(57)【要約】【課題】  Ｎ−アセチルヘパロサン由来の純度の高いオリゴ糖画分を提供すること。【解決手段】  Ｎ−アセチルヘパロサン構造を有するオリゴ糖を含む、精製オリゴ糖画分。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルヘパロサン構造を有するオリゴ糖を含む、精製オリゴ糖画分。
【請求項２】
Ｎ−アセチルヘパロサンを低分子化して得られたことを特徴とする請求項１に記載の精製オリゴ糖画分。
【請求項３】
オリゴ糖の純度が６０％以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載の精製オリゴ糖画分。
【請求項４】
前記オリゴ糖が３〜１００個の糖残基からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
【請求項５】
前記オリゴ糖が偶数糖であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
【請求項６】
前記オリゴ糖が奇数糖であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ糖画分に関し、特にＮ−アセチルヘパロサンから得られる高純度の精製オリゴ糖画分に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−アセチルヘパロサンは、生体内においてヘパリン、ヘパラン硫酸の合成前駆体となるグリコサミノグリカン（GAG）であり、同様の構造体を大腸菌Ｋ５株の培養液から得ることができる（例えば、特許文献１参照。）。このＮ−アセチルヘパロサンはヒアルロナンと同様に、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸の交互繰り返し構造であり、硫酸基を持たない。このＮ−アセチルヘパロサンを低分子化し精製して得るオリゴ糖は、ヘパリン・ヘパラン硫酸の生合成の研究や、関連酵素の研究、またそれら酵素の阻害剤開発研究、さらには種々の複雑な構造の糖鎖の化学合成原料など、種々の局面において非常に有用な化合物となり得る。
非特許文献１においては、Ｎ−アセチルヘパロサンオリゴ糖を高速液体クロマトグラフィーとＥＳＩ−ＭＳにより分析しているが、それぞれのサイズのオリゴ糖の単離精製は行われていない。
【特許文献１】特開２００４−０１８８４０号公報
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Journal of American Chemical Society）、２００２年６月２５日、 Vol. 124、 No.29、 p 8707-8718
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであって、その目的はＮ−アセチルヘパロサン由来の純度の高い精製オリゴ糖画分を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題は、以下の手段により解決される。
１．  Ｎ−アセチルヘパロサン構造を有するオリゴ糖を含む精製オリゴ糖画分。
２．  Ｎ−アセチルヘパロサンを低分子化して得られたことを特徴とする上記１に記載の精製オリゴ糖画分。
３．  オリゴ糖の純度が６０％以上であることを特徴とする上記１又は２に記載の精製オリゴ糖画分。
４．  前記オリゴ糖が３〜１００個の糖残基からなることを特徴とする上記１〜３のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
５．  前記オリゴ糖が偶数糖であることを特徴とする上記１〜４のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
６．  前記オリゴ糖が奇数糖であることを特徴とする上記１〜４のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、Ｎ−アセチルへパロサン由来の純度の高い新規精製オリゴ糖画分が得られる。この新規精製オリゴ糖画分は、ヘパリン・ヘパラン硫酸の生合成の研究や、関連酵素の研究、またそれら酵素の阻害剤開発研究、さらには種々の複雑な構造の糖鎖の化学合成原料など、種々の局面において非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の精製オリゴ糖画分は、Ｎ−アセチルヘパロサン構造、即ちグルクロン酸がＮ−アセチルグルコサミンにβ１，４結合し、Ｎ−アセチルグルコサミンがグルクロン酸にα１，４結合した直鎖状の繰り返し構造を有するオリゴ糖を含むものである。精製オリゴ糖画分は不純物が少ないことが好ましいが、必ずしも完全に精製されている必要はなく、部分的に精製されたものもこれに含まれる。オリゴ糖画分中におけるオリゴ糖の純度は、６０％〜１００％であることが好ましく、純度７０％〜１００％であることがより好ましく、９０％〜１００％であることがさらに好ましい。
【０００７】
また、精製オリゴ糖画分に含まれるオリゴ糖は、下記に示す、偶数の糖残基からなる偶数オリゴ糖でもよいし、奇数の糖残基からなる奇数オリゴ糖でもよい。偶数オリゴ糖としては、例えば、非還元末端に不飽和ウロン酸を有する偶数糖が挙げられ、奇数オリゴ糖としては、例えば、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有する奇数糖（奇数オリゴ糖）が挙げられる。
【０００８】
【化１】
2006291102.tif 000002
