(57)【要約】【課題】簡便に高純度で目的生体物質の分離を行うことを可能とする生体物質分離チップおよびこれを用いた生体物質の分離装置および分離回収方法を実現する。【解決手段】細孔のトランスポーターを含む脂質２重層が細孔に固定された部材と、前記細孔の一方に設けられた試料を添加する機構と、前記細孔の他方に設けられた細孔を通過する生化学物質を回収する機構とを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスポーターを含む脂質２重層が細孔に固定された部材と、
前記細孔の一方に設けられた試料を添加する機構と、
前記細孔の他方に設けられた細孔を通過する生化学物質を回収する機構と、
を有する生化学物質分離装置。
【請求項２】
細胞膜や核膜などに存在するトランスポーターを有する脂質２重層からなる分離部材を複数種用意し、その各々が前容器を仕切るように階層状に配置された構造を有し、分離した生化学物質を各分離部材間から回収する手段を有する生化学物質分離装置。
【請求項３】
１本の試料添加口と複数の回収口からなる容器の各々の回収口の入り口に、細胞膜や核膜などに存在し異なる生化学物質を透過するトランスポーターを有する脂質２重層を固定した構造を有する生化学物質分離装置。
【請求項４】
１本の試料添加口と複数の回収口からなる容器の各々の回収口の入り口に、細胞膜や核膜などに存在し特定の生化学物質を透過する複数種のトランスポーターをそれぞれ独立に有する脂質２重層を固定した構造を有し、各トランスポーターを通過した生化学物質を回収する手段を有する生化学物質分離装置。
【請求項５】
１本の試料添加口と複数の回収口からなる容器の各々の回収口の入り口に、細胞膜や核膜などに存在し特定の生化学物質を透過する複数種のトランスポーターをそれぞれ独立に有する脂質２重層を固定したエレメント構造を有し、特定の生化学物質を通過させるエレメントに存在するトランスポーターを回収する機構を有するトランスポーター分離装置。
【請求項６】
生化学物質を電気泳動ないし電気浸透流で移動せしめトランスポーターを通過させる機構を有する請求項１ないし５の分離装置。
【請求項７】
複数のトランスポーターと脂質２重層が細孔に各々独立に固定された部材と各細孔の前後の片方に試料を添加する機構と他方に細孔を通過する生化学物質を回収する機構とを設けた生化学物質分離装置の細孔の前部に生体試料溶液を添加する工程と、生化学物質を移動させ細孔を通過する物質と通過しない物質に分離する工程を有し、複数の性化学物質を分離する生化学成分分離法。
【請求項８】
複数のトランスポーターと脂質２重層が細孔に各々独立に固定された部材と各細孔の前後の片方に試料を添加する機構と他方に細孔を通過する生化学物質を回収する機構とを設けた生化学物質分離装置の細孔の前部に特定の生体試料溶液を添加する工程と、特定性化学物質が細孔を通過するエレメントを検出する工程と、特定性化学物質が細孔を通過するエレメントに存在するトランスポーターを回収する工程からなるトランスポーター分離法。
【請求項９】
生化学物質を移動させる手段が生化学物質を電気泳動ないし電気浸透流で移ある請求項７および８の分離法。
【請求項１０】
成熟ｍＲＮＡを採取するための生体試料チップであって、該生体試料チップは中空キャピラリー構造のチップ先端部を有し、前記生体試料チップ先端部に核膜の内側がチップの外側に向くように固定した構造のｍＲＮＡ分取チップ。
【請求項１１】
請求項１０記載の成熟ｍＲＮＡを採取するための生体試料チップの先端部を試料溶液中に浸し、チップ先端部に固定された核膜を通過してくるｍＲＮＡを生体試料チップ内に回収するｍＲＮＡ分離法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜が、細胞膜を通過する物質を選択する機能を持つことに着目した、簡便に高純度で目的生体物質の分離を行うことを可能とする生体物質分離チップおよびこれを用いた生体物質の分離装置および分離回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において、生化学物質というのは、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチドなどのオリゴペプチド、タンパク質などのポリペプチド、核酸、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、単糖、２単糖やオリゴ糖、多糖類などの糖類、ステロイドなどのホルモン類、ノルアドレナリン、ドーパミン、セロトニンなどの神経伝達物質、そのほか内分泌攪乱剤、各種薬剤、カリウム、ナトリウム、塩化物イオン、水素イオンなど生命現象にかかわる物質一般を指す。このように生化学物質とは多種多様な性質を持つものであるので、物質ごとに色々な分離法が考案され利用されてきた。
【０００３】
