(57)【要約】  【課題】  キチナーゼ遺伝子が導入されて糸状菌病に対する耐性が増強されたシクラメン属植物の形質転換体を提供する。  【解決手段】キチナーゼ遺伝子をコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡをシクラメンの葉柄または葉身に導入後、組換えＤＮＡが導入された細胞を選択し、選択された細胞から再生されたシクラメン属植物の形質転換体。  【選択図】  図１
2006075125.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチナーゼ遺伝子が導入されたシクラメン属植物の形質転換体。
【請求項２】
前記キチナーゼ遺伝子が、イネ由来のキチナーゼをコードする遺伝子である、請求項１に記載のシクラメン属植物の形質転換体。
【請求項３】
前記キチナーゼ遺伝子をコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡをシクラメンの葉柄または葉身に導入後、前記組換えＤＮＡが導入された細胞を選択し、選択された細胞から再生されたシクラメン属植物の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キチナーゼ遺伝子が導入されたシクラメン属植物の形質転換体に関し、詳細にはキチナーゼ遺伝子が導入されて糸状菌病に対する耐性が増強されたシクラメン属植物の形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
冬の鉢花の代表であるシクラメンには多くの植物病原菌による病害が知られている。一方、近年、遺伝子工学的技術を用いて植物に耐病性に関与する遺伝子を導入し、植物病害に強い病害耐性植物を作出する試みが進められている。例えば、植物病原菌に対する耐性の増強のために、キチナーゼ遺伝子の植物への導入が試みられている。シクラメンの植物病原菌としては種々の糸状菌が知られているが、糸状菌は、その細胞壁を構成する主要成分の一つとしてキチンを有している。一方、キチナーゼ（ＥＣ３．２．２．１４）は、植物病原糸状菌のキチンを分解する酵素であり、植物に感染しようとする糸状菌の細胞壁中のキチンに作用して、これらの病原菌による感染・発病を防止する防御機構となっていると考えられている。このような防御機構に着目し、種々の生物の由来するキチナーゼ遺伝子を植物に導入することによって、防御機構が強化された耐病性植物が作出されている。
【０００３】
例えば、＜１＞放線菌由来のキチナーゼ遺伝子を導入した病害抵抗性イネ植物（特許文献１）、＜２＞リゾプス・オリゴスポラス由来のキチナーゼ遺伝子導入りんご及びその作出方法（特許文献２）、＜３＞イネ由来のキチナーゼ遺伝子を導入してブドウ類の菌類抵抗性を増強させる方法（特許文献３）、＜４＞放線菌由来のキチナーゼ遺伝子を導入した耐病性クリーピングベントグラス（特許文献４）、＜５＞タバコ由来のキチナーゼ遺伝子をタバコ、ニンジン、ヒマワリ、トマト、ワタ、トウモロコシ、カモガヤに導入したもの（特許文献５、特許文献６）、＜６＞リゾプス・オリゴスポラス由来のキチナーゼ遺伝子をイネに導入したもの（特許文献７）、＜７＞トマト由来のキチナーゼ遺伝子をトウモロコシ、ダイズ、ピート、コムギ、オオムギ、ケシ、アブラナ、ヒマワリ、アルファルファ、バラ、カーネーション、ガーベラ、トマト、ニンジン、レタス、チコリ、メロン、キャベツ、タバコヘ導入したもの（特許文献８）、＜８＞細菌セラチア・マルセッセンス由来のキチナーゼ遺伝子をタバコに導入したもの（非特許文献１）、＜９＞インゲンマメ由来のキチナーゼ遺伝子をタバコに導入したもの（非特許文献２）、＜１０＞イネ由来のキチナーゼ遺伝子を高発現させた組換えイネ（非特許文献３）等が知られている。しかしながら、糸状菌病に対する防御機構の強化を目的としてキチナーゼ遺伝子を導入されたシクラメンは知られていない。
【特許文献１】特開２００３−２５０３７０号公報
【特許文献２】特開２０００−２７０７００号公報
【特許文献３】特開２０００−９３０２８号公報
【特許文献４】特開平９−１５４４２７号公報
【特許文献５】特開平３−３５７８３号公報
【特許文献６】特開平３−１１２４８８号公報
【特許文献７】特開平１０−２８６０３４号公報
【特許文献８】特開平６−３８７６２号公報
【非特許文献１】モレキュラー  ジェネラルジェネティクス（Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．）、第２１０巻、５７２〜５７７頁、１９８７年
【非特許文献２】ザ  プラント  セル（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ）、第１巻、５９９〜６０７頁、１９８９年
