(57)【要約】【課題】少なくとも1つの検出ユニットへ結像させる検出装置を有する共焦点レーザ走査型顕微鏡【解決手段】試料領域（23）の照明のための照明光を供給する照明装置（2）、照明光を試料上に誘導して走査する走査装置（3、4）および照明された試料領域（23）を走査装置（3、4）の使用下共焦点絞り（26）により少なくとも1つの検出ユニット（28）上に結像させる検出装置（5）を持つ共焦点レーザ走査型顕微鏡であって、照明装置（2）が走査装置（3、4）に線形照明光を供給し、走査装置（3、4）が線形照明光を試料上に誘導して走査し、および共焦点絞りがスリット絞り（26）として、または共焦点絞りの作用をする検出ユニット（28）のスリット状領域（28、48）として形成されるようになっている。【選択図】図１
2006031004.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
‐  試料領域（23）の照明のための照明光を供給する照明装置（2）、
‐  照明光を試料上に誘導して走査する走査装置（3、4）および
‐  照明された試料領域（23）を走査装置（3、4）の使用下共焦点絞り（26）により少なくとも1つの検出ユニット（28）上に結像させる検出装置（5）
を持つ、特に共焦点レーザ走査型顕微鏡など、
照明光が試料を複数の点または領域で平行に照明し、複数の点または領域が同時に検出される、照明された複数の試料点が一直線上に並び、複数の点が位置分解能のある検出器により同時に検出される、照明光と試料間の相対的移動により少なくとも1つの試料領域を捕捉するための光走査型顕微鏡であって、
‐  照明装置（2）が走査装置（3、4）に線形照明光を供給する、
‐  走査装置（3、4）が線形照明光を試料上に誘導して走査する、および
‐  共焦点絞りがスリット絞り（26）として、または共焦点絞りの作用をする検出ユニット（28）のスリット状領域（28、48）として形成されている
ことを特徴とする光走査型顕微鏡。
【請求項２】
顕微鏡（1）の照明光路（BS）内で、対象物（23）を捕捉する対物レンズ（21）の前に配置されていて、対象物の中間結像（ZB1）を実現させ、照明光路の入射ひとみ（EP）を可変的倍率（v）および/または可変的結像長（L）で射出ひとみ（AP）に結像させるズーム光学系によって特徴付けられる、請求項1に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３】
射出ひとみ（AP）内に、ズーム光学系の調整に依存することなく射出ひとみ（AP）の大きさを決定する、絞り（42）としての作用をする素子が配置されていることを特徴とする、ただしその場合に、射出ひとみ（AP）の大きさが、好ましくは対物レンズの入射ひとみ（OP）の大きさよりも小さいものとする、請求項2に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項４】
第1操作モードでは一定の結像長（L）で可変的倍率（v）を、第2操作モードでは一定の倍率（v）で可変的結像長を実現する制御ユニットによる制御下で位置調整の可能なズーム光学系によって特徴付けられる、請求項2または3に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項５】
走査装置（3、4）が、照明光の直線長を拡大し、ズーム光学系（42）のズーム係数が1未満である場合に、光路に接続される円筒型テレスコープ（37）を有していることを特徴とする、請求項2、3または4に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項６】
オリジナル光線（16.3）の衝突点領域では衝突点から離れた領域よりも強く湾曲している非球面凸面鏡（16.1）を有している、横断面の不均質な、特にガウス型のオリジナル光線（16.3）から線形照明光を生成するための変換ユニット（16）によって特徴付けられる、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項７】
ミラー（16.1）が丸みのある稜線（16.9）を持つ楔型に形成されていることを特徴とする、請求項6に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項８】
cを稜線（16.9）の曲率半径およびQを円錐定数であるとして、鏡面（16.6）がデカルト（x、y、z）座標において函数y2／[c+(c2-(1-Q)y2)1/2]を満たしていることを特徴とする、請求項6または7に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項９】
加えて、鏡面が稜線（16.9）の縦軸に沿って湾曲していることを特徴とする、請求項7に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１０】
ｒｘが稜線（16.9）の縦軸に沿った曲率半径、ａ（ｙ）が請求項8の関数であるとして、非球面鏡（16.1）が、関数ｆ（ｘ、ｙ）＝［（ａ（ｙ）−ｒｘ）&sup2;−ｘ&sup2;］1/2−ｒｘを満たしていることを特徴とする、請求項8または9に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１１】
ミラー（16.1）の対称軸が、オリジナル光線（16.3）の入射軸（QA）に対して4°〜20°の角度内にあることを特徴とする、請求項6〜10の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１２】
非球面鏡（16.1）の後方に集光ミラー（16.2）が配置されていることを特徴とする、請求項6〜11の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１３】
集光ミラー（16.2）が、円筒型またはゲート型であることを特徴とする、請求項10に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１４】
ｄが非球面鏡（16.1）と集光ミラー（16.2）間の距離であるとして、集光ミラー（16.2）が、ｘ方向に（ｒｘ＋2・ｄ）に等しい曲率半径を有していることを特徴とする、請求項１０〜１３に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１５】
走査装置が、独立した制御性および作用性のある2つの走査素子を有していて、そのうちの1つがズームの分散機能を実現するということを特徴とする、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１６】
検出ユニットが、共焦点平面に配置された位置分解性センサ（28）を有していて、位置分解性センサ（28）の部分領域の選択が共焦点スリット絞りとして作用することを特徴とする、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１７】
検出ユニットが、線形ビームを線に対して横方向に分割し、それを面光線検出器（50）上に誘導することを特徴とする、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１８】
分光計（49）が、共焦点絞りとして用いる入射スリット（48）を有していることを特徴とする、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１９】
検出ユニットが、線形ビームを線に対して横方向に時間分割し、それを面光線検出器上に誘導するストリークカメラを有していることを特徴とする、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２０】
照明装置（2）内の少なくとも1つの偏光子（45、46）および検出装置（5）内の少なくとも1つの偏光分析器（47）によって特徴付けられる、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２１】
検出装置（5）が、検出ユニット（28、28a）をそれぞれ1つずつ持つ複数のスペクトルチャネルを有していることを特徴とする、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２２】
共通のスリット絞り（26）が、すべてのスペクトルチャネル用に前方設置されていることを特徴とする、請求項21に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２３】
スリット幅の調整可能なスリット絞り（26）またはスリット幅の異なる交換可能な複数のスリット絞りを有するスリット絞りユニットによって特徴付けられる、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２４】
ホルダ（40、11）に保持されて光路内に設置され、ホルダを通じての傾倒および/または旋回運動により少なくとも1つの軸の周りを移動させることができ、それにより、その傾倒位置の変更から光路内でのビームの一定の平行移動（dx、dy）を設定することができる、少なくとも1つの透明なオプチカルフラットプレート（40、9）を持つ、照明装置（2）および/または検出装置（5）内に配備された補正装置によって特徴付けられる、前記請求項の1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２５】
2軸に対して傾倒および/または旋回の可能な少なくとも1つのプレート（40、9）または1軸に対して傾倒および/または旋回の可能な少なくとも2つの異なったプレートによって特徴付けられる、請求項24に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２６】
少なくとも1つの操作パラメータを捕捉し、操作パラメータの値に依存して傾倒位置を調整する調整装置によって特徴付けられる、請求項24または25のうちの1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２７】
プレート（40、9）の傾倒位置を調整量として使用する制御系によって特徴付けられる、請求項24〜26のうちの1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２８】
色との関連なしに、または色との関連に基づき、照準下で行う平行移動調整に用いられる異なった分散性を持つ素材から成る独立作動性の2つのプレート（40、9）によって特徴付けられる、請求項24〜27のうちの1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２９】
光路内の横色収差を補償するため、少なくとも1つのプレート（40、9）が、異なった分散性を持つ素材からの2つの部分プレート（40、9a、40、9b）で構成されていることを特徴とする、請求項24〜28のうちの1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３０】
試料領域（23）の検出ユニット（28）への結像またはスリット絞り（26）の検出ユニット（28）への結像をセンタリングするために、プレート（40、9）が光路内において検出ユニット（28）の前に配置されていることを特徴とする、請求項24〜29のうちの1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３１】
顕微鏡が、光路内に取換または調整の可能な素子を有していて、調整装置が、取換または調整の可能な素子の形成を操作パラメータとして捕捉することを特徴とする、請求項26に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３２】
検出装置（28、28a）が、様々な波長のビームを分析し、調整装置が光路内の波長を操作パラメータとして捕捉することを特徴とする、請求項26に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３３】
制御系が、検出ユニット（28）におけるビーム強度を最大限上げる、および/または画像移動を最小限に抑えることを特徴とする、請求項27に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３４】
試料領域（23）と共焦点絞り（26）との間にも、絞り（26）と検出ユニット（28）との間にも、2軸に対し傾倒および/または旋回の可能な1つのプレート（40、9）が、または1軸に対し傾倒および/または旋回の可能な異なった2つのプレートが、設置されていることを特徴とする、請求項２４〜３３のうちの1つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３５】
請求項１〜３４に記載の共焦点レーザ走査型顕微鏡が使用されていること、および試料がラマン分光法により、特にコヒーレントなストークスまたは反ストークスまたはハイパラマンまたは誘導ラマン分光法かあるいは高次ラマンプロセスにより分析されることを特徴とする、レーザ走査型顕微鏡検査のための方法。
【請求項３６】
特に細胞結合面および有機体全体における、なかでも1/10秒から時間単位までのダイナミックなプロセス等の生育過程、それも特に下記諸点、すなわち
・  その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので3次元ROI照明から保護されねばならない3次元領域での生細胞の分析、
・  例えばFRET実験などにおいて、3次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の3次元領域での分析、
・  例えば3次元FRAP、FLIP実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にROI外の観察も必要なマーカーによる生細胞の3次元領域での分析、
・  例えば3次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の3次元領域での照準分析、
・  例えばpaGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の3次元領域での照準分析、
・  例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の3次元領域での照準分析、
・  例えばCFP、GFP、YFP、DsRed、HcRedなど可変性多重マーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、
・  機能に依存して変色する、例えばCa+マーカーなどでマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、
・  生育に起因して変色するマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、例えばGFPによる形質転換動物、
・  例えばpaGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、