例えば、アミノ酸や糖の分離では、今でも、液体クロマトグラフィーが最も重要な分離手段であるが、そのバリエーションは、ペーパークロマトグラフィー、箔層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィーなどクロマトグラフィーを実行する上での形状のバリエーションに加え、分離単体の種類と分離溶媒のバリエーションが多様であるので、条件を最適化することで多くの生化学物質や化学物質を分離することが可能である。あるいはこれに類似の技術で、溶液の搬送を電気浸透流で行う方法も利用されている。
【０００４】
タンパク質やポリヌクレオチド（ＤＮＡやＲＮＡ）などの電荷を持った高分子の分離には一般的に電気泳動が用いられる。電気泳動においても、分離単体の選択と、溶媒の選択（多くの場合、ｐＨと静電力のコントロールを行う）により、高分離で、一般的には、サイズの２％くらいまでの違いを識別し分離できる。あるいはチャージの違いで分ける等電点電気泳動では０．０２ｐＨの違いに対応する等電点の違いでタンパク質を分離できる。ポリヌクレオチドの分野で、ＤＮＡシーケンサーに用いられている技術では、類似配列のＤＮＡに限れば、７００ｂｐと７０１ｂｐのＤＮＡを長さの差で分離することも可能である。
【０００５】
生化学研究の分野は、このような分離手段に支えられて発展してきた。生命の構成要素を成分ごとに分離し、それらの特性を明らかにすることで、生命現象全体が再構築できると考えられていたからである。近年のゲノム研究をはじめとするオーミクス研究では、生体の構成要因は遺伝子だけでも数万に及び、それ以外に、ゲノム情報によらずに関係し合う化学物質や物質間の相互作用は膨大な数にのぼることが明らかになりつつある。このため、生命現象は物質の複雑な相互作用の結果であるという古典的な解釈が再浮上している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの方法のうち、クロマトグラフィーは担体と溶媒界面における媒質の分配に依存する。電気泳動では担体と媒質の相互作用の度合いにより分離を行う。このため、分離する媒質の分子数が少ないと、媒質が担体に吸着されてしまい、回収できないことが頻繁に起きる。クロマトグラフィーや電気泳動の担体体積と表面積を小さくすることである程度解決できるが、分離する試料体積も少なくする必要があり、限界がある。この限界に挑んでいるのがナノクロマトグラフィーやナノ電気泳動である。分子数が数分子まで少なくなると、吸着の問題以外にも、確率論的なエラーも増えるので確実に分子を分離することが更に難しくなる。特にクロマトグラフィーは統計的に十分な分子が統計的に十分な数の相互作用席とインタラクションすることを前提としており、分離すべき分子の数が少なくなったからといって担体の相互作用席すなわちカラム表面積を少なくしたのでは、分離すべき分子と担体の相互作用席の衝突確率が低下してしまい、分離が不正確になる。
【０００７】
電気泳動においても、分離すべき分子数が少なくなっても電気泳動路を短くすることはできない。ＤＮＡ一分子の電気泳動を行う報告も頻繁に出ているけれども、１分子を実際に電気泳動分離して利用した例は皆無に等しい。
【０００８】
生化学物質の場合、それを高純度に精製するのが必ずしも適切であるとは限らない。多くの場合、ある生化学物質は他の特定の物質と共同作業を行っており、それらを分離してしまうと本来の能力を発揮しないことがよくある。
【０００９】
本発明は、以上のような従来技術の問題点を解消し、単に生化学物質を分離するという観点だけではなく、細胞の機能を明らかにするため、細胞に対して活性のある極小数の分子を機能追跡が可能な形で分離する、新しい技術手段を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、従来は生化学物質の分離とは関係の無いトランスポーターの研究用に開発されたパッチクランプ法として知られている分析手段に着目し、これを生化学物質の分離技術に発展させたものである。
【００１１】
一般的にパッチクランプには、
１）先端が１μｍ程度の開口部を持つガラス細管を細管の内外の電気抵抗がギガオームレベルになるまで細胞に押し付けることで密着させて調製するｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔタイプ（細胞膜の細胞質側がガラス細管の外を向いている）、
２）ガラス細管を細胞に押し付けた状態で吸引し、ガラス細管内に形成した脂質二重層を突き破ることで細胞全体をガラス細管の先に取り付けた形状のｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌタイプ、
