆行してくる蛍光とを分離するビームスプリッタと、このビームスプリッタにより分離された蛍光を検出する第１光センサと、前記レーザ出力手段の出力を検出する第２光センサと、この第２光センサの出力を参照して前記第１光センサの出力信号の利得を制御する利得制御回路とを備えている構成とした。
【００１１】
高速測定を行う場合、なんら工夫がないとレーザの出力パワーの揺らぎが大きな測定誤差となって現れてしまうが、上記の利得制御回路により、蛍光検出を行う第１光センサの出力からレーザのパワー変動の影響を除去して、蛍光標識の測定誤差を少なくすることが出来る。
【００１２】
好ましくは、前記対物レンズの開口数は０．３以上とすると良い。さらに好ましくは、前記第１光センサとしてアバランシェ・フォトダイオードやＰＩＮ型フォトダイオードを用いると良い。このような構成とすることで、高速な測定を行っても高い感度で蛍光の検出を行うことができ、測定誤差をより小さくすることが出来る。
【発明の効果】
【００１３】
以上説明したように、本発明に従うと、試料を載せたステージを移動させて試料の走査を行う従来のタイプと比較して、１０００倍以上高速に試料の走査を行って蛍光検出を行うことが出来る。また、高速走査を行っても、高感度に且つ高精度に蛍光標識の測定を行うことが出来るという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
【００１５】
図１は、本発明の実施の形態の蛍光検出装置の全体を示す構成図、図２は試料が搭載される標本プレートの一例を示す平面図である。
【００１６】
この実施の形態の蛍光検出装置１は、例えば人の唾液に試薬を加えた試料を電気泳動により標本プレート４０の微細な流路に流しながら、この流路に励起光であるレーザ光を照射して発せられた蛍光の量を測定する装置である。試薬には特定の高分子と結合する蛍光標識物質が含まれており、上記の蛍光検出により試料（唾液）に含まれる高分子の測定が可能となる。
【００１７】
この蛍光検出装置１には、蛍光標識物質の励起光となる波長５３２ｎｍのレーザ光を出力するＳＨＧ・ＹＡＧレーザ１０と、ビーム経路を曲げる反射ミラー１１と、レーザ光と標本から発せられた蛍光とを分離するビームスプリッタ１２と、レーザ光の一部の反射光を検出してレーザの出力パワーをモニタする出力モニタ用の光センサ（第２光センサ）１３と、ビームスプリッタ１２により分離された蛍光を高い感度で検出するアバランシェ・フォトダイオードからなる光センサ（第１光センサ）１４と、レーザ光を平行光線にするコリメータレンズ１５と、レーザ光を試料に集束させる対物レンズ１６と、試料が搭載される標本プレートをＸＹ方向に搬送する搬送ステージ１７と、出力モニタ用の光センサ１３のセンサ出力を参照して蛍光検出用の光センサ１４のセンサ出力の利得を制御するＡＧＣ（Auto Gain Control）回路１９と、対物レンズ１６を焦点方向（Ｆ方向）とそれに直交する横方向（Ｔ方向）とに駆動するレンズアクチュエータ（レンズ駆動手段）２０等が設けられている。
【００１８】
ＳＨＧ・ＹＡＧレーザ１０は、例えば５０ｍＷ程度の高い出力を行うものである。このようなレーザでは出力パワーに１０〜２０％程度の揺らぎを生じることがある。
【００１９】
対物レンズ１６は、開口数（ＮＡ）が０．３以上、好ましくは０．４５以上のものを採用する。これにより試料から発せられた蛍光を大きな割合で受けて光センサ１４側に導くことが可能となり、検出感度の向上を図ることが出来る。
【００２０】
