(57)【要約】    【課題】  本発明の目的は、電極基板に生体分子等が付着せずに、選択的に電子のみを移動可能とする膜を設けた電極基板を提供する。    【解決手段】  上記目的は、電極と、前記電極との間で電子の授受を行うことができる長さの膜厚を有し、前記電極に配設された膜と、を備える電流検出用電極基板により達成される。本発明の好ましい態様では、前記膜厚は、１０〜８０Åであり、前記膜は、式−ＣＨ2−で表される基を含む化合物、式−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−で表される基を含む化合物、式−ＣＨ2−および式−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−で表される基を含む化合物、または下記式（１）で表される基を含む化合物【化１】2006242925.tif 000008（ここで、ｍ、ｎ、ｌは１以上の整数であり、Ｘは、メチレン基またはカルボニル基を示す。）を含む単分子膜である。【選択図】    図１
2006242925.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極と、
前記電極との間でキャリアの授受を行うことができる長さの膜厚を有し、前記電極に配設された膜と、
を備える、電極基板。
【請求項２】
前記膜厚は、１０〜８０Åである、請求項１に記載の電極基板。
【請求項３】
電極と、
前記電極上に配設された膜と、を備え、
前記膜は酸素原子を含有する材料を含む、電極基板。
【請求項４】
前記膜は、主鎖に酸素原子を含む材料である、請求項３に記載の電極基板。
【請求項５】
前記材料は、直鎖構造を有する化合物を含み、前記直鎖構造中に酸素原子を含む、請求項３または４に記載の電極基板。
【請求項６】
前記膜は、式−ＣＨ2−で表される基を含む化合物、式−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−で表される基を含む化合物、式−ＣＨ2−および式−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−で表される基を含む化合物、または下記式（１）で表される基を含む化合物
【化１】
2006242925.tif 000007
（ここで、ｍ、ｎ、ｌは１以上の整数であり、Ｘは、メチレン基またはカルボニル基を示す。）
を含む単分子膜である、請求項１ないし５のうち何れか一項に記載の電極基板。
【請求項７】
前記膜は、官能基を含み、前記官能基を介してメディエーターまたは生体分子を含む、請求項１ないし６のうち何れか一項に記載の電極基板。
【請求項８】
前記電極と前記膜とは、硫黄原子または酸素原子を介して結合している、請求項１ないし７のうち何れか一項に記載の電極基板。
【請求項９】
前記生体分子は、核酸、タンパク質、酵素および抗体からなる群から選択される、請求項７に記載の電極基板。
【請求項１０】
請求項１ないし９のうち何れか一項に記載の電極基板と、
前記電極基板に対するカウンター電極と、
参照電極と、
を備える、検出装置。
【請求項１１】
前記電極基板と、前記カウンター電極と、前記参照電極とを個別に電気的に接続した検出回路をさらに備える、請求項１０に記載の検出装置。
【請求項１２】
被検物質の検出キットであって、
請求項１０または１１に記載の検出装置と、
前記被検物質との間で反応する生体分子およびメディエーターと、
を含む、キット。
【請求項１３】
緩衝液をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
試料中の被検物質の検出方法であって、
請求項１２または１３に記載のキットを準備する工程と、
前記試料を前記キットと接触させる工程と、
を含む検出方法。
【請求項１５】
前記被検査物質の存在下で電流値を測定する工程をさらに含む、請求項１４に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種分野における被検物質検出用電極基板および該基板を備える検出装置に係り、より詳細には、被検物質との間での電子などのキャリアの授受を検出する電極基板および該基板を備える検出装置等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ、タンパク質、抗体分子等の生体分子を、短時間に効率よく、かつ、正確に認識して、前記生体分子を含むサンプルの構造、機能、重量、電気的性質や光学的性質を情報として伝達できる検出装置の用途は、ヒトゲノム解析が終了した以降、ますます重要になってきている。たとえば、大量のサンプルを短時間に解析できるバイオチップは、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応を蛍光強度で計測する方法（たとえば、特許文献１参照）や、電界印加によって変化するＤＮＡ移動量の差を計測する方法（たとえば、特許文献２参照）等を利用している。一般的には、これらの文献に開示されているように、蛍光反応の強度変化を監視する方法が主流となりつつある。