・  検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、
・  
・  最終項目とそれ以前の項目との組み合せ、
のうちの少なくとも1つの研究のための、前記請求項の少なくとも1つに記載の装置および/または方法の使用。
【請求項３７】
特に、微小な運動構造体、例えばタンパク質の高速度描写に（殆どが1/100秒の領域）、それも特にROIブリーチングを伴うFRAPなどに適用される、細胞内運搬過程の研究のための前記請求項の少なくとも1つに記載の装置および/または方法の使用。
【請求項３８】
例えば、副分子構造解明のためのROIブリーチングを伴うFRETなど、好ましくは間接的技術の使用下における、特に、非常に微小な構造の高速度描写など、分子およびその他副細胞の描写のための前記請求項の少なくとも1つに記載の装置および/または方法の使用。
【請求項３９】
特に筋肉系または神経系に関する研究における迅速な信号伝達過程のための、特に、1/100秒から1/1000秒以下に到るまでの領域で展開されるイオン介在活動に関係する、高い経時的分解能による神経生理学過程のための、前記請求項の少なくとも1つに記載の装置および/または方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料領域の照明のための照明光を供給する照明装置、照明光を走査して試料上に誘導する走査装置および照明された試料領域を共焦点絞りにより走査装置を通して少なくとも1つの検出ユニットへ結像させる検出装置を有する共焦点レーザ走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
上記種類の共焦点レーザ走査型顕微鏡は現状技術から公知である。これについてはDE 197 02 753 A1が参考になる。分光撮像技術の分野においては、最近では機能増設型の顕微鏡、特に共焦点結像式のレーザ走査型顕微鏡が多用されるようになっている。それにより、選択した試料領域の分光特性を破壊および接触なしに測定することが可能である。
その共焦点光学顕微鏡法によれば、回折の制限された共焦点体積内で生成される、その大きさがマイクロメータ領域の光学信号を選択的に検出することができる。
【０００３】
走査レーザビームおよび/または試料送出ユニットを持つレーザ走査型顕微鏡は、検査試料の2次元または3次元画像を高いスポット分解能で生成することができる。共焦点レーザ走査型顕微鏡法はこの特性により、バイオメディカル領域の蛍光性試料には殆ど標準法としての地位を占めている。
適用上の観点からは、化学面での高い説得性に基づき特に共焦点ラマン顕微鏡法が非常に魅力的である。DE 0 542 962 B1には、コンフォカール条件の生成のためスポット分解性を持つ面検出器の然るべき読み出しが利用される共焦点ラマン顕微鏡法の構成について記述されている。
【特許文献１】ＤＥ  １９７  ０２  ７５３  Ａ１
【特許文献２】ＤＥ  ０  ５４２  ９６２  Ｂ１
【特許文献３】ＵＳ  ６  １３４  ００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ラマン分光法は旧来の蛍光分光法と比較すれば、しばしば数桁小さくなるその信号強度に問題がある。測定点当りの積分時間が、実際には1分以上になることがしばしばある。その結果、測定時間が何時間、何日にもなることが多々あり、そのため2次元または3次元の顕微鏡画像を高い点密度で撮影する場合、当然のことながら、共焦点ラマン顕微鏡法の適用は狭い範囲に限定される。積分時間の短縮は、レーザ出力の引き上げで確かに考えられなくはないが、しかし試料の早急な破壊を招来する。
例えば第2高調波発生により魅力的なコントラスト法を提供するものの、同じく低い信号強度、それに伴う長い測定時間により実際での使用が大きく制限されている非線形光学顕微鏡法の領域においても同様の問題に直面する。
【０００５】
US  ６  １３４  ００２から、検出器として分光分析器の使用される共焦点顕微鏡構造は公知である。分析器はその入射スリットでビームを撮影するが、線形であるそのスリット領域は試料の線形領域に一致している。試料上では点像が走査される。被検出光は、走査ユニットの2つの走査ミラーの間か、または試料方向で見て、走査ユニットの前に配置される、メインカラースプリッタとして作用するビームスプリッタにより分離される。
【０００６】
第1の方法では、2つの走査ミラーによって走査された試料上の点像は、1空間方向でしかデスキャンされないので、分光分析器には1ラインに沿って走査されたビームが衝突する。第2の方法では、ビームは走査ミラーによって完全にデスキャンされ、それによって定常化されるのでピンホール後には円筒型光学系により再度拡大される。US  ６  １３４  ００２から公知の構造は、スペクトル分析時間の短縮により撮像の促進化を達成するが、それにより必然的にスリット状の入射領域を持つ分光分析器が検出器として必要になるため、使用可能な検出器の範囲は大きく制限される。US 6、134、002に基づく構造の場合でも、高いレーザ出力により発生可能性のある前記試料損傷の問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の状況より、低強度の分光信号でもできる限り短時間で撮影できるように、レーザ走査型顕微鏡を改良開発することを基本課題に置いている。
この課題は本発明に基づき、走査装置の照明装置が線形照明光を供給し、走査装置が線形照明光を走査して試料上に誘導する、および共焦点絞りが、スリット絞りとして形成されているか、または共焦点絞りとして作用する、検出ユニットのスリット状領域が形成されている、前記様式の共焦点レーザ走査型顕微鏡により解決される。
【０００８】
本発明では、線形試料照明とスリット絞りまたはスリット絞りとして作用する領域による共焦点検出との組み合せにより上記の問題に対処している。したがって、US  ６  １３４  ００２で使用されている点像スキャナとは異なり、試料上に線形領域が照明され、少なくとも線形である検出器にコンフォカールに結像される。
【０００９】
従来型の単点式の共焦点レーザ走査型顕微鏡との比較では、撮像時間、試料内結像面積、視野およびピクセル当りのレーザ出力を同じとして、検出器ラインのピクセル数をnで表わせば√n倍改良された信号対雑音比が実現される。nは500〜2、000が典型的な値である。ただしこの場合、試料を照明するラインが、比較可能な共焦点点像スキャナにおけるレーザフォーカスのn倍の出力を有することが前提条件である。
【００１０】
これに代わり、本発明に基づくレーザ走査型顕微鏡で検出速度または信号対雑音比の改善を求めない場合では、共焦点点像スキャナで点状に供給されるビーム出力を照明ラインに分布させれば、撮像時間、信号対雑音比を同じとして試料のビームによる負荷は共焦点点像スキャナに比べて1/nに軽減される。
【００１１】
このように、ライン走査式のレーザ走査型顕微鏡は単点式共焦点スキャナと比較した場合、信号対雑音比および試料負荷が同じであれば、脆弱な試料物質の低強度信号をn倍速く、撮像時間が同じであれば√n倍改良された信号対雑音比で、または撮像時間が同じであれば、信号対雑音比同等で試料負荷1/nで結像させることが可能である。
【００１２】
所期の分解度に応じて、試料上に様々な幅のラインを照明して共焦点検出を行なうことになる。したがって、変更可能な照明が望ましい。これは、原則的には線形照明の生成時に既に実現することができる。しかしレーザ走査型顕微鏡では線形照明の生成は、合目的性の観点から照明モジュールで行なわれるので、照明モジュールで様々な光源からビームが合一化される場合、調整コストが比較的大きくなることがある。それゆえ、既に生成された線形照明光の線幅を変更する、好ましくは、照明光と被検出光が同一の光学素子によって誘導される、すなわちまだ分離されていない光路の領域内に置かれる、ズーム機能実現のためのズーム光学系が優先的に使用される。
【００１３】
レーザ走査型顕微鏡の場合、走査画像領域はスキャナズーム機能の然るべき制御によって選択できる。もちろんこれは、ガルバノスキャナとの組み合せによる単点走査の場合に限られる。ここでの平行走査式、すなわち複数点を同時走査するレーザ走査型顕微鏡の場合では、走査装置の位置調整によってはズーム機能を実現させることはできない。それは、ラインを形成する個々の走査点が相互間で固定した幾何学的関係の中に置かれているからである。
【００１４】
ズーム光学系によって達成される可変的倍率が、試料上を平行誘導される点の固定した幾何学的関係から、走査装置における操作によってはズーム機能が不可能である平行作動式多点スキャナの場合に走査フィールドのサイズ調整を可能にする。画像フィールドが望み通りに調整可能なサイズで走査されるように、偏向装置を制御するという、単点走査式の共焦点走査型顕微鏡自体にとって公知であるこのアプローチ法は、共振型スキャナ、すなわち共振振動で駆動される回転ミラーによって操作されるシステムの場合と同様に、そのような平行走査型システムの場合ではあまり可能性がない。この場合では最大限の操縦によっても殆ど調整不能だからである。
【００１５】
ズーム光学系の設置位置としては走査ユニットの直前（試料方向に見て）が考えられる。主として動力駆動されるズーム光学系は、それによるズーム倍率の適合化を通じて、特定調整領域における対角線方向の視野を連続的に変更させることが可能である。3つの光学的自由度が調整可能である、したがって線幅変更の場合に焦点位置、ひとみ位置および結像倍率など重要パラメータが無変化のままであるズーム光学系が特に好ましい。
【００１６】
対物レンズの分解能は入射ひとみが完全に照明されたときに最高に達する。したがって、ズームレンズの調整には関わりなく、ズーム光学系が対物レンズの入射ひとみを常に完全に照明するように、然るべき装置を設置するのが目的に適っている。それより、本発明の目的に適うまた別な態様として、ズーム光学系作動時に現われる最小射出ひとみのサイズより大きくない、絞りとして作用する素子をズーム光学系の射出ひとみに配置することが考えられる。この大きさは対物レンズ入射ひとみの大きさに等しいか、それより小さいのが目的に適っている。
【００１７】
ズーム光学系の作動時に倍率１．０未満に設定した場合、射出ひとみは非常に小さくなることがある。下限としてのこの小さな射出ひとみを設計上避けたい場合は、然るべきひとみ拡大作用をするテレスコープをズーム光学系の前に設置するのが目的に適っている。このテレスコープは、ズーム光学系が縮小作用をする場合にのみ光路内で作動するのが好ましい。ここでの「拡大」および「縮小」の概念は試料の結像を対象にする。
【００１８】
このテレスコープの作動により、倍率１．０におけるズームの射出ひとみを基本設計上の下限に設定することが可能になり、その場合ズーム光学系の縮小作用時に、射出ひとみが対物レンズのひとみを満たし切れずに空間ができるほど小さくなるという事態は起きなくなる。対物レンズのひとみを意識的に満たしたくない場合、すなわち全面には照明を当てたくない場合、対物レンズの交換性を考慮して、絞りの作用をする素子は取換可能なように構成するのが合目的的である。
【００１９】
そのような素子としては、例えば調整可能なアイリス絞りまたは取換可能な様々な絞りを持つ機構体、例えば様々な有孔絞りを持つダイヤル式絞りが使用の対象になる。
特にコンパクトな構造形態を持つ絞り作用素子は、走査ユニットによって実現される。例えば、大きさの限定された走査ミラーの面を絞りとして作用させることができる。
【００２０】
したがって、本発明の特に有利な実施態様では、その中に絞りの装備された出力側ひとみを持つズーム光学系が使用される。この絞りは、実際では走査ユニットの鏡面領域を制限することによって実現できる。ズーム光学系のこの出力側絞りの作用によって、ズーム倍率の調整如何に関わらず大きさの固定したひとみが常に共焦点顕微鏡の走査装置または対物レンズに結像する。好ましくも、絞りはそのほかに、走査装置領域内の意図しない散光の発生を阻止する作用もある。
【００２１】
ズーム倍率を1倍未満に設定したい場合、ひとみ内の充満には円筒型テレスコープを前置接続するのが有利である。この接続は、例えば旋回挿入方式により自動化されているのが好ましい。それにより、出力側ひとみ、例えばズーム対物レンズの上記絞りが照射不足になるのが防止される。このように、ズーム光学系の調整如何に関わらず、対物レンズひとみの位置では常に大きさ調整可能な照明ラインが与えられるので、試料領域の大きさを調整しながら検査することができる。
【００２２】
円筒型テレスコープ作動時には画像明度の急変が避けられない。それは、1つには円筒型テレスコープはビームを吸収し、また1つには、殊にビームの強度が比較的長いラインに亘って分布するからである。観察者の観点からこの作用を補償するために、光路に接続された円筒型テレスコープにおける制御装置が、検出装置の増幅率または走査装置の走査速度の調整を通して、円筒型テレスコープに起因する画像明度の低下を解消するように改良開発がなされている。制御装置が行うこの変更が、例えば調整器による操作プログラムの然るべき切換によって使用者に表示されれば目的に適っている。
【００２３】
（照明方向で見て）顕微鏡対物レンズの入射ひとみにおける軸方向での位置変動の問題は、驚いたことにズーム光学系の然るべき構成によって解決できることを発明者は認識するに到った。つまり、ズーム光学系は結像長（ズーム光学系の入射ひとみと射出ひとみ間の距離）が可変的に設定できるように構成されていれば有利である。そのように、本発明に基づくズーム光学系は二重機能を有している。1つには倍率変更によって走査フィールドの大きさを設定できること、また1つには軸方向に変動する顕微鏡対物レンズのひとみ位置の補償目的に伝達長の調整が可能であることによる。
【００２４】
さらに、第1操作モードで可変的結像長が実現されるように、ズーム光学系は制御ユニットによる制御下で調整できるようにするのが目的に適っている。ズーム光学系を作動中の、例えば旋回挿入される対物レンズに適合化するには、この操作モードで倍率を一定に保つのが得策である。ひとみ長の調整を終えれば、有利なことに、結像長を変更せずにズーム機能を働かすため、制御ユニットによる制御下で倍率を調整するという別な操作モードを実現することができる。
【００２５】
ズーム光学系のこの操作モードでの作用により、走査フィールドの大きさを調整することができる。同時に2軸方向に制御可能な走査ユニットを使用すれば、それに加えて、ズーム倍率の調整別に許容最大走査フィールド内における任意の領域をいわゆる「観察対象領域」として選定することができる。なお、この「観察対象領域」は光軸に対称である必要はない。検出光路におけるこの移動はズーム倍率設定の場合と全く同様に一旦中断される。それにより、試料内の特殊領域の観察が可能である。その上、様々な「観察対象領域」からの画像が得られ、それに続き非常に高分解性のある画像に合成することができる。
【００２６】
ズーム光学系の構造に4つの光学系グループが使用されていれば、可変的なひとみ結像を実現する上で特に合目的的である。その場合4つの光学系グループに、照明方向で見た順序として、正の屈折力、負の屈折力および2度続けて正の屈折力を付与するのが製造上好ましい。少なくとも3つの光学系グループが駆動装置により互に影響を受けずに調整できれば有利である。移動は、フォーカシングが無限大から無限大に維持されたままで、操作モードに応じて倍率または結像長（ひとみ長）が調整されるように行われる。
