(57)【要約】【課題】大気中に飛散している抗原の量を、凝集試験により簡易に測定することができる飛散抗原量の測定方法を提供する。【解決手段】(Ａ)担体粒子に、抗原に対する抗体を感作してブロッキングし、(Ｂ)大気中に飛散している抗原含有物質を捕集し、抽出して、抽出液の希釈系列液を調製し、(Ｃ)該希釈系列液に、抗体を感作してブロッキングした担体粒子を添加し、担体粒子の凝集が起こる最大希釈倍率より、抗原量を判定することを特徴とする飛散抗原量の測定方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(Ａ)担体粒子に、抗原に対する抗体を感作してブロッキングし、(Ｂ)大気中に飛散している抗原含有物質を捕集し、抽出して、抽出液の希釈系列液を調製し、(Ｃ)該希釈系列液に、抗体を感作してブロッキングした担体粒子を添加し、担体粒子の凝集が起こる最大希釈倍率より、抗原量を判定することを特徴とする飛散抗原量の測定方法。
【請求項２】
担体が、高比重ラテックスである請求項１記載の飛散抗原量の測定方法。
【請求項３】
抗原が、花粉抗原である請求項１記載の飛散抗原量の測定方法。
【請求項４】
花粉抗原が、スギ抗原Ｃｒｙ ｊ１、イネ科抗原Ｄａｃ ｇ、ヨモギ抗原又はブタクサ抗原である請求項３記載の飛散抗原量の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飛散抗原量の測定方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、大気中に飛散している抗原の量を、凝集試験により簡易に測定することができる飛散抗原量の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、わが国においては、花粉症が増加し、国民の１割以上が花粉症に悩んでいるといわれる。大気中の花粉の飛散量が多いほど、花粉症の発症率が高く、重症化しやすい。予防治療方法としては、薬剤によるメディカルケアと、アレルゲンの除去、回避などのセルフケアがあるが、セルフケアは特に重要で、日本アレルギー学会の治療ガイドラインには、スギ花粉の除去、回避について詳しく説明されている。
凝集試験により各種の抗原、抗体を検出する試薬が、さまざまな担体を用いて開発されている。例えば、ゼラチン担体を用いて、ＨＴＬＶ−１抗体、ＨＩＶ抗体を検出する試薬が富士レビオ(株)より発売されている。また、ラテックス担体を用いた試薬として、富士レビオ(株)よりヒトヘモグロビン検出試薬、極東製薬工業(株)よりＣＲＰ、リューマチ因子などの試薬が発売されている。これらは、臨床診断用試薬であり、保険点数の対象となっている。大気中の抗原量の測定は、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）を用いて、榎本らにより実施されている（非特許文献１）。しかし、凝集法などの簡便な方法で大気中のアレルゲンを測定したとの報告はこれまでになされていない。
花粉数情報は、各都道府県の衛生研究所などにより公表されている。近年、花粉数とアレルゲン量の間に乖離が存在するとの報告が散見されるようになってきている。例えば、スギの場合、花粉中に存在するアレルゲン（Ｃｒｙ ｊ１）量は、スギの種類により一桁以上のバラツキのあることが知られている。このために、本発明者らは、花粉数情報とアレルゲン量の情報は同時に提供されるべきであるとの認識に立ち、超高感度なＣｒｙ ｊ１のラジカルイムノアッセイ法を開発し、日本アレルギー学会において花粉飛散初期における抗原測定の有用性について報告した（非特許文献２）。花粉飛散期の場合は、大量の花粉（アレルゲン）が飛散しており、感度は重視されない。また、公表されている花粉情報も、段階表示でなされることが多い。このために、花粉飛散期においては、簡便な方法でアレルゲン量を測定できる手法が望まれていた。また、ダニ、カビ、ハウスダストなどに起因するアレルギー性炎症も近年増加する傾向にあり、一般家庭内におけるこれらの抗原の測定も重要視されるようになってきた。
【非特許文献１】榎本、大西、安枝、嶽、硲田、齊藤、十河、藤村、藤木、瀬野、井手、日本花粉学会会誌、４６巻、１号、９−１６頁（２０００）
