(57)【要約】【課題】複数の実質的に同時のトレースを有する入力核酸クロマトグラムを処理するコンピュータシステム、コンピュータプログラム製品、および方法を提供する。【解決手段】複数のトレースにおける各トレースは、複数のデータポイントを有する。複数のデータポイントにおける各それぞれのデータポイントは、それぞれのデータポイントに対応するトレースにおける位置で信号強度を表す。第1のピークは、複数のトレースにおける第2のトレースにおける第2のピークと実質的に重なり合う第1のトレースで識別される。第1のピークは、第1の出力ホモ接合表現に出力され、かつ第2のピークは、第2の出力ホモ接合表現に出力される。第1の出力ホモ接合表現は、入力核酸クロノグラムに対応する、第1のホモ接合配列表現または第1のホモ接合核酸クロノグラムである。第2の出力ホモ接合表現は、入力核酸クロノグラムに対応する、第2のホモ接合配列表現または第2のホモ接合核酸クロノグラムである。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の実質的に同時のトレースを有する入力核酸クロマトグラムを処理する方法において、前記複数のトレースにおける各トレースは、複数のデータポイントを有し、かつ各前記複数のデータポイントにおける各それぞれのデータポイントは、前記それぞれのデータポイントに対応する前記トレースにおける位置での信号強度を表す方法であって、
前記複数のトレースにおける第2のトレースの第2のピークと実質的に重なり合う前記複数のトレースにおける第1のトレースの第1のピークを識別することと、
第1の出力ホモ接合表示に対する前記第1のピークと、第2の出力ホモ接合表示に対する前記第2のピークとを出力することと含む方法。
【請求項２】
前記第1の出力ホモ接合表示は、前記入力核酸クロマトグラムの第1のホモ接合配列表示であり、かつ
前記第2の出力ホモ接合表示は、前記入力核酸クロマトグラムの第2のホモ接合配列表示である請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記第1の出力ホモ接合表示は、第1のホモ接合核酸クロマトグラムであり、かつ
前記第2の出力ホモ接合表示は、第2のホモ接合核酸クロマトグラムである請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記識別は、
（A）前記第1のトレースにおける1個または複数のピークの各それぞれのピークに関して、前記それぞれのピークにおける最大値を有するデータポイントをマークすることを含み、前記第1のトレースにおける前記1個または複数のピークは、前記第1のピークを含み、
（B）前記第2のトレースにおける1個または複数のピークの各それぞれのピークに関して、前記それぞれのピークにおける最大値を有するデータポイントをマークすることを含み、前記第2のトレースにおける前記1個または複数のピークは、前記第2のピークを含み、
（C）（i）前記第1のピークにおいて最大値を有する第1のデータポイント、および（ii） 前記第2のピークにおいて最大値を有する第2のデータポイントから、データポイントの重なり合う閾値数以内である前記入力核酸クロマトグラムの座標を識別すること含む請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記第1のデータポイントおよび前記第2のデータポイントが、2個のデータポイントから7個のデータポイントの間に離れるときに、前記第1のピークは、前記第2のピークに実質的に重なり合う請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記第1のデータポイントおよび前記第2のデータポイントが、3個未満のデータポイント離れるときに、前記第1のピークは、前記第2のピークに実質的に重なり合う請求項4に記載の方法。
【請求項７】
前記第1のピークおよび前記第2のピークは、それぞれ無関係に、5個のデータポイントから40個のデータポイントを備える請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記入力クロマトグラムは、ABIトレースファイルフォーマット、SCFファイルフォーマット、ZTRファイルフォーマット、またはALFファイルフォーマットである請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記第1の出力核酸クロマトグラムおよび前記第2の出力核酸クロマトグラムは、それぞれABIトレースファイルフォーマット、SCFファイルフォーマット、ZTRファイルフォーマット、またはALFファイルフォーマットに書き込まれる請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記座標の周りの所定の領域における前記入力クロマトグラムのピークの閾値数より多いときに、前記第1のピークおよび前記第2のピークは、前記第1の出力ホモ接合表示および前記第2の出力ホモ接合表示の両方にそれぞれ書き込まれる請求項4に記載の方法。
【請求項１１】
前記ピークの閾値数は、2個のピークから5個のピークの間である請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記所定の領域は、前記座標の周りで2個のデータポイントと20個のデータポイントの間である請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記第1のピークの前記第1のデータポイントと前記第2のピークの前記第2のデータポイントとの間の比が、閾値比の値より大きいとき、前記第1のピークおよび前記第2のピークは、前記第1の出力ホモ接合表示および前記第2の出力ホモ接合表示にそれぞれ書き込まれる請求項4に記載の方法。
【請求項１４】
前記閾値比の値は、少なくとも0.20である請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記閾値比の値は、少なくとも0.40である請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
前記第1のピークの前記第1のデータポイントと前記第2のピークの前記第2のデータポイントとの間の比が、閾値比の値より小さいとき、前記第1のピークおよび前記第2のピークは、前記第1の出力ホモ接合表示および前記第2の出力ホモ接合表示にそれぞれ書き込まれる請求項4に記載の方法。
【請求項１７】
前記入力核酸クロマトグラムに関して平均ピークバックグラウンド値を決定することと、
前記第1のピークの前記第1のデータポイントまたは前記第2のピークの前記第2のデータポイントが、前記平均ピークバックグラウンド値より小さいとき、前記第1のピークおよび前記第2のピークを、前記第1の出力ホモ接合表示および前記第2の出力ホモ接合表示に書き込むこととをさらに含む請求項4に記載の方法。
【請求項１８】
前記平均ピークバックグラウンド値は、
（i）（a）試験トレースにおけるピークの最大値を有する前記複数のトレースにおける前記試験トレースのデータポイントを、（b）前記複数のトレースの他のトレースの対応する領域内に最大値を有する対応するデータポイントと比較することと、
（ii）前記複数のトレースにおける各トレースが、前記比較することで（i）比較されるまで、前記複数のトレースにおける他のトレースの対応する領域内に最大値を有する対応するデータポイントに対する、前記試験トレースにおける前記データポイントとの比較を繰り返すことであって、
前記試験トレースにおける前記データポイントが、前記複数のトレースにおける各他のトレースの対応するデータポイントによって保持される前記値より大きい値を有するとき、前記データポイントの前記値は、カウンタに追加される、前記データポイントとの比較を繰り返すことと、
（iii）前記試験トレースにおける前記ピークの全てまたは前記ピークの一部が、前記比較すること（i）によって比較されるまで、前記試験トレースにおける異なるピークの最大値を有する異なるデータポイントを使用して、前記比較すること（i）および前記繰り返すこと（ii）を繰り返すことと、
（iv）前記複数のトレースにおける各トレースが、前記比較すること（i）における試験トレースとして考慮されるまで、前記複数のトレースにおける異なる試験トレースを使用して、前記比較すること（i）、前記繰り返すこと（ii）、および前記繰り返すこと（iii）を繰り返すことと、
（v）前記カウンタに追加されるピーク数によって前記カウンタを平均化することにより、前記平均ピークバックグラウンド値を得る請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記入力核酸クロマトグラムは、ヘテロ接合核酸サンプルからの核酸配列を表し、
前記ヘテロ接合核酸サンプルへの挿入または削除のポイントのために、前記入力核酸クロマトグラムを走査することと、
前記挿入または削除のポイントが見出され、かつ前記座標が前記ポイントの後であるとき、前記第1のピークおよび前記第2のピークは、それぞれ前記第1の出力ホモ接合表示および前記第2の出力ホモ接合表示に書き込まれる請求項4に記載の方法。
【請求項２０】
前記走査は、前記座標後に前記複数のトレースで生じるピークの数をカウントすることを含み、前記ピークの数が、挿入/削除の閾値数を超えるとき、前記座標は、前記ヘテロ接合核酸サンプルにおいて挿入/削除の前記ポイントであることが決定される請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記挿入/削除の閾値数が、25から75の間である請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記挿入/削除の閾値数が、75から200の間である請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
前記走査は、前記座標後に前記複数のトレースで重なり合うピークのパーセンテージを決定することを含み、重なり合う前記ピークのパーセンテージが、挿入/削除の閾値パーセンテージを超えるとき、前記座標は、前記ヘテロ接合核酸サンプルにおいて挿入または削除の前記ポイントであることが決定される請求項19に記載の方法。
【請求項２４】
前記挿入/削除の閾値パーセンテージは、2パーセントから90パーセントの間である請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記挿入/削除の閾値パーセンテージは、10パーセントから50パーセントの間である請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
前記入力核酸クロマトグラムは、ヘテロ接合核酸サンプルからの核酸配列を表し、前記出力する前に、スケーリング定数によって前記第1のピークおよび前記第2のピークを乗算することを含む請求項1に記載の方法。
【請求項２７】
前記スケーリング定数は、1.1から3.2の間である請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記スケーリング定数は、2.0である請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
前記入力核酸クロマトグラムにおける複数のピークに関する共通ピークプロファイルを生成することと、前記出力する前に、
前記共通ピークプロファイルに対して前記第1のピークまたは前記第2のピークを調べることをさらに含む請求項1に記載の方法。
【請求項３０】
前記生成することは、
前記入力核酸クロマトグラムにおけるピークのデータポイントの平均数を決定することと、
前記データポイントの平均数を有する前記入力核酸クロマトグラムにおけるピークの全てまたはピークの一部のプロファイルを平均化し、それによって前記共通ピークプロファイルを形成することとを含む請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記調べることは、前記第1のピークまたは前記第2のピークにおける試験データポイントの値が、誤りパーセンテージだけ、前記試験データポイントに対応する前記共通ピークプロファイルにおける前記データポイントの値を超えるかどうかを決定することを含む請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
前記誤りパーセンテージは、0.01から0.4の間である請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記誤りパーセンテージは、0.1である請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
前記入力クロマトグラム核酸における前記複数のトレースは、グアニンに関する第1のトレース、シトシンに関する第2のトレース、アデノシンに関する第3のトレース、およびチミンに関する第4のトレースからなる請求項1に記載の方法。
【請求項３５】
請求項1に記載の方法のステップを実行するためのコンピュータ実行可能な指示を有するコンピュータ読み取り可能媒体。
【請求項３６】
コンピュータシステムと共に使用するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュータ読み取り可能記憶媒体、および前記コンピュータ読み取り可能記憶媒体に埋め込まれたコンピュータプログラム機構を備え、前記コンピュータプログラム機構は、複数の実質的に同時のトレースを有する、入力核酸クロマトグラムを処理するためのものであり、前記コンピュータプログラム機構は、
前記複数のトレースの第2のトレースにおける第2のピークと実質的に重なり合う前記複数のトレースの第1のトレースにおける第1のピークを識別する指示と、
第1の出力ホモ接合表示に対する前記第1のピークと、第2の出力ホモ接合表示に対する前記第2のピークとを出力する指示とを含むコンピュータプログラム製品。
【請求項３７】
前記第1の出力ホモ接合表示は、前記入力核酸クロマトグラムの第1のホモ接合配列表示であり、かつ
前記第2の出力ホモ接合表示は、前記入力核酸クロマトグラムの第2のホモ接合配列表示である請求項36に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項３８】
前記第1の出力ホモ接合表示は、第1のホモ接合核酸クロマトグラムであり、かつ
前記第2の出力ホモ接合表示は、第2のホモ接合核酸クロマトグラムである請求項36に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項３９】
前記識別する指示は、
