(57)【要約】      （修正有）【課題】血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードするＤＮＡ配列から、受容体またはその類似体を生産する方法、およびそれに対する抗体を提供する。【解決手段】哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードする特定のＤＮＡ配列を、ウイルスのオペロン由来の誘導可能な制御要素を含む組み換え転写単位中で発現し、その累自体を含むタンパク質組成物を得る。また、発現した変性受容体に対する抗体を作製し、その検出法（検出薬剤）に利用可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号３または配列番号５に示す哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードする領域から実質的になるＤＮＡ配列。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３または配列番号５に示す哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードする領域から実質的になるＤＮＡ配列を有するｃＤＮＡクローン。
【請求項３】
４２℃、２０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド存在下で、配列番号１、配列番号３または配列番号５に示すＤＮＡ配列のクローンとハイブリダイズできて、かつ変性低密度リポ蛋白質と結合する機能を有する蛋白質をコードしているＤＮＡ配列。
【請求項４】
配列番号１、配列番号３または配列番号５に示すＤＮＡ配列と遺伝的コードの結果として縮重していて、かつ変性低密度リポ蛋白質と結合する機能を有する蛋白質をコードしているＤＮＡ配列。
【請求項５】
微生物もしくはウイルスのオペロン由来の誘導可能な制御要素を含む組み換え転写単位中で発現させることが可能な、配列番号１、配列番号３または配列番号５に示す哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体のアミノ酸配列を実質的にコードしている合成遺伝子からなるＤＮＡ配列。
【請求項６】
配列番号１、配列番号３または配列番号５に示す哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードする領域から実質的になるＤＮＡ配列からなる組換え発現ベクター。
【請求項７】
配列番号１、配列番号３または配列番号５に示す哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードする領域から実質的になるＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクターを宿主細胞に挿入し、この細胞を発現を引き起こす条件下で培養することからなる哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体またはその類似体を生産する方法。
【請求項８】
組換え細胞培養により生産された、配列番号１、配列番号３または配列番号５に示すアミノ酸配列を有する哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体またはその類似体を含むタンパク質組成物。
【請求項９】
配列番号１、配列番号３または配列番号５に示すアミノ酸配列を有する哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体またはその類似体を含む、変性低密度リポ蛋白質を検出するための薬剤。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号３または配列番号５に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１４０から２７０迄のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項１１】
配列番号１、配列番号３または配列番号５に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１４０から２７０迄のアミノ酸配列をコードする領域から実質的になるＤＮＡ配列。
【請求項１２】
配列番号１、配列番号３または配列番号５に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６１から２７０迄のアミノ酸配列を含むペプチドに対する抗体。
【請求項１３】
配列番号１、配列番号３または配列番号５に示す塩基配列を有するＤＮＡもしくはそのアナログに対応する哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体に対する抗体。
【請求項１４】
変性低密度リポ蛋白質受容体もしくはそのアナログが組み換え細胞培養により生産された請求項１２または１３に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類のリポ蛋白質の受容体、さらに詳しくは哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化の進展の過程では、血管内皮細胞の機能変化が初期の段階で重要であることが指摘されている。血管内皮細胞は種々の液性因子を放出し、循環系のホメオスターシスを保っている。この血管内皮細胞の機能は物理的な刺激や、種々の物質により障害を受けるがこの中でも変性低密度リポ蛋白質の一種である酸化低密度リポ蛋白質が最も重要であると考えられている。例えば、血管のトーヌス(tonus) の調節は血管内皮細胞が血管弛緩因子である一酸化窒素を放出することが重要であるが、この一酸化窒素の放出は酸化低密度リポ蛋白質により障害される。
一方、変性低密度リポ蛋白質は、低密度リポ蛋白質受容体とは異なる受容体を介してマクロファージや血管内皮細胞に取り込まれることが知られていた。マクロファージでは既に構造が決定されている（例えば、特許文献１〜３参照）スカベンジャー受容体を介して変性低密度リポ蛋白質は取り込まれ、マクロファージは動脈硬化巣で特徴的な泡沫細胞へと変化する。血管内皮細胞にはこのスカベンジャー受容体は発現しておらず、別の構造を持った受容体が存在することが予想されていた（例えば、非特許文献１参照）。
このような点から血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体の構造、すなわち、アミノ酸配列の解明が重要であるが、これまで全く構造はわかっていなかった。
【０００３】
【特許文献１】特表平６−５００７６５号公報
【特許文献２】特表平６−５０８６０４号公報
【特許文献３】特開平３−２９０１８４号公報
【非特許文献１】荒井秀典、北徹、酸化ＬＤＬ、代謝２８／４、１９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体の構造を解明し、これにより血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードするＤＮＡ配列を提供することである。