【０００３】
また、酵素やＤＮＡ、抗体等の生体分子が関与する生体反応を、in vivo（生体内）ではなく、in vitro（生体外）にて、リアルタイムに検出可能なセンサーまたはマイクロセンサーチップの需要が、昨今、かなり高まってきている。特に、ゲノム解析終了後、そのＤＮＡ鎖の機能解析に比重が移ってきており、とりわけ、ＤＮＡ鎖から形成される酵素、抗体などを含むタンパク質の機能解析、その機能に沿った創薬ターゲットの最適化が大きな比重を占めてくる。その解析を効率よく進めるために、つまり、ハイスループットに、ＤＮＡチップ、プロテインチップを利用することがますます重要になる。このようなチップ技術の核心部分は、検出方法（蛍光等の光検出、電気化学的検出、微小重量の検出等）と生体分子の反応との間における検出機構の役割を担うバイオインターサーフェス（以下、単に「ＢＩ」という。）の性能である。
【０００４】
このＢＩは、生体反応の情報をうまく選択して有用な情報パラメータのみ増幅させ、検出パラメータに変換、移動させる能力を必要とする。
【０００５】
かかるＢＩの機能を備える代表的な検出装置として、酵素分子を利用した電気化学的検出装置が実用化されたものを含めて、今後、大きな需要が期待できる。より具体的には、糖尿病疾患から生じる高血糖値を監視するための検出装置では、グルコース分子をグルコン酸に酸化させるグルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼの酵素分子を電極基板に固定化させ、基板上の酵素分子膜中にて血中に含まれるグルコースをグルコース酸へ酸化反応させ、その結果生じる酸化電流を電極にて捕捉、検出することでリアルタイムに検出できる（たとえば、特許文献３ないし５参照）。
【０００６】
このように、血糖値を監視するための検出装置では、一般的には酵素分子等の生体分子が、セルロースなどの水溶性ポリマー中で分散され、混合分散膜として電極上のスピンコート法等によって形成される。または、自己組織化単分子膜（以下、単に「ＳＡＭ」という。）を利用して、生体分子を電極基板表面に固定化または準固定化状態（非共有結合による緩い保持）にさせ、擬似生体反応を固体表面で起こし、監視する方法がある。そして、現在までのところ、ＳＡＭによる生体分子固定化法が急速に主流になりつつある。
【特許文献１】米国特許第５，４４５，９３４号
【特許文献２】米国特許第６，２８０，５９０号
【特許文献３】特開平６−７８７９１号
【特許文献４】特開平６−９０７５４号
【特許文献５】特表平８−５０５１２３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前述のＳＡＭを電極基板表面に固定化する方法には、後述するように、いくつかの問題点が指摘されている：すなわち、（１）単分子膜のため、電極基板表面と生体分子との間の相互作用の制御が困難である；たとえば、金属表面に生体分子が接触すると、生体分子、特に酵素等が変性し、酵素活性が失活してしまうおそれがある；（２）電極基板表面と生体分子との間の非特異的吸着の制御が困難である；たとえば、生体分子等が電極基板表面に静電的、分子間力的に吸着してしまうおそれがある；（３）単分子膜が極薄のため、酵素反応にて生成した酸化電流を監視しているのか、そのとも、リーク電流を監視しているのか、区別することが困難である；（４）従来のＳＡＭでは絶縁性が高く、膜の下部にある電極基板にて酵素等の酸化還元電流を検出できなくなるか、または、逆にＳＡＭの密度、膜厚が小さくリーク電流等が流れ易く、選択的透過膜を形成することが困難である。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、電極基板に生体分子等が付着せずに、選択的に電子のみの移動を可能とする膜を設けた電極基板等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、かかる事情に鑑み、電極基板の表面に生体分子等が付着せずに、選択的に電子やホール等のキャリアのみを移動可能とする膜を鋭意検討したところ、電極基板に特定の膜厚を有する膜を電極基板に配設させることにより、前記目的を達成し得る知見を得て、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、第一の態様では、本発明は、電極と、前記電極との間でキャリアの授受を行うことができる長さの膜厚を有し、前記電極に配設された膜と、を備える電極基板を提供する。かかる構成により、電極基板には生体分子等が付着せずに、電子やホール等のキャリアを選択的に透過させることができる電極基板が実現される。
