(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトと動物細胞において遺伝子発現を高い濃度に誘導する真核細胞発現ベクターを提供する。【解決手段】サイトメガロウイルスの最初期遺伝子またはヒトＥＦ１α遺伝子に由来する調節因子を有する高効率の真核細胞発現ベクターに関するものであって、転写調節部位は、固有の遺伝子発現条件に相応する異種プロモーターと５’非翻訳領域全体（５’−ｕｎｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ，５’−ＵＴＲ）を含む。本発明のベクターは、遺伝子治療剤としても有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチクローニング部位；
ポリ（Ａ）シグナル；
選択マーカー遺伝子；
ＣｏｌＥ１複製起源；および
外来遺伝子由来の転写調節要素としてＨＣＭＶ  ＩＥ遺伝子のプロモーター／エンヘンサー、およびエクソン１配列の全体、イントロンＡ配列の全体およびエクソン２の開始コドンのＡＴＧ直前までの配列からなる５’−非解読部位(５’−ｕｎｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ，５’−ＵＴＲ)の全体の塩基配列；
を含む核細胞発現ベクター。
【請求項２】
選択マーカー遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子であるｐＣＮベクターである、請求項１に記載の真核細胞発現ベクター。
【請求項３】
不要な遺伝子を取り除いてベクターの大きさを最小化し、選択マーカー遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子であるｐＣＫである、請求項１に記載の真核細胞発現ベクター。
【請求項４】
マルチクローニング部位にヒトＶＥＧＦ遺伝子を含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の真核細胞発現ベクター。
【請求項５】
ｐＣＫ／ＶＥＧＦ１６５ベクターで形質転換された大腸菌Ｔｏｐ１０−ｐＣＫ／ＶＥＧＦ１６５（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０１７９）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
真核細胞において外来遺伝子を一時的にあるいは永久的に発現させるために、組換え発現ベクターは大腸菌で複製と選択のための遺伝子だけでなく、プロモーター領域、ポリ(Ａ)アデニル化シグナル領域および真核細胞選択マーカー遺伝子を含む。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞において、より強力で安定的な遺伝子発現を誘導できる組換え発現ベクターを作製するための戦略のうち代表的な方法は、効率的なプロモーターを選別することによって遺伝子発現濃度を増大させるか、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現させてＳＶ４０複製開始点(replication origin)でプラスミドの自家複製を誘導するものである。最近は、ヒトサイトメガロウイルス(human cytomegalovirus, HCMV)最初期(immediate early, IE)遺伝子のプロモーターとヒトハウスキーピング遺伝子の一種であるＥＦ１αのプロモーターが真核細胞における遺伝子の発現を高濃度に引き上げるために開発された。
【０００３】
さらに、イントロンと非翻訳エクソン配列を含むプラスミドは、イントロン配列を有しないプラスミドに比べて遺伝子発現を高濃度に誘導すると報告され、外来性イントロンをもつ組換ベクターが開発され、安定的で連続遺伝子発現のために用いられている。
【０００４】
真核細胞において強力で安定な遺伝子を発現できるベクターの開発は動物細胞において効率的な外来遺伝子の発現はもちろん、遺伝子治療分野の成功のために非常に重要であるため、永久的または一時的に強くて安定した発現を可能にする新規な哺乳動物遺伝子発現ベクターの開発が望まれている。
【発明の開示】
【０００５】
そこで、本発明者らは、転写部位として外来遺伝子のプロモーターと内在遺伝子の開始コドンの上流に位置した、すべてのエクソンとイントロンを含む５’非翻訳領域(untranslated region, UTR)を有するベクターが効率的に遺伝子発現を誘導するという事実に基づいて、より安定的で強力な外来遺伝子を発現できる真核細胞発現ベクターを作製した。特に、本発明のベクターは、イントロンやエクソンのないHCMV IEまたはＥＦ１α発現ベクターよりインビボでより効率的である。さらに、HCMV IEのエンハンサーとＥＦ１αプロモーターの上流およびその５’UTR領域を含むキメラベクターは遺伝子発現を高濃度に引き上げた。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、一時的または永久的に形質移入された種々の哺乳動物細胞またはインビボで、強力で安定的な遺伝子発現を誘導するための遺伝子発現調節部位を含む哺乳動物遺伝子発現ベクターを提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、裸のＤＮＡを用いた遺伝子治療のための安定的な哺乳動物遺伝子発現ベクターを提供することである。
【０００８】
本発明のまた他の目的は、前記哺乳動物遺伝子発現ベクターで形質転換された組換え微生物を提供することである。
【０００９】
本発明によって、前記目的および利点が容易に達成される。
【００１０】
本発明は、マルチクローニング部位、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル領域、ＳＶ４０プロモーターと複製開始点、選択マーカー遺伝子およびＣolＥ１複製開始点を含む真核細胞発現ベクターを提供する。前記発現ベクターはさらに遺伝子発現のための調節部位、外来遺伝子由来のプロモーターと内在遺伝子の翻訳開始コドンの上流に位置した５’非翻訳領域全体を含む。
【００１１】
特に、本発明は、調節因子として、ヒトサイトメガロウイルス最初期遺伝子(HCMV IE)由来のプロモーター／エンハンサー、エクソン１、イントロンＡおよびエクソン２のＡＴＧ開始コドン直前までのヌクレオチド配列を含む真核細胞発明ベクターを提供する。好ましい一実施態様によって、本発明では配列番号３で表される調節因子を含むｐＣＮベクターが提供される。