また、本発明の目的は、変性低密度リポ蛋白質受容体またはその類似体を生産する方法を提供することでもある。
さらに、本発明の目的は、変性低密度リポ蛋白質受容体またはその類似体を含む蛋白質組成物を提供することでもある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者の研究により、血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体の構造が明らかとなった。血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体は、配列番号１、配列番号３または配列番号５に記載のアミノ酸配列を有している。
本発明は、哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードする領域から実質的になるＤＮＡ配列を提供するものである。
【０００６】
上記ＤＮＡ配列は、天然の哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体遺伝子のオープンリーディングフレームに由来するｃＤＮＡクローンであってもよい。また、上記ＤＮＡ配列は、上記ｃＤＮＡクローンとハイブリダイズできて、かつ生物学的活性を有する哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードしているＤＮＡ配列であってもよい。さらに、以上述べたようなＤＮＡ配列について、遺伝暗号の縮重の結果として、同じ変性低密度リポ蛋白質受容体をコードしているＤＮＡ配列であってもよい。
従って、本発明は、哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードする領域の配列番号１、配列番号３または配列番号５に示すＤＮＡ配列（当該塩基配列を有するＤＮＡ）、もしくはそのアナログにある。
また本発明は、哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードする領域の配列番号１、配列番号３または配列番号５に示すＤＮＡ配列を有するｃＤＮＡクローン、もしくはそのアナログにある。
また、本発明は、４２℃、２０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド水溶液中で、配列番号１、配列番号３または配列番号５に示すＤＮＡ配列のｃＤＮＡクローンとハイブリダイズでき、かつ哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質と結合する機能を有する蛋白質（即ち受容体）をコードしているＤＮＡ配列（当該塩基配列を有するＤＮＡ）にもある。
そしてまた、本発明は、配列番号１、配列番号３または配列番号５に示すＤＮＡ配列と遺伝的コードの結果として縮重していて、かつ哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質と結合する機能を有する蛋白質（即ち受容体）をコードしているＤＮＡ配列（当該塩基配列を有するＤＮＡ）にもある。
さらに本発明は、配列番号１、配列番号３または配列番号５に示す塩基配列を有するＤＮＡもしくはそのアナログに対応する変性低密度リポ蛋白質受容体（あるいは配列番号１、配列番号３または配列番号５に示すアミノ酸配列もしくはそのアナログを含む変性低密度リポ蛋白質受容体）の抗体にもある。
【発明の効果】
【０００７】
本発明が提供するＤＮＡ配列は発現ベクターに組込んで用いることができる。これにより、本発明は、この組換え発現ベクターを宿主細胞に挿入し、宿主細胞を、発現を引き起こす条件下で培養することからなる哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体またはその類似体を生産する方法も提供する。
さらに、本発明は、以上のように生産された生物学的活性を有する哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体またはその類似体を含む蛋白質組成物も提供する。
このように生産された哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体、その類似体およびそれらを含む蛋白質組成物は、哺乳類の変性低密度リポ蛋白質のアッセイに有用であり、また診断で用いる変性低密度リポ蛋白質受容体に対する抗体を調製する上でも有用である。
また、本発明の薬剤が動脈硬化症の疾患の診断に有効であることは、前述した変性低密度リポ蛋白質およびその受容体の生物学的活性から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本明細書において、「変性低密度リポ蛋白質受容体」とは、変性低密度リポ蛋白質に結合することができ、哺乳類の血管内皮細胞の細胞膜蛋白質と同様な本来の立体配置をとる際に、変性低密度リポ蛋白質分子によって与えられる情報を血管内皮細胞内に伝達する役割を持っている蛋白質を意味する。本明細書において用いる場合、この用語は、変性低密度リポ蛋白質に結合するか、あるいは情報伝達活性を有する天然蛋白質の類似物を含んでいる。
「変性低密度リポ蛋白質受容体のサブタイプ」とは、変性低密度リポ蛋白質受容体のうちで酸化変性低密度リポ蛋白質あるいはアセチル化変性低密度リポ蛋白質等の各種変性低密度リポ蛋白質に対して、異なる選択性、すなわち薬理学的親和性序列を示す各々の分子をいう。
【０００９】
本明細書において、ＤＮＡ配列において用いられる「コードする領域から実質的になる配列」等における『実質的に』の表現は、特定の対象となる配列、例えば変位配列で、本来の配列番号１、配列番号３または配列番号５に示す参照配列の１つ以上の置換、欠失あるいは付加によって変化したものであって、その全体としての作用が、参照配列と比較して不利な機能的相違をもたらさない配列も含むとの趣旨で用いられる。
具体的には後述する生物学的活性を有する、さらに具体的には、変性低密度リポ蛋白質と結合可能である範囲内で配列の変化が可能である。そのためには、変性低密度リポ蛋白質と結合する部分をコードする領域については、遺伝暗号の縮重を除き、配列番号１、配列番号３または配列番号５に示す参照配列と同じか、類似のアミノ酸への置換をもたらす程度の変更を加えた配列を有する必要がある。一方、上記以外の部分をコードする領域については、３０％以上（好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上）の相似性があればよい。
【００１０】
なお、上記の類似のアミノ酸への置換とは、天然のアミノ酸を下記の８群に分類する場合において、各群内におけるアミノ酸相互の置換を意味する。
（１）モノアミノモノカルボン酸
Gly Ala Val Leu Ile 
（２）オキシアミノ酸
Ser Thr 
（３）含硫アミノ酸
Cys Met 
（４）モノアミノジカルボン酸