【非特許文献２】青山、高橋、アレルギー、５３巻、１０号、１０８８−１０９０頁（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、大気中に飛散している抗原の量を、凝集試験により簡易に測定することができる飛散抗原量の測定方法を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、大気中に飛散している抗原含有物質を捕集し、抽出して、抽出液の希釈系列液を調製し、該希釈系列液に、抗原に対する抗体を感作してブロッキングした担体粒子を添加し、担体粒子が凝集する最大希釈倍率を求めることにより、飛散抗原量を半定量的に測定し得ることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）(Ａ)担体粒子に、抗原に対する抗体を感作してブロッキングし、(Ｂ)大気中に飛散している抗原含有物質を捕集し、抽出して、抽出液の希釈系列液を調製し、(Ｃ)該希釈系列液に、抗体を感作してブロッキングした担体粒子を添加し、担体粒子の凝集が起こる最大希釈倍率より、抗原量を判定することを特徴とする飛散抗原量の測定方法、
（２）担体が、高比重ラテックスである(１)記載の飛散抗原量の測定方法、
（３）抗原が、花粉抗原である(１)記載の飛散抗原量の測定方法、及び、
（４）花粉抗原が、スギ抗原Ｃｒｙ ｊ１、イネ科抗原Ｄａｃ ｇ、ヨモギ抗原又はブタクサ抗原である(３)記載の飛散抗原量の測定方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明方法によれば、日々の大気中の抗原の量を容易に測定することができる。本発明方法では、採集後の大気試料を抽出した抽出液と、抗体を感作した担体粒子とを反応させるだけで結果を得ることができ、特別に高価な装置は一切必要がなく、操作が簡単なために、日々の測定に適している。本発明方法は、大気中に飛散している花粉抗原の測定に特に有用である。本発明方法は、感作する抗体を変えることにより、Ｃｒｙ ｊ１以外のアレルゲン、ダニ、カビ、ハウスダストなどにも容易に適用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の飛散抗原量の測定方法においては、(Ａ)担体粒子に、抗原に対する抗体を感作してブロッキングし、(Ｂ)大気中に飛散している抗原含有物質を捕集し、抽出して、抽出液の希釈系列液を調製し、(Ｃ)該希釈系列液に、抗体を感作してブロッキングした担体粒子を添加し、担体粒子の凝集が起こる最大希釈倍率より、飛散抗原量を判定する。
本発明方法に用いる担体に特に制限はなく、例えば、高比重ラテックス、ゼラチン粒子、ヒツジやニワトリの血球、ヒトＯ型赤血球などの血球などを挙げることができる。これらの中で、高比重ラテックスは、自己凝集を起こしにくく、抗原と反応して明瞭な凝集パターンを示すので好適に用いることができる。
【０００７】
本発明方法に用いる高比重ラテックスは、ラテックス粒子の比重が１.２以上であることが好ましく、１.３以上であることがより好ましく、１.４以上であることがさらに好ましい。ラテックス粒子の比重が１.２未満であると、凝集パターンの形成に一晩以上の長時間を要するおそれがある。高比重ラテックス粒子を用いることにより、比較的短時間で凝集パターンを形成し、飛散抗原量を迅速に判定することができる。
本発明方法に用いる高比重ラテックス粒子の粒子径に特に制限はないが、平均粒子径が０.０５〜２μｍであることが好ましく、０.２〜１.８μｍであることがより好ましい。本発明方法に用いる高比重ラテックスの材料に特に制限はなく、例えば、ポリスチレンラテックス、ポリメタクリル酸メチルラテックス、ポリ塩化ビニルラテックスなどを挙げることができる。これらの中で、ポリスチレンラテックスを好適に用いることができる。ポリスチレンラテックスとしては、カルボキシ変性ポリスチレンラテックスも用いることができる。
本発明方法により大気中の飛散量を判定し得る抗原としては、例えば、花粉、ダニ、カビ、ハウスダストなどの抗原を挙げることができる。花粉としては、例えば、スギ、ヒノキなどの樹木の花粉、カモガヤ、オオアワガエリなどのイネ科植物の花粉、ブタクサ、ヨモギ、セイタカアワダチソウなどのキク科植物の花粉などを挙げることができる。
【０００８】