３）ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌタイプを形成した後に、ガラス細管近傍の脂質二重層を残す形で細胞を脱落させ、細管開口部周りに残っている脂質二重層を用いて細管開口部を封印して調製するｏｕｔｓｉｄｅ−ｏｕｔ（細胞質の外側が細管の外を向いている）タイプ、
の３種類が用いられている。
【００１２】
パッチクランプ法は、そもそも、トランスポーターの研究用に開発された技術であり、トランスポーターを介してのイオンの移動を電流変化として計測するものである。分析用の手段として開発された３種のパッチクランプ法のいずれの場合も、ガラス細管１本での操作によるトランスポーター自体の分取であり、従って、生化学物質の分離分取用の装置や手法としての認識はまったく無い。
【００１３】
本発明は、このパッチクランプ法に着目して上記の課題を解決するものである。パッチクランプ法で利用される細胞膜や核膜あるいはミトコンドリアの膜などに存在するトランスポーターを生化学物質の分離に利用する。トランスポーターとは、特定の化学物質が細胞膜などを通過する特別なチャンネルのことである。一般的には、グルタミン酸などのアミノ酸や、ジペプチドやトリペプチドなどのオリゴペプチドや種々低分子有機物が細胞膜を通過させて輸送するものである。
【００１４】
表１には、本発明に適用して好適なトランスポーターの例を、細胞と標識に採用できる特定の物質について示す。参照番号９３にトランスポーター名、参照番号９４に細胞膜のギャップを乗り越えて移動する基質、参照番号９５にトランスポーターが発現している臓器ないし細胞を表す。
【００１５】
【表１】
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もちろん、全ての細胞において存在するトランスポーターが知られているわけではなく、ゲノム配列から予想されるオーファントランスポーターや、トランスポーターが未知あるいは、表２記載のアルギニンオリゴマーのように具体的なトランスポーターという概念のチャンネルを使わなくても細胞膜を乗り越えて細胞内外に移動する物質もある。たとえば、一般に脂溶性が高く細胞内に取り込まれるステロイドや薬剤、有機物などの膜通過輸送にかかわる機能を持つものが存在することが分かっていれば本発明は実施できる。すなわち、種々物質を透過させる機能が確認できれば、発明は実施できる。
【００１６】
【表２】
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試料には、実際は色々なものが含まれ、分離するものも多種類に上ることがほとんどである。分離にはトランスポーターを含む膜を機能性分離膜として用い、これを固定した分離物質回収用のデバイスを用いることで達成できる。あるいは、より高精度な分離には、複数のトランスポーターを用いて混合物試料から生化学物質を分離するわけであるが、トランスポーターを埋め込んだ膜を直列につなぎ、生化学物質を段階的に分離することにより達成できる。試料中の媒質を拡散や電気泳動、電気浸透流で移動させ、膜を通過したものを回収する。トランスポーターを埋め込んだ膜を直列につなぎ、生化学物質を段階的に分離する場合、結果として、膜と膜の間に捕捉される生化学物質を回収することになる。あるいは、膜と膜の間に、それぞれ出口があるような構成とするときは各出口で溶液を個別に回収することで分離が達成される。
【００１７】
分子レベルの分離は、トランスポーターを埋め込む膜の面積を数１００ｎｍ２以下とすることで可能となる。また、この場合、分子がトランスポーターを何分子通過したかどうかは、膜の前後の電位の変化を計測することで確認できる。
【発明の効果】
【００１８】
トランスポーターは、そもそも、個々の分子を細胞内外に輸送する仕組みであるので、これを分離手段として利用することで、微量の生化学物質を分離できる。また、本発明によれば、トランスポーターを埋め込んだ膜を通過する生化学物質の数をカウントできるので、分離分子数が少なくても確実に分離が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（実施例１）
図１（ａ）は実施例１に係る本発明の生化学物質分離装置に利用できる生体物質分離チップの作り方の概要を断面図で示し、図１（ｂ）は出来上がった生体物質分離チップの構造の１例を模式的に示した断面図である。
【００２０】
図１において、１００は生体物質分離チップである。１は生体物質分離チップの基板であり、例えば、シリコン基板である。大きさは、例えば、図の高さ方向が５ｍｍ、図と垂直方向が５００μｍである。厚さは、例えば、１００μｍである。基板１の一端部に突起２を形成する、この高さは、例えば、５μｍであり、突起２の部分の厚さは、例えば、２μｍである。突起２の頂部に細孔３を形成する。この大きさは、例えば、１〜２μｍφである。基板１の下部の両面に電極層４，５が形成され、電極層４を全面的に覆う絶縁層６を形成した後、電極層７を形成する。この基板１は、半導体技術を利用して作成するが、その概要は、図２を参照して、後述する。