（A）前記第1のトレースにおける1個または複数のピークの各それぞれのピークに関して、前記それぞれのピークにおける最大値を有するデータポイントをマークする指示を含み、前記第1のトレースにおける前記1個または複数のピークは、前記第1のピークを含み、
（B）前記第2のトレースにおける1個または複数のピークの各それぞれのピークに関して、前記それぞれのピークにおける最大値を有するデータポイントをマークする指示を含み、前記第2のトレースにおける前記1個または複数のピークは、前記第2のピークを含み、
（C）（i）前記第1のピークにおいて最大値を有する第1のデータポイント、および（ii） 前記第2のピークにおいて最大値を有する第2のデータポイントから、データポイントの重なり合う閾値数以内である前記入力核酸クロマトグラムの座標を識別する指示を含む請求項36に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項４０】
複数の実質的に同時のトレースを有する入力核酸クロマトグラムを処理するコンピュータシステムであって、
中央処理ユニットと、
前記中央処理ユニットに結合されたメモリであって、前記入力核酸クロマトグラムを格納するメモリと、
プログラムモジュールとを備え、前記プログラムモジュールは、
前記複数のトレースの第2のトレースにおける第2のピークと実質的に重なり合う前記複数のトレースの第1のトレースにおける第1のピークを識別する指示と、
第1の出力ホモ接合表示に対する前記第1のピークと、第2の出力ホモ接合表示に対する前記第2のピークとを出力する指示とを含むコンピュータシステム。
【請求項４１】
前記第1の出力ホモ接合表示は、前記入力核酸クロマトグラムの第1のホモ接合配列表示であり、かつ
前記第2の出力ホモ接合表示は、前記入力核酸クロマトグラムの第2のホモ接合配列表示である請求項40に記載のコンピュータシステム。
【請求項４２】
前記第1の出力ホモ接合表示は、第1のホモ接合核酸クロマトグラムであり、かつ
前記第2の出力ホモ接合表示は、第2のホモ接合核酸クロマトグラムである請求項40に記載のコンピュータシステム。
【請求項４３】
前記識別する指示は、
（A）前記第1のトレースにおける1個または複数のピークの各それぞれのピークに関して、前記それぞれのピークにおける最大値を有するデータポイントをマークする指示を含み、前記第1のトレースにおける前記1個または複数のピークは、前記第1のピークを含み、
（B）前記第2のトレースにおける1個または複数のピークの各それぞれのピークに関して、前記それぞれのピークにおける最大値を有するデータポイントをマークする指示を含み、前記第2のトレースにおける前記1個または複数のピークは、前記第2のピークを含み、
（C）（i）前記第1のピークにおいて最大値を有する第1のデータポイント、および（ii）前記第2のピークにおいて最大値を有する第2のデータポイントからなるデータポイントの重なり合う閾値数以内である前記入力核酸クロマトグラムの座標を識別する指示を含む請求項40に記載のコンピュータシステム。
【請求項４４】
コンピュータシステムと共に使用するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュータ読み取り可能記憶媒体、および前記コンピュータ読み取り可能記憶媒体に埋め込まれたコンピュータプログラム機構を備え、前記コンピュータプログラム機構は、複数のトレースを有する入力核酸クロマトグラムを処理するためのものであり、前記コンピュータプログラム機構は、トレース分割ルーチンを備え、前記トレース分割ルーチンは、
第1の出力ホモ接合表示に対して前記入力核酸クロマトグラムにおける第1のトレースからの第1のピークの表示を出力する指示と、
第2の出力ホモ接合表示に、前記第1のピークと実質的に重なり合うポイントで前記入力クロマトグラムにおける第2のトレースで発生する第2のピークの表示を出力する指示とを含むコンピュータプログラム製品。
【請求項４５】
前記入力核酸クロマトグラムにおける座標が、（i）前記第1のピークにおいて最大値を有する第1のデータポイント、および（ii）前記第2のピークにおいて最大値を有する第2のデータポイントから、データポイントの重なり合う閾値数以内であるとき、前記第2のピークは、前記第1のピークと実質的に重なり合う請求項44に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項４６】
前記重なり合う閾値数は、2個のデータポイントから7個のデータポイントの間である請求項45に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項４７】
複数の実質的に同時のトレースを有する入力核酸クロマトグラムを処理する方法において、前記複数のトレースにおける各トレースは、複数のデータポイントを有し、かつ各前記複数のデータポイントにおける各それぞれのデータポイントは、前記それぞれのデータポイントに対応する前記トレースにおける位置での信号強度を表す方法であって、
前記複数のトレースにおける第2のトレースの第2のピークと実質的に重なり合う前記複数のトレースにおける第1のトレースの第1のピークを識別することと、
前記第1のピークの塩基表示を形成するために前記第1のピークをベースコーリングすることと、
前記第2のピークの塩基表示を形成するために前記第2のピークをベースコーリングすることと、
第1の出力ホモ接合配列に対する前記第1のピークの前記塩基表示を出力することと、
第2の出力ホモ接合配列に対する前記第2のピークの前記塩基表示を出力することと含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、核酸クロマトグラムを自動的に処理するためのコンピュータシステムおよび方法に関する。そのような方法は、ヘテロ接合核酸配列のトレースにおける多形性（polymorphisms）の検出および特徴付けを容易にするために使用されることができる。
【背景技術】
【０００２】
大量なＤＮＡ配列情報の利用可能性は、生化学の実施に影響し始めた。現在の大規模の配列出力の結果として、解析方法は、急増するデータと歩調を合わせるには不適切である。この増大する需要についていくために、改善された自動化が必要であり、配列データ処理における人間の関与が、著しく低減されまたは排除されることが特に重要である。この点における進歩は、誤り訂正における人間の関与の必要性を低減しかつ人間によるレビューをより効率的にするために、データ処理ソフトウェアの改善された精度および信頼性がある精度の測定の両方を必要とする。
【０００３】
現在、ＤＮＡ配列決定は、Applied Biosystems （ABI, Norwalk, Connecticut） 3730xl ＤＮＡ Analyzer、3730 ＤＮＡ Analyzer、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer、3100-Avant Capillary ＤＮＡ sequencer/genotyper、または310 Capillary ＤＮＡ sequencer/Genotyperなどの自動化されたシーケンサにおいて、Sangerの酵素によるジデオキシ鎖末端方法を使用して一般に実行される（Sanger et al. 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463-5467）。そのようなシーケンサは、1千より多い塩基を列挙する配列データを作ることがある。関心のＤＮＡテンプレート、およびテンプレート鎖上の特定のサイトに対する相補的なオリゴヌクレオチドプライマーで始まる。それぞれ4個の塩基（A、G、C、T）に関して、反応が実行され、ＤＮＡポリメラーゼは、様々な長さの標識付けられた一本鎖断片の母集団を合成し、各断片は、テンプレート鎖のセグメントに相補的であり、かつプライマーからその塩基の出現まで拡張する。これらの断片は、次にゲル電気泳動によって長さにしたがって分離され、その後、各断片の最終塩基の特定とともにそれらの相対サイズにより、テンプレートの塩基配列は推論されることができる。
【０００４】
自動化された配列決定（Smith et al. 1986, Nature 321: 674-679）において、断片は、プライマー（染料プライマー化学構造）に、またはジデオキシ鎖末端ヌクレオチド（染料ターミネータ化学構造）に取り付けられた蛍光染料で標識付けられる（Prober et al. 1987, Science 238: 336-341）。一般に、異なる染料がそれぞれ4つの反応のために使用され、それらは、単一のゲルレーンで組み合わせられかつ実行されることができる（染料ターミネータ化学構造の場合に、これは、全ての4つの反応が単一のチューブで実行されることも可能にする）。例えば、1つのそのような適用例は、レーザ励起と、非常に薄い（50-100ミクロン）変性ポリアクリルアミドゲルにおけるそれらの電気泳動分離の間に、4個の蛍光で標識付けられたＤＮＡ配列決定反応の並列検出のための冷却されたCCD（電荷結合デバイス）検出器（KostichkaおよびSmithの米国特許第5,162,654号）を用いる（Kostichka et al., Bio/Technology 10: 78-81 （1992））。Weissら（米国特許第5,470,710号）は、核酸分子検出のための酵素に結合された蛍光方法を使用する、他の蛍光に基づく配列決定適用を記載する。マルチチャネル毛細管電気泳動デバイスおよび方法を対象とする米国特許第6,596,140号も参照されたい。
【０００５】
一般に、マルチテンプレート（例えば、同時に36個以上）は、同じゲル上の別個のレーンで解析される。ゲルの底部で、レーザは、それらが通過したときに断片における蛍光染料を励起し、かつ検出器は、4つの異なる波長で放射強度を収集する。レーザおよび検出器は、ゲル画像を構築するために電気泳動の間に連続的にゲルの底部を走査し、各レーンは、4つの異なる色のバンドのはしご状のパターンを有し、各バンドは、特定の長さの断片に対応する。
【０００６】
コンピュータ解析は、次に、ゲル画像を各テンプレートに関する推論される塩基配列（または読み取り）へ変換するために使用される。一般にこの解析は、以下の4つの別個のステップからなる。すなわち、ゲルレーン境界が特定されるレーントラッキングのステップと、各4個の信号が、ゲルランの間に数千の等間隔の時刻点で信号強度を示す4個のアレイのセットを提供する、プロファイルまたは「トレース」のセットを作るためにレーン幅を横切って合計されるレーンプロファイリングのステップと、信号処理方法が、信号推定値を逆畳み込みしかつ平滑化し、雑音を低減し、かつ断片移動度に対する染料の作用および長期間の電気泳動の傾向を訂正するために使用されるトレース処理ステップと、処理されたトレースが、塩基の配列に変換されるベースコーリング（base-calling）ステップとである。
【０００７】
本明細書で使用される用語「トレース」は、ヌクレオチドなどの特定の化合物に関するクロマトグラフィによって得られた、時間で分割された分離パターンを指す。この分離パターンは、複数のデータポイントで特徴付けられ、複数のデータポイントにおける各データポイントが、各データポイントに対応する分離パターンにおける位置での信号振幅を表す。所定のデータポイントの値は、データポイントによって表される時点で検出器によって検知されたトレースに対応する化合物の量に応じて決定される。一般的な核酸配列において、例えば各データポイントでトレースによって表される塩基の存在量は変わる。トレースによって表される化合物が存在しないデータポイントは、一般に比較的小さな信号振幅に割り当てられる。逆に、トレースによって表される化合物が存在するデータポイントは、一般に比較的大きな信号振幅に割り当てられる。したがって、比較的小さな振幅を有するデータポイントおよび比較的大きな振幅を有するデータポイントのパターンは、トレースにおける「ピーク」を生じさせる。ある実施形態において、トレースは、5個のデータポイントより多く、100個のデータポイントより多く、または1,000個のデータポイントより多くを有する。ある実施形態において、トレースは、2個から100,000個以上のデータポイントを有する。
【０００８】
核酸配列に関する処理されたトレースは、通常、異なる色の4個の曲線からなるクロマトグラムの形態に表示され、各曲線は、（断片サイズを増大する）検出に対して増加する時間の方向に左から右に描かれた4個の塩基の1個の信号を表す。理想的なトレースは、均一に離間された重なり合わないピークからなり、各ピークは、配列決定された鎖における特定の塩基で終端する標識付けられた断片に対応する。したがって、核酸に関して、それぞれ唯一のヌクレオチドを表す4個のトレースが存在する。実際のトレースは、配列決定反応、ゲル電気泳動、およびトレース処理における可能性がある不完全性を含む様々な理由のために、この理想から逸脱する。（移動度に対する染料および特定の塩基配列の比較的大きな影響によって引き起こされる）非常に短い断片、および反応されていない染料−プライマーまたは染料−ターミネータ分子の異常な移動のために、トレースの最初の50個などのピークは、しばしば雑音が多くかつ不均一に離間される。トレースの端部に向かって、ピークは、より精度が低いトレース処理、拡散効果が増大しかつ連続する断片間の相対質量の差異が減少するときのより低い解像度、および所定サイズの標識付けられた断片分子の数が減少されたときに雑音から識別することのより大きな困難性の結果として、次第により不均一に離間されるようになる。特に、同一の塩基に関する不十分に解像されたピークは、単一の広いしばしばいびつなピークであり得る。
【０００９】
トレースのより良好に解像された領域において、最も一般的に見られる電気泳動異常は、一本鎖断片の端部近くの塩基が、相補的な上流側領域に結合するときに発生する圧縮であり（SangerおよびCoulson 1975, J. Mol. Biol. 94: 441-448、Sanger et al. 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463-5467）、ゲルを介してその長さから予想されるより迅速に移動するヘアピン状の構造を作り、したがってピークをその予想される位置から偏位させる。これにより、結果としてあるピークが他のピークより低く、または同一の塩基に関する2個の連続するピークが、合併されて１つのピークとなることになる。染料ターミネータ化学構造は、最大圧縮を解像するように現れるが（Lee et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20: 2471-2483）、この化学構造は、染料で標識付けられた末端ヌクレオチドに関する低減されたポリメラーゼ親和力によって引き起こされる自体のデータ品質問題を有する。