【００１２】
本発明はまた、調節因子として、ヒトＥＦ１α遺伝子由来のプロモーター／エンハンサー、エクソン１、イントロンＡおよびエクソン２のＡＴＧ開始コドン直前までのヌクレオチド配列を含む真核細胞発現ベクターを提供する。好ましい実施態様によって、本発明では配列番号６で表される調節因子を含むｐEFベクターが提供される。
【００１３】
また、本発明は、ｐＥＦベクターのＥＦ１αプロモーターの上流にHCMV IEのエンハンサー部位を挿入して構築されたキメラベクターpＣＥＦを提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記ベクターの不要な遺伝子を取除き、β−ラクタマーゼ(β−lactamase)遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に置換した最少化された真核細胞発現ベクターｐＣＫを提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、ｐＣＮ、ｐＥＦ、ｐＣＫおよびpＣＥＦベクターのマルチクローニング部位に有用な外来遺伝子を挿入したベクターを提供する。好ましい実施態様によって、本発明ではＶＥＧＦ(血管内皮増殖因子：vascular endothelial growth factor)遺伝子を含むpCN-VEGF、pEF-VEGF、pCK-VEGFおよびpＣＥＦ-VEGFが提供される。しかし、本発明の範囲はこれに制限されない。
【００１６】
本発明の他の実施態様によって、前記ベクターで形質転換された大腸菌菌株が提供される。
【００１７】
本発明のまた他の実施態様によって、前記ベクターを有効成分として含む遺伝子治療剤が提供される。
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明をHCMV IEプロモーターおよびヒトＥＦ１αプロモーターを用いる２つの場合に分けて説明する。
【００１９】
１．ＨＣＭＶ ＩＥ遺伝子に由来する発現ベクター
１）ｐＣＮの構築
HCMV IE遺伝子に由来するイントロンＡ配列は、遺伝子発現を増加させると報告されている(Chapman et al., Nucl. Acids Res., 19:3979-3986, 1991)。このような報告に基づいて、本発明者らは調節因子として、HCMV IE遺伝子に由来するプロモーター／エンハンサーおよび５’UTR、すなわち、RNA転写開始点からATG開始コドン直前のヌクレオチド配列(すなわち、エクソン１、イントロンＡ、エクソン２の一部)を含み、前記遺伝子がスプライシング(splicing)されたRNAから発現される真核細胞発現ベクター、pCNベクターを構築した。
【００２０】
本発明者らは、開始ベクターとして、pCDNA3.1(Invitrogen)を用いてより優れた真核細胞発現ベクターを構築した。pEQ276ベクター(Biegalke et al., Virology, 183:381-385, 1991)を鋳型として用い、HCMV IE遺伝子のエンハンサー／プロモーターおよび５’UTRを含むDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させた。前記増幅されたDNA断片をpCDNA3.1ベクターのHCMVエンハンサー／プロモーター断片と置換してpCNベクターを構築した。したがって、pCNの基本鋳型はpCDNA3.1と同様であるが、マルチクローニング部位に挿入された外来遺伝子はスプライシングされたメッセンジャーRNAから発現される。
【００２１】
２）ｐＣＮからの遺伝子発現濃度
HCMV IEの５’UTRが遺伝子発現効率に及ぼす影響を調査するために、プラスミドpCDNA3.1、pCN、およびpCIneoベクターに各々CATレポーター遺伝子を挿入することによってpCDNA3.1-CAT、pCN-CATおよびpCIneo-CATを構築した。293T細胞(DuBridge et al., Mol. Cell. Biol., 7:379-387, 1987)をこれらのベクターで形質移入させた後、形質移入された細胞内のCAT活性濃度を測定した。HCMV IEの５’UTRを含むpCN-CATで形質移入された細胞のCAT活性は、５’UTRを有しないベクターで形質移入された細胞に比べて約６０倍以上高かった。
【００２２】
さらに、遺伝子発現効率を確認するための他の標識としてパッケージング効率を測定した。特に、MLV由来のgag-polとenv遺伝子を各々pCNベクターに挿入し、これらのベクターをレトロウイルスベクターであるMFG-CAT(Kim et al., J. Virol., 72:994-1004, 1998)とともに用いて293T細胞を形質移入させた。２日後、ウイルスの上澄液を得、これをNIH 3T3細胞に導入するために使用した。その結果、従来の他のパッケージングベクターを用いたときより高いCAT活性が観察されたが、これは、pCNに基づいたパッケージング構造がgag／polおよびenvタンパク質を効率的に提供することを示唆する。このような結果は、本発明のpCNベクターが非常に効率的な発現ベクターであることを示す。
【００２３】
２．ヒトＥＦ１α遺伝子に由来する発現ベクターの構築
１）プラスミドｐＥＦの構築
ウイルスプロモーターを用いる遺伝子発現システムの短所を補完するために本発明者らはヒトヒトＥＦ１α遺伝子のプロモーターと５’UTRをクローニングした。特にプロモーターを含むＥＦ１α遺伝子プロモーター、エクソン１、イントロンＡおよびエクソン２部位の開始コドン直前までの塩基配列を含む染色体DNA断片を鋳型としてヒトの胎盤RNAを用いてPCRで増幅させた。PCR産物をpCDNA3.1ベクターのHCMVエンハンサー／プロモーター部位と置換してpEFを構築した。
【００２４】
したがって、pEFベクターはマルチクローニング部位の上流にＥＦ１αプロモーターと５’UTR部位全体(エクソン１、イントロンＡおよびエクソン２の一部)を含む。前記マルチクローニング部位に挿入された外来遺伝子はスプライシングされたメッセンジャーRNAに由来する。
【００２５】
２）ｐＥＦベクターの遺伝子発現濃度
