(57)【要約】      （修正有）【課題】心不全における突然死について患者を診断、スクリーニング又はモニタリングする方法及びキットを提供すること。【解決手段】  哺乳類対象における心不全での突然死のスクリーニング、診断、又は予後判定、哺乳類対象における心不全での突然死の判断、心不全での突然死のリスクのある哺乳類対象の同定、又は切迫した心不全での突然死を経験している哺乳類対象へ施された療法の効果のモニタリングの方法は、哺乳類対象から得た体液試料中のC反応性蛋白質(CRP)、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、好中球総数、白血球総数及びBNPのレベルを測定することを含む。哺乳類対象の心臓の健康のモニタリングの方法も更に含まれる。このような方法を実行するためのキット及び装置も提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類対象における心不全での突然死のスクリーニング、又は診断、心不全での突然死の判断、心不全での突然死のリスクのある哺乳類対象の同定、又は切迫した心不全での突然死を経験している哺乳類対象へ施された療法の作用のモニタリングのための方法であって：
哺乳類対象由来の試料中の第一マーカーのレベルを測定する工程、ここで第一マーカーは、C反応性蛋白質又は好中球総数である；及び
第一マーカーのレベルを心臓の健康の状態と関連付ける工程を含む、前記方法。
【請求項２】
試料は、血液又は血漿である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第一マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けは、心不全での突然死のリスクを評価することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
第一マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けは、心不全での炎症レベルを判定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
リスクの評価は、第一マーカーのレベルを、第一マーカーの閾値レベルと比較することを含む、請求項3記載の方法。
【請求項６】
第一マーカーのレベルと心臓の健康状態の関連付けは、対象へ施された療法の効果をモニタリングすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
第一マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けは、第一マーカーのレベルを、心不全での突然死のリスクが存在しないことの指標である第一マーカーのレベルと比較することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
第一マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けは、該試料を、第一マーカーに結合する抗体と接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該抗体は、モノクローナル抗体である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
更に第二マーカーのレベルを測定し、及び第二マーカーのレベルを心臓の健康状態と関連付ける工程を含み；この第二マーカーが、第一マーカーとは異なる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
第二マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けが、心不全での突然死のリスクを評価することを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
心不全での突然死のリスクの評価は、第二マーカーのレベルを、第二マーカーの閾値レベルと比較することを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
第二マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けが、第二マーカーのレベルを、心不全での突然死のリスクが存在しないことの指標である第二マーカーのレベルと比較することを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
第一マーカーは、C反応性蛋白質であり、及び第二マーカーは、好中球総数又は白血球総数である、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
好中球総数が、標準のフローサイトメトリーにより得られる、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
第二マーカーは、ミエロペルオキシダーゼである、請求項10記載の方法。
【請求項１７】
第二マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けは、該試料を、第二マーカーと結合する抗体と接触させることを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１８】
該抗体は、モノクローナル抗体である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
更に心拍数の変動性を測定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
心拍数の変動性は、NN間隔の標準偏差及びトライアンギュラーインデックスにより計算される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
NN間隔の標準偏差が、心不全での突然死が存在しないことの指標であるNN間隔の標準偏差と比較される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
トライアンギュラーインデックスが、心不全での突然死が存在しないことの指標であるトライアンギュラーインデックス値と比較される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
更に、第三マーカーのレベルを測定し、及び第三マーカーのレベルを心臓の健康状態と関連付ける工程を含み、この第三マーカーは、第一マーカー及び第二マーカーとは異なる、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
第三マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けは、心不全での突然死のリスクを評価することを含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
心不全での突然死のリスクの評価は、第三マーカーのレベルを、第三マーカーの閾値レベルと比較することを含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
第三マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けは、第三マーカーのレベルを、心不全での突然死のリスクが存在しないことの指標である第三マーカーのレベルと比較することを含む、請求項23記載の方法。
【請求項２７】
第三マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けは、第三マーカーのレベルを、進行性心不全からの死亡リスクの指標である第三マーカーのレベルと比較することを含む、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
第三マーカーは、ナトリウム利尿ペプチドである、請求項23記載の方法。
【請求項２９】
ナトリウム利尿ペプチドは、脳性ナトリウム利尿ペプチド又はN-末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチドである、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
第三マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けは、該試料を、第三マーカーと結合する抗体と接触させることを含む、請求項23記載の方法。
【請求項３１】
該抗体は、モノクローナル抗体である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
請求項１記載の方法を実行するためのキット。
【請求項３３】
哺乳類対象における心不全での突然死のスクリーニング、又は診断、心不全での突然死の判断、心不全での突然死のリスクのある哺乳類対象の同定、又は切迫した心不全での突然死を経験している哺乳類対象へ施された療法の効果のモニタリングのための方法であって：
哺乳類対象由来の試料中の第一マーカーのレベルを測定する工程であって、ここで第一マーカーは、好中球総数である工程；及び
第一マーカーのレベルを心臓の健康の状態と関連付ける工程を含む、前記方法。
【請求項３４】
哺乳類対象における心不全での突然死のスクリーニング、診断、もしくは予後判定、心不全での突然死の判断、心不全での突然死のリスクのある哺乳類対象の同定、又は切迫した心不全での突然死を経験している哺乳類対象へ施された療法の効果のモニタリングのためのキットであって：
試料を該哺乳類対象から採取し、及びC反応性蛋白質レベルを心臓の健康状態と関連付けるための使用説明書；
試料中のC反応性蛋白質レベルを測定するための1種以上の試薬を備える、前記キット。
【請求項３５】
C反応性蛋白質のレベルと心臓の健康状態との関連付けが、心不全での突然死のリスクを評価することを含む、請求項34記載のキット。
【請求項３６】
前記試料が、血液又は血漿である、請求項34記載のキット。
【請求項３７】
1種以上の試薬が、第一マーカーと特異的に結合する抗体を含む、請求項34記載のキット。
【請求項３８】
該抗体は、モノクローナル抗体である、請求項34記載のキット。
【請求項３９】
更に、心臓の健康状態の指標である第二マーカーのレベルを測定するための、1種以上の試薬を含む、請求項34記載のキット。
【請求項４０】
第二マーカーは、ミエロペルオキシダーゼである、請求項34記載のキット。
【請求項４１】
第二マーカーを測定するための1種以上の試薬は、第二マーカーに特異的に結合する抗体を含む、請求項39記載のキット。
【請求項４２】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項41記載のキット。
【請求項４３】
第二マーカーは、好中球総数又は白血球総数である、請求項39記載のキット。
【請求項４４】
更に、心拍数を測定及びモニタリングするために構成された検出器を備える装置を含む、請求項34記載のキット。
【請求項４５】
該装置が、患者へ出力を提供するように構成されている、請求項44記載のキット。
【請求項４６】
更に心不全での突然死が存在しない指標である第三マーカーのレベルを測定するための1種以上の試薬を含む、請求項34記載のキット。
【請求項４７】
第三マーカーのレベルは、進行性心不全による死亡リスクの指標である、請求項46記載のキット。
【請求項４８】
第三マーカーは、ナトリウム利尿ペプチドである、請求項46記載のキット。
【請求項４９】
ナトリウム利尿ペプチドは、脳性ナトリウム利尿ペプチド又はN-末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチドである、請求項46記載のキット。
【請求項５０】
第三マーカーを測定するための1種以上の試薬は、第三マーカーに特異的に結合する抗体を含む、請求項46記載のキット。
【請求項５１】
抗体は、モノクローナル抗体である、請求項50記載のキット。
【請求項５２】
哺乳類対象由来の試料中の第一マーカーのレベルを測定する工程であり、ここで該第一マーカーは、C反応性蛋白質又は好中球総数である工程、及び第一マーカーのレベルを心臓の健康状態と関連付ける工程を含む、哺乳類対象の健康をモニタリングする方法。
【請求項５３】
第一マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けが、心不全での突然死のリスクを評価することを含む、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
該試料は、血液又は血漿である、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
リスクを評価することが、第一マーカーのレベルを、第一マーカーの閾値レベルと比較することを含む、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
第一マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けが、第一マーカーのレベルを、心不全での突然死が存在しないことの指標である第一マーカーのレベルと比較することを含む、請求項52記載の方法。
【請求項５７】
第一マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けは、対象に施された療法の効果をモニタリングすることを含む、請求項52記載の方法。
【請求項５８】
第一マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けは、該試料を、第一マーカーに結合する抗体と接触させることを含む、請求項52記載の方法。
【請求項５９】
該抗体は、モノクローナル抗体である、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
更に、第二マーカーのレベルを測定し、及び第二マーカーのレベルを心臓の健康状態と関連付ける工程を含み；この第二マーカーは、第一マーカーとは異なる、請求項52記載の方法。
【請求項６１】
第一マーカーは、C反応性蛋白質であり、及び第二マーカーは、好中球総数又は白血球総数である、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
第二マーカーは、ミエロペルオキシダーゼである、請求項60記載の方法。
【請求項６３】
第二マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けは、心不全での突然死のリスクを評価することを含む、請求項60記載の方法。
【請求項６４】
心不全での突然死のリスクの評価は、第二マーカーのレベルを、第二マーカーの閾値レベルと比較することを含む、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
第二マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けは、該試料を、第二マーカーと結合する抗体と接触させることを含む、請求項60記載の方法。
【請求項６６】
該抗体は、モノクローナル抗体である、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
更に、心拍数の変動性を測定する工程を含む、請求項52記載の方法。
【請求項６８】
心拍数の変動性は、NN間隔の標準偏差及びトライアンギュラーインデックスにより計算される、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
NN間隔の該標準偏差が、心不全での突然死が存在しない指標であるNN間隔の標準偏差値と比較される、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
トライアンギュラーインデックスが、心不全での突然死が存在しない指標であるトライアンギュラーインデックス値と比較される、請求項68記載の方法。
【請求項７１】
心臓の健康状態をモニタリングするシステムであって：
試料投入口及び第一のアッセイを含むカートリッジであって、ここで第一のアッセイは第一マーカーを認識するものであり；及び
このアッセイにより認識された第一マーカーのレベルを測定するために構成された検出器を含むカートリッジ読取機を備える、前記システム。
【請求項７２】
装置は、患者に出力を提供するように構成される、請求項71記載のシステム。
【請求項７３】
第一のアッセイは、第一マーカーを認識する抗体を含む、請求項71記載のシステム。
【請求項７４】
該抗体は、C反応性蛋白質を認識する、請求項71記載のシステム。
【請求項７５】
更に、試料投入口及び第二のアッセイを含む第二の試験カートリッジを備え、ここで第二のアッセイは、第二マーカーを認識し；第二マーカーは第一マーカーとは異なる、請求項71記載のシステム。
【請求項７６】
第二のアッセイは、第二マーカーを認識する抗体を含む、請求項75記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、心不全における突然死について患者を診断、スクリーニング又はモニタリングする方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
心不全は、西欧社会の一般人口の1.5〜2％が罹患している慢性の進行性疾患である。心不全の有病率及び発症率は、高齢化する人口のために上昇している。心不全は、心臓が効率的に血液を全身へ送出するのに十分な強度を持たない場合に生じる。心臓血管系疾患は、増え続ける保健医療の負担となっている。米国だけでも、500万人以上がうっ血性心不全(CHF)に罹患している。心不全患者は、心不全での突然死を経験する高リスクのある患者である。心不全における突然の予想されない死亡は、米国成人において毎年約340,000件の死亡例を生じている。心不全における突然の予想されない死亡は、過去に心臓疾患と診断されたか又は診断されていないヒトにおける、突然の、心機能の不意の喪失である。死亡の時期及び様式は予想外である。これは、症状出現後、瞬時に又は短時間で生じる。突然死に至る患者の最も一般的な理由は、心臓血管系疾患、特に冠動脈心疾患である。心不全における予期しない急死(SUD)は、心筋の変性、又は高血圧患者における心臓肥大によっても生じる。SUDは、不整脈を引き起こし得る様々な心臓への投薬治療によっても生じることがある。特にいわゆる「抗不整脈薬」は、通常処方される用量であっても、時には致命的心室不整脈をもたらすことがある(「催不整脈」作用)。更にカリウム及びマグネシウムの血中レベルの有意な変化(例えば利尿薬の使用による)も、生命を脅かす不整脈及びSUDを引き起こすことがある。他のSUDの原因は、Wolff-Parkinson-White症候群などの疾患に起因した電気的異常、血管異常及び快楽のための薬物乱用を含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
（概要）
一般に、哺乳類対象からの試料中のマーカーレベル、例えばC反応性蛋白質(CRP)もしくは好中球総数、又は白血球総数は、哺乳類対象における心臓の健康状態のモニタリングに使用することができる。CRPは、MPOのような第二マーカーと併用することができる。CRPは、BNPのような第三マーカーと併用してもよい。心臓の健康状態は、心不全での突然死のスクリーニング、診断、又は予後判定、又は心不全での突然死の判定、又は心不全での突然死のリスクのある哺乳類対象の同定、又は切迫した心不全での突然死を経験している哺乳類対象に施された療法の効果のモニタリングにより、測定することができる。心不全での突然死は、予期しない急死を含む。本願明細書に説明された方法は、病院又はその他の保健医療施設又は家庭又は他の地域の場所において使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ひとつの態様において、哺乳類対象における心不全での突然死をスクリーニング又は診断し、心不全での突然死を判断し、心不全での突然死のリスクのある哺乳類対象を同定し、又は切迫した心不全での突然死を経験している哺乳類対象に施された療法の効果をモニタリングする方法は、哺乳類対象由来の試料中の第一マーカーのレベルを測定し、ここで第一マーカーは、C反応性蛋白質又は好中球総数であること、及び第一マーカーのレベルを心臓の健康状態と関連付けることを含む。この試料は、血液又は血漿であることができる。この方法は、心不全での突然死のリスクを評価することを含む。この方法は、心不全での炎症レベルを判定することを含む。更にリスクの評価は、第一マーカーのレベルを、第一マーカーの閾値レベルと比較することを含む。第一マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けは、対象へ施された療法の作用のモニタリングを含むことができる。この方法は、第一マーカーのレベルを、心不全での突然死のリスクが存在しないことの指標である第一マーカーのレベルと比較することを含む、第一マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けを含んでも良い。この方法は同じく、試料を、第一マーカーに結合する抗体と接触することを含む。この抗体は、モノクローナル抗体であることができる。この方法は更に、第二マーカーのレベルを測定し、及び第二マーカーのレベルを心臓の健康状態と関連付けることを含んでもよく；この第二マーカーは、第一マーカーとは異なる。
【０００５】
本方法は、心不全での突然死のリスクの評価を含む、第二マーカーのレベルと心臓の健康状態への関連付けを含むことができる。この方法は、心不全での突然死のリスクを評価するために、第二マーカーのレベルを、第二マーカーの閾値レベルと比較することを含むことができる。この方法は、第二マーカーのレベルの、心不全での突然死のリスクが存在しないことの指標である第二マーカーのレベルとの比較を含むことができる。第一マーカーは、C反応性蛋白質であり、及び第二マーカーは、好中球総数又は白血球総数であることができる。好中球総数は、標準のフローサイトメトリーにより得ることができる。第二マーカーは、ミエロペルオキシダーゼであることができる。
【０００６】
本方法は、試料を、第二マーカーと結合する抗体と接触することを含むことができる。この抗体は、モノクローナル抗体である。この方法は更に、心拍数の変動性を測定する工程を含むことができる。心拍数の変動性は、NN(normal to normal)間隔の標準偏差(SDNN)及びトライアンギュラーインデックスにより計算される。NN間隔の標準偏差は、心不全での突然死が存在しないことの指標であるNN間隔の標準偏差と比較することができる。該トライアンギュラーインデックスは、心不全での突然死が存在しないことの指標であるトライアンギュラーインデックス値と比較することができる。
【０００７】
本方法は更に、第三マーカーのレベルを測定し、及び第三マーカーのレベルを心臓の健康状態と関連付ける工程を含むことができ；この第三マーカーは、第一マーカー及び第二マーカーとは異なる。この方法は、心不全での突然死のリスクの評価を含む、第三マーカーのレベルの心臓の健康状態への関連付けを含むことができる。この方法は、第三マーカーのレベルを、進行性心不全からの死亡リスクの指標である第三マーカーのレベルと比較することを含む、第三マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けも含むことができる。この方法は、心不全の突然死のリスクを評価するために、第三マーカーのレベルを、第三マーカーの閾値レベルと比較することを含むことができる。この方法は、第三マーカーのレベルを、心不全での突然死のリスクが存在しないことの指標である第三マーカーのレベルと比較することを含む、第三マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けを含むことができる。第三マーカーは、ナトリウム利尿ペプチドである。ナトリウム利尿ペプチドは、脳性ナトリウム利尿ペプチド又はN-末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチドであることができる。
【０００８】
本方法は、試料を、第三マーカーと結合する抗体と接触することを含む、第三マーカーのレベルと心臓の健康状態との関連付けを含むことができる。この抗体は、モノクローナル抗体であることができる。このような方法を実行するためのキットも提供される。
【０００９】
更なる態様において、哺乳類対象における心不全での突然死のスクリーニングもしくは診断、心不全での突然死の判断、心不全での突然死のリスクのある哺乳類対象の同定、又は切迫した心不全での突然死を経験している哺乳類対象へ施された療法の効果のモニタリングのための方法は、哺乳類対象由来の試料中の第一マーカーのレベルを測定し、ここで第一マーカーは好中球総数であること、及び第一マーカーのレベルを心臓の健康の状態と関連付けることを含む。
