(57)【要約】  【課題】  煩雑な操作を必要とせず、検体中に特定塩基配列有する核酸が存在するか否かを迅速、かつ正確に判定することが可能な分析用部材、および該分析用部材を用いた、検体中の特定塩基配列を有する核酸の存在の有無を判定する方法を提供することにある。  【解決手段】  増幅を行う核酸増幅部分と、標的とする塩基配列をハイブリダイズするプローブが固定されている多孔質層を有するプローブ部とが、流路によって連結されている核酸の分析用部材の提供、及びこれを用いて、検体、プライマー及びＤＮＡポリメラーゼを含む溶液を、核酸増幅部分からプローブ部の順に流し、核酸増幅部分における核酸増幅の有無を、プローブ部におけるハイブリダイゼーションで検出することにより、検体中の特定塩基配列を有する核酸の存在の有無を判定する方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む溶液を流すための毛細管状流路を有し、かつ該毛細管状流路の一部にプローブが固定されているマイクロ流体デバイス(I)と、
前記核酸を含む溶液を核酸が熱変性する温度に加熱する温度調整手段(a)、及び
前記核酸を含む溶液を１０℃以下の設定温度に冷却する温度調整手段(b)
を有する温度調整装置(II)とを有し、
前記毛細管状流路内を流れる核酸が温度調整手段(a)、温度調整手段(b)の順序で加熱および冷却されるように、マイクロ流体デバイス(I)と温度調整手段(a)及び前記温度調整手段(b)を有する温度調整装置(II)とが配置されていることを特徴とする特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定するシステム。
【請求項２】
さらに核酸検出手段（III）を有する請求項１記載の特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定するシステム。
【請求項３】
前記温度調整装置（II）が、さらに、毛細管状流路中に固定されているプローブを加熱又は冷却するために前記毛細管状流路を加熱又は冷却する温度調整手段(ｃ)を有する請求項１又は２に記載の特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定するシステム。
【請求項４】
前記温度調整装置（II）が、さらに、毛細管状流路中においてＰＣＲ法に基づき所望の核酸を増幅させる為に前記核酸を含む溶液を熱変性温度、アニーリング温度及び伸長反応温度にそれぞれ保持するために、前記毛細管状流路を加熱又は冷却する温度調整手段(ｄ)を有するものである請求項１〜３のいずれかの請求項に記載の特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定するシステム。
【請求項５】
毛細管状流路を有し、かつ該毛細管状流路の一部にプローブが固定されているマイクロ流体デバイスを用いて、ハイブリダイゼーション法に基づき検体中の特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定する方法であって、核酸を含む溶液を、該毛細管状流路内を移動させることにより、ａ）核酸を熱変性する工程、ｂ）熱変性した核酸を１０℃以下に冷却する工程、ｃ）冷却した核酸をプローブとハイブリダイズさせる工程をこの順に有することを特徴とする特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定する方法。
【請求項６】
請求項１に記載のシステムを用いる請求項５記載の特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定する方法。
【請求項７】
前記溶液が、核酸増幅反応により得られた核酸を含む溶液である請求項５記載の特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定する方法。
【請求項８】
核酸増幅反応がＰＣＲ法である請求項７記載の特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定する方法。
【請求項９】
請求項４記載のシステムを用いて、マイクロ流体デバイスの毛細管状流路中においてＰＣＲ法に基づき所望の核酸を増幅させる請求項８記載の特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定する方法。
【請求項１０】
請求項３記載のシステムを用いて、プローブの温度を連続的あるいは段階的に変化させながら検出する請求項５記載の特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中に存在する特定の塩基配列を有する核酸が存在するか否かを判定するシステムおよび判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体中の特定塩基配列を有する核酸を検出し、判定する方法は数多く知られており、例えば、ハイブリダイズ法が挙げられる。ハイブリダイズの効率を上げ、検出感度を高めるために、ハイブリダイズに先立ち検体（核酸）を７０−１００℃で２−１０分間加熱した後、５℃以下に急冷するという方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、検体液の体積が大きい場合、急冷は困難で、充分な効果が得られないことがあった。また、加熱冷却操作に長時間を要することから、迅速な判定には不向きであった。
【０００３】
一方、ハイブリダイズの迅速化に焦点を当てた手法として、マイクロ流体デバイスを用いた方法が知られている。例えばマイクロ流体デバイスの流路内にＤＮＡプローブを固定したハイブリダイズ部を設け、検体を送液して該ハイブリダイズ部に接触させることでハイブリダイズさせる方法が挙げられる（例えば、特許文献２参照。）。この方法は、迅速性に優れているが、ハイブリダイズ効率が悪く検出感度が低くなることや、そのため正確な判断が困難となる場合があった。
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２８６２０号公報
【特許文献２】特開２００２−３００８７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、検体中に存在する特定の塩基配列を有する核酸を煩雑な操作を必要とせず、迅速かつ高感度で検出し判定することが可能なシステムおよび判定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、毛細管状流路を有し、かつ該毛細管状流路の一部にプローブが固定されているマイクロ流体デバイスに核酸を含む検体を注入し、該流路内を移動させながら核酸を熱変性、次いで１０℃以下に冷却した後、固定化プローブに接触させることによって、特定の塩基配列を有する核酸を迅速かつ効率的にハイブリダイズ、結果として高感度で検出できることを見いだし、本発明に至った。
【０００７】