本発明方法においては、担体粒子に抗原に対する抗体を感作する。抗原に対する抗体は、精製抗体を用いることが好ましい。担体粒子に抗体を感作する方法に特に制限はなく、例えば、超純水、緩衝液などで希釈した担体粒子の懸濁液と、抗体の緩衝液溶液を混合することにより、抗体を感作した担体粒子を得ることができる。この際に使用する緩衝液としては、例えば、ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、ＤＩＰＳＯ（３−[Ｎ,Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル)アミノ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、塩化アンモニウム緩衝食塩液、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）緩衝液、グリシン緩衝食塩液などを挙げることができる。これらの中で、ＭＯＰＳ緩衝液及びＤＩＰＳＯ緩衝液は、担体粒子の自己凝集を起こしにくいので特に好適に用いることができる。
本発明方法においては、担体粒子に抗体を感作してブロッキングする。ブロッキング処理することにより、抗体の非特異反応を阻止することができる。ブロッキング剤としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチンなどを挙げることができる。これらの中で、ウシ血清アルブミンを好適に用いることができる。
本発明方法においては、大気中に飛散している抗原含有物質を捕集し、抽出する。大気中に飛散している抗原含有物質を捕集する方法に特に制限はなく、例えば、吸引により大気をろ材に通過させ、大気中の抗原含有物質をろ材により捕集することができる。捕集した抗原含有物質は、例えば、炭酸水素アンモニウム水溶液などの弱アルカリ性液を用いて抽出することができる。抗原の抽出を行ったのち、遠心沈殿により固形分を分離し、上澄み液を抽出液として使用することができる。
【０００９】
本発明方法においては、抗原の抽出液の希釈系列液を調製する。希釈系列液は、例えば、マイクロウェルプレートを用い、ブロッキング剤を含む緩衝液を希釈液として倍々に希釈した２倍希釈系列液を調製することができる。
本発明方法においては、抗原の抽出液の希釈系列液に、抗原に対する抗体を感作してブロッキングした担体粒子を添加し、担体粒子の凝集が起こる最大希釈倍率を求める。図１は、担体粒子の凝集機構の模式的説明図である。抗体１が感作した担体粒子２と抗原３が液中に共存すると、抗体と抗原が結合して担体粒子が凝集する。担体粒子の凝集は、目視により観察することができ、あるいは、レーザー光を用いて散乱光の強度により判定することもできる。抽出液中の抗原の濃度が高いほど、担体粒子の凝集が起こる最大希釈倍率が大きくなる。一定の条件で捕集し、処理した特定の抗原についての担体粒子の凝集が起こる最大希釈倍率と、同一の条件で捕集した抗原含有物質についてＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）法などにより定量した抗原量の間には高い相関関係がある。特定の抗原について、担体粒子の凝集が起こる最大希釈倍率と抗原量の検量線を作成しておき、担体粒子の凝集が起こる最大希釈倍率から抗原量を半定量的に求めることができる。
【実施例】
【００１０】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１（スギアレルゲンＣｒｙ ｊ１に対する感作ラテックスビーズの調製）
超純水１ｍＬに高比重ラテックス［ＪＳＲ(株)、ＩＭＭＵＴＥＸ Ｈ１００７Ｒ、１.３μｍ］０.２ｍＬを加え、軽く撹拌したのち、抗Ｃｒｙ ｊ１ポリクローナル抗体［(株)林原生物化学研究所、anti Cry j1 rabbit IgG fraction、５００μｇ／ｍＬ］をそれぞれ１０μＬ（５μｇ）、２０μＬ（１０μｇ）、４０μＬ（２０μｇ）、５０μＬ（２５μｇ）添加し、室温にて３時間物理吸着を行った。次いで、冷却遠心器を用いて、４℃、２,０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心沈殿し、上澄み液をアスピレーターにて吸引除去し、ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液（０.１モル／Ｌ、ｐＨ７.０）３ｍＬを添加した。撹拌したのち、再度同じ条件で冷却遠心沈殿と、アスピレーターによる吸引処理を行い、３重量％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有するＭＯＰＳ緩衝液１ｍＬを添加し、４℃にて一晩ブロッキング処理を行った。さらに、遠心沈殿と上澄み液の吸引除去を行ったのち、１重量％ＢＳＡ含有ＭＯＰＳ緩衝液２ｍＬを用いて希釈し、抗体感作ラテックスビーズとした。
実施例２（至適ビーズの選定）
