(57)【要約】      （修正有）【課題】  ホップにおいてジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）の生成に関与する遺伝子を得、これを遺伝子工学技術に基づく、より客観的で予測可能性のあるホップの育種に応用すること。【解決手段】  ホップ雌株球果由来ＬｙｔＢ遺伝子、この遺伝子を含有する組換えベクター、この組換えベクターを含む形質転換体、前記遺伝子にコードされるタンパク質、前記遺伝子の一部を含む核酸プライマー、及び前記遺伝子の一部を含む核酸プローブを提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬｙｔＢ活性を有するタンパク質をコードする、ホップ由来の遺伝子。
【請求項２】
次の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする、ホップ由来の遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬｙｔＢ活性を有するタンパク質
【請求項３】
次の（i）若しくは（ii）のＤＮＡからなる、ホップ由来の遺伝子。
（i）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ii）配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬｙｔＢ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
次の（i）若しくは（ii）のＤＮＡをｃＤＮＡとする、ホップ由来の遺伝子。
（i）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ii）配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬｙｔＢ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子にコードされるタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子の一部を含む核酸プライマー。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子の一部を含む核酸プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及びホップ由来ＬｙｔＢタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、テルペノイド、アルカロイド、フェノーリスク、サボニンなどの膨大な種類の低分子有機化合物を生産して蓄積している。当初、これらの化合物は、生物の生命維持に直接関与するものでなく、単に副次的な機能しかないと考えられていたことから、便宜的に「二次代謝産物」と呼ばれていた。
【０００３】
近年では、この二次代謝産物が細胞の分化、外的因子からの防御物質として機能することが明らかになりつつあり、また、これら植物の生産する二次代謝産物は、嗜好物、医薬品、染料等の広い分野で利用され、応用されるに至っている。
【０００４】
こうした二次代謝産物は、その有用性に着目されて植物細胞内での生成過程の解明が進められ、現在ではこれら物質が多数の酵素等が関与した複雑なカスケードを経て生合成されていることが明らかになっている。このようなカスケードを経て生合成される物質の場合、多くは植物からの抽出により単離が行われているが、植物からの抽出では大量生産などの要請に沿わず、またコスト高等になるため培養細胞等を用いた試験管内での合成方法等の開発が進められている。
【０００５】
ところで、ホップはビールに爽快な苦味と香りを与える、ビールの主要な原料であるが、このホップの苦味の元となるフムロン等の苦味成分や、香りの成分となるイソプレノイドもまた二次代謝産物である。さらに、近年では、同じく二次代謝産物であるキサントフモールや8-プレニルナリンゲニンなどのプレニルフラボノイドが薬理作用を有していることが報告され(非特許文献１及び非特許文献２)、薬用資源としても注目されている。これらの二次代謝産物は、雌株のみに着生する球果のルプリン腺中に主に蓄積している。こうした経緯から、ホップにおいて、雌株のルプリン腺中に蓄積する二次代謝産物に主眼をおいた様々な品種改良が行われている。
【非特許文献１】Food Chem. Toxicol., 37, 271-285 (1999)
【非特許文献２】J. Clin. Endocrinol. Metab., 84, 2249-2252 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ホップは雌雄異株の植物であり、特に雄株はビールの原料となる球果を付けず、商業上重要視されないことからあまり研究がなされておらず、醸造上有用な遺伝形質についてもほとんど明らかにされていない。そのため、従来の交配によるホップ育種では、発現形質に関して経験と勘に頼る部分が多く、特に醸造品質については実際に球果が着生するまで全く予想が付かないというのが現状である。
【０００７】
今日では、形質転換技術や分子選抜技術といった遺伝子工学を用いた育種法が各種の植物において可能となりつつある。これらの方法によれば、発現形質に関して、経験と勘に頼る部分の多い伝統的な育種法に比べ、より客観的で予測可能性のある育種が可能である。
【０００８】