すなわち本発明は、核酸を含む溶液を流すための毛細管状流路を有し、かつ該毛細管状流路の一部にプローブが固定されているマイクロ流体デバイス(I)と、
前記核酸を含む溶液を核酸が熱変性する温度に加熱する温度調整手段(a)、及び
前記核酸を含む溶液を１０℃以下の設定温度に冷却する温度調整手段(b)
を有する温度調整装置(II)とを有し、
前記毛細管状流路内を流れる核酸が温度調整手段(a)、温度調整手段(b)の順序で加熱および冷却されるように、マイクロ流体デバイス(I)と温度調整手段(a)及び前記温度調整手段(b)を有する温度調整装置(II)とが配置されている、特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定するシステム（以下、単に「本発明のシステム」という。）を提供する。
【０００８】
また、本発明は、毛細管状流路を有し、かつ該毛細管状流路の一部にプローブが固定されているマイクロ流体デバイスを用いて、ハイブリダイゼーション法に基づき検体中の特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定する方法であって、核酸を含む溶液を、該毛細管状流路内を移動させることにより、ａ）核酸を熱変性する工程、ｂ）熱変性した核酸を１０℃以下に冷却する工程、ｃ）冷却した核酸をプローブとハイブリダイズさせる工程をこの順に有する、特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定する方法（以下、単に「本発明の判定方法」という。）を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のシステムおよび判定方法によれば、マイクロ流体デバイスの毛細管状流路内で検体に含まれる核酸の熱変性、冷却、プローブとの接触を実施するため、迅速かつ高効率のハイブリダイズが可能で、結果として迅速、高感度かつ正確に特定の塩基配列を有する核酸の有無の判定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（１）システム
本発明のシステムは、核酸を含む溶液を流すための毛細管状流路を有し、かつ該毛細管状流路の一部にプローブが固定されているマイクロ流体デバイス(I)と、
前記核酸を含む溶液を核酸が熱変性する温度に加熱する温度調整手段(a)、及び
前記核酸を含む溶液を１０℃以下の設定温度に冷却する温度調整手段(b)
を有する温度調整装置(II)とを有し、
前記毛細管状流路内を流れる核酸が温度調整手段(a)、温度調整手段(b)の順序で加熱および冷却されるように、マイクロ流体デバイス(I)と温度調整手段(a)及び前記温度調整手段(b)を有する温度調整装置(II)とが配置されており、特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定する。以下、説明する。
【００１１】
（１．１）マイクロ流体デバイス（I）
（１．１．１）マイクロ流体デバイスの定義
本発明において、マイクロ流体デバイスとは、マイクロ・フルイディック・デバイス、マイクロ・ファブリケイテッド・デバイス、ラボ・オン・チップ、又はマイクロ・トータル・アナリティカル・システム（μ−ＴＡＳ）とも呼ばれるものを指し、流路内で、流体が温度変化をうける機構、濃度調整される機構、化学反応をうける機構、流動の流速、流動の分岐、混合若しくは分離などの制御をうける機構、又は電気的、光学的な測定をうける機構等を設けた毛細管状の流路を有するデバイスである。なお、該流路はマイクロ流体デバイスの外部に連絡していても良いし、外部に連絡しておらず、デバイス内に他の構造、例えば、貯液槽、廃液吸収部、圧力タンク、減圧タンクなどを設けておき、それらに連絡していても良い。
【００１２】
本発明で使用されるマイクロ流体デバイスの外形、材質は任意であって、毛細管状流路を有し、かつ該毛細管状流路の一部にプローブが固定されていればよい。毛細管状流路は、塊状や板状の成形物の内部に形成してもよく、好ましくは薄板状やシート状の基板内に形成された毛細管状の流路を有するマイクロ流体デバイスが用いられる。基板は、例えば、ガラス、水晶等の結晶、シリコンなどの半導体、セラミック、炭素、有機重合体（ポリジメチルシロキサンのように、無機元素を含有するものであってもよい。以下単に「重合体」と称する。）、又はこれらの発泡体などであることが好ましい。特に重合体を材料に用いた場合、安価で大量に製造できるため検体毎の使い捨てが可能となり、他検体のコンタミネーションを防止できること、また容易に焼却処理することが可能なため、検体由来の汚染や感染を抑制できることなどから材料として重合体が好ましい。
【００１３】
（１．１．２）毛細管状流路
毛細管状流路の太さは、特に本発明の効果を損ねない範囲であれば限定されないが、断面積が１×１０−１２ｍ２〜１×１０−６ｍ２、好ましくは１×１０−１０ｍ２〜２．５×１０−５ｍ２の毛細管状の流路を有することが好ましい。流路断面の幅、高さは、両者とも好ましくは１μｍ〜１０００μｍであり、さらに好ましくは１０μｍ〜５００μｍである。流路断面が１０μｍより大きい場合には製造が容易となる。また、流路が１０００μｍより小さい場合には、マイクロ流体デバイスとしての効果、すなわち反応・分析時間の短縮、少量の試料で合成・分析が可能、少廃棄物、温調精度の向上などの特長が発揮されるため好ましい。
【００１４】
流路断面の幅／高さ比は、用途、目的に応じて任意に設定できるが、一般には、０．５〜１０が好ましく、０．７〜５が更に好ましい。流路の断面形状は、矩形（角が丸められた矩形を含む。以下同じ）、台形、円、半円形、スリット状など任意である。流路の幅は一定である必要はない。
【００１５】
（１．１．３）プローブ部
本発明で用いられるマイクロ流体デバイスは、毛細管状流路の内壁面の少なくとも一部にプローブが固定されている。プローブと対向する内壁までの平均距離が１〜１００μｍの範囲にあることにより、プローブが固定されている毛細管内を移動する核酸とプローブとの間に有効にアフィニティーが生じるため、有効にハイブリダイズすることが可能となる。プローブは、標的とする塩基配列の核酸に対し特異的にアフィニティーを示すものであれば任意であり、例えば、標的とする塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有する核酸が好ましく用いられる。該プローブは、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、内壁面の少なくとも一部に物理的、あるいは化学的に固定して用いられることが好ましい。固定には、公知慣用の任意の方法が使用できるが、例えば、プローブの末端をアミノ基等で修飾し、内壁面の少なくとも一部にアルデヒド基などを有する多孔質層を設け、公知の方法で化学的に結合させると、プローブが多孔質層と強固に結合し、内壁面に固定することができる。
【００１６】
固定されているプローブが一本鎖の核酸の場合は、そのまま使用することができる。また、二本鎖核酸の場合は、加熱変性させて、一本鎖核酸とした後、使用することが好ましい。