ビームスプリッタ１２は、レーザ光の波長である波長５３２ｎｍの光を１００パーセント近く透過する一方、蛍光の波長である波長５７０ｎｍの光を１００パーセント近く反射するフィルタ特性を有するものである。この特性により、レーザ光はほとんどパワーロスなく試料に照射され、試料から発せられて対物レンズ１６とコリメータレンズ１５を経てきた蛍光は１００パーセント近く光センサ１４側に送られるようになっている。なお、レーザ光の出力は非常に高いので、ビームスプリッタ１２によりごく僅かに反射されたレーザ光が出力モニタ用の光センサ１３に入射してそれによりレーサ光の出力パワーのモニタが可能になっている。
【００２１】
ＡＧＣ回路１９は、蛍光を検出する光センサ１４のセンサ出力を増幅するとともに、その増幅率を出力モニタ用の光センサ１３の出力で割り算するするような利得制御を行う回路である。蛍光標識物質から発せられる蛍光量は、照射される励起光の光量に比例して変動するため、上記のような利得制御により、レーザパワーの揺らぎに依存した光センサ１４の出力からこの揺らぎの影響を除去することが出来る。
【００２２】
なお、蛍光の光量に比べてレーザ１０の出力パワーは非常に大きいため、標本プレート４０に照射され散乱したレーザビームの戻り光が、ビームスプリッタ１２で僅かに反射して光センサ１４側に送られセンサ信号のノイズとなって現れることがあるが、このようなノイズが現れる場合には、出力モニタ用の光センサ１３のセンサ信号により、このノイズを除去することも出来る。すなわち、光センサ１３のセンサ信号をレーザビームの戻り光となる割合分、縮小して光センサ１４の出力から減じることで上記のノイズを除去することが出来る。
【００２３】
試料が搭載される標本プレート４０は、唾液が貯められる唾液ポッド４１、希釈水が投下される希釈水ポッド４２，４２、希釈撹拌用の撹拌ポッド４３、蛍光標識物質を含んだ試薬が投下される試薬ポッド４４〜４７、試料を電気泳動させるための電極４８…、これらを結ぶ複数のマイクロ流路等が薄いプレートの上面に形成され、さらに、撹拌ポッド４３やマイクロ流路が透明樹脂等の膜により覆われた構成となっている。
【００２４】
複数のマイクロ流路のうち撹拌ポッド４３から電極４８…にかけて伸びる４本のマイクロ流路５１〜５４が、蛍光検出を行う試料が流される流路であり、この流路の一部の範囲５１ａ〜５４ａにレーザ光が照射されて蛍光標識の測定が行われるようになっている。マイクロ流路５１〜５４は、例えば、幅が５０μｍで、深さが１０μｍ程度の大きさである。
【００２５】
図１の搬送ステージ１７は、上記マイクロ流路５１〜５４の測定対象範囲５１ａ〜５４ａを、レーザ光の照射位置に来るように標本プレート４０をＸＹ方向に搬送するものである。
【００２６】
図３には、対物レンズ１６を駆動するレンズアクチュエータ２０の詳細な斜視図を示す。
【００２７】
レンズアクチュエータ２０は、土台となるフレーム２０Ａと、対物レンズ１６を保持するレンズホルダ２１と、このレンズホルダ２１を支持する４本のワイヤ２２…と、レンズホルダ２１の側面に取り付けられた複数の電磁コイル（図示略）と、この電磁コイルに対向配置された磁石２３、２３等により構成される。磁石２３，２３と４本のワイヤ２２…の一端側はフレーム２０Ａ側に固定され、レンズホルダ２１と電磁コイルとは４本のワイヤ２２…により中空に浮いた状態にされている。
【００２８】
そして、レンズホルダ２１を支持するワイヤ２２…を介して電磁コイルに電流を流すことにより、電磁コイルと磁石２３，２３との間に電磁力が生じてレンズホルダ２１をフォーカス方向（Ｆ方向）とそれに直交する横方向（Ｔ方向）とに高速駆動可能なようになっている。
【００２９】
次に、上記構成の蛍光検出装置１の動作説明を行う。
【００３０】
図４は、対物レンズの駆動により標本プレートの流路にレーザ光が照射されている状態を示した説明図、図５は蛍光を検出する光センサ１４のセンサ信号から蛍光標識物体の検出信号を生成する信号処理の過程を説明する図である。
