(57)【要約】【課題】  特にヒト白血病細胞抽出液中のテロメラーゼに対し、高い活性阻害作用を示し、かつ相補的なＤＮＡとの間の２本鎖ハイブリッドを安定した状態で与える新規なコンジュゲートを提供する。【解決手段】  一般式【化１】2006075110.tif 000012  （Ａ1はアルキレン基又は酸素原子で中断されたアルキレン基、Ａ2はアルキレン基、Ｒはペブチド、糖又は機能性アミンの残基、ｎは０又は１）で表わされるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドコンジュゲートである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
2006075110.tif 000011
（式中のＡ1はアルキレン基又は酸素原子で中断されたアルキレン基、Ａ2はアルキレン基、Ｒはペブチド、糖又は機能性アミンの残基、ｎは０又は１である）
で表わされるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドコンジュゲート
【請求項２】
請求項１記載のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドコンジュゲートを有効成分としてなるアンチセンス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト白血病細胞抽出液中のテロメラーゼ活性を阻害する新規なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれを有効成分としたアンチセンス剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドとペプチドとの複合体は、遺伝子発現のアンチセンス剤として使用するためのポテンシャルを有し、そのペプチドにより活性オリゴヌクレオチドの細胞間濃度の増大を助長させるので、その形成のために多くの試みがなされている。
【０００３】
例えば、合成オリゴヌクレオチドの５´‐末端にチオール基を導入することにより、ＤＮＡとペプチドサイフォンとのコンジュゲートが得られている（非特許文献１参照）。そのほか、タンパク質分子中に存在するアミノ基、カルボン酸基、水酸基、フェノール基などの官能基を利用し、ジアルキル化試薬、ジマレイミド、ジアルデヒドなどの二官能性リンカーを介して機能性有機化合物、例えばアンジオテンシンＩ、インスリン、プラジキニン、トプラマイシン、その他の抗ガン性物質を複合させたものも知られ、また芳香族ジチオイソシアネートをリンカーとして用いることも提案されている（非特許文献２参照）。
【０００４】
しかしながら、これらのオリゴヌクレオチドとペプチドとの複合体は、その製造において必要な原料のコストが高い上に、製造過程も煩雑で、収率が低く、しかもアンチセンス特性も不十分であるため、実用的には必ずしも満足できるものではなかった。
【０００５】
【非特許文献１】「バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９４年、第５巻、ｐ．３７３−３７８
【非特許文献２】「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９６４年、第１４４巻、ｐ．１３４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、特にヒト白血病細胞抽出液中のテロメラーゼに対し、高い活性阻害作用を示し、かつ相補的なＤＮＡとの間の２本鎖ハイブリッドを安定した状態で与える新規なコンジュゲートを提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、新規なＤＮＡコンジュゲートを開発するために鋭意研究を重ね、先に天然型オリゴＤＮＡにω‐アミノアルキルホスホロエートを介して核局在化シグナルポリペプチドを縮合させることにより、優れたアンチセンス特性を有し、相補的なＤＮＡとの間で安定した２本鎖ハイブリッドを形成するＤＮＡコンジュゲートを得ることに成功したが、さらに研究を進めた結果、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（以下Ｓ‐オリゴヌクレオチドと略す）に核局在化シグナルペプチドを縮合させることにより、ヒト白血病細胞抽出液中のテロメラーゼに対し、高い活性阻害作用を示すＳ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲートが得られることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、一般式
【化１】
2006075110.tif 000002
（式中のＡ1はアルキレン基又は酸素原子で中断されたアルキレン基、Ａ2はアルキレン基、Ｒはペブチド、糖又は機能性アミンの残基、ｎは０又は１である）
