(57)【要約】【課題】  大規模な設備を必要とせずに簡便な方法で効率的に得られ、かつ、不純物の含有量が極めて低減された低分子ヘパリンまたはその塩、これを含有する医薬品組成物、ならびに低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法を提供する。【解決手段】  本発明の低分子ヘパリンまたはその塩は、ヘパリンおよび／またはその塩を低分子化し、還元剤を用いて処理を行ない、前記還元剤を除去および／または分解した後、前記溶液のｐＨを４以下に調整することにより得られる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリンおよび／またはその塩を低分子化し、還元剤を用いて処理を行ない、前記還元剤を除去および／または分解した後、溶液のｐＨを４以下に調整することにより得られる、低分子ヘパリンまたはその塩。
【請求項２】
請求項１において、
前記低分子化は、前記ヘパリンおよび／またはその塩と亜硝酸塩との反応により行なわれる、低分子ヘパリンまたはその塩。
【請求項３】
請求項２において、
前記亜硝酸塩の含有量が５ｐｐｍ以下である、低分子ヘパリンまたはその塩。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかにおいて、
前記溶液のｐＨを４以下に調整し、次いで前記溶液のｐＨを５．５〜８に調整した後、溶剤を加えて沈殿物を生じさせ、該沈殿物を回収することにより得られる、低分子ヘパリンまたはその塩。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかにおいて、
前記溶剤がエタノール、メタノール、およびアセトンから選択される少なくとも１種である、低分子ヘパリンまたはその塩。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかにおいて、
前記溶液のｐＨを４以下に調整する際、ｐＨを２．５以下に調整することにより得られる、低分子ヘパリンまたはその塩。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかにおいて、
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて３．６５−３．７５ｐｐｍの範囲に一重線ピークが実質的に検出されず、かつ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて６１．５−６２．５ｐｐｍの範囲にピークが実質的に検出されない、低分子ヘパリンまたはその塩。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかに記載の低分子ヘパリンまたはその塩を有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項９】
（１）ヘパリンおよび／またはその塩を低分子化した後、還元剤と反応させる工程、および
（２）前記還元剤を除去および／または分解した後、前記溶液のｐＨを４以下に調整する工程
を含む、低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法。
【請求項１０】
請求項９において、
前記工程（２）の後に、（３）前記溶液のｐＨを５．５〜８に調整した後、溶剤を加えて沈殿物を生じさせ、該沈殿物を回収する工程をさらに含む、低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法。
【請求項１１】
請求項９または１０において、
前記工程（２）における前記溶液のｐＨを４以下に調整する工程と、前記工程（３）とを１セットとして、前記セットを複数回繰り返し行なう、低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法。
【請求項１２】
請求項９ないし１１のいずれかにおいて、
前記低分子化は、前記ヘパリンおよび／またはその塩と亜硝酸塩との反応により行なわれる、低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法。
【請求項１３】
請求項１２において、
前記亜硝酸塩の含有量が５ｐｐｍ以下である、低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法。
【請求項１４】
請求項９ないし１３のいずれかにおいて、
前記工程（２）において、前記溶液のｐＨを４以下に調整する際、ｐＨを２．５以下に調整する、低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子化されたヘパリンまたはその塩、ならびにその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは、広い分子量分布を有する平均相対分子量１０,０００〜３０,０００のムコ多糖類の一種で、動物の生体組織（例えば、腸粘膜、肺、脾臓、肝臓、筋肉、腱）や細胞（例えば、肥満細胞）に広く存在する。ヘパリンは、強い血液抗凝固作用を有することから、心筋梗塞、脳塞栓等の種々の血栓塞栓症の治療および予防のほか、血液透析、輸血、血液検査等の際における血管カテーテルまたは注射針の挿入時において、血液凝固防止に用いられている。