【００３１】
この実施の形態の蛍光検出装置１では、先ず、標本プレート４０の唾液ポッド４１に唾液を載せ、この標本プレート４０を装置内に挿入して検出動作をスタートさせる。すると、標本プレート４０に希釈水と試薬が投入され、これらの試料が電気泳動によりマイクロ流路５１〜５４に流される。そして、このような標本プレート４０が搬送ステージ１７により搬送されて、先ず１本目のマイクロ流路５１がレーザ照射位置にセットされる。
【００３２】
マイクロ流路５１がレーザ照射位置にセットされたら、ＳＨＧ・ＹＡＧレーザ１０が駆動して、マイクロ流路５１へのレーザ光の照射が開始される。図４に示すように、レーザ光の照射は、レンズアクチュエータ２０が対物レンズ１６をＴ方向に一定の振幅で振動させながら対物レンズ１６の高さをスライドさせていくことで、レーザ光の焦点がマイクロ流路５１の断面のほぼ全域をジグザグに走査していくように行われる。
【００３３】
ここで、レンズアクチュエータ２０のＴ方向の振幅は、その振動周波数に応じて変化するため、その周波数を適宜設定することで、マイクロ流路の横幅長に合った振動振幅を容易に得ることが出来る。
【００３４】
なお、レンズアクチュエータ２０が対物レンズ１６をＴ方向とＦ方向との両方に異なる振動周波数で振動させることで、レーザ光の焦点がフォーカス方向と流路の横断方向との両方向にジグザグに移動して流路５１の断面のほぼ全域が走査されるようにしても良い。
【００３５】
そして、このような走査の途中、レーザ光の焦点位置に蛍光標識物質があれば、焦点位置から蛍光が発せられて、それが開口数の大きな対物レンズ１６により受光され、コリメータレンズを経て光センサ１４の受光面に集束されて検出される。このとき、レーザビームは試料中を透過して焦点位置でほとんど散乱しないので、レーザビームのパワーが非常に高くても、レーザビームの反射光が対物レンズ１６とコリメータレンズ１５を経て光センサ１４の受光面に集束される量は微小なものとなり、蛍光を検出する上で障害とならない。
【００３６】
そして、このような動作により、光センサ１４から図５（ａ）のような信号が出力される。ここで、レーザ光の出力パワーは１０％〜２０％の揺らぎがあり、蛍光の光量は、照射されたレーザのパワーに比例して増減するため、このセンサ信号はレーザパワーの変動の影響を受けたものとなる。さらに、レーザビームの戻り光も完全にゼロとはならず、センサ信号にノイズとなって現れることがある。
【００３７】
次いで、上記のセンサ信号はＡＧＣ回路１９に入力されて上述したようなレーザパワーに応じたゲインコントロールとノイズ除去が行われる。そして、図５（ｂ）のような、レーザパワーの変動の影響が除去された信号に変換される。次に、この信号が蛍光標識物質の検出を表わす検出レベルＬ１を超えているか否かで２値化処理され、それにより蛍光標識物質の検出を表わす２値信号（図５（ｃ））が生成され、この信号に基づき蛍光標識物質の量が計測される。
【００３８】
そして、このような蛍光検出を、例えば、マイクロ流路５１を流れる試料の流速を制御しながら一定時間行うことで、一定体積中の蛍光標識物質の計測が行われる。また、このような蛍光検出を、搬送ステージ１７の駆動によりその他のマイクロ流路５２〜５４を順次レーザ照射位置に配置して行うことで、複数種類の試薬が投与された各試料について蛍光標識物質の計測が行われる。
【００３９】
以上のように、この実施の形態の蛍光検出装置１によれば、対物レンズ１６を高速に変位させて試料を走査していく構成なので、従来の試料を載せたステージを移動させて試料を走査させる形式と比較して、非常に高速な蛍光検出を行うことが出来る。
【００４０】