【００１０】
ベースコーリングソフトウェアの目的は、上記データの問題に向かい合って可能なかぎり正確に配列を生成することである。本明細書で使用される用語「ベースコーリング」は、核酸配列におけるヌクレオチド塩基の同一性を決定するプロセスを言及する。
【００１１】
最も早期のベースコーリングソフトウェアのいくつかは、第1のABI配列決定機械に実装された処理ソフトウェアの一部であった（Connell et al., 1987, Bio Techniques 5: 342-348）。そのABIソフトウェアは、他の方法が判定されるベンチマークとしてしばしば使用される。完全なアルゴリズムの詳細は公開されていないが、そのベースコーリングソフトウェアのABI記載によれば（ABI 1996）、プログラムは、ピーク期間を予測するために移動度曲線を使用し、かつ、公称ピーク期間のインターバルにおける最も可能性のあるピークを識別し、良好な選択が存在しない場合にNを割り当てる。その後、ABIソフトウェアは、ピーク期間の均一性を含む基準を使用して、塩基を追加しかつ取り除く。
【００１２】
大きな容量の配列決定の出現は、他のベースコーリングソフトウェアプログラムの開発を促進した（Giddings et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21: 4530-4540、Golden et al., 1993, in Proceedings of the First International Conference on Intelligent Systems For Molecular Biology、Hunder et al. eds, pp, 136-144, AAAI Press, Menlo Park, California、Golden et al., 1995 in Evolutionary programming IV. Proceedings of the Fourth Annual Conference on Evolutionary Programming, 579-601、Berno, 1996, Genome Research 6: 80-91）。これら全てのプログラムは、ベースコーリングを含むマルチゲル画像処理ステップを実行し、配列決定機械に無関係にコンピュータでデータの有効な中央処理を可能にする長所を有する。しかしながら、これらソフトウェアプログラムのいずれも、満足できる方法でトレースにおけるヘテロ接合ピークを識別していない。
【００１３】
ABIシーケンサで利用可能なABIベースコーリングソフトウェアは、利用可能な塩基のほぼ半分を信頼性良く識別することができる。残りの半分は、一般に、破棄されるかまたはオペレータによって手動で訂正されなければならない多数の誤りを含む。ABIベースコーリングソフトウェアの精度に対する努力および改善する作業が行われた。例えば、Ewing et al., 1998, Genome Res. 8: 175-185は、ABIソフトウェアより低いエラーレートを達成する自動化されたシーケンサトレースに関して、phredと呼ばれるベースコーリングソフトウェアを記載する。Phredは、平均して、読み取り位置、機械動作状況、または配列決定化学構造と無関係に、試験された試験データセットにおけるABIソフトウェアより40パーセントから50パーセント少ないエラーとなる。
【００１４】
上記で識別されたソフトウェアプログラムは、それら自身の権利における重要な完成を示すが、それらは、ヘテロ接合核酸サンプルを満足できるほどうまくベースコールしない。ヘテロ接合ＤＮＡサンプルから得られた各配列決定トレース（例えば、人間のＤＮＡサンプル）は、2つの物理的な染色体への配列決定反応の生成物、母系由来の染色体、および対応する父系由来の染色体である。例えば、人間の染色体IVの領域が配列決定される場合を考慮する。この配列決定反応のために準備されたプライマーは、母系由来の染色体IVおよび父系由来の染色体IVの両方に結合する。したがって、母系由来の父系由来の染色体IVからの核酸配列の混合物が、配列決定される。制御されたマウスクロスからＤＮＡサンプルの場合（親は同系交配であるので、両方の染色体は同一である）とは異なり、母系由来の人間の染色体IVおよび父系由来の人間の染色体IVは、それらが異なるポイントを有する。すなわち、母系由来および父系由来の染色体上で対応する位置で異なる対立遺伝子が存在する染色体における多くのヘテロ接合ポイント（塩基位置）が存在する。母系由来および父系由来の染色体における対応する塩基位置間にヘテロ接合性が存在する各ポイントで、各ヌクレオチド毎に、2個のピークがトレースで発生する。人間において、5,00個から1,000個の塩基毎にほぼ1個が、このヘテロ接合性を有する。従来のベースコーリングソフトウェアは、そのような二重のピークを満足に識別しない。むしろ、そのようなピークは、一般に「読み取れない」として指定される。
【００１５】
ベースコーリングプログラムTraceTuner（Paracel, Pasadena, California）は、ヘテロ接合塩基を検出しかつ認識するある能力を有する。しかしながら、TraceTunerのヘテロ接合塩基認識アルゴリズムは、それらが手動の介在を必要とするので満足できない。したがって、技術は、ヘテロ接合核酸サンプルにおけるヘテロ接合塩基対を自動的に認識する改善されたシステムおよび方法をまだ必要とする。
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、従来技術の欠点を対処する。ヘテロ接合サンプルから収集されたトレース配列データにおける多形性を検出する新規なシステムおよび方法が開示される。ルールベースシステムを使用して、トレース配列データにおける二重ピークが検出され、そのような二重ピークにおける各ピークは、特徴付けられる。特徴付けられた二重ピークに関する情報は、ヘテロ接合トレース配列データからの対にされたホモ接合トレース配列を作成するために使用される。対にされたホモ接合トレース配列データは、次に、ABI配列決定ソフトウェア、Phred、またはTrace-Tunerなどの従来のベースコーリングソフトウェアを使用してベースコールされることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明方法およびシステムは、それらがヘテロ接合ＤＮＡの自動化された配列決定を可能にするために、非常に有利である。これに関して、本発明は、トレースにおける二重ピークの人間の解釈に関する必要性を取り除く。そのような人間の解釈は、その固有の主観的な性質のために誤る傾向がある。本発明の技術を用いて、ヘテロ接合トレースは、ルールベースシステムを使用して自動的に対のホモ接合塩基トレースに変換される。
【００１８】
本発明の技術は、ヘテロ接合核酸サンプルの遺伝子型を決定することに関する広い適用可能性を有する。例えば、特定の疾病の特徴に対する遺伝子ＤＮＡの特定の領域における遺伝子座間の関連性を確認するための1個の知られている技術は、疾病の特徴を研究するために選択されたコホート母集団の各メンバから取られたサンプルからＤＮＡの特定の領域を配列決定することである。このコホート母集団において見出された多形性は、次に、それらが疾病に関連付けられるかどうかを調べるために試験される（個別にまたはハプロタイプの形態で）。そのような関連性の検出は、遺伝子ＤＮＡの対象領域における遺伝子座が、疾病に関連付けられる仮定を確認する。この知られている技術の問題は、必要な関連性研究を実行するために必要となる多形性を識別するための従来の技術が、労働集約的でありかつ高価であることである。そのような多形性は、一般に配列トレースにおける二重ピークとして現れ、従来のベースコーリングソフトウェアは、そのような二重ピークを信頼性良く配列決定する自動化された方法を有さない。したがって、そのようなピークを特徴付け、それによって多形性を識別するために、人間の主観的な介在が必要となる。
【００１９】
本発明は、多形性を識別する主観的で労働集約的なステップを取り除く。本発明のシステムおよび方法を使用して、コホート母集団からのヘテロ接合核酸サンプルが、単一のヌクレオチド多形性（SNP）または多形性の他の形態（マーカ）を識別するために自動的に配列決定されることができる。次に、各これらSNP（または他の形態のマーカ）は、SNP（または他の形態のマーカ）が研究中の疾病と関連するかどうかを決定するために、関連性解析で試験されることができる。関連性研究のコストの大幅な削減に加えて、本発明のシステムおよび方法は、例えば一般的なSNPを見出すこと、診断、および科学捜査などの他の分野で一般に使用されることができる。
【００２０】
明細書および請求の範囲において、複数のトレースを有し、かつクロマトグラムの線形長軸に沿って割り当てられたデータポイントを有するクロマトグラム（例えば図4および図5に示されるような）を参照する。クロマトグラムは、この形態で提供されまたは表されることは必ずしも必要ではなく、また1個のエンティティに組み合わされまたは整列される4個のトレースを含むことも必ずしも必要ではないことを理解されたい。したがって、本発明の最も広い範囲内の「クロマトグラム」は、例えば、位置的指示（すなわち「データポイント」）に関連付けられた（または関連付けられることができる）ヌクレオチド測定値の信号強度を特定するデータファイルを含む。クロマトグラムは、それぞれ1個または複数のヌクレオチドの信号強度を特定する複数の別個のファイルを含むことができ、複数のファイルは、完全なセットを提供するために組み合わされかつ正規化されることができる。信号強度は、好ましくは、検出されたヌクレオチドの濃度に比例するが、正確である必要は無い。
【００２１】
本発明の一実施形態は、複数の実質的に同時のトレースを有する入力核酸クロマトグラムを処理する方法を提供する。方法において、複数のトレースにおける第1のトレースの1個または複数の各それぞれのピークに関して、それぞれのピークにおける最大値を有するデータポイントはマークされる。また、複数のトレースにおける第2のトレースの1個または複数の各それぞれのピークに関して、それぞれのピークにおける最大値を有するデータポイントはマークされる。（i）第1のトレースにおける1個または複数のピークの第1のピークで最大値を有する第1のデータポイント、および（ii）第2のトレースにおける1個または複数のピークの第2のピークで最大値を有する第2のデータポイントから、データポイントの重なり合う閾値数以内にある入力核酸クロマトグラムにおける座標を識別する。最後に、第1のピークは、第1の出力ホモ接合表示に出力され、かつ第2のピークは、第2の出力ホモ接合表示に出力される。ある実施形態において、重なり合う閾値数は、2個のデータポイントから7個のデータポイントの間であり、ある実施形態において、重なり合う閾値数は、3個のデータポイントである。
【００２２】
ある実施形態において、入力クロマトグラムは、ABIトレースファイルフォーマット、SCFファイルフォーマット、ZTRファイルフォーマット、またはALFファイルフォーマットである。ある実施形態において、第1の出力ホモ接合表示および第2の出力ホモ接合表示は、それぞれABIトレースファイルフォーマット、SCFファイルフォーマット、ZTRファイルフォーマット、またはALFファイルフォーマットに書き込まれる。ある実施形態において、座標の周りの所定の領域における入力クロマトグラムでピークの閾値数より多く存在するときに、座標は、別個のクロマトグラムに分割されず、第1のピークおよび第2のピークは、それぞれ第1の出力ホモ接合表示および第2の出力ホモ接合表示に書き込まれる。ある実施形態において、ピークの閾値数は、2個のピークと5個のピークとの間である。ある場合において、所定の範囲は、座標の周りで2個のデータポイントと20のデータポイントとの間である。
【００２３】
ある実施形態において、第1のピークの第1データポイントと第2のピークの第2データポイントとの間の比が、閾値の比の値より大きいとき、第1のピークおよび第2のピークは、それぞれ第1の出力ホモ接合表示および第2の出力ホモ接合表示に書き込まれる。ある場合、閾値の比の値は、少なくとも0.2または少なくとも0.4である。ある実施形態において、第1のピークの第1データポイントと第2のピークの第2データポイントとの間の比が、閾値の比の値より大きいとき、第1のピークおよび第2のピークは、それぞれ第1の出力ホモ接合表示および第2の出力ホモ接合表示に書き込まれる。
【００２４】
ある実施形態において、入力核酸クロマトグラムは、ヘテロ接合核酸サンプルからの核酸配列を表し、方法はさらに、ヘテロ接合核酸サンプルへの挿入または削除のポイントに関して、入力核酸クロマトグラムを走査することを含む。挿入または削除のポイントが見出されたとき、挿入または削除後の全ての領域は、第1の出力ホモ接合表示および第2の出力ホモ接合表示の両方に書き込まれる。ある場合において、挿入または削除に関する走査は、所定の座標の後の複数トレースで発生するピーク数をカウントすることを含む。ピークの数が、挿入/削除の閾値の数を超えると、その座標は、ヘテロ接合核酸サンプルにおける挿入または削除のポイントであることが決定される。ある実施形態において、挿入/削除の閾値の数は25から75の間である。他の実施形態において、挿入/削除の閾値の数は75から200の間である。
【００２５】
ある実施形態において、方法は、入力核酸クロマトグラムにおける複数のピークに関する共通ピークプロファイルを生成し、かつ出力ホモ接合表示を出力する前に、共通ピークプロファイルに対する第1のピークまたは第2のピークを検査することをさらに含む。ある実施形態において、共通ピークプロファイルは、（i）入力核酸クロマトグラムのピークにおけるデータポイントの平均数を決定し、かつ（ii）平均数のデータポイントを有する入力核酸クロマトグラムのピークの全てまたはピークの一部のプロファイルを平均化することによって生成され、それによって共通ピークプロファイルを形成する。ある実施形態において、検査することは、第1のピークまたは第2のピークにおける試験データポイントの値が、誤りパーセンテージだけ、試験データポイントに対応する共通ピークプロファイルにおけるデータポイントの値を超えるかどうかを決定することを含む。ある場合において、誤りパーセンテージは、約0.01と約0.4との間である。ある場合において、誤りパーセンテージは、約0.1である。
【００２６】