【００１０】
更なる態様において、哺乳類対象における心不全での突然死のスクリーニング、診断もしくは予後判定、心不全での突然死の判断、心不全での突然死のリスクのある哺乳類対象の同定、又は切迫した心不全での突然死を経験している哺乳類対象へ施された療法の効果のモニタリングのためのキットは、試料を該哺乳類対象から採取し、及びC反応性蛋白質レベルを心臓の健康状態と関連付けるための使用説明書、並びに試料中のC反応性蛋白質レベルを測定するための1種以上の試薬を備えることができる。試料は、血液又は血漿であることができる。このキットは、心不全での突然死のリスクを評価することを含む、C反応性蛋白質レベルを心臓の健康状態との関連付けるための使用説明書を備えることができる。このキットは、第一マーカーと特異的に結合する抗体を含むことができる。この抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１１】
このキットは、心臓の健康の状態の指標である第二マーカーのレベルを測定するための、1種以上の試薬を備えることができる。第二マーカーは、ミエロペルオキシダーゼである。このキットは、第二マーカーに特異的に結合する抗体を含むことができる。この抗体は、モノクローナル抗体である。第二マーカーは、好中球総数又は白血球総数であることができる。このキットは、心拍数を測定及びモニタリングするために構成された検出器を備える装置を含むことができる。この装置は、患者へ出力を提供するように構成されている。
【００１２】
このキットは、心不全での突然死が存在しないことの指標である第三マーカーのレベルを測定する1種以上の試薬を備えることができる。第三マーカーのレベルは、進行性の心不全による死亡のリスクの指標である。第三マーカーは、ナトリウム利尿ペプチドであることができる。ナトリウム利尿ペプチドは、脳性ナトリウム利尿ペプチド又はN-末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチドであることができる。このキットは、第三マーカーに特異的に結合する抗体を含むことができる。この抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１３】
更なる態様において、哺乳類対象の健康をモニタリングする方法は、該哺乳類対象からの試料中の第一マーカーのレベルを測定し、ここで該第一マーカーは、C反応性蛋白質又は好中球総数であること、及び第一マーカーのレベルを心臓の健康状態と関連付けることを含むことができる。この方法は、心不全での突然死のリスクを評価することを含む、第一マーカーのレベルの心臓の健康状態との関連付けを含むことができる。試料は、血液又は血漿であることができる。この方法は、第一マーカーのレベルを、第一マーカーの閾値レベルと比較することを含む、リスクを評価することを含むことができる。この方法は、第一マーカーのレベルを、心臓の健康状態と関連付けることを含むことができる。これは、第一マーカーのレベルの、心不全での突然死のリスクが存在しないことの指標である第一マーカーのレベルとの比較を含む。この方法は、対象に施された療法の作用をモニタリングすることを含むことができる。この方法は、試料を、第一マーカーに結合する抗体と接触することを含むことができる。抗体は、モノクローナル抗体である。この方法は更に、第二マーカーのレベルを測定し、及び第二マーカーのレベルを心臓の健康状態と関連付けることを含むことができ；この第二マーカーは、第一マーカーとは異なる。第一マーカーは、C反応性蛋白質を含み、及び第二マーカーは、好中球総数又は白血球総数を含むことができる。第二マーカーは、ミエロペルオキシダーゼを含むことができる。患者の健康のモニタリングは、患者における死亡又は状態の増悪のリスクをモニタリングすることを含むことができる。
【００１４】
この方法は、心不全での突然死のリスクを評価することを含むことができる。心不全での突然死のリスクの評価は、第二マーカーのレベルを、第二マーカーの閾値レベルと比較することを含むことができる。この方法は、試料を、第二マーカーと結合する抗体と接触することを含むことができる。抗体は、モノクローナル抗体を含むことができる。この方法は更に、心拍数の変動性を測定することを含むことができる。心拍数の変動性は、NN間隔の標準偏差及びトライアンギュラーインデックスにより計算される。NN間隔の標準偏差は、心不全での突然死が存在しないことの指標であるNN間隔の標準偏差値と比較することができる。トライアンギュラーインデックスは、心不全での突然死が存在しないことの指標であるトライアンギュラーインデックス値と比較することができる。
【００１５】
更なる態様において、心臓の健康状態をモニタリングするシステムは、試料投入口及び第一のアッセイを含むカートリッジであり、ここで第一のアッセイは第一マーカーを認識するもの；及び、このアッセイにより認識された第一マーカーのレベルを測定するために構成された検出器を含むカートリッジ読取機を備えてもよい。この装置は、患者に出力を提供するように構成することができる。第一のアッセイは、第一マーカーを認識する抗体を含むことができる。該抗体は、C反応性蛋白質を認識することができる。このシステムは、試料投入口及び第二のアッセイを含む第二の試験カートリッジを備えることができ、ここで第二のアッセイは、第二マーカーを認識し；第二マーカーは第一マーカーとは異なる。第二のアッセイは、第二マーカーを認識する抗体を含むことができる。
【００１６】
驚くべきことに、CRP及び好中球総数は両方とも、SUDの検出において増加し、これらは心拍数の変動性の測定値と組合せて、心不全におけるSUDの確率のスクリーニングを行う上で十分なように特異性及び積極的予測を改善することができる。
心不全を正確でうまくモニタリング、診断、管理及び治療するための試験及び手技の多くは、複雑で、高価であり、及び病院又はそうでなければ他の保険医療施設においてのみ受けることが可能である。患者にとって自宅又は保険医療施設の外部において心不全の可能性を管理又はモニタリングする方法は、依然うまくいっていない。有利なことに、突然死は、患者由来の試料中のCRP及び／又は好中球総数のレベルのモニタリングにより同定又は追跡することができる。
1又は複数の態様の詳細が、以下の図面及び説明において示される。その他の特徴、目的及び利点も、説明、図面及び「特許請求の範囲」から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（詳細な説明）
慢性心不全(CHF)管理の進歩にもかかわらず、CHF患者の致死率は依然高い(Hoらの論文、J. Am. Coll. Cardiol.、22: (Suppl):6-13 (1993)；Massieらの論文、Curr Opin Cardiol.、11: 221-6 (1996)；Mcdonaghらの論文、Lancet、350: 829-33 (1997)；Cowieらの論文、Eur. Heart J.、18: 208-25 (1997))。これらの死亡は、予期しない急死(SUD)及び進行性心不全(PHF)により引き起こされた死の異なる様式で生じることは明らかである(Goldmanらの論文、Circulation、87(Suppl): 3124-33 (1993)；Hinkleらの論文、Circulation、65: 457-64 (1982))。PHFの死亡は、ニューヨーク心臓協会(NYHA)分類の悪化、比較的低い左心室駆出率、又は低い運動能などの、簡単な臨床測定により予測することができる(Szlachcic らの論文、Am. J. Cardiol.、55: 1037-42 (1985)；Manciniらの論文、Circulation、83: 778-86 (1991)；Roulらの論文、Eur. Heart J.、16: 1387-98 (1995)；Cohnらの論文、N. Engl. J. Med.、311: 819-23 (1984)；Cohnらの論文、Circulation、87(Suppl): 5-16 (1993))。
【００１８】
対照的に、CHFにおけるSUDは、推測が容易ではない。SUDは、心臓疾患と診断されたことがあるか又はないヒトにおける突然の心機能の不意の喪失である(Nolanらの論文、Circulation、98: 1510-6 (1998)；La Rovereらの論文、Circulation、107: 565-70 (2003)；Galinerらの論文、Eur. Heart J.、21: 475-481 (2000))。SUDは、症状出現後瞬時に又は短時間で生じることがある。SUDは、大きい健康上の問題であり、米国成人においては病院又は緊急治療室のいずれかに到着する前に、毎年約340,000例が死亡している。
SUDは、急性冠動脈症候群又は初期不整脈のいずれかにより引き起こされ得る。このことは、差し迫った冠動脈事象の測定又は「不整脈惹起性(arrhythmogenicity)」の測定の一部は、SUD直前に増大することがあることを意味する(La Rovereらの論文、Circulation、107: 565-70 (2003)；Galinerらの論文、Eur. Heart J.、21: 475-481 (2000))。
【００１９】
うっ血性心不全における予期しない急死としても知られている突然死は、主として急性冠動脈症候群により引き起こされることが多く、これは次には「炎症を起こした」アテローム硬化斑の破壊に起因している(Daviesらの論文、N. Engl. J. Med.、310: 1137-40 (1984))。これが真実であるならば、好中球又はC反応性蛋白質のような炎症の個人内徴候は、SUDの直前に増加するであろうと予想することができる。この仮説は、C反応性蛋白質はSUDの前年に測定した場合に増大することを明確に示した、Ridkerとその同僚の象徴的研究(Ridkerらの論文、N. Engl. J. Med.、342: 836-43 (2000))により有望である。従ってSUD事象は、硬化斑の急性破壊部位は安定した硬化斑よりもはるかに多い炎症を有するという事実(van der Walらの論文、Circulation、89: 36-44 (1994))に起因し、及びSUDの数日から数週間前の間に硬化斑の不安定性及び血栓形成が存在するという最新の病理学データ(de Gouveiaらの論文、Eur. Heart J.、23: 1433-40 (2002))により、SUD事象の直前のC反応性蛋白質及び炎症は、更なる短期間の個人内増加により引き起こされる可能性がある。他方で、「不整脈惹起性」がSUDに寄与するならば、携帯型心電図は有用であるが、これまでのところSUDを予測するその能力は変動することが証明されている(Nolanらの論文、Circulation、98: 1510-6 (1998)；La Rovereらの論文、Circulation、107: 565-70 (2003)；Galinerらの論文、Eur. Heart J.、21: 475-481 (2000))。この変動性は、全ての現在の試験は横断的(cross sectional)なものであり、そこではひとつの試料が、多数の患者から採取され、その結果SUDが発生する前に長い空白の時間が存在することが理由であろう。代わりの試験デザインは、SUD前の個人内変化を調べるために、ECGが、同じ患者から多数回繰返しとられる縦断的試験(longitudinal study)である(Nakagawaらの論文、Br. Heart J.、71: 87-8 (1994))。空白の時間の問題とは別に、横断的試験の別の問題点は、ほとんどのパラメータは、個人内変動よりもより大きい個人間変動を有し、及び高い個人間変動性は、個人のリスクを確定する横断的試験の能力を大幅に制限することである。SUDアプローチとして次第に増悪することがある携帯型心電図(ECG)のふたつの測定値は、心拍数の変動性及び自発的心室性期外収縮活動である(Nakagawaらの論文、Br. Heart J.、71: 87-8 (1994)；Bigger T.の論文、Circulation、75(Suppl): 28-35 (1987))。ふたつの場合のひとつの先の報告が、患者においてSUD前に心拍数の変動性が増悪したことを示唆している(Nakagawaらの論文、Br. Heart J.、71: 87-8 (1994))。
【００２０】
従って、CHFにおけるSUDに先立ち、炎症(C反応性蛋白質／好中球)の測定値又は不整脈惹起性のある種の心電図(ECG)測定値が個人内で増加するかどうかを調べる研究が行われた。これらは、SUD前の最も可能性のある「引き金」事象である。
哺乳類対象における心不全の突然死の指標となる第一マーカーは、C反応性蛋白質(CRP-SwissProt P02741)である。哺乳類対象における心不全での突然死の指標となる第二マーカーを測定することができる。この第二マーカーは、好中球総数又は白血球総数により測定されても良い。好中球総数又は白血球総数は、例えば血球計により直接的に、又は例えばミエロペルオキシダーゼもしくはエラスターゼなどの蛋白質レベルの測定により間接的に測定することができる。好中球総数は、抗-ミエロペルオキシダーゼ抗体、抗-好中球エラスターゼ抗体又は抗-CD11b抗体を含むことができる抗-好中球抗体を用い間接的に得ることもできる。
【００２１】
第二マーカーは、主要な好中球蛋白質であるミエロペルオキシダーゼ(EC 1.11.1.7)であることができる。ヒトMPOのアミノ酸配列は、NCBIデータベースにおいて認めることができる(寄託番号NM_000250、寄託番号AH_002972)。測定することができる別の追加マーカーは、酸化された低密度リポ蛋白質、可溶性接着分子(例えば、E-セレクチン、P-セレクチン、細胞内接着分子-1、又は血管細胞接着分子-1)、Nourin-1、サイトカイン(例えば、インターロイキン-1β、-6、-8、及び-10、又は腫瘍壊死因子-α)、又は急性期反応物質(例えば、フィブリノーゲン、又は血清アミロイドA(SAA))などの、炎症マーカーを含むことができる。
【００２２】
哺乳類対象における心不全での突然死が存在しないことの指標となる第三マーカーも測定することができる。このようなマーカーは、天然の心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP-Brennerらの論文、Physiol. Rev.、70: 665 (1990)参照)、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)及びC-型ナトリウム利尿性(CNP-Stingoらの論文、Am. J. Physiol.、263: H1318 (1992)参照)などのナトリウム利尿ペプチド、並びにそれらの変種又は対立遺伝子変種を含む。適当なナトリウム利尿ペプチドは、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)又はN-末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド(N-BNP)である。別の適当なナトリウム利尿ペプチドは、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)である(Hallの論文、Eur. J. Heart Fail、3: 395-397 (2001))。
これらのマーカーは、患者における心不全の炎症レベルの判定に使用することもできる。炎症レベルは、予期しない急死(SUD)、進行性心不全(PHF)、急性冠動脈症候群(ACS)又は発作などの心臓血管系事象の高リスクに関連付けることができる。
【００２３】
このようなマーカーのレベルは、マーカーレベルをそのマーカーの閾値レベルと比較することにより、評価することができる。このような閾値レベルは、小児、青年、高齢者、もしくは人種／民族群のような大きい母集団群、又はそれらの組合せからプールされたデータに従い設定することができる。特定の母集団群について測定され及び設定された閾値レベルは、ひとつの母集団群から別のものへと振替え可能でも適用可能でもない。あるいは、閾値レベルは、個人の追跡から得られたデータから得られた閾値レベルを基にしてもよい。患者の頻繁な試験は、その特定の患者において先に確立された閾値レベルとのよりよい比較を提供し、並びに医師が患者の心臓の健康をより良く判定することを可能にするであろう。マーカーレベルの低下した個人内変動は、より特異的及び個人化された閾値が患者について定義されることを可能にする。
【００２４】
マーカーレベルを評価する方法は、個人内変動性の変化の観察、個人において確立されたベースラインレベルからの絶対もしくは相対レベルの変化の観察、又は経時的な陽性又は陰性の傾向の観察を含んでも良い。
試料中のマーカーレベルは、マーカーの全分子として、断片としての、試料中のマーカー量の定量により、又は試料中もしくは試料の派生物中のマーカーの活性の測定により、測定することができる。前述のマーカーの断片は、問題のマーカー独自のものであるアミノ酸配列を有するであろう断片を用いて測定することができる。この断片は、6個のアミノ酸と少ないことができるが、7、8、9、10、11、12、13、14、15個又はそれよりも多いアミノ酸であってよい。
【００２５】
概して、このマーカーのアミノ酸残基は、保存的置換において別のアミノ酸残基と交換することができる。保存的置換の例は、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンなどのある非-極性(すなわち、疎水性)残基の、別の非-極性残基との置換；ある極性(すなわち、親水性)残基の別の極性残基との置換、例えばアルギニンとリシンの間、グルタミンとアスパラギンの間、又はグリシンとセリンの間の置換など；リシン、アルギニン又はヒスチジンなどの、ある塩基性残基の、別の塩基性残基との置換；もしくは、アスパラギン酸又はグルタミン酸などのある酸性残基の、別の酸性残基との置換を含む。ある保存的置換において、アミノ酸残基は、化学的に類似した側鎖を有するアミノ酸残基と交換することができる。化学的類似性を伴う側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を持つアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を持つアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、未帯電極性側鎖を持つアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を持つアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分枝した側鎖を持つアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖を持つアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。
【００２６】
保存的置換は、誘導体化されない残基の代わりに、化学的に誘導体化された残基の使用も含んでよい。化学誘導体は、残基の官能基の反応により化学的に誘導体化された残基である。このような化学誘導体の例は、遊離のアミノ基が誘導体化され、例えば、アミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベンズオキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基などを形成している分子を含むが、これらに限定されるものではない。遊離のカルボキシル基は誘導体化され、塩、メチル及びエチルエステル、又は他のエステルもしくはヒドラジドを形成することができる。遊離のヒドロキシル基は誘導体化され、O-アシル又はO-アルキル誘導体を形成することができる。化学誘導体として、20種の標準のアミノ酸の1種以上の天然のアミノ酸誘導体を含む、それらのポリペプチドも含まれる。例えば、4-ヒドロキシプロリンは、プロリンと置換することができ；5-ヒドロキシルシン(hydroxylsine)は、ヒスチジンと置換することができ；ホモセリンは、セリンと置換することができ；並びに、オルニチンは、リシンと置換することができる。
【００２７】
ポリペプチドのアミノ酸残基は、非保存的置換において別のアミノ酸残基と交換することができる。場合によっては、非保存的置換は、ポリペプチドの関連する特性は変更しないであろう。この関連する特性は、それらの変種及び対立遺伝子変種を含むCRP、MPO、N-BNP、又はBNP又は他の生物学的活性を認識する抗体に結合する能力を含むが、これらに限定されるものではない。
試料中のマーカーレベルは、例えば、免疫クロマトグラフィーフォーマットのようなアッセイを用い、定性的又は定量的に測定することができる。定性的アッセイは、マーカーの存在と非存在を識別することができるか、又は試料中のマーカーレベルの範疇、例えば非存在、低濃度、中濃度もしくは高濃度又はそれらの組合せを識別することができる。定量的アッセイは、試料中のマーカーの数値測定を提供することができる。このアッセイは、マーカーをその特定のマーカーを認識する抗体と接触すること、質量分析によりマーカーを検出すること、細胞を含む試料をそれらの細胞によるマーカー遺伝子の発現(例えば、mRNA又はポリペプチドの)についてアッセイすること、又は測定の組合せを含むことができる。例えばこのアッセイは、試料をマーカーを認識する抗体と接触すること、及び質量分析測定を含むことができる。
【００２８】
これらのマーカーは、哺乳類の体から得ることができる、血液、血漿又は他の体液、例えば腸液、尿、全血、唾液、血清、リンパ、胃液、胆汁、汗、涙、並びに脳脊髄液中に検出することができる。体液は、処理されても(例えば、血清)又は処理されなくともよい。哺乳類対象はヒトであってよい。
測定された第一マーカー、例えばCRPのレベルは、心不全の非存在の指標であるCRPレベルと比較することができる。このレベルは、心不全においてSUDと無関係な1種以上の哺乳類対象からのCRPベースラインレベル、またはそのような哺乳類対象のCRPについて予め決定された参照範囲であることができる。この方法において、これらのレベルは、診断又は予後判定を提供するために、心不全においてSUDと無関係な対象の母集団試験から決定された参照レベルと比較することができる。このような対象は、年齢及び／又は性別を合致させることができる。ひとつの態様において、心不全での突然死のリスクの指標であるCRPレベルは、ベースライン値から、約3μg/ml又はそれ以上、例えば5μg/ml以上、10μg/ml以上、15μg/ml以上、20μg/ml以上、25μg/ml以上又は30μg/ml以上大きい。別の態様において、心不全での突然死のリスクの指標である好中球総数は、ベースライン値から約0.5x109/l、1x109/l、2x109/l、3x109/l、4x109/l、5x109/l又はそれ以上大きいことができる。
【００２９】
他の実施態様において、進行性心不全による死亡リスクの指標であるBNPレベルは、ベースライン値から約55pg/ml、65pg/ml、75pg/ml、85pg/ml、95pg/ml、又は105pg/mlであることができる。別の実施態様において、進行性心不全による死亡リスクの指標である好中球総数は、ベースライン値から約1.5x109/l、2x109/l、2.5x109/l、3x109/l又はそれよりも大きいことができる。更なる態様において、進行性心不全による死亡リスクの指標であるCRPレベルは、約5μg/ml又はそれよりも大きい、もしくは10μg/ml又はそれよりも大きいことができる。
【００３０】
正確な値は、アッセイ様式によって変動し得る。切迫したSUDを有する哺乳類対象に施された療法の作用をモニタリングするために、測定したCRPレベルを、対象の基本レベルと比較することができる。この基本レベルは、その療法の開始前に決定されても良い。この基本レベルからの偏差は、心臓の健康状態の改善又は増悪が存在するかどうか、その結果この療法が有効であるかどうかを示している。増加したCRPレベルは、心不全における進行性の切迫したSUDを示し、及びその逆の場合も同じである。当業者には、哺乳類対象における心不全のSUDのスクリーニング、診断又は予後判定のため、哺乳類対象における心不全のSUDの決定のため、心不全のSUD発症のリスクのある哺乳類対象の同定のため、又は心不全における切迫したSUDを有する哺乳類対象に施された療法の作用のモニタリングのためであるCRPの各レベルは、互いに異なることができることは理解されるであろう。これらのレベルは、本願明細書に説明されたものに類似した方法で容易に決定することができる。
【００３１】