【０００３】
特に、血液透析装置や人口心肺装置等の体外循環装置の使用時においては、透析膜や濾過膜上で灌流血液が凝固することにより、前記膜が目詰まりを起こすことがある。これを防止するためには、血液の凝固能を制御する必要がある。
【０００４】
一方、一定範囲内の分子量に調整された低分子ヘパリンは、血液抗凝固活性および抗血栓作用を保持しつつ、出血を助長する作用が少ないという特徴を有する。このため、低分子ヘパリンは、心筋梗塞、脳塞栓等の種々の血栓塞栓症の治療および予防のほか、血液透析装置や人口心肺装置等の体外循環装置使用時に好適に使用されている。
【０００５】
高精製度の低分子ヘパリンを効率良く製造する方法として、例えば、透析膜を用いた精製方法が挙げられる（特許文献１参照）。しかしながら、この方法によって、低分子ヘパリンまたはその塩を工業的に製造するためには大規模な工業設備を要するため、コストや設備面で容易に実施することが難しい。
【特許文献１】特許２６２８５０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、大規模な設備を必要とせずに簡便な方法で効率的に得られ、かつ不純物の含有量が極めて低減された低分子ヘパリンまたはその塩、これを含有する医薬品組成物、ならびに低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記目的を達成すべく、ヘパリンまたはその塩を低分子化する方法について鋭意研究を重ねた結果、ヘパリンおよび／またはその塩を低分子化し、還元剤を用いて処理を行ない、前記還元剤を除去および／または分解した後、溶液のｐＨを４以下に調整することにより、収率を低下させることなく不純物の含有量を効果的に低減できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明の低分子ヘパリンまたはその塩は、ヘパリンおよび／またはその塩を低分子化し、還元剤を用いて処理を行ない、前記還元剤を除去および／または分解した後、溶液のｐＨを４以下に調整することにより得られる。
【０００９】
ここで、上記本発明の低分子ヘパリンまたはその塩において、前記低分子化は、前記ヘパリンおよび／またはその塩と亜硝酸塩との反応により行なわれることができる。
【００１０】
ここで、上記本発明の低分子ヘパリンまたはその塩において、前記亜硝酸塩の含有量が５ｐｐｍ以下であることができる。
【００１１】
ここで、上記本発明の低分子ヘパリンまたはその塩において、前記溶液のｐＨを４以下に調整し、次いで前記溶液のｐＨを５．５〜８に調整した後、溶剤を加えて沈殿物を生じさせ、該沈殿物を回収することにより得ることができる。この場合、前記溶剤がエタノール、メタノール、およびアセトンから選択される少なくとも１種であることができる。
【００１２】
ここで、上記本発明の低分子ヘパリンまたはその塩において、前記溶液のｐＨを４以下に調整する際、ｐＨを２．５以下に調整することにより得ることができる。
【００１３】
ここで、上記本発明の低分子ヘパリンまたはその塩において、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて３．６５−３．７５ｐｐｍの範囲に一重線ピークが実質的に検出されず、かつ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて６１．５−６２．５ｐｐｍの範囲にピークが実質的に検出されないことができる。
【００１４】
本発明の医薬組成物は、上記本発明の低分子ヘパリンまたはその塩を有効成分として含有する。
【００１５】
本発明の低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法は、
（１）ヘパリンおよび／またはその塩を低分子化した後、還元剤と反応させる工程、および
（２）前記還元剤を除去および／または分解した後、前記溶液のｐＨを４以下に調整する工程
を含む。
【００１６】
ここで、上記本発明の低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法において、前記工程（２）の後に、（３）前記溶液のｐＨを５．５〜８に調整した後、溶剤を加えて沈殿物を生じさせ、該沈殿物を回収する工程をさらに含むことができる。
【００１７】
ここで、上記本発明の低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法において、前記工程（２）における前記溶液のｐＨを４以下に調整する工程と、前記工程（３）とを１セットとして、前記セットを複数回繰り返し行なうことができる。
【００１８】
ここで、上記本発明の低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法において、前記低分子化は、前記ヘパリンおよび／またはその塩と亜硝酸塩との反応により行なわれることができる。