【非特許文献３】セオレティカル  アプライト  ジェネテイクス(Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．)第９９巻、３８３〜３９０頁、１９９９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、キチナーゼ遺伝子が導入されて糸状菌病に対する耐性が増強されたシクラメン属植物の形質転換体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した。そして後述されるキチナーゼ遺伝子が導入されて糸状菌病に対する耐性が増強されたシクラメン属植物の形質転換体を提供すること事に成功した。すなわち、本発明の要旨とするところは、以下のとおりである。
【０００６】
（１）キチナーゼ遺伝子が導入されたシクラメン属植物の形質転換体。
（２）キチナーゼ遺伝子が、イネ由来のキチナーゼをコードする遺伝子である、（１）に記載のシクラメン属植物の形質転換体。
（３）キチナーゼ遺伝子をコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡをシクラメンの葉柄または葉身に導入後、組換えＤＮＡが導入された細胞を選択し、選択された細胞から再生されたシクラメン属植物の形質転換体。
【発明の効果】
【０００７】
シクラメンにキチナーゼ遺伝子を導入し、形質転換されたシクラメン植物体を得ることにより、糸状菌病に対する耐性が増強された耐病性シクラメンが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明のキチナーゼ遺伝子が導入されたシクラメン属植物の形質転換体は、以下の方法により作出することができる。
【０００９】
＜シクラメンへのキチナーゼ遺伝子の導入＞
１）キチナーゼ遺伝子を包含する組換えＤＮＡの構築
本発明で用いるキチナーゼ遺伝子は、キチンを構成するN−アセチルグルコサミンのβ−グルコシド結合を加水分解することができる酵素であるキチナーゼをコードする遺伝子である。キチナーゼには、エキソ型キチナーゼ及びエンド型キチナーゼがあるが、本発明には、植物由来のキチナーゼ、微生物由来のキチナーゼなど、キチン分解活性を有する酵素タンパク質をコードするいずれの遺伝子も使用できる。
【００１０】
本発明に使用し得るキチナーゼ遺伝子として具体的には、
（１)イネ由来キチナーゼ遺伝子  [セオレティカル  アプライド  ジェネティクス（Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．）第９９巻、３８３〜３９０頁、１９９９年]、(２)セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）由来キチナーゼ遺伝子[ザ  エンボ  ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．）、第５巻、４６７〜４７３頁、１９８６年]、(３)サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来キチナーゼ遺伝子[セル（Ｃｅｌｌ）、第４６巻、２１３〜２２５頁、１９８９年]、(４)リゾプス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）由来キチナーゼ遺伝子[ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ）、第１７４巻、第２２号、７３９８〜７４０６頁、１９９２年]、(５)インゲンマメ由来キチナーゼ遺伝子[プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル
アカデミー  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第８３巻、６８２０〜６８２４頁、１９８６年]、(６)タバコ由来キチナーゼ遺伝子[プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ
．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第８４巻、８９頁、１９８７年]、(７)キュウリ由来キチナーゼ遺伝子[プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ
ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第８６巻、８９６〜９００頁、１９８９年]、(８)バレイショ由来キチナーゼ遺伝子[ヌクレイック  アシド  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第１６巻、５２１０頁、１９８８年]等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、キチナーゼ活性を発現するか、耐病性を付与しうることができるタンパクをコードするものであれば特に制限されない。上記に例示したキチナーゼ遺伝子の中でも、好ましくは、イネ由来キチーゼ遺伝子である。また、必要であれば、これらキチナーゼ遺伝子を複数種用いることも可能である。さらに、シクラメン固有のキチナーゼ遺伝子であっても、多コピーでシクラメンに導入することによって、あるいは強力なプロモーターを連結した該遺伝子をシクラメンに導入してその発現を増強することにより、耐病性を増強できることが予想される。
