(57)【要約】      （修正有）【課題】  試験化学物質の甲殻類のエクジソンレセプターに対する結合強度の評価方法を提供する。【解決手段】  特定のアミノ酸配列を有するタンパク質と、他の特定のアミノ酸配列を有するタンパク質と、リガンドと、試験化学物質とを溶液中で共存させ、前者のアミノ酸配列を有するタンパク質に結合したリガンド量を測定することにより化学物質のエクジソンレセプターへの結合強度を評価する化学物質の結合強度評価方法。これら特定のアミノ酸配列を有するタンパク質は、対応する塩基配列を有する遺伝子を導入した形質転換体に産生させた遺伝子発現タンパク質が使用できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、３又は５で示される塩基配列を有する遺伝子。
【請求項２】
配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
少なくとも請求項１又は２に記載の遺伝子を含有するベクター。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の遺伝子の上流に前記遺伝子発現のためのプロモーターを接続した請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
少なくとも請求項１又は２に記載の遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるエクジソンレセプター。
【請求項７】
配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項８】
配列番号７、９又は１１で示される塩基配列を有する遺伝子。
【請求項９】
配列番号８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１０】
少なくとも請求項８又は９に記載の遺伝子を含有するベクター。
【請求項１１】
請求項８又は９に記載の遺伝子の上流に前記遺伝子発現のためのプロモーターを接続した請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
少なくとも請求項８又は９に記載の遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項１３】
配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるウルトラスピラクルタンパク質。
【請求項１４】
配列番号８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１５】
配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と、リガンドと、試験化学物質とを溶液中で共存させ、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に結合したリガンド量を測定することにより化学物質のエクジソンレセプターへの結合強度を評価する化学物質の結合強度評価方法。
【請求項１６】
配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が、配列番号５で示される塩基配列を有する遺伝子を導入して取得した形質転換体に産生させた遺伝子発現タンパク質である請求項１５に記載の化学物質の結合強度評価方法。
【請求項１７】
配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が、配列番号１１で示される塩基配列を有する遺伝子を導入して取得した形質転換体に産生させた遺伝子発現タンパク質である請求項１５に記載の化学物質の結合強度評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エクジソンレセプター遺伝子、その二量体形成におけるパートナーであるウルトラスピラクルタンパク質遺伝子、前記２種類の遺伝子を組み込んだベクター、及び前記２種類の遺伝子を導入した形質転換体に関する。また、本発明は、化学物質のエクジソンレセプターに対する結合強度を評価する化学物質の結合強度評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中に存在する化学物質あるいは化学製品から環境中に漏出する化学物質で、生体内においてホルモンに類似した作用を示すものは、いわゆる「環境ホルモン」と呼ばれる。環境ホルモンはヒトや生物の内分泌系に影響を及ぼし、生殖障害等を引き起こすことが明らかになっている。
【０００３】