（上記式において、ｍは１以上の整数を示す。また、波線は、還元末端における平衡を示し、αアノマーとβアノマーのいずれであってもよい。）
【０００９】
オリゴ糖の糖鎖長としては特に制限はないが、３〜１００個の糖からなることが好ましく、３〜５０個の糖からなることがより好ましく、３〜２１個の糖からなることがさらに好ましい。
また、オリゴ糖の分子量としては、５００〜２００００の範囲が好ましく、５００〜４１００の範囲がより好ましい。
本発明のオリゴ糖画分は、生体において重要な働きを担うグリコサミノグリカンであるヒアルロナンを構成する糖を含んでいるため、薬剤、食品、化粧品等の原材料等として有望である。
【００１０】
本発明の精製オリゴ糖画分は、Ｎ−アセチルヘパロサンを低分子化した後、単離精製することにより得られる。
Ｎ−アセチルヘパロサンは、未だ動物の生体組織から採取された実績は無いが、Ｎ−アセチルヘパロサンを産生する細菌等から採取することが可能である。Ｎ−アセチルヘパロサンを産生する細菌としては、大腸菌、パスツレラ菌等が挙げられる。大腸菌からＮ−アセチルヘパロサンを採取・単離する方法としては、特開平５−２７１３０５号公報、特開２００４−１８８４０号公報等に記載の方法を用いることができる。
【００１１】
Ｎ−アセチルヘパロサンは、Ｎ−アセチルヘパロサンの分解酵素で処理することにより低分子化することができる。Ｎ−アセチルヘパロサンの分解酵素としては、フラボバクテリウム由来ヘパリチナーゼI、K5リアーゼ等を用いることができる。
また、ヘパリチナーゼIを用いる場合の処理条件としては、２５〜６０℃（より好ましくは３６〜４５℃）で０．５〜１２０分間（より好ましくは２０〜６０分間）インキュベーションすることが好ましい。
【００１２】
上記のようにＮ−アセチルヘパロサンを分解酵素により処理すると、通常、種々のサイズの偶数オリゴ糖を含む混合物が得られる。この偶数オリゴ糖の混合物を精製することで、上記のような高い純度を有する偶数オリゴ糖を含む精製画分が得られる。オリゴ糖の混合物の精製は公知の精製方法を用いて行うことができ、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー等によって精製することができる。
【００１３】
また、Ｎ−アセチルヘパロサンを分解酵素により処理して得られた偶数オリゴ糖を酢酸水銀と反応させることで、偶数オリゴ糖の不飽和ウロン酸を除去し、奇数オリゴ糖を含む画分を得ることができる。この方法により奇数オリゴ糖を生成するには、Glycobiology vol.10 no.10 pp.1033-1039 (2000)に記載の方法に従って行うことができる。
なお、奇数オリゴ糖の生成は、偶数オリゴ糖の精製の後に行ってもよいし、種々のサイズを含む偶数オリゴ糖の混合物から上記方法により奇数オリゴ糖を生成した後に、これを精製して精製オリゴ糖画分を得てもよい。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明する。
［実施例１］
（偶数オリゴ糖混合物の調製）
特開２００４−１８８４０号公報の実施例１に記載の方法と同様にして大腸菌Ｋ５菌株を培養し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分を得て、さらに、同公報の実施例２に記載の方法と同様にしてこのＮ−アセチルヘパロサン画分を高純度に精製した。
精製したＮ−アセチルヘパロサン画分（100mg）を濃度が10mg/mlになるように、5mM酢酸カルシウムを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に溶解した。このN−アセチルヘパロサン溶解液に、フラボバクテリウム由来ヘパリチナーゼI（０．２ユニット）を添加し、３７℃で４５分間インキュベーションした。
その後、沸騰水浴中で反応を停止させ、沈殿物を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分）によって除去し、上清液を凍結乾燥した。以上のようにして、非還元末端に不飽和ウロン酸を有するN−アセチルヘパロサンのオリゴ糖混合物の凍結乾燥物を131.25mg得た（塩類を含む）。
【００１５】
得られたオリゴ糖混合物を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（MALDI-TOF-MS）にて分析したところ、図１に示すように、主として４〜２６糖の偶数糖混合物であることが確認された。（なお、測定条件上、質量電荷比６００以下を検出していないが、実際には２糖も生成している。また、２８糖以上の偶数オリゴ糖も、僅少量生成していると考えられる。）
なお、質量分析装置は、ブルカー・ダルトニクス社製のUltraflexを使用し、測定用マトリックスとしてはDHB(2,5-dihydroxybenzoic acid)を用いた。
【００１６】
（偶数オリゴ糖混合物の精製）
上記で得た偶数オリゴ糖混合物の凍結乾燥物（２mg）を、ゲル濾過クロマトグラフィーにて分取精製し凍結乾燥して、精製オリゴ糖画分を得た（図２参照。）。なお、ゲル濾過クロマトグラフィーには、アマシャム・バイオサイエンス社製のSuperdex Peptide 10/300GLを二本継ぎで使用した。
分取した各偶数精製オリゴ糖画分の純度を陰イオン交換HPLCにて確認した。なお、印イオン交換ＨＰＬＣの分析条件は以下の通りとした。この結果を図３に示す。
HPLCカラム：  YMC-Pack Polyamine II  （株）ワイエムシィ
移動相（溶媒）：  50mMから500mMまでのNaH2PO4による30分グラジェント
流速：  1.2ml/min.