測定された第二マーカーのレベルは、心不全におけるSUD非存在の指標である第二マーカーのレベルと比較することができる。このレベルは、1種以上の心不全におけるSUDを伴わない哺乳類対象由来の第二マーカーのレベルであるか、又は心不全におけるSUDを伴わない哺乳類対象における第二マーカーに関する予め決定された参照範囲を伴うことができる。再度正確な値は、アッセイ様式に応じて変動し得る。
本願明細書においてより詳細に説明されるように、CRP、N-BNP、好中球総数、白血球総数、心拍数の変動性の組合せの使用は、これらのマーカーのいずれか単独の使用と比べ、改善された特異性及び積極的予測を提供することができる。この結果、心不全を確認するために実行される心電図の必要性をより少なくし、著しい経費削減をもたらす。マーカーレベルは、存在するマーカーの量を示す濃度、質量、モル数、容量又はいずれか他の測定値の単位で提供することができる。
【００３２】
好中球総数又は白血球総数は、標準のフローサイトメトリー、又は国際公開公報第2003078972号に開示されたようなマイクロフルイディスク装置によるか、又は当業者に公知の他の方法により得ることができる。測定された好中球総数は、心不全においてSUDが存在しないことの指標である好中球総数と比較することができる。この好中球総数は、1又は複数の心不全におけるSUDを伴わない哺乳類対象由来の好中球総数であるか、又は心不全におけるSUDを伴わない哺乳類対象における第二マーカーの予め決定された参照範囲と比較することができる。心拍数の変動性は、心電図(ECG)から測定することができ、並びに全NN間隔の標準偏差(SDNN)及びトライアンギュラーインデックス(TI)は、Anonの論文(Circulation、93: 1043-65 (1996))に記載されたような、標準指針に従い分析することができる。
【００３３】
第一、第二又は第三マーカーの各レベルは、イムノアッセイを用い、すなわち、試料を、そのマーカーと特異的に結合する抗体と接触し、及び抗体と試料中の少なくとも1種の種の間に生じた結合を測定することにより、測定することができる。このようなアッセイは、競合的又は非競合的イムノアッセイであってよい。このようなアッセイは、均一及び不均一の両方共、当該技術分野において周知であり、ここで検出されるべき検体は、ラテックス又は金粒子、蛍光部分、酵素、電気化学的活性種などの検出可能な種により標識されている抗体などの特異的結合のパートナーとの結合が引き起こされる。あるいは検体は、前述の検出可能な種のいずれかにより標識され、限定量の特異的抗体と競合してもよい。その後検体の存在又は存在する量は、標識物の存在又は濃度の検出により決定される。このようなアッセイは、実験室用分析装置、又は欧州特許第EP291194号に開示されたような側方流動イムノアッセイのような、治療施設又は自宅用(point of care or home)の試験装置により、通常の方法で実行されても良い。
【００３４】
ひとつの実施態様において、イムノアッセイは、試験される対象由来の得た試料を、適当な抗体と、マーカーが存在する場合には免疫特異的結合が生じるような条件下で接触し、並びにその抗体による何らかの免疫特異的結合を検出又は量を測定することにより実行される。この抗体は、試料と、少なくとも約10分間、30分間、1時間、3時間、5時間、7時間、10時間、15時間、又は1日接触しても良い。ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈殿反応、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ及びプロテインAイムノアッセイのような技術を使用する競合的及び非競合的アッセイシステムを含むが、これらに限定されるものではない、いずれか適当なイムノアッセイを用いることができる。
【００３５】
例えば、マーカーは、二工程サンドイッチアッセイにより液体試料中に検出することができる。第一の工程において、捕獲試薬(例えば、抗-マーカー抗体)を用い、マーカーを捕獲する。この捕獲試薬は、任意に固相に固定することができる。第二の工程において、直接又は間接に標識された検出試薬を用い、捕獲されたマーカーを検出する。ひとつの態様において、検出試薬は抗体である。別の実施態様において、検出試薬はレクチンである。
ひとつの実施態様において、側方流動イムノアッセイ装置を、「サンドイッチ」形式で使用することができ、ここで試料中の十分なマーカーの存在は、側方流動アッセイの捕獲ゾーンでの「サンドイッチ」相互作用の形成を生じるであろう。ここで使用される捕獲ゾーンは、MPOの捕獲に適した抗体分子、抗原、核酸、レクチン、及び酵素などの捕獲試薬、並びに本願明細書に説明された他のマーカーを含んでも良い。この装置は、捕獲ゾーンでの捕獲に適した1種以上の発光標識物を、検体の存在により決定される捕獲の程度に組込んでもよい。適当な標識物は、ポリスチレンミクロスフェアに固定された蛍光標識物を含む。ミクロスフェアは、捕獲ゾーンにおいて捕獲を可能にするために、免疫グロブリンで被覆されてもよい。
【００３６】
使用することができる他のアッセイは、フロースルー装置を含むが、これに限定されるものではない。
フロースルーアッセイにおいて、ひとつの試薬(通常抗体)は、膜表面上の限定された領域に固定される。次にこの膜は、装置を通し試料容量をポンプ送出するための貯蔵庫として作用する吸着層上に積層される。固定後、非-特異的な相互作用を最小とするために、膜上の蛋白質-結合部位の残りがブロックされる。このアッセイが使用される場合、抗体に特異的なマーカーを含む体液試料が、マトリックスを通して膜及びフィルターに添加され、マーカーが固定された抗体に結合することを可能にする。任意の第二の工程において(第一の反応物が抗体である態様において)、タグを付けた二次抗体(酵素複合体、着色されたラテックス粒子に結合した抗体、又は着色されたコロイドに組込まれた抗体)を添加又は放出し、これは捕獲されたマーカーと反応し、サンドイッチを完了することができる。あるいは、二次抗体は、単独の工程で試料と混合し添加することができる。マーカーが存在する場合、着色された点が、膜の表面に顕出する。
【００３７】
本願明細書において使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。免疫グロブリン分子は、いずれかのクラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD及びIgA)又は免疫グロブリン分子サブクラスであることができる。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片及びF(ab')2断片、Fab発現ライブラリーにより産生された断片、抗-イディオタイプ(抗-Id)抗体、並びに前述のいずれかのエピトープ-結合断片を含むが、これらに限定されるものではない。抗体、又は一般的にいずれかの分子は、抗体が優先的に抗原に結合し、並びに例えば、他の分子との約30％未満、好ましくは20％、10％、又は1％の交差反応性を有する場合は、抗原(又は他の分子)に「特異的に結合する」。抗体の一部は、Fv及びFv'部分を含む。
【００３８】
本願明細書において考察されたCRP、MPO、BNP、好中球及びその他のマーカーを検出するための抗体は、市販されている。例えば、抗-CRP抗体は、Alpha Diagnostic International社(5415 Lost Lane, San Antonio, TX 78238 USA)及びResearch Diagnostics社(Pleasant Hill Road, Flanders NJ 07836, USA)から入手することができ、抗-MPO及び抗-BNP抗体は、Abcam社(21 Cambridge Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 0TP, UK)から入手することができる。BNP及びANPに結合する抗体は、市販されている。市販のBNPに結合する抗体の例は、ウサギ抗-ヒトBNPポリクローナル抗体(Biodesign International社)、ウサギ抗-BNPアミノ酸1-20ポリクローナル抗体(Biodesign International社)、抗-ヒトBNPモノクローナル抗体(Immundiagnostik社)、及びウサギ抗-ヒトBNPアミノ酸1-10ポリクローナル抗体(Immundiagnostik社)がある。市販のANPに結合する抗体の例は、マウス抗-ヒトANPモノクローナル抗体(Biodesign International社)、ウサギ抗-ヒトANPモノクローナル抗体(Biodesign International社)、マウス抗-ヒトANPモノクローナル抗体(Chemicon社)、ウサギ抗-ヒトANPアミノ酸95-103抗体(Immundiagnostik社)、ウサギ抗-ヒトANPアミノ酸99-126抗体(Immundiagnostik社)、ヒツジ抗-ヒトANPアミノ酸99-126抗体(Immundiagnostik社)、マウス抗-ヒトANPアミノ酸99-126モノクローナル抗体(Immundiagnostik社)及びウサギ抗-ヒトa-ANPポリクローナル抗体(United States Biological社)がある。好中球を検出する抗体は、抗-好中球エラスターゼ抗体(Chemicon社)、抗-CD11b(C3bi受容体)抗体、抗-好中球抗体であってよい。
【００３９】
本願明細書に説明された方法を実行するために、キットを使用することができる。
哺乳類対象における心不全での突然死をスクリーニング、診断もしくは予後判定するための、心不全での突然死を決定するための、心不全での突然死のリスクのある哺乳類対象を同定するための、又は切迫した心不全での突然死を経験している哺乳類対象に施される療法の作用をモニタリングするためのキットも提供される。このキットは、哺乳類対象から体液試料を採取するための使用説明書、並びに試料中のマーカーレベルを測定し、及びマーカーレベルを心臓の健康状態と関連付けるための1種以上の試薬を含むことができる。
これらの1種以上の試薬は、先に説明されたような、第一マーカーに特異的に結合する抗体を含んでよい。キットは、同じく先に説明されたような、哺乳類対象の心臓の健康状態の指標となる第二マーカーのレベルを測定する1種以上の試薬も含んでよい。キットは更に、第三マーカーのレベルを測定するための1種以上の試薬を含んでもよい。
【００４０】
哺乳類対象から体液試料を採取するための使用説明書は、任意であってよい。加えてキットは任意に、下記の1種又は複数種を含んでよい：(1)哺乳類対象における心不全での突然死のスクリーニング、診断もしくは予後判定のため、心不全での突然死を判断するため、心不全での突然死のリスクのある哺乳類対象を同定するため、又は切迫した心不全での突然死を経験している哺乳類対象に施される療法の作用をモニタリングするためのキットの使用に関する使用説明書；(2)キット中に存在する抗体に対する標識された結合パートナー；(3)その上にそのような抗体が固定された固相(例えば試薬細片)；並びに、(4)診断、予後判定もしくは治療的用途又はそれらの組合せに関する規制当局の承認を示すラベル又は添付文書である。その抗体又は各抗体に対する標識されない結合パートナーが提供される場合は、その抗体又は各抗体それ自身は検出可能なマーカー、例えば、化学発光部分、酵素部分、蛍光部分又は放射性部分により標識することができる。
【００４１】
該装置は、診断用キットに含まれ、これは任意に、下記の1種以上を含むことができる：事象検出、診断、予後判定、スクリーニング、治療的モニタリング又は患者管理のためのこれらの用途のいずれかの組合せに、このキットを使用するための使用説明書；試験を実施するために必要な試薬を含む使い捨ての試験用カートリッジ；又は、マーカー試験の結果を測定し、並びに任意に他のパラメータの手動もしくは自動の入力、パラメータの保存、及び測定した1個又は複数個のマーカーの評価と同時の又はそれとは別のパラメータの評価を可能にする器具もしくは装置である。
【００４２】
このキット内に供給された1個又は複数個のカートリッジは、使用者が、最低でも、CRPである第一マーカー、ミエロペルオキシダーゼである第二マーカー、又はナトリウム利尿ペプチドである第三マーカーを測定することを可能にする。好ましくは1個又は複数個の試験用カートリッジは、CRP、ミエロペルオキシダーゼ及び／又はBNPのようなナトリウム利尿ペプチドの逐次又は連続測定を可能にする。組合せカートリッジは、単独の試料から2種又はそれよりも多い異なるマーカーを試験することができる。
【００４３】
器具(耐久性のある又は使い捨ての)は、最低でも、マーカー試験の結果を測定し、並びに任意に他のパラメータの手動もしくは自動の入力、該パラメータの保存、及び測定したマーカーと一緒又は個別の該パラメータの評価を可能にする。
【００４４】
図Xを参照し、診断用装置100は、ディスプレイ120及び入力領域140を備える。ディスプレイ120は、様々なフォーマット、例えば、JPEG(joint photographic experts group)フォーマット、TIFF(tagged image file)フォーマット、GIF(graphics interchange)フォーマット、又はビットマップで画像を表示するために使用することができる。ディスプレイ120は、テキストメッセージ、ヘルプメッセージ、命令、質問、試験結果、及び患者への様々な情報を表示するために使用することもできる。一部のインプリメンテーションにおいて、ディスプレイ120は、ハイパーテキスト記述言語(HTML)フォーマットをサポートしており、その結果表示されたテキストは、追加の情報、画像、又はフォーマット済みのテキストへのハイパーリンクを含んでも良い。ディスプレイ120は更に、例えば、MPEG(moving picture experts group)フォーマット、Apple's QuickTimeフォーマット、又はDVDフォーマットで保存されたビデオを表示する機構を提供することができる。ディスプレイ120は追加的に、可聴式の命令、音、音楽などを生じる音源(例えば、スピーカー)を備えることができる。
【００４５】
入力領域140は、キー160を備えることができる。ひとつの実施態様において、入力領域140は、例えばディスプレイ120がタッチスクリーンであるような場合は、ディスプレイ120上に表示されたシンボルとして実現することができる。患者への命令及び質問は、ディスプレイ120上で患者に提示される。患者は、入力領域を介して質問に反応することができる。
また、装置100は、読取りのために診断試験用カートリッジを受け取る、カートリッジ読取機180も備えることができる。このカートリッジ読取機180は、例えば、試験用カートリッジ400について生じる呈色変化の大きさを基に、マーカーレベルを測定する。装置100は、プローブ接続200も備え、これらはプローブ(例えば、質量、温度、心拍数、心拍数の変動性、呼吸数、血圧、又は血中酸素飽和濃度のプローブ)をこの装置に接続する。
【００４６】
装置100は更に、通信ポート220を備える。通信ポート220は、例えば、電話線又はコンピュータネットワークに接続することができる。装置100は、患者の試験結果を、遠隔地から医療提供者に通信することができる。同様に医療提供者は、装置100により通信することができる(例えば、保存された試験結果にアクセスする、装置パラメータを調節する、又は患者へメッセージを送信する)。
ふたつの試験ゾーン420を伴うカートリッジ400が示されている。概して、カートリッジは、1、2、3、4、もしくは5個又はそれよりも多い試験ゾーンを備えることができる。各試験ゾーン420は、マーカーレベルを試験することができる。各試験ゾーン420は、試料投入口440、対照結果ウィンドウ460及び試験結果ウィンドウ480を備える。ひとつの実施態様において、カートリッジ400は、免疫クロマトグラフィー試験用カートリッジである。免疫クロマトグラフィー試験及び試験結果読取機の例は、例えば、米国特許第5,504,013号；第5,622,871号；第6,235,241号；及び、第6,399,398号に開示されており、その各々は全体が本願明細書に参照として組入れられている。
【００４７】
装置100を使用し、患者の健康に関する情報を提供する様々なマーカーのレベルを試験及び記録することができる。診断用装置100の様々なインプリメンテーションは、記憶媒体(例えば、ビデオカセットレコーダー(VCR)テープ又はデジタルビデオディスク(DVD)；コンパクトディスク(CD)；又は、フロッピーディスク)上に保存されたプログラム及び／又はデータにアクセスすることができる。加えて様々なインプリメンテーションは、別のコンピュータシステム上に保存されたプログラム及び／又はアクセスされたデータへ、直結ケーブル接続、コンピュータネットワーク、無線ネットワーク、衛星ネットワークなどを含む通信媒体を通じアクセスすることができる。
診断用装置を制御し及び患者にフィードバックを提供するソフトウェアは、汎用コンピュータ装置、携帯情報端末(PDA)、専用コンピュータ装置、ラップトップコンピュータ、ハンドヘルドコンピュータ、又はネットアプライアンスなどの、いずれかの処理装置上で動作するソフトウェアアプリケーションの形であることができる。
【００４８】
診断用装置は、プロセッサー、1個又は複数個の入力装置、1個又は複数個の出力装置、コンピュータで読取り可能な媒体、及びコンピュータ記憶装置を含むハードウェアの立体配置を用い実現されてもよい。このプロセッサーは、汎用マイクロプロセッサー又は特定用途向け集積回路(ASIC)などの、いずれかのコンピュータ処理装置を用い実現されてもよい。このプロセッサーは、機械装置に、センサーデータ及び／又は入力データを受け取らせ、並びにサービス技術者に、クエリー及び結果を表示、さもなければ出力する機械装置を提供するための入力/出力(I/O)装置と共に一体化することができる。入力装置は、例えば、下記の1種又は複数を含んでよい：マウス、キーボード、タッチスクリーン式ディスプレイ、ボタン、センサー、及びカウンターである。
【００４９】
ディスプレイ120は、液晶ディスプレイ(LCD)、テレビ、プリンター、及び発光ダイオード(LED)を含む、いずれかの出力技術を用い実現することができる。コンピュータで読取り可能な媒体は、固定された又は取り外し可能な媒体のいずれか上にプログラム及びデータを保存するための機械装置を提供する。コンピュータで読取り可能な媒体は、通常のコンピュータハードディスクドライブ、又は参照のために先に説明されたもののような他の取り外し可能な媒体を用い実現されてもよい。最後に、このシステムは、診断用装置の操作を補助するために、ランダムアクセスメモリー(RAM)のような、コンピュータ記憶装置を使用する。
【００５０】
装置100は、医療記録データベースのようなアプリケーション又は患者の治療において使用される他のシステムへのアクセスを提供することができる。ひとつの例において、この装置は、通信ポート220を介し、医療記録データベースに接続する。装置100は、オンラインに進み、現存のデータベースを統合し、及び他のウェブサイトに接続する能力を有しても良い。オンラインアクセスは、患者による医療情報への、及び介護者による患者の健康を反映している最新の試験結果への、遠隔オンラインアクセスも提供する。この装置は、病院、診療所、クリニック、及び患者の自宅において、患者又は付き添い介護者のいずれかにより使用することができる。
【００５１】
この装置は、特にマーカーレベルが患者の健康状態の変化を示す場合には、測定されたマーカーレベルに反応するように構成することができる。例えば、装置は、試験結果を保存し、及び経時的マーカーレベルの変化を決定するように構成することができる。経時的な結果の変化は、急性の変化又は慢性の変化であることができる。急性の変化は、短期間にわたるマーカーレベルにおける有意な変化であることができる。変化の大きさ及び期間は、各マーカーについて異なることができる。この装置は、各々の新たな試験結果を、最近の保存された試験結果の値(例えば、先の1、2、3、4、5又はそれよりも多い結果)、又は最近の試験結果の総計した測定値(例えば平均)のいずれかと比較し、急性の変化が生じたかどうかを決定するように構成することができる。ひとつの例において、急性の変化は、試験結果の先の結果からの変化の割合(％)により検出される。
【００５２】
慢性の変化も検出することができる。慢性の変化は、長期間にわたり生じるマーカーレベルの変化であることができる。例えば、慢性の変化は、多くの試験間隔が検出される急性の変化を伴わずに進行し、依然マーカーレベルは有意に異なるように生じる。慢性の変化を検出するために、装置は、各々の新たな試験結果を、より早期の試験の保存された結果、又はより早期の試験の総計した測定値と比べることができる。慢性の変化を検出するために、より早期の試験は、例えば、新たな試験結果の4〜12週前に得ることができる。ひとつの例において、総計した測定値は、例えば定期的平均値(rolling average)、例えば4週、8週、又は12週の定期的平均値などであることができる。
【００５３】
この装置は、試験結果を、保存された閾値又は範囲と比較するように構成することもできる。閾値は、値の上限もしくは下限又は範囲であることができる。従ってこの装置は、マーカー、又はマーカー群の測定された値が、安全なレベル、危険なレベルであるかどうかを決定するか、又は緊急を指摘することができる。装置は、医療を求めることを患者に指示することが適している場合には、試験の結果を患者に警告することができ、並びにそのように構成することができる。
【００５４】
この装置は、マーカーの組合せ、例えばふたつのマーカーの平均値、ふたつのマーカー間のレベルの差、ふたつのマーカーレベルの比、又はふたつもしくはそれよりも多いマーカーがそれらの各閾値を同時に超えたかどうかを追跡するように構成することもできる。装置は、1種又はそれよりも多いマーカーを、患者の徴候及び症状と組合せて追跡するように構成することができる。
この装置は、患者個人専用であることができる。各マーカーに関する閾値及び他のパラメータは、例えば、年齢、性別、又は病態のような患者の状況を基に、(例えば、医師又は他の介護者により)調節することができる。この装置が患者に示す質問及び回答も調節することができる。
この方法を実施する例を以下に示す。
【実施例】
【００５５】
（実施例）
（試験群及びデータ収集）
下記判定基準に合致する34名の患者を、本試験のために集めた：18ヶ月以上のCHF、3ヶ月間は臨床上安定；NYHA分類IIからIV；冠動脈疾患(94％)又は特発性拡張型心筋症により引き起こされたCHF；損なわれた左心室駆出(rejection)率が＜40％；6ヶ月以内の急性冠動脈事象なし；並びに、洞調律。除外基準は、冠動脈再建の予定；慢性閉塞性肺疾患；有意な腎機能障害；糖尿病；自律神経性ニューロパシー；末梢動脈疾患の制限；ペースメーカー埋込み；bブロッカーによる治療；及び、心房細動である。募集前に、テイサイド地区の倫理委員会及び研究所の委員会が本試験を承認した。患者は全員、本試験への参加について、書面によるインフォームドコンセントを提出した。
【００５６】
患者は、自宅待機し、月1回の間隔で来院した。24時間携帯型ECGモニター(Tracker2、Reynolds Medical社、ハートフォード、英国)を装着しキャリブレーションした。血液試料を、20分以上仰臥状態で休息した後採取した。24時間ECG結果は、Reynolds pathfinder 600シリーズワークステーションで処理した。好中球は、本発明者らの通常の血液臨床検査室において標準のフローサイトメトリーにより計数した。貯蔵した血漿を、標準の市販の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キット(Immuno-biological Laboratories社、ハンブルグ、独国)による高感度C反応性蛋白質分析に使用した。クラミジア肺炎病原体(Chlamydia pneumoniae)抗体(IgG、IgA、IgM)及び免疫複合体を、全ての試料について既報のように分析した(Tavendaleらの論文、Eur. Heart J.、23: 301-7 (2002))。毎月の試料を全て、好中球、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、及びアルドステロンについて分析した。C反応性蛋白質及びクラミジアは、1個のベースライン試料及び各患者について死亡又は試験終了時の前の最後の3試料についてのみ測定した。
【００５７】
全てのテープ(tape)に、標準Holter分析を施し、手作業でアーチファクトを確認した。引き続き、時間区域(time domain)の心拍数の変動性を、正常な形及び事前のサイクル時間の80〜120％の間のサイクル長を有するRR間隔から自動的に解析した。全てのテープを分析し、それらのデータファイルを検証し、個々の患者の臨床状態については盲検とされた試験担当医(AMAS)により編集した。平均して、各患者のデータの97％は、編集後更なる解析のために利用可能であった。SUDは、新たな症状が始まる前にPHFの証拠を伴わない新規症状の1時間以内の死亡とする従来の専門委員会の見解を基に、死亡は、PHF又はSUDとして分類した(Narangらの論文、Eur. Heart J.、17: 1390-403 (1996))。