pCNとpEFベクターの遺伝子発現効率を調査するために、これらのベクターでHeLa細胞を形質移入させ、形質移入させてから２日後CAT活性を測定した。その結果、一時的発現システムにおいては、pCNベクターがpEFベクターに比べて２倍程高いCAT活性を示した。しかし、長期間安定的に形質移入された細胞を用いてCAT活性を比べたとき、pEFで形質移入された細胞のCAT活性はpCNで形質移入された細胞より遥かに高い濃度を示した。
【００２６】
すなわち、HCMV IEプロモーターは細胞培養システムにおいて一時的に高い濃度の遺伝子発現を誘導したが、安定な系においては低い濃度の遺伝子発現を誘導した。しかし、安定的な発現システムにおいては、細胞性遺伝子に由来するEF1αプロモーターがウイルス遺伝子に由来するHCMV IEプロモーターより遥かに効率的に機能する。
【００２７】
したがって、pEFベクターは長期間の安定な遺伝子発現に好ましい反面、pCNベクターは一時的な遺伝子発現に好ましい。
【００２８】
３．キメラプラスミドpＣＥＦの構築
１)pＣＥＦベクターの構築
pCNとpEFの長所をすべて有する新規な発現ベクターを構築するためにキメラプラスミド(chimeric  plasmid)pＣＥＦを構築した。
【００２９】
具体的に、一時的で、かつ安定に高い濃度の遺伝子発現を誘導するために、pEFのプロモーターの上流にHCMV IE遺伝子のエンハンサーを挿入し、ＥＦ１α遺伝子のプロモーターとイントロンはそのまま維持した。
【００３０】
まず、pEFベクターの約900bp長さのイントロンのうち＋５７〜＋４０９位置の不要なイントロン配列を取除いてpEFsを構築した。HCMV IE遺伝子のエンハンサー配列をPCRで増幅させた後、増幅されたEF1αプロモーターの上流にpEFベクターを挿入した後キメラベクターpＣＥＦを構築した。
【００３１】
２)pＣＥＦベクターの遺伝子発現濃度
前記キメラベクターの転写効率を既存の他のベクターと比べるために、pＣＥＦのBamHI部位にCATを挿入してpＣＥＦ-CATを構築した。pCN-CATおよびpEF-CAT各々で293T細胞を形質移入させ、形質移入させてから２日後CAT活性を測定した。pＣＥＦは、pEFおよびpCNに比べて各々５倍および２倍以上高いCAT活性を誘導した。
【００３２】
４．裸のＤＮＡ遺伝子治療に適合なｐＣＫの構築
１）ｐＣＫの構築
裸のＤＮＡ遺伝子治療の構造に適合なＰＣＡを構築するために、本発明者らはpCNの基本骨格を修飾してpCKを構築した。PCKにおいて、最終DNA溶液中に残存するアンピシリンが遺伝子治療試験を受けている患者の何人かにアレルギー反応をもたらし得るため、β-ラクタマーゼ遺伝子をカナマイシンに対する耐性を誘発する遺伝子に置換した。さらに、プラスミドの大きさを3.7kbに最小化するためにベクターが遺伝子伝達ビヒクルとして機能するのに不要であると思われるヌクレオチド配列を全てプラスミドから取除き、その結果、大腸菌内での複製数が相対的に高くなる。
【００３３】
２）ｐＣＫの遺伝子発現濃度
pCKベクターは大腸菌内で効率的に発現され、安全性が向上した。前記ベクターの実施形態として、pCK-VEGF165を構築し、インビボおよびインビトロで遺伝子発現量を調査した。その結果から分かるように、遺伝子発現濃度は５’UTRを欠く対照群ベクターに比べて３０倍以上高い遺伝子発現濃度を示したが、これは前記pCK-VEGF165ベクターが虚血性疾患の治療に有用であることを示す。
【００３４】
５．遺伝子治療剤としてのＰＣＫ、ｐＥＦ、ｐＣＫおよびｐＣＥＦベクターの利用
前記pCNおよびpEFベクターの遺伝子治療剤としての利用可能性を試験するために、pCN、pEFおよびpＣＥＦベクターの各々にVEGF遺伝子を挿入することによって、pCN-VEGF、pEF-VEGFおよびpＣＥＦ-VEGFを構築した。その後、構築したベクターを用いてマウスの筋肉細胞株であるC2C12(ATCC  CRL-1772)を形質移入させ、VEGFタンパク質濃度をELISAで測定した。その結果、三つのすべてのベクターは、高効率でVEGFタンパク質を生産した。また、インビボでタンパク質発現濃度を調査するために、構築したベクターを２週齢のBalb／C雄マウスの前脛骨筋に注射し、注射してから２日後生産されたVEGFタンパク質の量を測定した。その結果、注射された筋肉でpCN-VEGFとpＣＥＦ-VEGFがpＣＥＦ-VEGFより高い濃度のVEGF活性を示した。そのような結果は、pCNとpＣＥＦベクターがインビボとインビトロで高い濃度の遺伝子発現を誘導できることを示唆する。
【００３５】
前述のように、pCKベクターは大腸菌内において高い複製数で生産され、その安全性も向上した。このベクターの実施形態として、pCK-VEGF165を構築し、遺伝子発現濃度をインビボおよびインビトロで調査した。その結果、前記ベクターの遺伝子発現濃度は５’UTRのないpCPベクターより３０倍以上高く、従って、前記pCK-VEGF165ベクターは虚血性疾患の治療に有用できる。新薬開発の前臨床試験として、経時的なタンパク質生産と急性毒性実験を行った。
【００３６】
前記pCN-VEGFベクターで形質転換された大腸菌を「Top10-pCN／VEGF」と命名し、1998年11月19日付で社団法人韓国種菌協会(Korea Culture Center of Microorganisms)に寄託番号KFCC-11064として寄託した。
【００３７】
前記pEF-VEGFベクターで形質転換された大腸菌を「Top10-pEF／VEGF」と命名し、1998年11月19日付で社団法人種菌協会に寄託番号KFCC-11063として寄託した。
【００３８】
前記pCK-VEGFベクターで形質転換された大腸菌を「Top10-pCK／VEGF165」と命名し、1999年12月27日付で社団法人韓国種菌協会に寄託番号KCCM-10179として寄託した。
【００３９】
前記の結果を総合してみると、本発明のpCN、pEF、pＣＥＦおよびpCKベクターは遺伝子発現を高効率で誘導できるため、インビボで外来遺伝子の連続発現を誘導するために、特に裸のＤＮＡ遺伝子治療療法に適用できる。特に、基本鋳型プラスミドpCKは、ベクターの向上した安全性と増加した生産性のため裸のＤＮＡ遺伝子治療に適している。
【実施例】
【００４０】
以下に説明する実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示する。
しかし、本発明の範囲および範疇内で当業界の熟練者は多様な変形および改良を行ない得ると理解されなければならない。
【００４１】
実施例１：ｐＣＮベクターの構築