Asp Glu 
（５）ジアミノモノカルボン酸
Lys Arg 
（６）芳香族環を有するアミノ酸
Phe Tyr 
（７）複素環を有するアミノ酸
His Try Pro 
（８）アミド基を有するアミノ酸
Asn Gln 
類似性を決定する目的においては、参照配列の短縮あるいは内在的欠失は無視してよい。配列の相似性が低い場合でも、同程度の生物学的活性を有し、同等の発現特性を有する配列は、実質的に同等な配列とみなす。
【００１１】
「生物学的に活性を有する」という用語は、変性低密度リポ蛋白質受容体の特性として用いられる場合、特定の分子が、変性低密度リポ蛋白質を結合可能であることが明らかにされている本発明の態様と充分なアミノ酸配列の類似性を有するか、あるいは混成受容体構成物の構成要素として細胞に変性低密度リポ蛋白質の刺激を伝達するために充分なアミノ酸配列の類似性を変性低密度リポ蛋白質受容体に対して有していることを意味する。
変性低密度リポ蛋白質を結合可能であるとは、具体的には、基準とする酸化変性低密度リポ蛋白質に対する親和性（解離定数）が１マイクロモル以下であることを意味する。本発明においては、その親和性が０．１マイクロモル以下であることが好ましく、０．０１マイクロモル以下であることがさらに好ましい。
生物学的活性は、変性低密度リポ蛋白質の結合に際して、血管内皮細胞内へ変性低密度リポ蛋白質の取り込みを促すことができることを意味する場合もある。
【００１２】
「ＤＮＡ配列」は、大きなＤＮＡ構成物から分離した断片あるいは構成要素として存在するＤＮＡポリマーを示しており、それらは少なくとも一度は実質的に純粋な形に単離されたＤＮＡを起源とする。すなわち、内在性物質の混入がない形で単離され、かつ同定、操作および標準的な生化学的方法、例えば、クローニングベクターを用いて、配列およびその構成要素である塩基配列が回収可能な程度の量あるいは濃度で存在する。こうした配列は、真核細胞遺伝子に典型的な内在性非翻訳配列（イントロン）によって中断されていないオープンリーディングフレームを持つ形で供給されることが好ましい。しかし、関連した配列を含んだ染色体ＤＮＡも用いられることは明らかである。非翻訳ＤＮＡは、オープンリーディングフレームの５’あるいは３’にあり、その場合、非翻訳配列はコード領域の操作あるいは発現の妨げとはならない。
「組換え発現ベクター」は（ａ）遺伝子発現における調節の役割を持つ要素、例えばプロモーター或いはエンハンサーのような単独または複数の遺伝的要素、（ｂ）ｍＲＮＡに転写され、蛋白質に翻訳される構造あるいはコード配列、及び（ｃ）適当な転写及び翻訳開始及び終止配列の集合を含む転写単位からなるプラスミドを示す。酵母の発現系で用いるための構造要素は、翻訳された蛋白質が宿主細胞によって細胞外に分泌されるためのリーダー配列を含んでいることが好ましい。組換え体蛋白質がリーダーあるいは輸送配列を持たずに発現された場合、その蛋白質はＮ−末端にメチオニン残基を含んでいる可能性がある。続いて、その残基は発現された組換え蛋白質から随意に切断され、最終産物を与える。
【００１３】
次に、変性低密度リポ蛋白質受容体をコードするｃＤＮＡの単離、およびＤＮＡ配列の決定について説明する。
培養ウシ大動脈内皮細胞から抽出したPoly (A)+ ＲＮＡの逆転写によって調製されたｃＤＮＡライブラリーから、ウシ変性低密度リポ蛋白質受容体をコードするＤＮＡ配列が単離された。このライブラリーは、ＳＶ４０、Ｉ型ヒトＴ細胞白血病ウイルス由来の調節配列を持った哺乳類発現べクター（ｐＭＥ１８Ｓ）を用いて、サルのＣＯＳ−７細胞に蓄積されたＤＮＡ断片よりｍＲＮＡを直接発現させることによってスクリーニングした。形質導入されたＣＯＳ−７細胞をＤｉＩ（1,1'-di-octadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate ）−酸化低密度リポ蛋白質を含む培地とともにインキュベートし、結合しなかったＤｉＩ−酸化低密度リポ蛋白質を除くために洗浄した後、トリプシン処理により細胞を浮遊状態にしてＦＡＣＳ(fluorescence-activated cell sorter)にかけ、ＤｉＩの蛍光を測定するとともに蛍光強度の高い細胞を回収した。形質導入細胞からプラスミドを抽出し、大腸菌を形質転換してプラスミドを精製し、再度上記の操作を繰り返した。このようにして４回この操作を繰り返すことにより、単一のクローンで変性低密度リポ蛋白質結合活性を持った表面蛋白質を合成することができた。このクローンは単離され、ウシの変性低密度リポ蛋白質受容体のｃＤＮＡ配列を決定するために挿入断片の配列が調べられた。
【００１４】
単離されたｃＤＮＡクローンをＣＯＳ−７細胞に導入し発現させたところ、この細胞は酸化低密度リポ蛋白質および酸化低密度リポ蛋白質に対する特異的結合活性を獲得し、これらの変性低密度リポ蛋白質は細胞内へと取り込まれた。さらにこのとき未変性の低密度リポ蛋白質に対する結合活性は見られず、変性した低密度リポ蛋白質に特異的な受容体と考えられる。
【００１５】
以上のように決定された変性低密度リポ蛋白質受容体をコードするＤＮＡ配列および相当するアミノ酸配列を配列番号１および配列番号３に示す。
ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列について説明する。
上記配列番号１及び３に示されるように、変性低密度リポ蛋白質受容体には少なくとも２種類のサブタイプが存在している。配列番号３は、配列番号１の２４番目のアミノ酸(Gly) の後に三アミノ酸(Thr Thr Gly) が挿入している以外は、配列番号１と同様である。本明細書において特に断らない場合は、配列番号１を基準に説明する。
最初のＡＴＧ（メチオニンをコードする開始コドン）からＴＧＡ（８１１−８１３）のストップコドンまで８１０ｂｐのオープンリーディングフレームが存在し、２７０アミノ酸残基がコードされている。このｃＤＮＡがコードしている変性低密度リポ蛋白質受容体ｍＲＮＡには過渡的に発現されるサイトカインや成長因子と同様に３’非翻訳領域にＡＵＵＵＡというｍＲＮＡを不安定化する配列が７ヶ所存在する。
このポリペプチドには、一ヶ所において２６個の疎水性アミノ酸（配列番号１におけるアミノ酸番号３１〜５６、配列番号３におけるアミノ酸番号３４〜５９）からなる膜貫通領域と思われる部分があり、膜貫通部分のＣ末端側に４つの糖鎖付加部位（配列番号１におけるアミノ酸番号６９、１３５、１７９および２０８、配列番号３におけるアミノ酸番号７２、１３８、１８２および２１１）が見出された。
【００１６】