【００１７】
多孔質層とは、層内に、表面まで連絡し、表面に開口している多数の細孔、即ち、連通細孔を有するものをいう。細孔の形状は任意であり、例えば三次元網目状（スポンジ状）、凝集粒子状、井戸状、不織布や編織布の繊維間状等であってもよい。多孔質層は、流路断面全面に形成されていても、また、一部に形成されていてもよい。特に、流路断面が方形である場合、一面のみの多孔質層で充分なプローブ固定量が得られる限り、作製が容易な一面のみ多孔質層の流路とすることが好ましい。多孔質層の厚みは、０．５μｍ〜３０μｍが好ましく、１μｍ〜２０μｍがさらに好ましく、２μｍ〜１０μｍが最も好ましい。０．５μｍ以上とすることで、充分な量のプローブを流路内面に固定可能であり、３０μｍ以下とすることで、分離や分析の時間短縮が計れる。上記多孔質層の細孔の孔径も任意であるが、０．０５μｍ〜３μｍが好ましく、０．１μｍ〜１μｍがさらに好ましい。０．０５μｍ以上とすることで、充分な量の標的とする塩基配列をハイブリダイズするプローブが固定可能となる。なお、前記細孔径は、多量に存在する細孔の孔径であり、必ずしも平均径とは限らない。
【００１８】
（１．１．４）核酸増幅部分
本発明で使用されるマイクロ流体デバイスは、検体中の核酸を増幅する手段を有する部分（以下、単に「核酸増幅部分」という）を有してもよく、より好ましい形態として使用される。この態様の詳細については、後述する。
【００１９】
（１．２）温度調整装置（II）
（１．２．１）核酸が熱変性する温度に加熱する温度調整手段（ａ）
本発明のシステムに使用する温度調整装置(II)は、毛細管状流路内を流れる核酸を含む溶液を、核酸が熱変性する温度に加熱する少なくとも１つの温度調整手段（ａ）を有する。該温度調整手段（ａ）は任意であって、例えば、マイクロ流体デバイス自身にヒーターを設けて所定部分を加熱しても、温度調整された加熱装置にマイクロ流体デバイスを接触させて所定部分を加熱しても良い。温度調整された加熱装置の例としては、金属製やセラミック製などの蓄熱体を加熱ヒーターで加熱し、温度調節器で設定温度より低い場合には加熱し、逆に設定温度より高い場合は放冷するなどして一定の温度に調節する装置等が挙げられる。前記核酸が熱変性する温度は、検出しようとする核酸の種類、例えば、核酸の長さやＧＣ含量などによって変動しうるが、通常、９０〜９６℃であればよい。検体中の核酸は、該温度調整手段（ａ）で熱変性温度に加熱されることによって、二本鎖核酸から一本鎖核酸に変性する。
【００２０】
（１．２．２）１０℃以下の設定温度に冷却する温度調整手段（ｂ）
本発明のシステムに使用する温度調整装置(II)は、毛細管状流路内を流れる核酸を含む溶液を、１０℃以下の任意の設定温度に冷却する少なくとも１つの温度調整手段（ｂ）を有する。該温度調整手段（ｂ）は、前述の温度調整手段（ａ）に対して、毛細管流路の下流部に設けられる。温度調整手段（ｂ）は任意であって、例えば、マイクロ流体デバイス自身に冷却装置を設けて所定部分を冷却しても、温度調整された冷却装置にマイクロ流体デバイスを接触させて所定部分を冷却しても良い。そのような冷却装置の例としては、金属製やセラミック製などの蓄熱体を冷媒やペルチェ素子で冷却し、温度調節器で設定温度より高い場合には冷却し、逆に設定温度より低い場合には加熱するなどして一定の温度に調節する装置等が挙げられる。検体中の核酸は加熱変性後、該温度調整手段（ｂ）で急冷されることによって一本鎖解離状態に保たれると考えられる。温度調整手段（ｂ）は、核酸が一本鎖解離状態を保てるよう１０℃以下とすることが好ましく、また、毛細管内で液が凍結せず流動できるよう−１０℃〜１０℃の任意の温度とすることがより好ましい。
【００２１】
（１．２．３）プローブ部の温度調整手段（ｃ）
本発明のシステムに使用する温度調節装置(II)は、プローブ部の温度を調整できる温度調整手段（ｃ）を備えることが望ましい。温度調整手段（ｃ）は任意であって、例えば、マイクロ流体デバイス自身に加熱または冷却装置を設けてプローブ部を温度調整しても、任意の温度に温度調整された温度調整装置にマイクロ流体デバイスを接触させてプローブ部を温度調整しても良い。温度調整された温度調整装置の例としては、金属製やセラミック製などの蓄熱体を加熱ヒーターで加熱し、温度調節器で設定温度より高い場合には冷却し、逆に設定温度より低い場合には加熱するなどして一定の温度に保持できる装置等が挙げられる。プローブ部の温度は、その使用方法によって異なり、プローブに核酸をハイブリダイズさせる場合は、実質的に相補的でない核酸や、プライマー、副産物などがハイブリダイズされないことが望ましく、プローブの鎖長やＧＣ含量などによって変動しうるが、例えば、４５〜６８℃の範囲で最適な温度に保持するのが好ましい。
【００２２】
また、プローブにハイブリダイズさせた核酸を解離させる場合は、該温度調整手段（ｃ）は、必要に応じて連続的に、あるいは、段階的に昇温できる機能を有していることが好ましい。この場合、ハイブリダイズさせた温度からプローブのＴｍ値以上に昇温すればよく、一定の速度、例えば、１分あたり５〜２０℃の昇温スピードで、Ｔｍ値以上、例えば、６０〜９６℃まで昇温すればよい。
【００２３】
（１．２．４）核酸増幅の為の温度調整手段（ｄ）
さらに本発明のシステムに使用する温度調整装置(II)は核酸を増幅するための手段を備えていても良く、一連の検出操作を簡略化できることから本発明の形態としてより好ましい。核酸を増幅する方法は任意であり、例えばＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）を用いることができる。マイクロ流体デバイスの毛細管状流路内でＰＣＲ法に基づき所望の核酸を増幅させる場合、本発明のシステムに使用する温度調整装置(II)は、核酸の熱変性温度、アニーリング温度及び伸長反応温度をそれぞれ保持する温度調整手段（ｄ）を有することが好ましい。より具体的には、マイクロ流体デバイスの一部に核酸が増幅する反応場となる毛細管状流路（以下、「核酸増幅部分」という）を設け、該核酸増幅部分全体の温度を、ＰＣＲに必要とされる変性、アニーリング、伸長反応温度にコントロールすることを繰り返す方法や、核酸増幅部分に変性、アニーリング、伸長反応温度の３つの温度帯を設け、それらの温度帯に核酸を含む溶液を通過させる、いわゆるフロースルーＰＣＲ法が挙げられる。前者の場合、目的の温度に到達するために一定の時間が必要であり、さらに、一定の温度に安定化させるためにも時間が必要であるのに対して、後者の場合、予め温度を設定するために、昇温、降温に要する時間が不要であり、ＰＣＲに要する時間が大きく短縮されることから、より好ましい形態である。
【００２４】
前記温度調節手段（ｄ）はマイクロ流体デバイス自身に組み込んで、核酸増幅部分の温度制御を行っても良いし、また、マイクロ流体デバイス自身には組み込まず、核酸増幅部分に相当するデバイス表面に前記温度調整手段（ｄ）を接触させるように配置して核酸増幅部分の温度制御を行っても良い。
【００２５】