【００１９】
この場合、前記亜硝酸塩の含有量が５ｐｐｍ以下であることができる。
【００２０】
ここで、上記本発明の低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法において、前記工程（２）において、前記溶液のｐＨを４以下に調整する際、ｐＨを２．５以下に調整することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の低分子ヘパリンまたはその塩によれば、大規模な設備を必要とせずに簡便な方法で効率的に得られ、かつ、不純物の含有量が極めて低減されている。
【００２２】
本発明の低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法によれば、簡便で効率的に精製することができることから、大規模な設備を要せず、長時間の精製工程を経ることなく、かつ、収率を低下させることなく、低分子ヘパリンまたはその塩を経済的に得ることができる。
【００２３】
本発明の医薬組成物によれば、上記本発明の低分子ヘパリンまたはその塩を有効成分として含有することにより、抗凝固作用を発揮することができ、かつ、出血との相関性が示唆される活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）延長作用が弱い。すなわち、本発明の医薬組成物によれば、出血を助長することなく、血液凝固作用および抗血栓作用を奏することができる。より具体的には、本発明の医薬組成物は、血液体外循環時の灌流血液の凝固ならびに汎発性血管内血液凝固症の防止のために使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下本発明を説明する。なお、本発明において「％」は「質量％」、「部」は「質量部」を意味する。
【００２５】
１．低分子ヘパリンおよびその塩
本発明の低分子ヘパリンまたはその塩（以下、「低分子ヘパリン等」ともいう）は、ヘパリンおよび／またはその塩を低分子化し、還元剤を用いて処理を行ない、前記還元剤を除去および／または分解した後、溶液のｐＨを４以下に調整することにより得られる。
【００２６】
本発明において、「ヘパリン」とは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがα１→４結合した２糖構造単位と、イズロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがα１→４結合した２糖構造単位とを含む多糖類である。なお、ヘパリンにおいては、Ｎ−アセチルグルコサミンのＣ６位の水酸基およびＣ２位のアミノ基の少なくとも一方が硫酸エステル化されていてもよく、また、グルクロン酸またはイズロン酸のＣ２位の水酸基が硫酸エステル化されていてもよい。
【００２７】
また、本発明において「ヘパリン塩」としては、特に限定されないが、薬学上許容しうる塩であることが好ましく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、バリウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００２８】
１．１．原料
本発明の低分子ヘパリン等の原料として使用可能なヘパリンおよびその塩（以下、「原料ヘパリンおよびその塩」または「原料ヘパリン等」ともいう）は、平均相対分子量が１０，０００〜３０，０００であり、平均相対分子量が１０，０００〜２０，０００であるものを使用するのが好ましい。
【００２９】
本発明に使用する原料ヘパリンおよびその塩としては、当該粗抽出物および精製物のいずれを用いてもよい。ヘパリンは、動物の器官内に広く分布している。例えば、本発明に使用する原料ヘパリンおよびその塩としては、ブタ腸粘膜由来のものを用いることができる。
【００３０】
１．２．低分子ヘパリンまたはその塩
本発明において、「低分子ヘパリンまたはその塩」は、原料ヘパリンおよびその塩よりも分子量が低減されたものをいう。
【００３１】
本発明の低分子ヘパリンまたはその塩は、平均相対分子量が通常２，０００〜１０，０００であり、好ましくは３，０００〜８，０００であり、より好ましくは４，０００〜６，０００である。
【００３２】
また、本発明の低分子ヘパリンまたはその塩は、異なる分子量を有するものの混合物であり、その９０％が分子量２，０００〜９，０００の間に分布していることが好ましい。
【００３３】
また、本発明の低分子ヘパリン塩としては、特に限定されないが、本発明の低分子ヘパリンの薬学上許容しうる塩であることが好ましい。薬学上許容しうる塩としては、医薬品として使用が許容される塩であれば特に限定されないが、例えばダルテパリンナトリウムに代表されるように、ヘパリン製剤としてはナトリウム塩、カルシウム塩が一般的である。
【００３４】
本発明の低分子ヘパリンまたはその塩において、不純物の有無は公知の分析方法（例えば、１Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ）によって確認することができる。