形質転換技術は外来遺伝子を植物細胞内に導入、発現させることで、付与したい形質を直接導入するという方法である。外来遺伝子を発現させるには、遺伝子の発現を制御する植物細胞内で機能可能なプロモーターに目的とする構造遺伝子および植物細胞内で機能可能なターミネーターを連結し、これを植物細胞内に導入する。実験レベルでよく用いられるプロモーターとしては、比較的多くの植物で組織を問わず導入遺伝子を発現させることのできるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターやノパリン合成酵素遺伝子プロモーター（Sanders P.R. et al., Nucleic Acid Res., 15, 1543-1558 (1987)）が知られている。また、導入遺伝子が植物の生育等に害を及ぼすおそれがある場合には、目的の組織または目的の時期において目的の量だけ外来遺伝子を発現させるようなプロモーター用いる必要がある。このようなプロモーターとしては、例えば、ホップ雌株の球果に含まれるルプリン腺で特異的に導入遺伝子を発現させることのできるバレロフェノンシンターゼプロモーター（J. Plant Physiol., 160, 1101-1108, (2003)）などが知られている。形質転換技術を用いた育種法の従来の伝統的な育種法に対する利点は、目的とする形質を種を問わず比較的確実に短期間のうちに付与することができることにある。また、ホップの場合、株分けにより増殖させることができ、付与した形質を固定するといった作業が不必要であるので、形質転換技術に基づく育種法は特に有効といえる。
【０００９】
分子選抜技術はＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）などのような遺伝子マーカーを用いた育種方法であり、特にイネやムギ類などにおいては実用段階に入っている。形質転換技術の場合、単一遺伝子に支配される形質の付与に力を発揮する一方で、複数の遺伝子に支配された形質を付与することは難しいとされているが、分子選抜技術はそのような形質転換技術の欠点を補うことができる。
【００１０】
目的とする形質に関連する遺伝子やその制御を司る遺伝子を明らかにすることができれば、上述のような遺伝子工学に基づいて、その形質に着目した育種を行うことができる。特にビール原料、薬用資源という見地から考えた場合、雌株の球果に含まれるルプリン腺毛より分泌される二次代謝産物の合成等に関与する遺伝子を明らかにすることができれば、これらの遺伝子を遺伝子工学に基づくホップの育種法に応用することができ、さらには、医療分野への応用も期待できる。
【００１１】
ホップにおける苦味成分、イソプレノイド、プレニルフラボノイド等は雌株の球果に含まれるルプリン腺毛より分泌される二次代謝産物であるが、これらはビール原料、薬用資源としてのホップにおいて特に重要な成分である。ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）はこれらの成分の生合成反応において基質となる化合物であり、これもまたホップでは特に重要な物質である。
【００１２】
ＤＭＡＰＰの生合成経路については、従来から知られているメバロン酸経路の他に、微生物や高等植物の色素体などでは非メバロン酸経路が存在していることが明らかにされている（Nat. Prod. Rep., 16, 565-573 (1999); Trends Plant Sci., 6, 78-84 (2001)）。非メバロン酸経路に関与する遺伝子は微生物ではその全容が解明されつつあり、それらの遺伝子の産物の一つであるＬｙｔＢタンパク質（ＬｙｔＢ酵素）は、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）からＤＭＡＰＰ及びイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を生成する反応を触媒することが明らかとなっている（FEBS Letters, 532, 437-440 (2002)）。
【００１３】
しかしながら、植物においては、アラビドプシスなど一部の植物でＬｙｔＢ様遺伝子の存在は認められているものの、その遺伝子の産物であるタンパク質がＤＭＡＰＰの生成に関与しているかは不明であった。ホップでは、ＬｙｔＢ様遺伝子の存否も不明であった。
【００１４】
ホップにおいてＤＭＡＰＰの生成に関与する遺伝子が得られれば、これをホップの育種に応用することによって、発現形質に関して、経験と勘に頼る部分の少ない、より客観的で予測可能性のあるホップの育種が可能となる。そして、ビール原料又は薬用資源としてより優れた形質を有するホップを得ることが可能となる。
【００１５】
そこで本発明は、ホップにおいてＤＭＡＰＰの生成に関与する遺伝子を得、これを遺伝子工学技術に基づくホップの育種に応用することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を進めた結果、ホップにＬｙｔＢ様遺伝子が存在することを明らかにするとともにその単離精製に成功し、さらにその遺伝子の産物であるタンパク質がＬｙｔＢ活性を有する（ＨＭＢＰＰからＤＭＡＰＰを生成する反応を触媒する）ことを明らかにすることにより、本発明に至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、ＬｙｔＢ活性を有するタンパク質をコードする、単離精製されたホップ由来の遺伝子（ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子）を提供する。ここで、「ホップ由来の遺伝子」には、ホップ雌株の球果から得られるゲノムＤＮＡ、又はこれに対応するｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡが含まれる。
【００１８】
本発明の遺伝子としては、例えば、次の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする、単離精製されたホップ由来の遺伝子がある。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬｙｔＢ活性を有するタンパク質