例えば核酸増幅部分に変性、アニーリング、伸長反応温度の３つの温度帯を設ける方法として、３つの異なる温度を持つ３つの外部ヒーターを平行に置き、該外部ヒーターによって構成される平面と平行となるような同一平面上に、一本の毛細管状の流路が該ヒーター上を往復するように複数回折り曲げたものを核酸増幅部分として接触させる方法などが挙げられる。
【００２６】
前記核酸が熱変性する温度に加熱する温度調整手段（ａ）と、ＰＣＲ法等の核酸増幅手段で用いる変性温度を保持する温度調整手段（ｄ）とは共通であっても良い。
【００２７】
（１．３）核酸検出手段
本発明のシステムは、その構成の一部として、プローブにハイブリダイズされた核酸の有無を判定するために、必要に応じて核酸検出手段を有する。本発明のシステムにおいて、プローブにハイブリダイズした核酸の有無を目視にて検出できる場合は特段の核酸検出手段を備えている必要はないが、目視にて検出できない場合は、例えば、蛍光顕微鏡、マイクロプレートリーダー、蛍光光度計、吸光光度計、電離箱、ＧＭ計数管、シンチレーション検出器などの従来公知の核酸検出手段を有する。
【００２８】
（１．４）移送手段
本発明のシステムは、検体を毛細管状流路内を移送させるために、移送手段を有することが好ましい。該移送手段は、任意であり、検体を一定の速度で移送できることが好ましく、例えば、マイクロシリンジポンプなどの微量の液体を送液できるポンプの使用が好ましく用いられる。この場合、マイクロ流体デバイスの注入口から注入してもよく、逆に排出口から吸引してもよい。勿論、注入と吸引を同時に行ってもよい。
【００２９】
（１．５）配置
本発明のシステムは、前記毛細管状流路内を流れる核酸が温度調整手段（ａ）、温度調整手段（ｂ）の順序で加熱および冷却されるように、マイクロ流体デバイス（I）と温度調整手段（ａ）及び温度調整手段（ｂ）を有する温度調整装置（II）とが配置される。この際、核酸が熱変性する温度に加熱する温度調整手段(ａ)及び１０℃以下の設定温度に冷却する温度調整手段（ｂ）を有する温度調整装置上に、毛細管状流路内を通過する検体が温度調整手段（ａ）及び温度調整手段（ｂ）の順序で加熱および冷却されるようにマイクロ流体デバイスが配置されることが好ましい。
【００３０】
また、本発明のシステムに使用する温度調整装置（II）が、さらに温度調整手段(ｃ)を有する場合には、本発明のシステムは、前記毛細管状流路内を流れる核酸が温度調整手段（ａ）、温度調整手段（ｂ）及び温度調整手段（ｃ）の順序で加熱および冷却されるように、マイクロ流体デバイス（Ｉ）と温度調整手段（ａ）、温度調整手段（ｂ）及び温度調整手段（ｃ）を有する温度調整装置（II）とが配置される。この際、温度調整手段（ａ）、温度調整手段（ｂ）及び温度調整手段（ｃ）を有する温度調整装置（II）上に、毛細管状流路内を通過する検体が温度調整手段（ａ）、温度調整手段（ｂ）及び温度調整手段（ｃ）の順序で加熱および冷却されるようにマイクロ流体デバイスが配置されることが好ましい。その際、プローブ部は温度調整手段（ｃ）に接するよう配置される。また、特定の塩基配列を有する核酸をプローブ部にハイブリダイズした状態で検出できるように、あるいはまた、一旦ハイブリダイズした該核酸をプローブ部から解離させ、これを下流部分で検出できるように核酸検出手段（３）を必要に応じて設置する。
【００３１】
また例えば、より好ましい形態として核酸増幅部分があるマイクロ流体デバイスを使用する場合、本発明のシステムは例えば、核酸増幅の為の温度調整手段（ｄ）、温度調整手段（ａ）、温度調整手段（ｂ）及び温度調整手段（ｃ）を有する温度調整装置(II)上に、毛細管状流路内を通過する検体が核酸増幅手段、温度調整手段（ａ）、温度調整手段（ｂ）、温度調整手段（ｃ）の順序で加熱もしくは冷却されるようにマイクロ流体デバイスが配置される。それ以外の配置、構成は上記と同じである。
更に、上記配置を補助する目的でマイクロ流体デバイス（I）と温度調整装置（II）を所定位置に固定する位置決め装置が設けられていてもよい。
【００３２】
（１．６）使用方法
前記のように配置されたシステムのマイクロ流体デバイスに注入口から検体液を注入する。注入した検体液の移送方法として、例えば注入口にシリンジポンプなどを接続し排出口に向けて送液する。送液の流速は流路の幅や深さ、受けさせたい温度履歴などによって適宜調節すればよいが、遅すぎると蒸発や拡散といった問題が、速すぎると温度調節がうまくいかないという問題が発生することから、０．１〜１００μl／分の範囲で設定することが好ましい。
【００３３】
検体液中の核酸は（核酸増幅部分を有するシステムにおいてはこれを通過する過程で増幅され）、核酸が熱変性する温度に加熱する温度調整手段（ａ）上を通過する際に一本鎖に解離し、次いで温度調整手段（ｂ）上を通過することで一本鎖状態が保持される。そしてプローブ部を通過する際、プローブと実質的に相補的な配列を有する核酸のみがハイブリダイズする。
【００３４】
検体液に続けて、プローブ部に非特異的に吸着した核酸を洗浄するなどの目的で緩衝液を送液してもよい。緩衝液としては例えばＳＳＣなどが挙げられる。
【００３５】
ハイブリダイズした核酸は、目視あるいは必要に応じて核酸検出手段で検出することができる。検出はプローブ部を観察することによっても、あるいはプローブ部から熱変性により解離させたものが通過する下流部分を観察することによっても可能である。これにより、検体液中に特定の塩基配列を有する核酸が存在するか否かを判定することができる。
【００３６】
（２）判定方法
本発明の判定方法は、毛細管状流路を有し、かつ該毛細管状流路の一部にプローブが固定されているマイクロ流体デバイスを用いて、ハイブリダイゼーション法に基づき検体中の特定の塩基配列を有する核酸の有無を判定する方法であって、核酸を含む溶液を、該毛細管状流路内を移動させることにより、ａ）核酸を熱変性する工程、ｂ）熱変性した核酸を１０℃以下に冷却する工程、ｃ）冷却した核酸をプローブとハイブリダイズさせる工程をこの順に有することを特徴とする。以下、詳述する。
【００３７】
（２．１）マイクロ流体デバイスを用いたハイブリダイゼーション法
（２．１．１）検体
本発明の判定方法は、まず、検体を含む溶液を、前記マイクロ流体デバイスの毛細管状流路に導入する。
検体としては、核酸、および核酸を含有する試料が挙げられ、全血、血清、糞便、尿等の生体由来物、または、動物、植物、ウイルス由来の細胞組織、細胞培養物、さらには、飲料物、缶詰等の加工食品を含む食品一般等が挙げられる。また、核酸あるいは核酸を含有する試料を予め核酸増幅方法によって増幅した試料を検体として用いることもできる。例えば、検体中に微量の核酸を含む場合、もしくは検体中に含まれる核酸量が未知の場合、予めサーマルサイクラー等を用いて核酸を増幅し、これを検体として用いることができる。
【００３８】
（２．１．２）マイクロ流体デバイスを用いた核酸の増幅
検体中の核酸を増幅する場合、核酸増幅部分を有するマイクロ流体デバイスを用いれば、増幅から検出までを連続して行うことができ、煩雑な操作やサンプルの移動に伴うコンタミネーションの危険が減るため、より好ましい。
【００３９】