環境ホルモンは、ホルモン受容体に結合してそれらのホルモンの支配下に置かれている遺伝子を転写活性化するホルモン様作用を有している。このホルモン様作用は、環境ホルモンが環境生物の内分泌攪乱を引き起こす主要な作用メカニズムであると考えられている。従来、化学物質のホルモン様作用については、魚類等の環境生物のホルモン受容体に対する作用を評価する方法が多く開発されている（例えば、特許文献１〜３及び非特許文献１〜３）。
【０００４】
特許文献１〜３及び非特許文献１〜３に記載の方法は、いずれも魚類等の脊椎動物の内分泌系への影響を評価する方法である。全生物の約９５％を占めるといわれる無脊椎動物の内分泌系へ化学物質が与える影響を評価するためには、無脊椎動物由来のホルモン受容体に対する作用を解明する必要がある。
【０００５】
一般に、化学物質の無脊椎動物に対する影響を評価するための試験生物としては、節足動物に属する甲殻類が国際的に用いられている。
【０００６】
節足動物の主要なホルモンには、生体の脱皮・変態を誘起する脱皮ホルモン及び幼弱ホルモンがある。節足動物の一分類である昆虫類においては、脱皮ホルモンのエクジステロイドが、エクジソンレセプターとウルトラスピラクルと呼ばれるタンパク質が形成するヘテロ二量体と結合し、このヘテロ二量体がDNA上の応答配列に結合することにより標的遺伝子群を活性化することが知られている。
【０００７】
甲殻類においても昆虫類と同様にエクジソンレセプターとウルトラスピラクルが存在してホルモンの作用に関与していることが予想されるものの、甲殻類の内分泌系についてはほとんど明らかにされていない。甲殻類においては、１種でエクジソンレセプターの存在が確認されているのみである（非特許文献４）。
【特許文献１】特開２０００−２０１６８８号公報（請求項１２）
【特許文献２】特願２００４−３５７５５８号公報（特許請求の範囲）
【特許文献３】特開２０００−２０１６８８号公報（特許請求の範囲）
【非特許文献１】マシューズ，ジェイ．，エト  アル．（2000）ディファレンシャル  エストロジェン  レセプター  バインディング  オブ  エストロジェニック  サブスタンシイズ：  ア  スピーシーズ  コンパリスン，  ジャーナル  オブステロイド  バイオケミストリー  アンド  モレキュラー  バイオロジー，74，223-234．(Matthews, J., et al. (2000) Differential estrogen receptor binding of estrogenic substances: a species comparison, J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 74, 223-234.)
【非特許文献２】イシハラ，エイ．，エト  アル．（2003）エンドクライン  ディスラプティング  ケミカルズ：  インターフェレンス  オブ  サイロイド  ホルモン  バインディング  トゥ  トランスサイレチン  アンド  トゥ  サイロイドホルモン  レセプターズ，  モレキュラー  アンド  セルラー  エンドクリノロジー，199，105-117．(Ishihara，A., et al. (2003) Endocrine disrupting chemicals: interference of thyroid hormone binding to transthyretins and to thyroid hormone receptors, Mol. Cell. Endocrinol., 199, 105-117.)
【非特許文献３】ウィルソン，ヴィ．エス．，エト  アル．（2004）クローニング  アンド  イン  ビトロ  エクスプレッション  アンド  キャラクタライゼーション  オブ  ザ  アンドロジェン  レセプター  アンド  アイソレーション  オブ  エストロジェン  レセプター  アルファ  フロム  ザ  ファットヘッド  ミノー  （ピメファレス  プロメラス），  エンバイロンメンタル  サイエンス  アンド  テクノロジー，38，6314-6321．(Wilson, V.S., et al. (2004) Cloning and in vitro expression and characterization of the androgen receptor and isolation of estrogen receptor alpha from the fathead Minnow (Pimephales promelas), Environ. Sci. Technol., 38, 6314-6321.)