【００１１】
本発明に係る電極基板の好ましい態様では、前記膜厚は、１０〜８０Åである。かかる長さを採用することにより、リーク電流の検出を回避するとともに、たとえば、生体分子との反応の結果生じた酸化電流もしくは還元電流のみを選択的に検出することができる。
【００１２】
また、第二の態様では、本発明は、電極と、前記電極上に配設された膜と、を備え、
前記膜は酸素原子を含有する材料を含む、電極基板を提供する。このような電極基板により、電子やホール等のキャリアを選択的に透過させることができる電極基板が実現される。
【００１３】
本発明に係る電極基板の好ましい態様では、前記膜は、主鎖に酸素原子を含む材料である。主鎖に酸素原子を有することで、キャリアの選択的な透過が可能となる。具体的には、デンドリマー等の分岐型高分子であって、主鎖に酸素原子を含む材料が挙げられる。
【００１４】
本発明に係る電極基板の好ましい態様では、前記材料は、直鎖構造を有する化合物を含み、前記直鎖構造中に酸素原子を含む。直鎖構造中に酸素原子を有することで、キャリアのより選択的な透過が実現される。
【００１５】
本発明に係る電極基板の好ましい態様では、前記膜は、式−ＣＨ2−で表される基を含む化合物、式−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−で表される基を含む化合物、式−ＣＨ2−および式−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−で表される基を含む化合物、または下記式（１）で表される基を含む化合物
【００１６】
【化１】
2006242925.tif 000003
（ここで、ｍ、ｎ、ｌは１以上の整数であり、Ｘは、メチレン基またはカルボニル基を示す。）
を含む単分子膜である。かかる構造を有する単分子膜を電極基板に設けることで、電極基板に生体分子等が付着せずに、選択的にキャリアのみの移動が実現される。
【００１７】
本発明に係る電極基板の好ましい態様では、前記膜は、官能基を含み、前記官能基を介してメディエーターまたは生体分子を含む。このように、単分子膜にメディエーターまたは生体分子を設けることで、効率的なキャリアの授受を可能とする。
【００１８】
本発明に係る電極基板の好ましい態様では、前記電極と前記膜とは、硫黄原子または酸素原子を介して結合している。かかる誘導体を用いることで、強固に、かつ、秩序構造を有する態様で、前記膜を電極基板に固定化することができる。
【００１９】
本発明に係る電極基板の好ましい態様では、前記生体分子は、核酸、タンパク質、酵素および抗体からなる群から選択される。これらの分子を用いることで、被検物質との相互作用に基づく電子の授受に起因したキャリア、具体的には電流の検出が実現される。
【００２０】
また、第三の態様では、本発明は、前述の電極基板と、前記電極基板に対するカウンター電極と、参照電極と、を備える検出装置を提供する。かかる検出装置を用いることで、in vitroにて、被検物質の検出を可能とする。
【００２１】
本発明に係る検出装置の好ましい態様では、前記電極基板と、前記カウンター電極と、前記参照電極とを、個別に電気的に接続した検出回路をさらに備える。かかる検出回路を用いることで、発生した電流を検出することが可能となる。
【００２２】
さらに、第四の態様では、本発明は、被検物質の検出キットであって、前述の検出装置と、前記被検物質との間で反応する生体分子およびメディエーターと、を含むキットを提供する。かかるキットにより、簡易に被検物質の有無の判別することが可能となる。本発明に係るキットの好ましい態様では、前記生体分子は酵素である。酵素を用いることが、試料中に存在する分子との間における、抗原抗体反応や酸化還元反応が行われ、その反応にて生じたキャリア、具体的には電子の授受を電極基板にて、酸化電流もしくは還元電流として検出することが可能となる。
【００２３】
本発明に係る検出キットの好ましい態様では、緩衝液をさらに含む。緩衝液を用いることで、被検物質を含む試料のｐＨの変動を抑制することができ、再現性のある検出が可能となる。
【００２４】