マイクロ流体デバイスで核酸を増幅する場合、例えば、検体、プライマー及びＤＮＡポリメラーゼを含む溶液をマイクロ流体デバイスの注入口から注入し、シリンジポンプなどにより送液して毛細管状流路中の核酸増幅部分を通過させればよい。通過する過程で例えばフロースルーＰＣＲなどが行われ、検体中の核酸が増幅される。
フロースルーＰＣＲの場合、例えば９０℃前後、７２℃前後、５５℃前後に温度調節した金属ブロックを並べて配置し、これらの上を順に繰り返し通過するようデザインされた流路を有するデバイスを密着させ、注入口から検体、プライマー及びＤＮＡポリメラーゼを含む溶液を注入し、送液すればよい。
【００４０】
本発明で用いるＤＮＡポリメラーゼは任意であるが、熱安定性を有していることが好ましい。
【００４１】
本発明で用いるプライマーは任意であり、増幅しようとする塩基配列に従い、公知の知見に基づいて調製したものを使用することができる。また、プライマーは標識されていてもよく、使用可能な標識としては蛍光物質、放射性同位体、ビオチン、酵素、発光団、抗原および抗体などが挙げられる。より具体的には、蛍光物質としてＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴＥＴ、テキサスレッド等が、放射性同位体としては32Ｐ、14Ｃ等が、また酵素としてはアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等が、発光団としてはルテニウム等が挙げられる。
【００４２】
核酸増幅反応液にはデオキシリボヌクレオシド三リン酸、塩化マグネシウムなどの金属塩類、トリス（Tris）等の緩衝剤を含んでいてもよい。
【００４３】
（２．１．３）核酸を熱変性する工程（ａ）
本発明の判定方法は、核酸を含む検体溶液を前記マイクロ流体デバイスの毛細管状流路に導入後、送液しながら核酸が熱変性する温度にまで加熱された流路部分を通過させる工程を含む。これによって検体中の核酸は熱変性して一本鎖となる。核酸の熱変性温度は、判定しようとする核酸の種類、例えば、核酸の長さやＧＣ含量などによって変動しうるが、通常９０〜９６℃である。
【００４４】
（２．１．４）熱変性した核酸を１０℃以下に冷却する工程（ｂ）
さらに本発明の判定方法は、熱変性した一本鎖の核酸を送液しながら、冷却された流路部分を通過させる工程を含む。この急冷操作によって、二本鎖に戻ることを抑制し一本鎖状態を保持させる。冷却温度は１０℃以下であれば良く、毛細管内で液が凍結せず流動できるよう−１０〜１０℃の任意の温度であることが好ましい。
【００４５】
（２．１．５）冷却した核酸をプローブとハイブリダイズさせる工程（ｃ）
本発明の判定方法は、工程（ａ）で熱変性され、続く工程（ｂ）で冷却された核酸をプローブ部に移送し、毛細管内壁に固定されたプローブと接触させることによってこれとハイブリダイズさせる工程を含む。ハイブリダイズの温度条件としては、核酸の長さやＧＣ含量などによって変動しうるものの、例えば４５〜６８℃の範囲で最適な温度に設定することが好ましい。
【００４６】
（２．２）ハイブリダイズ検出による核酸の有無の判定方法
検体中の特定塩基配列を有する核酸の有無は、プローブにハイブリダイズした核酸の検出結果により判定する。ハイブリダイズした核酸が検出されれば検体中に特定の塩基配列を有する核酸が存在するものと判定される。
ハイブリダイズした核酸を検出する方法としては、ハイブリダイズしているプローブ部を直接観察する方法と、ハイブリダイズした核酸を加熱により解離させ、これを流路中下流部分で観察する方法が挙げられる。検出手段は任意であるが、例えば核酸が蛍光標識されている場合は、蛍光顕微鏡などにより蛍光強度を測定すればよいし、また例えば放射性同位体標識されている場合は、ＧＭ計数管やシンチレーションカウンターなどにより測定すればよい。更に例えば核酸が標識されていない場合には、プローブとハイブリダイズしている状態の核酸に蛍光性インターカレーターなどを作用させ、その蛍光強度を測定すればよい。いずれの方法手段においても、バックグラウンドやノイズの低減を図る為、ハイブリダイズ後、検出に先立ちハイブリダイズ部を緩衝液などで洗浄することが好ましい。
【００４７】
（２．３）冷却効果の作用機序について
プローブにハイブリダイズできるのは検体中に一本鎖として存在している核酸であり、その割合を高めるため加熱変性させる工程をとっているが、温度が徐々に低下すると再び相補鎖とアニールしてもとの二本鎖に戻ってしまう。そこで、プローブと効率的にハイブリダイズさせるためには、相補鎖とアニールする前に一本鎖の状態でプローブと接触させることが必要である。マイクロ流体デバイスを用いた場合、解離された一本鎖の核酸は比較的短時間でプローブ部に到達し、プローブと接触しうるが、一本鎖の核酸が相補鎖とアニールする速度は相当に速く、マイクロ流体デバイスを使用しても効率的なハイブリダイズは困難である。
【００４８】
マイクロ流体デバイス上の核酸の熱変性部とプローブ部との間に冷却部を設けることによって、核酸を効率的にハイブリダイズできる理由は必ずしも明らかではないが、マイクロ流体デバイスは伝熱性に優れるために、急速に冷却することができ、ごく短時間で解離された状態を保持することができるためと推測される。解離された状態を保持できる理由もまた明らかではないが、冷却によって核酸の三次元的構造が変化し、相補鎖同士がアニールしにくい構造になっていること、あるいは、核酸が非特異的にアニールすることによって、相補鎖同士がアニールできない状態になっていることなどが推測される。後者の場合、非特異的にアニールされたものは、結合領域がプローブ鎖長より短いものが多いと考えられ、この場合、プローブ部の熱により解離されて一本鎖の核酸となり、プローブにハイブリダイズしやすくなる。
【００４９】
また、マイクロ流体デバイス上の核酸の熱変性部とプローブとは、該デバイスを軽量、微小化するために比較的近い距離に設定されることが多い。特に、プローブ部の温度調整手段は、厳密に温度制御されることが必要であるにもかかわらず、仮に熱変性部とプローブ部の間に冷却部が無い場合には、近傍にプローブ部よりも３０〜６０℃以上も高温の熱変性部があるため、プローブ部が熱変性部からの熱の流入による外乱を受け精密な制御が困難となる。一方、熱変性部とプローブ部との間に冷却体がある場合には、熱変性部の熱が冷却部に流れ、該冷却部がいわば緩衝剤的な役割を果たす結果、プローブ部の厳密な温度制御が可能となることが良好なハイブリダイズを示す一因と考えられる。
【００５０】
以上のことから、本発明のシステムおよび判定方法は、マイクロ流体デバイスの毛細管状流路内で検体に含まれる核酸の熱変性、冷却、プローブとの接触を実施するため、迅速かつ高効率のハイブリダイズが可能で、結果として迅速、高感度かつ正確に特定の塩基配列を有する核酸の有無の判定が可能となる。また、マイクロ流体デバイス内で一連の操作を実施することができるため、煩雑な操作を必要とせず、簡便に検出操作ができるだけでなく、さらに、検体を確実にプローブ部に輸送できることから、検体試料の移動に伴う夾雑物（コンタミ）の混入防止、判定ミス、検体取り違え、操作者への感染、人為的操作ミスを未然に防止することができ、特に臨床現場での利用に有効である。