本発明の他の態様は、コンピュータシステムとともに使用するためのコンピュータプログラム製品を提供する。コンピュータプログラム製品は、コンピュータ読み取り可能記憶媒体およびそれに埋め込まれたコンピュータプログラム機構を備える。コンピュータプログラム機構は、複数の実質的に同時のトレースを有する入力核酸クロマトグラムを処理することができる。コンピュータプログラム機構は、複数のトレースの第1のトレースにおける各1個または複数のピークに関して、ピークにおける最大値を有するデータポイントをマークする（A）ための指示を含む。コンピュータプログラム機構は、複数のトレースの第2のトレースにおける各1個または複数のピークに関して、ピークの最大値を有するデータポイントをマークする（B）ための指示をさらに含む。コンピュータプログラム機構は、（i）第1のトレースの1個または複数のピークにおける第1のピークに最大値を有する第1のデータポイント、および（ii）第2のトレースの1個または複数のピークにおける第2のピークに最大値を有する第2のデータポイントから、データポイントの重なり合う閾値数以内にある、入力核酸クロマトグラムにおける座標を識別するための指示をさらに含む。コンピュータプログラム機構は、第1の出力源に対する第1のピークの表示、および第2の出力源に対する第2のピークの表示を出力する指示をさらに含む。
【００２７】
本発明のさらに他の態様は、複数の実質的に同時のトレースを有する入力核酸クロマトグラムを処理するコンピュータシステムを提供し、コンピュータシステムは、中央処理ユニットと、中央処理ユニットに結合されたメモリとを備える。メモリは、入力核酸クロマトグラムとプログラムモジュールとを記憶する。プログラムモジュールは、複数のトレースにおける第1のトレースの各1個または複数のピークに関してマークする（A）指示を含み、データポイントは前記ピークにおける最大値を有する。プログラムモジュールは、複数のトレースにおける第2のトレースの各1個または複数のピークに関してマークする（B）指示をさらに含み、データポイントはピークの最大値を有する。プログラムモジュールは、（i）第1のトレースの1個または複数のピークにおける第1のピークに最大値を有する第1のデータポイント、および（ii）第2のトレースの1個または複数のピークにおける第2のピークに最大値を有する第2のデータポイントから、データポイントの重なり合う閾値数以内にある、入力核酸クロマトグラムにおける座標を識別するための指示をさらに含む。プログラムモジュールは、第1の出力源に対する第1のピークの表示、および第2の出力源に対する第2のピークの表示を出力する指示をさらに含む。
【００２８】
本発明のさらに他の態様は、コンピュータシステムとともに使用するためのコンピュータプログラム製品を提供する。コンピュータプログラム製品は、コンピュータ読み取り可能記憶媒体およびそれに埋め込まれたコンピュータプログラム機構を備える。コンピュータプログラム機構は、複数のトレースを有する入力核酸クロマトグラムを処理する。コンピュータプログラム機構は、トレース分割ルーチンを備える。トレース分割ルーチンは、第1の出力ホモ接合表示に対する入力核酸クロマトグラムにおける第1のトレースからの第1のピークを出力し、かつ第2の出力ホモ接合表示に対する、第1のピークに対応するデータポイントで入力クロマトグラムにおける第2のトレースにおいて生じる第2のピークを出力する指示を含む。ある実施形態において、入力核酸クロマトグラムにおける座標が、第1のピークに最大値を有する第1のデータポイント、および（ii）第2のピークに最大値を有する第2のデータポイントから、データポイントの重なり合う閾値数以内にあるときに、第2のピークは、第1のピークに対応する。ある実施形態において、重なり合う閾値数は、2個のデータポイントと7個のデータポイントとの間である。
【００２９】
同様の参照符号は、いくつかの図面の図を通じて対応する部品を参照する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、ヘテロ接合核酸配列クロマトグラムを配列決定するための処理の自動化することに向けられる。ルールベースシステムが、そのようなクロマトグラムを解釈するために使用される。各入力ヘテロ接合クロマトグラムに関して、2個の出力ホモ接合表示が作られる。二重ピークが、入力クロマトグラムに見出された場合に、本発明のシステムおよび方法は、ピークの1個を第1のホモ接合表示に配置し、かつ第2のピークを第2のホモ接合表示に配置する。このように、ホモ接合表示（例えば、2個のホモ接合クロマトグラムまたは2個のホモ配列）は、人間の主観的な介在の必要性なく各入力ヘテロ接合クロマトグラムを自動的に作る。したがって、本発明の方法は、多形性をヘテロ接合核酸トレーシングにおいて検出することができるため、効率が大幅に向上する。そのように、本発明の方法は、例えば多形性を見出すこと（例えば、シングルヌクレオチド多形性を見出すこと）、関連性解析、診断、および科学捜査などのいくつかの分野に広い適用性を有する。
【００３１】
図1は、ヘテロ接合核酸配列クロマトグラムにおける多形性を検出しかつ特徴付けるためのシステム10を示す。システム10は、好ましくは以下を含む。すなわち、
中央処理ユニット22と、
ストレージコントローラ28によって任意に制御される、ソフトウェアおよびデータを記憶するための、例えばハードディスクドライブなどのメイン不揮発性ストレージユニット30と、
不揮発性ストレージユニット28からロードされたプログラムおよびデータを含む、システム制御プログラム、データ、およびアプリケーションプログラムを記憶するための、好ましくは高速ランダムアクセスメモリ（RAM）であるシステムメモリ24であり、システムメモリ24は、リードオンリメモリ（ROM）を含んでもよい、システムメモリ24と、
1個または複数の入力デバイス（例えば、キーボード8、マウス36）、およびディスプレイ38または他の出力デバイスを含む、ユーザインタフェース26と、
任意に、任意の有線または無線通信ネットワークに、および/またはシーケンサ（図示せず）に接続するためのネットワークインタフェースカード39と、
システムの前述の要素に相互接続するための内部バス34とである。
【００３２】
システム10の動作は、中央処理ユニット22によって実行されるオペレーティングシステム40によって主に制御される。オペレーティングシステム40は、システムメモリ24に記憶されることができる。一般的な実装において、システムメモリ24は、以下を含む。すなわち、
オペレーティングシステム40と、
本発明によって使用される様々なファイルおよびデータ構造へのアクセスを制御するためのファイルシステム42と、
ヘテロ接合入力クロマトグラム46を2個のホモ接合出力表示（例えば、それぞれクロマトグラム52Aおよび52B）に分割するためのSplit_traceメインモジュール44とである。
【００３３】
Split_traceメインモジュール44は、入力クロマトグラム46を読み取り、かつ本発明による新規な方法を使用して出力ホモ接合表示（例えば、クロマトグラム52Aおよび52B）にそれを分割する。一般に、ＤＮＡ断片は、蛍光染料で標識付けられ、かつ4個の異なるヌクレオチドが、4個の異なる染料で標識付けられる。これらの標識付けられたＤＮＡ断片は、毛管を通過し、その間に蛍光検出器は、各蛍光染料のための毛管に沿って蛍光信号を読み取り、毛管に沿った座標で毎回、それぞれ4個の可能性があるヌクレオチドの1個に対応する読み取りである、4個の異なる蛍光信号読み取りがある。したがって、入力クロマトグラム46は、蛍光信号読み取り（トレース）の4個のアレイを含み、すなわちトレース1（48-1）、トレース2（48-2）、トレース3（48-3）、およびトレース4（48-4）であり、各トレースは、4個の可能性があるヌクレオチド（アデノシン、チミン、シトシン、グアニン）の1個を一意に表す。
【００３４】
図1に示される実施形態において、Split_traceメインモジュール44は、多数のサブルーチン（サブモジュール）を含む。これらサブモジュールは、それぞれトレース48-1、48-2、48-3、および48-4を走査する走査トレースモジュール56を含み、ピーク位置およびこれら各トレースにおけるピーク期間を決定する。トレース48は、複数のデータポイントおよびそのような各データポイントの強度値を含む。各トレースは、一般に数千のデータポイントからなる。各トレース48に関して、データ構造によって表されるトレースにおける各データポイントにの状態値を格納する、対応するトレース状態データ構造50が存在する。Split_traceメインモジュール44は、さらにmark_valid_peak_rangeルーチン62をさらに含み、mark_valid_peak_rangeルーチン62は、（i）入力クロマトグラム46における4個のトレースの質を評価し、（ii）許容可能なデータの始まりを示すこれらトレースにおける初期データポイントをマークし、かつ（iii）許容可能なデータの終わりを示すこれらトレースにおける最終データポイントをマークする。Split_traceメインモジュール44は、各走査におけるピークに関する共通ピークプロファイルを構築するためのプロファイルルーチンモジュール64をさらに含む。そのようなプロファイルは、例えば、隣接するピークとの重なり合いのために見失われている重なり合う二重ピークの部分を再構成するために使用される。Split_traceメインモジュール44は、さらに、入力トレース48における平均バックグラウンドを計算するためのcalc_avg_backgroud_peakルーチン66、ならびにホモ接合出力のホモ表示（例えば、クロマトグラム52Aおよび52B）書き出すためのトレース分割ルーチン68を含む。
【００３５】
図2は、本発明の例示的な実施形態による、ヘテロ接合入力クロマトグラム46を2個の出力ホモ接合表示（例えば、クロマトグラム52Aおよび52B）に分割する方法を示す。本発明の一実施形態によれば、図2に示されるステップは、モジュール44によって呼び出される様々なルーチンに関連するsplit_traceメインモジュール44によって実行される。
【００３６】
ステップ202。ステップ202において、入力クロマトグラム46が読み出される。入力クロマトグラム46は、4個の可能な塩基を区別するために4個の異なる色の染料または蛍光タグを使用する任意のシーケンサから読み出されることができる。例示的なシーケンサは、以下の表2に列挙されたシーケンサを含むが、これらに限定されない。
【表１】
2006084471.tif 000003
【００３７】
入力クロマトグラム46は、クロマトグラムトレース強度を提供する任意の種類のデータフォーマットである。一般に、入力クロマトグラム46は、トレース強度と、塩基コールと、それらの信頼値と、任意のテキストデータとを含み、任意のテキストデータは、その化学構造、配列決定の機械タイプ、および動作状態など特定の配列決定実験に関する。個別のトレースファイルとともに共通テキストデータのリストは、Biotechnology InformationトレースレポジトリのためのNational Center（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces）で提供される。
【００３８】
一実施形態において、入力クロマトグラムは、ABI 377ファイルフォーマットにおけるトレースファイルなどのABIトレースファイルである。ABI 377ファイルフォーマットの記載に関して、「Raw Data File Format, and Digital and Analog Raw Data Streams of the ABI PRISM 377 ＤＮＡ Sequencer」Clark Tibbetts, www-2.c2.cmu.edu/afs/cs/project/www/Papers,clark.htmlを参照されたい。ある実施形態において、入力クロマトグラム46は、SCFフォーマットである。SCFフォーマットにされたファイルは、単一の読み取りに関するデータを含み、かつそのトレースサンプルポイント、そのコールされた配列、トレースサンプルポイントに対する塩基の位置、および各塩基の精度の数値推定値を含む。SCFファイルフォーマットは、機械とは独立であり、このファイルフォーマットのバージョンは、DearおよびStaden, 1992, ＤＮＡ Sequence 3: 107-110に記載される。
【００３９】
ある実施形態において、入力クロマトグラム46は、ZTR圧縮されたファイルフォーマットである。ZTRファイルフォーマットに関するさらなる情報に関して、Bonfield et al., 1995 Nucleic Acids Res. 23: 4992-99を参照されたい。ある実施形態において、入力クロマトグラム46は、ALFフォーマットされたファイルである。ALFは、シーケンサからの配列情報を格納するためにAmersham Pharmacia Biotech （Uppsala, Sweden）によって開発されたファイルフォーマットである。
【００４０】
入力クロマトグラム46の特定のファイルフォーマットに関わらず、クロマトグラム内の各4個のトレースは、データ構造48-1、48-2、48-3、および48-4（図1）にそれぞれ分割される。最小でもトレース48は、一連のデータポイントおよび各データポイントの強度を含む。理想的には、対象の核酸（配列決定される核酸）における各塩基は、各4個のトレースにおける単一のデータポイントによって表される。各トレース48-1、48-2、48-3、および48-4におけるデータポイントは、それらが対象の核酸配列における同一の塩基位置を表すなら、対応すると言われる。所定のトレース48における各データポイントに関して、データポイントによって表される位置での所定のトレース48に対応する染料の強度の表示が存在する。図3の上方パネルにおいて、トレース48-1および48-2に関する例示的なデータは、10個の対応するデータポイントおよびそれらのそれぞれの強度値を含む。図3Aの上方パネルにおける各行は、入力クロマトグラム46のデータポイントまたは座標と考えることができる。
【００４１】
一般に、配列決定される核酸は、（i）ヘテロ接合ではなく、また（ii）ヘテロ接合であるが対応する母系および父系の染色体が同一である有機体から取られた場合、トレースにおける4個の対応するデータポイントの1個だけが、「ピーク」として表わされる。しかしながら、図3の上方パネルにおけるデータポイント数6によって示されるように、ヘテロ接合ＤＮＡが配列決定される場合、母系由来のおよび父系由来の染色体が、同じ塩基対を有さないデータポイントが存在し、したがって4個のトレースの2個は、この誤った組み合わせの塩基対を表すデータポイントで「ピーク」を示す。例えば、人間の染色体3上の領域が配列決定される場合を考慮する。ヘテロ接合ＤＮＡサンプルの場合において、母系由来の染色体3上の任意の塩基位置229が塩基「G」を有することが可能であり、一方、父系由来の染色体3上の対応する塩基位置は、塩基「C」を有する。塩基位置が配列決定されたとき、塩基「G」の染料を表すトレースにおけるデータポイントと、塩基「C」の染料を表すトレースにおけるデータポイントとの両方は、ピークを示す。この状況は、図4に示されている。図4のクロマトグラム402において、位置229（ボックス408）は、二重のピークを含む。したがって、クロマトグラム402が読み取られたとき、2個の異なるトレース48のデータポイント229は、ピークを含む。図2における残りのステップは、そのような二重ピークが、どのように分析されかつホモ接合「娘」染色体52に分割されることができるかを示し、ホモ接合「娘」染色体52は、次に主観的な人間の解釈の必要なしに自動的に配列決定されることができる。