【非特許文献４】チャン，エイ．シー．，エト  アル．（1998）クローニング  オブ  クラスタシアン  エクジステロイド  レセプター  アンド  レチノイド−エックス  レセプター  ジーン  ホモログズ  アンド  エレベーション  オブ  レチノイド−エックス  レセプター  エムアールエヌエイ  バイ  レチノイックアシッド，  モレキュラー  アンド  セルラー  エンドクリノロジー，139，209-227．(Chung, A.C., et al. (1998) Cloning of crustacean ecdysteroid receptor and retinoid-X receptor gene homologs and elevation of retinoid-X receptor mRNA by retinoic acid, Mol. Cell Endocrinol., 139, 209-227.)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
甲殻類の内分泌系におけるホルモン作用の解明なしでは、化学物質が甲殻類に及ぼす影響が内分泌系の撹乱により生じたものであるかどうかの確実な判定は困難である。化学物質のホルモン様作用を確実に評価するためには、甲殻類のホルモン受容体に対する化学物質の結合性や転写活性化能等を評価することにより、化学物質のホルモン作用特異的な影響を判定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、生態毒性試験に広く用いられており、米国環境保護庁により提案されている化学物質による内分泌撹乱作用の評価試験法（ユー．エス．エンバイロメンタル  プロテクション  エージェンシー．（2002）ドラフト  ディテールド  レビュー  ペーパー  オン  マイシッド  ライフ  サイクル  トキシティ  テスト，  イーピーエイ/68-ダブリュー-01-023, バテル，コロンバス，オハイオ．(U. S. Environmental Protection Agency. (2004) Draft detailed review paper on mysid life cycle toxicity test, EPA/68-W-01-023., Battelle, Columbus, OH.)）における試験生物であるマイシッドシュリンプ（Mysid shrimp；Americamysis bahia)に着目し、化学物質が甲殻類の内分泌系へ与える影響を評価する方法について鋭意検討した。その結果、マイシッドシュリンプの組織からエクジソンレセプター遺伝子とウルトラスピラクルタンパク質遺伝子を取得し、更にこれらの遺伝子を導入した形質転換体に産生させた遺伝子発現タンパク質を利用することにより化学物質のエクジソンレセプターに対する結合強度が評価できることを見出し本発明を完成するに到った。
【００１０】
即ち、上記課題を解決する本発明は以下に記載するものである。
【００１１】
〔１〕  配列番号１、３又は５で示される塩基配列を有する遺伝子。
【００１２】
〔２〕  配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１３】
〔３〕  少なくとも〔１〕又は〔２〕に記載の遺伝子を含有するベクター。
【００１４】
〔４〕  〔１〕又は〔２〕に記載の遺伝子の上流に前記遺伝子発現のためのプロモーターを接続した〔３〕に記載のベクター。
【００１５】
〔５〕  少なくとも〔１〕又は〔２〕に記載の遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【００１６】
〔６〕  配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるエクジソンレセプター。
【００１７】
〔７〕  配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
【００１８】
〔８〕  配列番号７、９又は１１で示される塩基配列を有する遺伝子。
【００１９】
〔９〕  配列番号８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００２０】
〔１０〕  少なくとも〔８〕又は〔９〕に記載の遺伝子を含有するベクター。
【００２１】
〔１１〕  〔８〕又は〔９〕に記載の遺伝子の上流に前記遺伝子発現のためのプロモーターを接続した〔１０〕に記載のベクター。
【００２２】
〔１２〕  少なくとも〔８〕又は〔９〕に記載の遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【００２３】
〔１３〕  配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるウルトラスピラクルタンパク質。
【００２４】