【００２１】
生体物質分離チップ１００は、図１（ｂ）に示すように、細孔３の部分に細胞のトランスポーターが取り込まれて完成する。以下、この細孔３の部分に細胞のトランスポーターを取り込む処理を説明する。
【００２２】
図が煩雑になるので、図示は省略したが、基板１と細胞１１を、顕微鏡の観察ガラス板の上に滴下した細胞培養に適したバッファの液滴中に対向して配置する。この際、顕微鏡で観察しながら、細胞１１のトランスポーター１２の部位が、突起２の突出側で細孔３の部分に向き合う形に置く。なお、１３は細胞１１の脂質二重層である。さらに、突起２の凹部側には、マイクロシリンジポンプに連結されたキャピラリーが一時的に取り付けられ、キャピラリーの内部を陰圧状態とすることができる。このキャピラリー内部には前記バッファが充填されている。さらに、キャピラリー内には電極が配置され、これに接続されている導線が引き出されるとともに、液滴の部分に他の電極が配置され、これに接続されている他の導線が引き出される。他の導線は、バッファの液滴とは電気的に絶縁されている。
【００２３】
顕微鏡で観察しながら、細胞１１のトランスポーター１２の部位を突起２の細孔３に接触させる。このとき、前述した二つの電極間の電気伝導度を監視していると、細胞１１のトランスポーター１２の部位が突起２の細孔３に接触する前は、キャピラリー内の電極と液滴の部分の他の電極とはバッファにより短絡状態であるのに対して、接触した後は、細孔３が細胞１１のトランスポーター１２と脂質二重層１３で塞がれるので、実質的に絶縁状態になる。
【００２４】
顕微鏡による目視および前述した二つの電極間の電気伝導度の急減により、細胞１１のトランスポーター１２の部位が突起２の細孔３に接触したことを確認すると、突起２の凹部側に一時的に取り付けられたキャピラリーに連結されているマイクロシリンジポンプを動作させて、キャピラリーの内部を陰圧状態とする。脂質二重層１３を突き破らない程度の圧力で吸引しながら細胞１１を引き剥がすと、トランスポーター１２を含む脂質二重層１３の一部が突起２の細孔３に固定された状態で残る。これにより、図１（ｂ）に示すように、細孔３の部分に細胞のトランスポーターが取り込まれた生体物質分離チップ１００が完成する。図１（ｂ）に示すトランスポーター付チップではｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔの形でトランスポーターが固定されている。電極層４，５および電極層７については、後述する。
【００２５】
なお、完成した生体物質分離チップ１００は細孔３に固定されたトランスポーター１２の損傷を避けるために、細胞培養に適したバッファ中に保存するのは言うまでも無い。
【００２６】
図２（ａ）−（ｇ）は生体物質分離チップ１００の基板１を形成する処理の概要を説明する図である。図２（ａ）−（ｇ）は左側に断面図、右側にそれに対応する平面図を示す。
【００２７】
まず、図２（ａ）に示すように、所定の結晶軸を持つシリコン基板１を準備し、その一面にマスク２１を施し、突起３を作成する位置に、マスク２１を除去した窓２２を形成する。
（ｂ）に示すように、エッチング処理をして、四角錐２３に対応する部分を除去する。次に、（ｃ）に示すように、マスク２１を除去し、シリコン基板１の他面にマスク２４を施し、突起３を作成する位置に、マスク２４を除去した窓を形成しこれにより断面三角の凹部２５，２６を形成する。凹部２５，２６は、平面図から分かるように、四角錐２３に対応する連続した凹部である。次に、（ｄ）に示すように、凹部２５,２６で囲まれた位置に、マスク２７を設けて、窓２８を開ける。次に、（ｅ）に示すように、この窓２８を利用して基板１の対応部分に細孔３を開ける。このとき、併せて、凹部２５,２６の周辺部の基板１にもエッチングを施して突起２を形成する。次に、（ｆ）に示すように、基板１の突起２のある面に電極４を形成する。この電極４はアルミの蒸着層とする。次に、（ｇ）に示すように、電極４の全面をポリイミドの絶縁層６で覆い、この上に、電極７を形成する。この電極７は白金の蒸着層とする。次いで、基板１の他の面にも電極５を形成する。この電極５も白金の蒸着層とする。かくして、生体物質分離チップ１００の基板１が形成される。ここでは、半導体技術に関する詳細なデータは省略したが、当業者は容易に実施できる。
【００２８】
図３は生体物質分離チップ１００の細孔３にグルコーストランスポーター１２を固定した生体物質分離チップによる生体物質の分離例について説明する図である。この例では、図１（ａ）で説明した細胞１１として、心筋由来の細胞を利用し、細孔３にグルコースを透過するトランスポーターを含む脂質二重層を固定する。心筋では上記手法でかなりの確率でグルコーストランスポーターを固定したチップ１００を得ることができる。上記手法でグルコーストランスポーター付チップを作成した場合、もちろん、他のトランスポーターも多数細孔３に固定されている。