【００１１】
上記キチナーゼ遺伝子固有のプロモーターがシクラメン細胞内で機能しない場合か、十分でない場合には、これらの遺伝子がシクラメンで必要量効率よく発現するように、また、キチナーゼ活性をより高めるために、シクラメン細胞で機能する適切なプロモーターを、キチナーゼ遺伝子の上流に配し、さらに、必要に応じて適切なターミネーターを下流に配するよう調製して、ベクターＤＮＡに組み込む。これらプロモーター等を最適化することは、当業者にとって容易なことである。
【００１２】
本発明で利用するプロモーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ３５Ｓ[ザ  エンボ  ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．）、第６巻、３９０１〜３９０７頁、(１９８７年）]が挙げられ、ターミネーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーターやノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーターが挙げられるが、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであればこれらのものに限定されない。
【００１３】
キチナーゼ遺伝子を包含するベクターが導入されたシクラメンの選抜を容易にするために、キチナーゼ遺伝子と同時に選抜マーカー遺伝子を併用して導入しても良い。その際に使用する選抜マーカー遺伝子としては、抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイクロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）およびカナマイシン、ゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子などから選ばれる１つ以上の遺伝子を使用することができるが、選抜マーカーとして機能する遺伝子であればこれらに限定されない。好ましくはハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を用いるのが良い。このようにして調製されたキチナーゼ遺伝子を包含するベクターをシクラメンの組織に導入する。
【００１４】
上記キチナーゼ遺伝子及び必要に応じてマーカー遺伝子を、シクラメンの細胞に導入するために、これらの遺伝子をベクターに組み込んで組換えＤＮＡを構築する。本発明に用いられるベクターとしては、ｐＢＩ１２１（クローンテック社製）、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ[プラント  セル  フィジオール（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｉｓｉｏｌ．）、第３１巻、８０５〜８１３頁、１９９０年]等が挙げられる。また、キチナーゼ遺伝子及びマーカー遺伝子は、単一のベクターに組み込んでもよいし、それぞれを別個のベクターに組み込んだ２種類の組換えＤＮＡを用いてもよい。
【００１５】
２）シクラメンの組織への遺伝子導入
本発明で用いられるシクラメンはシクラメン属に含まれる各種のシクラメン植物を指す。
例えば、シクラメン  パーシカム（Ｃｙｃｌａｍｅｎ  ｐｕｒｓｉｃｕｍ）、シクラメ
ン  ヘデリホリウム（Ｃｙｃｌａｍｅｎ  ｈｅｄｅｒｉｆｏｒｉｕｍ）、シクラメン  グラエカム（Ｃｙｃｌａｍｅｎ  ｇｒａｅｃｕｍ）、シクラメン  プルプラセンス（Ｃｙｃｌａｍｅｎ  ｐｕｒｕｐｒａｓｅｎｎｃｅ）等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、シクラメン  パーシカム（Ｃｙｃｌａｍｅｎ  ｐｕｒｓｉｃｕｍ）が挙げられる。
【００１６】
本発明で用いられるシクラメンの組織としては、シクラメンの植物体の葉身、葉柄、塊茎、花茎、根、花弁、葯基部などが挙げられるが、好ましくは葉柄または葉身である。
【００１７】
次に、シクラメンの組織への遺伝子導入を行う。遺伝子導入操作を行うにあたって、必要に応じて前培養を行うことができる。前培養は、シクラメンの無菌状態の組織片を採取し、有効塩素濃度０．１〜１％、好ましくは０．２〜０．６％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に１０〜６０分間、好ましくは１５〜３０分間浸漬し、殺菌処理を行う。次いで、組織片を取り出して、滅菌水で３〜５回洗浄し、表面に付着した次亜塩素酸ナトリウム溶液を取り除く。これを所望の大きさ、例えば葉柄を用いる場合は、２〜１０ｍｍ、好ましくは５〜７ｍｍ長の小片に切断して調製する。
