(57)【要約】    【課題】本発明は、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧の予防及び診断方法を提供することを目的とする。    【解決手段】本発明は、血管障害性遺伝子多型と脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧との、より正確な相関を検定する方法を提供する。また、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧の診断及び発症する危険性の大きさを予測する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管障害性が関与する疾患に対する易罹患性を判定する方法であって、ヒトの血管障害性遺伝子の塩基多型を同定することを特徴とする易罹患性判定方法。
【請求項２】
血管障害性が関与する疾患が、少なくとも脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧の一つであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血管の障害性に関する遺伝子が血中の総コレステロール濃度及び又は低比重リポ蛋白コレステロール濃度に影響を与える遺伝子であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
血管の障害性に関する遺伝子が血中の総コレステロール濃度及び又は低比重リポ蛋白コレステロール濃度に影響を与える遺伝子であり、該遺伝子の塩基多型により、血中の総コレステロール濃度及び又は低比重リポ蛋白コレステロール濃度が上昇することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
血管の障害性に関する遺伝子の塩基多型を同定することで、血中の総コレステロール濃度及び又は低比重リポ蛋白コレステロール濃度が上昇することを予測又は予防する方法。
【請求項６】
血管の障害性に関する遺伝子がアルコールの代謝に関する遺伝子であり、該遺伝子の塩基多型を同定することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
血管障害性に関する遺伝子が、ヒトのアルコール脱水素酵素遺伝子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
アルコール脱水素酵素遺伝子の多型が、47番目のアミノ酸がアルギニンからヒスチジンにより置換されている遺伝子である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
アルコール脱水素酵素遺伝子の多型が、47番目のアルギニンをコードする２番目の塩基であるグアニンが、アデニンにより置換されている遺伝子である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子多型を、遺伝子増幅法又は遺伝子伸長法を用いて検出する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ヒトのアルコール脱水素酵素遺伝子多型を同定するキットであって、
(i)遺伝子多型検出用プライマー、
(ii)ＤＮＡポリメラーゼ、
(iii)４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、
(iv)野生型検出用プローブ及び多型検出用プローブ
を含む、キット。
【請求項１２】
ヒトのアルコール脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型を同定するキットであって、
(i)野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマー
(ii) ＤＮＡポリメラーゼ並びに
(iii) ４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）
を含む、キット。
【請求項１３】
更に
(v)各遺伝子多型を検出する手段
を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
(v)各遺伝子多型を検出する手段が、
(v-1)野生型検出用プローブ及び多型検出用プローブ
を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
(v)各遺伝子多型を検出する手段が、
（v-3）分子量マーカー
を含む請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
各プライマー、ｄＮＴＰまたは各プローブの少なくとも１つが、予め標識されていてもよい、請求項１１〜１５のいずれかに記載のキット。
【請求項１７】
アルコール脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型において、多型が野生型と少なくとも単一ヌクレオチド置換で異なる遺伝子である請求項１１〜１６のいずれかに記載のキット。
【請求項１８】
血管障害性が関与する疾患に対する易罹患性を判定するためのキットであって、
(i)遺伝子多型検出用プライマー、
(ii)ＤＮＡポリメラーゼ、
(iii)４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、
(iv)野生型検出用プローブ及び多型検出用プローブ
を含む、キット。
【請求項１９】
血管障害性が関与する疾患に対する易罹患性を判定するためのキットであって、
(i)野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマー
(ii) ＤＮＡポリメラーゼ並びに
(iii) ４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）
を含む、キット。
【請求項２０】
更に
(v)各遺伝子多型を検出する手段
を含む、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
(v)各遺伝子多型を検出する手段が、
(v-1)野生型検出用プローブ及び多型検出用プローブ