【００１９】
また、次の（i）若しくは（ii）のＤＮＡからなる、又はこれをｃＤＮＡとする、単離精製されたホップ由来の遺伝子も、本発明の遺伝子である。
（i）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ii）配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬｙｔＢ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ホルムアミド濃度が３０〜５０％、好ましくは５０％であり、温度が３７〜５０℃、好ましくは４２℃の条件である。
【００２０】
本発明の遺伝子をマーカーとしてホップの育種に利用することにより、ビール原料、薬用資源として重要な苦味成分、イソプレノイド、プレニルフラボノイド等の含量において産業的により優れた品種を選抜することが可能となる。また、形質転換技術を用いてホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子をホップに導入することにより、苦味成分、イソプレノイド、プレニルフラボノイド等の含量において産業的に有用な品種の育種が可能となる。
【００２１】
イソプレノイドは、植物一般において、色素、香りの成分となり、また、植物ホルモン、ファイトアレキシン、害虫等に対する防御物質等になる物質である。従って、本発明の遺伝子を遺伝子工学技術に基づくホップの育種に応用することにより、ホップにおいて、色素、香りを制御し、また、植物ホルモン、ファイトアレキシン、害虫等に対する防御物質等の含量を制御することも可能となる。
【００２２】
また、本発明は、ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子を含有する組換えベクター、及びこの組換えベクターを含む形質転換体も提供する。本発明の組換えベクターにより、ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子をホップに導入することが可能となる。また、本発明の形質転換体により、ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子にコードされるタンパク質の大量供給が可能となる。
【００２３】
本発明は、ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子にコードされるタンパク質（ホップ由来ＬｙｔＢタンパク質）も提供する。このタンパク質が得られれば、その三次元構造や酵素反応機構を解明したり、その活性を制御する物質を探索したりすることが可能となる。前述のとおり、イソプレノイドには植物ホルモンなど植物の生育に必須の成分となるものもあるので、本発明のタンパク質の活性を阻害する物質の探索を通じて、例えば、新規除草剤の開発が可能になる。
【００２４】
また、本発明は、ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子の一部を含む核酸プライマー、及びホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子の一部を含む核酸プローブも提供する。本発明の核酸プライマーは、ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子の増幅に用いることができる。また、本発明の核酸プローブは、ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子の検出に用いることができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、ホップにおいてＤＭＡＰＰの生成に関与する遺伝子を得、これを遺伝子工学技術に基づくホップの育種に応用することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。
【００２７】
（ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子）
ホップ雌株球果由来全ＲＮＡおよびｍＲＮＡの調製：
ホップ雌株球果由来全ＲＮＡの調製は公知の方法で行うことができる。例えば、「植物のＰＣＲ実験プロトコール」（秀潤社、56頁(1995)）に記載の方法を用いることができる。また、得られた全ＲＮＡから、公知の方法でホップ球果由来ｍＲＮＡを調製することができる。例えば、「Oligotex-dT30<Super>」(タカラバイオ社)に添付のプロトコールに記載の方法を用いることができる。
【００２８】
ホップ雌株球果由来ｃＤＮＡライブラリーの作製：
ホップ球果由来ｃＤＮＡライブラリーは公知の方法で作製することができる。公知の方法としては、例えば、「Creater SMART cDNA Library Construction Kit」(ＢＤバイオサイエンス社)に添付のプロトコールに記載の方法が挙げられる。
【００２９】
ホップ由来ＬｙｔＢ様遺伝子の探索：
ホップ由来ＬｙｔＢ様遺伝子（ｃＤＮＡ）は、上記球果由来ｃＤＮＡライブラリーより得られる各クローンの塩基配列を解析し、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬなどのＤＮＡデータ−ベースに登録されている微生物、植物由来のＬｙｔＢ遺伝子との相同性を調べることにより、探索することができる。ここで、「ＬｙｔＢ様遺伝子」とは、既知のＬｙｔＢ遺伝子の塩基配列との相同性が高い塩基配列を有する遺伝子を意味する。塩基配列の決定は公知の方法で行うことができる。公知の方法としては、例えば、「ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit」（アプライドバイオシステムズ社）に添付されたプロトコールに記載の方法が挙げられる。