【００２７】
また、照明方向で見て最終のグループは、共焦点走査型顕微鏡では通例であるように、走査ユニットの前に走査対物レンズを配置してユニットとして形成するのが有利になる場合もある。各グループは、好ましくは、少なくとも1つのレンズから構成される。グループは、利用できるスペクトル領域および開口／視野角の可能性についてできる限り良好な特性が得られるように、結像欠陥が自動補正されるものであるのが好ましい。
【００２８】
ズーム対物レンズにより実現されるズーム機能だけに基づく、あるいは可能な走査フィールドにおける非対称のスキャナ操作法をも加えて行う上記「観察対象領域」の選定は、さらに、光路を回転させる素子の使用によって改善させることもできる。照明光路のひとみ内に、例えばアッベ・ケーニッヒプリズムを設置すれば、走査、ズーム操作の対象である走査フィールドを回転させることができる。検出光路ではプリズムによるこの回転は元どおり停止させる。そのようなアッベ・ケーニッヒプリズムは、例えばLINOS Photonics/ドイツから入手でき、現状技術で公知のものである。上記の構造様式では光路内ひとみ近くに配置される。そこは光線束が最も細く集束するところなので、非常に小さなプリズムの使用が可能だからである。これは回転角によっては画像フィールドを2倍の角度で回転させる。
【００２９】
線形照明は多様な方法で生成することができる。しかし、少なくとも1つの非球面鏡を使用するのが特に有利である。その場合、照明装置におけるビーム形成の基本原理は、非球面鏡により少なくとも1つの切断面でエネルギー分布を行うこと、および不均一な、特にガウス分布したプロファイルを、切断面に広範囲に亘って均一なエネルギー分布が現われるように変換することである。ミラーを2つの横断面方向で非球面に形成すれば、2つの切断面で均一性が、つまり均一化されたフィールドが得られる。
【００３０】
非球面鏡の使用により、照明光用に広いスペクトル帯域幅がカバーできると同時に均一な照明が得られる。その場合、元のビームの衝突点領域における切断面では衝突点から離れた領域に比べてより強く湾曲している反射非球面が適していて、それによればフォーカシングおよびエネルギー分布の際に波長依存性の避けられることが認識された。その場合、非球面鏡の可変性曲率というコンセプトが同時に他種多様なエネルギー分布性を展開する。照明装置によって、例えば、照明された領域の80 %以上で強度が最高値の80 %以下に低下しないように、ガウスビームを変形することができる。これは本質的には均一分布であり、ここで重要な意味をなしている。
【００３１】
中間像平面における均一化には、２軸非球面湾曲性の変形体が特に有利に使用できる。多点走査型顕微鏡の場合、点雲生成素子（例えば、ニポーディスク）の前にある中間像に対する均一照明が、試料部位間でほぼ統一されたビーム強度を持つ均一照明を可能にする。また、変換ユニットが対物レンズのひとみを完全照明することができるので、非常に良好な（高分解性）結像が達成される。それは均一に満たされたひとみにより光学分解能が余すところなく利用できるからである。
特に簡単に作製できる製品形態としては、丸みのある稜を持つ、楔形に作られたミラーがある。そのようなミラーは直方体から簡単に作製でき、均一なエネルギー分布を実現する焦線が得られる。
【００３２】
数学的に特に簡易に表し得る変形体として、該ミラーは円錐定数および稜の丸み半径によって定義付けされ、（x、y、z）座標の中でz座標に関しては式ｙ２／［ｃ＋（ｃ２−（１＋Ｑ）ｙ２）１／２］を満たしている。ただし、cは稜の丸み半径、Qは円錐定数である。
【００３３】
線形照明の場合、縦軸方向に延びるラインに沿ってビームを均一に分布させるだけでなく、ラインの幅についても後続光学系の入射ひとみの直径に適合させることが望まれる。これを達成するためには、非球面ミラーはラインを横切る方向にビームを拡大させることも必要である。丸み付けされた稜を持つ上記楔形ミラー変形体の場合これは、ミラー面または少なくとも稜を、稜の縦軸に沿って球面または非球面に湾曲させることにより極めて容易に達成することができる。
【００３４】
このように、丸み付けされた稜を持つ非球面ミラーは2次元で湾曲している。その場合第1切断方向（縦軸に垂直）は先端が丸み付けされた円錐形、第2切断方向（稜に沿う方向）は放物線状の球面または非球面の湾曲体とすることができる。したがって、後者の湾曲体は照明フィールドの幅を意味し、それに対して縦軸に垂直な非球面形はフィールドに沿う方向に拡大しており、非球面性ゆえにエネルギー分布をもたらしている。したがって、フィールドに沿う方向では広範囲に均一なエネルギー分布が達成される。
【００３５】
上記のほか、稜線に沿って球面状または放物線状に湾曲するミラーは次のような簡単な数式で表わすことができる :
ｆ（ｘ，ｙ)=√｛（ａ（ｙ）−ｒｘ）２−ｘ２−ｒｘ｝  、ただし、ｒｘは稜線に沿った、すなわち上記の第2切断方向における曲率半径である。
【００３６】
2方向に湾曲したミラー（例えば、第1切断方向が非球面、第2切断方向が球面）の場合、後続光学系の中間像または入射ひとみを完全に照明するためには、ミラーの後方に、例えば集光ミラー形態の集光光学系を配置するのが目的に適っている。その場合、長方形型フィールドの生成には円筒型またはゲート型の集光ミラーを使用する。
別なフィールド形態を得るためにミラー形態を変える場合、例えばこの第2ミラーにも上記の非球面を使用することができる。それは、第1方向での（非球面の1つによる）ひとみ充満ともう1つの方向での（もう1つの非球面による）中間像との間で均一化の組み合せを達成するためである。追加の非球面によって画像誤差の補償効果も得られる。集光ミラーに加えて、当然のことながら、さらに第2の非球面を設置することもできる。
【００３７】
したがって、第2切断面に球面曲率を持つ非球面ミラーを形成するには、集光ミラーがｘ方向ではｒｘ＋2・dに等しい曲率半径を有していることが好ましい。ただし、dは非球面ミラーと集光ミラー間の距離である。その場合、第２切断面における非球面ミラーの曲率半径ｒｘが、直接長方形の照明フィールドまたは照明光のプロファイルを等級付ける。
【００３８】
ひとみ照明の均一化には、当然、両切断方向において非球面であるミラーの使用も可能である。回転対称な非球面の場合では、これは均一照明された円形フィールドを生み出す。そうでない場合は楕円形のフィールドになる。このように照明されたひとみから、走査方法ごとに個々の領域が、例えばニポーディスク、スリット絞りなどにより選択でき使用できる。
【００３９】
非球面ミラーの照明には、ミラーの対称軸を、例えばガウス形プロファイルを持つオリジナルビームの入射軸に対して4°〜20°の角度に設置するのが、コンパクトな構造にできて有利である。例えば円筒型またはゲート型に構成することのできる後続設置集光ミラーが、非球面から分配されたビームエネルギーを収集し、伝播中に膨張する波収差を補償する。簡単な事例でそのような波収差が大きな影響を及ぼさない場合、集光ミラーの代わりに球面レンズを使用することもできる。
レーザ走査型顕微鏡では、好ましくも、オプショナルな独立作用性の第2走査装置によりズーム分散機能、すなわちクロップ（Crop）機能が実現される。
【００４０】
レーザ走査型顕微鏡では共焦点結像はスリット絞りによってもたらされる。検出器に任意のエアリー直径を生成するには、この場合スリット幅の無段調整の可能なスリット絞りが好ましい。無段調整は、例えばソリッド継手技術を応用したスリット絞りによって達成することができる。それに代わり、様々なスリット幅を持つ交換可能な複数のスリット絞りから成るスリット絞りユニットを使用することもできる。例えば、構造化クロムマスクなど、様々な幅を持つ固定式スリット絞りをスライダに配置することができる。
【００４１】
特別簡単な解決策として検出器自体がスリット絞りの作用をする場合がある。それには、例えば一列に並んだピクセルを持つライン検出器が使用できる。また、検出ユニットに、スリットを横切る方向にスポット分解能を持ち、共焦点平面に配置される面ビームセンサを装備させることも可能である。その場合、面ビームセンサにおいて選択された部分領域が共焦点スリット絞りとして作用する。このように、センサ、例えばCCDまたはCMOS検出アレーの読み出し領域における然るべき選択によってスリット絞りの直径変更効果が実現できる。
【００４２】
レーザ走査型顕微鏡では照明にも検出にも、当然種々様々なスペクトルチャネルが使用できる。これに関しては、走査装置がメインカラースプリッタの使用下で、照明入射ビームを試料領域からの戻りビームから分離するのであれば、非常に大きな多様性が与えられる。その場合カラースプリッタは、その開示内容が本発明と明白に結び付きのあるＤＥ  １０２  ５７  ２３７  Ａ１に基づくストライプミラーとして実現することができる。
【００４３】
そのようなストライプミラーはスペクトル的に独立したメインカラースプリッタとして作用する。これは、試料平面で反射する、すなわちコヒーレントな照明光が線形に結像する走査装置ひとみ平面内に設置される。それに対し、インコヒーレントな被検出信号ビームはひとみ平面全体を満たし、細いストライプミラーによって非主要部だけが減衰される。したがって、「カラースプリッタ」の概念は非スペクトルに作用する分離システムをも含んでいる。
適用別の選択が可能なように、メインカラースプリッタには、例えば、個々に取換可能なスプリッタを含む然るべき分離ダイヤルなど、簡便な取換を可能にする機械装置が備わっているのが好ましい。
【００４４】
ダイクロイックビームスプリッタは、例えば、反射測定、ストークス／反ストークスラマン分光法、高次のコヒーレントラマンプロセス、第２高調波発生、第３高調波発生、和周波発生などの一般的パラメトリック非線光学プロセス、2光子吸収、多光子吸収または蛍光測定など、コヒーレントな、すなわち指向性のあるビームを検出すべき場合には特に有利である。非線光学分光法としてのこれら方法の幾つかでは、コリニアに重なり合う2つまたはそれ以上のレーザビームが要求される。
この場合、図示されているような、複数レーザからの照明ビームの合一化が非常に有利であると実証されている。蛍光顕微鏡法で広く普及しているダイクロイックビームスプリッタであれば、原則として使用可能である。ラマン顕微鏡法でも、レイリー散乱成分の抑制のために検出器の前にホログラフィックノッチスプリッタまたはフィルタを使用するのが有利である。
【００４５】
複数のセパレート式スペクトルチャネルによる検出の場合、信号ビームはサブカラースプリッタによりスペクトル成分に分離される。その場合各サブカラースプリッタにはスペクトルチャネルが追加装備されている。個々のスペクトル成分は丸型および／または円筒型光学系により対象物平面に共役な、ストライプ形態の領域に集束する。このスリット絞り領域は部分コンフォーカル特性を示し、例えば放出フィルタによるスペクトルフィルタリング後、光学系グループ（例えば、円筒型レンズの使用下）により、スリット方向にスポット分解能を持つ然るべき検出器、例えばCCDラインカメラまたは光学マルチチャネル分析器に結像する。
【００４６】
検出器としては、代替用にまたは追加補充用に、線形ビームをラインを横切る方向にスペクトル分割し、面ビーム検出器へ誘導する分光計を使用することもできる。時間分解プロセスの分析を行いたい場合は、検出ユニットとして、線形ビームをラインを横切る方向に経時的に分割し、面ビーム検出器へ誘導するストリークカメラを使用するのが目的に適っている。
【００４７】
検出器のスポット分解信号は、一方の座標に場所の座標を、もう一方の座標には個別ピクセルにおけるビーム信号の時間的経緯またはスペクトル組成を場所座標に沿って再現する時間または波長の座標を含んでいる。
線形または非線形のラマン信号の検出では、偏光に依存する照明または検出により、検査対象である分子振動の対称を分析することができ、また障害となる非ラマン共振性基礎成分を抑制することができる。それゆえ、そのような適用例では、照明装置に少なくとも1つの偏光子を、および検出装置には少なくとも1つの偏光分析器を使用することが勧められる。
【００４８】
それぞれが1つずつ検出ユニットを持つ複数のスペクトルチャネルを有する記述の実施態様の場合、各スペクトルチャネルに独自のスリット絞りを使用することができる。しかし、構造の簡易化のために、全スペクトルチャネルの前に共通のスリット絞りをオプショナルに設置することもできる。
【００４９】
共焦点スリット状素子（例えば、スリット絞りまたは検出器で使用）は位置調整の簡易化のため、適切にスライドできるように形成することができる。しかし、照明装置内および/または検出装置内に設けられた補正装置のほうが構造的に簡易である。これにはプレートの傾倒位置の変更によって光路内におけるビームの平行移動幅を設定するために、光路内のホルダに保持され、それにより少なくとも1軸の周りを傾倒および/または旋回運動できるようになっている、少なくとも1つのオプチカルフラットな透明プレートが装備されている。
【００５０】
補正装置は、光学装置の結像時に発生する収差の補償または補正が簡易に行えるという長所を持っている。特に、周辺温度またはシステム温度、取換可能なまたは可動式素子の装置内設置、使用ビームの波長または波長領域に起因する色収差は簡単に補正することができる。その場合装置によっては、1軸傾倒または旋回移動で十分なことがある。2軸平行移動の配備を望む場合は、2軸対応の傾倒または旋回プレートを使用するか、あるいはそれぞれ異なった1軸式の傾倒または旋回プレートを2つ装備することができる。
【発明の効果】
【００５１】
本発明では、ホルダ付きのオプティカルフラットプレートを定義付けされた公知の方法により光路内で傾倒させ得るということが重要なポイントである。２軸調整にはそれぞれ、傾倒および旋回移動の組み合せが有用である。その場合、傾倒移動と旋回移動の組み合せは機械的に比較的簡単に実現することができ、しかも旋回運動で発生するオプティカルフラットプレートの光軸に沿う動きが不利益を招来することもない。
【００５２】
装置による補正は、例えば機械の調整などオペレータが手動で行うことができる。しかし、光学装置に関して少なくとも1つの作動パラメータを捕捉し、作動パラメータの値に依存して傾倒位置を調整する調整装置による改善が特に好ましい。傾倒位置は、例えば較正表で調整することができる。また、作動中の制御系を通じて恒常的に、規則的に、または要求に呼応して傾倒調整による補正を最適化することが可能である。そのような作業には、結像光学装置に対する上記影響を補償するために、プレートの傾倒位置を調整量として使用する制御系を装備することが望まれる。そのようにして、光学装置に起こり得る温度偏差または長時間ドリフト偏差を簡単に補償することができる。
【００５３】
オプチカルフラットプレートによる平行移動は、周知のとおり透明プレート材の屈折率に依存するので、多色ビームの場合光学装置の光路内での波長別平行移動においてプレート材の分散特性により横色収差が発生することがある。オプチカルフラットプレートを1つまたは複数の部分プレートから構成することによって、オプチカルフラットプレートに起因するそのような横色収差を補償することができる。
【００５４】
