(57)【要約】【課題】本発明は、定量可能な酵素濃度範囲が広く、簡便にα−アミノトランスフェラーゼの活性を検出できる検出方法を提供することを目的とする。【解決手段】ω−アミノ化合物と、検出対象のα−アミノトランスフェラーゼが触媒する反応によって生じたα−ケト酸とが、そのω−アミノ化合物及びα−ケト酸に特異的なω−アミノトランスフェラーゼを触媒とし、反応生成物である含アルデヒド化合物を生じさせ、この含アルデヒド化合物に対し、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下で、アルデヒドデヒドロゲナーゼを触媒として反応させて生じる還元型ニコチンアミド補酵素を検出することにより、検出対象のα−アミノトランスフェラーゼを検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ω−アミノ化合物と、α−アミノトランスフェラーゼが触媒する酵素反応によって生じたα−ケト酸とを基質とし、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物である含アルデヒド化合物を検出することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
【請求項２】
含アルデヒド化合物の検出方法が、含アルデヒド化合物を基質とし、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下、アルデヒドデヒドロゲナーゼを触媒とする酵素反応の生成物である還元型ニコチンアミド補酵素を検出する方法であることを特徴とする、請求項１に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
【請求項３】
検体に、α−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１とアミノ酸を加えてα−ケト酸２を生成させる工程と、
α−ケト酸２とω−アミノ化合物とを、それらを基質とするω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させる工程と、
含アルデヒド化合物を検出する工程と、
を有することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
【請求項４】
含アルデヒド化合物の検出工程が、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下、含アルデヒド化合物に、含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型ニコチンアミド補酵素を検出する工程であることを特徴とする、請求項３に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
【請求項５】
α−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、請求項１〜４の何れか１項に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
【請求項６】
ω−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、請求項１〜４の何れか１項に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
【請求項７】
アルデヒドデヒドロゲナーゼが好熱菌由来である、請求項４に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
【請求項８】
α−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１及びアミノ酸と、
α−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、
ω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物と、
を有する、α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出用キット。
【請求項９】
さらに、ω−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、
酸化型ニコチンアミド補酵素と
を有する、請求項８に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出用キット。
【請求項１０】
複数のα−アミノトランスフェラーゼのそれぞれに対し、α−ケト酸を用いて請求項１〜７のいずれか１項に記載の検出方法を行うことを特徴とする、α−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング方法。
【請求項１１】
α−ケト酸１と、
このα−ケト酸１を基質とするα−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるアミノ酸と、
このα−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、
このω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物と
を有する、α−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング用キット。
【請求項１２】
さらに、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、
酸化型ニコチンアミド補酵素と
を有する、請求項１２に記載のα−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング用キット。
【請求項１３】
複数のα−ケト酸のそれぞれに対し、α−アミノトランスフェラーゼを用いて請求項１〜７に記載のいずれかの検出方法を行うことを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
α−ケト酸１を基質とするα−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるアミノ酸と、
このα−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、
このω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物と
を有する、α−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニング用キット。
【請求項１５】
さらに、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、
酸化型ニコチンアミド補酵素と、
を有することを特徴とする、請求項１４に記載のα−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニング用キット。
【請求項１６】
ω−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸とω−アミノ化合物とを、ω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させ、アミノ酸及び含アルデヒド化合物を生成する第１の工程と、
生成したアミノ酸のアミノ基を除去することにより、α−ケト酸を再生する第２の工程と、
第１の工程及び第２の工程を繰り返すことによってα−ケト酸及び含アルデヒド化合物を増加させる第３の工程と、
増加した含アルデヒド化合物を定量する第４の工程と
を有することを特徴とする、α−ケト酸の定量方法。
【請求項１７】
第２の工程におけるアミノ酸からのアミノ基の除去方法が、α−アミノトランスフェラーゼを用いた酵素反応であることを特徴とする、請求項１６に記載のα−ケト酸の定量方法。
【請求項１８】
第４の工程における含アルデヒド化合物の定量方法が、含アルデヒド化合物に、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下、含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型ニコチンアミド補酵素を定量する方法である、請求項１６に記載のα−ケト酸の定量方法。
【請求項１９】
α−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、請求項１６〜１８の何れか１項に記載のα−ケト酸の定量方法。
【請求項２０】
ω−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、請求項１６〜１８の何れか１項に記載のα−ケト酸の定量方法。
【請求項２１】
アルデヒドデヒドロゲナーゼが好熱菌由来である、請求項１８に記載のα−ケト酸の定量方法。
【請求項２２】
ω−アミノトランスフェラーゼと、
ω−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるω−アミノ化合物と、
ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるアミノ酸を基質とするα−アミノトランスフェラーゼと、
α−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸と
を有する、α−ケト酸の定量用キット。
【請求項２３】
さらに、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、
酸化型ニコチンアミド補酵素と、
を有する、請求項２２に記載のα−ケト酸の定量用キット。
【請求項２４】
比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの所定量に、このα−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１とアミノ酸を加えてα−ケト酸２を生成させる工程と、
α−ケト酸２とω−アミノ化合物とを、それらを基質とするω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させる工程と、
生成した含アルデヒド化合物を定量する工程と、
比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された含アルデヒド化合物の量と、その際の当該α−アミノトランスフェラーゼの使用量との相関関係に、上記工程で測定した含アルデヒド化合物の生成量を照合し、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性を算出する工程と、
を有することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。
【請求項２５】
比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの所定量に、α−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１とアミノ酸を作用させて、α−ケト酸２を生成させる工程と、
α−ケト酸２とω−アミノ化合物とを、それらを基質とするω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させる工程と、
この含アルデヒド化合物を、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下、含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させて、還元型ニコチンアミド補酵素を生成させる工程と、
生成した還元型ニコチンアミド補酵素の吸光度を測定する工程と、