〔１４〕  配列番号８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
【００２５】
〔１５〕  配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と、リガンドと、試験化学物質とを溶液中で共存させ、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に結合したリガンド量を測定することにより化学物質のエクジソンレセプターへの結合強度を評価する化学物質の結合強度評価方法。
【００２６】
〔１６〕  配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が、配列番号５で示される塩基配列を有する遺伝子を導入して取得した形質転換体に産生させた遺伝子発現タンパク質である〔１５〕に記載の化学物質の結合強度評価方法。
【００２７】
〔１７〕  配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が、配列番号１１で示される塩基配列を有する遺伝子を導入して取得した形質転換体に産生させた遺伝子発現タンパク質である〔１５〕に記載の化学物質の結合強度評価方法。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、農業、漁業等における有用生物であって、毒性試験生物として広く用いられている甲殻類のエクジソンレセプターに対する化学物質の結合強度を簡便に測定することができる。本発明は、甲殻類の内分泌系に影響を及ぼす化学物質、特に農薬のプレスクリーニング法として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
後述する実施例において取得した配列番号１で表される塩基配列はマイシッドシュリンプのエクジソンレセプター（Ecdysone receptor；以下、ＥｃＲと称す）遺伝子の全長を表し、配列番号７で表される塩基配列はウルトラスピラクル（Ultraspiracle；以下、ＵＳＰと称す）遺伝子の全長を表す。ＥｃＲ及びＵＳＰは、他のホルモン受容体と同様にそれぞれＡ〜Ｆドメインで構成されるが、配列番号３の塩基配列はＥｃＲのＤＥＦドメインに、配列番号９の塩基配列はＵＳＰのＤＥＦドメインに相当する塩基配列である。これらのドメインのうち、ＥｃＲのリガンド結合ドメインはＥドメインである。ＥｃＲのＥドメインの塩基配列を配列番号５に示す。ＵＳＰについては、リガンド結合ドメインはＥＦドメインである。ＵＳＰのＥＦドメインの塩基配列を配列番号１１に示す。配列番号１、３、５、７、９及び１１の塩基配列に対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０及び１２に示す。
【００３０】
配列番号１、３、５、７、９及び１１に示す塩基配列からなる遺伝子及びこれらの塩基配列をその一部に含む遺伝子は、いずれも通常の遺伝子工学的手法を用いてプラスミド、ウイルス、ファージベクター等のベクターに挿入することができる。ベクターには必要により導入される宿主細胞において上記遺伝子が発現するためのプロモーターやプロモーターの制御因子を遺伝子の上流に接続する。ベクターは１以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子等を含んでいてもよい。
【００３１】
構築したベクターは常法により宿主細胞に導入して形質転換体を取得することができる。取得した形質転換体の培養を行うことにより、導入した遺伝子のコード情報に基づいて形質転換体にタンパク質を産生させる。
【００３２】
例えば宿主細胞として大腸菌を用いる場合には、遺伝子を適当なプロモーターの下流に接続し、大腸菌内で機能するベクターに挿入して発現ベクターを作製する。プロモーターとしては、ｔａｃプロモーター（アマシャムバイオサイエンス社製）、Ｔ７プロモーター（ノバゲン社製）等を、ベクターとしてはｐＧＥＸ−４Ｔ−１（アマシャムバイオサイエンス社製）、ｐＭＡＬ（ニューイングランドバイオラブズ社製）、ｐＥＴ（ノバゲン社製）等を挙げることができる。また、大腸菌としては、例えばＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（登録商標、ストラタジーン社製）、ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（登録商標、インビトロジェン社製）などが使用できる。
【００３３】
得られた遺伝子発現タンパク質を用いて競争結合試験を行うことにより化学物質のＥｃＲに対する結合強度を評価することができる。以下、化学物質のＥｃＲへの結合強度を評価する方法につき説明する。