【００１８】
これを例えば、ムラシゲ・スクーグ培地（以下「ＭＳ培地」という。)の無機塩濃度をそのままか、１／２〜１／３濃度に希釈したものにショ糖１０〜６０ｇ／Ｌ、好ましくは２０〜４０ｇ／Ｌ、植物ホルモンとしてオーキシン類を０．０１〜１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜５ｍｇ／Ｌ、とサイトカイニン類を０．０１〜１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜５ｍｇ／Ｌ、さらにアセトシリンゴンを１〜５０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０〜３０ｍｇ／Ｌをそれぞれ加え、ｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５〜６とし、ゲランガム１〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは２〜４ｇ／Ｌを加えた固体培地に置床する。これを１０〜３０℃、好ましくは１５〜２０℃の温度で、暗所で、３〜１４日間、好ましくは５〜１０日間前培養を行う。上記した前培養に用いる培地としては、ＭＳ培地の他に、ガンボーグの培地（Ｂ５培地）、ニッチ培地、ホワイト培地などをＭＳ培地に準じて用いることができる。
【００１９】
また、本発明の組織片の前培養工程では、培地に加えられる植物ホルモンとして、オーキシン類として２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２,４−Ｄ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）などが挙げられ、サイトカイニン類としてベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、チジアズロンなどを挙げることができる。このような植物ホルモンはその種類に応じて、適宜その添加量を選択して用いられる。
【００２０】
次に、上記した組織片を材料として公知の遺伝子導入法でキチナーゼ遺伝子を包含する組換えＤＮＡを導入できる。公知の遺伝子導入法としては、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ウイスカー法またはそれに準じた方法等が挙げられるが、本発明で用いる遺伝子導入方法としてはアグロバクテリウム法が好ましい。
【００２１】
例えばアグロバクテリウム法で遺伝子導入を行う方法では、まずキチナーゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡベクターのプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌に公知の凍結融解法（例えば、「植物細胞工学」、１９９２年、第４巻、第３号、１９３〜２０３頁)等を用いて導入する。
そして組換えＤＮＡベクターを保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌をＬＢ培地で１昼夜培養した培養液に、上記に記載の方法により得られた組織片を５〜６０分間、好ましくは１０〜３０分間浸漬する。浸漬後これを例えば、ＭＳ培地の無機塩濃度をそのままか、１／２〜１／３濃度に希釈したものにショ糖１０〜６０ｇ／Ｌ、好ましくは２０〜４０ｇ／Ｌ、植物ホルモンとしてオーキシン類を０．０１〜１０ｍｇ／Ｌ、
好ましくは０．１〜５ｍｇ／Ｌ、とサイトカイニン類を０．０１〜１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜５ｍｇ／I、さらにアセトシリンゴンを１〜５０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０
〜３０ｍｇ／Ｌをそれぞれ加え、ｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５〜６とし、ゲランガム１〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは２〜４ｇ／Ｌを加えた固体培地に置床する。培地に加えられる植物ホルモンとして、オーキシン類として２,４−Ｄ、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）などが挙げられ、サイトカイニン類としてベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、チジアズロンなどを挙げることができる。これを１０〜３０℃、好ましくは１５〜２０℃の温度で、暗所で、３〜１４日間、好ましくは５〜７日間共存培養を行いアグロバクテリウムの感染処理を行う。
【００２２】
＜組換えＤＮＡが導入された細胞の選抜＞