次に、ヒト肺より抽出したPoly(A)+ＲＮＡの逆転写によって調製されたｃＤＮＡライブラリーから、ヒトの変性低密度リポ蛋白質受容体をコードするＤＮＡ配列が単離された。このライブラリーのスクリーニングは、ランダムプライマーを用いて[a-32P]dCTP により標識したpBMLR1のXhoI/PstI 切断断片とのプラークハイブリダイゼーション法により行った。ハイブリダイゼーションは50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1M NaCl, 1% SDS, 0.2g/l Yeast tRNA 中で55℃で行い、55℃の2xSSC/0.1% SDS中で１５分間３回洗浄した後、オートラジオグラフィーにより陽性クローンを同定した。このクローンは単離され、ヒトの変性低密度リポ蛋白質受容体のｃＤＮＡ配列を決定するために挿入断片の配列が調べられた。この配列は蛋白質をコードする領域の一部のみを含むと考えられた。そこで、ヒト胎盤より抽出したPoly(A)+ＲＮＡの逆転写によって調製されたｃＤＮＡより、得られた配列を元に５’−ＲＡＣＥ(rapid amplification of cDNA end) 法を用いて、蛋白質全体をコードする領域のｃＤＮＡを得て、配列が調べられた。
配列番号５がヒトの変性低密度リポ蛋白質受容体のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列である。
ヒトの配列は、ウシの配列と同様に、最初のＡＴＧ（メチオニンをコードする開始コドン）からＴＧＡ（８１１−８１３）まで、８１０ｂｐのオープンリーディングフレームが存在し、２７０アミノ酸残基がコードされている。
このｃＤＮＡがコードするポリペプチドには、ウシの配列と同様に一ヶ所において２７個の疎水性アミノ酸からなる膜貫通領域と思われる部分があり、膜貫通部分のＣ末端側に４つの糖鎖付加部位（アミノ酸番号６９、１３５、１７９および２０６）が見出された。
ウシおよびヒトのアミノ酸配列は、共にＣ型レクチンの細胞外ドメインに持っており、この部分（アミノ酸番号１４０−２７０）が変性ＬＤＬとの結合に重要と考えられる。従って、アミノ酸番号１４０−２７０の部分配列を有するペプチドも、変性ＬＤＬとの結合機能を有すると推定できる。
【００１７】
本発明は、以上述べた変性低密度リポ蛋白質受容体をコードするＤＮＡ配列、および上記アミノ酸番号１４０−２７０の部分配列をコードするＤＮＡ配列を提供する。このＤＮＡ配列は、哺乳類、微生物による調節を受ける組換え体転写単位、またはウイルスの転写或いは翻訳調節要素内で発現され得る形で提供されることが好ましい。例えば、微生物内で発現される配列は、イントロンを含まないものである。好ましい態様では、本ＤＮＡ配列は少なくとも１つ、しかし随意に１つ以上のｃＤＮＡ配列或いはそれについての複製由来の配列成分からなる。
このような配列は、合成オリゴヌクレオチドを組み上げることにより調製されたＤＮＡ配列に連結しているか、あるいは隣接している。しかし、主にオリゴヌクレオチドから組み上げられた合成遺伝子は、ここで与えられる配列情報を用いることにより構築することができる。典型的な配列は、前述したものと実質的に同一な配列を含んでいる。コード配列は、Ｎ−末端に位置する、例えばヌクレオチド配列上で翻訳フレームと連結したメチオニンを特定するＮ−末端のＡＴＧコドンのような、１つ以上の付加的アミノ酸をコードするコドンを含むことができる。遺伝子コードの縮重のため、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にも相当の多様性がある。前述した典型的なＤＮＡ配列以外の態様には、中等度にストリンジェントな条件（すなわち、４２℃、２０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド存在下）で、典型的なＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる配列が含まれる。その他の配列は生物学的な活性を有する変性低密度リポ蛋白質受容体ペプチドをコードする上記の配列に縮重している。
【００１８】
以上の配列は、微生物もしくはウイルスのオペロン由来の誘導可能な制御要素を含む組み換え転写単位中で発現させることが可能である。本発明はまた、有用な量の精製された変性低密度リポ蛋白質受容体を生産するための発現ベクターを提供する。本発明のベクターは、哺乳類、微生物、酵母、バクテリオファージあるいはウイルス遺伝子由来の調節要素に使用可能な状態に連結された哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体、あるいは生物学的に等価な類似物をコードする合成あるいはｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片からなることができる。使用できる調節要素は以下に詳細に述べる。適当な細胞系列への形質転換、形質導入あるいは感染によって、このようなベクターは組換え体蛋白質の発現を誘導することができる。
哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体は、適当なプロモーターの調節の下、哺乳類細胞、酵母、細菌、あるいはその他の細胞中で発現することができる。無細胞翻訳系によっても、本発明のＤＮＡ構成物由来のｍＲＮＡを用いて哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体を生産することができる。細菌、真菌、酵母および哺乳類細胞宿主に用いるための適当なクローニングおよび発現ベクターは、ポウエル（Pouwel）ら（Cloning Vectors: A Laboratory Manual, エルスビュー社、ニューヨーク州、(1985)）によって述べられている。
【００１９】
種々の哺乳類細胞培養系を組換え体蛋白質の発現に用いることができる。適当な哺乳類宿主細胞系列としては、グルツマン(Gluzman) （Cell, 23, 175 (1981)) により述べられたサル腎臓細胞のＣＯＳ−７系列および、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系列などのベクターを発現可能な細胞系列が含まれる。哺乳類発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサーのような非転写要素、５’あるいは３’に隣接する非転写配列、また必須のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー（splice donor）およびアクセプター部位のような５’或い３’の非翻訳配列、および終止配列等を含んでいる。例えば、ＳＶ４０複製開始点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位等のＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列は、異種ＤＮＡ配列の発現に必要とされるその他の遺伝的要素を与えるために用いられる。典型的なベクターは、岡山とバーグ（Berg）（Mol.  Cell. Biol., 3, 280 (1983)) によって明らかにされた通りに構築することができる。
【００２０】
Ｃ１２７ネズミ乳腺表皮細胞で、哺乳類受容体ｃＤＮＡを安定かつ高レベルに発現するために有用な系は、コスマン（Cosman）ら（Molecular Immunol., 23, 935 (1986)) により述べられていることに従って構築することができる。