pCNを構築するために、HCMVの全長IEのエンハンサー／プロモーター(以下、「Pcmv」と称する)とその５’非翻訳領域全体(５’UTR)をPCRでクローニングした。HCMV IE遺伝子のプロモーターからエクソン５までを含むpEQ 276ベクター(Biegalke et al., Virology, 183:381-385, 1991)を鋳型として用い、配列番号１および配列番号２で表される２つの合成オリゴーヌクレオチドをプライマーとして用いた。
【００４２】
増幅された1.6kbのDNA断片は、エンハンサー／プロモーター、エクソン１、イントロンＡおよびエクソン２の開始コドンの上流配列を含むヌクレオチド配列に該当する(配列番号３)。１から599までのヌクレオチド配列はPcmv に相当し、600から720までの配列はエクソン１に、721から1547までの配列はイントロンＡに、そして1548から1564までの配列はエクソン２の開始コドンの上流配列に該当する。前記PCR産物をpZeroBluntベクター(Invitrogen)にクローニングしてpZero-CMVを構築した。その後、pCDNA3.1ベクター(Invitrogen)のPcmv を含むMluI-HindIII断片をベクターpZero-CMVからMluI／HindIII断片に置換してpCNベクターを構築した(図１参照)。したがって、前記pCNの基本鋳型はPcmvだけでなく、マルチクローニング部位、BGH(bovine growth hormone)ポリ(Ａ)アデニル化シグナル領域(以下、「pA」と称する)、SV40プロモーター(以下、「P SV40」と称する)、および複製開始点、ネオマイシン耐性遺伝子(以下、「NEO」と称する)およびＣolE1複製開始点などをすべて含むpCDNA3.1と同様である。pCNはマルチクローニング部位の上流にHCMV IEの５’UTR全体(すなわち、エクソン１、イントロンＡおよびエクソン２の一部)を有するため、pCDNA3.1とは異なる。したがって、前記マルチクローニング部位に挿入された外来遺伝子はスプライシングされたメッセンジャーRNAから発現される。
【００４３】
前記pCNベクターで形質転換された大腸菌は「Top10-pCN」と命名し、これを1998年7月20日付で社団法人韓国種菌協会に寄託番号KFCC-11045として寄託した。
【００４４】
実施例２：ｐＥＦの構築
pEFを構築するために、ヒトＥＦ１α遺伝子のプロモーター部位とその５’UTRを配列番号４と配列番号５で表されるプライマー対を用いたPCRでクローニングした。
【００４５】
エンハンサー／プロモーター(以下、「PEF」と称する)、エクソン１、イントロンＡおよびエクソン２のATGコドンの上流配列を含むPCR産物の1.2Kb長さのDNA断片はＥＦ１α遺伝子に由来する(配列番号６)。１から１３７までのヌクレオチド配列はPEFに相当し、138から158までの配列はエクソン１に、159から1104までの配列はイントロンＡに、1105から1136までの配列はエクソン２のATGコドンの上流配列に各々該当する。前記PCR産物をpZeroBluntベクターにクローニングしてpZero-EF1αを構築した。pCDNA3.1ベクターのMluI-NheI部位を前記pZero-EF1αからMlu／Nhe1断片に置換してpEFベクターを構築した(図２参照)。前記pEFの基本鋳型は前記pCDNA3.1と同様であるため、pEFはマルチクローニング部位、BGH  pA、PSV40および複製開始点、NEOおよびＣolEI複製開始点などをすべて含む。さらに、pEFはマルチクローニング部位の上流にPEF およびHCMV IEの５’UTR(すなわち、エクソン１、イントロンＡおよびエクソン２の一部)を有するため、前記マルチクローニング部位に挿入された外来遺伝子はスプライシングされたメッセンジャーRNAから発現された。
【００４６】
実施例３：pＣＥＦの構築
pCNは一時的に形質移入されたシステムにおいて遺伝子発現を高い濃度に誘導する反面、pEFは安定に形質移入されたシステムにおいて遺伝子発現を高い濃度に誘導することが観察された。そこで、本発明者らは、前記２つのベクターシステムの長所をすべて有するキメラベクターを構築した。
【００４７】
すなわち、キメラベクターは、PEF の５’末端にHCMV遺伝子のエンハンサー部位を挿入することによって構築され、残りの構造はそのまま維持させた。HCMV IE遺伝子のエンハンサー部位は、配列番号７および８で表されるプライマー対を用いてpEQ276のPCR増幅によってクローニングした。
【００４８】
本来のpEFベクターは、約900bp長さのイントロンを含む。イントロンの大きさを減らすために＋５７〜＋４０９位置のヌクレオチド配列をSacII制限酵素を用いた内部欠失(internal deletion)によって取除いてpEFsを構築した。BglII-SnaBI  HCMVエンハンサー断片をpEFsのNruI-BglII部位に挿入してpＣＥＦを構築した。
【００４９】
実施例４：ｐＣＫの構築
裸のＤＮＡ遺伝子治療の構造にさらに適合なベクターを構築するために、本発明者らはpCNの基本鋳型を変形して結果的にpCKを構築した。最終DNA溶液内に残存するアンピシリンが遺伝子治療を受けている患者の何人かにアレルギー反応をもたらし得るために、pCK中のβ-ラクタマーゼ遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に置換した。さらに、プラスミドの大きさを最小化するためにベクターが遺伝子伝達ビヒクルとして機能するのに不要なすべての可能なヌクレオチド配列をプラスミドから取除き、その結果、大腸菌内で相対的に高い複製数を有することになった。pCNベクターのプロモーター部位とその５’UTR、BGHpA部位を含むヌクレオチド配列は、配列番号９および配列番号１０で表されるプライマー対を用いたPCRによって増幅された。
【００５０】
前記DNA断片をpCR2.1ベクター(Invitrogen)にクローニングしてPCR2.1CMVpAを構築した。前記ベクターを制限酵素およびMluI／SalIで処理した後、PCR産物を含む断片を精製した。その後、ApoIとAflIIIを用いてカナマイシン耐性遺伝子とCo1EI複製開始点を含む断片をpZero2.1ベクター(Invitrogen)から分離した後、これを前記pCR2.1CMVpAから得たMluI／SalI断片と連結してpCKベクターを構築した(図４参照)。
【００５１】
実施例５：ｐＣＮ−ＶＥＧＦの構築