また、その際、レーザパワーの揺らぎが蛍光の検出信号に影響を及ぼすが、ＡＧＣ回路１９等によりそのような影響を除去して、正確な蛍光の検出信号が得られるようになっている。
【００４１】
また、レーザの焦点位置から発せられた蛍光は開口数の大きな対物レンズ１６で受け、それをコリメータレンズ１５を介して光センサ１４の受光面に集束して検出する構成なので、微小量の蛍光でも感度よく検出できるようになっている。また、光センサ１４としてアバランシェダイオードを用いることでより高感度な検出を実現している。
【００４２】
なお、本発明は、上記実施の形態に限られるものではなく、様々な変更が可能である。例えば、対物レンズを駆動するアクチュエータの構成は、例えば、光ディスクの対物レンズのアクチュエータとして提案されている種々の構造を適用することが出来る。また、蛍光を検出する素子としてＰＩＮフォトダイオードを用いても良い。
【００４３】
また、蛍光検出装置の光学系構成の他の一例の構成図である図６に示すように、励起光であるレーザ光と試料から発せられた蛍光とを分離させる光学部品として、レーザ波長を透過するロングパスフィルターやバンドパスフィルターの特性を有するエキサイター３１、レーザ波長を反射し蛍光の波長を透過させる特性を有するダイクロイックミラー３２、蛍光の波長を透過するバンドパス特性を有するエミッター３３を組み合わせた構成を用いても良い。そして、試料から発せられ対物レンズ１６で受けた蛍光を、ダイクロイックミラー３２とエミッター３３を介して抽出し、集束レンズ３４で光センサ１４の受光面に集束させて検出する構成とする。このような光学構成により、励起光と蛍光とのクロストークを低減し、より多くのレーザエネルギーを試料側に送り、より多くの蛍光エネルギーを光センサ１４側に送ることが出来る。
【００４４】
また、上記実施の形態では、対物レンズをフォーカス方向と流路の横断方向とに駆動させる構成としたが、対物レンズをフォーカス方向に駆動させず横方向のみ駆動する構成としても、深さ方向の走査が必要のない試料の場合には検出処理の高速化と云う同様の効果が奏される。
【００４５】
その他、標本プレートに形成されたマイクロ流路の大きさやそのパターン、試料の種類などは、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の実施の形態の蛍光検出装置の全体を示す構成図である。
【図２】試料の流路が形成された標本プレートの一例を示す平面図である。
【図３】対物レンズの駆動装置の詳細を示す斜視図である。
【図４】対物レンズの駆動により標本プレートの流路にレーザ光が照射されている状態を示す説明図である。
【図５】蛍光を検出する第１光センサの検出信号から蛍光標識物体の検出信号を生成する信号処理の過程を説明する図である。
【図６】本発明に係る蛍光検出装置において光学系構成の他の一例を示す構成図である。
【符号の説明】
【００４７】
１      蛍光検出装置
１０    ＳＨＧ・ＹＡＧレーザ
１２    ビームスプリッタ
１３    出力モニタ用の光センサ（第２光センサ）
１４    蛍光検出用の光センサ（第１光センサ）
１５    コリメータレンズ
１６    対物レンズ
１７    搬送ステージ
１９    ＡＧＣ回路（利得制御回路）
２０    レンズアクチュエータ（レンズ駆動手段）
４０    標本プレート
５１〜５４    マイクロ流路
【図１】
2006242726.tif 000003
【図２】
2006242726.tif 000004
【図３】
2006242726.tif 000005
【図４】
2006242726.tif 000006
【図５】
2006242726.tif 000007
【図６】
2006242726.tif 000008