【００３４】
まず、配列番号５で示される塩基配列を有する遺伝子を組み込んだベクターを導入した形質転換体に遺伝子発現タンパク質（ＥｃＲ）を産生させる。次いで、配列番号１１で示される塩基配列を有する遺伝子を組み込んだベクターを導入した形質転換体に遺伝子発現タンパク質（ＵＳＰ）を産生させる。得られた２種類の遺伝子発現タンパク質（ＥｃＲ及びＵＳＰ）と、リガンド（２０−ヒドロキシエクジソン等）と、試験化学物質とを溶液に添加し共存させる。ＥｃＲ及びＵＳＰ間での二量体形成と、リガンドと化学物質のＥｃＲへの競争結合が平衡に達した後、遊離のリガンドを溶液中から取り除き、溶液に残存するリガンド濃度を測定する。試験化学物質の遺伝子発現タンパク質への結合強度が強いほど遊離しているリガンド量が多く、測定される溶液中のリガンド濃度は低いものとなる。
【００３５】
配列番号５で示される塩基配列を有する遺伝子を組み込んだ形質転換体が産生した遺伝子発現タンパク質（ＥｃＲ）は、配列番号６で示されるアミノ酸配列、即ちリガンド結合ドメインであるＥドメインを有している。この遺伝子発現タンパク質はマイシッドシュリンプの組織から採取した天然由来のＥｃＲとはアミノ酸配列が一部異なるが、Ｅドメインを有しているのでＵＳＰ共存下でエクジソンが特異的に結合する。従って、試験化学物質のホルモン様作用が強いほど遺伝子発現タンパク質であるＥｃＲへの結合強度が強くなると類推できる。
【００３６】
一方、ＥｃＲと共存させるＵＳＰについても天然由来のＵＳＰとアミノ酸配列が一部異なっていてもよく、その一部にＥＦドメインを有しているものを使用できる。ＵＳＰ発現のために形質転換体に導入する遺伝子は、その一部に配列番号１１に示す塩基配列を有していればよい。
【００３７】
なお、配列番号５で示される塩基配列を有する遺伝子を組み込んだベクターと、配列番号１１で示される塩基配列を有する遺伝子を組み込んだベクターは、上述したように、それぞれ異なる宿主細胞に導入してＥｃＲとＵＳＰを別々に産生させてもよいし、２つのベクターを同じ宿主細胞に導入してＥｃＲとＵＳＰを同時に産生させてもよい。配列番号５で示される塩基配列を有する遺伝子と、配列番号１１で示される塩基配列を有する遺伝子は、１のベクターに組み込んで宿主細胞に導入することもできる。
【００３８】
宿主細胞に導入するベクターには、配列番号５に示す塩基配列を有する遺伝子に代えて、配列番号６で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を組み込んでＥｃＲのＥドメインを有するタンパク質を発現させてもよい。ＵＳＰを産生させる宿主細胞に導入するベクターついても同様に、配列番号１１に示す塩基配列を有する遺伝子に代えて、配列番号１２で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を組み込んでもよい。また、ベクターには配列番号１又は７で示される塩基配列を組み込んでマイシッドシュリンプの組織から採取したものと同等のＥｃＲ又はＵＳＰを産生させてもよい。
【００３９】
リガンドとしては、ＥｃＲの結合部位（Ｅドメイン）に特異的に結合する化合物であって、溶液中での濃度を高い精度で測定することが可能な化合物であれば制限なく用いることができる。本発明において好ましいリガンドとしては、エクジソンの水素原子をトリチウムで置換した放射リガンドを挙げることができ、具体的には［3Ｈ］−ポナステロンＡ、［3Ｈ］−エクジソン等が使用できる。
【００４０】
溶液中に存在する遊離のリガンドを溶液から取り除く方法としては、例えばデキストラン被覆活性炭（ＤＣＣ）を用いる方法を挙げることができる。ＥｃＲに結合したリガンドは、表面のデキストランが障害となって、ＤＣＣ内部の活性炭に吸着しない。一方、遊離のリガンドはデキストランを通過して活性炭表面に吸着する。このため、遊離のリガンドを溶液から除去するには、溶液にＤＣＣを添加して遊離のリガンドを吸着させた後、濾過、遠心分離等公知の方法を用いてＤＣＣを分離すればよい。
【００４１】
溶液中に添加するリガンド濃度は０．１〜５ｎＭが好ましく、０．２〜２ｎＭがより好ましい。また、溶液中のＥｃＲの濃度は２〜５０ｎＭとすることが好ましい。ＵＳＰの濃度は、ＥｃＲの濃度の１００〜３００モル％とすることが好ましく、１００〜１５０モル％とすることがより好ましい。
【００４２】
試験化学物質のＥｃＲに対する結合強度を評価する具体的な方法としては、例えば、化学物質が無添加のときにＥｃＲに結合するリガンド量の５０％が化学物質に置き換わる化学物質濃度（５０％阻害濃度、又はＩＣ50）を求める方法がある。
【００４３】
ＩＣ50は、リガンドと遺伝子発現タンパク質（ＥｃＲ及びＵＳＰ）の濃度を一定とし、試験化学物質の濃度を種々変化させて多数の試験溶液を調製し、ＥｃＲに結合しているリガンドの濃度を測定することにより算出できる。