を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
(v)各遺伝子多型を検出する手段が、
（v-3）分子量マーカー
を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
各プライマー、ｄＮＴＰまたは各プローブの少なくとも１つが、予め標識されていてもよい、請求項１８〜２２のいずれかに記載のキット。
【請求項２４】
構造遺伝子の遺伝子多型及びプロモーター遺伝子の遺伝子多型において、多型が野生型と少なくとも単一ヌクレオチド置換で異なる遺伝子である請求項１８〜２３のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの血管障害性遺伝子の遺伝子多型を同定する判定方法又は検定方法、判定又は検定キット、並びに該遺伝子に関連する疾患の診断及び発症する危険性の大きさの予測方法に関する。更には、ヒトのアルコール脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型を同定する判定方法又は検定方法、判定又は検定キット、並びに脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症および高血圧の診断及び発症する危険性の大きさの予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳梗塞とは、動脈が何らかの原因で詰まり、それ以降の組織に血液が流れなくなるか、若しくは流れにくくなった状態を言う。死因の約２０％が脳血管疾患であり、その中の約５０％が脳梗塞で占められている。脳梗塞は、脳塞栓と脳血栓の２つに分類される。脳塞栓は、脳動脈には直接的な原因がなく、心臓病（心房細動、心筋症等）を起こしたことによって、心臓内で形成された血液、蛋白、脂肪等の凝固物が、脳動脈に流れ込み、脳動脈を塞ぐことにより起こる。これに対し、脳血栓は脳動脈の動脈硬化によって血管内皮が肥厚し、発症する。発症頻度は、脳塞栓よりも脳血栓の方が多い。
【０００３】
脳血栓の原因となる動脈硬化を診断する方法として、現在、眼底検査 、Ｘ線ＣＴ、ＭＲＩ、脈波速度法、超音波による血流計測等の非侵襲的診断法と、血管造映、血管内視鏡、血管内エコー等の観血的検査とがある。
【０００４】
血液中の脂質のうち、コレステロール（LDLまたはHDL）、中性脂肪（TG）、リン脂質などのいずれかが標準値より高い値であれば、高脂血症と診断される。高脂血症には、高コレステロール血症、高中性脂肪血症、低HDL血症などがあり、遺伝性、もしくは不適切な食事や運動不足が原因で、血中の脂質が過剰となり、動脈硬化を引き起こして虚血性心疾患などの様々な成人病をもたらす。
【０００５】
高脂血症の診断基準については、虚血性心疾患などの動脈硬化性疾患の発生率と血漿（けっしょう）脂質の値の相関についての疫学調査から検討されており、日本動脈硬化学会の診断基準では、コレステロール値が220mg／dl以上または中性脂肪が150mg／dl以上であれば高脂血症と診断される。
【０００６】
血液が血管の壁に与える圧力のことを血圧と言い、一般に血圧が高いとか低いと言った時には、これは動脈壁にかかる圧力を示し、臨床的には上腕の動脈で測定した圧を指標する。血圧は常に一定のものではなく、心臓が収縮するときには血管に流れ込む血液で動脈内の圧力が上がり、逆に心臓が拡張する時には動脈内の圧力が下がり、一定の周期でまさに脈動している。心臓の収縮期の血圧を最大血圧（収縮期血圧）と呼び、拡張期の血圧を最小血圧（拡張期血圧）と呼ぶ。血圧が高いということは、血管壁にかかる圧力が高いと言うことで、精神的な興奮や緊張、食生活などの生活習慣、加齢の影響、外気の温度などの環境によっても影響を受ける。一時的な血圧の変化は血管壁の弾力性などで吸収できるが、長い期間にわたって高い血圧が続くと、血管壁に過度の負担がかかり、心臓にも大きな負担になる。このように慢性的に高い血圧が続く状態を高血圧症と言う。
【０００７】
高血圧症の診断基準については、上腕の動脈で測定した最大血圧が１４０mmHg以上あるいは最小血圧が９０ mmHg以上の場合には高血圧症と診断される。
【０００８】
脳梗塞、ラクナ梗塞、血管の状態により発症する可能性の高い疾患であり、何らかの原因で、血管障害が起こることで発症の引き金となる。高血圧は、脳梗塞やラクナ梗塞の危険因子であり、高脂血症は高血圧の危険因子であるという関係があるが、相互の関係は複雑であり、その間をつなぐ因子としては、加齢、内分泌・代謝異常、自律神経異常、などが想定されるが、遺伝的因子についての解明がなされている因子は少ない。
【０００９】
遺伝子解析が頻繁に行われるようになり、一塩基多型（ＳＮＰ）と呼ばれる、配列決定されたゲノムにおいて高頻度に検出される遺伝的変異が、種々の病気の有用なマーカーとなりつつある。
【００１０】
アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）はアルコール代謝の主要酵素である。ＡＤＨ遺伝子のうちＡＤＨ２とＡＤＨ３には性質の異なるアイソザイムをコードするアレルがあり、コーケシアンでは様々なＡＤＨ３アレルが見つかっている。モンゴロイド、特に日本人においてはＡＤＨ２遺伝子のアミノ酸配列４７番目のアルギニン（ＡＤＨ２＊１アレル）がヒスチジン（ＡＤＨ２＊２アレル）のうち、欧米人の５％以下の比率であるＡＤＨ２＊２アレルを８５％以上有している。
【００１１】
ＡＤＨ２＊１にコードされるβ１サブユニットとＡＤＨ２＊２にコードされるβ２サブユニットは１個のアミノ酸の違いしかないが、β２β２ダイマーはβ１β１ダイマーの約１００倍の活性がある。
【００１２】