補正装置はまた、操作状態に依存する、光学結像自体の可変的な横色収差の回避のためにも使用することができる。例えば、光学装置が様々な波長で操作可能な場合、波長に依存して、したがってまた操作状態に依存して横色収差が発生することがある。補正装置はその場合、実際に光学装置内で使用されている波長領域およびそれに起因する横色収差に応じてオプチカルフラットプレートを別な傾倒位置にセットするので、異なった波長領域での作業にも拘わらず装置内で効果に変わりのない光学的結像が得られる。この補正にももちろん、既述のとおり、制御系の装備も可能な然るべき調整装置を使用することもできる。
【００５５】
ホルダを通した駆動における精度および感度に対する要求は、平行移動の可能範囲と同様、オプチカルフラットプレートの厚さを通じて簡単にプレセットすることができる。
補正装置は、既述の通り、結像光学装置内で移動可能な光学素子への要求を緩和している。この長所は、共焦点顕微鏡が、様々なアプリケーションへの適合化、すなわち入射波長または読み出し波長の取換を行う、交換可能なビームスプリッタを有している場合に特に有効になる。補正装置は、変更可能な光学素子に起因する誤差を光学的結像に操作を加えることなく補正する。補正装置はその上、共焦点絞りと検出器間でも使用でき、絞りと検出器間の光路（結像）を適切に平行移動させることができる。
【００５６】
オプチカルフラット透明プレートのスリット絞りに対する垂直方向の偏差も水平方向の偏差も傾倒位置の然るべき調整によって補償される。
第1の場合では、試料からの光がスリット絞りに正確に命中し、スリット絞りの上や下に分散しないことが確保される。第2の場合では、試料からの光がライン検出器に正確に命中し、例えばそれぞれが固有のライン検出器を持つシステム内2つの検出チャネルの画像間でピクセル移動のないことが確保される。このようにして、共焦点顕微鏡はマルチチャネル構成においてサブピクセル単位の正確な画像カバリングを達成することができる。
【００５７】
補正装置は共焦点顕微鏡での使用の場合、以上のほか、スリット絞りおよび検出器を移動させなくても小型ライン検出器の使用が可能である点で有利である。それにより、分解能を高めるためにスリット絞りを強く絞った場合に調整ズレ（取換可能な素子の傾倒および楔角誤差に起因）が起こって不必要に光流が消失し信号対雑音比が低下するという事態が避けられる。
【００５８】
個々に接続可能な光学素子の傾倒誤差または楔角誤差は通例再現可能なので、透明なオプチカルフラットプレートの傾倒位置を簡単に選択することが可能である。接続可能な光学素子の取換において、顕微鏡の構成を望み通りにするには傾倒位置の新たな設定が必要であるが、それには透明なオプチカルフラットプレートを一定駆動させるだけで事足りる。それゆえ、取換または移動可能な素子を光路内に設置し、調整装置が取換または移動可能な素子の構成を操作パラメータとして捕捉し、操作パラメータの値に依存して傾倒位置の調整をする顕微鏡の開発改良が望まれる。
【００５９】
光学的結像に関するスリット絞りの調整ズレだけでなく、横色収差も補償するそのようなパラメータの例では、有利なことに、様々な波長のビームを顕微鏡光路内に誘導することが想定されている。その場合、調整装置により波長に応じて傾倒位置の調整が行われる。それぞれの検出チャネルに1つまたは複数のオプチカルフラットプレートが割り当てられ、検出器の前に配置されるが、オプチカルフラットプレート傾倒位置の調整は稼動チャネル内の波長または波長領域に依存して調整装置により行われる。
【００６０】
オプチカルフラットプレートの傾倒位置を調整量として用いることにより、検出ユニットにおけるビーム強度を最大に、および／または画像シフトを最小にする制御系が装備されていれば極めて快適な操作性が得られる。それにより、調整ズレを巻き込む長時間作用または温度変動について、技術サービス担当者の投入がなくても何時でも補正することができる。
【００６１】
本発明に基づく改良型顕微鏡では、試料を広域視野で照明して点または点群スポットの走査により結像させることが想定されている。
このように、本発明では有利なことに、広域視野照明と走査検出とが組み合わされている。驚くほど簡易なこの対策によってセパレート型検出器は省略することができる。同時にその他にも付随的利益が得られる。
【００６２】
広域視野照明には、定常光学観察用のレーザ走査型顕微鏡に元々備わっている光源を使用することができる。切換のための機械装置は全く必要ない。したがって、全体としては構造の簡易化がもたらされる。好ましくも、広域視野照明用の光源は試料の透過照明を実現しよう。また、例えばエピ蛍光測定または反射測定の実施に、広域視野落射照明を代替用に、および追加補充用に使用することも当然可能である。両モード（落射光および投射光）を同時に適用することもできる。
したがって、共焦点検出装置の深度弁別能が深度分解透過測定を実現する。
【００６３】
走査用の励起照明光源と比較して通例非常に広帯幅である、殆どの場合元々備わっている広域視野照明光源の使用により、従来式のレーザ走査型顕微鏡では共焦点結像の要求があるため不可能であった、または光源側に多大なコストを費やしてのみ可能であった白色光による透過光操作が実現可能になる。同様のことが広域視野落射蛍光励起についても当てはまる。
【００６４】
広域視野照明された試料を走査検出器により走査することによって、レーザ走査型顕微鏡の検出装置が持つスペクトル分析能を透過操作においても十分に利用することができ、それが試料特徴付けの改善に寄与している。
広域視野照明はスポット状の走査照明とは切り離して操作することができる。もちろん、制御ユニットは同時にも作動させることができ、その場合試料は透過操作に加え従来型の蛍光操作により同時に分析される。
【００６５】
例えば、制御ユニットは様々なスペクトルチャネルから適宜読み出しすることができる。その場合、あるスペクトルチャネルには試料の蛍光情報が、別なスペクトルチャネルには透過情報が収められている。例えば重畳画像について、これらの情報を適切に合成すれば、従来のシステムに優る試料分析が行える。したがって、制御ユニットはスポット照明装置と広域視野照明光源の作動を同時に制御し、スポット検出装置のスペクトルチャネルから適宜読み出しを行うのが好ましい。
【００６６】
本発明に基づく手段のもう1つの長所は、複数点に対し同時にも透過光走査ができることにある。試料の下方に配置される従来型のセパレート式検出器では、然るべきスポット分解能に欠けるためこれは不可能であった。本発明によって開かれた、透過光操作での多点型または点群型スキャナの使用で、広域視野照明の経時的変動により発生する問題が緩和される。それは、多点型または点群型システムにおける積分時間の然るべき延長によって補償できるからである。それゆえ、広域視野照明および点状または点群状の走査照明が同時に行なわれることが望まれる。
【００６７】
この場合、点群とは、レーザ走査型顕微鏡による共焦点の照明および結像において複数点が形成する、特にライン状形態のそれぞれの配置のことである。このアプローチにより、好ましくもさらに、現状技術では不可能であったレベルでの試料負荷の軽減または測定時間の短縮が実現される。したがって、スポット検出装置によって、例えば少なくとも1つのニポーディスクおよび少なくとも1つのマトリックス検出器によって共焦点点群結像が実現されることが特に好ましい。点群としてラインが用いられる場合、スポット検出装置においてもライン検出器付きの共焦点スリット絞りを使用することができる。
【００６８】
広域視野照明の使用は、最終的には透過光測定のための斬新なコントラスト法を開拓する。コントラスト法としては、従来型光学顕微鏡分野の現状技術レベルで公知であるすべてのものが対象になる。それの実現には、広域視野照明光源がコンデンサを有していて、コントラスト装置に接続可能であることが望まれる。例えば、コンデンサに適当なリング帯を配置することによって暗視野照明を実現することができる。
【００６９】
さらにまた、そのひとみ平面に適当なコントラスト装置の接続できる走査対物レンズを有する走査装置によれば別なコントラスト法も考えられる。コントラスト装置のコンデンサへの組み込みは、暗視野コントラストの場合だけでなく、位相コントラスト、VARELコントラスト、偏光コントラストまたは微分干渉コントラストの場合にも可能である。
【００７０】
レーザ走査型顕微鏡はゲート検出アレーおよび公知のポンピング、試料技術の補助を得て、経時分解プロセスの追加的検査が可能である。
スリット絞りで生成された部分コンフォーカル性により、広域視野光学照明に比べて改良されたスライス分割が達成される。したがって、本発明に基づくラインスキャナはz方向の迅速フォーカシングとの組み合せで広幅試料の3次元再構成を可能にする。z方向の迅速フォーカシングは、z方向での試料の動き（例えば、迅速な機械的駆動または試料の圧電式移動による）、対物レンズのz方向での移動（例えば、迅速な機械的駆動または対物レンズの圧電式移動による）、対物レンズのフォーカシングまたは迅速適合型光学系により実現することができる。
【００７１】
本発明に基づくレーザ走査型顕微鏡は、顕微鏡装置の使用により弱い分光信号のための検出方法を実現する。使用領域は顕微鏡検査、顕微鏡分析から2次元、3次元の「リアル」画像形成に到るまで広範囲に及んでいる。そのうち、主要な方法は、共焦点ストークス/反ストークス・ラマン顕微鏡法を含んでいる。しかし原則的には、各種分光法および特に信号強度の弱いその種の方法は、本発明に基づく顕微鏡の利用により顕微鏡観察でのコントラスト化に使用することができる。
【００７２】
そのような方法として、例えばルミネセンス分光法（蛍光、特に蛍光偏光測定、化学性蛍光、バイオ蛍光、燐光）赤外顕微鏡法、円2色性（CD）分光法、ハイパラマン分光法、誘導ラマン分光法、コヒーレントストークス/反ストークス・ラマン分光法（CARS、CSRSおよび高次コヒーレント・ラマンプロセスの全体、いわゆるHORSES）、第2高調波発生（SHG）、第3高調波発生（THG）、和周波発生（SFG）、2光子、多光子吸収または蛍光などの一般的パラメトリック非線光学プロセスが考えられる。
最後に挙げた非線光学分光法のうちの幾つかは、ビームがコリニアに重なり合う2つまたはそれ以上のレーザを必要とする。その場合、図示されている複数レーザのビーム結合が特に有利であることが実証されている。
【００７３】
本発明の使用法としては、顕微鏡の高いスポット分解能と旧来の光学分光法とが定型的に結び付けられている方法すべてがその対象になる。本発明の適用は、定型的に、すなわち高い時間コストを費やすことなく、2次元、3次元の物質分布を準リアルタイムで追跡すべき場合には特に有利である。したがって、有望な適用領域となるのは、化学、薬学分野における特性表示、繊維、フォイル、ワニス、分散液、懸濁液、エマルジョン、合成物質、錠剤などにおける作用物質の分布に対するプロセスコントロールである。これらのなかで特に興味惹かれるのは、結晶性および無定形固体の分析（例えば、結晶内不純物の分析および配分）である。既存物質の微量分析による特徴付けのほか、例えば微流動性反応担体中での置換、結晶転位および固体重合における化学反応プロセスの追跡も考えられる。
【００７４】
医療技術分野では、特に、作用物質に対してラマン分光法により行うスポット分解性の非浸入性測定がとりわけ大きな関心事である。ラマン分光法の医療分野への適用は、焦点におけるレーザの所要出力密度およびそれに付随して発生する生人体組織の破壊により制限されることが多い。本発明に基づくラインスキャナを対応の点像スキャナと比較した場合、撮像時間および信号対雑音比を同じとすれば、測定における試料の負荷を１／ｎ（n=500〜2000）に軽減させることができる。実際の適用例としては、人間の眼および皮膚における色素と抗酸化剤の不均一分布測定を挙げておく。
【００７５】
本発明のその他可能な適用領域として、薬剤作用物質の開発分野におけるマイクロタイタープレート（マルチウェルプレート）のハイスループット・ラマン・スクリーニングがある。ここでしばしば大きな関心事になるのは、レントゲン構造分析として装置関係のコストが低いだけでなく、上澄液を含む試料に対しても実施可能である、ラマン分光法による多形性の研究である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
以下では本発明を図解例に基づきさらに詳しく説明する。
図1は、主要部が5つのコンポーネント、すなわち、レーザ走査型顕微鏡検査のための励起光を生成する光源モジュール2、励起光をコリメートして試料上の走査のため然るべき偏向を行なう走査モジュール3、走査モジュールによって用意された走査ビームを顕微鏡光路内で試料の方向に向ける顕微鏡モジュール4および試料からの光線を受け止め検出する検出モジュール5から成るレーザ走査型顕微鏡1の模式図である。その場合検出モジュール5は、図1に描かれているように、スペクトル別のマルチチャネル型に構成することができる。
【００７７】
光源モジュール2は、レーザ走査型顕微鏡検査に適した照明光、したがって特に蛍光を誘起し得るビームを生成する。適用法に対応させるため、光源モジュールは当目的用に複数の光源を有している。図示された実施態様では光源モジュール2に2つのレーザユニット6および7が配備されている。それらの後にはそれぞれ光バルブ8および減衰器9が接続されており、それらはビームを結合ポイント10を通じて光ファイバ11に連結させている。光バルブ8は、レーザユニット6または7のレーザ自体の作動を遮断しなくてもビームを遮断させることのできるビーム偏向器として機能する。光バルブ8は、例えば、ビーム遮断のためレーザビームを光ファイバ11へ連結する手前で、図示されていない光の落下方向に偏向させるAOTF（音響光学フィルタ）として形成されている。
【００７８】
図1のモデル例ではレーザユニット6は、3つのレーザB、C、Dを有しているが、それに対しレーザユニット7はレーザAを1つ持つのみである。したがって、図の6と7は単一波長用レーザと多種波長用レーザの組み合せモデルであり、個別に、または共同で1つまたは複数のファイバに連結されている。複数ファイバを通じてビームを同時連結することも可能であるが、その場合ではビームは後に、すなわち適合光学系の通過後にカラー結合器によって混合される。このようにして、励起光用に種々様々な波長または波長領域を使用することができる。
【００７９】
光ファイバ11に通されたビームは、移動式のコリメーション光学系12および13によりビーム結合ミラー14、15を通じて合一化される。
コリメータ12、13は、光源モジュール2から走査モジュール3へ送られるビームが無限大光路にコリメートされるように作用する。これはそれぞれ、（図には描かれていない）中央制御ユニットの制御下のもと光軸に沿って移動することでフォーカシング機能を発揮する個別レンズで行うのが有利である。コリメータ12、13とそれぞれの光ファイバ末端との距離は変更可能なようになっている。
ビーム形成ユニット16については後にさらに詳しく説明するが、これは、ビーム結合ミラー14、15の後方に位置する回転対称なガウス型プロフィールのレーザビームから、もはや回転対称でない、長方形型照明フィールドの形成に適した横断面を持つ線形ビームを生成する。
【００８０】
以下では線形ビームと称するこの照明光は励起光として用いられ、メインカラースプリッタ17を通じてスキャナ18に誘導される。メインカラースプリッタについては後ほど詳しく述べるので、ここでは顕微鏡モジュール4から戻ってきた試料光を励起光から分離させる機能を持つことだけを指摘しておく。