ヒトVEGF121遺伝子をコーディングするcDNAをヒトの胎盤から分離した全体RNAからRT-PCR(逆転写PCR)によってクローニングした。PCRプライマーは配列番号１１(センスプライマー)および配列番号１２(アンチセンスプライマー)で表される。
【００５２】
前記ＲＴ−ＰＣＲ産物をＰＣＲ２．１ベクター（Invitrogen）にクローニングし、これらのベクターのＥｃｏＲＩ断片をｐＣＮベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入してｐＣＮ−ＶＥＧＦベクターを構築した（図５参照）。
【００５３】
実施例６：ｐＥＦ−ＶＥＧＦの構築
pCNベクターの代りにpEFベクターを用いたことを除いては実施例５と同様な方法で構築した。
【００５４】
実施例７：ｐＣＥＦ−ＶＥＧＦベクターの構築
pCNベクターの代りにpＣＥＦベクターを用いたことを除いては実施例５と同様な方法で構築した。
【００５５】
実施例８：ｐＣＫ−ＶＥＧＦベクターの構築
VEGF165をコーディングするcDNAは、ヒトの血管平滑筋細胞から分離した全体RNAからRT-PCRによってクローニングした。PCRプライマーは配列番号１３および配列番号１４で表される。増幅されたcDNAをPCR2.1ベクター(Invitrogen, USA)にクローニングし、そのヌクレオチド配列は塩基配列分析によって決定した。
【００５６】
前記pCR2.1-VEGF165からVEGF165を含むHindIII／XbaI断片をpCKベクターのHindIII／XbaI部位に挿入してpCK-VEGF165ベクターを構築した(図６および７参照)。
【００５７】
前記pCK-VEGF165で形質転換された大腸菌を「Top10-pCK／VEGF165」と命名し、これを1999年12月27日付で社団法人韓国種菌協会に寄託番号KCCM-10179として寄託した。
【００５８】
実施例９：ｐＣＰおよびｐＣＰ−ＶＥＧＦの構築
対照プラスミドとして、その基本鋳型はpCKと同様であるが、HCMVの主なIE部位の非翻訳リーダー配列を欠いたpCPベクターを構築した。pCPはpCDNA3.1から得たNdeI／HindIII断片をpCKのNdeI／HindIII部位に挿入して構築した(図８参照)。
【００５９】
その後、VEGF165遺伝子を含むpCK-VEGF165のHindIII／XbaI断片をpCPのHindIII／XbaI部位に挿入してpCP-VEGF165ベクターを構築した。
【００６０】
実施例１０：HCMV IEの５’UTR部位が遺伝子発現効率に及ぼす影響
１)pCDNA3.1-CAT,pCIneo-CAT,pCN-CATの構築
pCNベクターの遺伝子発現効率を市販の他のベクターと比べるために、本発明者らはpCDNA3.1(Inbvitrogen)およびpCIneoベクター(Promega)を選択した。pCDNA3.1はPCMVのみを含む反面、pCIneoは異種の合成イントロンを含む。CATレポーターを各プラスミドのBamHI位置に挿入してpCDNA3.1-CAT、pCN-CATベクターおよびpCIneo-CATベクターを構築した(図９参照)。
【００６１】
２)遺伝子発現濃度の比較
pCN-CAT、pCDNA3.1-CAT、pCIneo-CATベクターを各々293T細胞(DuBridge et al., Mol. Cell. Biol., 7:379-387, 1987)に形質移入させた。感染させてから２日後、遺伝子発現濃度を測定するためにタンパク質抽出物を分離した。その結果、下記表１に示すように、５’UTRを含むpCN-CATからのCAT活性は対照ベクターに比べて６０倍以上高かった。そのような結果は、５’UTR配列が遺伝子発現効率を増加させるに寄与することを示唆する。
【表１】
2006271394.tif 000002
【００６２】
実施例１１：pCNベクターがウイルスパッケージングに及ぼす影響
前記で構築されたpCNベクターが遺伝子発現効率およびレトロウイルスパッケージングに及ぼす影響を調査するために、前記pCNベクターを基本鋳型として用いてレトロウイルスベクターであるgag-polベクターとenvベクターを構築した。レトロウイルスベクターのネオマイシン内在遺伝子とマーカーを区別するために、前記パッケージングベクターに挿入されたマーカー遺伝子として、gag-polベクターの場合ピューロマイシン(puromycin)耐性遺伝子を、envベクターの場合ヒグロマイシン(hygromycin)耐性遺伝子をそれぞれ用いた。
【００６３】
１)pCP-gag／polベクターの構築
真核細胞選別マーカーとしてピューロマイシン遺伝子を含み、調節因子としてHCMV IE遺伝子のエンハンサー／プロモーターと５’UTR配列を含むpCP-gag／polベクターを次のように構築した。
【００６４】
まず、pCI-neoベクター(Promega)からNEO遺伝子を取除いた後、pCII-puroベクターベクターから分離したピューロマイシンを前記ベクターに挿入してpCI-puroベクターを構築した(図１０参照)。前記pCI-puroベクターにBglIIとNheＩの処理を通じてPCMV断片を取除いた後、前記実施例１で構築されたpCNベクターから分離したPCMVおよび５’UTR配列を含むMluI-HindIII断片を前記pCI-Puroベクターに挿入してpCPベクターを構築した(図１０参照)。
【００６５】
これに対し、従来のgag-pol発現ベクターであるpHIT60(Cannon et al., J. Virol., 70:8234-8240, 1996)を鋳型として用い、配列番号１５および配列番号１６で表される合成ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてMLV(murine leukemia virus)に由来するgag-pol遺伝子断片をPCRで増幅させた後、増幅されたgag-pol断片をpCIIベクター(Invitrogen)に挿入してpCII-gag／polベクターを構築した。
【００６６】
次いで、前記pCPベクターのMluＩ-HindIII部位に前記pCII-gag／polベクターから分離したgag-pol断片を挿入し、gag-pol発現ベクターであるpCP-gag／polベクターを構築した。
【００６７】
２）ｐＣＨ−ｅｎｖベクターの構築
真核細胞選別マーカーとしてヒグロマイシン遺伝子を有し、調節因子としてHCMV IE遺伝子のエンハンサー／プロモーターと５’UTR配列を含むpCH-envベクターを次のような方法で構築した。