酵母の系では、サッカロミセス・セレビシエのようなサッカロミセス属の種を用いることが好ましい。ピキア（Pichia）あるいはクリュベロミセス（Kluyveromyces ）等の、他の属の酵母も、組換え体蛋白質の生産株として用いることができる。
一般に、有用な酵母ベクターは複製開始点と、例えば大腸菌のアンピシリン耐性Ａｍｐr 遺伝子とサッカロミセス・セレビシエのＴＲＰ１遺伝子のような、酵母と大腸菌の両方で形質転換に用いることが可能な選択マーカー及び下流の構造遺伝子の転写を誘導する酵母の高発現遺伝子由来のプロモーターを含んでいる。このようなプロモーターは３−ホスホグリセリン酸リン酸化酵素で、α−因子、酸性ホスファターゼおよび熱ショック蛋白質等、高率で発現される遺伝子をコードする酵母の転写単位に由来する。この異種構造配列は、翻訳開始および終止配列並びに好ましくは、翻訳された蛋白質を細胞外の培地中へ分泌することを可能にするリーダー配列とともに適当なフレームに組み上げられる。上記の異質配列は、Ｎ−末端の同定可能なペプチドまたは、例えば発現された組換え体産物の安定化を行う、あるいは精製が単純になるような所望の特徴を与える配列を含む融合蛋白質をコードすることも任意に可能である。
【００２１】
有用な酵母ベクターは、大腸菌内での選択および複製のためにｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐr 遺伝子と複製開始点）およびグルコースによって抑制されるアルコール脱水素酵素２（ＡＤＨ２）プロモーターを含む酵母のＤＮＡ配列を用いることにより組み上げることができる。ＡＤＨ２プロモーターはルッセル（Russell ）ら（J. Biol. Chem., 258, 2674 (1982)) とベイヤー（Beier ）ら（Nature, 300, 724 (1982))によって開示されている。これらのベクターはまた、酵母ＴＲＰ１遺伝子を選択マーカーとして持ち、酵母２μ複製開始点を含んでいる。酵母リーダー配列、例えば酵母宿主からの異種蛋白質の分泌を導くα−因子のリーダーは、プロモーターと発現される構造遺伝子との間に挿入することができる（U.S. Patent No. 4,546,082 ；Kurianet al., Cell, 30, 933 (1982)；およびBittner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 983(1984)）。
リーダー配列はその３’末端付近に、外来の遺伝子とそのリーダー配列の融合を促進するための、一つ以上の有用な制限酵素切断部位を含むように修飾することができる。
【００２２】
適当な酵母の形質転換法は当業者にはよく知られている；典型的な技法は、ヒネン(Hinnen)ら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1978)によって述べられており、トリプトファン陽性となった形質転換体を、０．６７％酵母窒素源、０．５％カザアミノ酸、２％ブドウ糖、１０μｇ／ｍｌアデニン、２０μｇ／ｍｌウラシルからなる選択培地上で選択する。
ＡＤＨ２プロモーターからなるベクターによって形質転換された宿主株は、１％酵母抽出物、２％ペプトン、１％ブドウ糖、８０μｇ／ｍｌアデニン、８０μｇ／ｍｌウラシルを含む栄養豊富な培地で発現のために生育させる。ＡＤＨ２プロモーターの脱制御は培地中のブドウ糖が消費されてしまったときに起きる。粗酵母上清は濾過によって集められ、続いての精製の前に４℃に保つ。
【００２３】
細菌で使用する有用な発現ベクターは、哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードするＤＮＡ配列を適当な翻訳開始および終止信号とともに機能を持つプロモーターに読み枠を合わせて挿入することによって構築される。本ベクターは、一つ以上の表現型の選択マーカーと宿主内での増殖を保証する複製開始点を含んでいる。形質転換に適した原核生物宿主には、大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis) 、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)、およびシュードモナス(Pseudomonas) 属に含まれる様々な種ストレプトマイセス(Streptomyces)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)などが含まれるが、他のものも選択の対象として取ることもできる。
発現ベクターは、成熟蛋白質のＮ−末端残基をコードするコドンに近い部位でｃＤＮＡを切断することによって都合良く構築される。次いで、コード領域の欠失した部分を「埋め合わせる」ため、或いは発現ベクター中の適当な読み枠や開始メチオニンを特定するコドンとなるようにコード断片を連結するための連結配列を提供するために合成オリゴヌクレオチドを用いることも随時可能である。
【００２４】
制限的な例としてではなく典型的なものとしては、細菌で用いる有用な発現ベクターは、良く知られたクローニングベクターであるｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的要素からなる市販のプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌の複製開始点を含むことができる。こうした市販のベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３ｐ（ファルマシア・ファインケミカルズ、ウプサラ、スウェーデン）およびｐＧＥＭ１（プロジェマ・バイオテック、マジソン、ワイオミング州、米国）などを含んでいる。これらのｐＢＲ３２２の「主鎖」部分は、適当なプロモーターおよび発現される構造配列と結合している。
特に有用な細菌の発現系は、λファージのＰL プロモーターとｃ１８５７熱不安定なリプレッサーを用いている。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得られるλＰL 由来のプロモーターを取り入れたプラスミドベクターには、大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０９２）に内在した形のｐＨＵＢ２プラスミドと大腸菌株ＲＲ１（ＡＴＣＣ５３０８２）に内在した形のｐＰＬｃ２８がある。大腸菌内での発現に有用なその他のプロモーターとしては、スツデェー(Studier) ら(J. Mol. Biol. 189:113,1986)によって述べられているＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、ラウェー(Lauer)(J. Appl. Genet. 1:139-147, 1981)によって記載されておりＡＴＣＣ３７１２１として得られるｌａｃＺプロモーター及びマニアチス(Maniatis)(Molecular Coloning;A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.p.412) によって述べられているＡＴＣＣ３７１３８として得られるｔａｃプロモーターがある。