【００３５】
本発明の低分子ヘパリンまたはその塩は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて３．６５−３．７５ｐｐｍの範囲に一重線ピークが実質的に検出されず、かつ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて６１．５−６２．５ｐｐｍの範囲にピークが実質的に検出されない。これにより、本発明の低分子ヘパリンまたはその塩は不純物の含有量が極めて低減されている。なお、上記１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ測定は、重水中、３０℃で行なわれた場合である。
【００３６】
本発明の低分子ヘパリンまたはその塩は、亜硝酸塩の含有量が５ｐｐｍ以下であることが好ましい。亜硝酸塩の含有量は、グリース・ロメン亜硝酸試薬を添加した吸光度測定により測定することができ、例えば、後述する実施例に記載された方法により測定することができる。
【００３７】
例えば亜硝酸ナトリウムまたは亜硝酸カリウムなどの亜硝酸塩を吸引または経口摂取すると、チアノーゼ（口唇、爪、皮膚等）、錯乱、痙攣、めまい、頭痛、吐き気、意識喪失等の症状が表れることがある。このため、本発明の低分子ヘパリンまたはその塩の製造工程において、亜硝酸塩を使用する場合、亜硝酸塩を本発明の低分子ヘパリンまたはその塩から充分に除去する必要がある。本発明の低分子ヘパリンまたはその塩によれば、後述する製造方法により得られるため、亜硝酸塩などの不純物が極めて低減されている。このため、残存する亜硝酸塩により上記の症状が引き起こされることはない。
【００３８】
２．低分子ヘパリンまたはその塩の製造方法
２．１．工程（１）
本発明の低分子ヘパリン等の製造方法は、（１）原料ヘパリン等を低分子化した後、還元剤と反応させる工程を含む。
【００３９】
本発明において、原料ヘパリン等の低分子化は、原料ヘパリン等と亜硝酸塩との反応により行なうことができる。より具体的には、例えば、原料ヘパリン等および亜硝酸塩（亜硝酸ナトリウム，亜硝酸カリウム等）を溶媒に加えて得られた反応液を所定時間攪拌する方法が挙げられる。この場合、使用できる溶媒としては、原料ヘパリン等および亜硝酸塩を溶解させることができるものであれば特に限定されないが、水、アルコール（例えば、メタノール，エタノール，ｎ−プロパノール，２−プロパノール，ｎ−ブタノール，ｓｅｃ−ブタノール）、または水とアルコールとの混合溶媒等の水系溶媒が挙げられる。
【００４０】
亜硝酸塩との反応において、ヘキソサミニド結合が開裂することにより、低分子化（脱重合反応）が進行する。これにより、原料ヘパリン等の低分子化物が得られる。
【００４１】
原料ヘパリン等の低分子化の度合いは、反応時間、反応温度、使用する溶媒の種類、および反応液における原料ヘパリン等の濃度等を適宜調整することによって制御することができる。
【００４２】
本発明においては、原料ヘパリン等の低分子化物を、還元剤を用いて処理する。この処理により、前記低分子化物の末端基を還元することができる。これにより、本発明の低分子化ヘパリンを得ることができる。
【００４３】
ここで、還元剤としては、特に限定されないが、例えば、水系溶媒中での反応が可能であり、かつ、前記低分子化物中のカルボキシル基やアセチル基を還元せずに保持することができる点で、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）またはシアン化水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）が好ましい。
【００４４】
例えば、亜硝酸塩を用いて原料ヘパリン等を低分子化した場合、得られた低分子化物の末端基のうち少なくとも一部が−ＯＮＯ基であると推測される。前記低分子化物を、還元剤を用いて処理することにより、この−ＯＮＯ基を−ＯＨ基へと変換することができる。
【００４５】
２．２．工程（２）
本発明の低分子ヘパリン等の製造方法は、工程（１）の後、（２）還元剤を除去および／または分解した後、溶液のｐＨを４以下にする工程を含む。
【００４６】
還元剤の除去および／または分解は、使用する還元剤に適した方法によって行なうことが好ましい。すなわち、還元剤は反応液から除去してもよいし、または還元剤を反応液中で分解してもよいし、あるいは、還元剤の分解および除去の両方を行なってもよい。また、原料ヘパリン等の低分子化物に難溶性の溶剤を反応液に添加して、前記低分子化物を沈殿させて、該沈殿物を回収することにより、還元剤を除去してもよい。ここで、前記難溶性の溶剤としては、後述する溶剤を使用することができる。
【００４７】