【００３０】
ＬｙｔＢ様遺伝子にコードされるタンパク質の機能の確認：
単離精製されたＬｙｔＢ様遺伝子の発現、及びその産物であるタンパク質の精製は、公知の方法に従って、ＬｙｔＢ様遺伝子を発現ベクターに組み込み、これを大腸菌に導入することにより、大腸菌の菌体内で行うことができる。公知の方法としては、例えば、「QIAexpress Expression Synstem」（キアゲン社）に添付のプロトコールに記載の方法が挙げられる。
【００３１】
得られたタンパク質がＬｙｔＢ活性を有するか否かは公知の方法で確認することができる。公知の方法としては、例えば、Petraらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99, 12108-12113 (2002)）が挙げられる。得られたタンパク質がＬｙｔＢ活性を有することが確認されれば、本発明の遺伝子が得られたことになる。
【００３２】
本発明の遺伝子は、公知の方法に従って、導入遺伝子やマーカー遺伝子として形質転換技術や分子選抜技術といった遺伝子工学技術に基づくホップの育種に応用することができる。
【００３３】
（組換えベクター）
本発明の組換えベクターは、公知の方法に従って、本発明の遺伝子を適当なベクターに挿入することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。
【００３４】
本発明の遺伝子は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれる必要がある。そこで、本発明の組換えベクターは、宿主中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）及びターミネーターを含んだものであることが好ましい。
【００３５】
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、公知の方法に従って、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主として用いる細胞は、本発明の遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。
【００３６】
植物への組換えベクターの導入方法としては、例えば、アグロバクテリウム感染法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法が挙げられる。
【００３７】
植物体内で目的遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の５’末端側上流に植物用のプロモーターを、３’末端側下流に植物用のターミネーターを配置させる必要がある。プロモーターとしては、例えば、比較的多くの植物で組織を問わず導入遺伝子を発現させることができるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターやノパリン合成酵素遺伝子プロモーター（Sanders P.R. et al., Nucleic Acid Res., 15, 1543-1558 (1987)）が挙げられる。ホップでは、ホップ雌株の球果に含まれるルプリン腺中で特異的に導入遺伝子を発現させることができるバレロフェノンシンターゼプロモーターを用いることができる（J. Plant Physiol., 160, 1101-1108 (2003)）。ターミネーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスやノパリン合成酵素遺伝子に由来するターミネーターが挙げられる。
【００３８】
効率的に目的の形質転換細胞を選択するためには、有効な選択マーカー遺伝子を本発明の遺伝子と併用することが好ましい。その際に使用する選択マーカー遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子、ビアラホス（bialaphos）に対する抵抗性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子などから選ばれる１つ以上の遺伝子を用いることができる。本発明の遺伝子及び選択マーカー遺伝子は、単一のベクターに一緒に組み込んでも、それぞれ別個のベクターに組み込んだ２種類の組換えＤＮＡを用いてもよい。
【００３９】
（ホップ由来ＬｙｔＢタンパク質）
本発明のタンパク質は、公知の方法に従って、前記形質転換体を培地に培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。ここで、「培養物」とは、培養上清、培養細胞及び細胞破砕物のいずれをも意味する。
【００４０】
本発明のタンパク質が得られれば、公知の方法により、その三次元構造や酵素反応機構の解明や、その活性を制御する物質の探索を行うことができる。
【００４１】
（核酸プライマー）
ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子の一部を含む核酸プライマーは、公知の方法で作製することができる。例えば、β−シアノエチル合成法を用いたパーキンエルマー社製等の自動ＤＮＡ合成装置により簡単に合成することができる。
【００４２】
本発明の核酸プライマーは、公知の方法に従って、ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子の増幅に用いることができる。
【００４３】