【００４２】
ステップ204。ステップ204において、各4個のトレース48は、走査トレースモジュール56を使用して走査される。走査トレースモジュール56は、peak_sizeルーチン58およびis_peakルーチン60の2個のルーチンを含む。peak_sizeルーチン58は、各トレース48における最良の共通ピーク期間を決定することを助ける。ルーチン58は、それがピークの始まりであるかどうかを知るために、トレース48における各データポイントを評価することによってこのタスクを達成する。peak_sizeルーチン58が、トレース48における所定のデータポイントがピークの始まりであることを決定するなら、次にルーチンは、どれだけ多くのデータポイントがピークにあるかどうかを決定し、データポイントのこの数は、トレース48を表す対応するトレース状態データ構造50で記録される。図3の上方パネルを示す。両方のトレース48-1および48-2において、6個のデータポイントに及ぶピークは、4個の数のデータポイントで始まる。peak_sizeルーチン58は、このピークを検出し、ピークにおけるデータポイント数をカウントし、かつ、それぞれのトレース（それぞれトレース状態アレイ50-1および50-2）に一意に対応するトレース状態アレイ50におけるデータポイント4を表すデータ要素（ピークの始まり）にデータポイントピークカウントを格納する。各トレース48における最良の共通ピーク期間に関する情報は、以降split_traceメインモジュール44によって使用され、適切にトレース48を特徴付け、かつそのようなトレースにおける二重ピークを探す。
【００４３】
peak_sizeルーチン58は、ピーク期間を決定するように指示され、is_peakルーチン60は、各ピークの最大値、すなわちピーク位置または強度を正確に識別するように指示される。is_peakルーチン60は、各4個のトレース48における各データポイントを評価する。各そのようなデータポイントに関して、is_peakルーチン60は、データポイントがピークの最大値であるかどうかを決定する。最大値であれば、is_peakルーチン60は、データポイントに状態「TRACE_STATUS_PEAK」を割り当てる。そうでなければ、is_peakルーチン60は、データポイントに状態「TRACE_STATUS_NOTHING」を割り当てる。再び図3の上方パネルを示す。図3において、is_peakルーチン60は、走査48-1および48-2におけるピークではない各データポイントに値「NP」を割り当て、値「NP」は、データポイントがピークでなければTRACE_STATUS_NOTHINGと等価である。さらに、is_peakルーチン60は、トレース48-1および48-2におけるデータポイント6で発生のピークに値「PE」を割り当て、値「PE」は、TRACE_STATUS_PEAKと等価である。これらの指定は、以降の処理ステップでsplit_traceメインモジュール44によって使用される。
【００４４】
ステップ206。一般的なシーケンサによって生成されたトレース48において、トレースの始まりおよび終わりでのデータポイントの質は、一般に信頼性が無い。したがって、ステップ206において、mark_valid_peak_rangeルーチン62は、信頼性があるデータが始まる所定のトレース48における初期ポイントをマークし、信頼性があるデータが終わる所定のトレース48における最終ポイントをマークする。ある実施形態において、mark_valid_peak_rangeルーチン62は、トレースにおけるデータポイントの初期の所定数を自動的に無視することによって（IGNORE_DATA_INDEX）、所定のトレースの有効ピーク範囲の始まりを見出す。次に、ルーチン62は、データポイントの初期の所定数が破棄された後、発生するためのIGNORE_START_PEAK_NUMピークを探す。例えば、IGNORE_DATA_INDEXが50であり、かつIGNORE_START_PEAK_NUMが10であれば、mark_valid_peak_rangeルーチン62は、第1の50個のデータポイントを破棄し、次に、第1の50個のデータポイントが破棄された後、発生する10番目のピークを探す。ルーチン62は、適切なトレース状態データ構造50における「TRACE_STATUS_PEAK」指定を探すことによってピークを識別する。そのようなピーク指定が、上記処理ステップ204においてis_peakルーチン60によって行われることを思い出されたい。破棄されるデータポイント（IGNORE_DATA_INDEX）およびピーク（IGNORE_START_PEAK_NUM）の初期数が、ユーザ定義されることができる。一例において、0個と300個との間の初期データポイントが、破棄され、0個と25個との間の初期ピークが、有効ピークの始まりをマークするために破棄される。
【００４５】
有効ピーク範囲における最後のピークを識別するために使用される方法は、最初の有効ピークを識別するために使用されるプロセスと全く同じ方法で作用する。各走査における末端データポイントの所定数が無視される。次に、ルーチン62は、所定数のピーク（IGNORE_END_PEAK_NUM）が破棄されるまで、各走査の末端端部からのピークをカウントする（ピークを無視した末端を除く）。例えば、IGNORE_DATA_INDEXが50であり、かつIGNORE_END_PEAK_NUMが10である場合に、最後の50個のデータポイントが無視され、次に最後の50個のデータポイントを除いて走査の終わりの10番目のピークは、有効データ範囲の末端端部として指定される。所定のトレース58の有効範囲の終わりを探すために破棄される、データポイント（IGNORE_DATA_INDEX）およびピーク（IGNORE_END_PEAK_NUM）の末端数は、ユーザ定義されることができる。一例において、0個と300個との間の最終データポイントが、破棄され、0個と25個との間の最終ピークが、有効ピークデータの終わりをマークするために破棄される。
【００４６】
ステップ208。ステップ208において、プロファイルルーチン64は、4個のトレースにおいて見出されたピークに関する最良の共通ピーク期間を第1に決定する。本明細書で、用語「ピーク期間」は、ピーク内にあるデータポイント数を意味する。したがって、ステップ208の第1の目的は、トレース48のピークに関する最良の共通ピーク期間を識別することである。これは、状態データ構造50における情報を使用して達成される。ステップ204において、ピークサイズルーチン58が、トレース48における各ピークに関するピーク期間を識別し、対応する状態データ構造50における各そのようなピークの始まりにこの情報を配置することを思い出されたい。ステップ208において、このピーク期間情報は、最良の共通ピーク期間を識別するためにレビューされる。ある実施形態において、最小ピーク期間（例えば10個のデータポイント）より小さい、または最大ピーク期間（例えば50個のデータポイント）より大きいピークは、最良の共通ピーク期間を決定するときに無視される。
【００４７】
最良の共通ピーク期間を見出す目的は、この最良の共通ピーク期間を有するプロファイルが作られることができるようにすることである。このプロファイルは、二重ピークから再構成される単一のピークが、モデルプロファイルからあまりに大きく外れないことを確実にするために、以降の処理ステップで使用される。当業者は、モデルピークプロファイルを開発する多くの異なる方法が存在し、かつ全てのそのような方法が、本発明の範囲内であることを理解する。一実施形態において、最良の共通間隔であるピーク期間を有する4個のトレース58における各ピークは、モデルピークプロファイルを形成するためにともに平均化される。換言すれば、プロファイルは、最良の共通ピーク期間を有する4個のトレース48における各ピークの複合物を表す。ある実施形態において、この複合物は、max_valueによって複合物ピークにおける各データポイントを除算することによって正規化され、max_valueは、最大値を有する複合物ピークにおけるデータポイントの強度値である。そのような正規化プロセスに対する代替は多数ある。例えば、ある実施形態において、各トレース48に関する最良の共通ピーク期間は無関係に決定され、かつプロファイルは、各トレース48に関して無関係に開発される。ある実施形態において、プロファイルは、最良の共通ピーク期間だけでなく、最良の共通ピーク期間よりわずかに小さいまたはわずかに大きいピーク期間を開発する。ある実施形態において、プロファイルするために選択されたピークが、他のピークと重なり合わないこと、およびそれがピークをプロファイルするために使用される前に、ピークが二重ピークではないことを確実にするために検査が行われる。すなわち、ピークは、他の各トレース48における対応するデータポイントは、自身がピークではない場合だけをプロファイルするために選択される。
【００４８】
ステップ210。ステップ210において、入力クロマトグラム46におけるピークに関する平均バックグラウンドが決定される。これは、以下のアルゴリズムを使用して行われる。すなわち
100 データポイントの有効範囲における各データポイントiに関して{
102     各トレース48{
104         データポイントiがピークであれば、{
106             それを各他のトレース48における対応する最大ピーク値と比較し、他
のトレースにおける対応するピークがより大きいなら、平均バックグラ
ウンドカウントにピークiを追加し、1個だけカウントにおけるピーク数
を増分し、
}
}
}
108 バックグラウンドカウントに寄与するピーク数によって、バックグラウンドカウン
トを平均化する。
【００４９】
本質的に、このアルゴリズムは、上記ステップ204（ライン100および102）において、TRACE_STATUS_PEAK（PE）として標識付けられたデータポイントを識別することによって作用する。そのようなデータポイント（試験データポイント）が、トレース48の一方（ライン104）において見出されるとき、それは、各残りのトレースにおける対応するピークと比較される。試験データポイントが、対応するピークの一方の値より小さい値を有するなら、ピークがバックグラウンドであることが仮定され、かつその値が平均バックグラウンドカウント（ライン106）に追加される。ある実施形態において、試験データポイントは、MIN_OVERLAP_PEAK_RATIOによって乗算された対応するピークの値より小さい値を有さなければならない。換言すれば、
試験データポイント<（corresponding_peak_in_other_trace*MIN_OVERLAP_RATIO）
ここで、MIN_OVERLAP_RATIOは、ピークの一方が単にバックグラウンドであり、かつ他方のピークが塩基信号である場合と対立するものとして、2個のピークが重なり合うことを考慮するために必要となる、2個の重なり合うピークの最大値間の最小の比率である。ある実施形態において、MIN_OVERLAP_PEAK_RATIOは0.6である。これは、入力クロマトグラム46において重なり合うピークが存在するなら、それらは、より小さいピークが、より大きいピークの最大値の少なくとも60%である最大値を有するなら、重なり合うとして取り扱われる。別の方法では、この状態が合わないなら、より小さいピークは、上記で示されたライン102から108のアルゴリズムによってバックグラウンドとしてカウントされる。
【００５０】
アルゴリズムは、許可されたデータポイントの範囲内で各データポイントに関して繰り返される。平均バックグラウンドカウントは、平均バックグラウンドカウント値を生得るために、平均バックグラウンドカウントに寄与するバックグラウンドピーク数によって除算される。ある実施形態において、ステップ210は、calc_avg_background_peak_routine66によって実行される。
【００５１】
ステップ212。ステップ212において、トレースデータ構造50は、4個の構造の少なくとも2個の構造が、座標のMAP_OVERLAP_PEAK_GAP内にピークを示す座標（データポイント）を識別するために走査される。換言すれば、（毛管を使用するシーケンサにおいて）シーケンサの毛管に沿ったほぼ同一の座標で、ピークが4個の蛍光信号走査の少なくとも2個で検出されるときに、重なり合うピークが生じる。そのような座標は、重なり合うピークに関する候補である。
【００５２】
ある実施形態において、第1のピークにおける最大値を有するデータポイントが、第2のピークにおける最大値を有するデータポイントから閾値のデータポイント数以内であるときに、第1の走査における第1のピークは、入力クロマトグラム46における第2の走査の第2のピークと重なり合うと考えられる。換言すれば、ステップ212は、（i）クロマトグラム46における第1のトレース48の第1のピークの最大値を有するデータポイント、および（ii）クロマトグラム46における第2のトレース48の第2のピークの最大値を有するデータポイントから、データポイントの重なり合う閾値数以内である入力クロマトグラム46における座標を識別しようとする。好ましい実施形態において、この重なり合う閾値数は、3個のデータポイントである。すなわち、第1および第2のピークに最大値を有するデータポイントは、（毛管を使用するシーケンサにおいて）シーケンサの毛管に沿った座標で互いに3個のデータポイント以内になければならない。他の実施形態において、重なり合う閾値数は、1個のデータポイント、2個のデータポイント、4個のデータポイント、2個のデータポイントと7個のデータポイントとの間、8個以上のデータポイント、または25個の以下のデータポイントである。
【００５３】