スキャナ18は線形ビームを1軸方向に偏向させるので、ビームは走査対物レンズ19および鏡筒レンズ20、対物レンズ21を通って、プレパラートまたは試料23内にある焦点22に集束する。その場合光学結像は、試料23が励起光により焦線で照明されるように行なわれる。スキャナ18による2軸偏向はオプショナルである。これは、さらに詳しく説明するが、光軸に非対称なROI走査領域の選択に用いることができる。
【００８１】
線形焦点22で励起されたこのような蛍光ビームは、顕微鏡モジュール4の対物レンズ21、鏡筒レンズ20および走査対物レンズ19を通ってスキャナ18に戻るので、スキャナ18に向かっての戻り過程の方向では再び定常ビームになっている。したがって、スキャナ18は蛍光ビームをデスキャンするとも言われる。試料上の多くの点がライン状に同時平行に照明および走査される。したがって、ラインは点群から成っている。
【００８２】
メインカラースプリッタ17は励起光とは別な波長領域にある蛍光ビームを通すことができるので、蛍光ビームは検出モジュール5の転向ミラー24で転向させた後分析することができる。検出モジュール5は図1の実施態様では複数のスペクトルチャネルを有している。すなわち、転向ミラー24のほうから来た蛍光ビームはサブカラースプリッタ25により2つのスペクトルチャネルに分割される。
【００８３】
各スペクトルチャネルは、試料23に対して共焦点結合あるいは部分共焦点結合を実現するスリット絞り26を有しており、その大きさがビームの検出を可能にする焦点深度を決定する。したがって、スリット絞り26の幾何学構造は、蛍光ビームの検出がなされる（厚みのある）プレパラート内の切断面を決定づける。
【００８４】
スリット絞り26の後方にはさらに、検出モジュール5に到達した歓迎されざる励起光をブロックするためのブロックフィルタ27が配置されている。特定深度の切断面に由来する、このように分離され扇形に広がった線形ビームは、次に然るべき検出器28によって分析される。上記のカラーチャネルと同様に、スリット絞り26a、ブロックフィルタ27aおよび検出器28aを持つ第2スペクトル検出チャネルも構成されている。
【００８５】
図1のレーザ走査型顕微鏡1は、焦線によって照明される試料領域の共焦点走査のほか、これについて別途図示されているオプション構造によりまた別な計測作業法も可能である。その目的のため、当該ビームが、走査光学系19の照射方向とは逆向きにランプ光学系30およびコンデンサ31を通って試料23のほうに向けられた広域視野照明としてのハロゲンランプ29が配備されている。この照明の透過成分も同様に、対物レンズ21、鏡筒レンズ20、走査対物レンズ19およびスキャナ18を通され、走査法によって走査され、メインカラースプリッタ17および検出モジュール5のサブカラースプリッタによりスペクトル分析される。スキャナ18を通しての検出により試料走査の形でスポット分解が行われ、同時にハロゲンランプ29を通しての広域視野照明も可能である。
【００８６】
同じコンセプトを後方反射ビームおよびエピ蛍光ビームの評価にも適用することができる。その場合では、照明光を水銀蒸気ランプ34からランプ光学系35を通じてビームスプリッタ36に誘導し、そこで顕微鏡モジュール4の鏡筒へ連結させる。このビームは、その後対物レンズ21を通って試料23に達する。この場合も照明はスキャナ18の作用を借りずに行われる。それに対し、検出はやはり検出モジュール5の走査光学系19およびスキャナ18を通じて行われる。このように、検出モジュール5はこの追加態様に対して二重機能を有している。当モジュールは、一つには走査入射励起光に対する検出器として用いられる。その場合、スキャナ18は励起光の入射にも検出光のデスキャンにも用いられる。検出モジュール5は、また一つには、もはやそれ以上構造化されないビームが、すなわち対物レンズ21の下方または上方から広域視野照明光として試料に入射する場合にはスポット分解検出器として作用する。
さらにまたスキャナ18も二重作用を有している。それは、点状入射励起光の場合だけでなく、広域視野照明の場合でも試料の点状走査によってスポット分解を達成するからである。
【００８７】
図1のレーザ走査型顕微鏡1は、さらに組み合せ操作も可能であり、その場合光源モジュール2から点状または点群状に入射した励起光のほか、ハロゲンランプ29または水銀蒸気ランプ34からの広域視野照明も試料23に向けられ、そのように重複照明された試料においてスキャナ18および検出モジュール5により、それぞれ対応した点状または点群状の走査が達成される。したがって、サブカラースプリッタ25〜25cの然るべき選択によって、旧来の透過式または反射式顕微鏡検査法をレーザ蛍光測定と組み合わせることができる。そのように、走査および検出器28〜28cの信号評価から得られた画像情報は、次に単独で、または重畳状態で評価および表示することができる。
【００８８】
広域視野照明の場合、照明領域の調整ができるように、特にランプ光学系30とコンデンサ31間に視野絞りを設置するすることができる。さらに、コンデンサ31に開口絞りを接続させることもできる。開口絞りはレーザ走査型顕微鏡のひとみ平面に対して共役位置に設置される。このひとみ平面は、スキャナ18の存在するひとみ平面であり、またメインビームスプリッタ17の配置されている平面である。例えば暗視野コントラスト、位相コントラストVARELコントラストまたは微分干渉コントラストなど旧来の顕微鏡検査法から公知のコントラスト法を適用するために、様々な光学素子を開口絞りとして、およびひとみ平面で使用することができる。適切な開口絞りまたはひとみ平面に設置される素子については、例えば出版物“Microscopy from the very beginning”、Carl Zeiss Mikroskopie社、D-07740  イェーナ、1997年出版、18〜23ページに説明されている。当出版物の開示内容のうち、この点に関しては本発明に明確な形で取り入れられている。そのようなコントラスト操作法に適しているのは、もちろん該ひとみ平面だけではない。それに対しては他のひとみ平面も有用である。この措置は、例えばメインカラースプリッタ17の近くでも、あるいは検出光路の1つ（または複数）のスペクトルチャネル内で、それもサブカラースプリッタ25後方のリレー光学系によって行うことができよう。
【００８９】
検出モジュール5での共焦点スリット開口の使用はモデル例としてのものに過ぎない。原則として、点雲型またはニポーディスク型など任意のマルチポイント型装置が使用できる。ただし、検出器28がスポット分解能を有していて、スキャナ通過時に試料の複数点が同時平行的に捕捉されることが不可欠である。
このコンセプトにより、技術水準的にこれまでは必要であった顕微鏡モジュール4のノンデスキャン検出器が省略できる。その上、共焦点検出により、ノンデスキャン検出の場合では、通例高コストのマトリックスセンサでしか得られないような高分解能が達成できる。しかも、例えばハロゲンランプ29または水銀蒸気ランプ34など入射広域視野照明の経時的変動についても、スポット分解検出器28、28aにおける然るべき統合により解消することができる。
【００９０】
レーザ走査型顕微鏡1のこの操作法にはもちろん、メインカラースプリッタ17およびサブカラースプリッタ25がそれに適合するように調整される。それにより、カラースプリッタが然るべきダイクロイックタイプとして構成されていれば、両種照明、すなわち下方からの広域視野照明と対物レンズ21を通しての照明を同時に行なうことができる。また、走査された光源モジュール2からの照明と任意に組み合わせることも可能である。それに対応して重なり合う評価信号のグラフィック模様が、従来法に優る画像情報を提供する。
【００９１】
例えば、ラインスキャナの共焦点マルチポイント結像とマルチチャネルスペクトル検出との組み合せにより高度に並行的なデータ記録が可能である。1秒当り200画像以上という撮像率が達成でき、レーザ走査型顕微鏡ではこれ迄実現されなかったリアルタイム性が現実になる。他方、レーザ走査型顕微鏡1は、特に強度の弱い信号に対し高感度の検出を可能にする。単点式の共焦点レーザ走査型顕微鏡との比較では、撮像時間、試料内結像面積、視野およびピクセル当りのレーザ出力を同じとして、多点結像のポイント数をnで表わせば√n倍改良された信号対雑音比が実現される。検出器の場合1走査線500〜2、000が典型的な値である。
【００９２】
レーザ走査型顕微鏡1の光源2は、それに必要な前提、すなわち、例えばビーム形成ユニット16から発せられる照明ラインなど、比較可能な単点式共焦点スキャナのレーザフォーカスに対しn倍の出力を持つ多点照明という条件を満たしている。
そのほか、撮像時間および信号対雑音比を同条件にして単点式共焦点スキャナと比較した場合の試料負荷に関しては、すなわち試料に当てることで試料を退色させるかもしれないビームの照射は、これ迄単点式共焦点スキャナで適用されてきたビーム出力を複数の点に、例えばラインに分布させることで1/nの量に減らすことができる。
【００９３】
このように、多点走査式のレーザ走査型顕微鏡は単点式共焦点スキャナと比較した場合、信号対雑音比および試料負荷が同じであれば脆弱な試料物質の低強度信号をn倍速く、撮像時間が同じであれば√n倍改良された信号対雑音比で、または撮像時間が同じであれば、信号対雑音比同等で試料負荷１／ｎで結像させることが可能である。
【００９４】
図2は、レーザ走査型顕微鏡1における光源モジュール2、走査モジュール3および検出モジュール5の実施態様の詳細を示したものである。既に図1で描かれた構成部は図2でも同符号で表わしてあるので、図2の説明に関しては少なくとも部分的には図1を参考にすることができる。
図2から見て取れるように、可動式の、すなわち移動可能なコリメータ12および13を経由したガウス光線束はビーム結合ミラー14、15としてのミラー階段を通じて合一化され、続いて長方形のビーム横断面を持つ光線束に変換される。図1のビーム形成ユニット16としては、最も簡単な例では円筒型光学系が使用される。しかし図2の実施態様では、円筒型テレスコープ37が使用されていて、その後方に非球面ユニット37、続いて円筒型光学系39が配置されている。
【００９５】
なお、非球面ユニット37の構造様式および機能については、以下に図3〜7を手掛かりに説明する。
図3および図4は、光源ビームのビームプロファイルの変形を可能にする照明装置を示している。
図3は（x、y）平面の断面で、図4はそれに垂直な（z、y）平面の断面である。元々は、伝播方向に垂直なそれぞれの断面方向ではガウスプロファイルを示すビームである。変形後プロファイル平面Pでは実質上長方形のフィールドに照明するビームになっている。その場合フィールド縦軸に沿う強度分布はガウス形ではなくボックス形である。
【００９６】
ビームの変形には、ビームを拡大する非球面鏡38.1が利用される。拡大されたビームは集光ミラー38.2により再び平行化される。非球面鏡38.1には、光源から発せられた、回転対称なガウス型ビームプロファイルを有する元のビーム38.3が衝突する。非球面鏡38.1は図3に描かれた断面ではその曲率半径ｒｘに応じて湾曲しており、したがってそこでは球面である。非球面成分は図4に描かれた、なお説明の要する断面において初めてその作用を現わす。非球面鏡38.1ではあるがx軸に沿って球面性があるため、非球面鏡38.1から発した分散ビームはガウスプロファイルを保持したまま拡大される。図3の切断平面でも同様に球面である集光ミラー38.2は、図3の断面図の中のひとみ平面Pにおいても同様にガウスプロファイルを有する特徴化ビーム38.5用として配備されている。この拡大を望まない場合は、もちろん非球面鏡38.1および集光ミラー38.2を（x、z）平面に対してフラットに構成することもできる。
【００９７】
図4は、図3に垂直な断面を示している。この平面では、非球面鏡38.1は非球面に形成されていて、光源から発せられたオリジナルビーム38.3はエネルギーの再分配下で分散性ビーム38.4に変換される。非球面鏡38.1は光軸に対して角度を増す方向にビーム出力を増大させながら反射するので、図4の断面図では分散性ビーム38.4内でエネルギーが再分配される。集光ミラー2は、図4の断面図では横断面がもはやガウス形でない分散性ビーム4を集めてプロファイルを持つビーム38.5に平行化させる。したがって、図4のこの平面では図3の場合とは異なり、図解された部分ビームは等間隔の分布を呈していない。
【００９８】
図3および図4で示した凸曲面を持つ非球面鏡38.1の作用については、図5で例示した鏡面38.6を観察することにより一層理解しやすくなる。鏡面38.6は、稜線38.9で合流する2つの屋根面38.7、38.8を有している。稜線38.9の湾曲からも明かになるように、鏡面38.6も同時にx軸に沿う方向で球面湾曲している（選択的特徴、上記参照）。したがって、鏡面38.6は（z、y）断面（y軸に平行）では丸みのある先端を持つ円錐形である。それに対し、x軸に平行な断面（(z、x)断面）では球面湾曲を形成する。x軸に沿う方向では、球面湾曲の代わりに、もちろんフラットな構成あるいは非球面性の湾曲も同様に使用することができる。
【００９９】
（z、y）平面における非球面湾曲は図4に描かれたエネルギー再分配を惹き起こす。それは、先端部分だけが丸みのある円錐形のプロファイルであるため、光軸に対する角度が大きくなればエネルギー増量分も反射されるからである。それに対し、（x、y）平面の球面湾曲は、図3に描かれているようにプロファイルを維持したままビームの拡大をもたらす。そのように、回転対称な元のガウス形プロファイルがほぼ長方形のプロファイルに変形される。両切断平面が非球面の場合、両切断平面のフィールドは均質化される。
【０１００】
図6は（z、y）断面、すなわちy軸に沿う断面における鏡面38.6の切断線38.12を示している。切断線38.12は説明のため、図6だけでなく図5にも記入されていて、そこでは太線表示されている。その形態は実質上2つの幾何学ファクタによって決められる。1つは放物線38.10で、これが切断線38.12の丸みある先端の形態を決定し、他の1つは漸近線38.13で、これが先端38.11から離れた位置で切断線38.12の辿る軌跡を定義付ける。放物線38.10は先端に対する曲率半径の指定により定義付けすることができる。漸近線38.13は円錐定数Qによって決定づけられる。y値が無限大のほうへ向かうと、切断線38.12は直線１／（Ｑ・ｃ）＋ｙ／（１−（１＋Ｑ）１／２）に接近する。これより、円錐定数Qは外球面領域における勾配（１−（１＋Ｑ）１／２を決定づける。半径cは先端38.11領域における曲率を決定する。以上より、切断線は全体として等式y2/[c + (c2-(1 + Q)y2)1/2]によって定義付けされる。
【０１０１】
1切断方向について説明した非球面性は、もちろん他の切断方向においても想定し得る。そうすることで、均一に照明された楕円形または円形のフィールドが得られる。回転対称な非球面鏡38.1の場合後者になる。選択肢としてx方向の球面性を放棄することもできる。その場合では、非球面鏡38.1は各x座標について切断線38.12のプロファイル形態を持つことになる。
【０１０２】