心拍数の変動性は、標準の指針に従い解析した(Anon、Circulation、93: 1043-65 (1996))。
【００５８】
これらの解析は、SPSS(version 10、SPSS社、シカゴ、IL、米国)により行った。データのほとんどは正規分布した。正規分布しない又は正規分布のボーダーラインのデータは、そのまま及び対数変換後に解析した。異なる時点の平均値は、反復測定の分散分析及び線形対比並びに適している場合は一元分散分析、それに続くポストホックBonferroni相関により比較した。p値＜0.05は有意であると見なした。好中球、アルドステロン、C反応性蛋白質、BNP、全NN間隔の標準偏差(SDNN)、及びトライアンギュラーインデックスの変動係数は、各々、0.8％、6％、13％、15％、0.3％、及び1.2％であった。
【００５９】
その時点(1990年代半ば)で、標準の実践として、β遮断薬で治療された患者はいなかった(表1)。平均(SD)の経過観察期間は、20(5)ヶ月であった。経過観察期間に、患者9名が死亡し、4名がPHFであり(7、12、21、及び24ヶ月)、並びに5名がSUDであった(6、11、15、20、及び21ヶ月)。全てのPHF死亡は病院で発生し、及び全SUDは地域で発生したことは無意味であり、このことはこれらの死亡は正確に分類されたことの検証を補助する(Narangらの論文、Eur. Heart J.、17: 1390-403 (1996))。
【００６０】
【表１】
2006292623.tif 000002
【００６１】
*常に全体的左心室拡張及び虚血性心疾患の症状又は徴候の欠如を基にした。
ACE、アンギオテンシン転換酵素；LVEF、左心室駆出率；NYHA、ニューヨーク心臓協会；SDANN、全ての5分毎のNN間隔の平均；SDNNi、全ての5分毎のNN間隔の平均(SD)。
【００６２】
C反応性蛋白質及び非-持続性心室頻脈(NSVT)事象がPHF群よりも高いこと(表2)を除き、ベースライン時に有意差は存在しなかった。他方で、いくつかのパラメータの個人内変化は、これら3群間で高度に有意差があった。図1は、死亡(SUD群及び進行性心不全(PHF)群)又は試験終了(生存群)のいずれかの前の、ベースラインから最後の3回の測定値までの変化(平均(SEM))、(トライアンギュラーインデックス(TI)、全NN間隔の標準偏差(SDNN)、及び心室性期外収縮数)を示している。//は、複数の測定を示している。*p＜0.05；**p＜0.01。死亡した患者(SUD及びPHF)は、平均24時間の心拍数の変動性(トライアンギュラーインデックス及びSDNN)のベースラインと最後の3回の値の間の連続変化において、対照生存群と比較して有意な個人内増悪を有した(図1参照)。
【００６３】
図2は、死亡(SUD群及びPHF群)又は試験終了時(生存群)のいずれかの前の、血漿脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、C反応性ペプチド(CRP)、及び好中球のベースラインから最後の3回の測定までの変化(平均(SEM))を示している。//は、複数の測定を示している。*p＜0.05；**p＜0.01。同様のパターンが、白血球総数、好中球総数、及びC反応性蛋白質において認められ、全てPHF群及びSUD群の両方において死亡前に漸増した(図2参照)。図3、4、5、及び6は、突然死亡した症例の個別のデータを示している。特に図3は、SUD患者5名のベースラインからSUDまでの、個人の好中球変化を示している。各記号は、各患者のSUD前の連続した毎月の値を示している。図4は、SUD患者5名のベースラインからSUDまでの、個人のC反応性蛋白質(CRP)の変化を表している。各記号は、各患者のSUD前の連続した毎月の値を示している。図5は、SUD患者5名のベースラインからSUDまでの、個人の全NN間隔の標準偏差(SDNN)の変化を表している。各記号は、各患者のSUD前の連続した月の値を示している。図6は、SUD患者5名のベースラインからSUDまでの、個人のトライアンギュラーインデックス(TI)の変化を表している。各記号は、各患者のSUD前の連続した毎月の値を示している。
【００６４】
ほとんどの症例において、SUD前に明らかな変化が認められ、これは表2の下側部分のデータにより判断されるように、生存群においては認められなかった。BNPは、他とは異なり、CHFにおける突然死の予測は認められなかった。しかしBNPは、進行性心不全における死亡が予測されることが認められた。
【００６５】
【表２】
2006292623.tif 000003
【００６６】
病院で死亡したPHF患者は、SUD群及び対照群の両方とは対照的に、24時間平均心室性期外収縮、NSVT事象、及び24時間平均最大心拍数の有意な増加も有した。加えて、通常臨床状態の増悪が検出されるいくつかのパラメータは、同じパターンに従った。これらは、24時間平均最大心拍数、BNP、及びアルドステロンであった。これらのパラメータは全て、PHFで死亡した患者においては漸増したが、SUD群においては変化せず、予想されたように挙動した。クラミジア肺炎病原体の力価又は免疫複合体に関して、有意な変化は認められなかった。
ここで対処する問題点は、「Circulation」の記事に記したように「本発明者らは現時点で、主要な治療的介入を正当化するのに十分な精度を伴う、突然の心停止のリスクのある患者の大半を同定する道具を持たない」ことである(Zipes、Circulation、104: 2506-8 (2001))。
【００６７】
特にSUDは、心拍数の変動性の漸進性の個人内減少及び炎症マーカー(好中球及びC反応性蛋白質)の個人内増加が先行するが、BNP、アルドステロン、心拍数、及び期外収縮のような従来の疾患進行性の測定値には何ら変化がない。実際、C反応性蛋白質、好中球、及び心拍数の変動性の変化の診断精度は、極めて良好であり、感度60〜100％及び特異性84〜92％であり、このことはこのような変化は、生存群においては認められることは極めて稀であることを意味する。他方で、SUDではなく、PHF死亡には、心拍数の変動性及び炎症のみで個人内増悪が先行するのではなく、同じく下記の疾患重症度の従来の測定値においても増悪する：BNP、アルドステロン、期外収縮、及びNSVT。クラミジア肺炎病原体の炎症における個人内増加に特異的に関連していることの証拠はない。
【００６８】
死亡した患者のPHF群及びSUD群への正確な分類は、明らかに重要である。全てのPHF死亡は、入院中に生じたが、全てのSUDは自宅において生じたということは、本発明者らの分類が正確であることの指摘の一部である。これは、SUD群ではなく、PHF死亡群における疾患重症度の従来の測定値の実質的増加によっても裏付けることができる。本発明者らの心拍数の変動性のデータは、最近の大きいUK-HEART(英国心不全評価及びリスクトライアルの判定)を裏付けており、ここでは低SDNNは、PHFに起因した死亡を予測した(Nolanらの論文、Circulation、98: 1510-6 (1998))。しかし本発明者らの研究とは対照的に、UK-HEARTにおいては、SUD群において心拍数の変動性には特に異常は認められなかったが；しかし、UK-HEARTは、心拍数の変動性測定とその後のSUDの間の時間的空白がそのような関係を検出するには余りにも長いような横断的試験であった。これは、心拍数の変動性とSUDの間の連関が、UK-HEARTにおけるよりも、頻繁な心拍数の変動性のモニタリングを伴う本縦断的試験において、より検出可能である理由を説明している。
【００６９】
重要な問題点は、「炎症」の個人内増加及び心拍数の変動性の個人内増悪が関連しているかどうかである。新たな情報は、その可能性があることを示唆している。炎症は、内皮の機能障害を生じ(Bhagatらの論文、Cardiovasc Res.、53: 481-2 (1996)；Bhagatらの論文、Circulation、96: 3042-7 (1997))、これは次に冠動脈事象を予測した(Al Suwaidiらの論文、Circulation、101: 948-54 (2000)；Schachingerらの論文、Circulation、101: 1899-906 (2000))。内皮の機能障害は、心拍数の変動性により示される自律神経機能を増悪することがわかっている血管の一酸化窒素の低下にも関連している(Chowdharyらの論文、Clin Sci.、97: 5-17 (1999)；Spiekerらの論文、J. Am. Coll Cardiol.、36: 213-8 (2000))。この仮説における最後の関連付けは、自律神経(迷走神経)機能障害は恐らく多くの不整脈惹起性の刺激のひとつである(Zuanettiらの論文、Circ Res.、61: 429-35 (1987))ことである。最新データは一般に、CHFにおけるSUDは、炎症が誘導した内皮機能障害に先行することが多い剖検時に同定可能な急性冠動脈事象に関連することが多いが、常ではないことと一致する(Uretskyらの論文、Circulation、102: 611-6 (2000))。
【００７０】
差し迫ったSUDは、心拍数の変動性、好中球、又はC反応性蛋白質の逐次測定により同定可能であるので、これらの結果は、CHF患者のリスクの階層化を暗示している。差し迫ったPHF死亡は通常、ベッドサイドで容易に認識されるのに対し、差し迫ったSUDは、ベッドサイドで予測することは困難である。このことは、炎症又は自律神経機能障害の個人内増加はSUD又はPHF死亡を予告するかどうかを確認することは、臨床上比較的容易であることを意味している。心拍数又は神経ホルモンの測定は、疑いが依然存在する場合に、この識別を補助する。これは、冠動脈再建、コートしたステントの挿入もしくは埋込み型除細動器などの侵襲的手法の、又は切迫したSUDの高リスク患者への移植さえもののより良い標的化につながる。これらの測定は、SUDを防止するための標的化された抗炎症治療に関する患者の選択も補助する。これは更に、シクロスポリン又はステロイドなどの極めて「毒性」のある抗炎症薬の短期投与にも関連し、これは患者が切迫したSUDのリスクがあると同定される場合は警告するが、SUDリスクが現実的でない場合は警告しない。実際IMPRESS(冠動脈ステント埋込み後の再狭窄の防止のための免疫抑制療法)試験は、短期間高用量のプレドニソロンは、異なる集団ではなく類似集団において、心臓血管系事象を劇的に低下することができることを示した(Versaciらの論文、J. Am. Coll Cardiol.、40: 1935-42 (2002))。心室性期外収縮データは、増悪する心室性期外収縮及び増大したNSVTは、PHF死亡前のみに生じるが、SUD前には生じない点が興味深い。このことは、心室性期外収縮は、将来の突然死の特異的な原因であるよりもむしろ、疾患進行の結果であることを示唆した先の総説の記事を裏付けている(Packerの論文、Circulation、85: 50-6 (1992))。NSVT事象の数及びSUD群の患者の数は両方とも小さく、このことは、NSVTの結果を信頼できないものにしている。
【００７１】
本試験は、CHFにおいてbブロッカー及び埋込み可能な電気的除細動器の使用前に行われたことに言及することは価値があるが、両方とも全体を予防するよりもむしろ死期を遅らせる。これらの同じ個人内変化は、遅延された死亡の前に、依然生じる。まとめると、このデータは、SUDは、好中球、C反応性蛋白質、又は心拍数の変動性の広範な個人間の値の絶対値を用いるよりもむしろ、個人内変化から予測可能であることの可能性を示している。これは、比較的小規模の予備試験であったが、関連した作業は、大規模であった-540個の24時間ECGテープ及びほとんどの検体の540回のアッセイ。しかし、本発明者らの結果の信憑性は、炎症のふたつの独立した測定値(C反応性蛋白質及び好中球)における変化は同じであるという知見により増大している。しかしながら、この興味のある知見を確認するためには、より大規模な試験が必要であろう。毎月の好中球総数は、差し迫ったSUDのリスクが高いCHF患者への新規治療を標的化する安価で有効な方法であることが最終的には証明される(Millerらの論文、J. Heart Lung Transplant、14: 1143-53 (1995))。更に全てのSUDの半数は、少なくともCHFの既応のある患者において発生すると言われているので(Hinkle らの論文、Circulation、65: 457-64 (1982))、これらのデータは、患者のより広範な群に関連しているかもしれない。
【００７２】
本発明は、本発明の数種の態様の例証として意図されている実施例において明らかにされた特定の実施態様により範囲が限定されるものではなく、及び機能的に同等であるあらゆる態様は本発明の範囲内である。実際、本願明細書に示され及び説明されたものに加え、本発明の様々な修飾が、当業者に明らかとなり、これらは添付された「特許請求の範囲」内に収まることが意図されている。
本願明細書に引用された各及び全ての参考文献は、各参考文献が個別に本願明細書に参照として組入れられているのと同じ程度に全ての目的のためにその全体が組込まれている。更に、本発明はそれらの好ましい態様を参照し詳細に説明されているが、当業者には、本発明の範囲から逸脱しない限りは、様々な変更を行い、同等物を使用することができることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図1は、死亡(SUD群及び進行性心不全(PHF)群)又は試験最終日のいずれかの前の、トライアンギュラーインデックス(TI)、全NN間隔の標準偏差(SDNN)、及び心室性期外収縮カウントの変化を表す一連のグラフである。
【図２】図2は、死亡(SUD群及びPHF群)又は試験最終日(生存群)のいずれかの前の、血漿中の脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、C反応性ペプチド(CRP)、及び好中球の変化を示す一連のグラフである。
【図３】図3は、SUD患者における好中球変化を示すグラフである。
【図４】図4は、SUD患者におけるC反応性蛋白質(CRP)変化を示すグラフである。
【図５】図5は、SUD患者における個々の全NN間隔の標準偏差(SDNN)の変化を示すグラフである。
【図６】図6は、SUD患者におけるトライアンギュラーインデックス(TI)の変化を示すグラフである。
【図７】図7は、診断装置及び関連した試験用カートリッジを図示している略図である。
【図１】
2006292623.tif 000004
【図２】
2006292623.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【外国語明細書】
1.  Title of Invention
MARKERS FOR SUDDEN DEATH IN HEART FAILURE
2.  Detailed Description of Invention
(TECHNICAL FIELD)
This invention relates to methods and kits for diagnosing, screening or monitoring a patient for sudden death in heart failure.
(BACKGROUND)
Heart failure is a chronic, progressive disease that affects 1.5-2% of the general population of the Western world.  The prevalence and incidence of heart failure is growing due to an aging population.  Heart failure occurs when the heart is not strong enough to pump blood efficiently around the body.  Cardiovascular disease places an ever increasing burden on healthcare.  In the United States alone, there are over 5 million sufferers from Congestive Heart Failure (CHF). A patient with heart failure can be a patient at high-risk of experiencing sudden death in heart failure.  Sudden unexpected death in heart failure results in about 340,000 deaths each year among U.S. adults.  Sudden unexpected death in heart failure, is the sudden, abrupt loss of heart function in a person who may or may not have been previously diagnosed for heart disease.  The time and mode of death are unexpected.  It occurs instantly or shortly after symptoms appear.  The most common reason for patients to die suddenly is cardiovascular disease, in particular, coronary heart disease.  Sudden unexpected death (SUD) in heart failure may also be caused by degeneration of the heart muscle, or to cardiac enlargement in patients with high blood pressure.  SUD may also be caused by various heart medications that can cause arrhythmias. In particular, so-called "antiarrhythmic" drugs, even at normally prescribed doses, sometimes may produce lethal ventricular arrhythmias ("proarrhythmic" effect).  Further significant changes in blood levels of potassium and magnesium (from using diuretics, for example) also can cause life-threatening arrhythmias and SUD.  Other causes of SUD include electrical abnormalities due to diseases such as Wolff-Parkinson-White syndrome, blood vessel abnormalities and recreational drug use.
(SUMMARY)
In general, levels of a marker in a sample from a mammalian subject, such as C-reactive protein (CRP) or neutrophil count, or white blood cell count, can be used to monitor the status of cardiac health in the mammalian subject.  CRP can be used in combination with a second marker such as MPO.  CRP may be used in combination with a third marker such as BNP.  The status of cardiac health may be measured by screening, diagnosis or prognosis of sudden death in heart failure in a mammalian subject, or determining sudden death in heart failure, or identifying a mammalian subject at risk of sudden death in heart failure, or monitoring the effect of therapy administered to a mammalian subject experiencing imminent sudden death in heart failure.  Sudden death in heart failure includes sudden unexpected death.  The methods as described herein may be used in a hospital or other health-care settings or in home or other community situations. The patient can be a patient with heart failure.
In one aspect, a method for screening or diagnosing sudden death in heart failure in a mammalian subject, for determining sudden death in heart failure, for identifying a mammalian subject at risk for sudden death in heart failure or for monitoring the effect of therapy administered to a mammalian subject experiencing imminent sudden death in heart failure includes measuring a level of a first marker in a sample from the mammalian subject, wherein the first marker is C-reactive protein or neutrophil count and associating the level of the first marker with a status of cardiac health.  The sample can be blood or plasma.  The method can include evaluating a risk of sudden death in heart failure.  The method can include assessing the level of inflammation in heart failure.  Further, evaluating the risk can include comparing the level of the first marker with a threshold level of the first marker.  The method of associating the level of the first marker with a status of cardiac health can include monitoring an effect of therapy administered to the subject.  The method may include associating the level of the first marker with the status of cardiac health which includes comparing the level of the first marker with a level of the first marker which is indicative of the absence of the risk of sudden death in heart failure.  The method may also include contacting the sample with an antibody that binds to the first marker.  The antibody can be a monoclonal antibody.  The method may further include measuring the level of a second marker and associating a level of the second marker with the status of cardiac health; the second marker being different from the first marker.