で表わされるＳ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲート、及びそれを有効成分としてなるアンチセンス剤を提供するものである。
【０００９】
本発明におけるＳ‐オリゴヌクレオチドは、天然型オリゴヌクレオチドにおけるリン酸ジエステル構造がホスホリン酸ジエステル構造に変ったものである。
このオリゴヌクレオチドとしては、１０〜１５個の塩基単位からなるヌクレオチドの残基、例えば配列表配列番号１‐３´及び配列表配列番号２‐３´などが好ましい。
【００１０】
前記の一般式（Ｉ）におけるＳ‐オリゴヌクレオチドの由来については、特に制限はなく、各種動物細胞由来のオリゴヌクレオチド、各種細菌類由来のオリゴヌクレオチドあるいはそれらを酵素で細断して得られるヌクレオチドセグメントなどの中から、その使用目的に応じ任意に選んで使用することができるが、本発明においては、５´‐末端水酸基にアミノ化剤を反応させてアミノ基を導入したものを用いることが必要である。
【００１１】
次に、一般式（Ｉ）中のＡ1結合のアルキレン基としては、炭素数２〜１０、好ましくは４〜８のポリメチレン基、例えばエチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基などを挙げることができる。このアルキレン基は、炭素鎖が酸素原子で中断されたもの、例えば２‐オキサプロピレン基、３‐オキサペンチレン基、４‐オキサヘプチレン基などであってもよい。
また、一般式（Ｉ）中のＡ2結合のアルキレン基としては、炭素数４〜１２のポリメチレン基又は分枝状アルキレン基が好ましい。
【００１２】
そして、前記のＳ‐オリゴヌクレオチドにリンカーを介して導入されるペプチドとしては、各種タンパク質の分解により得られるペプチド、例えば核外輸送シグナルペプチド、抗原由来の核局在化シグナルペプチド、合成された両親媒性α‐へリックス、β‐シートペプチドなどを、糖類としては、ショ糖、ガラクトサミンなどを、また機能性アミンとしては、スペルミン、リポフェクトアミンなどを挙げることができる。
【００１３】
本発明のＳ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲートのうち、一般式（Ｉ）において、ｎ＝１のものは、固相フラグメント縮合法に従い、固相担体例えば多孔性ガラス、制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）、ポリエチレングリコール−ポリスチレンなどに、５´末端に水酸基をもつＳ‐オリゴヌクレオチドを縮合させたのち、触媒の存在下、一般式
【化２】
2006075110.tif 000003
（式中のＲ1及びＲ2は保護基、Ａ1は前記と同じ意味をもつ）
で表わされる亜リン酸エステルを反応させ、５´末端を化学修飾し、一般式
【化３】
2006075110.tif 000004
（式中のＲ1、Ｒ2及びＡ1は前記と同じ意味をもつ）
で表わされるＤＮＡ誘導体を形成させたのち、酸化して、一般式
【化４】
2006075110.tif 000005
（式中のＲ1、Ｒ2及びＡ1は前記と同じ意味をもつ）
で表わされるＳ‐オリゴヌクレオチド誘導体とし、次いで一般式
ＯＣＮ−Ａ2−ＮＣＯ  （Ｖ）
（Ａ2は前記と同じ意味をもつ）
で表わされる脂肪族ジイソシアネートを反応させることにより、一般式
【化５】
2006075110.tif 000006
（式中のＲ1、Ａ1及びＡ2は前記と同じ意味をもつ）
で表わされる化合物を製造したのち、これにペプチド、糖又は機能性アミンを反応させ、最後にアルカリ例えばアンモニア水で処理して固相担体からの切りはなし、及び保護基の脱離を行うことにより製造することができる（以下合成法１という）。
【００１４】
一方、一般式（Ｉ）において、ｎ＝０のものは、前記一般式（Ｖ）で表わされる脂肪族ジイソシアネートの代りに、式
【化６】
2006075110.tif 000007
で表わされるカルボニルジイミダゾールを用いて、一般式
【化７】
2006075110.tif 000008
（式中のＲ1、Ａ1は前記と同じ意味をもつ）
で表わされる化合物を製造したのち、これにペプチド、糖又は機能性アミンを反応させ、さらにアルカリ処理することにより製造することができる（以下合成法２という）。
これらの反応は、適当な溶媒、例えばアセトニトリル、ジメチルホルムアミドなどを用いて行われる。
【００１５】
次いで、このようにして得た反応生成物にアンモニア水を加え、固体担体からＤＮＡコンジュゲートを切り出すとともに、場合により存在するペプチドの保護基の脱離を行う。
Ｒ1及びＲ2で示される保護基としては、例えば２‐シアノエチル基のようなω‐シアノアルキル基や、４‐メトキシフェニルジフェニルメチル基のようなトリフェニルメチル誘導体残基が用いられる。
【００１６】