ＡＤＨ２とアルデヒド脱水素酵素２の遺伝型と２型糖尿病における血管合併症（糖尿病網膜症および糖尿病腎症）との関連は既に報告されているが、健常人を主とした一般人におけるＡＤＨ２の遺伝型と血管障害性の疾患に関する関連は未だ見いだされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記の事情に鑑みて達成されたものであり、血管障害性遺伝子多型と脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧との、より正確な相関を検定する方法を提供することを目的とするものである。さらに、アルコール脱水素酵素遺伝子の多型を同定することで、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧の診断及び発症する危険性の大きさを予測する方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、日本人の１１０２名の男性と１０９３名の女性の計２１９５名のアルコール脱水素酵素２（ＡＤＨ２）遺伝子型と血管の状態に関する疫学的調査を実施し、血管障害性に関する疾患との関連について鋭意検討を行った結果、ＡＤＨ２の４７番目のアミノ酸であるアルギニンをコードしている２番目の塩基であるグアニンがアデニンに置換することでアミノ酸がヒスチジンに置換されている遺伝子多型を有する男性と脳梗塞との間に極めて高い関連を有することを見出した。また、血中の総コレステロール濃度及び又は低比重リポ蛋白コレステロール濃度が上昇、更には高血圧とも高い関連を有することを見いだした。
【００１５】
本発明者らは、上記の知見及び考察を基に、さらに検討を重ね、本発明を完成するに至ったものである。即ち、本発明者らは以下の発明を提供するものである。
【００１６】
項１：血管障害性が関与する疾患に対する易罹患性を判定する方法であって、ヒトの血管障害性遺伝子の塩基多型を同定することを特徴とする易罹患性判定方法。
【００１７】
項２：血管障害性が関与する疾患が、少なくとも脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧の一つであることを特徴とする項１に記載の方法。
【００１８】
項３：血管の障害性に関する遺伝子が血中の総コレステロール濃度及び又は低比重リポ蛋白コレステロール濃度に影響を与える遺伝子であることを特徴とする項１または２に記載の方法。
【００１９】
項４：血管の障害性に関する遺伝子が血中の総コレステロール濃度及び又は低比重リポ蛋白コレステロール濃度に影響を与える遺伝子であり、該遺伝子の塩基多型により、血中の総コレステロール濃度及び又は低比重リポ蛋白コレステロール濃度が上昇することを特徴とする項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００２０】
項５：血管の障害性に関する遺伝子の塩基多型を同定することで、血中の総コレステロール濃度及び又は低比重リポ蛋白コレステロール濃度が上昇することを予測又は予防する方法。
【００２１】
項６：血管の障害性に関する遺伝子がアルコールの代謝に関する遺伝子であり、該遺伝子の塩基多型を同定することを特徴とする項１〜５のいずれかに記載の方法。
【００２２】
項７：血管障害性に関する遺伝子が、ヒトのアルコール脱水素酵素遺伝子であることを特徴とする項１〜６のいずれかに記載の方法。
【００２３】
項８：アルコール脱水素酵素遺伝子の多型が、47番目のアミノ酸がアルギニンからヒスチジンにより置換されている遺伝子である、項１〜７のいずれかに記載の方法。
【００２４】
項９：アルコール脱水素酵素遺伝子の多型が、47番目のアルギニンをコードする２番目の塩基であるグアニンが、アデニンにより置換されている遺伝子である、項１〜８のいずれかに記載の方法。
【００２５】
項１０：遺伝子多型を、遺伝子増幅法又は遺伝子伸長法を用いて検出する項１〜９のいずれかに記載の方法。
【００２６】
項１１：ヒトのアルコール脱水素酵素遺伝子多型を同定するキットであって、
(i)遺伝子多型検出用プライマー、
(ii)ＤＮＡポリメラーゼ、
(iii)４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、
(iv)野生型検出用プローブ及び多型検出用プローブ
を含む、キット。
【００２７】
項１２：ヒトのアルコール脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型を同定するキットであって、
(i)野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマー
(ii) ＤＮＡポリメラーゼ並びに
(iii) ４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）
を含む、キット。
【００２８】
項１３：更に
(v)各遺伝子多型を検出する手段
を含む、項１２に記載のキット。
【００２９】
項１４：(v)各遺伝子多型を検出する手段が、
(v-1)野生型検出用プローブ及び多型検出用プローブ
を含む、項１３に記載のキット。
【００３０】
項１５：(v)各遺伝子多型を検出する手段が、
（v-3）分子量マーカー
を含む項１４に記載のキット。
【００３１】
項１６：各プライマー、ｄＮＴＰまたは各プローブの少なくとも１つが、予め標識されていてもよい、項１１〜１５のいずれかに記載のキット。
【００３２】
項１７：アルコール脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型において、多型が野生型と少なくとも単一ヌクレオチド置換で異なる遺伝子である項１１〜１６のいずれかに記載のキット。
【００３３】
項１８：血管障害性が関与する疾患に対する易罹患性を判定するためのキットであって、
(i)遺伝子多型検出用プライマー、
(ii)ＤＮＡポリメラーゼ、
(iii)４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、
(iv)野生型検出用プローブ及び多型検出用プローブ
を含む、キット。
【００３４】
項１９：血管障害性が関与する疾患に対する易罹患性を判定するためのキットであって、
(i)野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマー
(ii) ＤＮＡポリメラーゼ並びに
(iii) ４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）
を含む、キット。
【００３５】
項２０：更に
(v)各遺伝子多型を検出する手段
を含む、項１９記載のキット。
【００３６】
項２１：(v)各遺伝子多型を検出する手段が、
(v-1)野生型検出用プローブ及び多型検出用プローブ
を含む、項２０に記載のキット。
【００３７】
項２２：(v)各遺伝子多型を検出する手段が、