The method can include associating the level of the second marker with the status of cardiac health which includes evaluating a risk of sudden death in heart failure.  The method can include comparing the level of the second marker with a threshold level of the second marker to evaluate the risk of sudden death in heart failure.  The method can include comparing the level of the second marker with a level of the second marker which is indicative of the absence of the risk of sudden death in heart failure.  The first marker can be C-reactive protein and the second marker can be a neutrophil count or white blood cell count.  The  neutrophil count can be obtained by standard flow cytometry.  The second marker can be myeloperoxidase.
The method can include contacting the sample with an antibody that binds to the second marker.  The antibody can be a monoclonal antibody.  The method can further include measuring heart rate variability.  Heart rate variability can be calculated by standard deviation of normal to normal intervals and triangular index.  The standard deviation of normal to normal intervals can be compared with standard deviation of normal to normal intervals which are indicative of the absence of sudden death in heart failure.  The triangular index can be compared with triangular index values which are indicative of the absence of sudden death in heart failure.
The method can further include measuring the level of a third marker and associating the level of the third marker with the status of cardiac health, the third marker being different from the first marker and the second marker.  The method can include associating the level of the third marker with the status of cardiac health which includes evaluating a risk of sudden death in heart failure.  The method can also include associating the level of the third marker with the status of cardiac health which includes comparing the level of the third marker with a level of the third marker which is indicative of the risk of death from progressive heart failure.  The method can include comparing the level of the third marker with a threshold level of the third marker to evaluate the risk of sudden death in heart failure.  The method can include associating the level of the third marker with the status of cardiac health includes comparing the level of the third marker with a level of the third marker which is indicative of the absence of the risk of sudden death in heart failure.  The third marker can be a natriuretic peptide.  The natriuretic peptide can be brain natriuretic peptide or N-terminal pro-brain natriuretic peptide.
The method can include associating the level of the third marker with the status of cardiac health which includes contacting the sample with an antibody that binds to the third marker.  The antibody can be a monoclonal antibody.  A kit for carrying out such methods is also provided.
In a further aspect, a method for screening or diagnosing sudden death in heart failure in a mammalian subject, for determining sudden death in heart failure, for identifying a mammalian subject at risk of sudden death in heart failure, or for monitoring the effect of therapy administered to a mammalian subject experiencing imminent sudden death in heart failure can include measuring a level of a first marker in a sample from the mammalian subject, wherein the first marker is a neutrophil count; and associating the level of the first marker with a status of cardiac health.
In a further aspect, a kit for screening, diagnosis or prognosis of sudden death in heart failure in a mammalian subject, for determining sudden death in heart failure, for identifying a mammalian subject at risk of sudden death in heart failure, or for monitoring the effect of therapy administered to a mammalian subject at experiencing imminent sudden death in heart failure can include instructions for taking a sample from said mammalian subject and associating the level of C-reactive protein with the status of cardiac health and one or more reagents for measuring the level of C-reactive protein in the sample.  The sample can be blood or plasma.  The kit can include instructions for associating the level of C-reactive protein with the status of cardiac health which includes evaluating the risk of sudden death in heart failure.  The kit can include an antibody that binds specifically to the first marker.  The antibody can be a monoclonal antibody.
The kit can include one or more reagents for measuring the level of a second marker indicative of status of cardiac health.  The second marker can be myeloperoxidase.  The kit can include an antibody that binds specifically to the second marker.  The antibody can be a monoclonal antibody.  The second marker can be neutrophil count or white blood cell count.  The kit can include a device that includes a detector configured to measure and to monitor heart rate.  The device can be configured to provide an output to a patient.
The kit can include one or more reagents for measuring the level of a third marker indicative of the absence of sudden death in heart failure.  The levels of the third marker can be indicative of a risk of death from progressive heart failure.  The third marker can be a natriuretic peptide.  The natriuretic peptide can be brain natriuretic peptide or N-terminal pro-brain natriuretic peptide.  The kit can include an antibody that binds specifically to the third marker.  The antibody can be a monoclonal antibody.
In a further aspect, a method of monitoring the health of a mammalian subject can include measuring the level of a first marker in a sample from said mammalian subject, wherein said first marker is C-reactive protein or neutrophil count, and associating the level of the first marker with the status of cardiac health.  The method can include associating the level of the first marker with the status of cardiac health which includes evaluating the risk of sudden death in heart failure.  The sample can be blood or plasma.  The method can include evaluating the risk which includes comparing the level of the first marker with a threshold level of the first marker.  The method can include associating the level of the first marker with the status of cardiac health.  This includes comparing the level of the first marker with a level of the first marker which is indicative of the absence of sudden death in heart failure.  The method can include monitoring an effect of therapy administered to subject.  The method can include contacting the sample with an antibody that binds to the first marker.  The antibody can be a monoclonal antibody.  The method can further include measuring the level of a second marker and associating a level of the second marker with the status of cardiac health; the second marker being different from the first marker.  The first marker can include C-reactive protein and the second marker can include neutrophil count or white blood cell count.  The second marker can include myeloperoxidase.  Monitoring the health of a patient can include monitoring the risk of death or worsening condition in the patient.
The method can include evaluating a risk of sudden death in heart failure.  Evaluating the risk of sudden death in heart failure can include comparing the level of the second marker with a threshold level of the second marker.  The method can include contacting the sample with an antibody that binds to the second marker.  The antibody can include a monoclonal antibody.  The method can further include measuring heart rate variability.  Heart rate variability can be calculated by standard deviation of normal to normal intervals and triangular index.  The standard deviation of normal to normal intervals can be compared with standard deviation of normal to normal intervals values which are indicative of the absence of sudden death in heart failure.  The triangular index can be compared with triangular index values which are indicative of the absence of sudden death in heart failure.
In a further aspect, a system for monitoring cardiac health may include a cartridge including a sample port and a first assay, wherein the first assay recognizes a first marker; and a cartridge reader including a detector configured to measure a level of the first marker recognized by the assay.  The device can be configured to provide an output to a patient. The first assay can include an antibody that recognizes the first marker.  The antibody can recognize C-reactive protein.  The system can include a second test cartridge that includes a sample port and a second assay, wherein the second assay recognizes a second marker; the second marker being different from the first marker.  The second assay can include an antibody that recognizes the second marker.     Surprisingly, CRP and neutrophil count both have incremental value in detection of SUD which coupled with measurements of heart rate variability can improve the specificity and positive prediction sufficiently to make screening for SUD in heart failure a possibility.
Many of the tests and procedures for accurately and successfully monitoring, diagnosing, managing and treating heart failure are complex, expensive and available only at a hospital or other health-care settings.  Methods for patients to manage or to monitor the likelihood of heart failure at home or otherwise outside a health-care setting can be even less successful.  Advantageously, sudden death can be identified or tracked by monitoring the level of CRP and/or neutrophil count in a sample from a patient.     The details of one or more embodiments are set forth in the drawings and description below.  Other features, objects, and advantages will be apparent from the description, the drawings, and from the claims.
(DETAILED DESCRIPTION)
Despite advances in the management of chronic heart failure (CHF), patients with CHF still have a high mortality rate (Ho et al., J Am Coll Cardiol. 1993:22 (Suppl):6-13; Massie et al., Curr Opin Cardiol. 1996;11 :221-6; Mcdonagh et al., Lancet 1997;350 :829-33; Cowie et al., Eur Heart J. 1997;18 :208-25).  These deaths appear to occur by different modes: sudden unexpected death (SUD) and death caused by progressive heart failure (PHF) (Goldman et al., Circulation 1993;87 (Suppl):3124-33; Hinkle et al., Circulation 1982;65 :457-64).  PHF deaths can be predicted by simple clinical measures such as worsening New York Heart Association (NYHA) class, lower left ventricular ejection fraction, or low exercise capacity (Szlachcic et al., Am J Cardiol. 1985;55 :1037-42; Mancini et al., Circulation 1991;83 :778-86; Roul et al., Eur Heart J. 1995;16 :1387-98; Cohn et al., N Engl J Med. 1984;311 :819-23; Cohn et al., Circulation 1993;87 (Suppl):5-16).