以降の処理ステップは、ルールの数が満足されるかどうかを見るために、この処理ステップで識別される座標を試験する。座標がそのようなルールに実際に従うなら、重なり合う各2個のピークで最大値を有するデータポイントは、TRACE_STATUS_OVERLAP_PEAKとして標識付けられ、2個のピークが、別個の出力クロマトグラムファイル52に最終的に分割されるか、またはピークが、ベースコーリングされ、ピークのヌクレオチド表示が、別個のホモ接合配列に書き込まれる。一般的な実施形態において、入力クロマトグラム46における座標は、それらが重なり合うピークを含むかどうかを見るために、クロマトグラムにおける許容データポイントの1個の端部から始めて、線形に、ステップ212の連続的なインスタンスによって調べられる。重なり合うピークが座標で見出されるとき、プロセス制御は、ステップ216に進む。
【００５４】
ステップ216。ある例において、重なり合うピークは、入力クロマトグラム46におけるピークがあまりにも詰まっているときに、人為的に引き起こされる。したがって、本発明のある実施形態において、重なり合うピークの識別された対の周りの領域は、領域におけるあまりにも多くのピークが存在するかどうかを決定するために調べられる。換言すれば、決定は、ステップ212の最後のインスタンスで識別された座標の周りの所定の領域において、入力クロマトグラム46のピークの閾値数より多く存在するかどうかについて行われる。そのようなピークが閾値数より多く存在するとき、ステップ212の最後のインスタンスで識別された重なり合うピークは、分割されず、それらは、最終的に両方の出力ホモ接合表示に対して書き込まれる。
【００５５】
2個のパラメータが、一般的に処理ステップ216において使用される。すなわち（i）ウインドウサイズと、（ii）ウインドウサイズで許容されるピークの最大数とである。例えば、ウインドウサイズが7であり、かつこのウインドウで許容されるピークの最大数が3である場合を考える。ステップ216において、ステップ212の最後のインスタンスで選択された座標、およびこの座標に先行する3個のデータポイントならびにこの座標に後続する3個のデータポイントは、全ての4個のトレース48（7×4=28データポイントの全体に関して）で調べられ、これら領域におけるピーク数が合計される。ピークの数が3を超えるなら（216-はい）、プロセス制御はステップ218に進み、ステップ218で、検査される領域における各ピークは、詰まっているとしてフラグ付けられ、この領域におけるピークは、異なる出力ホモ接合表示に分割されない。この領域におけるピークの数が、3以下であるなら（216-いいえ）、ピークは、詰まっているとしてフラグ付けられない。
【００５６】
異なるウインドウサイズ、およびそのようなウインドウサイズにおける最大の許容可能なピーク閾値が、使用されることができることが理解される。ある実施形態において、ステップ216で検査されるウインドウサイズは、4個のデータポイントと8個のデータポイントの間であり、5個のデータポイントと10個のデータポイントの間であり、2個のデータポイントと20のデータポイントの間であり、20個より多いデータポイントまたは50個より少ないデータポイントである。ある実施形態において、ステップ216において適用されるウインドウにおけるピークの最大の許容可能な数は、2個のピーク、3個のピーク、4個のピーク、5個のピーク、2個のピークと5個のピークの間、5個のピークと10個のピークの間、10個より多いピーク、または50個より少ないピークである。
【００５７】
ステップ218。ステップ212の最後のインスタンスで識別された重なり合うピークが、ピークがともにあまりにも詰まっているクロマトグラム46の領域にあると決定が行われたときに、プロセス制御は、ステップ218に進む。したがって、確実に誤った測定を妨げるために、そのようなピークは、詰まっているとフラグが付けられ、もはやピークと考えられない。そのような詰まった領域における強度は、両方の出力ホモ接合表示（例えば、クロマトグラム52Aおよび52B）に書き込まれる。詰まっているピークが、詰まっているとフラグが付けられ、プロセス制御は、以下のステップ234に進む。
【００５８】
ステップ220-224。ヘテロ接合ＤＮＡサンプルにおける各2個の染色体からのＤＮＡは、等しくあるべきであるが、重なり合うピークの最大値は、同一であると限らない。染料の量、隣接の干渉などの多くの要因は、最大ピーク値に影響を及ぼす。したがって、異なる強度を有する重なり合うピークのある程度の余裕が存在する。ある実施形態において、許容される余裕の量は、2個の重なり合うピークの小さい方のピークが、クリーンでありかつ完全であるかどうかに応じる。小さい方のピークが、クリーンでありかつ完全である（220-はい）なら、第1の（小さい方の）ピークと第2の（大きい方の）ピークとの間の比は、本発明の一実施形態において0.2ほど小さいことができる（ステップ222）。ある実施形態において、小さい方のピークが、クリーンでありかつ完全であるときの最小の許容可能な比が、0.1と0.95との間である。より好ましい実施形態において、最小の許容可能な比は、少なくとも0.2または少なくとも0.4である。
【００５９】
2個の重なり合うピークの小さい方のピークが、クリーンでなくかつ完全でない（220-いいえ）なら、第1のピークと第2のピークとの間の比は、本発明の一実施形態において0.6ほど小さいだけであり得る（ステップ224）。ある実施形態において、小さい方のピークが、クリーンでなくかつ完全でないときの最小の許容可能な比が、0.1と0.95との間である。より好ましい実施形態において、最小の許容可能な比は、少なくとも0.2である。さらにより好ましい実施形態において、最小の許容可能な比は、約0.2と約0.6との間である。
【００６０】
ステップ218。重なり合うピークが、状態220から224を満足することに失敗するなら（222-いいえ、または224-いいえ）、プロセス制御は、ピークが擬似的に重なり合うピークとしてラベル付けられるステップ228に進む。擬似的に重なり合うピークは、別個のクロマトグラムに分割されるより、以降の処理ステップにおいて各ホモ接合表示（例えば、出力クロマトグラム52）に書き込まれる。ピークが、擬似的に重なり合うとしてフラグが付けられるなら、プロセス制御は、以下のステップ234へ進む。
【００６１】
ステップ232。重なり合うピークが、状態220から224を満足するなら（222-はい、または224-はい）、プロセス制御は、ピークが重なり合うピーク（TRACE_STATUS_OVERLAP_SPLITTED）としてラベル付けられるステップ232へ進む。重なり合うピークは、以降の処理ステップにおいて別個のクロマトグラム52に書き込まれる。ある実施形態においては、重なり合うピークは、重なり合うピークとして指定されるために、追加のルールを満足しなければならない。例えば、ある実施形態において、2個のピークの小さい方のピークが、重なり合うピークが重なり合うとして指定されるために、ある閾値バックグラウンドレベルより大きくなければならない。2個のピークの小さい方のピークが、この要件を満足しないなら、ピークは、擬似的に重なり合うピークとしてラベル付けられ、それらは、別個の出力ホモ接合表示（例えば、クロマトグラムファイル52）に分割されない。
【００６２】
ステップ234。ステップ234において、入力クロマトグラム46の有効な領域全体が、重なり合うピークに関して検査されたかどうかの決定が行われる。そうでなければ（234-いいえ）、候補の重なり合うピークが存在する他の座標を見出すために、プロセス制御はステップ212へ戻って進む。次に、ステップ216からステップ234は、詰まっているピーク（ピークがあまりにも詰まっている）、擬似的に重なり合う（ピークは、比またはバックグラウンド要件を満たさない）、または重なり合うピークとして、候補の重なり合うピークにラベルを付けるかどうかを決定するために、新たな候補の重なり合うピークについて繰り返される。一般的に、ステップ212の連続するインスタンスは、全ての有効なデータポイントが試験されるまで、クロマトグラムの一方の端部から他方の端部へ進む線形の順に入力クロマトグラム46から重なり合うピークの座標を検索する。しかしながら、本発明は、そのようなアプローチに限定されず、実際に、ステップ212の連続するインスタンスにおける重なり合うデータポイントを得るための任意のアプローチは、重なり合うピークの全てまたは重なり合うピークの一部が、ステップ216からステップ234で試験される限り従うことができる。
【００６３】
ステップ236。全ての候補の重なり合うピークが、擬似的に重なり合う、詰まっている、または重なり合う（234-はい）としてラベルが付けられると、入力クロマトグラム46全体にわたって新たなループが、挿入または削除が存在するかどうかを決定するために実行される。トレース48は、挿入または削除が2個の染色体の一方で始まる座標で始まる、擬似的に重なり合うまたは重なり合うとしてマークされた多数のピークを有する。さらに、染色体は、挿入または削除のポイントの後でもはや整列されないので、トレース48において、対応する染色体が適切に整列されたなら一般的に見出されるはずのものより多くのピークが存在することになる。この状態は、図5に示される。図5において、挿入は、配列であるヘテロ接合核酸の座標166で現れる。したがって、座標166から、入力クロマトグラム（ボックス508）において多数のピークが存在する。
【００６４】
ステップ236において、クロマトグラム46におけるデータポイントiが、選択されかつその後処理ステップ238で試験される。
【００６５】
ステップ238。ステップ238は、ステップ236の最後のインスタンスで識別される座標は、実際に、ヘテロ接合核酸サンプルにおける2個の対応する染色体の一方の染色体の挿入または削除の始まりではないことを確実にするために調べられる。本発明のある実施形態において、挿入/削除を調べることは、2つの異なる試験を使用して達成される。第1の試験において、決定は、ステップ236の最後のインスタンスにおいて選択された座標i（データポイント）で始まる入力クロマトグラム46に残る（または、入力クロマトグラム46の所定の領域にある）ピーク数が、閾値数のピークを超えるかどうかの決定が行われる。そうであれば（238-はい）、プロセス制御は、データポイントiに続く各ピークが、重なり合わないピークとしてマークされるステップ240へ進む。ある実施形態において、入力クロマトグラム46の残りで許容されるピークの閾値数は、25から75の間、50から100の間、75から200の間、150から400の間、または500より大きい。
【００６６】
ヘテロ接合核酸サンプルにおける挿入および削除を検出するために使用される第2の試験は、入力クロマトグラム46の残り（ステップ236の最後のインスタンスにおいて識別されたデータポイントiに続く入力クロマトグラムのあるウインドウ）で見出されるピークのタイプを考慮する。重なり合う（または擬似的に重なり合う）入力クロマトグラム46の残りにおける全ピーク数のパーセンテージが、閾値パーセンテージを超えるなら（238-はい）、プロセス制御はステップ240へ進む。ある実施形態において、この閾値パーセンテージは、2パーセントと90パーセントとの間である。より好ましい実施形態において、この閾値パーセンテージは、10パーセントと50パーセントとの間である。さらに他の実施形態において、この閾値パーセンテージは、20パーセントと40パーセントとの間である。ある好ましい実施形態において、閾値パーセンテージは、25パーセントである。
【００６７】
ステップ240。染色体の挿入または削除が、入力クロマトグラム46における座標（データポイント）iで検出されたときに、プロセス制御はステップ240へ進む。この場合に、前に重なり合うとして識別された重なり合うピークの各セットは、ステップ240において重なり合わないピークとしてマークされる。削除または挿入が第1に検出されたポイントからの入力クロマトグラムの全てのデータが、両方のクロマトグラムファイル52Aおよび52Bに書き込まれるように、これは行われる。本発明のある実施形態において、削除または挿入は、識別されかつフラグが付けられる。次に、挿入および/または削除が、考慮された後で染色体を再整列し、かつ図2に概略が示される技術を使用して再整列された配列における重なり合うピークをフラグ付ける試みが行われる。
【００６８】
ステップ242。染色体の挿入または削除が、データポイントiで検出されないなら（238-いいえ）、入力クロマトグラム46における全てのデータポイントiが評価されたかどうかの決定が行われる（ステップ242）。そうであれば（242-はい）、プロセス制御は、ステップ244へ進む。そうでなければ（242-いいえ）、プロセス制御は、一般的に入力クロマトグラム46における連続する次のデータポイントiが選択されるステップ236へ戻って進む。
【００６９】
ステップ244。ヘテロ接合核酸サンプルの場合に、検出された信号は、両方の染色体からのＤＮＡによって寄与され、ホモ接合（重なり合う）ピークは、通常ヘテロ接合ピークより大きな値を有する。ステップ244は、各ホモ接合ピーク（重なり合うとしてマークされた各ピーク）を定数で乗算することによってこの現象を訂正する。一般に、この定数はファクタ2である。ある実施形態において、定数は、約1.1と約3.2の間の範囲である。
【００７０】
ステップ246。重なり合う不完全なピークへの隣接するピークの影響は、ステップ246で考慮される。より多くのMAX_PEAK_ERRORだけ、ステップ208（図2A）でモデル化された共通ピークプロファイルを超える重なり合うピークにおける各データポイントに関して、データポイントの値は、共通ピークプロファイルによって定められた値に低減される。好ましい実施形態において、MAX_PEAK_ERRORは0.1である。ある実施形態において、MAX_PEAK_ERRORは0.01から0.4の範囲である。したがって、ステップ246は、それらのプロファイルが、ステップ208で作成された共通ピークプロファイルからそれ程大きく外れないことを確実にすることによって、トレース48における重なり合うピークを訂正する作用を有する。
【００７１】
ステップ248。ステップ248において、クロマトグラム52Aおよび52Bが生成される。TRACE_STATUS_OVERLAP_PEAK_SPLITTED（すなわち、うまく重なり合うとしてフラグ付けられたままである各ピーク）としてフラグ付けられた各位置に関して、重なり合うピークの一方は、クロマトグラム52Aおよび52Bの一方に書き込まれ、重なり合うピークの他方は、トレース分割ルーチン68によってクロマトグラム52Aおよび52Bの他方に書き込まれる。ある実施形態において、クロマトグラム52Aおよび52Bは、ABIトレースファイルフォーマット、SCFファイルフォーマット、ZTRファイルフォーマット、またはALFファイルフォーマットで生成される。
【００７２】