比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された還元型ニコチンアミド補酵素の吸光度、その際の当該α−アミノトランスフェラーゼの使用量との相関関係に、上記工程で測定した還元型ニコチンアミノ補酵素の吸光度を照合し、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性を算出する工程と
を有することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。
【請求項２６】
α−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、請求項２４または２５に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。
【請求項２７】
ω−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、請求項２４または２５に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。
【請求項２８】
アルデヒドデヒドロゲナーゼが好熱菌由来である、請求項２５に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。
【請求項２９】
比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１及びアミノ酸と、
α−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、
ω−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるω−アミノ化合物と、
を有する、α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定用キット。
【請求項３０】
さらに、ω−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、
酸化型ニコチンアミド補酵素と
を有することを特徴とする、請求項２９に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定用キット。
【請求項３１】
さらに、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを含むことを特徴とする請求項２９または３０に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−アミノトランスフェラーゼの活性検出方法、比活性測定方法、並びにスクリーニング方法、及びα−ケト酸の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心疾患又は肝疾患の場合、アラニントランスアミナーゼやアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが血中に遊離することから、診断や治療の経過観察の指標として、これらアミノトランスフェラーゼの活性測定が繁用されている。
【０００３】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の測定は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼに対し、Ｌ−アスパラギン酸及び２−オキソグルタル酸を基質として、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによって生成されるオキサロ酢酸を、リンゴ酸脱水素酵素によってリンゴ酸に変え、このときの還元型ニコチンアミド補酵素の減少速度を、波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより行われている。
【０００４】
しかし上記の方法は、還元型ニコチンアミド補酵素の減少速度を測定する方法であり、十分量の基質を反応系に加えることができないため、反応がすぐに飽和してしまい、定量可能な酵素濃度の上限が低い。従って、アミノトランスフェラーゼ活性の測定には、生成する還元型ニコチンアミド補酵素の吸光度の上昇に基づいて生体物質を測定する方法が好適である。
【０００５】
アミノトランスフェラーゼにより生成するピルビン酸から、ピルビン酸デヒドロゲナーゼを用いて、還元型ニコチンアミド補酵素を生成させ、吸光度の上昇によりアミノトランスフェラーゼの活性測定を行う方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。また、この反応系はピルビン酸を定量する際にも用いられている。
【０００６】
しかしながら、上記の方法では、酵素としてピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体が用いられており、当該酵素複合体は３種の酵素が非共有結合で分子集合した複合体なので、高純度の酵素複合体を得ることが困難である。また、還元作用を示すコエンザイムＡを使用する必要があり、コエンザイムＡが測定値に影響を与えるおそれがあるという難点を有している。
【特許文献１】特開平６−８６６９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のような事情に鑑み、本発明は、定量可能な酵素濃度範囲が広く、簡便にα−アミノトランスフェラーゼの活性を検出できる検出方法やα−ケト酸の定量方法などを提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下によって構成される。
【０００９】
（１）ω−アミノ化合物と、α−アミノトランスフェラーゼが触媒する酵素反応によって生じたα−ケト酸とを基質とし、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物である含アルデヒド化合物を検出することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
【００１０】
（２）含アルデヒド化合物の検出方法が、含アルデヒド化合物を基質とし、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下、アルデヒドデヒドロゲナーゼを触媒とする酵素反応の生成物である還元型ニコチンアミド補酵素を検出する方法であることを特徴とする、前記第１項に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
【００１１】
（３）検体に、α−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１とアミノ酸を加えてα−ケト酸２を生成させる工程と、α−ケト酸２とω−アミノ化合物とを、それらを基質とするω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させる工程と、含アルデヒド化合物を検出する工程とを有することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
【００１２】
（４）含アルデヒド化合物の検出工程が、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下、含アルデヒド化合物に、含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型ニコチンアミド補酵素を検出する工程であることを特徴とする、前記第３項に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
【００１３】
（５）α−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、前記第１項〜第４項の何れか１項に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
【００１４】
（６）ω−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、前記第１項〜第４項の何れか１項に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
【００１５】
（７）アルデヒドデヒドロゲナーゼが好熱菌由来である、前記第４項に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法。
【００１６】
（８）α−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１及びアミノ酸と、α−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、ω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物とを有する、α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出用キット。
【００１７】
（９）さらに、ω−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを有する、前記第８項に記載のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出用キット。
【００１８】
（１０）複数のα−アミノトランスフェラーゼのそれぞれに対し、α−ケト酸を用いて前記第１項〜第７項のいずれか１項に記載の検出方法を行うことを特徴とする、α−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング方法。
【００１９】
（１１）α−ケト酸１と、このα−ケト酸１を基質とするα−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるアミノ酸と、このα−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、このω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物とを有する、α−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング用キット。
【００２０】
（１２）さらに、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを有する、前記第１２項に記載のα−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング用キット。
【００２１】
（１３）複数のα−ケト酸のそれぞれに対し、α−アミノトランスフェラーゼを用いて前記第１項〜第７項に記載のいずれかの検出方法を行うことを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニング方法。
【００２２】
（１４）α−ケト酸を基質とするα−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるアミノ酸と、このα−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、このω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物とを有する、α−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニング用キット。
【００２３】
（１５）さらに、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを有することを特徴とする、前記第１４項に記載の特定のα−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニング用キット。
【００２４】