本発明の核酸プライマーに含まれるホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子部分は、ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子の末端部分であることが好ましい。また、本発明の核酸プライマーに含まれるホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子部分の長さは、好ましくは２０〜２５塩基程度である。
【００４４】
（核酸プローブ）
ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子の一部を含む核酸プローブは、公知の方法で作製することができる。例えば、ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子を含むベクターを適当な制限酵素で消化し、その遺伝子のフラグメントを分取することにより得ることができる。また、β−シアノエチル合成法を用いたパーキンエルマー社製等の自動ＤＮＡ合成装置により簡単に合成することもできる。
【００４５】
本発明の核酸プローブは、公知の方法に従って、ホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子の検出に用いることができる。
【００４６】
本発明の核酸プローブに含まれるホップ由来ＬｙｔＢ遺伝子部分の長さは、好ましくは５００〜１５００塩基程度である。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００４８】
（実施例１：ホップ雌株球果由来全ＲＮＡ及びｍＲＮＡの調製）
ホップ雌株球果由来全ＲＮＡの調製は以下の通りに行った。ホップ雌株の球果を凍結状態で軽く粉砕し、メッシュ径２５０μｍの篩で篩う事により、透過画分をルプリン濃縮球果画分とした。この画分を液体窒素中で十分に凍結粉砕し、２％ＣＴＡＢ溶液（２％セチルトリメチルアンモニウムブロミド、０.１Ｍ トリス（ｐＨ９.５）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．４Ｍ ＮａＣｌ、５％β−メルカプトエタノール）に懸濁して、６５℃で１０分間保温した。クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出後、１／３倍量の１０Ｍ塩化リチウムを加え、一晩放置し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、沈殿を水に溶かした。これらの溶液に更に１／３倍量の１０Ｍ塩化リチウムを加え、一晩放置し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿を７０％エタノールで洗浄後、乾燥し、再度水に溶かして全ＲＮＡサンプルとした。さらに、得られた全ＲＮＡから「Oligotex-dT30<Super>」（タカラバイオ社）を用いて、添付のプロトコール等に記載の方法でｍＲＮＡを調製した。
【００４９】
（実施例２：ホップ雌株球果由来ｃＤＮＡライブラリーの作製）
得られたホップ雌株球果由来ｍＲＮＡから、「Creater SMART cDNA Library Construction Kit」（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて、添付のプロトコールに記載の方法でｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００５０】
（実施例３：ホップ由来ＬｙｔＢ様遺伝子の探索）
実施例２で得られたｃＤＮＡライブラリーよりランダムにクローンを抽出し、それぞれに含まれるホップ由来ｃＤＮＡの末端の塩基配列を解析した。得られた塩基配列について、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）の提供するBLAST Search（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて相同性検索を行い、データベース上に登録されているＬｙｔＢ遺伝子と相同性をもつｃＤＮＡを見つけ出した。配列表の配列番号１は、得られたＬｙｔＢ様遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列を示す配列である。また、配列表の配列番号２は、得られたＬｙｔＢ様遺伝子（ｃＤＮＡ）にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す配列である。
【００５１】
（実施例４：ＬｙｔＢ様遺伝子にコードされるタンパク質の機能の確認）
単離精製したＬｙｔＢ様遺伝子にコードされるタンパク質に実際にＬｙｔＢ活性があるか否かを確認するために、そのＬｙｔＢ様遺伝子を大腸菌で発現させることを試みた。
【００５２】
まず、実施例３で単離精製したＬｙｔＢ様遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列に基づいて、ＬｙｔＢ様遺伝子のコーディング領域の開始コドン側末端配列にＳｐｈＩ配列を付加したプライマー（配列：GCATGCATGTCGATCACTTTCCACCTCTGC（配列番号３））と、終止コドン側末端配列にＰｓｔＩ配列を付加したプライマー（配列：CTGCAGCTAACTTAAACTAAGCAAGTTGC（配列番号４））を設計し、実施例３で得られたＬｙｔＢ様遺伝子を鋳型にＰＣＲを行った。配列表の配列番号３は、開始コドン側末端配列にＳｐｈＩ配列を付加したプライマーの塩基配列を示す配列である。配列表の配列番号４は、終止コドン側末端配列にＰｓｔＩ配列を付加したプライマーの塩基配列を示す配列である。得られた増幅産物をｐＣＲ２.１ベクター（Invitrogen社）にサブクローニングし、塩基配列を解析することにより、ＰＣＲによる取り込みエラーが存在していないことを確認した。