図5に描かれた鏡面は曲率半径c= 10 mm、円錐定数Q=-100およびx軸に沿う方向の曲率半径rx= 100 mmを有している。パラメータrxは通例、オリジナルビーム38.3の直径より遥かに大きく選定することができる。
【０１０３】
図7はy軸に沿ったプロファイル平面において、プロファイル38.14として描かれた強度Iの近似的均等分布を示している。見て取れるように、照明された領域の80 %以上においてビーム強度が最高値の80 %を上回っている。したがって、実質上均質である。プロファイル38.14はボックス形に近く、いずれにしろ元のガウス形プロファイルよりも長方形のほうに遥かに近い。両空間方向が非球面性であれば、図7の“y”に代えて照明フィールドの半径が用いられよう。
【０１０４】
非球面鏡38.1の凸面型または凹面型の鏡面38.6は種々様々な方法で作ることができる。例えば、（z、x）平面における鏡面の曲率半径rxと同じ曲率半径を持つシリンダに、切断線38.12に相当するプロファイルを加工することができる。（z、x）平面で湾曲のない、すなわちこの切断面での曲率半径が無限大と想定できる鏡面38.6を望む場合では、加工は、稜線の領域では放物線38.10によって規定される曲率cに対応して丸み付けされている直方体または楔体に対して行うことができる。rx半径が0より小さい場合については、非球面鏡38.1の鏡面38.6形成にはレプリカまたは模造技術が活用できる。
【０１０５】
プロファイルビーム38.5の生成には、図3および4に示されているように、非球面鏡38.1の後方に集光ミラー38.2が配置される。これは、例えば曲率半径rtx、rtyを有するゲート型ミラーとして形成されていて、分散ビーム38.4を平行化する。その場合、分散ビーム38.4は非球面鏡38.1の（(z、x)平面における）球面曲率にも切断線38.12に基づく非球面プロファイルにも影響されながらそれぞれ離れ離れに進行する。したがって、集光ミラー38.2は分散ビーム38.4のコリメーションのため、異なった曲率半径rtx、rtyを持つゲート型ミラーとして形成される。第1に挙げた分散はプロファイルビーム38.5によって照明された長方形フィールドの高さを調整し、第2に挙げた分散は縦軸方向での拡大を惹き起こす。
【０１０６】
照明対象の長方形フィールドの高さ調整を非常に簡単に実施できるようにするには、ゲート型ミラーの半径rtxはrtx+2・dとして選択する。なお、dは光軸における非球面ミラー38.1と集光ミラー38.2間の距離を表わしている。それにより、ビーム拡大係数rtx/rxおよび1+2d/rxなども同時に得られる。
【０１０７】
集光ミラー38.2の代わりに、もちろん対応のゲート型色消しレンズを使用することもできる。さらに、均質化された方向を横切る方向で光線束直径の変化を防止するために、非球面ミラー38.1の半径rxおよび集光ミラー38.2の半径rtxと共にフォーカシングおよび均質化された方向を横切る方向で光線束直径を照準変更させるに相応しい大きさを持つ、少なくとも1つの円筒型ミラーを使用することもできる。この円筒型ミラーは非球面鏡38.1の前方、またはゲート型集光ミラー38.2の後方に配置することができる。その機能は少なくとも1つの円筒型色消しレンズによっても達成可能である。
【０１０８】
非球面鏡38.1による照明装置は、鏡筒レンズと対物レンズ間のひとみを均一に充満させる目的で用いることができる。それにより、対物レンズの光学分解能は完全にその効果を発揮することができる。これの変法は点走査型顕微鏡システムまたはライン走査型システムにおいて有用である（後者の場合、試料上または試料内にフォーカシングされるのは軸の位置においてだけではない）。
【０１０９】
説明したとおり線形に整えられた励起光がメインカラースプリッタ17の方向に偏向される。当カラースプリッタは、好ましい実施態様では分割ミラーとして、つまり本発明でもその内容を包括的に取り入れているDE 10257237 A1記載のスペクトル中性な分割ミラーとして形成されている。したがって、「カラースプリッタ」の概念には非スペクトル的に作用する分割システムの意が含まれている。記述のスペクトル非依存型カラースプリッタの代わりに、均一型中性スプリッタ（例えば50/50、70/30、80/20タイプなど）またはダイクロイックスプリッタを使用することができる。適用別に選択することができるように、メインカラースプリッタとしては、交換可能な個別スプリッタを含む、例えば然るべきスプリッタ切換ダイヤルにより簡易交換のできる機構の備わっているのが好ましい。
【０１１０】
例えば、反射、ストークス/反ストークスラマン分光法、高次数のコヒーレントラマンプロセスや、第2高調波発生、第3高調波発生、和周波混合発生などの一般的パラメトリック非線光学プロセス、2光子、多光子吸収および蛍光におけるコヒーレントビーム、すなわち特に方向づけられたビームを検出すべき場合はダイクロイックメインカラースプリッタが有利である。これらの方法のうち、非線光学分光法のいくつかは、コリニヤ重畳をなす2つまたはそれ以上のレーザビームの使用を必要とする。この場合、図示されているような複数レーザビームの結合が特に有利であると実証されている。原則的には、蛍光顕微鏡検査で広く普及しているダイクロイックビームスプリッタであれば使用可能である。また、ラマン顕微鏡検査には、レイリー散乱成分の抑制のため検出器の前にホログラフィックノッチ・スプリッタまたはフィルタを設置するのが有利である。
【０１１１】
図2、12、14および15に示されているように、有利なことに、励起光または照明光は自動制御式ズーム光学系41を通じてスキャナ18に誘導される。そのようにして、ズーム係数を適合化することができ、走査視野を一定の調整領域内で連続的に変更することができる。ズーム光学系としては、焦点位置や結像倍率の適合化などの連続調整過程でひとみの位置を一定に維持するものが特に有利である。例えば図2に描かれた矢印が象徴するズーム光学系41の自由移動度は、3つのパラメータ、結像倍率、焦点位置、ひとみ位置の適合化に設定されている自由移動度の数値に正確に一致している。
【０１１２】
ズーム光学系で特に好ましいタイプは、出力側のひとみに固定型絞り42の配置されているものである。絞り42を実地で簡単に実現するには、スキャナ18鏡面幅の制限によって構成することもできる。ズーム光学系41を持つ出力側絞り42により、ズーム倍率の設定如何に拘わらず常に一定したひとみ直径を走査対物レンズ19上に結像させることが可能になる。このように、ズーム光学系41を任意に設定した場合でも対物レンズのひとみは依然として完全に照らし出されたままである。スキャナ18領域での願わしくない散乱光発生事態の阻止には独自型絞り42の使用が好ましい。
【０１１３】
ズーム光学系41と共同作用をする円筒型テレスコープ37は、同じくモータ作動式であり、非球面ユニット38の前に配置されている。図2の実施態様ではコンパクト構造の理由からこれが選ばれているが、そのようにする必要はない。
ズーム倍率1.0未満が望まれる場合、円筒型テレスコープ37は自動的に光学光路内に旋回挿入される。これは、ズーム対物レンズ41が縮小された場合に開口絞り42への照明が不完全になるのを防止する。したがって、旋回挿入の可能なこの円筒型テレスコープ37により、ズーム倍率1未満の場合でも、すなわちズーム対物レンズ41の設定の如何に拘わらず、対物レンズひとみの位置では常に一定長の照明光線の到達が保証される。それにより、単式視野ズームに比較して、照明光におけるレーザ出力損失が避けられる。
【０１１４】
円筒型テレスコープ37の旋回挿入時には照明光線による画像明度の急変が避けられないので、画像明度を一定に保つため、（図には描かれていない）制御ユニットでは、円筒型テレスコープ37が作動している場合、スキャナ18の送出し速度または検出モジュール5における検出器の増幅係数がそれ相応に適合するような設計がなされている。
【０１１５】
図18は、図1の光路のうち、メインカラースプリッタ17と顕微鏡モジュール4内に配置された試料23間の光路について可能な実施態様を模式的に示したものである。図19では簡略化のため2構成部だけが示されているズーム光学系41は、照明光路BSでひとみを結像させる作用を持つ。同時に、図18では破線で描かれている対象物光路GS内のズーム光学系41に中間像ZBが生成される。ズーム光学系41は無限大から無限大へフォーカシングする。
【０１１６】
ズーム光学系41の射出ひとみAPは、記述のとおり目的に適うように、絞り42によってカットされているいるので、ズーム倍率の調整如何に関わらず、後続配置された走査対物レンズ19では常に固定したひとみ直径が与えられる。顕微鏡モジュール4内で鏡筒レンズ20と対物レンズ21間の対物レンズひとみOPには対物レンズの絞りOBが配置されており、そこでは射出ひとみAPにより照明が満たされているか、あるいはそれを越えて過剰に照明されている。それにより、対物レンズは最高度の分解能が達成できる。
【０１１７】
図19は対物レンズのひとみOPにおける照明充満度を調整する絞り42の作用を示している。図19のグラフでは垂直軸にひとみ直径dが、水平軸にズーム光学系41で得られる倍率vが記録されている。曲線60は、絞り42不使用時におけるひとみ直径の変動函数を示している。破線61は絞り42によって形成される、倍率v別のひとみ直径を示している。点破線62は対物レンズひとみOP直径の最終的な変動経過を表わしている。図から見て取れるように、絞り42より小さな対物レンズ絞りOBがあるため、対物レンズのひとみは倍率vに影響されない。もちろん、対物レンズの絞りOBは対物レンズ21の構成フレームによって代用することもできる。これは、セパレート式の構成素子にする必要はない。
【０１１８】
図２０ａ／２０ｂ、２１ａ／２１ｂおよび２２ａ／２２ｂはズーム対物レンズ41の様々な調整状態を示している。この場合、描画は図19とは逆になっている。すなわち、図20〜22では照明方向は左から右と設定されている。また、図20〜22でも図19と同様、簡略化のためスキャナ18は描き入れていない。見て取れるように、例示されている構造様式ではズーム対物レンズは4つの光学系グループG1〜G4から成っている。そのうちグループG1は正の屈折力を有していて固定配置されている。第2グループG2は負の屈折力を持ち、いずれも正の屈折力を持つグループG3およびG4と一緒に動かされる。移動は、フォーカシングが無限大から無限大へ維持されたまま、倍率またはひとみ長が走査モードに応じて調整されるように行われる。
【０１１９】
そのほか、実施態様によっては、グループG1を後続の走査対物レンズとのユニットとして構成するのが得策になる場合もある。つまり、この変化法では走査対物レンズは照明装置内で（図4〜6には描かれていない）スキャナの前に配置される。
各グループは少なくとも1つのレンズから成っている。想定されたスペクトル領域および照準された開口/視野角の要求が満たされるように、グループは結像欠陥に関してはできる限り自動補正されるようになっている。
【０１２０】
図２３〜２５は、グループＧ１〜Ｇ４を持つズームレンズの動きを模式的および例示的に示している。焦点距離はそれぞれ次のとおりである：  Ｇ１：４５ｍｍ、Ｇ２：−１５３ｍｍ、Ｇ３：４５ｍｍ、Ｇ４：８９ｍｍ。焦点距離は伝達長Lにより階級付けされる。
【０１２１】
図23〜25では具体的説明のため、さらに射出ひとみAPおよび入射ひとみEPも描き込まれている。伝達長Lは、入射ひとみEPと射出ひとみAP間の距離から得られる。図20aでは、さらに、4グループG1〜G4それぞれにについて、光軸に沿って測定されるz座標が記入されている。その場合、入射ひとみがポジション0に置かれている。
【０１２２】
符号aの付いた図は、それぞれ、符号bの付いた図に対して90°回転させた断面図である。したがって、図20a、21aおよび22aはひとみ光路を、図20b、21bおよび22bは対象物光路を含んでいる。実施例で使用されているのは線形照明を持つ共焦点スリット絞り装置なので、ひとみ光路にひとみが、あるいは図20a、21a、22aに結節点がある場合には常に対象物光路にラインが現われる。別様式の共焦点結像（例えば、ニポーディスク、多点スキャナ、単点スキャナ）の場合では当然状況は異なる。
【０１２３】
図２１ａ／２１bでは倍率はv＝１．４に設定されているが、一方図２２ａ／２２bの配置では同結像長の場合倍率はv＝２．０となる。図２０ａ／２０bの設定では、図21および22の場合とは異なり、図２１ａ／２１bと同倍率とすれば結像長は10 mm長くなる。図に描き込まれた射出ひとみAPの長さがこのことを明白に物語っている。
【０１２４】
このように、ズーム光学系41は異なった2つの操作モードで操作することができる。1つには、結像長Lを一定として倍率vを調整することができる。図21a/21bに描かれた位置関係から図22a/22bの位置関係へのシフトは、走査フィールドに対してズーム操作を実現する、例えば第1モードでの操作となる。それに対するグループG2〜G4の調整は図23から見て取れる。そこにはグループG1〜G4のz座標が、図20aに対応してvの函数として描かれている。
【０１２５】
「倍率」の概念は、ここでもズーム光学系の作用、すなわち画像の拡大に関することである。もちろん画像の拡大は、照明方向のズーム光学系が実際上、照明光源から供給される画像の縮小をもたらす結果になった場合、すなわち、例えば焦線が短縮された場合に達成される。それに反し検出方向では、照明方向に向かう方向で拡大が現われる。
【０１２６】
図24は倍率一定で伝達長を変更する第2操作モードを示している。目盛はz軸に沿ってミリメータ単位で記入されているので、伝達長はズーム光学系の位置調整により例えば20 mm幅までの変更が可能である。射出ひとみAPの位置は（0 mmの位置にある）入射ひとみを起点とすれば180 mmから200 mmへシフトする。図8の値は倍率1.0における伝達長の変化幅に当る。
【０１２７】
図25は上記の第1操作モード（図23）と第2操作モード（図24）の組み合せから成る操作モードを示している。図9に示された光学系グループG2〜G4（光学系グループG1については再調整しない）の制御により、伝達長L（図25の変更された射出ひとみ長から得られる）と同時に倍率vが変更される。
【０１２８】
図20は、ズーム光学系41によれば、利用可能な最大走査フィールドSFから如何にしてROI（観察対象領域）が選択できるかを示している。スキャナ18の制御において、例えば共振型スキャナの場合の絶対的要求どおりに振幅を変えないでおくと、ズーム光学系の設定倍率が1.0以上であれば、選択領域ROIは走査フィールドSFの光軸を中心として縮小される。フィールドを光軸、すなわち走査ミラーの定常位置に対して非対称に走査するようにスキャナを制御すれば、ズーム作用との関係で選定領域ROIのオフセットシフト量OFが得られる。これは“crop”機能とも称される。
【０１２９】
スキャナ18の既述のデスキャン作用により、およびズーム光学系41の再度の通過により、検出光路における検出器方向での観察対象領域ROIの選択は一旦中断される。それにより、走査画像SF内でROI領域について任意の選択が可能である。それに加え、様々なROI領域の選択に対応して画像が取得でき、それらを高分解性の画像に合成することができる。
【０１３０】