さらにまた、第五の態様では、本発明は、試料中の被検物質の検出方法であって、前記キットを準備する工程と、前記試料を前記キットに接触させる工程と、を含む検出方法を提供する。かかる方法によれば、簡易に試料中の特定の被検物質の検出ができる。
【００２５】
本発明に係る検出方法の好ましい態様では、前記被検査物質の存在下で電流値を測定する工程、をさらに含む。かかる電流値の結果に基づき、試料中に存在する被検物質の有無の検出ができ、さらに被検物質の不存在下での電流値との比較から、被検物質の濃度を算出することも可能となる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係る電極基板によれば、電極基板の表面には生体分子等が付着せずに、電子を選択的に通過させることができる電極基板が提供される。さらに、かかる電極基板を用いて、被検物質の検出を容易に可能とする検出装置が実現される。さらにまた、前記検出装置と生体分子およびメディエーターとを組み合わせることにより、グルコースやスーパーオキサイドラジカル等の被検物質の検出を容易に可能とする検出キットおよび検出方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
次に、本発明の実施の形態について、図面を参照しつつ説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。
【００２８】
図１は、本発明に係る電極基板１０の概略断面図を示す。本発明に係る電極基板１０は、電極２０と、前記電極２０に配設され、その電極との間で電子やホール等のキャリアの授受を可能とする長さの膜厚を有する膜３０とを備える。本発明に用いる電極２０の材質としては、特に限定されず、炭素、金、銀、白金、銅等が挙げられる。図１に示す電極の形状は、平板状で例示しているが、この形状に限定されることなく、ピンなどの円柱状等であってもよい。
【００２９】
本発明に用いる膜３０は、本発明に係る電極基板１０を用いて被検物質の検出に用いる際、電極２０の表面に被検物質や、当該被検物質と反応する生体分子などが電極２０の表面に付着するのを防止し、電子やホール等のキャリアのみを選択的に透過させる膜である。ここで、本発明で用いる生体分子とは、たとえば、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸や、酵素や抗体などのタンパク質をいう。生体分子等の表面への付着防止および電子の選択的透過の観点から、本発明に用いる膜３０の膜厚としては、１０〜８０Åであることが好ましく、より好ましくは１０〜５０Åであり、さらに好ましくは１０〜３０Åであるが、膜を構成する材料の性質や使用の目的に応じて、膜厚は適宜選択可能である。
【００３０】
また、本発明の別の態様では、本発明に係る電極基板１０に用いる膜３０は、酸素原子を含有する材料を含む。具体的には、前記材料は、主鎖に酸素原子を含む。主鎖に酸素原子を含む材料の具体例としては、デンドリマーなどの分岐型高分子等が挙げられる。また、前記材料は、直鎖構造を有する化合物を含み、該直鎖構造中に酸素原子を含んでいてもよい。
【００３１】
本発明に用いる膜３０を構成する基の具体例としては、前述の所定の膜厚を有するならば特に限定されず、式−ＣＨ2−で表される基を含む化合物、式−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−で表される基を含む化合物、式−ＣＨ2−および式−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−で表される基を含む化合物、または下記式（１）で表される基を含む化合物
【００３２】
【化１】
2006242925.tif 000004
（ここで、ｍ、ｎ、ｌは１以上の整数であり、Ｘは、メチレン基またはカルボニル基を示す。）
を含む単分子膜等が挙げられる。
【００３３】
本発明に用いる膜３０を形成するための機能性分子としては、特に限定されないが、式−ＣＨ2−で表される基を含む化合物、式−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−で表される基を含む化合物、式−ＣＨ2−および式−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−で表される基を含む化合物、または下記式（１）で表される基を含む化合物
【００３４】
【化１】
2006242925.tif 000005
（ここで、ｍ、ｎ、ｌは１以上の整数であり、Ｘは、メチレン基またはカルボニル基を示す。）