【００２５】
適当な宿主株を形質転換し適当な細胞濃度までその宿主株を増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法（例えば、温度シフトあるいは化学的誘導）で脱抑制し、細菌を更に短期間培養する。細胞は普通遠心により集め、物理的あるいは化学的方法で破砕し、その結果生じた粗抽出液をその後の精製のために残しておく。例えば、細胞を最大の通気と激しい撹拌を行なう条件下で、１０リットルの培養器中で増殖させる。消泡剤(Antifoam A)を用いるのが好ましい。培養はモット(Mott)ら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:88, 1985)によって開示された超誘導培地中３０℃で行なうか、あるいはそれに代るものとしては、抗生物質を含んだ培地で培養し、Ａ600 が０．４−０．５に相当する細胞濃度で温度を４２℃にあげることによって脱抑制し、次いで温度シフト後、３−６時間が好ましいが、２−２０時間の間に細胞を集める。細胞は、初め濾過あるいはその他の方法で濃縮し、次に１０．０００ｘｇで１０分間、４℃で遠心後、直ちに細胞のペレットを凍結する。
好ましくは、精製された哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体あるいは生物学的に等価な類似体は、培養液から精製される本発明の合成遺伝子の組換え体翻訳産物を発現するために適した宿主／ベクター系を培養することによって調製される。
【００２６】
精製された変性低密度リポ蛋白質受容体を生産する別の方法は、細胞培養上清あるいは抽出液からの精製を含んでいる。この方法では、有用な量の蛋白質を作る細胞系列を用いる。そのような細胞系列からの上清は、例えばアミコン社あるいはミリポア・ファルコン社の限外濾過装置と言った市販の蛋白質濃縮濾紙を用いて随時濃縮することができる。濃縮操作に続き、濃縮液を既に述べたような適当な精製用マトリックスにかける。例えば、適当なアフィニティーマトリックスは、適当な支持体に結合した変性低密度リポ蛋白質受容体あるいはレクチンまたは抗体分子などから成っている。それに代るものとして、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を持つ担体あるいはマトリックスのような陰イオン交換樹脂が用いられる。マトリックスとしては、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースあるいはその他の蛋白質精製に通常用いられているようなものが使用可能である。また、その代りとして、陽イオン交換樹脂を用いることも可能である。適当な陽イオン交換体としては、スルフォプロピル基あるいはカルボキシメチル基からなる種々の不溶性マトリックスを含んでいるスルフォプロピル基が好ましい。
最後に、メチルあるいはその他の脂肪族基を有するシリカゲルなどの疎水性充填剤ＲＰ−ＨＰＬＣを用いた一種以上の逆相系高速液体クロマトグラフィーＲＰ−ＨＰＬＣを、変性低密度リポ蛋白質受容体組成物を更に精製するために用いることが可能である。上述の精製段階のいくつかあるいは全てを様々に組み合わせることにより、均一な組換え体蛋白質を得ることが可能だろう。
【００２７】
細菌の培養で生産された組換え体蛋白質は通常細胞ペレットからの抽出を始めとして、一工程以上の濃縮、塩析、水相のイオン交換あるいはゲル濾過クロマトフラフィーの段階を経て単離される。最後に、高速液体クロマログラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製段階として用いることができる。組換え体哺乳類変性低密度リポ蛋白質受容体の発現に用いられた微生物細胞は、凍結−融解の繰り返し、超音波処理、物理的破砕、あるいは細胞溶解試薬を用いるなど、どのような都合の良い方法によっても破壊することができる。
哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体を分泌タンパクとして発現する酵母の発酵は精製を大いに容易にしている。大規模な発酵の結果得られる分泌された組換え体蛋白質はウルダル(Urdal) ら(J. Chromatog. 296:171,1984)によって明らかにされた方法と類似した方法によって精製することが可能である。この引用文献には、組換え体ヒトＧＭ−ＣＳＦの精製のための調製用ＨＰＬＣカラムにおける、二段階の連続した逆相系ＨＰＬＣ処理が述べられている。
【００２８】
種々の態様において、本発明は内在性物質の混入無しに、実質的に均一で、本来のグリコシル化様式を伴なったあるいは伴なわない組換え体哺乳類変性低密度リポ蛋白質受容体ポリペプチドを提供している。
本発明における組換え体である変性低密度リポ蛋白質受容体の蛋白質には、微生物中での発現あるいは微生物によって発現された蛋白質の精製を助けるような適当なペプチドあるいは蛋白質配列と融合された蛋白質として発現した哺乳類の変性低密度リポ蛋白質受容体も本発明により意図されているものである。
本発明の蛋白質の生物学的に等価な類似体とは、生物学的活性に不要な末端、あるいは細胞内側の残基または配列が削られた変性低密度リポ蛋白質受容体のような短縮された種々の類似体を含んでいる。
ここで用いられている「変異アミノ酸配列」とは、天然の配列から故意に作られた変種のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを示している。「変異蛋白質」あるいは「類似体」は、変異アミノ酸配列を含む蛋白質を意味している。「天然の配列」は野生型あるいは天然の形の遺伝子または蛋白質と同一なアミノ酸配列あるいはヌクレオチド配列を示している。
【００２９】
変性低密度リポ蛋白質受容体の蛋白質を適当なプロテアーゼで切断するか、あるいは、変性低密度リポ蛋白質受容体の一部を組み替えＤＮＡの方法により大腸菌や哺乳動物等に発現させて、可溶化したペプチド断片を得てもよい。そのようなペプチド断片も、前述した定義を有する限り、すなわち、変性低密度リポ蛋白質と結合可能である限り、本発明の範囲に含まれる。
受容体を可溶化することにより、可溶化したペプチド断片を変性低密度リポ蛋白質に結合させて、リポ蛋白質を不活性化することが可能になる。すなわち、ペプチド断片を、変性低密度リポ蛋白質を原因とする疾患の治療に用いることが可能である。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例について説明する。以下の実施例において、ウシ大動脈内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列を解明した。このようにして、配列番号１または配列番号３に示される配列が解明された結果、ヒトの哺乳類の内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列（すなわち配列番号５）の解明は、容易に実施することができた。他の哺乳類の内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列の解明も、同様に容易に実施できる。