選択ROI領域を光軸に対する補正分OFだけ移動させるのでなく、それに加えて回転もさせたい場合は、メインカラースプリッタ17と試料23間の光路のひとみに、周知のとおり画像フィールドに対して回転作用のあるアッベ・ケーニッヒプリズムを配置した実施態様が目的に適っている。この場合も検出器方向で作業の中断を行う。それにより、様々な補正シフトOFおよび様々な回転角を持つ画像が測定でき、続いて、例えば文献
“Three-dimensional
and multidimensional microscopy ; Image acquisition processing VII” Proceedings of SPIE第3919巻（2000年）、141〜150ページのGustafsson、 M.著“Doubling the lateral resolution of wide-field fluorescence
microscopy using structured illumination”に記載されているようなアルゴリズムに従って高分解性のある画像に補正することができる。
【０１３１】
絞り26を通過した試料からのビームは分光計49の入口48に導かれ、そこでライン状入射ビームはラインを横切る方向に分光分割され、2次元分解検出装置、本実施例ではCCDカメラ50に導かれる。図17に描かれた試料上の焦線は、次に、同様に図17に示された画像52へと分割される。なお、Xで示された方向はスポット分解性を再現していて、それに垂直な方向、図17ではλで示された方向は、それに対し、当該位置でのビームのスペ図2のレーザ走査型顕微鏡では、モータ作動式ズーム光学系41およびモータにより操作切換可能な円筒型テレスコープ37のほか、検出モジュール5でも遠隔制御可能な調整素子が設置されている。例えば、色波長誤差の補正のため、スリット絞りの前に丸型光学系44と円筒型光学系39が、検出器28の直前に円筒型光学系39が設置されており、それらはモータによりそれぞれ軸方向に移動できるようになっている。
【０１３２】
加えて、補償のため補正ユニット40が配備されているが、それについては図8〜11を手掛かりに以下に簡単に説明する。
図8はレーザ走査型顕微鏡1の検出モジュール5の実施態様を表わした模式図である。当モジュールには検出器28としてCCD配列43が装備されていて、これはカラースプリッタ25を通じてレーザ走査型顕微鏡1の光路に結合している。カラースプリッタ25は、様々な波長領域のビームが捕捉できるように、取換可能になっている。取換可能なカラースプリッタ25は、レーザ走査型顕微鏡で使用される励起ビームに対してだけでなく、検出対象の（蛍光）ビームに対しても適合性がある。
CCD配列43は、カラースプリッタ25から共焦点絞りとして作用するスリット絞り26を通って到達したビームを保有する。
【０１３３】
スリット絞り26は、前方配置の丸型光学系44、同様に前方配置の第1円筒型光学系39および後方配置の第2円筒型光学系と共に検出装置5のピンホール対物レンズを形成する。その場合ピンホールはスリット絞り26によって実現される。
蛍光励起のために照明される試料23のライン状または列状の領域、すなわち共焦点結像のなされる領域が図8に摸式的に描かれている。システム内で反射した励起光のCCD配列43における意図せざる検出を回避するために、さらにブロックフィルタ27が前置接続されるが、これは、希望する蛍光ビームだけがCCD配列43に到達するように、然るべきスペクトル特性を有している。
【０１３４】
カラースプリッタ25またはブロックフィルタ27を取り換えて旋回挿入した場合、幾分かの傾倒誤差または楔角誤差が発生するのは避けられない。カラースプリッタは試料領域とスリット絞り26間の誤差を、ブロックフィルタ27はスリット絞り26とCCD配列43間の誤差を持ち込む可能性がある。その場合に、スリット絞り26またはCCD配列43の新たな位置調整が必要になることがないように、丸型光学系44とスリット絞り26の間に、すなわち試料23とCCD配列43間の結像光路内に、コントローラCの制御下で様々な傾倒位置に設定することのできるオプチカルフラットのプレート40が配置されている。オプチカルフラットプレート40は、その目的のために然るべき（図8には描かれていない）ホルダ内に設置されている。これについては後に図11を手掛かりに説明する。
【０１３５】
オプチカルフラットプレート40は、図8では光軸OAの微小移動として描かれている平行移動を惹き起こす。この平行移動は、2部から成るオプチカルフラットプレート40の構成（後ほど説明）を描いた図10の図解からも見て取れる。プレート表面に対して斜めの角度でプレート40に入射する光線束Eは位置シフトした光線束Aとしてプレートの外へ出る。オプチカルフラットプレート40がなければビームは図10の破線に沿って進むことになる。
【０１３６】
オプチカルフラットプレート40の傾倒位置を変更することによって、カラースプリッタ25の取換時に変化する可能性のある光路内所与条件に対し常に最適位置、すなわち2軸センタリングされた位置が確保されるように、スリット絞り26に対する試料列の位置（およびスリット絞り26の後方にプレート40を配置する場合ではそれに加え選択的に、同じく絞りの作用をするCCD配列43に対する絞りの位置）を調整することができる。この様子は、スリット絞り26の試料列23への投射が上面図で示されている図9から見て取れる。図から明らかなように、例えばカラースプリッタ17または25、あるいはブロックフィルタ27が原因になり得る傾倒誤差または楔角誤差に基づき、スリット絞り26と試料列23間でx方向での調整量dxおよびy方向での調整量dyが得られる。
【０１３７】
調整量dxが不必要に信号対雑音比を悪化させる結果になる。スリット絞り26を強く絞ることによって、すなわちそのx方向の幅を狭めることによって共焦点顕微鏡の深度分解能を改善しようとしても、調整量dxが試料列23の高さの半分より大きければ、もはやビームがCCD配列に全く到達しないという事態が起こりかねない。その場合の調整量dxでは、レーザ走査型顕微鏡で達成可能な深度分解能は機器本来の性能水準より劣る結果になる。同様のことが、スリット絞り26とCCD配列23の調整のための選択的または累積的なバリエーションにも当てはまる。
【０１３８】
オプチカルフラットプレート40の傾倒位置の調整で達成される、試料スポット像のスリット絞り26に対する光学的調整により、x方向で見てCCD配列43の面領域が不必要に非照射のままであることが避けられる。
【０１３９】
それに対し、調整量dyは、CCD配列43によって捕捉されたy方向でのスポット情報が試料23における実際の放出または反射状況に一致しない事態を惹き起こす。結果として画像（または画像相当物）にアーチファクトの発生することがある。プレート40の傾倒位置の調整が調整量dyを最小限に、その上好ましくも0にすることも可能であり、その場合ではスリット絞り26がCCD配列43の中央に来て、CCD配列43のピクセルすべてが正しく照明されることになる。これは特に、レーザ走査型顕微鏡が、サブカラースプリッタ25を通して様々なカラーチャネルの読み出しを行う複数の検出チャネルを有している場合には重要である。チャネルの調整は個別式であるため、そうでない場合は調整量dyに差が生じるので、そのようなマルチチャネル式顕微鏡では、合成画像における個別カラーチャネルの割り振り時に結果的に誤差が生じよう。
【０１４０】
検出モジュール5で利用される波長または波長領域に応じて、ピンホール対物レンズが様々な横色収差を見せることがある。同じことは、前置接続された素子、例えばカラースプリッタ17、25または光軸OA上に設置されたその他の光学系にも当てはまる。この横色収差は、プレート40の傾倒位置の調整によって照準補償することができる。コントローラCは、その目的のため傾倒位置を制御する。その場合、モジュール5が使用できる波長領域または波長毎にそれぞれ固有傾倒位置を割り当てる。
【０１４１】
検出チャネルに比較的帯幅域の広いビームが導入された場合に、透明なオプチカルフラットプレート40材の持つ分散性により、波長に依存してその量は異なるが、入射光線束Eに対して通過光線束Aに移動が起きるようであれば、オプチカルフラットプレート自体横色収差の原因になり得る。その補償には実施例として図10に描かれた、2つの部分プレート40a、40bから成るオプチカルフラットプレート40の構造が想定されている。この部分プレート40a、40bの素材は互に相違していて、所与の波長領域では分散に起因する横色収差ができる限り相殺されるように選択されている。例えば、部分プレート40aは短波長に対しては部分プレート40bより大きな移動を惹き起こす。長波長に対しては逆の関係になる。このようにして、オプチカルフラットプレート40の横色収差が補償される。色に依存しない、または照準条件下で依存する平行移動の実現には、偏向方向が逆で分散性の異なる素材から成る、傾倒可能な別々な2つのプレートを使用することもできる。
【０１４２】
コントローラCは操作者のプレセットに対して、レーザ走査型顕微鏡の実際的状況（特に、周辺温度、機器本体温度またはその他極端な影響要因）の評価後に、あるいは連続的な、または断続的な制御過程においてプレート40の傾倒位置を調整する。制御量としては、較正過程におけるCCD配列43でのビーム強度または画像シフトが利用できる。
【０１４３】
コントローラCによって制御される駆動部40.11は図11に透視図として描かれている。図から見て取れるように、オプチカルフラットプレート40は2つのステップモータ40.12、40.13によりx軸またはy軸の周りを調整移動する。x軸側の移動はプレート40中央の回転軸による傾倒運動である。y軸側の回転はプレート外にある軸の周りの揺動運動である。
【０１４４】
x軸の周りの傾倒には保持プレート40.14が備えられていて、そこに一対の板バネ40.15がネジ固定されており、それらが中にオプチカルフラットプレート40の収納されたフレーム40.18を固定している。板バネ40.15は傾倒軸も固定している。板バネはフレーム40.16に固定されているローラ40.17を、同様に保持プレート40.14に設置されたステップモータ40.12で作動する板カム40.18に圧し付ける。したがって、板カム40.18の位置次第でローラ40.17、同時にフレーム40.16が様々な形で外側に誘導され、それによってプレート40がx軸の周りを傾倒する。
【０１４５】
保持プレート40.14はそれ自体、旋回軸40.20の周りを回転できるレバー40.19のアームである。旋回軸40.20は、プレート40がy平面の周りを移動するための軸である。レバー40.19のもう一方のアーム40.21はその末端部で、ステップモータ40.13作動式の板カム40.23に接するローラ40.22を支えている。旋回軸40.20には、板バネ40.15がローラ40.17を板カム40.18に圧し付けるのと同様、ローラ40.22を板カム40.23に圧し付けるバネ素子が装備されている。
【０１４６】
図にはない配線を通じてステップモータと結合しているコントローラCは、ステップモータ40.12、40.13の制御により検出装置の光路に配置されたオプチカルフラットプレート40の傾倒位置または旋回位置を機械操作で調整することができる。ステップモータ40.12、40.13の増分制御のもと、操作開始時の基準ポジションとの組み合せによって、プレート40の操作時点での実位置がコントローラCに伝達されるので、プレート40の位置を制御系において調整量として使用することが、あるいは保存された基準値に基づいて調整することができる。
【０１４７】
図11にモデル例として示された2軸調整に代わり、1軸調整可能なプレートを2枚相前後して接続することもできる。
補正ユニット40、40aによる調整に加え、スリット絞り26、26a自体の調整も可能である。これは特に、スリット絞り26、26aの幅を、したがってまたエアリー直径を検出器に適合させるために行われる。スリット絞り26、26aのスリット幅を調整することによって焦点深度およびまた試料内のz方向、すなわち光軸に沿う方向での深度弁別性が調整される。追加補助的な横移動は補正ユニット40、40aの調整領域外における粗調整に利用される。
【０１４８】
図12は図1、2からの派生的構造であり、異なった大きさの固定スリットを持つスリット絞りがスライダ上に配置されている。スリット絞り26のこの変形体としては、例えば機械動力により調整される然るべき構造化のなされたクロムマスクが考えられる。図2の構造とは異なり、スリット絞りがサブカラースプリッタ25に対しても配置されている。これは図2の構造に対する代替構造である。
【０１４９】
図13は図12の構造を簡易化したズーム調整のない、すなわちズーム光学系41および円筒型テレスコープ37の省かれた形式である。図13も1スペクトルチャネルだけを持つ構造様式の例である。すなわち、検出モジュール5での複数スペクトルチャネルの構成はなされていない。サブカラースプリッタ25も装備されていない。図13の構造様式では後にマルチチャネル検出モジュール5への装備拡張が簡単にできるように、サブカラースプリッタ25の代わりに、後にサブカラースプリッタに取換できる（図13には描かれていない）補償グラスを配置するのが目的に適っている。
【０１５０】
図14には、その検出器28、28aが共焦点平面にあるCCD配列として構成され、しかもスリット絞りを有しその機能も担っている、レーザ走査型顕微鏡1のまた別な実施態様が示されている。読み出し可能な然るべき検出器アレーを使用すれば、検出器アレー上の読み出し領域の然るべき選択によりスリット絞りの大きさ変動効果が実現できる。
【０１５１】
図15には、照明光路に偏光子45、46が、検出器経路に分析器47、47aが接続されているまた別な変形構造が示されている。これらの構成群は、例えばモータ駆動で光路内に配置可能なように形成することができる。偏光敏感な励起または検出は、対称を検査対象の分子振動に組み込んだり、支障になるラマン非共鳴性のバックグラウンド信号を抑制したり、特に線形または非線形ラマン信号の評価において有用である。
【０１５２】
これ迄説明してきたレーザ走査型顕微鏡の実施態様では、検出モジュール5内にスペクトル不連続の検出経路が配備されている。広帯域幅のスペクトル領域を同時に分析したい場合は、図16に体系的に描かれたコンセプトが使用できる。図16は走査モジュール3と検出モジュール5を抜粋し簡易化して示したものである。スリットクトル合成をコード表示したものである。図52では、説明のため、スペクトル合成を象徴的に表わした一連の曲線53が記入されている。実際に得られるのは、もちろん曲線53ではなくて、CCDカメラ50のλ方向に配置されたピクセルであり、これは試料のスポット撮影ビームのスペクトル組成に依存して様々な強度で照明される。
【０１５３】
簡易化された実施態様ではスリット絞り26は分光計49の入射スリットで実現できる。その場合ではスリット絞り26と入射スリットとして形成された入射窓48が一致する。
特にホログラフィック・ラマンノッチフィルタ使用の場合のラマン顕微鏡検査においては、二重型および三重型の分光計の代わりに単式モノクロメータを使用することも考えられる。
【０１５４】