（１６）ω−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸とω−アミノ化合物とを、ω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させ、アミノ酸及び含アルデヒド化合物を生成する第１の工程と、生成したアミノ酸のアミノ基を除去することにより、α−ケト酸を再生する第２の工程と、第１の工程及び第２の工程を繰り返すことによってα−ケト酸及び含アルデヒド化合物を増加させる第３の工程と、増加した含アルデヒド化合物を定量する第４の工程とを有することを特徴とする、α−ケト酸の定量方法。
【００２５】
（１７）第２の工程におけるアミノ酸からのアミノ基の除去方法が、α−アミノトランスフェラーゼを用いた酵素反応であることを特徴とする、前記第１６項に記載のα−ケト酸の定量方法。
【００２６】
（１８）第４の工程における含アルデヒド化合物の定量方法が、含アルデヒド化合物に、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下、含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型ニコチンアミド補酵素を定量する方法である、前記第１６項に記載のα−ケト酸の定量方法。
【００２７】
（１９）α−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、前記第１６項〜第１８項の何れか１項に記載のα−ケト酸の定量方法。
【００２８】
（２０）ω−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、前記第１６項〜第１８項の何れか１項に記載のα−ケト酸の定量方法。
【００２９】
（２１）アルデヒドデヒドロゲナーゼが好熱菌由来である、前記第１８項に記載のα−ケト酸の定量方法。
【００３０】
（２２）ω−アミノトランスフェラーゼと、ω−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるω−アミノ化合物と、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるアミノ酸を基質とするα−アミノトランスフェラーゼと、α−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸とを有する、α−ケト酸の定量用キット。
【００３１】
（２３）さらに、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを有する、前記第２２項に記載のα−ケト酸の定量用キット。
【００３２】
（２４）比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの所定量に、このα−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１とアミノ酸を加えてα−ケト酸２を生成させる工程と、α−ケト酸２とω−アミノ化合物とを、それらを基質とするω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させる工程と、生成した含アルデヒド化合物を定量する工程と、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された含アルデヒド化合物の量と、その際の当該α−アミノトランスフェラーゼの使用量との相関関係に、上記工程で測定した含アルデヒド化合物の生成量を照合し、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性を算出する工程とを有することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。
【００３３】
（２５）比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの所定量に、α−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１とアミノ酸を作用させて、α−ケト酸２を生成させる工程と、α−ケト酸２とω−アミノ化合物とを、それらを基質とするω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させる工程と、この含アルデヒド化合物を、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下、含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させて、還元型ニコチンアミド補酵素を生成させる工程と、生成した還元型ニコチンアミド補酵素の吸光度を測定する工程と、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された還元型ニコチンアミド補酵素の吸光度、その際の当該α−アミノトランスフェラーゼの使用量との相関関係に、上記工程で測定した還元型ニコチンアミノ補酵素の吸光度を照合し、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性を算出する工程とを有することを特徴とする、α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。
【００３４】
（２６）α−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、前記第２４項または第２５項に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。
【００３５】
（２７）ω−アミノトランスフェラーゼが好熱菌由来である、前記第２４項または第２５項に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。
【００３６】
（２８）アルデヒドデヒドロゲナーゼが好熱菌由来である、前記第２５項に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定方法。
【００３７】
（２９）比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるα−ケト酸１及びアミノ酸と、α−アミノトランスフェラーゼを触媒とする酵素反応の反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、ω−アミノトランスフェラーゼの基質になりうるω−アミノ化合物とを有する、α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定用キット。
【００３８】
（３０）さらに、ω−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを有することを特徴とする、前記第２９項に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定用キット。
【００３９】
（３１）さらに、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを含むことを特徴とする前記第２９項または第３０項に記載のα−アミノトランスフェラーゼの比活性測定用キット。
【発明の効果】
【００４０】
本発明によれば、たとえば、広い酵素濃度範囲で、簡便にα−アミノトランスフェラーゼの活性が検出または定量でき、さらには、α−ケト酸が定量可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００４２】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００４３】
＜１＞α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法
本発明に従って、検体中のα−アミノトランスフェラーゼの活性を検出するスキームを以下に示す。  
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【００４４】
まず、検体中で、アミノ基受容体としてのα−ケト酸１と、アミノ基供与体としてのアミノ酸１を作用させる。検体にα−アミノトランスフェラーゼの活性がある場合には、その触媒作用によりアミノ酸２とα−ケト酸２が生成する。次に、生成したα−ケト酸２をアミノ基受容体とし、アミノ基供与体としてのω−アミノ化合物を、ω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させる。この含アルデヒド化合物を検出することにより、α−アミノトランスフェラーゼ活性を検出する。
【００４５】
ここで、検体中に、十分なα−ケト酸１、アミノ酸１、ω−アミノ化合物、ω−アミノトランスフェラーゼが含まれていないと、この反応過程は進まないか、反応に時間がかかるため、含アルデヒド化合物が検出できない。そこで、検出の際には、それらのうち不足すると思われる成分を反応液に加えることが好ましい。この場合、α−ケト酸１及びアミノ酸１は、検出するα−アミノトランスフェラーゼの基質になることができる化合物を選択する。α−ケト酸２は、検出対象のα−アミノトランスフェラーゼによって生成されるため、ω−アミノトランスフェラーゼは、その生成されたα−ケト酸２を基質として用いることのできる酵素を選択する。そして、ω−アミノ化合物は、選択されたω−アミノトランスフェラーゼが基質として用いることができる化合物を選択する。
【００４６】
アミノ酸１としてはその入手しやすさや溶解性の観点から、グルタミン酸、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、メチオニン、バリン、セリン等のアミノ酸を用いることができる。検出対象のα−アミノトランスフェラーゼがＬ−アミノトランスフェラーゼの場合はＬ−アミノ酸を、Ｄ−アミノトランスフェラーゼの場合はＤ−アミノ酸を、不明の場合はＤＬ−アミノ酸をそれぞれ用いることが好ましい。
【００４７】
α−ケト酸１としてはその入手しやすさや溶解性の観点からピルビン酸、２−ケトグルタル酸、オキザロ酢酸、フェニルピルビン酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、２−オキソイソペンタン酸、４−メチル−２−オキソペンタン酸、３−メチル−２−オキソペンタン酸、フェニルグリオキシル酸等があげられるが、これらα−ケト酸のうち、使用するω−アミノトランスフェラーゼが基質として認識しない化合物、または認識しても活性が非常に弱い化合物を選択することが好ましい。
【００４８】
ω−アミノ化合物は、構造の末端にアミノ基を有する化合物を示し、例示すれば、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、プロピレンジアミン、ブチレンジアミン、１−アミノプロパン、１−アミノブタン、１−アミノペンタン、ベンジルアミン、β−アラニン、６−アミノヘキサン酸、５−アミノペンタン酸、４−アミノブタン酸等があげられる。
【００４９】
α−アミノトランスフェラーゼとは、α−アミノ酸のアミノ基をα−ケト酸に転移して、別のα−ケト酸と別のα−アミノ酸を生じる反応を触媒する酵素群のことである。具体的には、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．５）、芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．５７）、ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．９）、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．５２）、セリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．４５）、セリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．５１）、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．４４）、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．４２）、及びＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２１）等の各ファミリーに属する酵素を例示できる。