上記のようにして遺伝子導入を行った組織片を、次のようにして調製した選抜培地に置床する。この選抜培地は、特定の基本培地に特定の植物ホルモン、酸素源、ビタミン類を加え、特定のゲル化剤を加えて固化した固体培地である。例えばＭＳ培地の無機塩濃度をそのままか、１／２〜１／３濃度に希釈したものにショ糖１０〜６０ｇ／Ｌ、好ましくは２０〜４０ｇ／Ｌ、植物ホルモンとしてオーキシン類を０．０１〜１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜５ｍｇ／Ｌ、とサイトカイニン類を０．０１〜１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜５ｍｇ／Ｌ、さらにアセトシリンゴンを１〜５０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０〜３０ｍｇ／Ｌをそれぞれ加え、ｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５〜６とし、ゲランガム１〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは２〜４ｇ／Ｌを加えて調製する。
【００２３】
この選抜工程では、培地に加えられる植物ホルモンとして、オーキシン類として２,４−Ｄ、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）などが挙げられ、サイトカイニン類としてベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、チジアズロンなどを挙げることができる。
【００２４】
この選抜培地には、効率的に目的の形質転換細胞を選抜するために、選抜マーカー遺伝子の種類に応じた選抜薬剤を添加する。選抜薬剤としてはハイグロマイシンを１〜２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは３〜５ｍｇ／Ｌの濃度で添加する。さらに、遺伝子導入処理の終了したアグロバクテリウム菌の除菌薬剤として、カルベニシリンを５０〜５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１００〜３００ｍｇ／Ｌの濃度で添加する。これを、１０〜３０℃、好ましくは１５〜２０℃の温度で、暗所で、３０〜１２０日間、好ましくは６０〜９０日間培養すると、組織片から不定芽もしくは不定胚が形成される。
【００２５】
＜組換えＤＮＡが導入された細胞から植物体の再生＞
上記の選抜工程で培養した組織片から不定芽または不定胚を切断して分離・採取し、これを次のようにして調製した植物体育成培地に置床する。この植物体育成培地は、特定の基本培地に特定の植物ホルモン、酸素源、ビタミン類を加え、特定のゲル化剤を加えて固化した固体培地である。例えばＭＳ培地の無機塩濃度をそのままか、１／２〜１／３濃度に希釈したものにショ糖１０〜６０ｇ／Ｌ、好ましくは２０〜４０ｇ／Ｌ、植物ホルモンとしてオーキシン類を０．０１〜１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜５ｍｇ／Ｌ、とサイトカイニン類を０．０１〜１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜５ｍｇ／Ｌ、カルベニシリンを５０〜１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは３００〜５００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５〜６とし、ゲランガム１〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは２〜４ｇ／Ｌを加えて調製する。
【００２６】
この再生工程では、培地に加えられる植物ホルモンとして、オーキシン類として２,４−Ｄ、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）などが挙げられ、サイトカイニン類としてベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、チジアズロンなどを挙げることができる。これを、１０〜３０℃、好ましくは１５〜２０℃の温度で、明所で、３０〜１２０日間、好ましくは６０〜９０日間培養すると、不定芽もしくは不定胚から形質転換植物体が育成される。ここに明所条件とは、照度が５００〜１００００ルクス、好ましくは
５００〜２０００ルクスであり、光照射時間は１日５〜２４時間、好ましくは１４〜１８時間である。
【００２７】
＜キチナーゼ遺伝子の植物体への導入の確認＞
上記の再生工程で得られた形質転換細胞（カルス）および形質転換植物体に目的とするキチナーゼ遺伝子が組み込まれていることの確認は、これらの細胞から常法に従ってＤＮＡを抽出し、公知のＰＣＲ法（Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ３７， １７２（１９８５））もしくはサザンハイブリダイゼーション法（Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ９８，５０５（１９８０））により行うことができる。