（v-3）分子量マーカー
を含む、項２１に記載のキット。
【００３８】
項２３：各プライマー、ｄＮＴＰまたは各プローブの少なくとも１つが、予め標識されていてもよい、項１８〜２２のいずれかに記載のキット。
【００３９】
項２４：構造遺伝子の遺伝子多型及びプロモーター遺伝子の遺伝子多型において、多型が野生型と少なくとも単一ヌクレオチド置換で異なる遺伝子である請求項１８〜２３のいずれかに記載のキット。
【００４０】
本明細書でいう多型とは、同一集団上において、ある遺伝子座にある対立遺伝子が二種類以上存在し、その頻度が１％以上ある状態をいい、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、タンデムリピート多型、マイクロサテライト多型、挿入／欠失型多型などを含む。
【００４１】
本発明における多型は、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧に罹りやすい体質を付与する原因遺伝子の一つである。したがって、このような多型を有するか否かを調べるためのプローブ、プライマー及びキットは、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧に罹る可能性の高いグループ及び脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧の近縁者への遺伝を調べる遺伝子診断に用いることが可能である。
【００４２】
本発明の対象となる多型は、ヒトのアルコール脱水素酵素２遺伝子（ＡＤＨ２）に存在する多型であることが好ましく、より好ましくは４７番目のアミノ酸であるアルギニンをコードしている２番目の塩基であるグアニンが他の塩基に置換されている多型であり、さらに好ましくは、アデニンに置換しているものである。
【００４３】
本発明のキットは、ヒトのＡＤＨ２遺伝子の多型を含むDNA配列を特異的にハイブリダイゼーションできるプローブ、またはそのような多型を含むDNA配列を増幅できるプライマーを含む。キットに含まれる試薬としては、塩基の置換を検出できる方法により適宜変更可能である。たとえば、相補鎖を合成するタイプの多型配列の検出方法であれば、ｄｄＮＴＰ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、緩衝液などを含み、ＲＦＬＰのように制限酵素の切断に基づき検出する場合には適当な制限酵素を含む。
【００４４】
なお、本発明のＡＤＨ２遺伝子の多型同定キットにより、早期に脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧の発症する危険性の大きさを予測するのに有効である。
【００４５】
ＡＤＨ２遺伝子多型を同定する方法としては、特に限定されない。多型配列の検出方法としては、被験者のＤＮＡを対象として、特定遺伝子の遺伝子多型を検出する方法としては、サザンハイブリダイゼーション法やドットハイブリダイゼーション法（J. Mol. Biol., 98: 503-517, 1975等参照）、ジデオキシ塩基配列決定法、ＤＮＡの増幅手法を組み合わせた各種の検出法，例えばＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法（RFLP: Restriction fragment length polymorphism），ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86: 2766-2770, 1989等参照）、ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法（SSO: Specific sequence oligonucleotide）、ＰＣＲ−ＳＳＯとドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（Nature, 324: 163-166, 1986等参照）、ＡＲＭＳ法（Nucleic Acids Res., 1989, 2503-2516 (1989)）、ＡＳＰＣＲ（Proc. Natl. Acad. Sci., 1989, vol.86, 2757-2760）等が好適に用いられる。
【００４６】
また、本発明で言う「同定」とは、目的とする配列を直接的に同定する場合のみならず、目的とする配列と相補的な配列を検出することによる間接的な同定をも含む広い意味で、「同定」という用語を用いることとする。
【００４７】
尚、上記において、被験物としてのＤＮＡは、ヒトＤＮＡの全長ＤＮＡであってもよいが、必ずしもその必要はなく、ヒトＤＮＡの少なくとも上記本発明にかかる遺伝子の遺伝子多型位置を含む部分ＤＮＡであればよい。
【００４８】
また、測定対象であるＤＮＡは、ヒトに由来するものである限り特に制限されることなく、ヒトＤＮＡを含む例えば血液、毛髪、生体材料組織、手術切除組織、細胞株等の生体試料から広く採取されることができ、このサンプルに対して測定が行われる。
【００４９】
上記試料からＤＮＡの抽出する方法は、常法に従って行えばよく、例えば、自動核酸分離装置NA-1000（倉敷紡績（株））、ゲノム抽出キット（キアゲン（株））を用いて行うことができる。
【００５０】
本発明のヒトＤＮＡ多型の検出は、より好適には、少量のＤＮＡ試料を用いて簡便且つ容易にしかも感度及び精度の高い検出が可能である観点より、遺伝子増幅法、具体的にはＰＣＲ法若しくはそれに準じたＤＮＡ増幅法を組み合わせた方法や、遺伝子伸長法により実施することができる。これらは、所望ＤＮＡ断片を増幅または伸長し、得られた増幅ＤＮＡまたは伸長ＤＮＡの当該多型部位を含む塩基配列を解析することにより実施することができる。遺伝子伸長法においては、予め、ＤＮＡ断片を増幅させておいてもよい。
【００５１】