【００５０】
また、酵素の具体例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、酵母のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｔｉｍａのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉの芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓの芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓの芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓの芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓの芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼなどが挙げられる。
【００５１】
その他、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒのヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ｈｉｓＣ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｔｉｍａのヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ、酵母のホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＳｅｒＣ）、大腸菌のホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ｓｅｒＣ）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉのホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓのセリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ｓｇａＡ）、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｍのセリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ｓｇａＡ）、ウサギのセリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（Ａｇｘｔ）、マウスのセリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（Ａｇｘｔ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓのアラニンアミノトランスフェラーゼ、酵母のアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（Ａｇｘ１）などの酵素が挙げられる。
【００５２】
また、ラットの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｂｃａｔ）、Ｅ．ｃｏｌｉの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｉｌｖＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．のＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓのＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼなどの酵素も挙げることができる。
【００５３】
さらに、近年のゲノム解析の成果より、多くの遺伝子がα−アミノトランスフェラーゼをコードしていることが示唆されている。このようなα−アミノトランスフェラーゼに対しても本発明は使用可能である。具体例としては、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＥ３２９７）やアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＥ１９６４、ＰＡＥ２２５１）など、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｉｓｓｙのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＢ０５２５、ＰＡＢ０７７４，ＰＡＢ１８１０）など、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｕｃａｎｉｕｍのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＴＶＧ０３９３５３５、ＴＶＧ０４８０７０５、ＴＶＧ０５５７３７９）やヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＴＶＧ００７７１５９）などを例示することができる。
【００５４】
その他、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍのセリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（Ｔａ１０１８）、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＶＮＧ０３８７Ｇ、ＶＮＧ２１２２Ｇ）など、Ａｅｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＦ０９３３）やヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＦ２００２、ＡＦ２０２４）など、Ｍｅｈｔａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＭＫ１６２７）など、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｉｃｉｎａ  ｍａｚｅｉのセリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＭＭ０２４６）やホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＭＭ２９１１）などのα−アミノトランスフェラーゼを例示することができる。
【００５５】
また、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＭＪ１００８）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのセリンアミノトランスフェラーゼ（ＰＨ１３０８）、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘのチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＡＰＥ２５７５）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＳＴ１２２５）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｅの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＣＥ２０９５）など、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＳＡＶ６８０４）等のα−アミノトランスフェラーゼを例示することもできる。
【００５６】
検体に含まれる酵素は、単独であっても、２種以上であってもよい。酵素の由来は特に制限されず、動物、植物、細菌、酵母、カビ等、どのような生物に由来してもよい。
【００５７】
ω−アミノトランスフェラーゼとは、ω−アミノ化合物のアミノ基をα−ケト酸に転移して、含アルデヒド化合物とα−アミノ酸を生じる反応を触媒する酵素群のことである。特にここでは、検出するα−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるα−ケト酸を基質とするω−アミノトランスフェラーゼを用いる。
【００５８】
本発明で使用できるω−アミノトランスフェラーゼとしては、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１１）、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１３）、ω−アミノ酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１８）、４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１９）、及びＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．６２）等の各ファミリーに属する酵素が例示できる。
【００５９】
酵素の具体例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのω−アミノ酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ、酵母の４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＵＧＡ１）、Ｅ．ｃｏｌｉの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ｇａｂＴ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＡＢＡ）、Ｂｕｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ｂｉｏＡ）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍのＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ｂｉｏＡ）等が挙げられる。
【００６０】
さらに、近年のゲノム解析の成果より、多くの遺伝子がω−アミノトランスフェラーゼをコードしていることが示唆されている。このようなω−アミノトランスフェラーゼも本発明に使用可能であることが予想される。具体例としては、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＥ１７９９）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＳＳＯ２７２７、ＳＳＯ３２１１）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＦ１２３２、ＰＦ１４２１）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＰＦ１６８５）やＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ＰＦ１９０６）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＢ００８６、ＰＡＢ１９２１、ＰＡＢ２３８６）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＰＡＢ２４４０）等を例示することができる。