【００２８】
＜形質転換シクラメンの糸状菌病に対する耐性の確認＞
キチナーゼ遺伝子を導入した形質転換シクラメンの糸状菌病に対する耐性は、簡易的な検定方法において確認することができる。
【００２９】
シクラメンの糸状菌病の対象としては、灰色かび病、炭そ病、委ちょう病などが挙げられる。具体的には、形質転換シクラメンの葉または花を切除し、ガラスシャーレー内に置床し、所定の数に調製した糸状菌の胞子懸濁液(１０4〜１０6個／ｍＬ)を接種する。処理後、対象糸状菌の発病至適環境条件下で所定の期間感染処理を行う。対象とする糸状菌病の発生経過を観察しながら適宜、発病程度から、糸状菌病に対する耐性程度を確認することができる。
【００３０】
以下に、本発明の実施例の例示により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。以下の実験操作の手順は特に記述しない限り、「モレキュラー  クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版」（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ、１９８９年）に記載されている方法に従った。
【実施例】
【００３１】
(１)イネ由来のキチナーゼ遺伝子を包括する組換えＤＮＡの構築
キチナーゼ遺伝子として、公知のイネ由来のキチナーゼ遺伝子[ＲＣＣ２（ＥＭＢＬ  Ａｃｃ．  ＃Ｘ５６７８７）またはＲＣＧ３（ＥＭＢＬ  Ａｃｃ．  ＃Ｄ１６２２３）]を用いた。キチナーゼ遺伝子（ＲＣＣ２またはＲＣＧ３）を保持する、組換えベクターｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＲＣＣ２、ｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＲＣＧ３（共に、独立行政法人
農業生物資源研究所より入手）をアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＥＨＡ１０１株）に公知の凍結融解法（例えば、「植物細胞工学」、１９９２年、第４巻、第３号、１９３〜２０３頁)により移行させたアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌ＥＨＡ１０１−ＲＣＣ２、ＥＨＡ１０１−ＲＣＧ３（共に、独立行政法人  農業生物資源研究所より入手）を作製した。
【００３２】
組換えベクターｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＲＣＣ２、ｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＲＣＧ３は、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーターとそのエンハンサー領域を４個反復連結した人工プロモーターＥＮ４とノパリンシンターゼ由来のＮＯＳターミネーターの間に連結したキチナーゼ遺伝子（ＲＣＣ２またはＲＣＧ３）および前記した３５Ｓプロモーターとカリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーターの間に連結したハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）を有する。（図１）
【００３３】
(２)シクラメンの組織へのキチナーゼ遺伝子の導入
シクラメン(シクラメン  パーシカム（Ｃｙｃｌａｍｅｎ  ｐｕｒｓｉｃｕｍ）、品種:シューベルト、有限会社  泉農園より購入)の種子を有効塩素濃度が１％の次亜塩素酸ナトリウム液で２０分間浸漬し滅菌後、１／２無機塩濃度のＭＳ培地、ショ糖３質量％、ゲ
ランガム０．３質量％(ｐＨ５．８)に置床して、２０℃、暗所で６０日間培養した。種子から発芽して生じた幼苗の葉柄部分を長さ５ｍｍに切断し、遺伝子導入用組織片とした。
【００３４】
１試験区あたり１００本の組織片を、１／２無機塩濃度のＭＳ培地にショ糖３質量％、植物ホルモンとしてチジアズロン１ｍｇ／Ｌ、２,４−Ｄ１ｍｇ／Ｌ、アセトシリンゴン２０ｍｇ／Ｌをそれぞれ加え、ｐＨ５．８として、ゲルライト０．３質量％を加えた固体培地に置床した。この培養に用いられる容器は、滅菌したプラスチックシャーレ（直径９ｃｍ、高さ１．５ｃｍ)であり、シャーレ１枚あたり組織片１０本を置床している。これを２０℃で暗所にて７日間培養した。
【００３５】