【００４４】
ＩＣ50の値は、リガンドの種類や濃度等の試験条件に依存するが、同一条件下においては試験化学物質とＥｃＲとの結合の強さに比例する。従って、ＩＣ50から試験化学物質のＥｃＲへの結合強度の相対的な関係を評価できる。
【実施例】
【００４５】
実施例１（マイシッドシュリンプＥｃＲ遺伝子及びＵＳＰ遺伝子の取得）
RNeasy Mini Kit（キアゲン社製）を用いて、マイシッドシュリンプ成体からtotal RNAを抽出・精製した。得られたtotal RNAを鋳型として、オリゴdTプライマーを用いたSuperScript II RNase H- Reverse Transcriptase（登録商標、インビトロジェン社製）による逆転写反応を行い、一本鎖cDNAを合成した。合成した一本鎖cDNAを鋳型として、プライマー対（EcR遺伝子取得用としてaとb、USP遺伝子取得用としてcとd）を用いたPCRによりDNAフラグメントの増幅を行った。PCR条件は、EcR遺伝子の増幅においては30サイクル、94℃-15秒、49℃-30秒、68℃-3.5分とし、USP遺伝子の増幅においては30サイクル、94℃-15秒、51℃-30秒、68℃-3分とした。プライマーの塩基配列は、以下に示すとおりである。
a：5’-AATCTTGATCTGACATCGTTTGCG-3’（配列番号１３）
b：5’-GAACATTTCACAAGTAATAATAACCG-3’（配列番号１４）
c：5’-ATCCCGATAAATTGGGCT-3’（配列番号１５）
d：5’-AGGAGTCAAAATATTTGTCAAGAG-3’（配列番号１６）
増幅されたDNAフラグメントをpCR-Blunt II-TOPO（登録商標、インビトロジェン社製）を用いてサブクローニングし、プラスミドを調製した。pCR-Blunt II（登録商標、インビトロジェン社製）に基づいたプライマーを用い、ダイターミネーター法により塩基配列を決定した。さらに、本遺伝子の内部配列に基づいたプライマーにより塩基配列を決定した。DNAシーケンサーはModel CEQ 8000（登録商標、ベックマンコールター社製）を用いた。
【００４６】
実施例２（遺伝子発現用ベクターの構築）
実施例１で得られたEcR遺伝子のうち配列番号３で示される領域と、USP遺伝子のうち配列番号９で示される領域を以下のプライマー対（EcR遺伝子取得用としてeとf、USP遺伝子取得用としてgとh）を用いたPCRにより増幅した。得られたPCR産物をEcoR I及びNot Iで消化し、同制限酵素で消化した大腸菌用発現プラスミドpGEX-4T-1（アマシャムバイオサイエンス社製）にそれぞれ導入した。
e：5’-GACGAATTCAGGCCTGAATGTGTGG-3’（配列番号１７）
f：5’-GATCGCGGCCGCTTAAAAGTCCCATAGTT-3’（配列番号１８）
g：5’-GACGAATTCAAAAGAGAGGCAGTACA-3’（配列番号１９）
h：5’-GAACGCGGCCGCTTAGCTTGCAGATAAAAT-3’（配列番号２０）
実施例３（遺伝子発現タンパク質の調製）
以下の方法を用いて配列番号３及び９で示される遺伝子からのタンパク質発現を行った。実施例２で構築した２種類の発現ベクターをそれぞれ大腸菌BL21-CodonPlus (DE3)-RIL（登録商標、ストラタジーン社製）に導入し、アンピシリン及びクロラムフェニコール含有L-Broth（25 mL）に植菌し、37℃で終夜培養した。250 mLのL-Brothに植え換え、25℃で3〜8時間培養を行った後に、終濃度0.8mMとなるようにイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトシドを添加し、目的タンパク質の発現誘導を開始し、15℃で終夜培養した。遠心分離により大腸菌を集菌し、超音波による破砕を行った。遠心分離による可溶性画分の抽出を行い、0.5％(v/v)トリトンX-100を含むリン酸緩衝化生理食塩水(PBST)で平衡化したグルタチオン固定化樹脂を添加し、4℃で30分ゆるやかに撹拌した。4℃で3,000回転、10分間遠心し、上清を除いた。PBSTで再懸濁による洗浄を行い、4℃で5,000回転、10秒間遠心し、上清を除いた。本洗浄操作を3回繰り返した。16 mMの還元型グルタチオンを含むトリスバッファー(pH8.0)を加え、4℃で10分間撹拌し、発現タンパク質を樹脂から溶出、精製した。
【００４７】