を含む分子等が挙げられる。かかる機能性分子は、電極表面との間で膜を形成し得るように、結合可能な官能基を有している。その官能基は、用いる電極の種類等との関係に応じて選択され得る。本発明で用いる機能性分子における、該電極と結合可能な官能基としてはカルコゲン原子である硫黄原子または酸素原子等が挙げられる。結合に作用する硫黄原子の具体例としては、たとえば、チオール基（−ＳＨ）やジスルフィド（−ＳＳ−）基等を含む化合物が挙げられ、結合に作用する酸素原子の具体例としては、シリル基（−Ｓｉ−）等を含む化合物が挙げられる。
【００３５】
図２は、本発明による一の態様の電極基板の概略断面図を示す。図２（Ａ）に示す膜３０は、ポリエチレングリコールの一方の末端がチオール基を有する機能性分子を利用して形成される膜を例示し、図２（Ｂ）は、ポリエチレンの一方の末端がチオール基を有する機能性分子を利用して形成される膜を例示する。ここで、図２に示す例におけるｋおよびｊの値は、おおよそ２０から３０の間の整数である。たとえば、下記式（２）および（３）で表される、Ｐｏｌｙｐｕｒｅ製のmPEG thiolやPEG thiol propionic acidを用いて、電極上に膜を形成することができる。
【００３６】
【化２】
2006242925.tif 000006
ここで、ｘおよびｙは、任意の整数である。
【００３７】
本発明において、膜３０を電極上に形成する方法について説明する。図２（Ａ）および図２（Ｂ）に例示した電極に膜を形成する方法は、以下の方法に限定されないが、電極を、前述の機能性分子を含む溶液に浸すことにより、電極上に膜を形成することができる。
【００３８】
次に、本発明による電極基板の応用例について説明する。本発明の一の態様によれば、糖尿病患者のグルコース濃度（血糖値）の測定に適用可能である。図３は、本発明による電極基板を用いた、グルコース濃度測定の概略模式図を示す。図３の例示では、被検物質としてグルコースの検出を説明する。図３に示すように、本発明に係る電極基板１０は、血液試料中のグルコースが、生体分子であるグルコースオキシターゼ（以下、単に「ＧＯＤ」という。）の作用によりグルコノラクトンへ酸化すると同時に、酵素であるＧＯＤの活性中心にあるＦＡＤ（Flavin adenine nucleotide）が還元されてＦＡＤＨ（還元体）に変換される。そして、ＦＡＤＨに蓄えられた電子は、メディエーター（以下、単に「ＭＥＤ」という。）を介して、本発明による基板電極１０へ到達する。その際、電子の動きは、本発明に係る電極基板１０上に設けた膜を選択的に透過して電極基板１０まで移動し、酸化電流として検出される。そのため、測定された電流値の大小から、試料中に含まれる被検物質であるグルコースの量を同定することができる。なお、電流の測定は、サイクリックボルタンメトリーやディフェレンシャルパルスボルタンメトリー等により実行することができる。
【００３９】
このように、本発明に係る電極基板１０が備える膜３０が所定の長さ以上である場合には、膜が、電子が電極へ移動する障壁となり、酸化電流を測定することが不可能となり、逆に、膜の膜厚が所定の長さよりも短い場合には、生体分子等が電極表面に付着し、酵素等の生体分子が変性してしまうおそれがある。
【００４０】
前述のグルコース濃度の測定の場合、本発明で用いるメディエーターの具体例としては、特に限定されないが、フェロセン、フェロセン誘導体等を挙げることができ、反応補酵素として、ピロキノリンキノン、ニコチンアミドアデニンヌクレオチド等を共存させてもよい。
【００４１】
また、本発明の別の態様によれば、ＧＯＤおよびＭＥＤを、電極基板が有する膜の末端の官能基を介して膜に結合させてもよい。具体的には、膜を構成する単分子として、式−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−基を有する分子を用いた場合であって、その末端が水酸基（−ＯＨ）であるとき、その水酸基を介してＭＥＤ等を結合させることができる。さらに、その水酸基の反応性を利用して、マレイミド基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を導入し、酵素の表面に存在する活性アミノ基やチオール基と反応させて、生体分子を膜３０に直接導入することもできる。
【００４２】