【００２９】
生体物質分離チップ１００は、容器５００の独立の空間５０１と５０２に、電極５を有する裏面と電極７を有する表面をそれぞれ向けて配置されている。電極４はアースされている。電極５と７は必要に応じて電源５０５および電流計５０６に取り付けられる。
【００３０】
まず、２ｍＭカルシウムを含むＭ９培地（ｐＨ７．１）の溶液で空間５０１と５０２を満たす。ここで、空間５０１と５０２は図では広く描かれているが、実際は数十μｍのギャップで、液は毛細管で入れる。この時点の電流計５０６の値をモニターする。次に、空間５０１には２％グルコースを含むＭ９培地を試料溶液として毛細管現象を利用して加えると電流値が変化する。このことからグルコースと他の何らかのイオンがカップルし膜を透過していることがわかる。所定時間後に空間５０２側の溶液を回収する。
【００３１】
空間５０２から回収した液と、もとのＭ９培地をキャピラリーで回収し、その中にＭ９培地に懸濁した大腸菌を１匹ずつ吸い上げる。空間５０２より回収した液では５０〜６０分後に分裂するが、Ｍ９培地では１２０分以上かけても分裂しない。このことから、少なくてもグルコースがトランスポーターを通過して回収されることがわかる。
【００３２】
（実施例２）
図４は、細胞培養に適したバッファ中に保存されている生体物質分離チップ１００を３枚組み合わせた実施例２の生体物質分離装置の概要を示す断面図である。実施例２の生体物質分離装置は、細孔３に固定されたトランスポーター１２の損傷を避けるために、細胞培養に適したバッファ中で組み立てられる。具体的には、顕微鏡の観察ガラス板の上に滴下した細胞培養に適したバッファの液滴中で目視により組み立てるのが実際的である。ここで、生体物質分離チップ１００のそれぞれは、細胞膜や核膜などに存在し特定の生化学物質を透過する複数種の細胞のトランスポーターを細孔３に固定したものである。
【００３３】
図４において、１００は図１（ｂ）に示す生体物質分離チップである。生体物質分離チップ１００が１００〜５００μｍ離して３枚並べられ、その両側にシリコン基板を利用して製作された側壁１０１，１０２が設けられている。側壁１０１，１０２の内面側には、生体物質分離チップ１００で設けられている電極４および絶縁層６に対応する電極４’および絶縁層６’が設けられている。これら側壁１０１，１０２は生体物質分離チップ１００と同様に半導体技術により製作できる。これらの生体物質分離チップ１００は、図５に外観を示すような、クランプ６００により固定される。この際、生体物質分離チップ１００間および生体物質分離チップ１００と側壁１０１，１０２間には、適当なスペーサが挿入されるか、クランプ６００自体が適当なスペーサを持っているものとされる。
【００３４】
なお、図４において、生体物質分離チップ１００間および生体物質分離チップ１００と側壁１０１，１０２間の上下端に丸みを持って示した線は、このスペースに保持される液体が表面張力によって保持されていることを示すものである。
【００３５】
図５は、生体物質分離チップ１００を３枚組み合わせた実施例２の生体物質分離装置の外観を示す斜視図である。図に示すように、各エレメント１００と側壁１０１および１０２はクランプ６００で固定されている。ここで各エレメント１００の間隙は図４において３０−１，３０−２，３０−３、３０−４のように開口している。各エレメント間は数十μｍのギャップなので、キャピラリーピペット６０１を用いて毛細管で液を出し入れできる。このような構造のため、各エレメント間隔にはそれぞれ異なる溶液を出し入れできる。
【００３６】
図４に示すように、顕微鏡の観察ガラス板の上に滴下した細胞培養に適したバッファの液滴中で目視により組み立てられた生体物質分離装置は、組み立てが終わった状態では、各生体物質分離チップ１００間および生体物質分離チップ１００と側壁１０１および１０２間はバッファで満たされている。
【００３７】
この状態で、各生体物質分離チップ１００間および生体物質分離チップ１００と側壁１０１および１０２間にキャピラリーピペット６０１を用いて毛細管で試料を出し入れして分離処理をすることになるが、これに先立って、電極４および４’は全て接地する。これは、生体物質分離チップ１００と側壁１０１および１０２の表面を溶液が流動するときに発生する静電気をシールドし、電流雑音の発生を抑止するためである。また、生体物質分離チップ１００の両面の電極５、７間には所定の電圧を印加できるように、電源３１とこれによる電流が監視できるようにする。トランスポーター１２が細孔３に安定して固定されているときは電源３１による電流は実質的に零であるが、トランスポーター１２が脱落したときは、大きな電流が流れるから、容易に検出できる。
【００３８】