【００６１】
その他、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（Ｔａ００６８）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡＦ００８０、ＡＦ１８１５）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＭＴＨ１３３７）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＭＭ００４７、ＭＭ１４０６）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＭＡ０１１９、ＭＡ２８５９）、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＭＪ０７２１）やＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ＭＪ１３００）等のω−アミノトランスフェラーゼを例示することができる。
【００６２】
また、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＨ０１３８、ＰＨ０７８２、ＰＨ１４２３）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＰＨ１７１６）、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＰＥ０４５７）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡＰＥ１４６４）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＣＥ１５２９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＳＡ０１７９、ＳＡ０８１８）やＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ＳＡ２２１４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＳＡＶ２５８３）やオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＳＡＶ３４２０，ＳＡＶ７１１２）等のω−アミノトランスフェラーゼを例示することもできる。
【００６３】
これらの酵素は単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。酵素の由来も特に制限されず、動物、植物、細菌、酵母、カビ等いずれに由来する酵素を用いてもよい。
【００６４】
＜２＞α−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング方法
前述のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法を用いて、特定のα−ケト酸からアミノ酸を生成するアミノ基転移反応を触媒する酵素をスクリーニングすることができる。即ち、複数のα−アミノトランスフェラーゼのそれぞれに対し、目的とするアミノ基転移反応の基質であるα−ケト酸１とアミノ酸１、ω−アミノ化合物、及びω−アミノトランスフェラーゼを添加、反応させ、含アルデヒド化合物が検出された場合、その時に用いたα−アミノトランスフェラーゼが、添加したα−ケト酸１を基質として利用でき、そのアミノ基転移反応を触媒することが結論される。ここで用いるα−アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸１、ω−アミノ化合物、及びω−アミノトランスフェラーゼは前述のものが例示できる。
【００６５】
＜３＞α−ケト酸のスクリーニング方法
前述のα−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法を用いて、特定のα−アミノトランスフェラーゼに対して、その基質となり得るα−ケト酸をスクリーニングすることも可能である。即ち、複数のα−ケト酸のそれぞれに、対象となるα−アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸１、ω−アミノ化合物、及びω−アミノトランスフェラーゼを添加、反応させ、含アルデヒド化合物が検出された場合、その時に用いたα−ケト酸が、特定のα−アミノトランスフェラーゼに対する基質であるということが結論される。ここで用いるα−アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸１、ω−アミノ化合物、及びω−アミノトランスフェラーゼは前述のものが例示できる。
【００６６】
＜４＞α−ケト酸の定量方法
検体中のα−ケト酸を定量するには、まず、定量対象物であるα−ケト酸２と、アミノ基供与体としてのω−アミノ化合物とをω−アミノトランスフェラーゼの存在下反応させ、アミノ酸１と含アルデヒド化合物を生成させる。この時、ω−アミノトランスフェラーゼは、α−ケト酸２を基質として反応できる酵素を選択し、ω−アミノ化合物は、その酵素が基質とできる化合物を選択する。この反応の結果、アミノ酸１と含アルデヒド化合物が生成する。
【００６７】
次にアミノ酸１のアミノ基を除去することにより、α−ケト酸２を再生する、この際、用いる酵素は、アミノ基を付加できる酵素であれば何れでも良く、例えば、α−アミノトランスフェラーゼや、ある種のデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。使用できるα−アミノトランスフェラーゼは、「α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法」で記述した酵素に準じる。α−アミノトランスフェラーゼを用いる場合に必要なケト酸１は、前述のものが例示できる。また、デヒドロゲナーゼとしては、アラニンデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．１）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．２、Ｅ．Ｃ．１．４．１．３、Ｅ．Ｃ．１．４．１．４）、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．５）などが挙げられる。
【００６８】
こうして再生されたα−ケト酸２は、ω−アミノトランスフェラーゼによって、再びアミノ酸１になり、これらの反応が繰り返されることにより、α−ケト酸２及び前記含アルデヒド化合物は増加する。この反応の繰り返しによって、ごく微量のα−ケト酸２を検出できるようになる。
【００６９】
一方、既知の濃度のα−ケト酸２を用いて、同様の実験を行い、検量線を作製する。最終的に得られた含アルデヒド化合物を直接または間接的に定量し、検量線と比較することにより、検体中のα−ケト酸２が定量できる。
【００７０】
＜５＞α−アミノトランスフェラーゼの比活性の測定方法
後述の実施例で行ったα−アミノトランスフェラーゼの比活性の測定試験から、α−アミノトランスフェラーゼの使用量と、前述のようにしてα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された含アルデヒド化合物の量との間には相関関係があることが明らかになった（実施例「好熱菌α−アミノトランスフェラーゼの検量線の作成」参照）。
【００７１】
従って、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された含アルデヒド化合物の量と、その際の当該α−アミノトランスフェラーゼの使用量との相関関係を用いることにより、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性を測定することができる。即ち、所定量の、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼに、前述のα−ケト酸１とアミノ酸１とを作用させてα−ケト酸２を生成させた後、生成したα−ケト酸２とω−アミノ化合物とをω−アミノトランスフェラーゼの存在下で反応させて、含アルデヒド化合物を生成させ、含アルデヒド化合物の生成量を測定した後、この測定結果を前述の相関関係に照合することにより、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性を算出することができる。これによって、特定のα−ケト酸１と特定のアミノ酸１とに対する、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性が測定できる。
【００７２】
なお、比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼと、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼとの種類は、同一であってもよいし、異なるものであってもよい。
【００７３】
ここで、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された含アルデヒド化合物の生成量と、当該α−アミノトランスフェラーゼの使用量との相関関係は、例えば検量線などを作成することによって容易に把握することが可能になる。
【００７４】
＜６＞含アルデヒド化合物の検出・定量方法
例えば、生成した含アルデヒド化合物に、酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下アルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型ニコチンアミド補酵素を検出すれば含アルデヒド化合物を検出することができる。この検出方法は、定量性があるため、前述のα−ケト酸やα−アミノトランスフェラーゼの比活性などの定量方法においても用いることができる。また、塩基性フクシンを用いた方法、銀鏡反応やフェーリング反応を用いた方法等を利用してもよい。
【００７５】
アルデヒドデヒドロゲナーゼとしては、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（１．２．１．１２）、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１５）、こはく酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１６）、アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１９）、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．２８）、及びＬ−アミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３１）等の各ファミリーに属する酵素が例示できる。
【００７６】
具体例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＨ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｋＨ）、酵母のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ１、ＡＬＤ６、ＡＬＤ２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉのこはく酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃＤ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｘｙｌＣ），Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのＬ−アミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