また、本発明に係る電極基板１０を用いて、活性酸素種の検出にも適用可能である。ここで、活性酸素種とは、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ2-）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、過酸化水素などをいう。このような活性酸素種を生体内で多量に摂取すると組織障害を起こし、炎症、老化、発癌、心筋梗塞などの様々な疾患を引き起こすことが知られている。特に、ヒドロキシラジカルは、活性酸素種の中でも活性が高く、拡散律速的に生体にアタックして細胞等の脂質から水素を引き抜き、脂質を過酸化脂質ラジカルとして炎症や各種疾患を引き起こすと考えられている。他方、生体は各種活性酸素を低減するためのいくつかの酵素を有している。たとえば、スーパーオキサイドディスムターゼ（以下、単に「ＳＯＤ」という。）は、スーパーオキサイドアニオンを不均化反応で過酸化水素に変換するが、カタラーゼやグルタチオンペルオキシダーゼは、過酸化水素を消失させる。
【００４３】
かかる現象を利用して、後述するように、スーパーオキサイドラジカルの検出が可能となる。図４（Ａ）および４（Ｂ）は、本発明による電極基板１０を用いた、スーパーオキサイドラジカルの検出を説明する概略模式図である。図４（Ａ）は、ＳＯＤ４０とカタラーゼ５０の組み合わせで修飾された電極基板１０の概略図であり、図４（Ｂ）は、ＳＯＤ４０とホースラディッシュパーオキシダーゼ６０との組み合わせで修飾された電極基板１０の概略図である。各種酵素により電極基板の修飾は、本発明による膜３０を有する電極基板１０において、膜の末端にある水酸基を介して、または該水酸基から誘導されたマレイミド基あるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を介して行うことができる。
【００４４】
図４（Ａ）に示すように、スーパーオキサイドラジカルを含む試料溶液を、酵素としてＳＯＤやカタラーゼが固定化された電極基板１０と接触させると、そのラジカルは、最初にＳＯＤ酵素の反応部位に取り込まれ、活性部位中に存在する亜鉛、マンガンまたは銅原子の触媒作用により過酸化水素に還元される。この過酸化水素は、ＳＯＤと同様に電極基板１０に固定化されているカタラーゼ５０によってさらに還元されて水と酸素に変換される。その際、電極基板１０から供給される電子によって酵素触媒反応が活性化されるため、その際、電極基板１０から供給される還元電子の量を還元電流として測定できる。この還元電流の大小により、試料中に存在するスーパーオキサイドラジカルの量を同定することができる。なお、電流の測定は、サイクリックボルタンメトリーやディフェレンシャルパルスボルタンメトリー等により実行することができる。
【００４５】
図４（Ｂ）は、図４（Ａ）におけるカタラーゼ５０に代えてホースラディッシュパーオキシダーゼ（以下、単に「ＨＲＰ」という。）６０を用いて修飾した電極基板１０を利用した場合における、スーパーオキサイドラジカルの検出の概略図である。なお、図４（Ｂ）におけるスーパーオキサイドラジカルの反応機構は、図４（Ａ）にて説明したカタラーゼ５０を用いた場合と同様である。
【００４６】
図４（Ａ）および図４（Ｂ）に例示する本発明の実施形態において、さらにフェロセン等の電子移動を補助するメディエーターが含まれてもよい。
【００４７】
図５は、本発明に係る電極基板１０と、前記電極基板１０に対するカウンター電極７０と、参照電極８０とを備える、本発明に係る検出装置１００の概略平面図を示す。図５に示す検出装置１００は、主要な電極構成のみを例示するが、本発明に用いるカウター電極７０は、特に限定されないが、白金から構成され、本発明に用いる参照電極８０は、電極基板１０とカウンター電極７０の電位の基準となる電極であり、特に限定されないが、塩化銀から構成される。たとえば、被検物質を含む試料を、前記カウンター電極７０および前記参照電極８０と、前記被検物質と反応する酵素等が固定化された、本発明による電極基板１０とを覆うように滴下すると、本発明による電極基板１０にて電子の授受が行われる。図５には不図示であるが、前記カウンター電極７０および前記参照電極８０と、本発明による電極基板１０とを、個別に検出回路１２０と電気的に接続することにより、検出された電流を検出回路１２０にて測定できる。本発明で用いる検出回路１２０の具体例としては、特に限定されないが、薄膜トランジスタ等が挙げられる。なお、電流の測定は、電気化学的な測定で可能であり、たとえば、サイクリックボルタンメトリーやディフェレンシャルパルスボルタンメトリー等により行うこともできる。
【００４８】