【００５３】
次に、挿入断片を制限酵素ＳｐｈＩ及びＰｓｔＩで消化して切り出し、「QIAexpress Expression System」（キアゲン社）に含まれる発現ベクターｐＱＥ３０のＳｐｈＩ／ＰｓｔＩ部位に組み込んだ後、大腸菌に導入してＬｙｔＢ様遺伝子を大腸菌の菌体内で発現させ、その発現産物を精製した。大腸菌内でのＬｙｔＢ様遺伝子の発現、及び発現産物の精製は、「QIAexpress Expression System」に添付のプロトコールに従って行った。
【００５４】
最後に、得られた発現産物がＬｙｔＢ活性を有するか否かを調べた。
【００５５】
２０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７.０）、１.５ｍＭ ＮＡＤＰＨ、６０μＭ ＦＡＤ、３.３ｍＭ ＨＭＢＰＰ、及び０.７ｍｇ／ｍＬ発現タンパク質を含む２００μＬの混合液を３７℃にて反応させ、反応０時間、２時間及び４時間の反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。反応２時間及び４時間で２５μＬをサンプリングし、ＨＰＬＣ分析時まで−３０℃で保存した。カラムにはHydrosphere C18（ＹＭＣ社）を、移動層には２５ｍＭ炭酸水素アンモニウムを用い、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで分析を行った。なお、反応液のＨＰＬＣ分析に先立ちＨＭＢＰＰ及びＤＭＡＰＰの標準品をＨＰＬＣで分析して、それぞれの化合物のリテンションタイムを調査しておき、それらのリテンションタイムから反応生成物の同定を行った。
【００５６】
図１は、ＨＰＬＣにおけるＨＭＢＰＰ及びＤＭＡＰＰの標準品のリテンションタイムを示すＨＰＬＣチャートである。図１では、10.437分及び15.771分の位置にピークが現れている。図２は、反応０時間の反応液をＨＰＬＣで分析して得られたＨＰＬＣチャートである。図２では、11.046分の位置にピークが現れている。図３は、反応２時間の反応液をＨＰＬＣで分析して得られたＨＰＬＣチャートである。図３では、15.529分及び17.775分の位置にピークが現れている。図４は、反応４時間の反応液をＨＰＬＣで分析して得られたＨＰＬＣチャートである。図４では、15.529分及び17.775分の位置に図３のものよりも大きいピークが現れている。図１〜４より、11.046分、15.529分及び17.775分の位置のピークはそれぞれＨＭＢＰＰ、ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰのものであり、上述の反応によりＨＭＢＰＰよりＤＭＡＰＰ及びＩＰＰが生成されたことがわかった。
【００５７】
さらに、ＨＰＬＣにおけるＤＭＡＰＰ及びＩＰＰのピーク画分を高速原子衝突質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）により分析した。
【００５８】
図５は、ＨＰＬＣにおけるＤＭＡＰＰのピーク画分をＦＡＢ−ＭＳで分析して得られたＭＳスペクトルである。図６は、ＨＰＬＣにおけるＩＰＰのピーク画分をＦＡＢ−ＭＳで分析して得られたＭＳスペクトルである。図５及び６のいずれにも、ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰの分子量である２４６.０のピークが現れている。図５及び６より、反応生成物がＤＭＡＰＰ及びＩＰＰであることが確認された。
【００５９】
これらの結果より、単離精製されたホップ由来ＬｙｔＢ様遺伝子の産物であるタンパク質がＨＭＢＰＰよりＤＭＡＰＰ及びＩＰＰを生成する反応を触媒する（ＬｙｔＢ活性を有する）こと、すなわち単離精製されたホップ由来ＬｙｔＢ様遺伝子がＬｙｔＢ遺伝子であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、発現形質に関して、経験と勘に頼る部分の多い従来の育種法に比べ、より客観的で予測可能性のあるホップの育種が可能となる。特に、ビール原料又は薬用資源としてより優れた形質を有するホップを得ることが可能となる。
【００６１】
例えば、ビール原料、薬用資源として重要な苦味成分、イソプレノイド、プレニルフラボノイド等の含量において産業的により優れた品種を選抜することが可能となる。また、苦味成分、イソプレノイド、プレニルフラボノイド等の含量において産業的に有用な品種の育種が可能となる。さらに、ホップにおいて、色素、香りを制御し、また、植物ホルモン、ファイトアレキシン、害虫等に対する防御物質等の含量を制御することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＨＰＬＣにおけるＨＭＢＰＰ及びＤＭＡＰＰの標準品のリテンションタイムを示すＨＰＬＣチャートである。
【図２】反応０時間の反応液をＨＰＬＣで分析して得られたＨＰＬＣチャートである。
【図３】反応２時間の反応液をＨＰＬＣで分析して得られたＨＰＬＣチャートである。
【図４】反応４時間の反応液をＨＰＬＣで分析して得られたＨＰＬＣチャートである。
【図５】ＨＰＬＣにおけるＤＭＡＰＰのピーク画分をＦＡＢ−ＭＳで分析して得られたＭＳスペクトルである。
【図６】ＨＰＬＣにおけるＩＰＰのピーク画分をＦＡＢ−ＭＳで分析して得られたＭＳスペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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