精製した発現タンパク質溶液を2.5 mMの塩化カルシウムを含むトリスバッファー(pH8.0)に対して透析した後、終濃度40 U/mlとなるようトロンビンを添加し、20℃で60分間反応させ発現タンパク質からグルタチオンS-トランスフェラーゼを切断した。グルタチオンS-トランスフェラーゼを切断した発現タンパク質の濃度をProtein 200 Plus LabChip Kit（登録商標、アジレントテクノロジー社製）を装着したAgilent 2100 Bioanalyzer（アジレントテクノロジー社製）により定量した。
【００４８】
試験例１（遺伝子発現タンパク質のリガンド結合性の測定）
実施例３で調製した遺伝子発現タンパク質（EcR、USP）に対して脱皮ホルモンが特異的に結合できることを確認するために、ホルモン濃度依存的な飽和結合試験を行った。非特異的な結合度は大過剰の非標識20-ヒドロキシエクジソン（1 μM）を添加して測定した。使用した試薬、機器は以下の通りである。
・ホルモン受容体混合液：EcR DEFドメイン (EcRdef)とUSP DEFドメイン (USPdef)の等モル混合液
・標準リガンド：[3H]-ポナステロンＡ（168.3 Ci/mmol、パーキンエルマー社製）0, 0.157, 0.313, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 nM
・非特異的結合測定用リガンド：20-ヒドロキシエクジソン（1 μM）（和光純薬工業社製）
・バインディングバッファー（pH 7.4）：
10 mM Tris-HCl（シグマ社製）
1 mM EDTA（和光純薬工業社製）
1 mM EGTA（和光純薬工業社製）
1 mM NaVO3（和光純薬工業社製）
10% グリセロール（和光純薬工業社製）
10 mg/mL 牛血清アルブミン（和光純薬工業社製）
0.5 mM PMSF（和光純薬工業社製）
0.2 mM ロイペプチン（和光純薬工業社製）
・デキストラン被覆活性炭（DCC）懸濁液：0.04%デキストラン（シグマ社製）、0.4%活性炭（和光純薬工業社製）のバインディングバッファー懸濁液
・液体シンチレーションカウンター：トライカーブTR-3100（パーキンエルマー社製）
以下の組成で反応溶液を調製した。
ホルモン受容体混合液                     30 μL
標準リガンド                             10 μL
20-ヒドロキシエクジソン（10 μM、全結合測定時にはバインディングバッファー）
10 μL
バインディングバッファー                 50 μL
計                                      100 μL
上記の組成の反応混合液を25℃で1時間反応させた。100 μLのDCC懸濁液を添加して氷上で10分間放置した。溶液を濾過してDCCを除去した後、溶液の放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００４９】
受容体に特異的結合したリガンド濃度をリガンド添加濃度に対してプロットしたグラフと、特異的結合したリガンド濃度に対して特異的結合したリガンド濃度とフリーのリガンド濃度の比の値をプロットしたグラフ（スキャッチャードプロット）を図１に示す。
【００５０】
試験例２（遺伝子発現タンパク質のリガンド結合性の測定）
実施例３で調製した２種類の遺伝子発現タンパク質（EcR、USP）の共存がリガンドとの特異的結合に必須であることを確認するために、EcR、USPそれぞれ単独もしくは共存下で結合試験を行った。使用した試薬、機器は以下の通りである。
・ホルモン受容体：EcR DEFドメイン (EcRdef)、USP DEFドメイン (USPdef)
・標準リガンド：[3H]-ポナステロンＡ（168.3 Ci/mmol、パーキンエルマー社製）10 nM
・非特異的結合測定用リガンド：20-ヒドロキシエクジソン（1 μM）（和光純薬工業社製）
・バインディングバッファー（pH 7.4）：
10 mM Tris-HCl（シグマ社製）
1 mM EDTA（和光純薬工業社製）
1 mM EGTA（和光純薬工業社製）
1 mM NaVO3（和光純薬工業社製）
10% グリセロール（和光純薬工業社製）
10 mg/mL 牛血清アルブミン（和光純薬工業社製）
0.5 mM PMSF（和光純薬工業社製）
0.2 mM ロイペプチン（和光純薬工業社製）
・デキストラン被覆活性炭（DCC）懸濁液：0.04%デキストラン（シグマ社製）、0.4%活性炭（和光純薬工業社製）のバインディングバッファー懸濁液
・液体シンチレーションカウンター：トライカーブTR-3100（パーキンエルマー社製）
以下の組成で反応溶液を調製した。
ホルモン受容体（EcR溶液、USP溶液、又はEcRとUSPの等モル混合液）
30 μL
標準リガンド                             10 μL