また、本発明は、本発明による検出装置１００を備える検出キットを提供する。具体的には、本発明に係る検出キットは、前記検出装置１００と、被検査物質と反応する酵素等の生体分子と、被検物質と生体分子との間で生じた電子の移動を補助するメディエーターとを備える。本発明に係る検出キットは、図３および図４で説明したように、簡易にグルコース濃度の測定や、食品に含まれる活性酸素種の検出が可能となる。また、本発明に係る検出用キットは、水溶液である反応場のｐＨを制御する目的から、緩衝液、たとえば、リン酸緩衝液をさらに含む。なお、本発明に係る電極基板１０、カウンター電極７０、参照電極８０および検出回路１２０を薄膜構造とすることで、本発明に係るキットの小型化が実現される。
【００４９】
さらに、本発明は、試料中の被検物質の検出方法であって、前述の本発明に係るキットを準備する工程と、生体試料、食品試料や、水や空気中の成分を含む環境試料などの、被検物質を含有する試料を、前記キットの電極基板１０と接触させる工程を含む検出方法を提供する。そして、前記被検物質の存在下において、前記電極基板１０にて観測された酸化電流または還元電流を、サイクリックボルタンメトリーやディフェレンシャルパルスボルタンメトリー等により測定することにより、被検物質の有無を観測することができる。くわえて、被検物質の検量線を事前に準備し、被検物質の不存在下と存在下の双方の場合において、本発明に係る電極基板１０を介して酸化電流または還元電流を測定することにより、被検物質の濃度をも算出することが可能となる。
【００５０】
図６は、複数の本発明に係る検出装置１００と、各検出装置１００と個別に電気的に接続された検出回路１２０とを備える装置１５０の概略平面図を示す。また、検出回路１２０と検出装置１００との電気的接続は、検出装置１００のうち、本発明に係る電極基板１０、カウンター電極７０および参照電極８０のそれぞれから個別に、検出回路１２０と接続されている。検出回路１２０として薄膜トランジスタを用いた場合、本発明による電極基板１０を、薄膜トランジスタのドレイン部に接続し、電極基板１０にて測定された電流値を受け、さらに増幅させることもできる。
【００５１】
図６に示すように、かかる装置は、個別に検出装置１００毎に、同一または異なる試料と接触させることで、同時に同一試料または複数の試料における被検物質の検出が可能となる。さらに、同一の試料でも、濃度を変化させて個別の検出装置１００と接触させて測定することも可能である。なお、各検出装置１００と検出回路１２０を接続する回路は、特に限定されないが、銀配線１６０等で接続されている。
【００５２】
図７は、図６に示した装置１５０を、パーソナルコンピュータ（以下、単に「ＰＣ」という。）１６０に接続して、ＰＣにて駆動可能にしたシステム２００の概略斜視図を示す。なお、装置１５０は、たとえば、プラスチック基板で覆われた構造であり、ディスポーザブル化した構成を示す。本発明で用いるプラスチック基板の具体例としては、特に限定されないが、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂等が挙げられる。かかる構成により、装置１５０のみを使い捨て構造にし、図３および４にて説明したように、血糖値の管理や、食品に含まれる活性酸素種の検出を、簡易に行うことができる。特に、ＰＣとの接続により、検出回路１２０として薄膜トランジスタを介して、薄膜トランジスタにて得られた情報をＵＳＢ等のインタフェースでＰＣに送信することができ、もってＰＣ駆動による検出が可能となる。また、装置１５０に、薄膜トランジスタと接続したＲＦタグを配して、薄膜トランジスタにて得られた情報を無線通信により、ＰＣへ送信することができる。試料の検出をする際、マイクロスポッティング法やインクジェット法等により、試料の液滴を、本発明による電極基板１００と接触させて検出することも可能である。かかるシステム２００により、in vitroにて、リアルタイムに検出可能なセンサーシステム２００が提供される。
【００５３】
以下に示す本発明の実施例及び比較例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであり、本発明は以下の具体例に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例に様々な変更を加えて本発明を実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。
【００５４】
(実施例)