【００６８】
まず、pCI-neoベクター(Promega)からNEO遺伝子を取除いた後、pCII-MMTVhygベクターから分離したMMTV(mouse mammary tumor virus)LTR(long terminal repeats)およびヒグロマイシン遺伝子を含むDNA断片を前記ベクターに挿入してpCI-hygroベクターを構築した(図５ａ参照)。前記pCI-hygroベクターをBglIIとNheＩの処理を通じてPCMV断片を取除いた後、前記実施例１で構築したpCNベクターから分離したPCMVおよび５’UTRを含むMulI-HindIII断片を前記pCI-hygroベクターに挿入してpCHベクターを構築した(図１２参照)。
【００６９】
一方、従来のenv発現ベクターであるpHIT456(Cannon et al., J. Virol., 70:8234-8240, 1996)を鋳型として用い、配列番号１７および配列番号１８で表される合成ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてMLVに由来するenv断片をPCRで増幅させた後、増幅させたenv断片をpCII(Invitrogen)ベクターに挿入してpCII-envベクターを構築した。
【００７０】
次いで、前記pCHベクターのMluI-NotI部位に前記pCII-envベクターから分離したenv断片を挿入してenv発現ベクターであるpCH-envベクターを構築した(図１３参照)。
【００７１】
３)パッケージング効率の検証
pCP-gag／polベクターとpCH-envベクターのパッケージング効率を既存のパッケージングベクターと比べるために、レトロウイルスMFG-CATベクター(Kim et al., J. Virol., 72:994-1004, 1998)をpCP-gag／polおよびpCH-envベクターとともに293T細胞に形質移入させ、形質移入された細胞を48時間培養した後、細胞培養液をを0.45μmフィルターで濾過して細胞のないウイルス上澄液を得た。
【００７２】
次いで、前記ウイルスをNIH 3T3細胞(ATCC CRL 1658)に形質移入させた後、形質移入された細胞を４８時間培養した後、細胞質タンパク質抽出液のCAT活性を測定することによってレトロウイルスパッケージングの効率を決定した。
【００７３】
その結果、下記表２に示すように、本発明のpCP-gag／polおよびpCH-envのパッケージング効率は、従来のベクターを用いた場合に比べて約２０％増加したことを確認した。これは、エンハンサー／プロモーター配列以外に５’UTR配列をさらに挿入すると組換えベクターが種々の目的の真核細胞遺伝子発現ベクターとして有用であることを示す。
【表２】
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【００７４】
実施例１２：細胞培養システムにおけるpCN、pEFおよびpＣＥＦベクターの遺伝子発現濃度の比較
CAT断片をpEFベクターのHindIII／XbaI位置に挿入してpEF-CATベクターを構築した(図１２参照)。
【００７５】
pCN-CATとpEF-CATをHeLa細胞に形質移入させた。２日後、遺伝子発現濃度を比べるためにCAT活性を測定した。pCMVの遺伝子発現濃度を１と定め、残りの他のベクターの発現効率をそれに相応して決定した。表３から分かるように、遺伝子発現が染色体ではなく、エピソームプラスミドから誘導される一時的発現システムにおいてはPCMVがPEFより遥かに高い遺伝子発現を誘導した。
【００７６】
さらに、前記pＣＥＦ遺伝子発現濃度を既存の他のベクターと比べるために、pＣＥＦのBamHI部位にCAT断片を挿入してpＣＥＦ-CATを構築した。pＣＥＦ-CAT、pCN-CAT、pEF-CATを各々293T細胞に形質移入させ、４８時間後CAT活性を測定した。
【００７７】
【表３】
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【００７８】
表３に示すように、キメラベクターのCAT活性はpEF-CATに比べて１０倍、pCN-CATに比べて２倍程高かった。
【００７９】
実施例１３：連続発現システムの経時的な遺伝子発現
連続培養システムにおいてCAT遺伝子がどのぐらい長時間、そしてどのぐらいの多量に発現されるかを調査するために、安定に形質移入された細胞株を構築した。HeLa細胞をpCN-CATまたはpEF-CATで形質移入させ、G418を用いて選別した。G418耐性細胞を得た後、各細胞株からCAT活性を比べた。図１４に示すように、pEF-CATで形質移入された細胞のCAT活性はpCN-CATで形質移入された細胞のCAT活性とほとんど同じであった。この結果は、一旦染色体内に挿入されればPCMVの活性はPEFの活性は減少するが、PEFの活性は維持されることを示す。
【００８０】
前記結果を確認するために、pCN-CATまたはpEF-CATが安定的に形質移入された細胞株からCAT活性を６週間測定した結果、初期にはHCMVプロモーターからのCAT活性がEF1αに由来するプロモーターからのCAT活性より３倍程高かった。しかし、２週後にはHCMVプロモーターからのCAT活性がEF1αプロモーターCAT活性より低かった(図１８参照)。この結果は、PCMV由来の遺伝子発現濃度が染色体内に挿入された後減少したことを立証する。
【００８１】
実施例１４：サブクローンの遺伝子発現濃度の比較
細胞個体群(population)の活性は、異種構成員の平均値を示す。しかし、これらを産業的な目的に使用するためには、サブクローンが特徴づけられなければならない。したがって、各サブクローンの特性を調査するためにリングクローニング方法を行って細胞個体群からサブクローンを分離した。２５個のサブクローンがpCN-CATで形質移入された細胞株から分離され、１３個のサブクローンがpEF-CATで形質移入された細胞から得られた。これらの結果は、PCMVを有する２５個のサブクローンのうち三つが非常に高い遺伝子発現濃度を示す反面、残りの大部分はCATタンパク質を生産しなかったことを示す(図１９参照)。すなわち、PCMVを有する安定的に形質移入された細胞から誘導された大部分のクローンは不活性化された。
【００８２】