実施例１で調製した３種のビーズを用い、性能比較を行った。Ｃｒｙｊ１標準液として、既知濃度のスギ花粉エキス［日本アレルギー学会］を使用した。５００ｎｇ／ｍＬのＣｒｙ ｊ１標準液を調製し、標準液の分注量を２０μＬとし、これを１重量％ＢＳＡ含有ＭＯＰＳ緩衝液を用いて倍々に希釈し、２倍希釈系列液を調製した。この希釈系列液に、実施例１で調製した抗体感作ラテックスビーズを１重量％ＢＳＡ含有ＭＯＰＳ緩衝液にて４倍希釈した抗体感作ラテックスビーズ１５μＬを分注し、２時間後における凝集パターンを目視にて判定した。
抗体量１０μｇ以上で良好な凝集パターンが観測され、抗体量２０μｇと２５μｇの抗体感作ラテックスビーズの間に有意な差は認められなかったことより、抗体量２０μｇ抗体感作ラテックスビーズを至適ビーズと判断した。
実施例３（Ｃｒｙ ｊ１に対する検出感度）
抗体量２０μｇの抗体感作ラテックスビーズを用いて、Ｃｒｙ ｊ１に対する検出感度を検討した。Ｃｒｙ ｊ１濃度を１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、２.５ｎｇ／ｍＬ、１.２５ｎｇ／ｍＬ、０.６２５ｎｇ／ｍＬとし、実施例２と同様にして判定した。Ｃｒｙ ｊ１濃度１.２５ｎｇ／ｍＬまで検出可能であった。
実施例４（大気試料からのＣｒｙ ｊ１抽出）
大気中のＣｒｙ ｊ１を、サイクロンサンプラー［Ｂｕｒｋａｒｄ Ｃ９０Ｍ］を用いて採取した。試料は２４時間間隔で採取し、試料の交換は午前６時に行った。試料の吸引容量は１６.６Ｌ／ｍｉｎなので、１時間で約１ｍ3の大気がサンプリングされ、２４時間では約２４ｍ3採取される。サンプリング後の試料を、０.１重量％のＢＳＡを含む０.１２５モル／Ｌの炭酸水素アンモニウム水溶液１００μＬを用いて、撹拌しながら室温で２時間抽出した。抽出したのち、３,０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心沈殿し、上澄み液を分取して測定に用いた。
ダーラム捕集器をサイクロンサンプラーと同一地点に設置し、サイクロンサンプラーと同様に、午前６時にスライドグラスを交換し、顕微鏡下で１ｃｍ2内に存在する花粉数を計測した。
実施例５（ＥＬＩＳＡ法と凝集法のデータ比較）
２００４年のスギ花粉飛散時期に、日ごとに採集した大気試料の抽出液を用いて凝集反応を行ったところ、１５〜１２０ｐｇ／ｍ3の濃度で強い凝集がみられた。凝集力価とＥＳＲラジカルイムノアッセイ法によるＣｒｙ ｊ１定量結果とを図２に示す。図中、棒グラフは、凝集力価であり、折れ線グラフは、ＥＳＲラジカルイムノアッセイ法によるＣｒｙ ｊ１濃度である。なお、凝集力価とは、２倍希釈系列液において、陽性と判定される最大希釈倍率である。
図２に見られるように、凝集力価とＥＳＲラジカルイムノアッセイ法により求めたＣｒｙ ｊ１濃度の間には、正の相関があり、相関係数は０.９２であった。この結果より、凝集力価から半定量的にＣｒｙ ｊ１濃度の推定が可能であることが分かる。
実施例６（イネ科アレルゲンＤａｃ ｇに対する抗体感作ラテックスビーズの調製）
独自に調製したＤａｃ ｇ精製抗体を用い、実施例１と同様にして、抗体感作ラテックスビーズの調製を行った。また、標準液としてアレルゲンスクラッチエキス［鳥居薬品(株)、カモガヤ花粉］を使用し、実施例３と同様にして、検出感度を検討した。使用したアレルゲンスクラッチエキスにはＤａｃ ｇの濃度は表示されていなかったが、希釈倍率６,４００倍までラテックスの凝集が起こり、検出が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明方法によれば、日々の大気中の花粉抗原量を容易に測定することができる。本発明方法では、採集後の大気試料を抽出した花粉抽出液と、抗体を感作した担体粒子とを反応させるだけで結果を得ることができ、特別に高価な装置は一切必要がなく、操作が簡単なために、日々の測定に適している。本発明方法は、感作する抗体を変えることにより、Ｃｒｙ ｊ１以外のアレルゲン、ダニ、カビ、ハウスダストなどにも容易に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】担体粒子の凝集機構の模式的説明図である。
【図２】凝集力価とＣｒｙ ｊ１定量結果の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【００１３】
１  抗体
２  担体粒子
３  抗原
【図１】
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【図２】
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