具体的には、他の哺乳類の内皮細胞あるいは適当な臓器より抽出したｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡから、配列番号１、配列番号３または配列番号５に示されるＤＮＡ配列とハイブリダイズできるものを選択することにより、他の哺乳類の内皮細胞の変性低密度リポ蛋白質受容体をコードするＤＮＡを得ることができる。これは、下記実施例１のように、手掛かりとなる配列が存在していない状況から該当するＤＮＡを選択する場合と異なり、当業者であれば実施が容易である。
また、得られた配列の分析も、配列番号１、配列番号３または配列番号５に示されるＤＮＡ配列を参照することにより、下記実施例１の場合（参照すべき配列がない状況）よりも、容易に実施できる。
なお、以下の実施例では、酸化低密度リポ蛋白質結合に関してアッセイを実施したが、アセチル化低密度リポ蛋白結合に関するアッセイも同様に実施できる。
【００３１】
［実施例１］
Chomczynski ら（Biotechniques 15, 532 (1993)）と同様の手法を用いて培養ウシ大動脈内皮細胞より抽出した全ＲＮＡから単離したPoly（Ａ）+ の付加したｍＲＮＡを逆転写することによりｃＤＮＡライブラリーを作製した。具体的には、細胞を酸性イソチアン酸グアニジウム／フェノール溶液中で溶かし、溶解物にクロロホルムを加え、水層と有機層を遠心分離した。水層を回収し、アルコール沈澱によりさらに精製した。オリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーによりｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡを単離し、二本鎖ｃＤＮＡは、グブラー（Gubler）とホフマン（Hoffman)(Gene, 25, 263 (1983) ）と同様の方法で調製した。具体的には、ＲＮＡはオリゴｄＴまたはランダムオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて逆転写酵素により、ｃＤＮＡに複製した。ｃＤＮＡを大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩとＲＮａｓｅＨと共にインキュベーションすることにより二本鎖にし、その末端はさらにＴ4 ＤＮＡポリメラーゼとインキュベーションすることにより平滑化した。平滑末端を持つこれらのｃＤＮＡに、ＢｓｔＸＩリンカーを付加した後、セファクリル(sephacryl) Ｓ−５００ＨＲによるゲル濾過クロマトグラフィーにより短いものを排除した。そして哺乳動物細胞用高発現プラスミドベクターｐＭＥ１８Ｓに結合させた。このｐＭＥ１８Ｓの模式図を図１（東京医科歯科大学、丸山博士より入手）に示す。
【００３２】
ｐＭＥ１８ＳベクターはＳＶ４０の複製起点、ＳＶ４０／ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１プロモーターを含んで創製された３．４ｋｂのプラスミドベクターである。
以上のようにしてできたｐＭＥ１８Ｓ上のウシ大動脈ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌(E. coli. ElectroMax DH 10B)を形質転換するのに用い、約７×１０５ のコロニーを得た。これらの組換え体を５００ｍｌの２ｘＹＴ中で３７℃にて振とう培養し、プラスミドＤＮＡをＣｓＣｌ密度勾配遠心にて調製した。Lipofectamine を用いてサルのＣＯＳ−７細胞の集密的になっていない（サブコンフルエント）細胞単層にトランスフェクトした。次に導入された配列が過渡的な発現をできるように細胞を３日間培養し、各プレートの細胞の単層を以下のように酸化低密度リポ蛋白質結合に関してアッセイした。
【００３３】
プレートに、１５μｇのＤｉＩ標識酸化低密度リポ蛋白質を含む１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地５ｍｌを加え、３７℃、５％ＣＯ２下で１２時間インキュベートした。次にこの培地を除き、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄後、トリプシン処理により細胞をプレートからはがした。この細胞をＦＡＣＳにかけ、ＤｉＩの蛍光を測定するとともに、蛍光強度の高い細胞を回収した。回収した細胞からプラスミドを抽出し、上記の操作を４回繰り返した。このようにしてライブラリーから約７×１０５の組換え体をスクリーンした後、酸化低密度リポ蛋白質受容体の発現を誘導することのできる単一のクローンｐＢＬＯＸ−１が導入されたＣＯＳ−７組換え体を得た。
図２は、ｐＢＬＯＸ−１を導入したＣＯＳ−７細胞および導入していない対照のＣＯＳ−７細胞のＦＡＣＳによる蛍光強度分布を示すグラフである。
クローンｐＢＬＯＸ−１の挿入断片はBluescriptII SK-プラスミドにサブクローンし、ダイデオキシ法によってＤＮＡ配列を決定した（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977))。
【００３４】
［実施例２］
受容体ｃＤＮＡを使用したノーザンブロットによる各組織での発現状態
前記のような方法でウシの各組織からｐｏｌｙ（Ａ)+ＲＮＡを抽出し、それぞれ５μｇずつをホルムアルデヒド／１．１％アガロースゲル電気泳動で分離した後、ジーンスクリーンプラス膜(NEN, DuPont) に転写した。１．８ｋｂのｃＤＮＡ断片をランダムプライム法によってα−３２Ｐ−ｄＣＴＰで８×１０８ ｃ．ｐ．ｍ．／ｍｇになるようにラベルしプローブとして用いた。ハイブリダイゼーションは１Ｍ塩化ナトリウム／１％ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ溶液中で６０℃で行ない、２×ＳＳＣ／１％ＳＤＳにより洗浄した。オートラジオグラフィーは８時間行なった。
１１のウシ組織から抽出したpoly（Ａ)+ＲＮＡに対してノーザンブロットを行なったところ、多量の発現がみられたのは培養内皮細胞と肺であった。
【００３５】
［実施例３］
ＣＨＯ−Ｋ１細胞による変性低密度リポ蛋白質受容体の発現
変性低密度リポ蛋白質受容体ｃＤＮＡ挿入断片を、ｂｓｒ(blasticidin S-resistance)遺伝子とＳＶ４０ウイルス由来のプロモーターを含む発現ベクターｐＳＶ２ｂｓｒと変性低密度リポ蛋白質受容体発現プラスミドｐＢＬＯＸ−１を用いて、変性低密度リポ蛋白質受容体発現細胞を作成した。
ＣＨＯ（chinese hamster ovary ）Ｋ１細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＨａｍＦ１２培地で、サブコンフルエント（subconfluent）に単層培養した。