【００７７】
また、近年のゲノム解析の成果より、多くの遺伝子がアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしていることが示唆されており、これらも本発明に使用可能であることが予想される。具体例としては、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍｐｅｒｎｉｘのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＰＥ１７８６）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉのメチルマロン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＴ１１１６）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＯ０３１１７）やメチルマロン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＯ１２１８）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＭＭ００４８）やコハク酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＭＭ０８３８、ＭＭ２３４１）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＣＥ００７９、ＣＥ２６２５）等を例示することができる。
【００７８】
これらの酵素は単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。酵素の由来も特に制限されず、動物、植物、細菌、酵母、カビ等由来の酵素を好適に用いることができる。
【００７９】
還元型ニコチンアミド補酵素の測定方法は公知の手法を用いることができる。例えば、生成する還元型ニコチンアミド補酵素がＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨである場合は、酸化型ニコチンアミド補酵素が透明であり、還元型ニコチンアミド補酵素が黄色であるため、３４０ｎｍの吸光度の増加量を測定することにより、還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を容易に測定できる。また、生成する還元型ニコチンアミド補酵素とテトラゾリウム塩化合物とから、電子キャリアーを介してホルマザン色素を生成させ、このホルマザン色素を比色定量することにより還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を定量することもできる。
【００８０】
ω−アミノ化合物として、ヒポタウリンを用い、ω−アミノトランスフェラーゼを触媒にして反応させると、スルフィノアセトアルデヒドを経て、二酸化硫黄が生成する。この二酸化硫黄はローズアニリンを用いた呈色反応により、還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を定量することができる（左右田ら  （１９８２）含硫アミノ酸  ５巻２４９頁）。
【００８１】
＜７＞α−アミノトランスフェラーゼの活性検出用キット
本発明のα−アミノトランスフェラーゼの活性検出用キットは、α−アミノトランスフェラーゼの基質であるα−ケト酸１及びアミノ酸１と、α−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、ω−アミノ化合物とを含有するものである。このキットに更にω−アミノトランスフェラーゼによる反応の生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを加えることにより、α−アミノトランスフェラーゼの活性検出をさらに容易に行うことができる。
【００８２】
特定のα−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング用キットは、特定のα−ケト酸１と、そのα−ケト酸１を基質とするα−アミノトランスフェラーゼの基質であるアミノ酸と、そのα−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、そのω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物とを含有するものである。このキットに更にω−アミノトランスフェラーゼによる反応の生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素を加えることにより、特定のα−ケト酸をアミノ基転移反応によってアミノ酸に変換するためのα−アミノトランスフェラーゼのスクリーニングを容易に行うことができる。
【００８３】
特定のα−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニング用キットは、候補となる複数のα−ケト酸１のそれぞれに対し、α−ケト酸１を基質とするα−アミノトランスフェラーゼの基質であるアミノ酸１と、このα−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、このω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物とを有するものである。このキットに更に、ω−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素を加えることにより、特定のα−アミノトランスフェラーゼ基質のスクリーニングを手軽に行えるようになる。
【００８４】
α−ケト酸の定量キットは、定量対象であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、このω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物と、このω−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるアミノ酸１を基質とするα−アミノトランスフェラーゼと、このα−アミノトランスフェラーゼの基質であるケト酸１を有するものである。このキットに更に、ω−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物である含アルデヒド化合物に特異的なアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを加えることにより、この定量方法をより手軽に行うことができるようになる。
【００８５】
比活性が未知のα−アミノトランスフェラーゼの比活性を定量するためには、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを用いることにより生成された含アルデヒド化合物の量と、その際の当該α−アミノトランスフェラーゼの使用量との相関関係を用いる場合には、比活性の定量対象のα−アミノトランスフェラーゼの基質であるα−ケト酸１およびアミノ酸１と、このα−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物であるα−ケト酸２を基質とするω−アミノトランスフェラーゼと、このω−アミノトランスフェラーゼの基質であるω−アミノ化合物を有するキットを用いることが有効である。このキットは、更に、比活性が既知のα−アミノトランスフェラーゼを有するものであることが好ましい。含アルデヒド化合物の定量方法として、還元型ニコチンアミド補酵素の吸光度を測定する場合には、このキットに更に、ω−アミノトランスフェラーゼによる反応生成物である含アルデヒド化合物を基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼと、酸化型ニコチンアミド補酵素とを加えることが好ましい。
【００８６】
これらのキットに含有される個々の試薬は、トリス緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、ホウ酸緩衝溶液等の緩衝溶液に溶解されていてもよく、粉状の形態で、実験者が試薬の最終調整をするようになっていてもよい。
【００８７】
＜８＞好熱菌への応用
本発明の、α−アミノトランスフェラーゼ活性の検出方法、α−アミノトランスフェラーゼの比活性の測定方法、α−ケト酸の定量方法、α−アミノトランスフェラーゼやα−ケト酸のスクリーニング方法、あるいはそのための検出用キット、またはスクリーニング用キットは、好熱菌由来の酵素においても用いることができる。
【００８８】
好熱菌由来の酵素は中温菌由来の酵素に比べ高い耐熱性を有しており、物理化学的なストレスにも耐性が高く、工業的に有用な酵素として最近注目されている。
【００８９】
好熱菌由来の酵素は、中温菌由来の酵素が高い活性を示す３０℃から４０℃ではほとんど活性がなく、５０℃から１２０℃の高温で高い活性を示す。従って、好熱菌由来の酵素が活性を示す条件で、中温菌由来の酵素を用いて好熱菌由来の酵素の活性を検出、測定、定量またはスクリーニングすることは困難である。
【００９０】
例えば、超好熱菌由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのスクリーニングをする場合には、Ｌ−アスパラギン酸及び目的とするアミノ酸に対応するα−ケト酸を基質として、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによって酵素反応温度が７０℃から１００℃でオキサロ酢酸を生成させる（一回目の酵素反応）。その後反応容器を室温まで冷却し、リンゴ酸脱水素酵素及び還元型ニコチンアミド補酵素を加え、二回目の酵素反応を行い、還元型ニコチンアミド補酵素の減少速度を波長３４０ｎｍで測定する。このように試薬の添加や冷却といった煩雑な操作が必要になる。
【００９１】
従って、好熱菌由来のα−アミノトランスフェラーゼを検出対象とする場合、好熱菌由来のω−アミノトランスフェラーゼと、好熱菌由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼを組み合わせて用いることで、工業的に有用な好熱菌由来の酵素活性を煩雑な操作を必要とせず、簡便に検出、測定、定量またはスクリーニングすることができる。
【００９２】
ここで、好熱菌由来のα−アミノトランスフェラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｔｉｍａのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＥ３２９７）やアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＥ１９６４、ＰＡＥ２２５１）など、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｉｓｓｙのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＢ０５２５、ＰＡＢ０７７４，ＰＡＢ１８１０）などが例示できる。
【００９３】