上記で得られた組換えベクターｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＲＣＣ２、ｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＲＣＧ３を包含するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＥＨＡ１０１−ＲＣＣ２、ＥＨＡ１０１−ＲＣＧ３）をＬＢ培地で２８℃で一晩培養した培養液に上記に記載のシクラメンの葉柄の組織片１００個を３０分間浸漬処理した。浸漬処理後、１／２無機塩濃度のＭＳ培地にショ糖３質量％、植物ホルモンとしてチジアズロン１ｍｇ／Ｌ、２,４−Ｄ１ｍｇ／Ｌ、アセトシリンゴン２０ｍｇ／Ｌをそれぞれ加え、ｐＨ５．８として、ゲルライト０．３質量％を加えた固体培地に置床した。２０℃の温度条件下で暗所にて６日間共存培養を行った。
【００３６】
共存培養後の組織片１００個を、５０ｍＬ容の無菌の遠心管（内径２７ｍｍ、長さ１１５ｍｍ）に移しいれ、洗浄液(１／２無機塩濃度のＭＳ液体培地にカルベニシリン３００ｍｇ／Ｌを加えたもの)３０ｍＬを加えて洗浄した。さらにこの操作を２回繰り返した後、無菌のろ紙を用いて余分な水分を取り除いた。洗浄された組織片は、１／２無機塩濃度のＭＳ培地にショ糖３質量％、植物ホルモンとしてチジアズロン１ｍｇ／Ｌ、２,４−Ｄ１ｍｇ／Ｌ、アセトシリンゴン２０ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン５００ｍｇ／Ｌ、ハイグロマイシン５ｍｇ／Ｌをそれぞれ加え、ｐＨ５．８として、ゲルライト０．３質量％を加えた固体選抜培地に置床した。２０℃の温度条件下で暗所にて１ヶ月毎に新しい選抜培地に移植した。
【００３７】
(３)形質転換シクラメンの再生
選抜培地に移植後、約２ヶ月で組織片からハイグロマイシン抵抗性の形質転換カルスを形成させた。これらのカルスは、１／３無機塩濃度のＭＳ培地にショ糖３質量％、植物ホルモンとしてＮＡＡ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ＢＡ  ０．０２ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン３００ｍｇ／Ｌ、ハイグロマイシン５ｍｇ／Ｌをそれぞれ加え、ｐＨ５．８として、ゲルライト０．３質量％を加えた固体再生培地に置床した。２０℃の温度条件下で暗所にて１ヶ月毎に新しい選抜培地に移植した。
【００３８】
再生培地に移植後、約２ヶ月で形質転換カルスから形質転換された不定芽を形成させた。これらの不定芽は、１／３無機塩濃度のＭＳ培地にショ糖３質量％、植物ホルモンとしてＮＡＡ  ０．１ｍｇ／Ｌを加え、ｐＨ５．８として、ゲルライト０．３質量％を加えた発根培地に置床した。２０℃の温度条件下で明所（１０００ルクス、１６時間照明）培養した。その結果、キチナーゼ遺伝子ＲＣＣ２により形質転換されたシクラメン植物体が１５個体、キチナーゼ遺伝子ＲＣＧ３により形質転換されたシクラメン植物体が３１個体得られた。これらの植物体はすべて、順化、鉢上げを行った。
【００３９】
(４)導入したキチナーゼ遺伝子の解析
上記(３)で得られた形質転換植物の葉を遺伝子解析用の材料とした。シクラメンの葉片１０ｍｇから公知のＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウム）法に従って全ＤＮＡを抽出した。これらはＰＣＲ法により導入遺伝子の確認を行った。用いたプライマーは、化学合成により作製した
（ａ）プライマーＮＯ．１(配列番号１に示す)
５'-AGAGGCCGTTCAACAGCGGCTCGTCGGTTGGGT-３'
（ｂ）プライマーＮＯ．２(配列番号２に示す)
５’-AAGCATGCCCTACCCGCCTTCCTAGTTG-３'
（ｃ）プライマーＮＯ．３(配列番号３に示す)
５'-GTATAATTGCGGGACTCTAATC-３'
キチナーゼ遺伝子ＲＣＣ２の確認には上記プライマー（ａ）と（ｃ）を組み合わせ、キチナーゼ遺伝子ＲＣＧ３の確認には上記プライマー（ｂ）と（ｃ）を組み合わせた。
【００４０】
上記において抽出した各形質転換シクラメンのＤＮＡ溶液１μＬ、上記２種類のプライマー各０．２μＭ、およびＰＣＲキット(宝酒造(株)製、ＬＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ
２．１)を混合調製し（総量２５μＬ）、以下の条件で増幅反応を実施した。
【００４１】
増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（ＡＳＴＥＫ社製、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｔｅｍｐ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＰＣ−７００)を用いて、変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを５５℃、１分間、また伸張（Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）を７２℃、３０秒間行う３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。