これに対し、PEFを有する１３個のサブクローンのうち７個が非常に高い遺伝子発現効率を示した。このような結果は、EF1αのような細胞性遺伝子から誘導されたプロモーターは連続培養システムにおいてPCMVのようなウイルス性プロモーターより安定的で効率的な遺伝子発現が誘導できることを示す。
【００８３】
実施例１５：VEGFの発現濃度
１)インビボでVEGFの発現
インビボでVEGFの発現濃度を調査するために、２週齢のBalb／Cマウスの前脛骨筋(anterior tibialis)にプラスミドを注射した。注射してから２日後、注射された筋肉組織から抽出した総タンパク質を用いてELISAを行った。図２０に示すように、筋肉に発現されたVEGFの濃度は非常に高かった(図２０参照)。
【００８４】
２)インビボのpCDNA3.1-VEGF165、pCN-VEGF165、pEF-VEGF165およびpＣＥＦ-VEGF165のVEGF発現濃度の比較
インビボの遺伝子発現濃度を比べるために、４週齢のBALV／Cマウスの前脛骨筋にpCDNA3.1-VEGF165、pCN-VEGF165、pEF-VEGF165およびpＣＥＦ-VEGF165プラスミドを各々100μｇずつ注射した。２日後、注射された筋肉組織から抽出した総タンパク質を用いてELISAを行った。その結果、pＣＥＦからのVEGF発現濃度がpEFおよびpCNよりそれぞれ９倍および３倍高かった(図１４参照)。
【００８５】
実施例１６：インビボでpCKとpCPの遺伝子発現濃度の比較
１)pCK-CATおよびpCP-CATの構築
pCKからの遺伝子発現効率をHCMV IE遺伝子の５’UTRを欠いたpCPからの遺伝子発現効率と比較するために、CATレポーター遺伝子を前記pCKとpCPベクターのHindIII／XbaI位置に各々挿入してpCK-CATとpCP-CATベクターを構築した(図２１および２２参照)。
【００８６】
２)インビトロでpCKとpCPの遺伝子発現効率の比較
pCK-CATおよびpCP-CATをC2C12細胞に形質移入させ、２日後CAT活性濃度を測定した。その結果、pCKベクターのCAT活性がpCPに比べて３０倍以上高かった(図２３参照)。
【００８７】
３)pCK-VEGF165とpCP-VEGF165のVEGF発現濃度の比較
pCK-VEGFおよびpCP-VEGFをC2C12細胞(ATCCCRL-1772)に形質移入させ、２日後VEGF発現濃度を測定した。その結果、pCK-VEGFベクターの発現濃度がpCPより３０倍以上高かった(図２４参照)。
【００８８】
実施例１７：インビボでpCKとpCPの遺伝子発現濃度の比較
１)インビボでpCP-CATとpCK-CATの比較
pCK-CAT１００μｇとpCP-CATを２〜４週齢のBalb／C雄マウスの前脛骨筋に注射し、４８時間後CAT活性を測定した。図２５に示すように、pCK-CATの遺伝子発現濃度はpCP-CATに比べて３０倍以上高かった(図２５参照)。
【００８９】
２)インビボでpCP-VEGFとpCK-VEGFの比較
裸のＤＮＡ遺伝子治療のためのpCK-VEGF165ベクターの使用可能性および優秀性を調査するために、pCK-VEGF165またはpCP-VEGF165ベクターを２〜４週齢のBalb／C雄マウスの前脛骨筋に注射した後、注射した筋肉組織から抽出した総タンパク質を用いてELISA(R & D systems社, n=41)を行った。具体的には、耐毒素除去カラム(Endotoxin-free Ｃolumn; Qiagen, Inc.)を用いて分離したDNAを1mg／mlの濃度でPBSに溶解した後、インスリン注射器を用いて注射した。その結果、pCK-VEGFベクターはpCP-VEGF165ベクターに比べてインビトロで高い遺伝子発現濃度を示した。この結果は、pCKベクターが裸のＤＮＡ遺伝子治療に有用であることを示す(図２６参照)。
【００９０】
実施例１８：遺伝子発現の経時変化
１)インビボでCAT生産濃度の経時変化
インビボのCAT生産の薬物動力学資料を得るために、pCK-CATベクター１００μgを２〜４週齢のBalb／C雄マウスの前脛骨筋に注射した後、９〜１５匹のマウスを用いて２週間CAT活性を測定した。その結果、pCK-CATベクターからのCAT発現は注射後２週間持続した(図２７参照)。
【００９１】
２)インビボのVEGF165発現の経時変化
インビボのVEGF発現の薬物力学資料を得るために、pCK-VEGF165ベクター１００μｇを２〜４週齢のBalb／C雄マウスの前脛骨筋に注射した後、１２匹のマウスを用いて２週間VEGF165濃度の変化を測定した。図２８に示すように、pCK-VEGFベクターからのVEGF165遺伝子発現が１回注射後２週間持続した(図２８参照)。
【００９２】
実施例１９：遺伝子発現の濃度依存性
１)CAT発現の濃度依存性
プラスミド濃度が遺伝子発現効率に及ぼす影響を調査するために、２〜４週齢のBalb／C雄マウスにpCK-CATベクターを増加投与量で注射し、２日後、注射部位からタンパク質を抽出し、これを分析した。この結果は、注射したpCK-CATベクターの投与量が遺伝子発現濃度と相関性があることを示す(図２９参照)。
【００９３】
２)インビボでVEGF発現の濃度依存性
プラスミド濃度が遺伝子発現効率に及ぼす影響を調査するために、２〜４週齢のBalb／C雄マウスにpCK-VEGFを増加投与量で注射した。注射してから２日後マウスを屠殺し、注射部位の総タンパク質を抽出してELISAで分析した(n=8-10)。その結果、注射したpCK-VEGFベクターの投与量が遺伝子発現濃度と相関性があるという前記結果を確認した(図２７参照)。
【００９４】
実施例２０：ラットマウスへの非経口投与による急性毒性実験
特定の病原のない(SPF)４週齢のBalb／C系マウスを用いて急性毒性実験を行った。マウスを５つの群に分け、各群のマウスに０.５間隔で50mg／kgの最大濃度までpCK-VEGF165を漸増する投与量で注射した。プラスミドを生理食塩水に溶解し、注射容量は２００μｌであった。
【００９５】
また、特定の病原のない(SPF)４週齢のＳＤ系ラットも５つの群に分け、各群のラットに０.５間隔で200mg／kgの最大濃度までpCK-VEGF165を漸増する投与量で注射した。プラスミドを生理食塩水に溶解し、注射容量は５００μｌであった。
【００９６】
各群は、５匹のマウスから構成されており、平均体重の個体を均一に分布した。DNA溶液をマウスとラットの前脛骨筋にインスリン注射器を用いて注射した。等量のPBSを対照群に投与した。投与してから１週間後、疾病、臨床症状、体重変化を観察した。その後、動物を解剖して内部臓器の異常可否を肉眼で観察した。