In contrast, SUD in CHF is not as easy to predict.  SUD is the sudden, abrupt loss of heart function in a person who may or may not have diagnosed heart disease (Nolan et al., Circulation 1998;98 :1510-6; La Rovere et al., Circulation 2003;107 :565-70; Galiner et al., Eur Heart J. 2000;21 :475-481).  SUD may occur instantly or shortly after symptoms appear.  SUD is a major health problem, causing about 340,000 deaths each year among U.S. adults either before reaching a hospital or emergency room.
SUD can be triggered either by an acute coronary syndrome or by a primary arrhythmia.  This means that some measure of an impending coronary event or of "arrhythmogenicity" may increase just before the SUD (La Rovere et al., Circulation 2003;107 :565-70; Galiner et al., Eur Heart J. 2000;21 :475-481).  
Sudden death, also known as sudden unexpected death in congestive heart failure may often be primarily caused by an acute coronary syndrome, which is in turn due to the rupture of an "inflamed" atherosclerotic plaque (Davies et al., N Engl J Med. 1984;310 :1137-40).  If this were true, one may expect that intraindividual signs of inflammation such as neutrophilia or C-reactive protein would increase just before the SUD.  This hypothesis is made likely because of the landmark work of Ridker and colleagues (Ridker et al., N Engl J Med. 2000;342 :836-43) who showed clearly that C reactive protein is increased when measured years before the SUD.  As such, there may be a possibility that a SUD event is triggered by a further, short term intraindividual increase in C-reactive protein and inflammation just before the SUD event due to the fact that sites of acute rupture in plaques have much more inflammation in them than stable plaques (van der Wal et al., Circulation 1994;89 :36-44) and by recent pathological data that plaque instability and thrombus formation exist for days to weeks before SUD (de Gouveia et al., Eur Heart J. 2002;23 :1433-40.  On the other hand, if "arrhythmogenicity" contributes to SUD, then ambulatory electrocardiography may be useful, but it has so far proved variable in its ability to predict SUD (Nolan et al., Circulation 1998;98 :1510-6; La Rovere et al., Circulation 2003;107 :565-70; Galiner et al., Eur Heart J. 2000;21 :475-481).  This variability may be because all current studies are cross sectional, where one sample is taken from a large number of patients and there is then a long time gap before the SUD occurs.  The alternative study design would be a longitudinal study where many repeated ECGs are taken from the same patients to look for intraindividual changes before the SUD (Nakagawa et al., Br Heart J. 1994;71 :87-8).  Apart from the time gap problem, another problem with cross sectional studies is that most parameters have greater interindividual variability than they do intraindividual variability, and high interindividual variability severely limits the ability of cross sectional studies to identify individual risk.  Two measures on the ambulatory electrocardiogram (ECG) that may progressively worsen as SUD approaches are heart rate variability and spontaneous ventricular extrasystole activity (Nakagawa et al., Br Heart J. 1994;71 :87-8; Bigger T. Circulation 1987;75 (Suppl):28-35).  One previous report of two cases did suggest that heart rate variability worsened in patients before their SUD (Nakagawa et al., Br Heart J. 1994;71 :87-8).
A study was thus performed to see whether SUD in CHF was preceded by intraindividual increases in inflammation (C reactive protein/neutrophils) or in certain electrocardiogram (ECG) measures of arrhythmogenicity.  These are the most likely "trigger" events before SUD. 
A first marker indicative of sudden death in hearth failure in a mammalian subject is C-reactive protein (CRP  SwissProt P02741).  A second marker indicative of sudden death in heart failure in a mammalian subject can be measured.  The second marker may be measured by neutrophil count or white blood cell count.  Neutrophil count or white blood cell count can be measured directly, for example, by cell counting or indirectly, for example, by measuring a level of a protein such as myeloperoxidase, or elastase.  Neutrophil count may also be obtained indirectly using anti-neutrophil antibodies which can include anti-myeloperoxidase antibody. anti neutrophil elastase antibody or anti-CD11b antibody.
The second marker can be myeloperoxidase (EC 1.11.1.7) which is a major neutrophil protein.  The amino acid sequence for human MPO may be found in NCBI database Accession NM_000250, Accession AH_002972).  Other additional markers that can be measured may include markers of inflammation such as a oxidized low-density lipoprotein, a soluble adhesion molecule (e.g., E-selectin, P-selectin, intracellular adhesion molecule-1, or vascular cell adhesion molecule-1), Nourin-1, a cytokine (e.g., interleukin-1β, -6, -8, and -10 or tumor necrosis factor-alpha), or acute phase reactants (e.g., fibrinogen, or serum amyloid A (SAA)).
A third marker indicative of the absence of sudden death in heart failure in a mammalian subject may also be measured.  Such markers may include natriuretic peptide, such as native atrial natriuretic peptide (ANP  see Brenner et al, Physiol. Rev., 1990, 70: 665), brain natriuretic peptide (BNP) and C-type natriuretic (CNP- see Stingo et al, Am. J. Physiol. 1992, 263: H1318), and variants or allelic variants thereof.  A suitable natriuretic peptide is brain natriuretic peptide (BNP) or N-terminal pro-brain natriuretic peptide (N-BNP).  Another suitable natriuretic peptide is atrial natriuretic peptide (ANP) (Hall, Eur J Heart Fail, 2001, 3:395-397).   
These markers may also be used to assess the level of inflammation in heart failure in a patient.  The levels of inflammation can be associated with a high risk of cardiovascular events such as sudden unexpected death (SUD), progressive heart failure (PHF), acute coronary syndrome (ACS) or stroke.  
The levels of such markers may be evaluated by comparing the level of a marker with a threshold level of the marker.  Such threshold levels may be set according to data pooled from large population groups such as children, young adults, the elderly, or racial/ethnic groups, or combinations thereof.  The threshold levels that are measured and set for a certain population group may not be transferable or applicable from one population group to the other.  Alternatively, the threshold level may also be based on threshold levels obtained from data obtained from individualized tracking.  Frequent testing of a patient may provide better comparisons to the threshold levels previously established within that particular patient and would allow the physician to better assess the patient's cardiac health.  The reduced intraindividual variance of marker levels would allow a more specific and individualized threshold to be defined for the patient.  
The method of evaluating the levels of the markers may include observing a change in intraindividual variability, observing a change in absolute or relative level from a baseline level established within an individual or observing a positive or negative trend over time.
A level of a marker in a sample can be measured by quantifying the amount of the marker in the sample as a whole molecule, as fragments of the marker, or by measuring the marker's activity in the sample or a derivative of the sample.  Fragments of the above-described markers can be measured using a fragment that will have an amino acid sequence which is unique to the marker in question.  The fragment may be as few as 6 amino acids, although it may be 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or more amino acids.
In general, an amino acid residue of the marker can be replaced by another amino acid residue in a conservative substitution.  Examples of conservative substitutions include, for example, the substitution of one non-polar (i.e., hydrophobic) residue such as isoleucine, valine, leucine or methionine for another non-polar residue; the substitution of one polar (i.e. hydrophilic) residue for another polar residue, such as a substitution between arginine and lysine, between glutamine and asparagine, or between glycine and serine; the substitution of one basic residue such as lysine, arginine or histidine for another basic residue; or the substitution of one acidic residue, such as aspartic acid or glutamic acid for another acidic residue.  In an conservative substitution, an amino acid residue can be replaced with an amino acid residue having a chemically similar side chain. Families of amino acid residues having side chains with chemical similarity have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
A conservative substitution may also include the use of a chemically derivatized residue in place of a non-derivatized residue.  A chemical derivative a residue chemically derivatized by reaction of a functional group of the residue.  Examples of such chemical derivatives include, but are not limited to, those molecules in which free amino groups have been derivatized to form, for example, amine hydrochlorides, p-toluene sulfonyl groups, carbobenzoxy groups, t-butyloxycarbonyl groups, chloroacetyl groups or formyl groups.  Free carboxyl groups may be derivatized to form salts, methyl and ethyl esters, or other types of esters or hydrazides.  Free hydroxyl groups may be derivatized to form O-acyl or O-alkyl derivatives.  Also included as chemical derivatives are those polypeptides which contain one or more naturally-occurring amino acid derivatives of the twenty standard amino acids.  For example, 4-hydroxyproline may be substituted for proline; 5-hydroxylsine may be substituted for histidine; homoserine may be substituted for serine; and ornithine may be substituted for lysine.  
An amino acid residue of the polypeptide can be replaced by another amino acid residue in a non-conservative substitution.  In some cases, a non-conservative substitution will not alter the relevant properties of the polypeptide.  The relevant properties can be, without limitation, ability to bind to an antibody that recognizes CRP, MPO, N-BNP, or BNP including variants and allelic variants thereof or other biological activity.  
The level of markers in a sample can be measured qualitatively or quantitatively using an assay, for example, in an immunochromatographic format.  A qualitative assay can be distinguish between the presence or absence of a marker, or can distinguish between categories of marker levels in a sample, such as absent, low concentration, medium concentration or high concentration, or combinations thereof.  A quantitative assay can provide a numerical measure of a marker in a sample.  The assay can include contacting a marker with an antibody that recognizes that particular marker, detecting the marker by mass spectrometry, assaying a sample including cells for expression (e.g., of mRNA or polypeptide) of the marker gene by the cells, or a combination of measurements.  For example, the assay can include contacting a sample with an antibody that recognizes the marker and a mass spectrometry measurement.
The markers can be detected in blood, plasma or other bodily fluids which can be obtained from a mammalian body, such as interstitial fluid, urine, whole blood, saliva, serum, lymph, gastric juices, bile, sweat, tear fluid and brain and spinal fluids.  Bodily fluids may be processed (e.g. serum) or unprocessed.  The mammalian subject may be a human.
The measured level of the first marker, for example CRP, may be compared with a level of CRP which is indicative of the absence of heart failure.  This level may be the baseline level of CRP from one or more mammalian subjects free from SUD in heart failure, or with a previously determined reference range for CRP in such mammalian subjects.  In this way, the levels can be compared with reference levels determined from population studies of subjects free from SUD in heart failure to provide a diagnosis or prognosis.  Such subjects may be matched for age and/or gender.  In one embodiment, the level of CRP which is indicative of risk of sudden death in heart failure may be about 3 μg/ml or more, for example, greater than 5 μg/ml, greater than 10 μg/ml, greater than 15 μg/ml, greater than 20 μg/ml, greater than 25 μg/ml or greater than 30 μg/ml from baseline values.  In another embodiment, the neutrophil count which is indicative of risk of sudden death in heart failure may be about 0.5 X 109/l, 1 X 109/l, 2 X 109/l, 3 X 109/l, 4 X 109/l, 5 X 109/l or more from baseline values.  
In another embodiment, the level of BNP which is indicative of risk of death from progressive heart failure may be about 55 pg/ml, 65 pg/ml, 75 pg/ml, 85 pg/ml, 95 pg/ml, or 105 pg/ml from baseline values.  In another embodiment, the neutrophil count which is indicative of risk of death from progressive heart failure may be about 1.5 X 109/l, 2 X 109/l, 2.5 X 109/l, 3 X 109/l or more from baseline values.  In a further embodiment, the level of CRP which is indicative of risk of death in progressive heart failure may be about 5 μg/ml or more, or 10 μg/ml or more.
The precise value can vary according to assay format.  To monitor the effect of therapy administered to a mammalian subject having imminent SUD, the measured level of CRP can be compared with a base level for the subject.  The base level may be determined prior to commencement of the therapy.  Deviations from this base level indicate whether there was an improvement or deterioration of status of cardiac health and hence whether the therapy is effective.  An increased level of CRP indicates progressively imminent SUD in heart failure and vice versa.  It will be appreciated by one of skill in the art that the respective levels of CRP which are for screening, diagnosis or prognosis of SUD in heart failure in a mammalian subject, for determining SUD in heart failure in a mammalian subject, for identifying a mammalian subject at risk of developing SUD in heart failure, or for monitoring the effect of therapy administered to a mammalian subject having imminent SUD in heart failure may be different from one another.  These levels may be easily determined in a manner similar to that described herein.
The measured level of the second marker may be compared with a level of the second marker which is indicative of the absence of SUD in heart failure.  This level may be the level of the second marker from one or more mammalian subjects free from SUD in heart failure, or with a previously determined reference range for the second marker in mammalian subjects free from SUD in heart failure.  Again, the precise values can vary according to assay format.  
As is explained in more detail herein, using a combination of CRP, N-BNP, neutrophil count, white blood cell count, heart rate variability can provide improved specificity and positive predictive value relative to using any of these markers alone.  The result of this is that fewer echocardiographs need to be carried out to confirm heart failure, resulting in a significant cost saving.  Marker levels may be provided in units of concentration, mass, moles, volume or any other measure indicating the amount of marker present.
Neutrophil count or white blood cell count may be obtained by standard flow cytometry or by microfluidic devices as described in WO2003078972, or by any other method known to a person of skill in art.  The measured neutrophil count may be compared with a neutrophil count which is indicative of the absence of SUD in heart failure.  This neutrophil count may be compared with the neutrophil count from one or more mammalian subjects free from SUD in heart failure, or with a previously determined reference range for the second marker in mammalian subjects free from SUD in heart failure.  
Heart rate variability may be measured by electrocardiogram (ECG) and standard deviation of all NN intervals (SDNN) and triangular index (TI) may be analyzed according to standard guidelines as described in Anon, Circulation 1996; 93:1043-65.
The respective levels of the first, second or third markers may be measured using an immunoassay, i.e., by contacting the sample with an antibody that binds specifically to the marker and measuring any binding that has occurred between the antibody and at  least one species in the sample.  Such assays may be competitive or non-competitive immunoassays.  Such assays, both homogeneous and heterogeneous, are well-known in the art, wherein the analyte to be detected is caused to bind with a specific binding partner such as an antibody which has been labelled with a detectable species such as a latex or gold particle, a fluorescent moiety, an enzyme, an electrochemically active species, etc.  Alternatively, the analyte may be labelled with any of the above detectable species and competed with limiting amounts of specific antibody.  The presence or amount of analyte present is then determined by detection of the presence or concentration of the label.  Such assays may be carried out in the conventional way using a laboratory analyser or with point of care or home testing device, such as the lateral flow immunoassay as described in EP291194.
In one embodiment, an immunoassay is performed by contacting a sample from a subject to be tested with an appropriate antibody under conditions such that immunospecific binding can occur if the marker is present, and detecting or measuring the amount of any immunospecific binding by the antibody.  The antibody may be contacted with the sample for at least about 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, 3 hours, 5 hours, 7 hours, 10 hours, 15 hours, or 1 day.  Any suitable immunoassay can be used, including, without limitation, competitive and noncompetitive assay systems using techniques such as western blots, radioimmunoassays, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), "sandwich" immunoassays, immunoprecipitation assays, precipitin reactions, gel diffusion precipitin reactions, immunodiffusion assays, agglutination assays, complementfixation assays, immunoradiometric assays, fluorescent immunoassays and protein A immunoassays.
For example, a marker can be detected in a fluid sample by means of a twostep sandwich assay.  In the first step, a capture reagent (e.g., an antimarker antibody) is used to capture the marker.  The capture reagent can optionally be immobilised on a solid phase.  In the second step, a directly or indirectly labelled detection reagent is used to detect the captured marker.  In one embodiment, the detection reagent is an antibody.  In another embodiment, the detection reagent is a lectin.
In one embodiment, a lateral flow immunoassay device may be used in the "sandwich" format wherein the presence of sufficient marker in a sample will cause the formation of a "sandwich" interaction at the capture zone in the lateral flow assay.  The capture zone as used herein may contain capture reagents such as antibody molecules, antigens, nucleic acids, lectins, and enzymes suitable for capturing MPO and other markers described herein.  The device may also incorporate one or more luminescent labels suitable for capture in the capture zone, the extent of capture being determined by the presence of analyte.  Suitable labels include fluorescent labels immobilised in polystyrene microspheres.  Microspheres may be coated with immunoglobulins to allow capture in the capture zone. 
Other assays that may be used include, but are not limited to, flow-through devices.
In a flow-through assay, one reagent (usually an antibody) is immobilised to a defined area on a membrane surface.  This membrane is then overlaid on an absorbent layer that acts as a reservoir to pump sample volume through the device.  Following immobilisation, the remainder of the protein-binding sites on the membrane are blocked to minimise non-specific interactions.  When the assay is used, a bodily fluid sample containing a marker specific to the antibody is added to the membrane and filters through the matrix, allowing the marker to bind to the immobilised antibody.  In an optional second step (in embodiments wherein the first reactant is an antibody), a tagged secondary antibody (an enzyme conjugate, an antibody coupled to a coloured latex particle, or an antibody incorporated into a coloured colloid) may be added or released that reacts with captured marker to complete the sandwich.  Alternatively, the secondary antibody can be mixed with the sample and added in a single step.  If a marker is present, a coloured spot develops on the surface of the membrane.