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むチオールから作成された膜を含む電極と、アルカンチオールから作成された膜を含む電極とを用いて、溶液中でグルコースオキシダーゼがグルコース添加によって酵素反応を起こし、グルコン酸を生成する際、発生する酸化電流を選択的に透過する度合いを、サイクリックボルタノメトリー（ＣＶ）で測定した。溶液中には、グルコースオキシターゼ酵素分子を、０．１Ｍ  ＰＢＳ緩衝液溶液中に、１．２ｍｇ/１００ｍｌの濃度で調整し分散させた。さらに、０．１Ｍに調整したＦｅ（ＣＮ）63-イオンを混合さえ、十分に窒素置換された溶液中に金電極上に膜で修飾されたサンプル電極基板（working electrode）、Ｐｔカウンター電極、ＡｇＣｌ参照電極を入れて、温度３５度でグルコース添加後にＣＶ測定を行った（図８参照）。アルカンチオールから作成された膜のうち、膜厚が大きいＣ１８（ヘキサデカンチオール）から作成された膜は、電極表面で絶縁膜として作用し、酸化電流は観測されなかった（図８のＣ１８に相当）。
一方、Ｃ６（ヘキサンチオール）から作成された膜は、膜として薄いため（膜厚約５Å）、容易に酸化電流を透過させるが、他の酵素反応以外の要因からも電流検出されやすく、選択性という点で問題を有する。
ＰＥＧを含む膜の場合は、膜厚が約２５Åにもかかわらず、酵素反応によって生じる酸化電流を、選択的かつ効率よく酸化電流を透過させることが可能であることが判明した(図８のＰＥＧに相当)。さらに、グルコースオキシダーゼ存在下、グルコース添加なしで電圧を加えると、酵素反応が全く起こらないため、電子透過性のよりＰＥＧを含む膜を電極表面に設けても、電流は一切測定されなかった。つまり、ＰＥＧを含む膜は、酵素反応から生じた反応電子のみを選択的に電極へ移動させる効果が実証された。
【００５５】
(例)
スーパーオキサイドラジカルの検出をするため、酵素としてＳＯＤとＨＲＰを利用した場合における、本発明に係る電極基板を作製することができる。各酵素分子の電極基板上への固定化は、金電極を用いた場合、特に限定されないが、以下のように行う。すなわち、アミノエタンチオールをジメチルスルホキシド溶液、１０ｍＭ中に金電極基板を２時間浸漬させて、アミノ基で表面被覆されたＳＡＭを形成させる。次いで、グルタルアルデヒド１％水溶液中に上記アミノ被覆電極基板を１時間浸漬させると、アルデヒド被覆表面を有する金電極基板が形成される。この基板を、再度、ＳＯＤ  ５０units/ml  ＰＢＳ緩衝液５０ｍＭ中に浸漬させて、酵素表面のアミノ基とアルデヒド基本とを反応させてイミド結合を形成させて、酵素分子の固定化を行う。他の酵素であるＨＲＰも同様にして、電極基板表面に固定化される。このように、固定化された酵素分子膜を有する電極基板上に、スーパーオキサイドラジカルを含む試料溶液と接触させると、ラジカルは、まず酵素ＳＯＤの作用により過酸化水素に還元される。この過酸化水素は、ＳＯＤと同じように電極基板表面に固定化されたＨＲＰによってさらに還元されて水と酸素を生成する。その際、電極より供給される電子によって酵素触媒反応が活性化される。そして、電極より供給される還元電子の量が還元電流として、サイクリックボルタンメトリーにより測定される。この還元電流の量が大きければ、先の試料溶液中には多量のスーパーオキサイドラジカル種が包含されており、逆に、この還元電流の量が小さければ、スーパーオキサイドラジカルの量は少量であることが判明する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、本発明に係る電流検出用電極基板の概略断面図を示す。
【図２】図２（Ａ）および図２（Ｂ）は、本発明による一の態様の電極基板の概略断面図を示す。
【図３】図３は、本発明による電極基板を用いた、グルコース濃度測定の概略模式図を示す。
【図４】図４（Ａ）および図４（Ｂ）は、本発明による電極基板を用いた、スーパーオキサイドラジカルの検出を説明する概略模式図を示す。
【図５】図５は、本発明に係る電極基板と、前記電極基板に対するカウンター電極と、参照電極とを備える、本発明による検出装置の概略平面図を示す。
【図６】複数の本発明に係る検出装置と、各検出装置と個別に電気的に接続された検出回路とを備える装置の概略平面図を示す。
【図７】図７は、図６に例示した装置を、パーソナルコンピュータに接続して、パーソナルコンピュータで駆動可能にしたシステムの概略斜視図を示す。
【図８】図８は、グルコースの検出において、本発明による電極基板を用いて得られたサイクリックボルタンメトリーの結果を示す。
【符号の説明】
【００５７】
１０・・・電極基板、２０・・・電極、３０・・・膜、７０・・・カウンター電極、８０・・・参照電極、１００・・・検出装置、１２０・・・検出回路、１５０・・・装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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