【００９７】
いずれの動物においてもVEGF発現プラスミドの投与によって誘発されたとみられる何らかの変化も発見されなかった。結論的に、pCK-VEGFベクターのマウスに対する最少致死量値は50mg／kgであり、ラットに対する最少致死量は２０mg／kg以上であると判断される。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
以上で述べたように、本発明は、種々の真核細胞において遺伝子発現を高い濃度に誘導できる効率的な真核細胞遺伝子発現ベクターを提供する。本発明のベクターは次のような特徴を有する:
【００９９】
１．HCMV IEとヒトEF1α調節部位を用いたベクターを構築するために、５’UTR全体(エクソン１、イントロンＡ、エクソン２の一部)部位およびプロモーターを種々の真核細胞における遺伝子発現を高効率に誘導するために用いた。
【０１００】
２．HCMV IE遺伝子のプロモーターと５’UTR部位を有するベクターは一時的に形質移入された動物細胞において遺伝子発現を強力に誘導できる。
【０１０１】
３．ＥＦ１α遺伝子のプロモーターと５’UTR部位を有する発現ベクターは動物細胞において高効率で安定的な遺伝子発現を誘導できるため、良質の細胞株を確立することができる。
【０１０２】
４．HCMV IE遺伝子のプロモーターと５’UTR部位を有する発現ベクターはインビボで遺伝子発現を高い濃度に誘導できるため、これらは裸のＤＮＡを用いた遺伝子治療に非常に有用である。
【０１０３】
５．HCMV IEエンハンサー、EF1αプロモーターおよびEF1α５’UTRキメラベクターは既存のベクターより遺伝子発現を高い濃度に誘導する。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】HCMV IE遺伝子に由来するエンハンサー／プロモーターおよび５’UTRを含む断片をpCDNA3.1に挿入することによってプラスミドｐＣＮを構築する過程を示す模式図である。
【０１０５】
【図２】ヒトＥＦ1α遺伝子由来のエンハンサー／プロモーターおよび５’UTRを含む断片をpCDNA3.1に挿入することによってプラスミドｐＥＦを構築する過程を示す模式図である。
【０１０６】
【図３】ＥＦ１α遺伝子由来のプロモーターと部分的なイトロン配列を含むｐＥＦｓベクターにHCMV IE遺伝子に由来するエンハンサー断片を挿入することによってpＣＥＦを構築する過程を示す模式図である。
【０１０７】
【図４】ｐＣＫベクターの構築過程を示す模式図である。
【０１０８】
【図５】VEGF121を用いてプラスミドpCN-VEGFベクターを構築する過程を示す模式図である。
【０１０９】
【図６】プラスミドpCK-VEGF165の構築過程を示す模式図である。
【０１１０】
【図７】プラスミドpCK-VEGF165の構築過程を示す模式図である。
【０１１１】
【図８】ｐＣＫベクターから５’UTRを取除いたｐＣＰベクターの構築過程を示す模式図である。
【０１１２】
【図９】プラスミドpCDNA3.1およびpCNの構築過程を示す模式図である。
【０１１３】
【図１０】、ＭＬＶのgag-pol遺伝子を発現するpCP-gag／polベクターの構築過程を示す模式図である。
【０１１４】
【図１１】ＭＬＶのgag-pol遺伝子を発現するpCP-gag／polベクターの構築過程を示す模式図である。
【０１１５】
【図１２】ＭＬＶのｅｎｖ遺伝子を発現するプラスミドpCH-envの構築過程を示す模式図である。
【図１３】ＭＬＶのｅｎｖ遺伝子を発現するプラスミドpCH-envの構築過程を示す模式図である。
【０１１６】
【図１４】一時的に形質移入されたシステムにおいて、pCDNA3.1-VEGF、pEF-VEGF、pCN-VEGFおよびpＣＥＦ-VEGFベクターの遺伝子発現濃度を示すグラフである。
【０１１７】
【図１５】プラスミドpEF-CATの構築過程を示す模式図である。
【０１１８】
【図１６】pEF-CATまたはpCN-CATベクターで一時的に形質移入されたHeLa細胞のCAT活性を示すグラフである。
【０１１９】
【図１７】pEF-CATまたはpCN-CATで安定的に形質移入されたHeLa細胞のCAT活性を示すグラフである。
【０１２０】
【図１８】pEF-CATまたはpCN-CATベクターで安定的に形質移入されたHeLa細胞の遺伝子発現濃度の経時変化を示すグラフである。
【０１２１】
【図１９】pEF-CATまたはpCN-CATベクターで安定的に形質移入されたHeLa細胞個体群から得られたサブクローンの遺伝子発現濃度を示すグラフである。
【０１２２】
【図２０】、pCN-VEGFベクターを注射したマウス筋肉におけるＶＥＧＦの発現濃度を示すグラフである。
【０１２３】
【図２１】プラスミドpCK-CATおよびpCP-CATの構築過程を示す模式図である。
【０１２４】
【図２２】プラスミドpCK-CATおよびpCP-CATの構築過程を示す模式図である。
【０１２５】
【図２３】pCK-VEGFまたはpCP-VEGFベクターで形質移入されたC2C12細胞のＣＡＴ活性を示すグラフである。
【０１２６】
【図２４】pCK-VEGF165またはpCP-VEGF165ベクターで形質移入されたC2C12細胞のＶＥＧＦ濃度を示すグラフである。
【０１２７】
【図２５】pCK-CATまたはpCP-CATベクターを注射したマウスの筋肉細胞におけるＣＡＴ活性を示すグラフである。
【０１２８】
【図２６】pCK-VEGFまたはpCP-VEGFベクターを注射したマウスの筋肉細胞におけるＶＥＧＦ濃度を示すグラフである。
【０１２９】
【図２７】ＣＡＴ遺伝子を注射したマウスの筋肉細胞における遺伝子発現の経時変化を示すグラフである。
【０１３０】
【図２８】pCK-VEGF165ベクターを注射したマウスの筋肉細胞におけるＶＥＧＦ濃度の経時変化を示すグラフである。
【０１３１】
【図２９】pCK-CATを注射したマウスの筋肉細胞における遺伝子発現の濃度依存度を示すグラフである。
【０１３２】
【図３０】pCK-VEGF165を注射したマウスの筋肉細胞における遺伝子発現の濃度依存度を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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