このようにして得られる一般式
Ｓ‐オリゴヌクレオチド−ＰＯ3ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−Ｒ
で表わされる本発明のＳ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲートの例としては、Ｓ‐オリゴヌクレオチド及びＲが以下の表１に示す構造をもつＣ1〜Ｃ3を挙げることができる。
【００１７】
【表１】
2006075110.tif 000009
【００１８】
天然オリゴヌクレオチドは、細胞導入剤がないと細胞内に全く導入されない。
しかしながら、これに核局在化シグナルペプチドをコンジュゲートさせると、細胞導入剤なしに細胞内に容易に導入され、かつ核内に局在化するし、核外輸送シグナルペプチドをコンジュゲートさせると細胞内に容易に導入され、かつ細胞質（核外）に局在化する。
これに対し、Ｓ‐オリゴヌクレオチドに核局在化シグナルペプチドをコンジュゲートさせた本発明のＳ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、細胞導入剤なしに細胞内に容易に導入され、しかも細胞質と核内の両方に局在化する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によると、簡単な反応操作により、特にテロメラーゼ活性に対して高い阻害作用を示し、優れたアンチセンス特性をもち、相補的なＤＮＡとの間で安定した２本鎖ハイブリッドを形成しうる、アンチセンス剤として好適なＳ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲートを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００２１】
先ずＤＮＡ自動合成機（クルアケム（Ｃｒｕａｃｈｅｍ）社製、製品名「ＰＳ２５０」）を用い、制御多孔性ガラス（グレンリサーチ社製、製品名「５００Åサポート」、以下ＣＰＧと略す）に、５´末端の水酸基をジメトキシトリチル基で保護したＳ‐オリゴヌクレオチド（５´‐配列表配列番号３‐３´）を担持させたのち、トリクロロ酢酸の３質量％アセトニトリル溶液で処理して、その保護基を脱離し、その遊離水酸基に市販のアミノ化試薬であるＮ‐メトキシトリチル‐２‐（２‐アミノエチルオキシ）エチルホスホアミダイトを１Ｈテトラゾールを含むジメチルホルムアミド溶液により室温下、３０分間反応させることによりアミノ化した。
【００２２】
次いで未反応の５´‐水酸基を無水酢酸によりキャッピングしたのち、ヨウ素酢酸溶液によりリン原子部分を酸化してリン酸エステルを形成させた。このようにして得た中間体化合物にトリクロロ酢酸の３質量％アセトニトリル溶液を反応させて末端アミノ基の保護基であるメトキシトリチル基を除去し、次にヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＩ）又はカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）とジイソプロピルエチルアミンを含むジメチルホルムアミド中、室温下２〜１２時間反応させたのち、ＳＶ４０Ｔ抗原核局在化シグナル（配列表配列番号７）をジイソプロピルエチルアミンを含むジメチルホルムアミド中、室温下２４時間反応させた。
【００２３】
次に、このようにして得た反応生成物を濃アンモニア水中、５５℃において４時間処理することにより、ＣＰＧからの切り出しとオリゴヌクレオチド及びペプチドに結合している保護基の除去を行い、所望のＳ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲートを粗製物として得た。
この粗製物を逆相液体クロマトグラフを用いて精製し、得られた化合物を液体クロマトグラフ及びレーザー励起飛行時間型質量スペクトル分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）により分析した。この際の収率は３０．４５％、ＴＯＦ−ＭＳは５６４２．６３であった。
【００２４】
比較例
実施例１におけるＳ‐オリゴヌクレオチドの代りに、天然オリゴヌクレオチド（配列表配列番号２‐３´）を用いる以外は、実施例１と同様に処理してオリゴヌクレオチドコンジュゲートＮｏ．２を製造した。この際の収率は１８．２１ｗｔ％、ＴＯＦ−ＭＳは５３８４．２６であった。
【実施例２】
【００２５】
実施例１で得たＳ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲート試料Ｎｏ．１及び比較例で得たオリゴヌクレオチドコンジュゲートＮｏ．２について、相補鎖ＤＮＡとの安定性を次のようにして試験した。