例えば、還元剤として水素化ホウ素ナトリウムを使用する場合、還元剤と原料ヘパリン等の低分子化物との反応を行なった後、例えば塩酸を反応液に加えて過剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解する。さらに、例えば水酸化ナトリウム水溶液を反応液に加えて中和した後、溶剤を添加して沈殿物（本発明の低分子化ヘパリン）を析出させ、該沈殿物を回収することができる。この方法によれば、本発明の低分子化ヘパリンと還元剤とを効率よく分離することができる。ここで、沈殿物を生じさせるために使用する溶剤とは、沈殿物を生じさせることができるものであれば特に限定されないが、本発明の低分子化ヘパリンに対する溶解性が低いものが好ましく、例えば、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、ジエチルエーテル、アセトン、酢酸エチル等またはこれらの２種以上の混液であって、水を適宜含有することができる。前記溶剤としては、好ましくはエタノール、メタノール、およびアセトンから選択される少なくとも１種であり、さらに好ましくは含水エタノール（９０〜９８（Ｖ／Ｖ）％エタノール水溶液）である。
【００４８】
次いで、得られた前記沈殿物を溶媒に溶解させて、溶液を調製する。ここで、前記溶液を調製するのに使用する溶媒は、特に限定されず、前記沈殿物を溶解させることができればよい。例えば、上述の原料ヘパリン等を低分子化する際に使用する溶媒（例えば、水）や、塩化ナトリウム水溶液等を例示することができる。
【００４９】
次いで、還元剤を除去および／または分解した後、溶液のｐＨを４以下にする。ここで、前記溶液のｐＨを４以下にするために使用するものとしては、例えば、酸や酸性陽イオン交換樹脂が挙げられる。
【００５０】
酸としては、特に限定されないが、医薬品の製造において使用できるものが好ましい。酸としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、ならびに酢酸、氷酢酸、フマル酸、リンゴ酸等の有機酸を挙げることができる。
【００５１】
酸性陽イオン交換樹脂としては、特に限定されないが、例えば、強酸性陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ１Ｂ，ダウエックス５０Ｗ）、弱酸性陽イオン交換樹脂（デュオライトＣ−４６４）等が挙げられ、強酸性陽イオン交換樹脂が好ましい。
【００５２】
前記工程（２）において、溶液のｐＨを４以下に調整する際、前記溶液のｐＨが４以下、好ましくは２．５以下となるように調整するのが好ましい。ここで、前記溶液のｐＨを４より高く調整すると、得られた低分子ヘパリンと不純物との解離が充分行われず、その後カラム等による精製処理を行っても、不純物の除去率が低下する。
【００５３】
なお、前記工程（２）において、溶液のｐＨを４以下に調整する際のｐＨの下限値は特に限定されないが、特に、ｐＨを２．５以下に調整することにより、医薬品として使用されるのに充分な純度の低分子ヘパリンを得ることができる。また、ｐＨを２．５以下に調整した場合においても、ｐＨを２．５に調整する場合と効果はほぼ同等である。
【００５４】
２．３．工程（３）
本発明の低分子ヘパリン等の製造方法においては、前記工程（２）の後に、（３）溶液のｐＨを５．５〜８に調整した後、溶剤を加えて沈殿物を生じさせ、該沈殿物を回収する工程をさらに含むことができる。ここで、回収される沈殿物は低分子ヘパリン塩である。
【００５５】
前記工程（３）において、溶液のｐＨを６．５±０．８に調整するのがより好ましく、６．５±０．５に調整するのがさらに好ましい。
【００５６】
前記工程（３）において、前記溶液のｐＨを調整するにあたり、塩基を使用することができる。塩基としては、医薬品の製造において使用が許容される塩基であればよく、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。
【００５７】
本発明において、前記工程（２）において溶液のｐＨを４以下に調整し、次いで、前記工程（３）において溶液のｐＨを５．５〜８に調整するという簡便な工程を行なうことにより、効率良く不純物を除去することができる。その際の作用機序は、以下の通りであると推測される。
【００５８】
前記工程（２）において、溶液のｐＨを４以下に調整することにより、原料ヘパリン等を低分子化する際に用いる試薬（例えば、亜硝酸塩やその他の不純物（例えば、エチレングリコール、ＥＤＴＡ、酢酸、メチル硫酸アンモニウム、メチル硫酸ナトリウム等）が低分子ヘパリンから解離し、前記工程（３）において、前記溶液のｐＨを５．５〜８に調整した後、ヘパリン難溶性の溶剤（エタノール等）で低分子ヘパリン塩を沈殿させることにより、不純物と低分子ヘパリン塩とを分離することができると考えられる。これにより、純度の高い低分子ヘパリンまたはその塩を得ることができる。
【００５９】
また、前記工程（２）における溶液のｐＨを４以下に調整する工程と、前記工程（３）とを１セットとして、前記セットを複数回繰り返し行なうのがより好ましい。この方法によれば、不純物の含有量をより低減することができる。なお、この方法において、前記工程（３）により回収された沈殿物を溶媒に溶解させて得られた溶液のｐＨを４以下に調整する。この場合に使用する溶媒は、低分子ヘパリンを溶解することができるものであればよく、例えば、前記工程（２）において、沈殿物を溶解させる際に使用した溶媒を使用することができる。