その他、Ａｅｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＦ０９３３）やヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＦ２００２、ＡＦ２０２４）など、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＭＪ１００８）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのセリンアミノトランスフェラーゼ（ＰＨ１３０８）、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘのチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＡＰＥ２５７５）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＳＴ１２２５）などの好熱菌由来のα−アミノトランスフェラーゼも例示できる。検出対象としては、これらの酵素が単独で含まれていても、複数が含まれていてもよい。また、使用対象としては、これらの酵素は単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９４】
また、好熱菌由来のω−アミノトランスフェラーゼとしては、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＥ１７９９）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＳＳＯ２７２７、ＳＳＯ３２１１）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＦ１２３２、ＰＦ１４２１）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＰＦ１６８５）やＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ＰＦ１９０６）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＡＢ００８６、ＰＡＢ１９２１、ＰＡＢ２３８６）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＰＡＢ２４４０）などが例示できる。
【００９５】
その他、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（Ｔａ００６８）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡＦ００８０、ＡＦ１８１５）、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＭＪ０７２１）やＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ＭＪ１３００）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＨ０１３８、ＰＨ０７８２、ＰＨ１４２３）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＰＨ１７１６）、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘの４−アミノブタン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＰＥ０４５７）やアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡＰＥ１４６４）などの好熱菌由来のω−アミノトランスフェラーゼも例示できる。これらの酵素は単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９６】
好熱菌由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼとしては、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍｐｅｒｎｉｘのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＰＥ１７８６）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉのメチルマロン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＴ１１１６）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＯ０３１１７）やメチルマロン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＯ１２１８）などが例示できる。これらの酵素は単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９７】
中温菌由来のα−アミノトランスフェラーゼの活性検出方法において、好熱菌由来のω−アミノトランスフェラーゼを用いるのも有効である。すなわち、最初から反応系に全て必要な試薬を添加しておき、中温菌由来の酵素が十分な活性を持つ好適な温度で酵素反応を行い、α−ケト酸２を生成させる。次に新たに試薬等を加えることなく、好熱菌由来の酵素が十分な活性を持つ好適な温度まで昇温し、酵素反応を行う。このとき、昇温により中温菌由来の酵素を失活させることができる。そして反応後の還元型ニコチンアミド補酵素を常法により定量すればよい。ω−アミノトランスフェラーゼ反応のための昇温により、同時に中温菌由来の酵素を失活させることができるため、実験手順が省けるだけでなく、より正確に酵素活性を検出することができる。
【００９８】
このような中温菌由来のα−アミノトランスフェラーゼと好熱菌由来のω−アミノトランスフェラーゼの組み合わせは、α−アミノトランスフェラーゼやα−ケト酸のスクリーニング方法や、α−アミノトランスフェラーゼの測定方法などにも、有効に応用されうる。
【実施例】
【００９９】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１００】
［１］酵素調製方法
１．トランスアミナーゼ（ＡＰＥ２２４８）
（１）遺伝子組換え細胞の作成方法
外来遺伝子として、超好熱菌エアロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＡＰＥ２２４８）（配列番号１）を用いた。
【０１０１】
まず、配列番号１に示すヌクレオチド配列をエアロパイラム・ペルニクスのゲノムから、ＰＣＲ反応で増幅し抽出した。ＰＣＲ反応のためのプライマーには配列番号２および３に示すオリゴヌクレオチドを用いた。
【０１０２】
従って、増幅したＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１に示したヌクレオチド配列から終止コドンを除いた配列とHis-tagをコードする配列との融合配列となる。ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績株式会社製）を用い、同酵素のプロトコールに従った。反応終了後、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）を用いて、キットのプロトコールに従い精製し、０．１μg／μｌのＤＮＡ溶液を得た。
【０１０３】
次に、制限酵素ＸｈｏＩ  １μｌ、ＮｄｅＩ  １μｌ、１０×Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ（以上、タカラバイオ株式会社製）及び上記で得たＤＮＡ溶液４３μｌを混合し、３７℃で、一晩酵素消化を行った。
【０１０４】
別途、ｐＥＴ２１ａ（＋）（０．５μｇ／μｌ）（Ｎｏｖａｇｅｎ製）２μｌ、ＸｈｏＩ  １μｌ、ＮｄｅＩ  １μｌ 及び１０×Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ（以上、タカラバイオ株式会社製）を混合し、３７℃で、一晩酵素消化を行った。こうして得られた制限酵素消化したゲノムＤＮＡ及びプラスミドを、それぞれ電気泳動し、両方の必要な部分をまとめ、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）を用いて、キットのプロトコールに従い精製した。精製物をイソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノールでリンスした後乾燥させたものを５μｌの滅菌水に溶解した。このＤＮＡ溶液に対し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２  ｓｏｌ  Ｉ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、キットのプロトコールに従いライゲーションし、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール等で精製した。精製したプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株をエレクトロポレーション法により形質転換した。
【０１０５】
形質転換した菌を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ平板寒天培地（１Ｌ中にトリプトン１０ｇ、酵母エキス  ５ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇを含む）に植菌し、３７℃で、一晩培養した。寒天培地上に形成されたシングルコロニーの中から、コロニーを無作為にいくつか選択し、選択した各コロニーを直接反応溶液に懸濁し、コロニーダイレクトＰＣＲを行うことで目的の断片をもつクローンのスクリーニングを行った。コロニーダイレクトＰＣＲは以下の手順にて行った。  
Ｅｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）        ０．５μｌ
緩衝液（１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、タカラバイオ株式会社製）  ５μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ、タカラバイオ株式会社製）          ４μｌ
配列番号４のプライマーＤＮＡ（１００  ｐｍｏｌ／μｌ）    ０．５μｌ
配列番号５のプライマーＤＮＡ（１００  ｐｍｏｌ／μｌ）    ０．５μｌ
各コロニー中の大腸菌                                      微量
を混合し、水を加えて、全量５０μｌに調製した。
【０１０６】
市販の温度サイクリング装置（ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いて９４℃、で３分恒温後、〔９４℃、６０秒−５６℃、６０秒−７２℃、１４０秒〕のサイクルを２５回繰り返した。反応終了後、１％アガロース電気泳動により、目的の断片の増幅が行われているかを確認し、陽性コロニーを得た。この形質転換体を増幅し、目的のトランスアミナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを調製した。組換えプラスミドに含まれる目的のＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、ＤＮＡ配列に間違いがないことを確認した。
【０１０７】
こうして得た組換えプラスミドを用いて、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）株の形質転換を行った。形質転換した大腸菌は、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ平板寒天培地に植菌し、３７℃で培養した。
【０１０８】
（２）タンパク質の発現誘導