【００５１】
（３）用途
本発明のシステムおよび検出方法は医学分野、薬学分野、農学分野などにおいて、遺伝子の発現解析やＤＮＡ診断など種々の用途、目的に使用できる。例えば、農学分野では品種の鑑定や種の改良などを目的とした塩基配列と表現型の関係解明が挙げられ、薬学分野では患者の薬物感受性の予察が挙げられる。また、医学分野では感染症の原因微生物の分析、疾患関連遺伝子のタイピング、ガンの診断、生体移植の適合性分析などが挙げられる。その他にも同一人判定、親子判定、男女判定などの法務鑑定での使用、考古学的研究での使用などを挙げることができる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は、以下の実施例の範囲に限定されるものではない。本実施例における紫外線照射、および蛍光特性測定は、以下の方法にて行った。
【００５３】
（紫外線ランプ１による照射）
３０００Ｗメタルハライドランプを光源とするアイグラフィックス株式会社製のＵＥ０３１−３５３ＣＨＣ型ＵＶ照射装置を用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を特に指定が無い限り室温、窒素雰囲気中で照射した。
【００５４】
（紫外線ランプ２による照射）
２５０Ｗ高圧水銀ランプを光源とするウシオ電機株式会社製のマルチライト２５０Ｗシリーズ露光装置用光源ユニットを用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が５０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を、特に指定が無い限り室温、窒素雰囲気中で照射した。
【００５５】
（蛍光強度測定方法）
ライカ株式会社製の共焦点レーザー顕微鏡ＴＣＳ−ＮＴを用いて測定した。測定条件はＰＭＴ感度４５０Ｖ、ピンホール１．００である。
【００５６】
（実施例１）
［エネルギー線硬化性組成物（i）の調製］
平均分子量２０００の３官能ウレタンアクリレートオリゴマー（大日本インキ化学工業株式会社製の「ユニディックＶ−４２６３」）７２質量部、ジシクロペンタニルジアクリレート（日本化薬株式会社製の「Ｒ−６８４」）１８質量部、メタクリル酸グリシジル（和光純薬工業株式会社製）１０質量部、デカン酸メチル（和光純薬工業株式会社製）を１５０質量部、揮発性の良溶剤としてアセトンを１０質量部、紫外線重合開始剤として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン（チバガイギー社製の「イルガキュア１８４」）３質量部を均一に混合して組成物（ｉ）を調製した。
【００５７】
［エネルギー線硬化性組成物（ii）の調製］
活性エネルギー線架橋重合性化合物として、「ユニディックＶ−４２６３」を８０質量部、及び１，６−ヘキサンジオールジアクリレート（第一工業製薬株式会社製の「ニューフロンティアＨＤＤＡ」）を２０質量部、光重合開始剤として「イルガキュア１８４」５質量部を均一に混合して組成物（ii）を調製した。
【００５８】
［エネルギー線硬化性組成物（iii）の調製］
活性エネルギー線架橋重合性化合物として、「ユニディックＶ−４２６３」を６０質量部、「ニューフロンティアＨＤＤＡ」４０質量部、光重合開始剤として「イルガキュア１８４」５質量部、及び重合遅延剤として２，４−ジフェニル−４−メチル−１−ペンテン（関東化学株式会社製）０．５質量部を均一に混合して組成物（iii）を調製した。
【００５９】
［多孔質層を底面に持つ凹部（流路）の形成］
ポリアクリレート（三菱レイヨン社製の「アクリライトL 000番」）製の７．５ｃｍ×２．５ｃｍ×１ｍｍの板に、組成物（ii）を塗布し、紫外線ランプ１により紫外線を３秒照射した。この半硬化状態の塗膜上に、組成物（i）を塗布し、該組成物（i）に紫外線ランプ１により紫外線を４０秒間照射して組成物（i）を硬化させ、ｎ−ヘキサンでデカン酸メチルを洗浄除去して多孔質塗膜を形成した。
【００６０】
上記多孔質塗膜に、組成物（iii）を染みこませ、該組成物（iii）の未硬化塗膜を形成し、所定のフォトマスクを通して紫外線ランプ２による紫外線照射を１２０秒間行って前記組成物（iii）の半硬化塗膜を形成し、非照射部分の未硬化の前記組成物（iii）をエタノールで除去して、多孔質塗膜が一部分に存在する塗膜を支持体上に形成した。該塗膜の上に、組成物（iii）を塗工し、該組成物（iii）の未硬化塗膜を形成し、所定のフォトマスクを通して紫外線ランプ２による紫外線照射を１２０秒間行い前記組成物（iii）の半硬化塗膜を形成し、非照射部分の未硬化の前記組成物（iii）をエタノールで除去して、多孔質塗膜が底面の一部に露出した凹部状の塗膜を支持体上に形成した。
【００６１】
［多孔質塗膜へのプローブの固定］
１０％ポリアリルアミン溶液（日東紡製のＰＡＡ−１０Ｃ）を純水にて希釈して５質量％ポリアリルアミン水溶液を調製した。次に、上記工程で作製した凹部を有する支持体を、該５質量％ポリアリルアミン水溶液と接触させ、５０℃にて２時間反応させることにより、ポリアリルアミン中の一部のアミノ基を、多孔質塗膜中のエポキシ基と反応させた。その後、流水で３０分間洗浄することによって、該標的とする塩基配列をハイブリダイズするプローブ固定用部分多孔質塗膜へのアミノ基の導入を行った。
【００６２】
２５質量％グルタルアルデヒド溶液（和光純薬工業製の２５％グルタルアルデヒド溶液）をリン酸緩衝液（和光純薬工業製の「りん酸緩衝剤粉末」を１リットルの滅菌水に溶解したもの）にて５倍希釈して５質量％グルタルアルデヒド水溶液を調製した。次に、上記工程にてアミノ基を導入した凹部を有する支持体を、該５質量％グルタルアルデヒド水溶液中に入れ、５０℃、２時間反応させて、該多孔質塗膜中に導入されたほぼ全てのアミノ基を、該グルタルアルデヒド中の片方のアルデヒド基と反応させた。その後、流水で５分洗浄して、該標的とする塩基配列をハイブリダイズするプローブ固定用部分多孔質塗膜へのアルデヒド基の導入を行った。
【００６３】
ＰＣＲ用サンプルチューブに５’末端をアミノ基修飾した核酸Ａ（５００μｍｏｌ／ｌ；配列番号１；nucleic acid A）を１μl、核酸Ａに相補的な核酸Ｂ（５００μｍｏｌ／ｌ；配列番号２；nucleic acid B）を１μl、ＰＣＲ用１０×緩衝液（宝酒造株式会社製の１０× Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ）を１μｌ、滅菌水を７μｌ加えた。サーマルサイクラーを用いてこれに「９５℃、２分→８０℃、２分→７０℃、２分→６０℃、２分→５０℃、２分→４０℃、２分→３０℃、２分→４℃、２分」の温度変化を与えることにより、核酸ＡとＢをアニールさせて二本鎖核酸とし、核酸溶液（Ｃ）を調製した。
【００６４】