今、側壁１０１側から見た生体物質分離チップ１００のトランスポーター１２をそれぞれ１２−１、１２−２および１２−３とするとき、トランスポーター１２−１をニューロン由来の細胞膜より調製したトランスポーター、トランスポーター１２−２を精巣の細胞膜より調製したトランスポーター、そして、トランスポーター１２−３を肺の細胞膜由来の脂質二重層とする。
【００３９】
まず、すべての間隙にｐＨ６．５のバッファを満たし、３０−１にグルタミン酸とアスパラギン酸とアラニンとグルタミンからなるアミノ酸混合溶液を入れる。すると電流計３２ならびに電流計３３に１００ｎＡ程度の電流が観測され、何らかの基質輸送が起きていることがわかる。電流計３４を流れる電流は他の１／３程度である。間隙３０−２から３０−４の溶液を毛細管現象で回収し、ナノＬＣを用いてアミノ酸分析すると、グルタミン酸とアスパラギン酸は脂質二重層１２−１と１２−２を透過し間隙３０−２と３０−３に蓄積されることがわかる。間隙３０−４で観測されるグルタミン酸とアスパラギン酸は検出限界以下である。アラニンとグルタミンはすべての間隙から検出される。
【００４０】
実際、一般にこれらの細胞には、トランスポーターデータベース（ＨＵＧＯの公式ウェブサイトの中のHGNC Gene Grouping/Family Nomenclature（June 2004アップデート）、http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamily.shtml、に記載されているSLC new solute carrier superfamily proposed members （http://www.bioparadigms.org/slc/menu.asp）によれば、アミノ酸輸送に関するＳＬＣ１ファミリーのトランスポーターが発現しており、酸性アミノ酸はニューロン、精巣、腎臓、肝臓、心臓などで多く発現しているが、中性アミノ酸であるアラニンやグルタミンは幅広い臓器で発現しているので特に結果と矛盾は無い。
【００４１】
このように本発明の生化学物質分離装置と生化学物質分離法を用いれば、極微量の生化学物質をその性質で大まかに分類できるし、各間隙にどのような物質が蓄積されるかを見ることで、固定した細胞間の物質輸送に関する比較を透過する物質の差で解析する差分解析が可能である。
（実施例３）
実施例３では、キャピラリーチップ先端部に核膜を固定したタイプの生体物質分離チップについて述べる。図６（ａ）−（ｆ）は実施例３に係わるキャピラリーチップ先端部に核膜を固定したタイプの生体物質分離チップの作成手順を説明する図である。ここでは、アフリカツメガエルの卵母細胞の核膜を用いて、ｍＲＮＡ精製チップとする例について説明する。
【００４２】
図６（ａ）は準備過程を示す図であり、核膜を採取するアフリカツメガエルの卵母細胞とキャピラリーチップとを目視のための顕微鏡の視野の部分に配置したときの概要を示す。４１はアフリカツメガエルの卵母細胞、４２は細胞質、４３は細胞核、４４は細胞質と核を仕切る核膜、４５は細胞膜をあらわす。４６はキャピラリーチップであり、細胞に与える物理的なダメージを少なくするために、先端４８（細胞に挿入される部分）の直径をおおむね４００μｍφ、長さ２０ｍｍである。キャピラリー４６はＸ、Ｙ、Ｘ軸の移動に加え、先端角度が変えられる冶具４９に取り付けられている。また、キャピラリー４６の内部には、細胞の培養に使用される種類のバッファが入れられている。冶具４９は水圧で駆動される駆動装置５０に取り付けられている。駆動装置５０から冶具４９への動力伝達は水圧を利用する。さらにキャピラリー４６にはマイクロシリンジポンプ５１が取り付けられており、キャピラリー４６の内部を自在に陰陽圧状態とすることができる。４７はキャピラリー４６とマイクロシリンジポンプ５１とを結ぶチューブである。
【００４３】
細胞４１の損傷を防ぐために、細胞４１とキャピラリー４６の先端部は、顕微鏡の視野の部分に設けられた観察ガラス板５２の上に形成された細胞の培養に使用される種類のバッファの液滴５３の中にあるようになされ、以下の処理は、全て、液滴中で行われる。さらに、キャピラリー４６内には一時的に電極５４が配置され、これに接続されている導線５５が引き出されるとともに、細胞４１の細胞質４２の部分にも一時的に電極５６が配置され、これに接続されている導線５７が引き出されている。以下の図６（ｂ）−図６（ｅ）では、図が煩雑になるので、観察ガラス板５２、液滴５３および電極５４，５６とその引き出し線５５，５７の表示は省略する。
【００４４】
図６（ｂ）は、顕微鏡で目視しながら、細胞４１の細胞膜４５をキャピラリー４６で突き破った状態を示す。
【００４５】
図６（ｃ）は、キャピラリー４６の先端４８を核膜４４に接触させ、マイクロシリンジポンプ５１を作動させ、キャピラリー４６内部を陰圧とし、キャピラリー４６の先端４８を核膜４４に密着させる状態を示す。ここで、マイクロシリンジポンプ５１での陰圧の度合いを調整し、核膜４４が敗れない程度の圧力で吸引しながら、核膜４４をキャピラリーチップ先端に付着した状態でキャピラリー４６を細胞４１から引き抜く。これでチップ先端部４８に核膜４４の内側がチップの外側に向くように固定した構造のキャピラリーチップ４６が得られる。