【００６０】
本発明の低分子ヘパリン塩は、上記工程を行なった後、必要に応じて他の精製（例えばカラム精製）を行なった後、真空乾燥または凍結乾燥等の乾燥処理を施すことにより得ることができる。
【００６１】
２．４．本発明の製造方法の一例
本発明の製造方法の一例を以下に示すが、本発明の製造方法はこれに限定されない。
【００６２】
（ａ）局方ヘパリンナトリウム水溶液を塩酸で酸性に調整し、亜硝酸ナトリウム水溶液を加え、低分子化反応（脱重合反応）を行なう。反応中、塩酸を用いて反応液を酸性に維持する。
【００６３】
（ｂ）次いで、反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和し、反応を停止させる。
【００６４】
（ｃ）次いで、反応液を加温し、還元剤（水素化ホウ素ナトリウム）を加えて、還元反応を行なう（以上、前記工程（１）に相当）。
【００６５】
（ｄ）次いで、反応液に塩酸を加えて、過剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解した後、水酸化ナトリウム水溶液にて中和する。
【００６６】
（ｅ）次いで、反応液に、沈殿物が析出するまで溶剤（エタノール）を加え、静置した後、遠心分離により沈殿物を回収する。
【００６７】
（ｆ）次いで、この沈殿物を塩化ナトリウム水溶液に溶解させて、溶液を調製した。
【００６８】
（ｇ）次いで、この溶液を塩酸にてｐＨを４以下（２．２±０．３）に調整する（以上、前記工程（２）に相当）。
【００６９】
（ｈ）次いで、この溶液を水酸化ナトリウムにてｐＨを５．５〜８に調整する。
【００７０】
（ｉ）次いで、この溶液に、沈殿物が析出するまで溶剤（エタノール）を加え、静置した後、遠心分離により沈殿物を回収する（以上、前記工程（３）に相当）。
【００７１】
（ｋ）次いで、この沈殿物を蒸留水に溶解させ、カラム精製を行なう。
【００７２】
（ｌ）次いで、メンブレンろ過を行ない、得られた溶出液に、沈殿が析出するまでエタノールを加え、静置した後、遠心分離により沈殿物を回収する。
【００７３】
（ｍ）回収した沈殿物を真空乾燥することにより、低分子ヘパリンナトリウムを得る。
【００７４】
３．医薬組成物
本発明の医薬品組成物は、本発明の低分子ヘパリンまたはその塩を有効成分とする医薬用製剤である。本発明の医薬品組成物の一態様としては、例えば、ダルテパリンナトリウム注射液が挙げられる。このダルテパリンナトリウム注射液は、亜硝酸ナトリウムを用いて低分子化されたヘパリンナトリウムを主剤として製剤化された静脈注射用医薬品である。ダルテパリンナトリウム注射液は、血液透析時における血液体外循環時の灌流血液の凝固防止、ならびに汎発性血管内血液凝固症の治療に使用することができる。
【００７５】
４．実施例
次に、本発明を実施例、比較例、試験例および応用例に基づき、さらに詳細に説明する。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７６】
４．１．測定方法
本実施例で得られた低分子ヘパリンについて、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲを測定した。本実施例における１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲの測定条件を以下に示す。また、本実施例および比較例で得られた低分子ヘパリンに亜硝酸塩が残存しているかどうかについて測定を行なった。
【００７７】
４．１．１．試料溶液の調製
各試料（低分子ヘパリンまたはその塩）を約５０ｍｇ秤量し、重水（Ｄ２Ｏ）０．７５ｍＬに溶解させ、内部標準試薬としてトリメチルプロパンスルホン酸ナトリウム（ＤＳＳ）約３ｍｇを添加した。
【００７８】
４．１．２．１Ｈ−ＮＭＲの測定条件
装置                ：ＶＸＲ−４００Ｓ（バリアン社製）
観測周波数          ：３９９．９ＭＨｚ
温度                ：３０℃
基準                ：ＤＳＳ  (０ｐｐｍ)
以上の条件にて、各試料の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを求めた。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいては特に、３．６５−３．７５ｐｐｍの範囲に一重線ピーク（不純物のシグナル）が認められるかどうかを確認した。
【００７９】
４．１．３．１３Ｃ−ＮＭＲの測定条件
装置                ：ＶＸＲ−４００Ｓ（バリアン社製）
観測周波数          ：１００．５ＭＨｚ
温度                ：３０℃
基準                ：ＤＳＳ  (０ｐｐｍ)
以上の条件にて、各試料の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを求めた。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいては特に、特に６１．５−６２．５ｐｐｍの範囲にピーク（不純物のシグナル）が認められるかどうかを確認した。