上記増幅法としては特に限定されるものではないが、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction；特公平４−６７９６０号公報、特公平４−６７９５７号公報）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification method；Ｎａｔｕｒｅ  第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（WO089/12696、特開平2-2934号など）、ＳＤＡ（Strand Displacment Amplification；Nucleic Acids Res.  第２０巻、第１６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（WO90/01069  ）、ＴＭＡ（Transcription Mediated amplification Method；J.Clin.Microbiol.  第３１巻、第３２７０頁(1993)）などが挙げられ、いずれにおいても適用することが可能である。遺伝子伸長法としては、ＡＲＭＳ法の記載に基づいて行うことができる。
【００５２】
また、ここで塩基配列の解析は、特に制限はなく上記した各種の測定手法において採用されている方法、例えば塩基配列の配列決定、ハイブリダイゼーションや制限酵素の利用によるもの、電気泳動等により好ましく行い得る。
【００５３】
ハイブリダイゼーション法によれば、本発明の塩基多型部位を含む位置に野生型、多型特異的プローブ（野生型検出用プローブ及び／又は変異型検出用プローブ）を設定し、各プローブでの反応性の有無により野生型または多型配列のいずれかを有するかを解析できる。
【００５４】
本発明の検出方法の例を挙げる。一つとしては、まず、ヒト生体試料からＤＮＡを抽出し、該遺伝子の少なくとも多型配列を有するかどうかが疑われる遺伝子断片を増幅する。増幅はＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）と共に、遺伝子多型検出用プライマーとして、遺伝子多型部位を含まないプライマー（フォワードプライマーとリバースプライマー）を用いて被験ＤＮＡから増幅し、多量に且つ濃縮されたサンプルを得ることが好ましい。次いで、増幅ＤＮＡサンプルに野生型と多型配列を有するプローブ（野生型検出用プローブ及び変異型検出用プローブ）を作用させ、どちらのプローブが作用したかを測定することにより、本発明にかかる遺伝子多型の存在を検定することができる。
【００５５】
または、上記濃縮されたサンプルに、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）と共に、遺伝子多型検出用プライマーとして、遺伝子多型部位を含むプライマー、即ち、野生型用プライマー及び／または多型用プライマーを用いて被験ＤＮＡを伸長させる。次いで、伸長ＤＮＡサンプルに野生型と多型配列を有するプローブ（野生型検出用プローブ及び／または変異型検出用プローブ）を作用させ、どちらのプローブが作用したかを測定することにより、本発明にかかる遺伝子多型の存在を検定することができる。または電気泳動によって伸長されたかどうか検出してもよい。
【００５６】
または、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）と共に、野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマーを用いて、遺伝子を増幅させることによって検定することもできる。これは検出を所望する遺伝子多型部位を有する所望のＤＮＡ断片を特異的に増幅するように適宜設定したプライマーの採用により行い得る。具体的には、特定の遺伝子多型部位を含む遺伝子断片が増幅されたか否かによって、遺伝子多型を検出する方法であるが、特定の遺伝子多型部位を含む染色体又は断片を含む核酸試料に、野生型用プライマーと及び多型用プライマー（フォワードプライマーに相当）を同時にまたはそれぞれ別々に用いて、リバースプライマーと共に増幅反応を行うことにより多型を検出する方法である。ここでフォワードプライマーは上鎖（upper strand）に相同でも下鎖（lower strand）に相同であってもよいが、好ましくは上鎖（upper strand）に相同であって、リバースプライマーはその反対である。
【００５７】
本発明において、野生型用プライマーとは、通常の表現型を有している上鎖又は下鎖の塩基多型部位を含む遺伝子断片に相同な配列を有するプライマーであって、多型用プライマーとは、野生型とは異なる配列を有している上鎖又は下鎖の塩基多型部位を含む遺伝子断片に相同な配列を有するプライマーである。本発明においては、より具体的には、構造遺伝子の野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマー、プロモーター遺伝子の野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマーを使用する。
【００５８】
野生型用プライマーと多型用プライマーは、好ましくは、３’末端近傍に遺伝子多型部位を有するのが好ましい。
【００５９】
遺伝子の増幅におけるプライマーは、被験者のヒトＤＮＡに由来するＤＮＡを鋳型として、少なくとも当該所望の多型部位を含む領域を有する部分ＤＮＡを増幅できるように設計されたものであり、これは、ヒトＤＮＡに特異的であって、他の遺伝子と相同でなければ（例えば、繰り返し配列やパリンドローム配列でないこと等が重要）特に制限されることなく、ＤＮＡの合成の態様、合成するＤＮＡの領域及び塩基長等に応じて適宜選択することができる。
【００６０】
本発明におけるプライマーの塩基長は、当該ＤＮＡに特異的なプライマーとして機能し得る限り特に制限されず、通常１５〜３５程度、好ましくは２０〜３０程度であることができる。
【００６１】
また、増幅されるＤＮＡ領域も、特に限定されないが、引き続く塩基配列の解析に好適に利用できるように設定するのがよく、例えばハイブリダイゼーション法を利用する場合は、プローブとの反応が容易に確認できるように設定するのがよい。
【００６２】
従って、本発明は、被験者のヒトＤＮＡに由来するＤＮＡを鋳型として、少なくとも本発明の特定の遺伝子多型部位を含む領域を有する所望の部分ＤＮＡを合成できるように設計した上記各プライマーをも提供する。
【００６３】
尚、ここでいうＤＮＡの合成とは、特定のＤＮＡ（センス鎖、アンチセンス鎖）を鋳型として、その配列に相補的な配列を有するＤＮＡを伸長及び増幅することを広く含む概念である。
【００６４】
上記したプライマーを含む本発明のＤＮＡは、所望により、ＤＮＡ自動合成機等を利用して本発明で開示する塩基配列に従って合成することができる。