The term "antibody" as used herein refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, i.e., molecules that contain an antigen binding site that specifically binds an antigen.  The immunoglobulin molecules can be of any class (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD and IgA ) or subclass of immunoglobulin molecule.  Antibodies includes, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, bispecific, humanised and chimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments and F(ab')2 fragments, fragments produced by a Fab expression library, antiidiotypic (antiId) antibodies, and epitopebinding fragments of any of the above.  An antibody, or generally any molecule, "binds specifically" to an antigen (or other molecule) if the antibody binds preferentially to the antigen, and, e.g., has less than about 30%, preferably 20%, 10%, or 1% cross-reactivity with another molecule.  Portions of antibodies include Fv and Fv' portions.
Antibodies for detecting CRP, MPO, BNP, neutrophils and the other markers discussed herein are available commercially.  For example, anti-CRP antibodies are available from Alpha Diagnostic International, Inc., 5415 Lost Lane, San Antonio, TX 78238 USA and Research Diagnostics Inc Pleasant Hill Road, Flanders NJ 07836, USA, anti-MPO and anti-BNP antibodies are available from Abcam Ltd, 21 Cambridge Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 0TP, UK.  Antibodies binding to BNP and ANP can be obtained commercially. Examples of commercially available antibodies binding to BNP are rabbit anti-human BNP polyclonal antibody (Biodesign International), rabbit anti-BNP amino acids 1-20 polyclonal antibody (Biodesign International), anti-human BNP monoclonal antibody (Immundiagnostik), and rabbit anti-human BNP amino acids 1-10 polyclonal antibody (Immundiagnostik). Examples of commercially available antibodies binding to ANP are mouse anti-human ANP monoclonal antibody (Biodesign International), rabbit anti-human ANP monoclonal antibody (Biodesign International), mouse anti-human ANP monoclonal antibody (Chemicon), rabbit anti-human ANP amino acids 95-103 antibody (Immundiagnostik), rabbit anti-human ANP amino acids 99-126 antibody (Immundiagnostik), sheep anti-human ANP amino acids 99-126 antibody (Immundiagnostik), mouse anti-human ANP amino acids 99-126 monoclonal antibody (Immundiagnostik) and rabbit anti-human a-ANP polyclonal antibody (United States Biological).  Antibodies for detecting neutrophils may include anti neutrophil elastase antibody (Chemicon), anti-CD11b (C3bi receptor) antibody, anti-neutrophil antibodies.
A kit can be used to carry out the methods described herein.
Also provided is a kit for screening, diagnosis or prognosis of sudden death in heart failure in a mammalian subject, for determining sudden death in heart failure, for identifying a mammalian subject at risk of sudden death in heart failure, or for monitoring the effect of therapy administered to a mammalian subject experiencing imminent sudden death in heart failure.  The kit can include instructions for taking a sample of bodily fluid from the mammalian subject, and one or more reagents for measuring the level of markers in the sample and associating the level of the markers with the status of cardiac health.
The one or more reagents may comprise an antibody that binds specifically to the first marker, as is described above.  The kit may further comprise one or more reagents for measuring the level of a second marker indicative of the status of cardiac health in a mammalian subject, as is also described above.  The kit may further comprise one or more reagents for measuring the level of a third marker.  
The instructions for taking a sample of bodily fluid from the mammalian subject may be optional.  In addition, a kit may optionally comprise one or more of the following: (1) instructions for using the kit for screening, diagnosis or prognosis of sudden death in heart failure in a mammalian subject, for determining sudden death in heart failure, for identifying a mammalian subject at risk of sudden death in heart failure, or for monitoring the effect of therapy administered to a mammalian subject experiencing imminent sudden death in heart failure; (2) a labelled binding partner to any antibody present in the kit; (3) a solid phase (such as a reagent strip) upon which any such antibody is immobilised; and (4) a label or insert indicating regulatory approval for diagnostic, prognostic or therapeutic use or any combination thereof.  If no labelled binding partner to the or each antibody is provided, the or each antibody itself can be labelled with a detectable marker, e.g., a chemiluminescent, enzymatic, fluorescent, or radioactive moiety.  
A device can be included in the diagnostic kit, which can optionally include one or more of the following: instructions for using the kit for event detection, diagnosis, prognosis, screening, therapeutic monitoring or any combination of these applications for the management of patients; a disposable testing cartridge containing the necessary reagents to conduct a test; or an instrument or device that measures the result of marker testing and optionally, allows manual or automatic input of other parameters, storage of the parameters, and evaluation of the parameters alongside or separate from the evaluation of the measured marker or markers.
The testing cartridge or cartridges supplied in the kit allow the user to measure as a minimum, a first marker which can be CRP, a second marker which can be myeloperoxidase or a third marker which can be a natriuretic peptide.  Preferably, the testing cartridge or testing cartridges allow the sequential or serial measurement of CRP, myeloperoxidase and/or a natriuretic peptide such as BNP.  A combination cartridge can test two or more different markers from a single sample.
The instrument (durable or disposable), at a minimum, measures the result of marker testing and optionally, allows manual or automatic input of other parameters, storage of said parameters, and evaluation of said parameters with or separate to the measured markers.  
Referring to FIG. X, diagnostic device 100 includes display 120 and input region 140.  The display 120 may be used to display images in various formats, for example, joint photographic experts group (JPEG) format, tagged image file format (TIFF), graphics interchange format (GIF), or bitmap.  Display 120 can also be used to display text messages, help messages, instructions, queries, test results, and various information to patients.  In some implementations, display 120 supports the hypertext markup language (HTML) format such that displayed text may include hyperlinks to additional information, images, or formatted text.  Display 120 can further provide a mechanism for displaying videos stored, for example in the moving picture experts group (MPEG) format, Apple's QuickTime format, or DVD format.   Display 120 can additionally include an audio source (e.g., a speaker) to produce audible instructions, sounds, music, and the like.  
Input region 140 can include keys 160.  In one embodiment, input region 140 can be implemented as symbols displayed on the display 120, for example when display 120 is a touch-sensitive screen.  Patient instructions and queries are presented to the patient on display 120.  The patient can respond to the queries via the input region. 
Device 100 also includes cartridge reader 180, which accepts diagnostic test cartridges for reading.  The cartridge reader 180 measures the level of a marker based on, for example, the magnitude of a color change that occurs on a test cartridge 400.  Device 100 also includes probe connections 200, which connect probes (e.g., a probe of weight, temperature, heart rate, variability of heart rate, breathing rate, blood pressure, or blood oxygen saturation) to the device.  
Device 100 further includes a communication port 220.  Communication port 220 can be, for example, a connection to a telephone line or computer network.  Device 100 can communicate the results of patient tests to a health care provider from a remote location.  Likewise, the health care provider can communicate with the device 100 (e.g., to access stored test results, to adjust device parameters, or send a message to the patient).  
Cartridge 400 is shown with two testing zones 420.  In general, a cartridge can include 1, 2, 3, 4, or 5 or more testing zones.  Each testing zone 420 can test the level of a marker.  Each testing zone 420 includes a sample input 440, a control result window 460 and a test result window 480.  In one embodiment, the cartridge 400 is an immunochromatographic test cartridge.  Examples of immunochromatographic tests and test result readers can be found in, for example, U.S. Patent Nos. 5,504,013; 5,622,871; 6,235,241; and 6,399,398, each of which is incorporated by reference in its entirety.
Device 100 can be used to test and record the levels of various markers that provide information about the patient's health.  Various implementations of diagnostic device 100 may access programs and/or data stored on a storage medium (e.g., video cassette recorder (VCR) tape or digital video disc (DVD); compact disc (CD); or floppy disk).  Additionally, various implementations may access programs and/or data accessed stored on another computer system through a communication medium including a direct cable connection, a computer network, a wireless network, a satellite network, or the like.  
The software controlling the diagnostic device and providing patient feedback can be in the form of a software application running on any processing device, such as, a general-purpose computing device, a personal digital assistant (PDA), a special-purpose computing device, a laptop computer, a handheld computer, or a network appliance.
A diagnostic device may be implemented using a hardware configuration including a processor, one or more input devices, one or more output devices, a computer-readable medium, and a computer memory device.   The processor may be implemented using any computer processing device, such as, a general-purpose microprocessor or an application-specific integrated circuit (ASIC).  The processor can be integrated with input/output (I/O) devices to provide a mechanism to receive sensor data and/or input data and to provide a mechanism to display or otherwise output queries and results to a service technician.   Input device may include, for example, one or more of the following: a mouse, a keyboard, a touch-screen display, a button, a sensor, and a counter. 
The display 120 may be implemented using any output technology, including a liquid crystal display (LCD), a television, a printer, and a light emitting diode (LED).  The computer-readable medium provides a mechanism for storing programs and data either on a fixed or removable medium.  The computer-readable medium may be implemented using a conventional computer hard drive, or other removable medium such as those described above with reference to.  Finally, the system uses a computer memory device, such as a random access memory (RAM), to assist in operating the diagnostic device.  
The device 100 can provide access to applications such as a medical records database or other systems used in the care of patients.  In one example, the device connects to a medical records database via communication port 220.  Device 100 may also have the ability to go online, integrating existing databases and linking other websites.  Online access may also provide remote, online access by patients to medical information, and by caregivers to up-to-date test results reflecting the health of patients.  The device can be used in a hospital, physician's office, clinic, and patient's home either by the patient or an attendant care giver.
The device can be configured to respond to the measured level of a marker, in particular when the level of the marker indicates a change in the patient's health status.  For example, the device can be configured to store the results of tests and determine changes in the levels of markers over time.  A change in results over time can be an acute change or a chronic change.  An acute change can be a significant change in the level of a marker over a short period of time.  The magnitude of change and period of time can be different for each marker.  The device can be configured to compare each new test result either to a stored values of recent test results (e.g., the previous 1, 2, 3, 4, 5 or more results), or to an aggregate measure of recent test results (such as an average) to determine if an acute change has occurred.  In one example, an acute change is detected by the percentage change in a test result from the previous result.  
Chronic changes can be detected as well.  A chronic change can be a change in the level of a marker that occurs over a long period of time.  For example, a chronic change can occur such that many testing intervals pass without an acute change being detected, yet the level of marker is significantly different.  To detect a chronic change, the device can compare the results of each new test to a stored result of an earlier test, or to an aggregate measure of earlier tests.  For detecting chronic changes, the earlier test can be, for example, 4-12 weeks prior to the new test result.  In one example, the aggregate measure can be a rolling average, such as a 4-week, 8-week, or 12-week rolling average.  
The device can also be configured to compare test results to a stored threshold value or range.  The threshold value can be an upper or lower limit or range of values.  Thus, the device can determine if the measured value of a marker, or group of markers, is a safe level, a dangerous level, or indicates an emergency.  The device can alert the patient to the results of the test and can be configured, when appropriate to instruct the patient to seek medical care. 
The device can also be configured to track combinations of markers, for example, an average value of two markers, the difference in level between two markers, a ratio of the levels of two markers, or whether two or more markers exceed their respective threshold values at the same time.  The device can be configured to track one or more markers in combination with a patient's signs and symptoms.  
The device can be personalized for a patient.  The threshold values and other parameters for each marker can be adjusted (for example, by a physician or other caregiver) based on the circumstances of the patient, such as, for example, age, gender, or disease status.  The questions and responses that the device presents to the patient can also be adjusted.  
Examples of implementing the method follow.
(EXAMPLES)
(Study group and data collection)
34 patients who met the following criteria: CHF for  18 months, clinical stability for three months; NYHA class II to IV; CHF caused by coronary artery disease (94%) or idiopathic dilated cardiomyopathy; impaired left ventricular rejection fraction of ＜ 40%; no acute coronary event within six months; and sinus rhythm were recruited for this study.  Exclusion criteria were planned coronary revascularisation; chronic obstructive pulmonary disease; significant renal dysfunction; diabetes mellitus; autonomic neuropathy; limiting peripheral arterial disease; implanted pacemaker; treatment with b blockers; and atrial fibrillation.  The local Tayside ethics and research committee approved the study before recruitment.  All patients gave written and informed consent to participate in the study.
Patients were seen at monthly intervals in their own home.  A 24 hour ambulatory ECG monitor (Tracker2, Reynolds Medical Ltd, Hertford, UK) was applied and calibrated.  Blood samples were taken after  20 minutes supine rest.  The 24 hour ECG results were processed with a Reynolds pathfinder 600 series workstation.  Neutrophils were counted by our routine haematology laboratory by standard flow cytometry.  Stored plasma was used for high sensitivity C reactive protein analysis with a standard commercial enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Immuno-biological Laboratories, Hamburg, Germany).  Chlamydia pneumoniae antibodies (IgG, IgA, IgM) and immune complexes were analyzed on all samples as described before (Tavendale et al., Eur Heart J. 2002;23:3017).  All monthly samples were analyzed for neutrophils, brain natriuretic peptide (BNP), and aldosterone.  C reactive protein and chlamydiae were measured only on a single baseline sample and in the last three samples for each patient before death or at the end of study.  
All tapes were subjected to standard Holter analysis with artefacts confirmed manually.  Subsequently, time domain heart rate variability was analyzed automatically from RR intervals that had normal morphology and cycle lengths between 80120% of the preceding cycle duration.  All tapes were analyzed and their data files were reviewed and edited by an investigator (AMAS) blinded to the individual patient's clinical status.  On average, 97% of the data for each patient were available for further analysis after editing.
Death was classified as PHF or SUD based on the conventional expert committee view that SUD was a death within one hour of new symptoms without evidence of PHF before the new symptoms began (Narang et al. Eur Heart J. 1996;17:1390403).
Heart rate variability was analyzed according to standard guidelines (Anon. Circulation 1996; 93:1043-65).
The analyses were done with SPSS (version 10, SPSS Inc, Chicago, Illinois, USA).  Most of the data were normally distributed.  Data that were not normally distributed or were borderline in terms of normal distribution were analyzed as they were and after a log transformation.  Mean values at different time points were compared by repeated measurements analysis of variance and linear contrasts and when appropriate a one way analysis of variance followed with post hoc Bonferroni correction.  Values of p ＜ 0.05 were accepted as significant.  The coefficients of variation of neutrophils, aldosterone, C reactive protein, BNP, standard deviation of all NN intervals (SDNN), and triangular index are 0.8%, 6%, 13%, 15%, 0.3%, and 1.2%, respectively.  
No patient was treated with  blockade, as was standard practice at the time (mid 1990s) (Table 1).  The mean (SD) follow up period was 20 (5) months.  Nine patients died during follow up, four of PHF (during months 7, 12, 21, and 24) and five of SUD (during months 6, 11, 15, 20, and 21).  It is worth noting that all PHF deaths occurred within hospital and all SUD occurred in the community, which helps to validate that the deaths were correctly classified (Narang et al. Eur Heart J. 1996;17:1390403).
(Table 1)
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There were no significant differences at baseline except that C reactive protein and non-sustained ventricular tachycardia (NSVT) events were higher in the PHF group (Table 2).  On the other hand, intraindividual changes in several parameters were highly significantly different between the three groups.  Figure 1 show changes (mean (SEM)) from baseline to the last three measurements (triangular index (TI)), standard deviation of all NN intervals (SDNN), and ventricular extrasystole counts) before either death ((SUD) and progressive heart failure (PHF) groups) or the end of the study (for the alive group).  // indicates multiple measurements.  *p＜ 0.05; **p＜ 0.01.).  The patients who died (SUD and PHF) had significant intraindividual worsening in the sequential changes between baseline and the last three values of mean 24 hour heart rate variability (triangular index and SDNN) in contrast to the control survival group (see Figure 1).  
Figure 2 shows changes (mean (SEM)) from baseline to the last three measurements of plasma brain natriuretic peptide (BNP), C-reactive peptide (CRP), and neutrophils before either death (SUD and PHF groups) or the end of the study (for the alive group).  // indicates multiple measurements.  *p＜ 0.05; **p＜ 0.01.  A similar pattern was seen for the white cell count, the neutrophil count, and C reactive protein in that they all increased progressively before death in both the PHF group and the SUD group (see Figure 2).  Figures 3, 4, 5, and 6 show the individual data of those who died suddenly.  Specifically, Figure 3 shows individual neutrophil changes from baseline until SUD in the five SUD patients.  Each symbol represents a monthly value in each patient sequentially before their SUD.  Figure 4 shows individual C-reactive protein (CRP) changes from baseline until SUD in the five SUD patients.  Each symbol represents a monthly value in each patient sequentially before their SUD.  Figure 5 shows individual standard deviations of all NN intervals (SDNN) changes from baseline until SUD in the five SUD patients.  Each symbol represents a monthly value in each patient sequentially before their SUD.  Figure 6 shows individual triangular index (TI) changes from baseline until SUD in the five SUD patients.  Each symbol represents a monthly value in each patient sequentially before their SUD.
A clear change was seen in most cases before SUD, which was not seen in the alive group as judged by the data in the lower part of Table 2.  Unlike others, BNP was not found to predict sudden death in CHF.  BNP however was found to be predictive of death in progressive heart failure.
(Table 2)
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Patients who died in hospital of PHF also had significant increases in 24 hour mean ventricular extrasystoles, NSVT events, and 24 hour mean maximum heart rate in contrast to both SUD and control groups.  In addition several parameters, which usually detect a worsening clinical state, followed the same pattern.  These were 24 hour mean maximum heart rate, BNP, and aldosterone.  All of these parameters behaved as expected in that they increased progressively in those who died of PHF but were unchanged in the SUD group.  No significant changes were noted in any of the C pneumoniae titres or in immune complexes.