20-ヒドロキシエクジソン（10 μM、全結合測定時にはバインディングバッファー）
10 μL
バインディングバッファー                 50 μL
計                                      100 μL
上記の組成の反応混合液を25℃で1時間反応させた。100 μLのDCC懸濁液を添加して氷上で10分間放置した。溶液を濾過してDCCを除去した後、溶液の放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００５１】
各受容体に対して特異的結合した標準リガンド量を図２に示す。
【００５２】
実施例４（遺伝子発現タンパク質を用いた競争結合試験）
以下の方法を用いて、実施例３で調製した遺伝子発現タンパク質（EcR、USP）に対する試験物質の結合強度を測定した。使用した試薬、機器は以下の通りである。
・ホルモン受容体混合液：EcR DEFドメイン (EcRdef)とUSP DEFドメイン (USPdef)の等モル混合液
・標準リガンド：[3H]-ポナステロンＡ（168.3 Ci/mmol、パーキンエルマー社製）5.0 nM
・試験物質
２０−ヒドロキシエクジソン（20-OH-E）、ムリステロンＡ（MuA）（以上、和光純薬工業社製）、α−エクジソン（α-E）、ポナステロンＡ（PoA）（以上、シグマ社製）
・バインディングバッファー：10 mM Tris-HCl, pH 7.4（1 mM EDTA、1 mM EGTA、 1 mM NaVO3、10% グリセロール、10 mg/L 牛血清アルブミン、0.5 mM PMSF、0.2 mM ロイペプチン）
・デキストラン被覆活性炭（DCC）懸濁液：0.04%デキストラン（シグマ社製）、0.4%活性炭（和光純薬工業社製）のバインディングバッファー懸濁液
・試験物質溶液（1 x 10-5〜1 x 10-12 M、公比3.2）
・液体シンチレーションカウンター：トライカーブTR-3100（パーキンエルマー社製）
以下の組成で反応溶液を調製した。
ホルモン受容体                         30 μL
標準リガンド（5 nM）                   10 μL
試験物質（各試験濃度の10倍濃度溶液）   10 μL
バインディングバッファー               50 μL
計                                    100 μL
上記の組成の反応混合溶液を25℃で1時間反応させた。100 μLのDCC懸濁液を添加して氷上で10分間放置した。溶液を濾過してDCCを除去した後、溶液の放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００５３】
標準リガンドの受容体結合率B/B0（%）は以下の式で表される。
【００５４】
【数１】
2006246767.tif 000002
各化学物質の受容体結合率B/B0（%）を化学物質濃度に対してプロットしたグラフを図３に示す。このグラフにおいて受容体結合率B/B0（%）は下記式で近似できる。
【００５５】
【数２】
2006246767.tif 000003
ここで、Xは溶液中の化学物質濃度（M）、Yは受容体結合率B/B0（%）、Topは受容体結合率B/B0（%）の頭打ちの数値、Bottomは受容体結合率B/B0（%）の底打ちの数値、HillSlopeは化学物質により異なる定数を示す。
【００５６】
得られたデータからGraphPad Prism Ver. 3（登録商標、GraphPad Software社製）を用いて50%阻害濃度（IC50）を算出した。結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
2006246767.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】試験例１において測定した遺伝子発現タンパク質に対して特異的結合したリガンド濃度をリガンド添加濃度に対してプロットしたグラフと、遺伝子発現タンパク質に対するリガンドの特異的結合性を示すスキャッチャードプロットである。
【図２】試験例２において測定した各受容体に特異的結合したリガンド量を示すグラフである。
【図３】実施例４において測定した各試験化学物質の濃度と遺伝子発現タンパク質に対するリガンドの結合率の関係を示すグラフである。
【図１】
2006246767.tif 000005
【図２】
2006246767.tif 000006
【図３】
2006246767.tif 000007
【配列表】
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