【００４６】
ここで、顕微鏡で目視しながらキャピラリー先端４８を核膜４４に接触させるのに加え、電極５４と電極５６との間の電気伝導度を利用することができる。すなわち、キャピラリー先端４８を核膜４４に接触させ、密着させる過程を電気伝導度で監視できる。キャピラリー４６の先端４８が細胞質４２にあるうちは、電極５４と電極５６との間の電気伝導度はきわめて大きい（短絡状態）が、キャピラリー４６の先端４８が細胞４１の核膜４４へ接触すると、電極５４と電極５６との間の電気伝導度は小さくなり（抵抗が大きくなった状態）、しかも、ある程度密着させることで電気伝導度はより小さくなる。
【００４７】
従って、目視によりキャピラリー４６の先端４８の細胞４１の核膜４４への接触を制御するとともに、電極５４と電極５６との間の電気伝導度をチェックすることにより、より容易に、キャピラリー４６の先端４８の細胞４１の核膜４４への接触および密着を管理することができる。
【００４８】
キャピラリー４６の先端４８を細胞４１の核膜４４へ密着させた後、核膜４４をチップ先端４８に保持したまま、キャピラリー４６を細胞４１から引き抜く。
【００４９】
図６（ｄ）は、細胞４１から引き抜いたキャピラリー４６の周りを洗浄し、キャピラリー４６の周りに付着している核酸成分やタンパク質成分などを除去する処理があることを示す。
【００５０】
図６（ｅ）は、キャピラリーチップ先端部に核膜を固定したタイプの生体物質分離チップを完成させた状態を示す図である。この状態では、キャピラリー４６内には細胞の培養に使用される種類のバッファが残っているが、チップ先端部に固定された核膜を保護するために、全体をバッファに入れて保存するのが良い。
【００５１】
図７は、実施例３の生体物質分離チップを利用してｍＲＮＡを分取する具体例を説明する図である。
【００５２】
例えば、アフリカツメガエルから得る肝臓組織を凍結し、フェノール・クロロホルム溶液を加え、直ちにホモジナイズする。エタノール沈殿を行い、トータルＲＮＡとゲノム断片の混合ペレットを得る。５ｍＭの５０ｍＭトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、試料溶液とする。この試料溶液２１１を容器２１２に入れる。生体物質分離チップを作成したときと同様な構成、すなわち、冶具４９、駆動装置５０、マイクロシリンジポンプ５１およびチューブ４７よりなる装置のチューブ４７の先端に生体物質分離チップ４６を取り付けてある。この際、生体物質分離チップ４６内に電極５４を配置し、引き出し線５５を介して直流電源の＋極に接続する。一方、試料溶液２１１の入った容器２１２には電極５６を浸漬し、引き出し線５７を介して直流電源の−極に接続する。
【００５３】
生体物質分離チップ４６の先端部を上記試料溶液２１１の入った容器２１２に浸け、前記直流電源により、キャピラリーチップ４６の内側と外側の間に５Ｖ／ｃｍの直流電圧による電界をかける。この操作で生体物質分離チップ４６の先端に固定された核膜を通過しキャピラリー内部に移行するｍＲＮＡを回収する。
【００５４】
このようにして得るｍＲＮＡとキャピラリーチップ外液に残るｍＲＮＡでは、明らかにサイズが異なり、キャピラリーチップ内の液から得られるｍＲＮＡは１ｋ〜３ｋｂのものが多いが、外液から得られるｍＲＮＡは数１０ｋｂまでスメアーなバンドが広がっている。このように本発明のチップを用いて核膜を固定したデバイスを用いることでｍＲＮＡ混合液からスプライシングを受けてサイズが小さくなった成熟ｍＲＮＡを得ることができる。
【００５５】
実施例３に用いる核膜付キャピラリーチップの他の形状について述べる。図８（ａ）−（ｃ）は、実施例３で使用できるキャピラリー４６の先端部の構成例を説明する図である。先端部にはいずれも核膜２５０が貼り付けてある。
【００５６】
図８−（ａ）ではキャピラリー４６の内側に仕切り２２１が、キャピラリー４６の先端近くまで形成されている例である。これによれば、キャピラリー４６内に、仕切り２２１で区分された流路２２２−１と２２２−２が形成される。したがって、キャピラリー内の液を２３のように片方の流路から他方の流路に流すことで、試料溶液中のｍＲＮＡを連続的に回収できる。
【００５７】
図８−（ｂ）はキャピラリー４６の先端近くまでに第２のキャピラリー２２６を挿入した構造で流路２２７−１と２２７−２を形成している。キャピラリー内の液を先端部の隙間を使って２２８のように外側の流路から内側の流路に流して核膜を通過するｍＲＮＡを採取することができる。第２のキャピラリー２２６はキャピラリー４６の中に差し込まれておればよく、別段固定しなくても上記機能を発揮する。