前記工程にてアルデヒド基を導入した多孔質塗膜に、核酸溶液（Ｃ）を５μｌ滴下して、湿度１００％、５０℃にて１５時間インキュベートし、核酸の末端アミノ基を多孔質層のアルデヒド基と共有結合させた。その後、該多孔質塗膜を０．２質量％のテトラヒドロ硼酸ナトリウム水溶液に浸漬し、５分間還元反応させ、次いで、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液でリンスし、さらに、０．２×ＳＳＣでリンスし、プローブ固定用部分多孔質塗膜への前記二本鎖核酸（Ｃ）の固定を行った。
【００６５】
１０×ＴＢＥ緩衝液（和光純薬工業製の「１０×ＴＢＥ粉末」を滅菌水に溶かしたもの）を滅菌水にて１００倍して０．１×ＴＢＥ緩衝液を調製した。次に、上記工程にて核酸溶液（Ｃ）を導入した凹部を有する支持体を、該０．１×ＴＢＥ緩衝液に浸漬し、９５℃にて５分間煮沸しプローブ固定用部分多孔質塗膜に固定された核酸（Ｃ）から前記核酸（Ｂ）を解離させ、前記核酸（Ａ）のみがプローブ固定用部分多孔質塗膜上に固定された凹部を有する支持体を得た。
【００６６】
［蓋の固着］
組成物（ii）を、一時的な支持体である１５ｃｍ×５ｃｍ×３０μｍのポリプロピレンフィルム（二村化学工業社製の「二軸延伸ポリプロピレンフィルム「太閤」FOR 30番」）のコロナ放電処理された面上に、１２８μｍのアプリケータを用いて塗工した。該組成物（ii）の未硬化塗膜に、紫外線ランプ１により紫外線を３秒照射し、前記組成物の半硬化塗膜を形成し、上記工程で作製した凹部に張り合わせ、紫外線ランプ１により、紫外線を４０秒間照射して完全に硬化させた後、該一時的な支持体であるポリプロピレンフィルムを剥離し、多孔質層が底面に露出した流路を形成した。この後、前記工程において凹部上に張り合わせ完全に硬化した塗膜上に組成物（i）を塗布して塗膜を形成し、さらにその上に上基材として、下基材と同じポリアクリレート製（三菱レイヨン社製の「アクリライトＬ 000番」）の７．５ｃｍ×２．５ｃｍ×１ｍｍの板を重ね合わせ、５０ｍＷ／ｃｍ2の紫外線を窒素雰囲気中にて塗膜全面に４０秒間照射し、塗膜を硬化させた。
【００６７】
次いで、上基板を通過し流路に通じる直径１ｍｍの孔を、ドリルを使用して流路の両末端に形成し、さらにこれら２つの孔にそれぞれ内径３ｍｍ、高さ５ｍｍのポリ塩化ビニル管を接着して注入口（１２）、排出口（１３）とし、図２及び図３に示すマイクロ流体デバイス（１’）を製造した。
【００６８】
［ＰＣＲ（サーマルサイクラー）］
ＤＮＡポリメラーゼとしてジーンタック（株式会社ニッポンジーン製）を使用し、ＰＣＲ用緩衝液、ｄＮＴＰ混合液は該酵素に添付のものを使用した。２００μl容量のＰＣＲ用サンプルチューブに、５μｌの１０×ＰＣＲ用緩衝液、４μｌのｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ  各２．５ｍｍｏｌ／ｌ）、２．５μｌのプライマー１（ＦＩＴＣ標識、１０μｍｏｌ／ｌ；配列番号３；primer 1）、２．５μｌのプライマー２（１０μｍｏｌ／ｌ；配列番号４；primer 2）、０．２５μｌのジーンタック（５ユニット/μｌ）、テンプレートとして０．５μlのｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ１２  Ｇｌｙ（ＤＮＡ１ｎｇ；タカラバイオ株式会社製；配列番号５）を入れ、さらに滅菌水を加えて５０μｌとした。また、ｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ１２  Ｇｌｙの代わりにプラスミドｐＵＣ１１９溶液（ＤＮＡ１ｎｇ）を用いたものも用意した。これらをサーマルサイクラーにセットし、「９４℃、３０秒→５５℃、３０秒→７２℃１０秒」のサイクルを３０回行うことによって核酸を増幅させた。これらのＰＣＲ産物を検体液として以下の試験に供した。
【００６９】
［ハイブリダイゼーション］
マイクロ流体デバイス（１’）を図４に示す３つの金属ブロックから成る温度調整装置上に固定した。金属ブロック（Ａ）（２１）を９０℃、金属ブロック（Ｂ）（２２）を１℃、金属ブロック（Ｃ）（２３）を５５℃に設定した。前記で調製した各検体液２０μlをそれぞれマイクロ流体デバイス（１’）の注入口（１２）に注入し、さらに注入口（１２）にマイクロシリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製  ＩＣ３２００）を接続し、流速５μｌ/分で排出口（１３）に向けて送液し、次いで、０．２×ＳＳＣに切り替えて送液した。送液の過程で金属ブロック（Ａ）（２１）上を通過させることによって検体液中の核酸を変性して一本鎖化し、金属ブロック（Ｂ）（２２）上を通過させることによって一本鎖状態を保持し、引き続く該金属ブロック（Ｃ）（２３）上で一本鎖化した核酸をプローブとハイブリダイズさせた。
【００７０】
［核酸の検出］
プローブ部（９’）をライカ株式会社製の共焦点レーザー顕微鏡ＴＣＳ−ＮＴにて観察することによって、ハイブリダイズした核酸の検出を行った。テンプレートにｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ１２  Ｇｌｙを用いた試験区では、検体液注入から約３分後に該プローブ部（９’）の蛍光強度が大きく増加し、その際の蛍光強度は２００であった。一方、ｐＵＣ１１９を用いた試験区の蛍光強度は０であり、両者の蛍光強度の差は大きかった。これにより、検体中の特定塩基配列を有する核酸の塩基配列特異的検出が、即ち、検体中に特定塩基配列を有する核酸が含まれているか否かを迅速かつ正確に判定できた。
【００７１】
（実施例２）
基板としてポリアクリレート（三菱レイヨン社製の「アクリライトL 000番」）製の１２ｃｍ×３ｃｍ×１ｍｍの板を用い、露光時のフォトマスクを変えた以外は、実施例１と同様の操作で、図５及び図６に示すマイクロ流体デバイス（１’’）を得た。
【００７２】
［フロースルーＰＣＲ］
マイクロ流体デバイス（１’’）を図７に示す５つの金属ブロックから成る温度制御装置上に固定した。金属ブロック（Ａ）（３１）を９０℃、金属ブロック（Ｂ）（３２）を７２℃、金属ブロック（Ｃ）（３３）を５５℃、金属ブロック（Ｄ）（３４）を１℃、金属ブロック（Ｅ）（３５）を５０℃に設定した。
【００７３】
ＤＮＡポリメラーゼとしてジーンタック（株式会社ニッポンジーン製）を使用し、ＰＣＲ用緩衝液、ｄＮＴＰ混合液は該酵素に添付のものを使用した。２００μl容量のＰＣＲ用サンプルチューブに、５μｌの１０×ＰＣＲ用緩衝液、４μｌのｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ  各２．５ｍｍｏｌ／ｌ）、２．５μｌのプライマー１（ＦＩＴＣ標識、１０μｍｏｌ／ｌ；配列番号３；primer 1）、２．５μｌのプライマー２（１０μｍｏｌ／ｌ；配列番号４；primer 2）、０．２５μｌのジーンタック（５ユニット/μｌ）、テンプレートとして０．５μlのｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ１２  Ｇｌｙ（ＤＮＡ１ｎｇ；タカラバイオ株式会社製；配列番号５）、１０μlの２５％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液、５μlのグリセロールを入れ、さらに滅菌水を加えて５０μｌとした。また、ｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ１２  Ｇｌｙの代わりにプラスミドｐＵＣ１１９溶液（ＤＮＡ１ｎｇ）を用いたものも用意した。これらを検体液として以下の試験に供した。