検出：  UV210nm
温度：  室温
【００１７】
さらに、MALDI-TOF-MS（Ultraflex，ブルカー・ダルトニクス社製）およびESI-IT-MS（エレクトロスプレー−イオントラップ型質量分析装置；Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００  ｐｌｕｓ，ブルカー・ダルトニクス社製）にて、その分子量を確認した。この結果をそれぞれ図４及び５に示す。
【００１８】
［実施例２］
（偶数オリゴ糖混合物の精製）
偶数オリゴ糖の精製は、陰イオン交換HPLCによっても実施した。
上記で得た偶数オリゴ糖混合物の凍結乾燥物（３mg）を、ＹＭＣ−ＰＡ−１２０−Ｓ５イオン交換カラム（ワイエムシィ（株））にアプライし、流速0.5mL/min.で４５分間に硫酸ナトリウム溶液を20mMから100mMまでの直線濃度勾配で溶出した。カラムから溶出した液をフラクション・コレクターにて１分毎に分取した。分取液はUV210ｎｍの吸収にてモニターし、N−アセチルヘパロサン２糖、４糖、６糖、８糖と考えられる画分を集めた。以上の操作を１５回繰り返して得た画分をセファデックスG-25カラムにより脱塩後、濃縮、凍結乾燥した。これらの操作により得た精製２糖、４糖、６糖、８糖の収量はそれぞれ、１０ｍｇ、８ｍｇ、６ｍｇ、４ｍｇであった。
【００１９】
得られたオリゴ糖のうち、精製４糖、６糖、８糖について、1H-NMRスペクトルを測定した。測定装置はVARIAN社製UNITY INOVA500 (500MHZ)を使用し、各オリゴ糖試料をALDRICH社製重水に溶解し、７０℃で測定を行った。内部標準をtert-ブタノール（1.23ppm）とした場合の、各オリゴ糖の測定結果は以下のとおりであり、精製４糖、６糖、８糖についてのＮＭＲスペクトルをそれぞれ図１０〜１２に示す。これらの結果より、それぞれの鎖長のN-アセチルヘパロサンオリゴ糖であることが支持された。
【００２０】
（精製４糖）
δ(ppm) = 5.782(br, 1H, H-4ｄ), 5.371(br, 1H, H-1c), 5.206(br, 0.6H, H-1aα), 5,075(m, 1H, H-1ｄ), 4.707(m, 0.4H, H-1aβ), 4.528(brd, 1H, H-1b), 3.929〜3.368(m), 2.997 (brt, 2H), 2.032(s, 3H, NH- COCH3), 2.026(s, 3H, NH-COCH3)
【００２１】
（精製６糖）
δ(ppm) = 5.778(br, 1H, H-4f), 5.366(br, 2H, H-1c, H-1e), 5.199(brs, 0.6H, H-1aα), 5,067(m, 1H, H-1f), 4.707(m, 0.4H, H-1aβ), 4.527(brd, 1H, H-1b or H-1ｄ), 4.487(brd, 1H, H-1ｄ or H-1b), 3.947〜3.623(m), 3.367 (brt, 3H), 2.034(s, 3H, NH- COCH3), 2.029(s, 3H, NH- COCH3), 2.025(s, 3H, NH- COCH3)
【００２２】
（精製８糖）
δ(ppm) = 5.778(m, 1H, H-4h), 5.366(br, 3H, H-1c, H-1e, H-1g), 5.199(brs, 0.6H, H-1aα), 5,068(d, 1H, H-1h), 4.707(brs, 0.4H, H-1aβ), 4.526(d, 1H, H-1b or H-1ｄ or H-f), 4.481(d, 2H, H-1ｄ or H-1f or H-1b), 3.946〜3.621(m), 3.367 (t, 4H), 2.038(s, 3H, NH- COCH3), 2.035(s, 3H, NH- COCH3), 2.026(s, 6H, NH- COCH3)
【００２３】
［実施例３］
（奇数オリゴ糖混合物の調製）
上記実施例１の「偶数オリゴ糖混合物の調製」で得た偶数オリゴ糖混合物（100mg）を濃度が20mg/mlになるように蒸留水に溶解し、酢酸を用いてpHを5.0に調整した。同量の70mM酢酸水銀（pH5.0）を偶数オリゴ糖混合物の溶液に混合し、室温に１０分間放置した。
その後、Hg2+を除くために陽イオン交換体（ダイヤイオン  PK220；30ml）カラムを用い、酸性画分を集め、中和した後、凍結乾燥した。この凍結乾燥物（342.3mg）を少量の蒸留水に再溶解し、セファデックスG-10カラム（2.2×115cm）にアプライし、蒸留水を用いて奇数オリゴ糖混合物を溶出した。