ＵＶ検出器（日本分光社製、製品名「Ｖ−５６０ＵＶ／Ｖｉｓスペクトロメータ」）を用い、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2からなる緩衝溶液（ｐＨ７．０）中に各試料を１μＭ濃度で溶解し、これに相補鎖ＤＮＡを加え、９２℃で５分間加熱することにより、いったん２本鎖を融解したのち、４℃まで徐冷して２本鎖を再結合させた。
次いで、これを５℃から８０℃まで０．５℃／分の上昇速度で加熱し、ＵＶ検出器により２６０ｎｍにおける吸光度変化を測定し、５０％吸光度上昇地点の温度を融解温度として算出した。その結果を表２に示す。
なお、表中の＋Ｍｇは測定溶液にＭｇＣｌ2が存在する場合、−ＭｇはＭｇＣｌ2が存在しない場合を示す。
【００２６】
【表２】
2006075110.tif 000010
この表から、本発明のＳ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子は、相補的なＲＮＡとの間でハイブリッド２本鎖を形成しうることが分る。
【実施例３】
【００２７】
本発明のＳ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲートのＤＮＡ分解酵素ＤＮアーゼ１に対する耐性試験を行った。
すなわち、実施例１で得た試料Ｎｏ．１を０．１Ｍ  ＮａＣｌで濃度１μＭに調整し、この中に１６０Ｋｕｎｉｔ単位のＤＮアーゼ１（シグマ社製）５ｍｌを加え、３７℃に保持して、経時的にその分解率を測定したところ、１８０分間における分解率は１３％であった。
また、比較のために、比較例で得た天然オリゴヌクレオチドコンジュゲートを用いて同様に分解率を測定したところ、分解率は１００％であった。
なお、１Ｋｕｎｉｔとは２５℃、ｐＨ５．０において１ｍｌ中のヌクレオチドについて、ＵＶスペクトル２６０ｎｍの吸光度を１分間で０．００１上昇させる単位である。
【実施例４】
【００２８】
実施例１で得た試料Ｎｏ．１と比較例で得た試料Ｎｏ．２についてリボヌクレアーゼＨに対する分解試験を行った。
すなわち、各試料と相補的なＲＮＡの５´‐末端を蛍光ラベルで修飾したものを１０μＭ濃度に調整し、ハイブリッド２本鎖を形成させたのち、リボヌクレアーゼＨ（シグマ・アルドリッチ社製）２．５単位を加え、反応緩衝液中における分解率を２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で経時的に測定したところ、両者は全く同様の活性を示した。
【実施例５】
【００２９】
実施例１で得た試料Ｎｏ．１と比較例で得た試料Ｎｏ．２について血清中での安定性を調べた。
各試料を１２０μｌの超純水に１ｎＭ濃度で溶かし、１０％の非動化済みウシ胎児血清２０μｌを加え、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いてオリゴヌクレオチドの分解状態を経時的にモニターした。この際、所定時間ごとに試料を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０９Ｍホウ酸、７Ｍ尿素からなる反応溶液（ｐＨ８．４）中に加え、液体窒素を用いて凍結することによって反応を停止させた。
モニターは、ＲＰ−ＨＰＬＣ（ヒューレット−パッカード社製、シリーズ１１００）とＯＤＳカラム（５×１２５×４ｍｍ）を用い、２６０ｎｍにおける変化を測定することによって行った。その結果、試料Ｎｏ．２は２４時間後にほぼ１００％分解したのに対し、試料Ｎｏ．１は１５％の分解に止まった。
【実施例６】
【００３０】
実施例１で得た試料Ｎｏ．１と比較例で得た試料Ｎｏ．２について細胞抽出液中でのヒトテロメラーゼ阻害活性を測定した。なお、ここで用いたヒトテロメラーゼはガン細胞中に特異的に発現し、細胞の不死化を引き起す酵素である。
白血病細胞由来のジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞から抽出した液を用い、５０％阻害に要する濃度（ＩＣ50）で表わした。
その結果、試料Ｎｏ．２は１０３０ｎＭであったのに対し、試料Ｎｏ．１は０．５ｎＭという非常に低い濃度で十分な活性を示すことが分った。
このことから、本発明のＳ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドコンジュゲートに比べて著しく高いヒトテロメラーゼ阻害活性を示す。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明のＳ‐オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、優れたアンチセンス特性を有し、相補的なＲＮＡと安定なハイブリッド２本鎖を形成するので、アンチセンス剤として有用である。
また、ガン細胞の不死化に寄与するテロメラーゼの活性を阻害するので、ガン患者に投与すればガン細胞の増殖を阻害するために効果的である。
【配列表】
2006075110000001.app