【００８０】
４．１．４．亜硝酸塩の含有量の測定方法
本実施例においては、亜硝酸塩の含有量を以下に示す方法により測定した。なお、この測定方法によれば、亜硝酸ナトリウムのみならず、他の亜硝酸塩（亜硝酸カリウム）についても含有量を測定することができる。
【００８１】
（ａ）試料（低分子ヘパリンまたはその塩）を蒸留水で１００倍希釈し、１（Ｗ／Ｖ）％の試料溶液を調製した。
【００８２】
（ｂ）試料に対し、亜硝酸塩がそれぞれ２，４，６，８，１０ｐｐｍとなるように亜硝酸塩水溶液を調製し、これを標準溶液とした。
【００８３】
（ｃ）試料溶液および標準溶液それぞれにグリース・ロメン亜硝酸試薬を加え、１０分間放置した後、蒸留水を対照として、波長５２５ｎｍにて吸光度を測定した。
【００８４】
（ｄ）標準溶液の吸光度測定結果より得られる検量線より、試料に含まれる亜硝酸塩の含有量を測定した。
【００８５】
４．２．実施例１
（ａ）局方ヘパリンナトリウム１５．０ｇを溶媒（イオン蒸留水）２５０ｍＬに溶解させて反応液を調製し、次いで、４ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液にてこの反応液のｐＨを２．５に調整した。
【００８６】
（ｂ）次いで、反応液に５％亜硝酸ナトリウムを１０ｍＬ加え、低分子化反応（脱重合反応）を室温にて１時間行なった。反応中、反応液のｐＨを４ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液を用いてｐＨ２．５に維持した。
【００８７】
（ｃ）次いで、４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を用いて、反応液のｐＨを７．０に調整し、反応を停止させた。
【００８８】
（ｄ）次いで、反応液を４０℃に加温し、還元剤（水素化ホウ素ナトリウム）１．０ｇを加え、還元反応を２時間行なった。
【００８９】
（ｅ）次いで、４ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液を用いて、反応液のｐＨを４．０に調製し、過剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解した。
【００９０】
（ｆ）次いで、４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を用いて、反応液のｐＨを７．０に調製した。
【００９１】
（ｇ）次いで、反応液に、沈殿が析出するまで溶剤（エタノール）を加え、静置した後、遠心分離により沈殿物を回収した。
【００９２】
（ｈ）次いで、この沈殿物を５％塩化ナトリウム水溶液１５０ｍＬに溶解させて、溶液を調製した。
【００９３】
（ｉ）次いで、４ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液を用いて、この溶液のｐＨを４以下（２．２±０．３）に調整した。
【００９４】
（ｊ）次いで、４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を用いて、この溶液のｐＨを７．０に調整した。
【００９５】
（ｋ）次いで、この溶液に沈殿物が析出するまで溶剤（エタノール）を加え、静置した後、遠心分離により沈殿物を回収した。
【００９６】
（ｌ）次いで、この沈殿物を蒸留水２００ｍＬに溶解させ、カラム精製を行なった。
【００９７】
（ｍ）次いで、メンブレンろ過を行ない、その溶出液に沈殿が析出するまでエタノールを加え、静置した後、遠心分離により沈殿物を回収した。
【００９８】
（ｎ）回収した沈殿物を真空乾燥することにより、白色で粉末状の低分子ヘパリンナトリウム（ダルテパリンナトリウム）を得た。
【００９９】
４．３．実施例２
実施例１で、工程（ｉ）において溶液のｐＨを３．８±０．３に調整した以外は、実施例１と同様の方法にて、低分子ヘパリンナトリウム（ダルテパリンナトリウム）を得た。
【０１００】
４．４．実施例３
実施例１で、工程（ｇ），（ｋ），および（ｍ）において、溶剤をエタノールのかわりにメタノール−アセトン（１：１）の混液を用いた以外は、実施例１と同様の方法にて、低分子ヘパリンナトリウム（ダルテパリンナトリウム）を得た。
【０１０１】
４．５．実施例４
実施例１で、工程（ｇ）の次に工程（ｌ）のカラム精製を行ない、次いで、工程（ｈ）〜（ｋ）の処理を行った以外は、実施例１と同様の方法にて、低分子ヘパリンナトリウム（ダルテパリンナトリウム）を得た。
【０１０２】
４．６．比較例１
実施例１で、工程（ｈ）〜（ｋ）を削除した（すなわち、工程（ｇ）の次に工程（ｌ）を行なった）以外は、実施例１と同様の方法にて、低分子ヘパリンナトリウム（ダルテパリンナトリウム）を得た。
【０１０３】
４．７．比較例２
実施例１で、工程（ｉ）において、ｐＨを５．０±０．３に調整した以外は、実施例１と同様の方法にて、低分子ヘパリンナトリウム（ダルテパリンナトリウム）を得た。