【００７４】
各検体液２０μlをそれぞれマイクロ流体デバイス（２０）の注入口（１２’）に注入し、さらに注入口（１２’）にマイクロシリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製  ＩＣ３２００）を接続し、流速５μｌ/分にて排出口（１３’’）に向けて送液した。次いで０．２×ＳＳＣに切り替えて送液した。これにより、検体液は「金属ブロック（Ａ）（３１）→（Ｂ）（３２）→（Ｃ）（３３）→（Ｂ）（３２）→（Ａ）（３１）→（Ｂ）（３２）→（Ｃ）（３３）・・・」という順序で金属ブロック上を通過した。核酸の伸長反応は、（Ｃ）（３３）→（Ｂ）（３２）へと移動する際の（Ｂ）（３２）上で行われる。
【００７５】
［ハイブリダイゼーション］
検体液は前記核酸増幅（フロースルーＰＣＲ）部を通過した後、金属ブロック（Ａ）（３１）→（Ｄ）（３４）、（Ｅ）（３５）上を通過し排出口（１３’’）から排出される。該金属ブロック（Ａ）（３１）上で核酸を変性して一本鎖化し、金属ブロック（Ｄ）（３４）上で一本鎖状態を保持し、続く金属ブロック（Ｅ）（３５）上でプローブとハイブリダイズさせた。
【００７６】
［核酸の検出］
プローブ部（９’’）をライカ株式会社製の共焦点レーザー顕微鏡ＴＣＳ−ＮＴにて観察することによって、ハイブリダイズした核酸の検出を行った。テンプレートにｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ１２  Ｇｌｙを用いた試験区では、検体液注入から約２０分後に該プローブ部（９’’）表面の蛍光強度が大きく増加し、その際の蛍光強度は１７０であった。一方、ｐＵＣ１１９を用いた試験区の蛍光強度は０であり、両者の蛍光強度の差は大きかった。これにより、検体中の特定塩基配列を有する核酸の塩基配列特異的検出が、即ち、検体中に特定塩基配列を有する核酸が含まれているか否かを迅速かつ正確に判定できた。
【００７７】
（比較例１）
実施例１において、図４に示す温度調整手段（ｂ）の電源をオフにして冷却しなかった以外、実施例１と同様の操作で検出を行った。
【００７８】
テンプレートにｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ１２  Ｇｌｙを用いた試験区では検体液注入から約３分後に、プローブ部（９’’）の蛍光強度が僅かに増加した。その際の蛍光強度は３０であった。一方、ｐＵＣ１１９を用いた試験区の蛍光強度は０であり、両者の蛍光強度の差は僅かであった。よって、これをもって検体中の特定塩基配列を有する核酸の塩基配列特異的検出、即ち、検体中に特定塩基配列を有する核酸が含まれているか否かの判定を行うのは困難であった。
【００７９】
（比較例２）
温度調整装置として、図８に示す４つの金属ブロックから成る温度調整装置を用い、金属ブロック（Ａ）（４１）を９０℃、金属ブロック（Ｂ）（４２）を７２℃、金属ブロック（Ｃ）（４３）を５５℃、金属ブロック（Ｄ）（４４）を５０℃に設定した上に固定した以外、実施例２と同様にして得られたマイクロ流体デバイスを用いて、同様の操作で検出した。
【００８０】
テンプレートにｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ１２  Ｇｌｙを用いた試験区では検体液注入から約２０分後に、プローブ部（９’’）の蛍光強度が僅かに増加した。その際の蛍光強度は３０であった。一方、ｐＵＣ１１９を用いた試験区の蛍光強度は０であり、両者の蛍光強度の差は僅かであった。よって、これをもって検体中の特定塩基配列を有する核酸の塩基配列特異的検出、即ち、検体中に特定塩基配列を有する核酸が含まれているか否かの判定を行うのは困難であった。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本発明のシステムの模式図である。
【図２】実施例１及び比較例１で使用したマイクロ流体デバイスの模式図の平面図である。
【図３】実施例１及び比較例１で使用したマイクロ流体デバイスの模式図の側面図である。
【図４】実施例１及び比較例１で使用したマイクロ流体デバイス及び温度調整装置を有するシステムの模式図の平面図である。
【図５】実施例２及び比較例２で使用したマイクロ流体デバイスの模式図の平面図である。
【図６】実施例２及び比較例２で使用したマイクロ流体デバイスの模式図の側面図である。
【図７】実施例２で使用したマイクロ流体デバイスと温度調整装置とを有するシステムの模式図の平面図である。
【図８】比較例２で使用したマイクロ流体デバイスと温度調整装置とを有するシステムの模式図の平面図である。
【符号の説明】
【００８２】
１…マイクロ流体デバイス、１’…実施例１で用いたマイクロ流体デバイス、１’’…実施例２および比較例で用いたマイクロ流体デバイス
２…温度調整装置、３…温度調整手段（ａ）、４…温度調整手段（ｂ）、５…温度調整手段（ｃ）、６…ポンプ、７…廃液、８…温度調節器
９…プローブ部、９’…実施例１で用いたマイクロ流体デバイスのプローブ部、
１０…核酸検出手段
１１…毛細管状流路、１１’…実施例１及び比較例１で用いたマイクロ流体デバイスの毛細管状流路、１１’’…実施例２および比較例２で用いたマイクロ流体デバイスの毛細管状流路、１２…実施例１及び比較例１で用いたマイクロ流体デバイスの注入口、１２’…実施例２および比較例２で用いたマイクロ流体デバイスの注入口、１３…実施例１及び比較例１で用いたマイクロ流体デバイスの排出口、１３’…実施例２および比較例２で用いたマイクロ流体デバイスの排出口
２１…金属ブロック（Ａ）、２２…金属ブロック（Ｂ）、２３…金属ブロック（Ｃ）、
２４…デバイス架設台、２５…デバイス位置決め支持具
３１…金属ブロック（Ａ）、３２…金属ブロック（Ｂ）、３３…金属ブロック（Ｃ）、
３４…金属ブロック（Ｄ）、３５…金属ブロック（Ｅ）
４１…金属ブロック（Ａ）、４２…金属ブロック（Ｂ）、４３…金属ブロック（Ｃ）、
４４…金属ブロック（Ｄ）。
【図１】
2006271216.tif 000002
【図２】
2006271216.tif 000003
【図３】
2006271216.tif 000004
【図４】
2006271216.tif 000005
【図５】
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【図６】
2006271216.tif 000007
【図７】
2006271216.tif 000008
【図８】
2006271216.tif 000009
【配列表】
2006271216000001.app