【００６５】
増幅または伸長したＤＮＡを遺伝子多型の塩基配列を解析する方法としては、より具体的には、上記のごとく、電気泳動を行ってもよいし、塩基配列決定法に従っておこなってもよいし、質量分析をおこなってもよいし、更にはプローブを用いたハイブリダイゼーションによっておこなってもよい。
【００６６】
プローブを用いたハイブリダイゼーション法としては、伸長または増幅された特定の核酸に、該核酸配列中に含まれる遺伝子多型配列部分に特異的なプローブ（野生型検出用プローブまたは多型検出用プローブ）を用いて、ハイブリダイゼーションをおこなって検出してもよいし、２種以上のプローブ（野生型検出用プローブ及び多型検出用プローブ）を同時にまたは別々に作用させ、各々のプローブにより得られる検出シグナルの比を求めることによって行うこともできる。
【００６７】
本発明で使用されるプローブは、遺伝子多型部位を含みその種類により検出シグナルが異なれば良いが、好ましくは連続した少なくとも１５塩基、より好ましくは連続した少なくとも１８塩基からなる塩基配列が必要である。上限としては４０塩基程度、好ましくは２０〜３０塩基程度である。プローブは特定核酸配列と相補鎖を形成すればＤＮＡでもＲＮＡでもＰＮＡでもよく、化学合成または生物学的な方法により調製することができる。例えば、パーキンエルマー社のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いてホスホアミダイト法により合成できる。精製はＦＰＬＣでＭＯＮＯ−Ｑカラムや逆相カラムにて実施しても良い。他の合成方法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイト法等がある。
【００６８】
上記各プライマー、ｄＮＴＰ、各プローブは、予め標識されていてもよい。または、リンカーアームを有していてもよい。具体的には、合成時にビオチン、リンカーアーム、蛍光物質等を有するヌクレオチドまたはオリゴｄＧＴＰ、オリゴｄＡＴＰ、オリゴｄＴＴＰ、オリゴｄＣＴＰ等を５’末端または３’末端に付加し修飾基を導入しても良い。あるいはビオチン、リンカーアーム、蛍光物質等を有するヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配列中のヌクレオチドの替わりに置換して合成し修飾基を導入しても良い。あるいは合成したヌクレオチドに後から32P、35Sなどの放射性物質、ALP、PODなどの酵素、FITC、HEX、6-FAM、TETなどの蛍光物質など、公知のオリゴヌクレオチドの標識物を導入しても良い。
【００６９】
また本発明において、プローブで検出する前に、予め試料中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸配列を増幅させておいてもよい。
【００７０】
より具体的には、例えば、ビオチン等で標識したプライマーを用いて核酸配列を伸長または増幅した後、伸長または増幅核酸を１本鎖にし、例えば、マイクロタイタープレートのような固相に結合させた野生型検出用プローブまたは多型検出用プローブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしなかった核酸を洗いだし、プローブとハイブリダイズした核酸のプライマーの標識によりハイブリダイズしたか否かを検出し、各プローブの検出シグナルの比により遺伝子多型が野生型か多型もしくは混合型であるのかを同定する方法が挙げられる。
【００７１】
本発明によって明らかにされた、ヒトのＡＤＨ２の遺伝子多型を同定し、検定することで、脳梗塞またはラクナ梗塞の危険性のある素因を診断するにあたっては、本発明のキットを使用することが好ましい。
【００７２】
かかる検定キットは、被験者のヒトＤＮＡに由来するＤＮＡを鋳型として、本発明特定の遺伝子多型位置を含むＤＮＡ領域を合成できるように設計された前記のプライマーを必須成分として含有することを特徴とするものである。当該プライマーは、本発明の多型の検出方法に応じて適宜選択することができる。
【００７３】
本発明のキットは、ヒトのアルコール脱水素酵素遺伝子多型を同定するための試薬キットであって、また、血管障害性が関与する疾患に対する易罹患性を判定するための試薬キットである。なお、血管障害性が関与する疾患は、少なくとも脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧の一つであることが好ましく、血管の障害性に関する遺伝子が血中の総コレステロール濃度及び又は低比重リポ蛋白コレステロール濃度に影響を与える遺伝子であることが好ましい。
【００７４】
本発明の試薬キットは、上記プライマー成分に加えて、本発明にかかる変異の存在の検出に応じた一乃至数個の試薬を組み合わせたものであってもよい。かかる試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ＤＮＡ合成基質類、ＤＮＡ合成酵素類等を挙げることができる。更に、当該試薬キットには、測定の実施の便益のために適当な緩衝液、洗浄液等が含まれていてもよい。
【００７５】
具体的には、本発明のキットは、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。
【００７６】
より具体的には、本発明のキットには、ヒトのＡＤＨ２の遺伝子多型を同定する検定キットであって、
(i)遺伝子多型検出用プライマー、
(ii)ＤＮＡポリメラーゼ、
(iii)４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、
(iv)野生型検出用プローブ及び多型検出用プローブ
を含むキットが含まれる。
【００７７】
(i)遺伝子多型検出用プライマーにおける遺伝子多型検出用プライマーとしては、遺伝子多型部位を含まないプライマー、即ち、フォワードプライマー及びリバースプライマーの組み合わせであってもよいし、遺伝子多型部位を含むプライマー、即ち、野生型用プライマー及び多型用プライマーの組み合わせであってもよい。
【００７８】
(iv)野生型検出用プローブ及び多型検出用プローブとしては、上記の通りである。
【００７９】
また、本発明のキットには、
(i)野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマー
(ii) ＤＮＡポリメラーゼ並びに
(iii) ４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）
を含むキットが含まれる。
【００８０】
(i)野生型用プライマー、多型用プライマー及び共通のリバースプライマーとしては、検出を所望する遺伝子多型部位を有する所望のＤＮＡ断片を特異的に増幅するように適宜設定できる。野生型用プライマーと多型用プライマーは、好ましくは、３’末端近傍に遺伝子多型部位を有するのが好ましい。
【００８１】
さらに、上記キットは、(v)各遺伝子多型を検出する手段に必要な試薬を含んでいてもよい。例えば、電気泳動法に必要な分子量マーカー、またはハイブリダイゼーションに必要な各種プローブを含んでいてもよい。
【００８２】
該プローブとしては、具体的には、遺伝子多型を検出するための、野生型検出用プローブ及び／または多型検出用プローブが挙げられる。それらは上述の通りである。
【００８３】
また、本発明のキットにおいては、各プライマー、ｄＮＴＰ、各プローブは、予め標識されていてもよい。または、リンカーアームを有していてもよい。
【発明の効果】
【００８４】
上述したように、本発明は、血管障害性遺伝子多型と脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧との、より正確な相関を判定又は検定する方法である。例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子の多型を同定することで、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧の診断及び発症する危険性の大きさを予測する方法であり、該疾患の早期発見、予防に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００８６】
実施例１：アレル特異プライマーを用いたＡＤＨ２遺伝子の塩基多型の検出
１）多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
ＧｅｎＢａｎｋの情報に基づき（アクセッション番号AF153821）、プライマーをデザインし、DNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、ＧＥＮＳＥＴ KK、アマシャムファルマシア  バイオテク（株）等）に依頼した。
【００８７】
配列表の配列番号１に示すオリゴ１はアンチセンス鎖で、3’末端から2番目に野生型(G)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチを有する。配列表の配列番号２に示すオリゴ2はアンチセンス鎖で、3’末端から2番目に変異型(A)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチを有する。配列表の配列番号３に示すオリゴ３がセンス鎖であり、オリゴ１、2と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ1、2、3は必要により標識して使用される。
【００８８】
（２）PCR法による遺伝子多型の解析
1) PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により遺伝子の塩基多型を解析した。
【００８９】
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。
Taq DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ１および／または２
(オリゴ1は5’をFITCにより標識、オリゴ2はTexas Redにより標識)  5 pmol
オリゴ3 (5’をビオチンにより標識)     5 pmol
×10緩衝液                            2.5 μl
2mM dNTP                              2.5 μl
25 mM  MgCl２                         2.0 μl
Taq DNAポリメラーゼ                   1.3 Ｕ
抽出DNA溶液                          20 ng
増幅条件
95℃・5分
95℃・30秒、62.5℃・30秒、72℃・30秒（35サイクル）
72℃・2分
【００９０】
2) アビジン結合磁性粒子による検出
1)の増幅反応液10μｌを500mMトリス緩衝液(pH7.5)、2M NaCl、1mM EDTA 1.25μgアビジン結合磁性粒子（ダイナル製）の溶液40μlに加えて、室温にて15分間反応させた。これによって、増幅されたヒトＡＤＨ２伝子断片および、ビオチン標識オリゴヌクレオチドがアビジン結合磁性粒子に捕捉される。
【００９１】
次に、磁性粒子を磁石で分離し、未反応蛍光標識オリゴヌクレオチドが含まれる上清を7.5ｍMnaOH 100μlと混和した。室温で10分間放置後に暗室中で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。
【００９２】
所要時間は約0.5時間であった。
【００９３】
得られた蛍光強度から、以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
【００９４】
FL（試料の蛍光強度）＝FLb-FLs        （式１）
FLｂ：Negative Control （試料が未添加）の蛍光強度
FLｓ：各試料の蛍光強度
表１にみられるようにアレル特異プライマーを用いて、ＡＤＨ２遺伝子多型を正確に同定することが可能であった。
【００９５】
【表１】
2006075134.tif 000002
【００９６】
実施例２：ＡＤＨ２遺伝子多型と疾患との関連解析
本発明を完成するにあたり、本発明者等は1997年から始まった、老化と老化に関連する疾患の予測研究の集団から、40〜79歳の居住地をランダムにセレクトした参加者（１１２６名の男性、１１０６名の女性）について、１０００以上の項目（例えば、年齢、身長、体重、喫煙の有無、飲酒量、頭部ＭＲＩ、及び各種血液検査等）を行い、ＤＮＡサンプル用の末梢血を採取した。