UV210/232nmおよび電気伝導度をモニタリングし、UV210(+)・UV232(-)画分を集め、凍結乾燥した。以上のようにして、非還元末端にヘキソサミンを有するN−アセチルヘパロサンのオリゴ糖混合物の凍結乾燥物を44.7mg得た（塩類を含む）。
得られたオリゴ糖混合物を実施例１と同様にしてMALDI-TOF-MSにて分析したところ、図１に示すように、主として５〜２５糖の偶数糖混合物であることが確認された。（測定条件上、質量電荷比６００以下を検出していないが、実際には単糖（N-アセチルグルコサミン）、３糖も生成している。また、２７糖以上の奇数オリゴ糖も、僅少量生成していると考えられる。）
【００２４】
（奇数オリゴ糖混合物の精製）
上記で得た奇数オリゴ糖混合物の凍結乾燥物（２mg）をゲル濾過クロマトグラフィー（実施例１と同様の装置を使用）にて分取精製し凍結乾燥して、精製オリゴ糖画分を得た。（図６参照。）
分取した各精製奇数オリゴ糖画分の純度を、上記実施例１と同様にして陰イオン交換HPLCにて確認した。この結果を図７に示す。（なお、図３及び図７において、各糖鎖のピークが二分されて見える場合があるのは、オリゴ糖構造中、還元末端のα／βアノマーの共存によるピーク分離であり、これは水溶液中で平衡状態にあるものであるから問題とはならない。）
また、MALDI-TOF-MSおよびESI-IT-MSにて、その分子量を確認した。この結果を図８及び９に示す。
以上の実施例より、Ｎ−アセチルヘパロサンの偶数糖及び奇数糖の精製オリゴ糖画分を高い純度で得られることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１及び実施例３により得られた偶数糖及び奇数糖のオリゴ糖混合物をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（MALDI-TOF-MS）により分析した結果を示す図である。
【図２】実施例１におけるゲル濾過クロマトグラフィーによる偶数オリゴ糖画分の分離を示す図である。
【図３】実施例１により得られた精製オリゴ糖画分の純度を示す図である。
【図４】実施例１により得られた精製オリゴ糖画分をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（MALDI-TOF-MS）により分析した結果を示す図である。
【図５】実施例１により得られた精製オリゴ糖画分をESI-IT-MS（エレクトロスプレー−イオントラップ型質量分析装置）により分析した結果を示す図である。
【図６】実施例３におけるゲル濾過クロマトグラフィーによる奇数オリゴ糖画分の分離を示す図である。
【図７】実施例３により得られた精製オリゴ糖画分の純度を示す図である。
【図８】実施例３により得られた精製オリゴ糖画分をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（MALDI-TOF-MS）により分析した結果を示す図である。
【図９】実施例３により得られた精製オリゴ糖画分をESI-IT-MS（エレクトロスプレー−イオントラップ型質量分析装置）により分析した結果を示す図である。
【図１０】実施例２により得られた偶数オリゴ糖（精製４糖）画分のＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１１】実施例２により得られた偶数オリゴ糖（精製６糖）画分のＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１２】実施例２により得られた偶数オリゴ糖（精製８糖）画分のＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１】
2006291102.tif 000003
【図２】
2006291102.tif 000004
【図３】
2006291102.tif 000005
【図４】
2006291102.tif 000006
【図５】
2006291102.tif 000007
【図６】
2006291102.tif 000008
【図７】
2006291102.tif 000009
【図８】
2006291102.tif 000010
【図９】
2006291102.tif 000011
【図１０】
2006291102.tif 000012
【図１１】
2006291102.tif 000013
【図１２】
2006291102.tif 000014