The problem being addressed here is that, as stated in an editorial in Circulation, "we currently lack the tools to identify most people at risk of a sudden cardiac arrest with a degree of accuracy sufficient to warrant major therapeutic interventions" (Zipes. Circulation 2001;104:25068).
In particular, SUD is preceded by progressive intraindividual decreases in heart rate variability and intraindividual increases in markers of inflammation (neutrophils and C reactive protein), but not by any change in the traditional measures of disease progression such as BNP, aldosterone, heart rate, and extrasystoles.  Indeed, the diagnostic accuracy of the changes in C reactive protein, neutrophils, and heart rate variability was fairly good with sensitivities of 60100% and specificities of 8492%, which meant that such changes were very seldom seen in the alive group.  On the other hand, PHF deaths but not SUDs were preceded by intraindividual worsening not only in heart rate variability and inflammation but also by worsening in the traditional measures of disease severity: BNP, aldosterone, extrasystoles, and NSVT.  No evidence was found to specifically implicate C pneumoniae in the intraindividual increases in inflammation.  
The correct classification of those who died into PHF and SUD groups is clearly important.  That all PHF deaths occurred during hospitalization while all SUDs occurred in the community is some indication that our classification is correct.  This can also be supported by the substantial increase in conventional measures of disease severity in the PHF death group but not in the SUD group.  Our heart rate variability data support the recent large UK-HEART (UK heart failure evaluation and assessment of risk trial), where low SDNN predicted death caused by PHF (Nolan et al., Circulation 1998;98:15106).  However, in contrast to our study, in UK-HEART no particular abnormality in heart rate variability was seen in the SUD group; however, UK-HEART was a cross sectional study where the time gap between the heart rate variability measure and the subsequent SUD may have been too long to detect such a relation.  This may explain why a link between heart rate variability and SUD was more detectable in the present longitudinal study with frequent heart rate variability monitoring than in UK-HEART.  
A key question is whether intraindividual increases in "inflammation" and intraindividual worsening in heart rate variability may be related.  New information suggests that this is possible. Inflammation produces endothelial dysfunction, (Bhagat et al., Cardiovasc Res. 1996;53:4812; Bhagat et al., Circulation 1997;96:30427) which in turn predicts coronary events ( Al Suwaidi et al., Circulation 2000;101:94854; Schachinger et al., Circulation 2000;101:1899906).  Endothelial dysfunction is also associated with reduced vascular nitric oxide, which is known to worsen autonomic function as indicated by heart rate variability (Chowdhary et al., Clin Sci. 1999;97:517; Spieker et al., J Am Coll Cardiol. 2000;36:2138).  The final link in this hypothesis is that autonomic (vagal) dysfunction is probably one of many arrhythmogenic stimuli (Zuanetti et al., Circ Res. 1987;61:42935).  Recent data are generally consistent with this in that SUD in CHF is often but not always associated with an identifiable acute coronary event at necropsy (Uretsky et al., Circulation 2000;102:6116) which may be preceded by inflammation induced endothelial dysfunction.  
These results have implications for risk stratification of patients with CHF, since impending SUD may be identifiable by sequential measuring of heart rate variability, neutrophils, or C reactive protein.  Impending PHF death is usually easy to recognize at the bedside, whereas impending SUD is difficult to predict at the bedside.  This means that it should be relatively easy clinically to ascertain whether an intraindividual increase in inflammation or autonomic dysfunction is heralding a SUD or a PHF death.  A measure of heart rate or neurohormones may assist this differentiation, if doubt still exists.  This may lead to better targeting of invasive procedures such as coronary revascularisation, insertion of coated stents or implantable defibrillators, or even transplantation towards those at high risk of imminent SUD.  These measures may also help in the selection of patients for targeted anti-inflammatory treatments to prevent SUD.  This may even involve short term administration of fairly "toxic" anti-inflammatories such as cyclosporine or steroids, which would be warranted if the patient is identified to be at risk of an imminent SUD but not warranted if the SUD risk is distant.  Indeed the IMPRESS (immunosuppressive therapy for the prevention of restenosis after coronary artery stent implantation) study showed that short term high dose prednisolone can reduce cardiovascular events dramatically in a similar but different population (Versaci et al., J Am Coll Cardiol. 2002;40:193542).  The ventricular extrasystole data are interesting in that worsening ventricular extrasystoles and increased NSVT occur only before PHF deaths but not before SUDs.  This supports a previous review article that suggested that ventricular extrasystoles are a consequence of disease progression rather than a specific cause of future sudden death (Packer, Circulation 1992;85:506).  The number of NSVT events and the number of patients in the SUD group are both small, which makes these NSVT results unreliable.  
It is worth commenting that this study was done before the use of  blockers and implantable cardioverter-defibrillators in CHF, although both should defer deaths rather than prevent them entirely.  The same intraindividual changes can still occur before the deferred death.  In summary, the data raise the possibility that SUD may be predictable from intraindividual changes in neutrophils, C reactive protein, or heart rate variability rather than using absolute across the board interindividual values.  This was a relatively small pilot study, although the work involved was large540 ambulatory ECG tapes and 540 assays of most analytes.  However, the credibility of our results is increased by the finding that changes were the same in two independent measures of inflammation (C reactive protein and neutrophils).  Nevertheless, larger studies will be needed to confirm this intriguing observation.  Monthly neutrophil counts may ultimately prove to be a cheap and effective way of targeting novel treatments to patients with CHF at high risk of impending SUD (Miller et al., J Heart Lung Transplant 1995;14:114353).  Furthermore, these data may be relevant to a wider group of patients, since half of all SUDs are said to occur in patients with at least a history of CHF (Hinkle et al., Circulation 1982;65:45764). 
The present invention is not to be limited in scope by the specific embodiments disclosed in the examples which are intended as illustrations of a few aspects of the invention and any embodiments that are functionally equivalent are within the scope of this invention.  Indeed, various modifications of the invention in addition to those shown and described herein will become apparent to those skilled in the art and are intended to fall within the scope of the appended claims.
Each and every reference cited herein is hereby incorporated in its entirety for all purposes to the same extent as if each reference were individually incorporated by reference. Furthermore, while the invention has been described in detail with reference to preferred embodiments thereof, it will be apparent to one skilled in the art that various changes can be made, and equivalents employed, without departing from the scope of the invention.
4.  BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWING
Figure 1 is a series of graphs depicting changes in shows changes in triangular index (TI), standard deviation of all normal to normal (NN) intervals (SDNN), and ventricular extrasystole counts before death ((SUD) and progressive heart failure (PHF) groups) or the end of study.
Figure 2 is a series of graphs depicting changes in plasma brain natriuretic peptide (BNP), C-reactive peptide (CRP), and neutrophils before either death (SUD and PHF groups) or the end of the study (for the alive group).
Figure 3 is a graph depicting neutrophil changes in SUD patients.
Figure 4 is a graph depicting C-reactive protein (CRP) changes in SUD patients.
Figure 5 is a graph depicting individual standard deviations of all NN intervals (SDNN) changes in SUD patients.  
Figure 6 is a graph depicting triangular index (TI) changes in SUD patients.
Figure 7 is a diagram illustrating a diagnostic device and an associated testing cartridge.
(WHAT IS CLAIMED IS:)
1.   A method for screening or diagnosing sudden death in heart failure in a mammalian subject, for determining sudden death in heart failure, for identifying a mammalian subject at risk for sudden death in heart failure or for monitoring the effect of therapy administered to a mammalian subject experiencing imminent sudden death in heart failure, said method comprising: 
measuring a level of a first marker in a sample from the mammalian subject, wherein the first marker is C-reactive protein or neutrophil count; and 
associating the level of the first marker with a status of cardiac health.
2.   The method of claim 1, wherein the sample is blood or plasma.
3.   The method of claim 1, wherein associating the level of the first marker with the status of cardiac health includes evaluating a risk of sudden death in heart failure
4.   The method of claim 1, wherein associating the level of the first marker with the status of cardiac health includes assessing the level of inflammation in heart failure.
5.   The method of claim 3, wherein evaluating the risk includes comparing the level of the first marker with a threshold level of the first marker.
6.   The method of claim 1, wherein associating the level of the first marker with the status of cardiac health includes monitoring an effect of therapy administered to the subject.
7.   The method of claim 1, wherein associating the level of the first marker with the status of cardiac health includes comparing the level of the first marker with a level of the first marker which is indicative of the absence of the risk of sudden death in heart failure.
8.   The method of claim 1, wherein associating the level of the first marker with the status of cardiac health includes contacting the sample with an antibody that binds to the first marker.
9.   The method of claim 8, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
10.  The method of claim 1, further comprising measuring the level of a second marker and associating a level of the second marker with the status of cardiac health; the second marker being different from the first marker.
11.  The method of claim 10, wherein associating the level of the second marker with the status of cardiac health includes evaluating a risk of sudden death in heart failure.
12.  The method of claim 11, wherein evaluating the risk of sudden death in heart failure includes comparing the level of the second marker with a threshold level of the second marker.
13.  The method of claim 10, wherein associating the level of the second marker with the status of cardiac health includes comparing the level of the second marker with a level of the second marker which is indicative of the absence of the risk of sudden death in heart failure.
14.  The method of claim 10, wherein the first marker is C-reactive protein and the second marker is a neutrophil count or white blood cell count.
15.  The method of claim 14, wherein the neutrophil count is obtained by standard flow cytometry.
16.  The method of claim 10, wherein the second marker is myeloperoxidase.
17.  The method of claim 10, wherein associating the level of the second marker with the status of cardiac health includes contacting the sample with an antibody that binds to the second marker.
18.  The method of claim 17, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
19.  The method of claim 1, further comprising measuring heart rate variability.
20.  The method of claim 19, wherein heart rate variability is calculated by standard deviation of normal to normal intervals and triangular index.
21.  The method of claim 20, wherein the standard deviation of normal to normal intervals are compared with standard deviation of normal to normal intervals which are indicative of the absence of sudden death in heart failure.
22.  The method of claim 21, where triangular index is compared with triangular index values which are indicative of the absence of sudden death in heart failure.
23.  The method of claim 1, further comprising measuring the level of a third marker and associating the level of the third marker with the status of cardiac health, the third marker being different from the first marker and the second marker.
24.  The method of claim 23, wherein associating the level of the third marker with the status of cardiac health includes evaluating a risk of sudden death in heart failure.
25.  The method of claim 24, wherein evaluating the risk of sudden death in heart failure includes comparing the level of the third marker with a threshold level of the third marker.
26.  The method of claim 23, wherein associating the level of the third marker with the status of cardiac health includes comparing the level of the third marker with a level of the third marker which is indicative of the absence of the risk of sudden death in heart failure.
27.  The method of claim 23, wherein associating the level of the third marker with the status of cardiac health includes comparing the level of the third marker with a level of the third marker which is indicative of the risk of death from progressive heart failure.
28.  The method of claim 23, wherein the third marker is a natriuretic peptide.
29.  The method of claim 28, wherein the natriuretic peptide is brain natriuretic peptide or N-terminal pro-brain natriuretic peptide.
30.  The method of claim 23, wherein associating the level of the third marker with the status of cardiac health includes contacting the sample with an antibody that binds to the third marker.
31.  The method of claim 30, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
32.  A kit for carrying out the method of claim 1.
33.  A method for screening or diagnosing sudden death in heart failure in a mammalian subject, for determining sudden death in heart failure, for identifying a mammalian subject at risk of sudden death in heart failure, or for monitoring the effect of therapy administered to a mammalian subject experiencing imminent sudden death in heart failure, said method comprising 
measuring a level of a first marker in a sample from the mammalian subject, wherein the first marker is a neutrophil count; and 
associating the level of the first marker with a status of cardiac health.
34.  A kit for screening, diagnosis or prognosis of sudden death in heart failure in a mammalian subject, for determining sudden death in heart failure, for identifying a mammalian subject at risk of sudden death in heart failure, or for monitoring the effect of therapy administered to a mammalian subject at experiencing imminent sudden death in heart failure, the kit comprising:
instructions for taking a sample from said mammalian subject and associating the level of C-reactive protein with the status of cardiac health; 
one or more reagents for measuring the level of C-reactive protein in the sample.
35.  The kit of claim 34, wherein associating the level of C-reactive protein with the status of cardiac health includes evaluating the risk of sudden death in heart failure.
36.  The kit of claim 34, wherein the sample is blood or plasma.
37.  The kit of claim 34, wherein the one or more reagents comprise an antibody that binds specifically to the first marker.
38.  The kit of claim 34, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
39.  The kit of claim 34, further comprising one or more reagents for measuring the level of a second marker indicative of status of cardiac health.
40.  The kit of claim 34, wherein the second marker is myeloperoxidase.
41.  The kit of claim 39, wherein the one or more reagents for measuring the second marker comprises an antibody that binds specifically to the second marker.
42.  The kit of claim 41, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
43.  The kit of claim 39, wherein the second marker is neutrophil count or white blood cell count.
44.  The kit of claim 34, further comprising a device including a detector configured to measure and to monitor heart rate.
45.  The kit of claim 44, wherein the device is configured to provide an output to a patient.
46.  The kit of claim 34, further comprising one or more reagents for measuring the level of a third marker indicative of the absence of sudden death in heart failure.
47.  The kit of claim 46, wherein the levels of the third marker is indicative of a risk of death from progressive heart failure.
48.  The kit of claim 46, wherein the third marker is a natriuretic peptide.
49.  The kit of claim 46, wherein the natriuretic peptide is brain natriuretic peptide or N-terminal pro-brain natriuretic peptide.
50.  The kit of claim 46, wherein the one or more reagents for measuring the third marker comprises an antibody that binds specifically to the third marker.
51.  The kit of claim 50, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
52.  A method of monitoring the health of a mammalian subject comprising measuring the level of a first marker in a sample from said mammalian subject, wherein said first marker is C-reactive protein or neutrophil count, and associating the level of the first marker with the status of cardiac health.
53.  The method of claim 52, wherein associating the level of the first marker with the status of cardiac health includes evaluating the risk of sudden death in heart failure.
54.  The method of claim 52, wherein the sample is blood or plasma.
55.  The method of claim 53, wherein evaluating the risk includes comparing the level of the first marker with a threshold level of the first marker.
56.  The method of claim 52, wherein associating the level of the first marker with the status of cardiac health includes comparing the level of the first marker with a level of the first marker which is indicative of the absence of sudden death in heart failure.
57.  The method of claim 52, wherein associating the level of the first marker with the status of cardiac health includes monitoring an effect of therapy administered to subject.
58.  The method of claim 52, wherein associating the level of the first marker with the status of cardiac health includes contacting the sample with an antibody that binds to the first marker.
59.  The method of claim 58, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
60.  The method of claim 52, further comprising measuring the level of a second marker and associating a level of the second marker with the status of cardiac health; the second marker being different from the first marker.
61.  The method of claim 60, wherein the first marker is C-reactive protein and the second marker is neutrophil count or white blood cell count.
62.  The method of claim 60, wherein the second marker is myeloperoxidase.
63.  The method of claim 60, wherein associating the level of the second marker with the status of cardiac health includes evaluating a risk of sudden death in heart failure.
64.  The method of claim 63, wherein evaluating the risk of sudden death in heart failure includes comparing the level of the second marker with a threshold level of the second marker.  
65.  The method of claim 60, wherein associating the level of the second marker with the status of cardiac health includes contacting the sample with an antibody that binds to the second marker.
66.  The method of claim 65, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
67.  The method of claim 52, further comprising measuring heart rate variability.
68.  The method of claim 67, wherein heart rate variability is calculated by standard deviation of normal to normal intervals and triangular index.
69.  The method of claim 68, wherein the standard deviation of normal to normal intervals are compared with standard deviation of normal to normal intervals values which are indicative of the absence of sudden death in heart failure.
70.  The method of claim 68, where triangular index is compared with triangular index values which are indicative of the absence of sudden death in heart failure.
71.  A system for monitoring cardiac health, comprising:
a cartridge including a sample port and a first assay, wherein the first assay recognizes a first marker; and 
a cartridge reader including a detector configured to measure a level of the first marker recognized by the assay.
72.  The system of claim 71, wherein device is configured to provide an output to a patient.
73.  The system of claim 71, wherein the first assay includes an antibody that recognizes the first marker.
74.  The system of claim 71, wherein the antibody recognizes C-reactive protein.
75.  The system of claim 71, further comprising a second test cartridge including a sample port and a second assay, wherein the second assay recognizes a second marker; the second marker being different from the first marker.
76.  The system of claim 75, wherein the second assay includes an antibody that recognizes the second marker.
1. ABSTRACT
A method for screening, diagnosis or prognosis of sudden death in heart failure in a mammalian subject, for determining sudden death in heart failure in a mammalian subject, for identifying a mammalian subject at risk of sudden death in heart failure, or for monitoring the effect of therapy administered to a mammalian subject at experiencing imminent sudden death in heart failure included measuring the level of C-reactive protein (CRP), myeloperoxidase (MPO), neutrophil count, white blood cell count and BNP in a sample of bodily fluid from the mammalian subject.  Methods for monitoring the cardiac health of a mammalian subject are further included.  Kits and devices for carrying out such methods are also provided.
2. Representative Drawing
None
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