【００９７】
採取された末梢血より、フェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、実施例１の方法によりＡＤＨ２の遺伝多型を同定した。
【００９８】
得られた結果の解析は、疾患との関連性、頻度及びハーディ・ワインバーグ平衡を決定するための統計的手法より行った。
【００９９】
遺伝子多型と関連の認められた男性の結果を表２に示す。
【０１００】
ＡＤＨ２の遺伝子型をＡＤＨ２＊２／２、ＡＤＨ２＊２／１、ＡＤＨ２＊１／１の３つに分け解析を行った。ＡＤＨ２＊２／２は遺伝子型Ａ／Ａを、ＡＤＨ２＊２／１は遺伝子型Ａ／Ｇ、ＡＤＨ２＊１／１は遺伝子型Ｇ／Ｇを示す。
【０１０１】
女性においては、３タイプで大きな差は認められなかったが、男性において、総コレステロール（ＴＣ）と低比重リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）のレベルが２／２と２／１のタイプ間で著しい差が認められ、２／１タイプはＴＣとＬＤＬ−Ｃのレベルを増加させることが示唆された。
【０１０２】
頭部ＭＲＩの結果、２／２タイプのグループに比較して、２／１タイプのグループで、高頻度で脳梗塞及びラクナ梗塞が認められた。
【０１０３】
【表２】
2006075134.tif 000003
【０１０４】
アルコールの飲酒とも関連して解析した結果、アルコール消費量と関連なく２／１タイプにおいて、２/2タイプと比較し、脳梗塞及びラクナ梗塞に対して高いリスクを示した。結果を表３に示す。
【０１０５】
【表３】
2006075134.tif 000004
【０１０６】
２群に分けて解析した結果、１／１および２／１のグループは、２／２タイプのグループに比較して、有意に拡張期血圧が高かった。結果を表４に示す。
【０１０７】
【表４】
2006075134.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
上述したように、本発明は、血管障害性遺伝子多型と脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧との、より正確な相関を判定又は検定する方法である。例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子の多型を同定することで、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧の診断及び発症する危険性の大きさを予測する方法であり、該疾患の早期発見、予防に有用である。
【０１０９】
以上の本発明者の実験により、血管障害性遺伝子多型を同定することで、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧の診断及び発症する危険性の大きさの予測事が可能になる。例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子の多型を同定することで、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧の診断及び発症する危険性の大きさを予測する事が可能になり、該疾患の早期発見、予防、治療方針の変更、特に薬剤の選択や投与量の調節に有用である事が示された。
【０１１０】
したがって、本発明によれば、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧患者の早期発見と、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧に罹患する可能性の高い人を従来の報告にない高い頻度で検出することができる。また本発明の多型配列を同定することによって、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧発症前に脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧に罹患する可能性の高いグループを検出することができ、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧発症前に予防または早期の治療を行うことができる。さらに、他の脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧との関連が示唆されている遺伝子の多型の検出と組み合わせることにより、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧に罹る可能性がより高い人をより高い精度で検出することができる。本発明のキットまたは方法を用いて、たとえ脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧の発症が確認される前であっても、希望により本発明の多型を有しているかどうかを調べ、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧に罹患しやすい形質が遺伝しているかどうかを推定できる点で有益である。さらに、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧を有する患者においても、その原因のひとつに遺伝的背景があることを教育し、生活習慣の改善などに努力させることができる。また、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧を有する患者の治療において、最適な薬剤の選択、最適な投与量の判断、あるいは薬剤の効果に対する判断において、遺伝因子が関与しているかを調べることで、治療方針を変更することが可能である点で有益である。
【０１１１】
ＡＤＨ２は飲酒行動を規定する因子でもある。よって、脳梗塞、ラクナ梗塞、高脂血症及び高血圧に罹患しやすい形質が遺伝しているかどうかを推定する上において、飲酒行動の因子が深く関与している場合、ＡＤＨ２因子から得られる情報に対して飲酒量との換算式を追加することにより、上記の疾患に罹患する可能性が高い人を、より高い精度で検出することができる。
【配列表】
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