変性低密度リポ蛋白質受容体発現プラスミドｐＢＬＯＸ−１とｐＳＶ２ｂｓｒをLipofectamine により、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を２４時間後、約１０倍の培養面積にまき直し、さらに２４時間待って細胞が充分接着した後、培地を５μｇのblasticidin S 含有上記培地に替えた。
【００３６】
これによって、トランスフェクションされたｂｓｒ遺伝子がゲノムに組み込まれた細胞のみが増殖し、コロニーを形成した。
充分に成長したコロニーをペニシリンカップ法によりトリプシンにてはがし、１２穴プレートにまき直して同じ培地で増殖させた。
こうして単離したクローナルな細胞が、実際に変性低密度リポ蛋白質受容体を発現していることを、前記のようにＤｉＩ標識変性低密度リポ蛋白質取り込みによる細胞質内蛍光強度上昇を蛍光顕微鏡を用いて観察することにより確認した。蛍光顕微鏡写真を図３に示す。
【００３７】
［実施例４］
可溶性変性低密度リポ蛋白質受容体の作成
変性低密度リポ蛋白質受容体ｃＤＮＡをＰＣＲ法により、プライマーペア(5'-gcggatcctgtgctctcaatagattcgc-3',5'-ggggatcctgatctcataaagaaacag-3')を用いて、細胞外ドメイン（変性低密度リポ蛋白質との結合部分を含む）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１の塩基配列の１６０〜８１３）をBamHI の制限酵素部位を付けて増殖し、BamHI で消化した後、ヒスチジンの６回繰り返し配列をｔａｇとして大腸菌に蛋白を発現するベクターｐＱＥ１０（Qiagen社製）のBamHI siteに挿入した。このプラスミドを大腸菌株XL-2Blueにトランスフォーム後、２ｘＹＴ培地にて３７℃で振とう培養した。６００ｎｍの吸光度が０．６になったところでＩＰＴＧ（isopropylthio-β-D-galactoside）を１ｍＭの濃度で加え、３０℃で２０時間さらに培養した。大腸菌を遠心にて回収し、６Ｍ塩酸グアニジン、０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム、０．０１Ｍトリス（ｐＨ８．０）にて溶解した。不溶物を遠心にて除去後、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen社製）を加え、可溶性変性低密度リポ蛋白質受容体を吸着させた。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを８Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム、０．０１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、および８Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム、０．０１Ｍトリス（ｐＨ６．３）にて洗浄後、８Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム、０．０１Ｍトリス、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．３）にて可溶性変性低密度リポ蛋白質受容体を溶出し、精製した。上記の操作により得られた可溶性変性低密度リポ蛋白質受容体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて均一な標品であることが示された。
なお、ｔａｇは、ＧＳＴやｃ−ｍｙｃ等、他のものを用いてもよい。この場合は、精製法もそれに応じて、抗体等を用いた方法を用いることができる。また、適当な哺乳動物発現用ベクターを用いれば、組み替えＤＮＡの操作により、同様に可溶性変性低密度リポ蛋白質受容体を作成することができる。
【００３８】
［実施例５］
抗ＬＯＸ−１抗体の作成
ポリメラーゼチェーン反応によりウシＬＯＸ−１ｃＤＮＡの細胞外ドメインをコードする領域（アミノ酸61-270）を、ＢａｍＨＩを付加した２つのプライマー 5'-ggggatcctgatctcataaagaaacag-3'と5'-gcggatcctgtgctctcaatagattcgc-3'により増幅した。増幅したｃＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで消化した後、キアゲン(QIAGEN)社のｐＱＥ１０ベクターのＢａｍＨＩ部位にサブクローンした。細胞外ドメイン蛋白の合成と生成はキアゲン社のQIA express systemを用いて行なった。実際には、上記のプラスミドによりストラタジーン(Stratagene)社の大腸菌株ＸＬ−１ blue を形質転換し、２ｘＹＴ培地にて培養した。蛋白の合成は、イソプロピル・チオ−β−Ｄ−ガラクトシドを最終濃度２ｍＭで加えることで誘導した。
細胞を遠心分離により回収し、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、０．１Ｍリン酸ナトリウム、および０．０１Ｍ−Ｔｒｉｓ・ＨＣl を含むｐＨ８．０の溶液に溶解後、キアゲン社のＮi-ＮＴＡ樹脂カラムにかけてカラムクロマトグラフィーを行なった。次いで、８Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸ナトリウム、及び０．０１Ｍ−Ｔｒｉｓ・ＨＣl を含むｐＨ６．３の水溶液でカラムを洗浄した後、蛋白質を８Ｍ尿素、０．１Ｍ−ＥＤＴＡ、０．１Ｍリン酸ナトリウム、及び０．０１Ｍ−Ｔｒｉｓ・ＨＣl を含むｐＨ６．３の溶液を用いて溶出した。バッファーを、アミコン社のCentriprep 10 にてリン酸塩緩衝生理食塩水に交換し、蛋白質を等容量のフロイント・コンプリート・アジュバントでエマルジョンにして、ウサギの肩甲骨脊椎間の皮内に隔週で接種することで免疫を行った。
免疫染色
培養ウシ大動脈内皮細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルバッファーにて直接溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ナイロン膜に転写した。雪印乳業株式会社製のブロックエースにてブロッキングした後、ベクトール(Vector)社の免疫染色キットを用い、ペルオキシダーゼ抱合アビジン・ビオチン複合体による標準的な方法により、上記のウサギから得られた抗血清の染色を行った。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施例１で用いた哺乳動物細胞用高発現プラスミドベクターｐＭＥ１８Ｓの模式図である。
【図２】ｐＢＬＯＸ−１を導入したＣＯＳ−７細胞および導入していない対照のＣＯＳ−７細胞のＦＡＣＳによる蛍光強度分布を示すグラフである。
【図３】ＤｉＩ標識変性低密度リポ蛋白質投与による細胞質内蛍光強度上昇を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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