【０１０４】
４．８．試験例
実施例１および比較例１でそれぞれ得られた低分子ヘパリンナトリウムの純度について、亜硝酸ナトリウムの含有量ならびに１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ測定による不純物スペクトルの検出により評価した。
【０１０５】
亜硝酸ナトリウムの含有量については、前記方法にて吸光度を測定し定量した。
【０１０６】
また、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲの測定については前記方法にて、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを求めた。より具体的には、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、３．６５−３．７５ｐｐｍの範囲に一重線ピークが実質的に検出されるかどうか、そして、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて、６１．５−６２．５ｐｐｍの範囲にピークが実質的に検出されるかどうかを確認した。
【０１０７】
【表１】
2006291028.tif 000002
【０１０８】
表１より、実施例１〜４においては亜硝酸ナトリウムの含有量が５ｐｐｍ以内であり、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ測定結果より、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて３．６５−３．７５ｐｐｍの範囲に一重線ピークが実質的に検出されず、かつ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて６１．５−６２．５ｐｐｍの範囲にピークが実質的に検出されなかった。以上の結果から、実施例１〜４の低分子ヘパリンナトリウム（ダルテパリンナトリウム）は、医薬品として充分な程度まで不純物含有量が低減されていることが確認された。
【０１０９】
これに対し、比較例１で得られた低分子ヘパリンナトリウムは、医薬品としては不適であり、比較例２で得られた低分子ヘパリンナトリウムは、医薬品とするにはさらなる精製工程を必要とすることが示唆された。以上の結果から、比較例１で得られた低分子ヘパリンナトリウムは、実施例１の工程（ｉ）の工程に相当する工程（還元剤の除去および／または分解後、溶液のｐＨを４以下に調整する工程）を経ていないため、不純物を十分に除去できなかったと推測される。また、比較例２で得られた低分子ヘパリンナトリウムは、実施例１の工程（ｉ）に相当する工程において、溶液のｐＨを約４以上に調整したため、不純物を十分に除去できなかったと推測される。
【０１１０】
４．９．応用例
実施例１〜４で得られた低分子ヘパリン（ダルテパリンナトリウム）の粉末を、最終ｐＨが６〜７．５となるよう緩衝剤を配合し、等張化した注射用蒸留水に溶解し、１ｍＬ当り１０００低分子ヘパリン国際単位となるよう準無菌的に調製した。
【０１１１】
次に、この溶液を０．１μｍ径のメンブレンフィルターで濾過した後、無菌環境下で、自動バイアル充填密封機（立花製作所製）にて、洗浄および滅菌した後、パイロジェンフリーとしたバイアル瓶に５ｍＬ充填し、密封（施栓）して製剤化した。
【０１１２】
得られた製剤（血液凝固阻止剤）は、平均相対分子量約５，０００であり、そのうち９０％が２，０００〜９，０００の範囲に分布するダルテパリンナトリウムを１ｍＬ当り１０００低分子ヘパリン国際単位含有する。これにより、本応用例で得られた製剤は、静脈注射用製剤に適合する品位を有していた。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】実施例１で得られた低分子ヘパリンＮａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである（３．６５−３．７５ｐｐｍの範囲に一重線ピークが認められない）。
【図２】実施例１で得られた低分子ヘパリンＮａの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである（６１．５−６２．５ｐｐｍの範囲にピークが認められない）。
【図３】比較例１で得られた低分子ヘパリンＮａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである（３．６５−３．７５ｐｐｍの範囲に一重線ピーク（「Ａ」で示す）が認められる）。
【図４】比較例１で得られた低分子ヘパリンＮａの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである（６１．５−６２．５ｐｐｍの範囲にピーク（「Ａ」で示す）が認められる）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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