図27は、ニポーディスク方式を実現するレーザ走査型顕微鏡1として考えられる別な構造様式を示している。図27では極端に簡略描画されている光源モジュールが、ミニレンズアレー65からメインカラースプリッタ17を通過して、例えばUS 6、028、306、WO 88 07695またはDE 2360197 A1に記載されているようなニポーディスク64を照明する。ミニレンズアレー65を通じて照明されたニポーディスクのピンホールは顕微鏡モジュール4内の試料に結像する。ここでも試料側の画像サイズを変更できるように、ズーム光学系41が設置されている。
【０１５５】
ニポースキャナの場合、例えば図2の構造様式からは変更部分があり、照明はメインカラースプリッタ17を通過させて行われ、検出光は反射分離される。さらに、ニポーディスク64による多点照明の場合では、それに対応した平行な走査が行われるように、検出器28はスポット分解能を持つように作られている。そのほか、ニポーディスク64とズーム光学系41の間には、ニポーディスク64のピンホールを通り抜ける発散光を適当な束直径に変換させる、正の屈折力を持った然るべき固定型光学系63が配置されている。メインカラースプリッタ17は、図3のニポー式構造の場合では旧来型のダイクロイックビームスプリッタであり、したがってスリット状または点状の反射領域を持つ上記ビームスプリッタではない。
【０１５６】
ズーム光学系41は、例えば上段で説明した構造様式に対応しているが、この場合はニポーディスク64があるため、もちろんスキャナ18は不要になる。しかし、図10を基に説明したROI領域の選択を行いたい場合は、これを設置することができる。同じことがアッベ・ケーニッヒプリズムについても言える。
【０１５７】
多点走査による別法が、模式図として図28に示されているが、その方法では複数の光源がスキャナのひとみに対して斜めに照射される。この場合でもメインカラースプリッタ17とスキャナ18間での結像にズーム光学系41を使用することにより、図26に描かれたようなズーム機能を実現することができる。ひとみに共役な平面に様々な角度から光線束を同時入射することにより、光点が対象物平面に共役な平面に形成され、それがスキャナ18により同時に対象物フィールド全体のうちの一部領域上に誘導される。スポット分解性のあるマトリックス検出器28では部分画像全体の評価を通して画像情報が生成される。
【０１５８】
その他の実施態様としては、US 6、028、306に記載されているような多点走査があるが、その開示内容の中で関連事項は本発明に包括的に取り入れられている。ここでも図27および28の場合と同様、スポット分解性のある検出器28を設置することができる。その場合では試料は多点光源によって照明されるが、それは、多点光源が実現されるようにマルチ開口プレートを照明する、マイクロレンズアレーの後続配置されたビームエキスパンダによってなされる。
【０１５９】
本発明は、迅速作業性のある共焦点レーザ走査型顕微鏡の適用可能性を大幅に拡大するものである。このような改良開発の重要性は、細胞生物学的に関する標準文献およびそこに記述されている細胞、副細胞の迅速な変化過程1、さらには多数の色素を用いた検査方法2を手掛かりに読み取ることができる。
例えば下記の文献が参考になる :
1 B.
Alberts他著（2002年）: Molecular Biology of
the Cell ; Garland Science刊
1、2 G. Karp著（2002年）: Cell and Molecular Biology ; Concepts and Experiments ; Wiley Text
Books刊
1、2 R. Yuste他著（2000年）: Imaging neurons &#8211; a laboratory Manual ; Cold Spring Harbor
Laboratory Press刊、 ニューヨーク
2 R.P.
Haugland著（2003年）: Handbook of fluorescent
Probes and research Products第10版
; Molecular Probes Inc. and Molecular Probes Europe BV刊
【０１６０】
本発明は次のプロセスおよび変遷にとって非常に重要な意味を持っている :
有機体の生育
記述の本発明は、なかでも1/10秒から時間レベルまでのダイナミックな変遷を特徴とする生育過程の研究に適している。ここでは細胞結合面および有機体全体への適用例について記述する :
・  Abdul-Karin、M. A.他は2003年“Microvasc. Res.”第66巻、113〜125ページに動物生体における血管の変化に関する長期分析結果を記録した。その場合、蛍光画像は数日間隔で撮影された。運動の定角軌道を模式的に描くために、3次元のデータ記録が適合アルゴリズムで評価されている。
・  Soll、D. R.他は2003年“Scientic World Journ.”第3巻827〜841ページに3次元空間全体における生体細胞の核および偽足に関する顕微鏡データのソフトウェアベースによる運動分析について記述している。
・  Grossmann、 R他は2002年“Glia”第37巻229〜240ページにラットの微小神経膠細胞における運動の3次元分析について記述している。そのデータは10時間以上に亘って記録されたものである。神経膠細胞にはトラウマ性傷害の後に同時に迅速反応が発現するので、高いデータ収得率およびそれ相応のデータ量が得られる。
これに関しては特に次のことが重要なポイントである :
・  その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので3次元ROI照明から保護されねばならない3次元領域での生細胞の分析
・  例えばFRET実験などにおいて、3次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の3次元領域での分析
・  例えば3次元FRAP、FLIP実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にROI外の観察も必要なマーカーによる生細胞の3次元領域での分析
・  例えば3次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の3次元領域での照準分析
・  例えばpaGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の3次元領域での照準分析
・例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の3次元領域での照準分析
・  例えばCFP、GFP、YFP、DsRed、HcRedなど可変性多重マーキングのなされた3次元組織結合における生細胞
・  機能に依存して変色する、例えばCa+マーカーなどでマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞
・  生育に起因して変色するマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞、例えばGFPによる形質転換動物
・  例えばpaGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた3次元組織結合における生細胞
・  検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた3次元組織結合における生細胞
・  
・  最終項目とそれ以前の項目との組み合せ
【０１６１】
細胞内の運搬過程
記述の本発明は細胞内運搬過程の研究にはこの上なく適している。この場合では正しく非常に微小な運動構造体、例えばタンパク質を高速度で（殆どが1/100秒の領域）描写しなければならないからである。複雑な運搬過程のダイナミックスを捕捉するためには、ROIブリーチングを伴うFRAPもしばしば適用される。そのような研究例として、ここでは以下のものを挙げておく :
・  Umenishi、 F.他が2000年“Biophys J.”第78巻1024〜1035ページに、GFP変換された培養細胞におけるアクアポリンの空間運動性についての分析結果を記述している。その場合、細胞膜の照準点を局部ブリーチングして、周辺における蛍光拡散の分析を行っている。
・  Gimpl、 G.他が2002年“Prog. Brain Res.”第139巻43〜55ページに、ROIブリーチングによる実験、運動性分析のための蛍光撮像およびGFPマーキングされたオキシトシン受容体の線維芽細胞内での分布について記述している。その場合、空間位置設定、分解能およびブリーチングと撮像との直接的な時間的連続性に関して高い要求が課されている。
・  Zhang他が2001年“Neuron”第31巻261〜275ページに、GFP変換された神経細胞における生細胞の撮像について記述している。その場合、顆粒の運動がブリーチングと蛍光撮像との組み合せにより分析された。神経細胞のダイナミックスに起因して、撮像速度には高い要求が課される。
分子間の相互作用
記述の本発明は、特に分子間およびその他副細胞間の相互作用の描写に適している。これらの場合では非常に微小な構造が高速度（1/100秒レベル）で描出されねばならない。相互作用に必要な分子の空間ポジションの解明には、例えばROIブリーチングを伴うFRETなどの間接的な技術を使用することもできる。適用される例として、ここでは以下のものを挙げておく :
・  
Petersen、 M. A.およびDalley、 M. E.が2004年“Glia”第46巻195〜206ページに、ラット海馬角の培養における2チャネル撮影について記述している。この場合は、マーカーとしてのレクチンとシトックスについて3次元空間において長時間に亘り2チャネルで記録される。
・  
Yamamoto、 N.他が2003年“Clin. Exp. Metastasis”第20巻633〜638ページに、ヒトの線維肉腫細胞の2色撮影について記述している。この場合では緑色と赤色の蛍光タンパク質（GFPおよびRFP）が同時にリアルタイムで観察された。
・  
Bertera、 S.他が2003年“Biotechniques”第35巻718〜722ページに、合成後色が緑から赤に変化するタイムレポータプロテインによってマーキングされた転換マウスのマルチカラー撮影について記述している。撮像は生体動物の組織内3次元空間で迅速シリーズとして行われる。
【０１６２】
細胞間の信号伝達
記述の本発明は、殆どが極端に迅速になる信号伝達過程の研究には他に抜きん出て適している。殆どが神経生理学に関するこの過程では経時的分解能に最大限の要求が課される。それは、イオンによって媒介される活動が1/100秒から1/1000秒以下の範囲で起こるからである。筋肉系または神経系の検査への適用例として、ここでは次のものを挙げておく :
・  Brum
G他が2000年“J Physiol”第528巻419〜433ページに、伝達物質としてのカフェインによる刺激後のカエルの筋肉細胞における迅速なCa+活動の位置確認について記述している。この位置確認およびマイクロメータ単位の精度を持つ分解能は、迅速型の共焦点顕微鏡の使用下でないと達成されない。
・  Schmidt
H他が2003年“J Physiol”第551巻13〜32ページに、転換マウスの神経細胞突起におけるCa+イオンの分析について記述している。変化するCa+に結合するタンパク質による、マウス内での迅速なCa+変化状況についての研究は、高分解能を持つ共焦点顕微鏡により初めて行うことができた。それは、神経細胞内におけるCa+活動の位置確認およびその精確な経時的動力学が重要な役割を果たしているからである。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】レーザ走査型顕微鏡の模式図
【図２】レーザ走査型顕微鏡の光源モジュール、走査モジュールおよび検出モジュールの模式図
【図３】図2のレーザ走査型顕微鏡の照明装置における第1切断平面での光路の模式図
【図４】第1平面に対して垂直方向の第2平面における図3の光路
【図５】図3および図4の光路内で使用される非球面鏡のコンピュータ表示
【図６】図5の非球面鏡の特性値を表わすための同鏡の切断図
【図７】図1および図2の光路により得られる、切断面における強度プロファイル
【図８】図1または図2のレーザ走査型顕微鏡に使用される走査モジュールの模式図
【図９】図8の配置における所要補正量を示すための模式図
【図１０】図8の配置におけるオプチカルフラットプレートの模式図
【図１１】動力駆動部の付いた図8のオプチカルフラットプレートの透視図
【図１２】別のレーザ走査型顕微鏡の模式図
【図１３】1スペクトルチャネルだけを持つレーザ走査型顕微鏡の構造様式の模式図
【図１４】別の実施例のレーザ走査型顕微鏡の模式図
【図１５】図2類似の描画によるレーザ走査型顕微鏡のその他の形態
【図１６】図2類似の描画によるレーザ走査型顕微鏡の走査モジュールおよび検出モジュールの模式図
【図１７】図16の検出モジュールの作用態様を示すための2つの模式図
【図１８】図2のレーザ走査型顕微鏡に設置されたズーム光学系とレーザ走査型顕微鏡によって捕捉される試料との間にある光路の模式図
【図１９】図18の構造におけるひとみ直径を示した曲線
【図２０】図2のズーム光学系における様々な位置設定、b図はa図に対して90°回転させたときの断面図
【図２１】図2のズーム光学系における様々な位置設定、b図はa図に対して90°回転させたときの断面図
【図２２】図2のズーム光学系における様々な位置設定、b図はa図に対して90°回転させたときの断面図
【図２３】結像長の一定な第1操作モードにおける図20〜22のズーム光学系に含まれる4つの光学系グループの位置調整グラフ
【図２４】倍率の一定な第2操作モードにおける4つの光学系グループの位置調整グラフ
【図２５】図23および24と同形式であるが、結像長および倍率を同時に変動させる操作モードのグラフ
【図２６】ズーム作用の可能性を示すための走査フィールド模式図
【図２７】ニポーディスク付きのレーザ走査型顕微鏡の模式図
【図２８】平行な多点照明および走査によるレーザ走査型顕微鏡の模式図
【符号の説明】
【０１６４】
１      レーザ走査型顕微鏡
２      光源モジュール
３      走査モジュール
４      顕微鏡モジュール
５      検出モジュール
６，７      レーザユニット
８      光バルブ
１１      光ファイバ
１２，１３      コリメータ
１４，１５      ビーム結合ミラー
１７      カラースプリッタ
１８      スキャナ
１９      走査対物レンズ
２０      鏡筒レンズ
２１      対物レンズ
２２      焦点
２３      試料
２４      転向ミラー
２６      スリット絞り
２７      ブロックフィルタ
２８      検出器
２９      ハロゲンランプ
３４      水銀蒸気ランプ
３６      ビームスプリッタ
３７      円筒形テレスコープ
３８      非球面ユニット
４１      ズーム対物レンズ
４２      開口絞り
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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