図3はステップ248を示す。図3の上方パネルにおいて、トレース48-1および48-2における座標6に中心合わせされた重なり合うピークが存在することが明らかである。これらのピークが、図2に示される試験を満足し、かつ重なり合うとしてラベル付けられるようになると仮定すれば、それらは、2個の異なる出力ホモ接合表示（例えば、クロマトグラム54）に分割される。例示的な出力ホモ接合表示である出力クロマトグラム52が、図3の下方パネルに示されている。下方パネルにおいて、出力クロマトグラム52Aは、トレース48-1からピークを受けるが、トレース48-2からピークは受けない。したがって、出力クロマトグラム52Bは、トレース48-2からピークを受けるが、トレース48-1からピークは受けない。
【実施例１】
【００７３】
本発明の一実施形態による処理技術は、以下に開示される。図4を参照すると、本発明の技術のグラフ表示が提供される。図4において、位置229で（ボックス408）で二重ピークを含む入力クロマトグラム402が存在する。従来のベースコーリングソフトウェアは、この二重ピークをシトシン（C）として識別する。しかしながら、入力クロマトグラム402に本発明の発明方法を適用することによって、位置229での二重ピークが、2個のホモ接合ピーク、それぞれ出力クロマトグラム404および406に関するホモ接合ピークに分割される出力クロマトグラム404および406を生じる。出力クロマトグラム404および406を読み取るときに、従来のベースコーリングソフトウェアは、座標229が、グアニン（クロマトグラム404:G）およびシトシン（クロマトグラム406:C）からなると正しく識別する。
【００７４】
一般に、入力クロマトグラム402は、1個または複数の二重ピークを含む。例えば、入力クロマトグラムが、以下の配列を含むヘテロ接合核酸サンプルに基づく場合を考える。すなわち、
ACGTTTC および
ACCTTAC である。
【００７５】
これらの配列は、ともに表記法AC（G/C）TT（T/A）Cで表されることができ、ここで、（G/C）は、入力配列に対応するクロマトグラム402において第1の二重ピークを表し、（T/A）は第2の二重ピークを表す。そのような例において、本発明の方法は、ヘテロ接合入力の2個の可能なホモ接合表現の１つを出力する。すなわち、
（I）ACGTTTCおよびACCTTAC、または
（II）ACCTTTCおよびACGTTAC である。
【００７６】
換言すれば、本発明のシステムおよび方法は、上記で示された例において配列対（I）であるヘテロ接合サンプルの「真の」配列を決定するように設計されていない。むしろ、本発明のシステムおよび方法の目的は、ヘテロ接合データにおける多形性が、自動的に見出されることができるように、ヘテロ接合入力データのホモ接合表現を生成することである。ホモ接合表現は、例えばホモ接合配列またはホモ接合クロマトグラムの形態であることができる。好ましい実施形態において、ホモ接合表現は、洗練された塩基割り当て技術がその表現に適用されることができるような、ホモ接合クロマトグラムの形態である。
【実施例２】
【００７７】
複合の人間疾病に関する遺伝的感受性要因の識別は、それらの病原論、および疾病治療ならびに防止に関する新規な戦略における洞察を生成することができる。かなりの労力にもかかわらず、人間の母集団におけるほとんどの共通の疾病に対する感受性を考慮する遺伝的な異型は、さらに識別されなければならない。情報のこの不十分性の1つの理由は、遺伝子座と疾病との間の関連性の確認に含まれる時間および労力の量である。そのような確認戦略における律速的な仕事の1つは、疑わしい遺伝子座におけるマーカの識別である。図6を参照して、本発明は、マーカを識別する時間および費用を著しく低くするために、ヘテロ接合入力クロマトグラム46をホモ接合出力クロマトグラムに分割する自動化された方法（例えば、図2に示される方法）を使用する。図6に説明される適用において、染色体ＤＮＡの領域（遺伝子座）は、その遺伝子座が疾病かまたは関心の特徴に関連付けられるかどうかを決定するために解析される。
【００７８】
ステップ602。ステップ602において、関心の特徴に関連付けられることができる染色体ＤＮＡの領域（遺伝子座）が、標準の遺伝的な解析を使用して識別される。例示的な関心の特徴は、「例示的な特徴」と題された部分で以下に記載される。1つのアプローチにおいて、従来のMendelian解析が、関心の特徴に関連付けられる特定の遺伝子を識別するために使用される。Mendelianアプローチにおいて、基礎となる遺伝子型に関する情報を多く含む個々の表現型が、遺伝子を特徴付けるために使用される。表現型（研究中の特徴）が、基礎となる遺伝子型に関する情報をほとんど提供しない状態において、定量的な遺伝子は、遺伝子座（定量的な特徴遺伝子座と呼ばれる）と研究中の特徴との間の関連性を見出すために使用されることができる。定量的な遺伝的なアプローチは、研究中の種に関する遺伝マップの構成を必要とする。遺伝マップは、染色体に沿った遺伝子座の順番付けおよびそれらの間の相対距離を示す。そのようなマップは、回帰分析（Soller et al,. 1976, Theor. Appl. Genet. 47: 35-39）、またはインターバル方法（LanderおよびBotstein,1989,Genetics 121: 185-199）を使用して構成されることができる。そのようなマップで使用されることができるマーカは、単一のヌクレオチド多形性、制限酵素で得られるＤＮＡ断片長さの多形性、マイクロサテライトマーカ、短いタンデムリピート、配列長さ多形性、およびＤＮＡメチル化を含むが、それらに限定されない。遺伝マップが構成されると、関心の特徴に関連付けられる遺伝子座は、（i）t検定などの線形モデル（例えば、SokalおよびRohlf, 1995, Biometry 2nd Ed., W. H. Freeman and Co., NY）ANOVAまたは回帰、または（ii）または最尤推定（例えば、Genetics and Analysis of Quantitative Traits, Lynch and Walsh, 1998, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massachusetts, Appendix 4）を使用して見出されることができる。
【００７９】
ファミリ研究が、喘息、自閉症、精神分裂症、多発硬化症、組織的なエリテマトーデス、およびタイプIおよびタイプIIの真性糖尿病などの多くの一般的な人間の疾病に対する遺伝性の疾病素質を明らかに示した。レビューするために、Risch （2000） Nature 405: 847-56を参照されたい。過去20年にわたって、多数の浸透、膀胱組織症、Huntingtonの疾病、およびDuchene筋ジストロフィーなどの単一の遺伝（Mendelian）障害に関する原因になる遺伝的な変異体は、解析と人間の母集団における位置クローンとを関連付けることによって識別される。これらの成功は、種の遺伝子の遺伝子組成（遺伝子型）と種によって示される1個または複数の物理的な特徴（表現型）との間の強い関連性が存在する異常の相対レートで発生する。ある程度まで、同一の方法が、全体の母集団における共通の疾病に対する可能性に関連する遺伝異型を識別するために使用される。レビューするために、Lander et al. （1994） Science 265: 2037-48を参照されたい。胸部がん（BRCA-1およびBRCA-2）、結腸がん（FAPおよびHNPCC）、Alzheimer's疾病（APP）、およびtype II疾病（MODY-1,MODY-2,MODY-3）などのある一般的な疾病のサブセットに対する可能性に関連する遺伝異型は、これらの方法によって識別される。ある例において、研究中の特徴に関連付けられることができる複数の染色体領域は、ステップ602において識別され、各これらの領域は、図6に示される以降の処理ステップを使用して同時にまたは個別に解析される。
【００８０】
関心対象の特徴に関連付けられる遺伝子座を識別する方法に関して、Risch （2000） Nature 405: 847-56、Lander et al. （1994） Science 265: 2037-48、NadeauおよびFrankel, 2000, Nature Genetics 25: 381-84、Fisch et al., 1996, Genetics 143: 571-77、Luo et al. 1992, Heredity 69: 236-242、Jiang et al., 1997, Genetics 101: 47-58、Olson et al., 1999, Statist. Med. 18: 2961-81、Schork et al., 1998, and TIG 14: 266-72、HainesおよびPereicak-Vance, Approaches to Gene Mapping in Complex Human Diseeases, Wiley-Liss, Incを参照されたい。
【００８１】
ステップ604。研究中の特徴に関連付けられる遺伝子座が識別されると、コホート母集団が集められる。理想的に、コホート母集団は、研究中の特徴を異なって示すメンバを含む。例えば、研究中の特徴が胸部がんであるなら、一般的なコホート母集団は、胸部がんを有する女性と、胸部がんを有さない女性とを含む。Cheng et al., 1999, Genome Res 9:936-949において、血管造影図がGensini方法（Gensini, 1975, Coronary arteriography, Futura Publishing Co., New York, NY）によって定量化されかつ記録された、142の関連性のないCaucasiansの複合コホートが使用された。これらの記録は、コホートを冠状動脈閉塞の異なる深刻性を表す五分位数に再分割するために使用された。
【００８２】
ステップ606。ステップ606において、コホート母集団は、遺伝子型が決定される。一般にこれは、複数のＤＮＡ配列を生じるために、コホート母集団の各メンバにおいてステップ602で識別された染色体ＤＮＡの領域を配列決定することを含む。ある例において、コホートメンバからのＤＮＡは、Bell et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 5759-63の方法など標準的な技術を使用して、またはＤＮＡ隔離キット（例えば、Puregene ＤＮＡ Isolation Kit, Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN）を使用して、血液から得られる。純化されたＤＮＡは、ステップ602で識別された領域に特定のプライマーを使用して増幅され、増幅された領域は、上記表2で開示された複数のＤＮＡシーケンサの任意の1つのＤＮＡシーケンサなどのシーケンサを使用して配列決定される。ステップ606は、それぞれコホート母集団の異なるメンバからステップ602において識別される染色体ＤＮＡの領域を表現する複数のＤＮＡ配列の生成を結果として生じる。染色体ＤＮＡの複数の領域が識別される状態において、ステップ606は、各コホート母集団のメンバに関して複数の配列を結果として生じ、各配列は、ステップ602において識別された各領域に対応するものである。そのような各配列は、配列によって生成された核酸クロマトグラム46によって表現される。
【００８３】
ステップ608。ステップ608においてシーケンサによって生成された複数のクロマトグラムの配列決定は、特に、核酸の源がヘテロ接合である場合に、従来のベースコーリングソフトウェアが、そのような配列を配列決定するために使用されるときに、図6に示される方法の最も時間のかかるステップの1つのステップを示す。従来のベースコーリングソフトウェアを使用して、クロマトグラム46におけるヘテロ接合性の各ポイントは、どの2個の塩基があるかを見るために可視的に調べられなければならない。これは、時間がかかるだけではなく、主観的な人間の解釈に晒される。有利には、本発明は、図2に示される技術を使用して、ヘテロ接合クロマトグラム46をホモ接合クロマトグラム52に自動的に分割することによって、この主観的な時間がかかるステップを回避する。ホモ接合クロマトグラム52は、次に、ステップ606において増幅されかつ/またはシーケンサにかけた核酸を配列決定するために、従来のベースコーリングソフトウェアを使用して配列決定されることができる。
【００８４】
ステップ610。ステップ610の一実施形態において、出力クロマトグラム54におけるデータポイントの全てまたはデータポイントの一部は、シングルヌクレオチド多形性（SNP）に関して解析される。シングルヌクレオチド多形性（SNP）は、所定のデータポイントに異なる対立遺伝子が存在するときに生じる。例えば、コホート母集団の10個のメンバにおける所定の遺伝子座が配列決定される場合を考える。コホート母集団における所定の塩基に対応するデータポイント90を含む遺伝子座を考える。位置90での塩基が、母集団の10個のメンバに対応する10個の配列で変化するなら、位置90はSNPとして規定される。例えば、ヘテロ接合核酸が考えられるなら、10個のコホートメンバは、全部で20個の配列に関して、1個の母系に基づく配列および1個の父系に基づく配列を生じる。1個または複数の核酸が、20個配列において位置90で表現されるなら、その位置はSNPであると考えられる。ある実施形態において、より厳しい基準が使用される。すなわち、少数の対立遺伝子が、1個または複数の配列において呈されなければならない。したがって、このより厳しい基準の下で、20個の配列のうち19個がグアニンをコードし、1個がアデノシンをコードする結果は、SNPであるとは考えられない。しかしながら、18個の配列がグアニンをコードし、2個の配列がアデノシンをコードする結果は、SNPであると考えられる。ここで、グアニンは多数の対立遺伝子であり、アデノシンは少数の対立遺伝子である。さらに他の実施形態において、少数の対立遺伝子は、配列決定されたＤＮＡサンプルの少なくとも約5パーセント、配列決定されたＤＮＡサンプルの少なくとも約10パーセント、配列決定されたＤＮＡサンプルの少なくとも約15パーセント、配列決定されたＤＮＡサンプルの約20パーセント以上でなければならない。
【００８５】