【００５８】
図８−（ｃ）は図８−（ｂ）と同様であるが、キャピラリー４６の中に設ける内側のキャピラリー２３２が２３２−１から２３２−５までの５本とされた例である。この例では、たとえば、１分間ずつ２３２−２から２３２−４の各１本のみを所定の陰圧として吸引を行い、２３２−１からバッファを供給する。その間、異なる４種の試料溶液に先端をつけることで４種の試料中のｍＲＮＡを分離することができる。
【００５９】
（実施例４）
図９は、実施例２の３連構造を実施例３のガラスキャピラリーで実現する簡易法を説明する図である。ガラスキャピラリーは、高周波で引き伸ばし、図の３４６−１，３４６−２，３４６−３のようにテーパーをつけてある。各キャピラリーの間には電極３６４−１，３６４−２，３６４−３が挟みこまれている。実施例２と同様に、キャピラリーの先端を各細胞膜に押し付け、軽く吸引しながら細胞から引き離す。これで細胞膜（脂質二重層）の一部３９４−１，３９４−２，３９４−３をキャピラリー先端に付けたものが得られる。この状態で各キャピラリー先端にはトランスポーターを含む脂質二重膜が固定される。各キャピラリーには実施例２と同じ細胞の脂質二重層を固定する。３本のキャピラリーをバッファ中で重ねる。
【００６０】
図９はこのようにして調製した３個カスケードに配列した生体物質分離チップの概要を示す断面図である。３４６−１〜３４６−３は生体物質分離チップであり、先端部に核膜３９４−１〜３９４−３を固定している。三つの生体物質分離チップはわずかに隙間を残した形で連結されている。図９のように、容器３６０内の試料溶液３６１に先端が浸されている。ここでは基質の移動を加速するため、電極３６４−１と試料溶液中に用意した電極３６４−４の間に電界をかける。もちろん、電極３６４−３、３６４−２，３６４−１と電極３６４−４をこの順で切り替えて段階的に物質輸送を行ってもよい。所定の時間が過ぎた後、各キャピラリーを分離し、テーパーの大きいほうから加圧して、先端の脂質二重層を突き破り、内溶液を回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】（ａ）は実施例１に係る本発明の生化学物質分離装置に利用できる生体物質分離チップの作り方の概要を断面図で示し、（ｂ）は出来上がった生体物質分離チップの構造の１例を模式的に示した断面図である。
【図２】（ａ）−（ｇ）は生体物質分離チップ１００の基板１を形成する処理の概要を説明する図であり、左側に断面図、右側にそれに対応する平面図を示す図である。
【図３】生体物質分離チップ１００の細孔３にグルコーストランスポーター１２を固定した生体物質分離チップによる生体物質の分離例について説明する図である。
【図４】細胞培養に適したバッファ中に保存されている生体物質分離チップ１００を３枚組み合わせた実施例２の生体物質分離装置の概要を示す断面図である。
【図５】生体物質分離チップ１００を３枚組み合わせた実施例２の生体物質分離装置の外観を示す斜視図である。
【図６】（ａ）−（ｆ）は実施例３に係わるキャピラリーチップ先端部に核膜を固定したタイプの生体物質分離チップの作成手順を説明する図である。
【図７】実施例３の生体物質分離チップを利用してｍＲＮＡを分取する具体例を説明する図である。
【図８】（ａ）−（ｃ）は、実施例３で使用できるキャピラリー４６の先端部の構成例を説明する図である。
【図９】実施例２の３連構造を実施例３のガラスキャピラリーで実現する簡易法を説明する図である。
【符号の説明】
【００６２】
１…基板、２…突起、３…細孔、４，５，７…電極層、６…絶縁層、１１…細胞、１２…トランスポーター、１３…脂質二重層、２１，２４，２７…マスク、２３…四角錐、２５，２６…凹部、２８…窓、３０−１，３０−２，３０−３，３０−４…開口、３１…電源、３２，３３，３４…電流計、４１…アフリカツメガエルの卵母細胞、４２…細胞質、４３…細胞核、４４…核膜、４５…細胞膜、４６…キャピラリーチップ、４７…チューブ、４８…キャピラリーチップの先端、４９…冶具、５０…駆動装置、５１…マイクロシリンジポン、５４，５６…電極、５５，５７…引き出し線、１００…生体物質分離チップ、１０１，１０２…側壁、５００…容器、５０１，５０２…空間、５０５…電源、５０６…電流計、６００…クランプ、６０１…キャピラリーピペット、２２１…仕切り、２２６…キャピラリー、２２７−１，２２７−２…流路、２３２−１〜２３２−５…内側のキャピラリー、３４６−１，３４６−２，３４６−３…ガラスキャピラリー、３６０…容器、３６１…試料溶液、３６４−１，３６４−２，３６４−３，３６４−４…電極、３９４−１，３９４−２，３９４−３…脂質二重層。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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