【００４２】
ＰＣＲ反応液を、常法により、１．２％アガロースゲル電気泳動で分析したところ、形質転換されたシクラメン植物体から抽出したＤＮＡから４００ｂｐの増幅されたＤＮＡのバンドが確認された。このＤＮＡバンドパターンより、すべての植物体においてキチナーゼ遺伝子（ＲＣＣ２、ＲＣＧ３）の形質転換が確認された。
【００４３】
(５)形質転換シクラメンの糸状菌病抵抗性の検定１
上記(３)で得られた形質転換シクラメンの灰色かび病に対する抵抗性を検定した。検定用の形質転換シクラメンの花弁を切り取り、滅菌水で湿らせたろ紙を敷いた９ｃｍプラスチックシャーレに入れた。灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｉａ：東京都農業試験所より分譲）の胞子懸濁液は、灰色かび病菌をＰＤＡ培地上で２４℃、２週間生育させた後、菌糸表面に形成した胞子を絵筆でかき集め、１０5個／ｍＬになるようにグルコース２質量％液に懸濁して調製した。この灰色かび病菌胞子懸濁液を上記した花弁に噴霧接種し、２４℃、暗黒下のインキュベーターに７日間静置した。
【００４４】
抵抗性の検定は、罹病面積を測定し、花弁全体の面積に対する病班面積率を算出して行った。非形質転換シクラメンに比べて、キチナーゼ遺伝子の形質転換シクラメンでは、胞子からの菌糸の伸長が著しく抑えられ、病斑面積が明らかに少なかった。この結果は表１に示した。なお、表中、形質転換２−１、２−２は、キチナーゼ遺伝子ＲＣＣ２を導入して得られた形質転換シクラメンであり、形質転換３−１、３−２は、キチナーゼ遺伝子ＲＣＧ３を導入して得られた形質転換シクラメンである。
【００４５】
【表１】
2006075125.tif 000003
【００４６】
（６）形質転換シクラメンの糸状菌病抵抗性の検定２
上記(３)で得られた形質転換シクラメンの炭そ病に対する抵抗性を検定した。検定用の形質転換シクラメンの葉を切り取り、滅菌水で湿らせたろ紙を敷いた９ｃｍプラスチックシャーレに入れた。炭そ病菌（Ｃ．ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ：栃木県農業試験所より分譲）の胞子懸濁液は、炭そ病菌をＰＤＡ培地上で２４℃、２週間生育させた後、菌糸表面に形成した胞子を絵筆でかき集め、１０5個／ｍＬになるように滅菌水に懸濁して調製した。この炭そ病菌胞子懸濁液を上記した葉に１００μＬを滴下接種し、２４℃、暗黒下のインキュベーターに７日間静置した。
【００４７】
抵抗性の検定は、罹病面積を測定し、花弁全体の面積に対する病班面積率を算出して行った。非形質転換シクラメンに比べて、キチナーゼ遺伝子の形質転換シクラメンでは、胞子からの菌糸の伸長が著しく抑えられ、病斑面積が明らかに少なかった。この結果は表２に示した。なお、表中、形質転換２−１、２−２は、キチナーゼ遺伝子ＲＣＣ２を導入して得られた形質転換シクラメンであり、形質転換３−１、３−２は、キチナーゼ遺伝子ＲＣＧ３を導入して得られた形質転換シクラメンである。
【００４８】
【表２】
2006075125.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明により提供されるキチナーゼ遺伝子が形質転換されたシクラメンは、灰色かび病などの糸状菌病に対する抵抗性が顕著に増加し、農業生産上重要なシクラメンの育種と開発に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】組換えベクターｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＲＣＣ２、ｐＢＩ３３３−ＥＮ４−ＲＣＧ３を示す図。
【符号の説明】
【００５１】
Ｐ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター
ＨＰＴ  ：ハイグロマイシン耐性遺伝子
ＴＣａＭＶ：カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター
ＴＮＯＳ：ＮＯＳ遺伝子ターミネーター
ＰＥＮ４：ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（エンハンサー４反復）
ＲＣＣ２：イネ・キチナーゼ遺伝子ＲＣＣ２
ＲＣＧ３：イネ・キチナーゼ遺伝子ＲＣＧ３
ＲＢ， ＬＢ：Ｔ−ＤＮＡ右側ボーダー配列、左側ボーダー配列
【配列表フリーテキスト】
【００５２】
配列番号１：導入用遺伝子確認用プライマー
配列番号２：導入用遺伝子確認用プライマー
配列番号３：導入用遺伝子確認用プライマー
配列番号４：イネ由来キチナーゼをコードするＤＮＡ（ＲＣＣ２）の塩基配列
配列番号５：イネ由来キチナーゼをコードするＤＮＡ（ＲＣＧ３）の塩基配列
【図１】
2006075125.tif 000005
【配列表】
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