ステップ612。研究中の特徴と染色体ＤＮＡ（遺伝子座）の領域との関連性は、遺伝子座内のマーカまたはハプロタイプが、その特徴に関連するなら、確認されたと考えられる。ステップ612において、ステップ610で見出された各マーカ（例えばSNP）、またはそのようなマーカから導き出されたハプロタイプは、関連性解析を使用して研究中の特徴との関連性を試験される。目的は、研究中の特徴の1つの表現型を示すコホート母集団の一部に過剰表現されるマーカまたはハプロタイプを識別することである。例えば、Campbell et al., 1999, Mol. Psychiatry 4: 68-70において、170人の母系のCaucasian神経性無食欲症患者または150人の正常な母系対照のコホートが、遺伝子型決定された。このコホート母集団におけるマーカの関連性解析は、マーカD11S911の特定の対立遺伝子が、神経性無食欲症母集団において著しく過剰表現されることを明らかにした。カイ二乗試験、またはFisherの両側直接検定の試験（SokalおよびRohlf, 1995, Biometry, 3rd ed., Freeman, San Francisco, California）などの統計的試験が、遺伝子座におけるマーカの対立遺伝子または遺伝子座におけるハプロタイプが、研究中の特徴の特定の表現型と関連付けられるかどうかを決定するために使用されることができる。
【００８６】
ハプロタイプは、従来の技術を使用するステップ610で識別されるマーカ情報を使用し構成されることができる。そのような技術は、Stephens et al. 2001, Am. J. Hum. Genet. 68: 978-89、Liu et al., 2001, Genome Res. 11: 1716-1724、Abescasis et al. 2002, Nature Genet. 30: 97-101に開示される技術を含むが、これらに限定されない。さらに、ソフトウェア解析パッケージHapscopeは、期待値最大化またはBayesian統計アルゴリズム（Zhang et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30: 5213-21）を使用する計算によるハプロタイプ構成をサポートする。
【００８７】
例示的な特徴。上記で議論したように、図6に示される本発明の実施形態は、遺伝子座を、ある複数種（単一種でもよい）に属する1個または複数の有機体によって示される特徴と関連付ける方法を提供する。ある例において、遺伝子座は、遺伝子であり、それは、コホートグループの一部によって示される特定の表現型に関連付けられるその遺伝子内のマーカを識別することによって、特徴に関連付けられる。本発明のある実施形態において、関心の特徴は、例えば人間の疾病などの疾病である複合特徴である。例示的な疾病は、これらに限定されないが、アレルギー、喘息、およびパニック異常、病的恐怖、および外傷後のストレス異常などの強迫異常を含む。
【００８８】
例示的疾病は、さらに、Addison疾病、円形脱毛症、硬直性脊椎炎、抗燐脂質症候群、Behcet疾病、慢性疲労症候群、Crohn疾病および潰瘍性結腸炎、糖尿病、線維筋痛、Goodpasture症候群、移植片対宿主病、狼瘡、Meniere疾病、多発硬化症、重症の筋無力症、筋炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ発熱、類肉腫症、硬皮症、血管炎、白斑、およびWegener肉芽腫症などの自己免疫性異常を含む。
【００８９】
例示的疾病は、さらに、軟骨形成不全症、骨肉腫、進行性骨化性線維形成異常症、線維性形成異常、レッグカルベペルテス病、骨髄腫、骨形成不全症、骨髄炎、骨粗しょう症、変形性骨炎、および側彎症などの骨疾病を含む。例示的疾病は、膀胱がん、骨肉腫、脳腫瘍、乳がん、子宮頚がん、結腸がん、婦人科がん、Hodgkin疾病、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、睾丸がんなどのがんを含む。
【００９０】
例示的疾病は、さらに、軟骨形成不全症、色盲、酸性マルターゼ欠乏症、副腎大脳白質萎縮症、Aicardi症候群、アルファ-1抗トリプシン欠乏症、アンドロゲン不感症症候群、Apert症候群、形成異常症、毛細血管拡張性運動失調症、青色ゴムまり様母斑症候群、カナヴァン疾病、Cri du chat症候群、胆嚢線維症、Dercum疾病、ファンコーニ貧血、進行性骨化性線維形成異常症、脆弱性X症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、血色素症、血友病、Huntington疾病、Hurler症候群、低ホスファターゼ血症、クラインフェルター症候群、Krabbes疾病、Langer-Giedion症候群、大脳白質萎縮症、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、Moebius症候群、ムコ多糖症（mps）、爪膝蓋症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、Niemann-Pick症候群、骨形成不全症、ポルフィリン症、Prader-Willi症候群、下顎前突、プロテウス症候群、網膜芽腫、Rett症候群、rubinstein-taybi症候群、Sanfilippo症候群、Shwachman症候群、鎌状赤血球病、Smith-Magenis症候群、Stickler症候群、テイサックス症、血小板減少欠乏橈骨（tar）症候群、Treacher collins症候群、トリソミー症候群、結節硬化症、Turner症候群、尿素サイクル疾病、Von Hippel-Lindau疾病、Waardenburg症候群、Williams症候群、およびWilson症候群などの遺伝子異常を含む。
【００９１】
例示的疾病は、さらに、狭心症、形成異常症、粥状動脈硬化症/動脈硬化症、先天性心臓疾病、心内膜炎、高コレステロール、高血圧症、ＱＴ延長症候群、僧帽弁逸脱症、体位起立性の頻脈症候群、および血栓症を含む。
【実施例３】
【００９２】
本発明の方法は、SNPを見出すことを実行するためのComputer Program Listing Appendixにおけるソフトウェアプログラムを使用し、かつ32人の欧州人からの遺伝子ＤＮＡサンプルを使用する人間遺伝子HRMT1L3（NCBI承認番号NM_019854; Stausberg et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 16899-903）の遺伝子型を決定して試験された。HRMT1L3は、約3.5Mbで人間の染色体12に位置付けされる蛋白質アルギニンN-メチル基転移酵素である。それは、102.38Kbの遺伝子領域を包含する10個のエクソンを有する。HRMT1L3によって包含されるほとんどの遺伝子領域が、イントロン領域であるので、そのエクソンおよび調節領域だけを遺伝子型決定する決定が行われた。PCRプライマーの全体で48個の対が指定された。プライマーは、ともに図7に示されるように遺伝子領域の全体でほぼ30Kbを包含する。
【００９３】
全体で48個のPCR反応が、32人の欧州人の各遺伝子ＤＮＡサンプルで実行され、結果として生じた増幅PCR生成物の両方の鎖が、配列決定された。全体で、48×3×22=3072個のアンプリコン（amplicon）が配列決定された。各アンプリコンの長さは約650bpである。したがって、約48×32×2×650=1996.8Kbが配列決定された。これらの配列が、配列の質を解析し、同一の遺伝子領域からのアンプリコンを整列し、かつ可能性がある多形性をグラフ表示することができるSequencher（Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan）またはTraceTuner（Paracel, Pasadena, Calfornia）などの従来のコンピュータソフトウェアを用いて人間によって解析されたなら、1個のプライマー対からの64個のヘテロ接合波形を試験し、SNPを識別し、かつ対立遺伝子情報を収集するために、熟練した技術者でもほぼ0.5時間から1時間かかる。したがって、これら3072個の配列、または1996.8Kbの配列の全てを検査するために、1人の熟練した技術者で少なくとも16時間かかる。表1に詳述されたComputer Program Listing Appendixにおけるソフトウェアプログラムで実現されるような本発明のシステムおよび方法を使用して、質のチェックし、ヘテロ接合波形をホモ接合波形に分割し、SNPを見出すことを実行し、かつ対立遺伝子情報を収集することを含み、3072個のヘテロ接合波形、または1996.8Kbの配列の全てを完全に解析するために5分間未満かかる。44個のSNPの全ては、解析された核酸配列において見出される。
【００９４】
代替実施形態
本発明の特定の実施形態の前述の記載は、例示および説明の目的のために示され、完全に開示された詳細な形態であることを目的とはせず、また開示された詳細な形態に本発明を限定することを目的とはしない。多数の修正および変形が、上記教示を考慮して可能である。例えば、参照が、それぞれ4個の可能な塩基、すなわちアデノシン、グアニン、シトシン、およびチミンに関するトレースを含む、入力クロマトグラム46に対して行われる。しかしながら、本発明は、そのような塩基を有する核酸配列に制限されない。実際に、それらに限定されないが、任意のプリンまたはピリミジン誘導体を含む任意の塩基は、それらが、一意なフルオロフォアまたは他のラベル付け試薬で区別されてラベル付けられる限り本発明で使用されることができる。例えば、そのような塩基は、WO98/16,539（Novo Nordisk A/S）、WO98/04,126（Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc.）、WO98/01,459（Novo Nordisk A/S）、Baysらへの米国特許第6,492,348号、Matteucciらへの米国特許第6,005,096号、Inoueらへの特開昭62-59,293号（1987年）、Prober et al., 1987, Science 238: 336-41、Sung, 1981, Nucl. Acids Res. 9（22）: 6139-51、Sung, 1982, J. Org. Chem. 47: 3623-28、Draper, 1984, Nucleic Acids Res. 12（2）: 989-1002、Draper, 1986, Anal. Biochem. 157（2）: 199、欧州特許出願公開第063,879号、およびPCT特許出願第PCT/US84/00,279号に開示される塩基を含むがそれらに限定されない。
【００９５】
引用された参照文献および結論
本明細書に言及された全ての参照文献は、それら全体を参照によって本明細書に組み込まれ、それぞれ個別の出版物または特許または特許出願が、全ての目的のためにその全体が参照によって組み込まれるように特定的にかつ個別に示されるように、同じ範囲に対する全ての目的のためである。
【００９６】
実施形態は、本発明の原理およびその実際の適用を最も良く説明するために選択されかつ記載され、それによって、当業者が、想定される特定の使用に適している様々な修正とともに、本発明および様々な実施形態を最良に使用することを可能にする。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲およびそれらの等価物によって規定されることが目的とされる。
【００９７】
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2006084471.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本発明の一実施形態による核酸配列トレーシングにおけるヘテロ接合性を検出しかつ特徴付けるためのコンピュータシステムを示す図である。
【図２Ａ】本発明の一実施形態による核酸配列トレーシングにおけるヘテロ接合性を検出しかつ特徴付けるための処理ステップを示す図である。
【図２Ｂ】本発明の一実施形態による核酸配列トレーシングにおけるヘテロ接合性を検出しかつ特徴付けるための処理ステップを示す図である。
【図２Ｃ】本発明の一実施形態による核酸配列トレーシングにおけるヘテロ接合性を検出しかつ特徴付けるための処理ステップを示す図である。
【図２Ｄ】本発明の一実施形態による核酸配列トレーシングにおけるヘテロ接合性を検出しかつ特徴付けるための処理ステップを示す図である。
【図３】本発明の一実施形態により作られたトレース配列データ構造を示す図である。
【図４】入力クロマトグラム、および本発明の方法を使用する入力クロマトグラムに基づき作られた2個の例示的なホモ接合表示を示す図である。
【図５】入力クロマトグラム、および本発明の方法を使用する入力クロマトグラムに基づき作られた2個の例示的なホモ接合表示を示す図である。
【図６】関心の疾病と遺伝子座との関連性を確認するために、図2の処理ステップを使用する適用を示す図である。
【図７】人間遺伝子HRMT1L3のエクソン構造を示す。各垂直バーがエクソンを示し、底部での短い水平方向ラインは、PCR増幅によって包含される遺伝子領域を示す図である。
【符号の説明】
【００９９】
3  人間の染色体
8  キーボード
10  システム
22  中央処理ユニット
24  システムメモリ
26  ユーザインタフェース
28  ストレージコントローラ
30  メイン不揮発性ストレージユニット
34  内部バス
36  マウス
38  ディスプレイ
39  ネットワークインタフェースカード
40  オペレーティングシステム
42  ファイルシステム
44  Split_traceメインモジュール
46  ヘテロ接合入力クロマトグラム
48  入力トレース
48-1、48-2、48-3、48-4  トレース
50  トレース状態データ構造
52A、52B、402  クロマトグラム
56  走査トレースモジュール
58  peak_sizeルーチン
60  is_peakルーチン
62  mark_valid_peak_rangeルーチン
64  プロファイルルーチンモジュール
66  calc_avg_backgroud_peakルーチン
68  トレース分割ルーチン
166  座標
229  塩基位置
404、406  出力クロマトグラム
408  ボックス
【図１】
2006084471.tif 000027
【図２Ａ】
2006084471.tif 000028
【図２Ｂ】
2006084471.tif 000029
【図２Ｃ】
2006084471.tif 000030
【図２Ｄ】
2006084471.tif 000031
【図３】
2006084471.tif 000032
【図４】
2006084471.tif 000033
【図５】
2006084471.tif 000034
【図６】
2006084471.tif 000035
【図７】
2006084471.tif 000036
【外国語明細書】
2006084471000001.pdf