（１）で得た組換え大腸菌は、５０μｇ／ｍｌアンピシリンと３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５ｍｌに植菌し、一晩３７℃で前培養した。次に、５０μｇ／ｍｌアンピシリンと３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５００ｍｌに、前培養した菌液５ｍｌを植菌し、３７℃でＯＤ６６０が１．０になるまで本培養した。ここにＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように添加し、４６℃で２０時間培養し、トランスアミナーゼ遺伝子の発現を誘導した。
【０１０９】
培養後菌液を集菌し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗菌し、１ｍＭのピリドキサールリン酸を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕後遠心分離し、上清を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液を８０℃で３０分熱処理することにより大腸菌由来のアミノトランスフェラーゼを失活させ、遠心して不溶物を除き、上清を粗酵素液とした。このように、好熱菌のアミノトランスフェラーゼを用いることにより、精製段階で、大腸菌等から混入したアミノトランスフェラーゼを容易に失活させることができる。
【０１１０】
粗酵素液を等量のサンプル緩衝液（０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、１２％βメルカプトエタノール、２０％グリセロール、ここに微量のブロモフェノールブルーを含む）と混合し、含まれる可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析したところ、誘導されたタンパク質のバンドがはっきりと確認できた。
【０１１１】
（３）酵素の精製
熱処理した粗酵素液から、Ｐｒｏｔｉｎｏ  Ｎｉ２０００（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）のプロトコールに従い、His-tagを利用してタンパク質を精製した。５００ｍｌの培養液から１．８ｍｇの精製酵素を得た。
【０１１２】
（４）酵素活性の確認方法
４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのアラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、またはロイシンをアミノ基の供与体として含む反応液１９０μｌに、（３）で精製した酵素（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて８０℃で２分間酵素反応を行った。反応後、３０％トリクロロ酢酸水溶液５０μｌを加えて反応を停止した。反応系中に生成したグルタミン酸は、Ｍａｒｆｅｙ’ｓ試薬を用いて誘導体化し、ＨＰＬＣで定量した。酵素活性の測定結果を図１に示す。
【０１１３】
２．トランスアミナーゼ（ＰＨ１３７１）
外来遺伝子として、超好熱菌パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｉｉ）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＰＨ１３７１）を用いた他は、ＡＰＥ２２４８に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。なお、誘導培養は２５℃で２０時間行った。ここで用いたＰＨ１３７１のヌクレオチド配列を配列番号６に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号７および８に示した。  
粗酵素液中の可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析したところ、誘導されたタンパク質のバンドが確認できた。  
また、ＡＰＥ２２４８と同様の手法で、酵素活性を測定した。酵素活性の測定結果を図１に示す。
【０１１４】
３．トランスアミナーゼ（ＡＰＥ０１６９）
外来遺伝子として、超好熱菌エアロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＡＰＥ０１６９）を用いた他は、ＡＰＥ２２４８に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。なお、ＰＣＲ生成物とベクターの消化にはＮｏｔＩ  １μｌとＮｄｅＩ  １μｌを用いた。誘導培養は２５℃で２０時間行った。ここで用いたＡＰＥ０１６９のヌクレオチド配列を配列番号９に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号１０および１１に示した。  
粗酵素中の可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析したところ、誘導されたタンパク質のバンドが確認できた。  
また、ＡＰＥ２２４８と同様の手法で、酵素活性を測定した。酵素活性の測定結果を図１に示す。
【０１１５】
４．トランスアミナーゼ（ＳＴ１２１７）
外来遺伝子として、超好熱菌スルホロバス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＳＴ１２１７）を用いた他は、ＡＰＥ２２４８に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。なお、誘導培養は２５℃で２０時間行った。ここで用いたＳＴ１２１７のヌクレオチド配列を配列番号１２に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号１３および１４に示した。  
粗酵素液中の可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。誘導されたタンパク質のバンドが確認できた。  
また、ＡＰＥ２２４８と同様の手法で、酵素活性を測定した。酵素活性の測定結果を図１に示す。
【０１１６】
５．トランスアミナーゼ（ＳＴ１４１１）
外来遺伝子として、超好熱菌スルホロバス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＳＴ１４１１）を用いた他は、ＡＰＥ２２４８に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。なお、誘導培養は２５℃で２０時間行った。ここで用いたＳＴ１４１１のヌクレオチド配列を配列番号１５に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号１６および１７に示した。  
粗酵素液中の可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。誘導されたタンパク質のバンドが確認できた。  
また、ＡＰＥ２２４８と同様の手法で、酵素活性を測定した。酵素活性の測定結果を図１に示す。
【０１１７】
６．トランスアミナーゼ（ＳＴ０１９１）
外来遺伝子として、超好熱菌スルホロバス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＳＴ０１９１）を用いた他は、ＡＰＥ２２４８に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。なお、誘導培養は２５℃で２０時間行った。ここで用いたＳＴ０１９１のヌクレオチド配列を配列番号１８に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号１９および２０に示した。  
粗酵素液中の可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。誘導されたタンパク質のバンドが確認できた。
【０１１８】
４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのオルニチン、アセチルオルニチン、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタン酸、β−アラニン、４−アミノブタン、または５−アミノペンタンをアミノ基の供与体として含む反応液１９０μｌに、上記１．の（３）と同様の操作で精製した酵素（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて８０℃で５分間酵素反応を行った。反応後、３０％トリクロロ酢酸水溶液５０μｌを加えて反応を停止した。反応系中に生成したグルタミン酸は、Ｍａｒｆｅｙ’ｓ試薬を用いて誘導体化し、ＨＰＬＣで定量した。
【０１１９】
結果を表１に示す。
【表１】
2006271375.tif 000004
【０１２０】
７．デヒドロゲナーゼ（ＳＴ００６４）
外来遺伝子として、超好熱菌スルホロバス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）のデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＳＴ００６４）を用いた他は、ＡＰＥ２２４８に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。なお、誘導培養は２５℃で２０時間行った。ここで用いたＳＴ００６４のヌクレオチド配列を配列番号２１に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号２２および２３に示した。  
粗酵素液中の可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。誘導されたタンパク質のバンドが確認できた。
【０１２１】
１０ｍＭのグルタルアルデヒドまたはグリセルアルデヒド、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および１０ｍＭのニコチンアミド補酵素（酸化型）を含む反応液６００μｌに、上記１．の（３）と同様な操作で精製した酵素（０．２μｇ/μｌ）を２０μｌ加えて５０℃で６０分間酵素反応を行った。反応後、直ちに氷冷して反応を停止した。反応系中に生成したニコチンアミド補酵素（還元型）を分光高度計を用いて３４０ｎｍの波長で測定し、酵素活性を求めた。
【０１２２】
結果を表２に示す。
【表２】
2006271375.tif 000005
【０１２３】
［２］α−アミノトランスフェラーゼのスクリーニング
ａ．４−フルオロフェニルグリオキシル酸、ｂ．２，４，６−トリメチルフェニルグリオキシル酸、ｃ．２−メトキシフェニルグリオキシル酸、ｄ．２，５−ジメチルフェニルグリオキシル酸、ｅ．３−メトキシフェニルグリオキシル酸、ｆ．ビフェニル−４−グリオキシル酸、ｇ．４−メトキシフェニルグリオキシル酸、ｈ．トリメチルグリオキシル酸、ｊ．３，４，５−トリメトキシフェニルグリオキシル酸、ｋ．インドール−３−グリオキシル酸、ｌ．２−メチルインドール−３−グリオキシル酸  ｍ．３，４，５−トリフルオロフェニルグリオキシル酸、ｎ．ナフタレン−１−グリオキシル酸、ｏ．チオフェン−２−グリオキシル酸を用い、各ケト酸を基質とするα−アミノトランスフェラーゼをスクリーニングした。候補となるα−アミノトランスフェラーゼには、ＰＨ１３７１、ＡＰＥ０１６９、ＡＰＥ２２４８、ＳＴ１２１７、ＳＴ１４１１を用いた。
【０１２４】
１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２ｍＭ  α−ケト酸、５ｍＭ  Ｌ−アラニン、５ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、４０ｍＭ  ５−アミノペンタン酸、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、１０μＭ  ピリドキサール−５′−リン酸、０．２μｇのα−アミノトランスフェラーゼ、２μｇのＳＴ０１９１（ω−アミノトランスフェラーゼ）、４０μｇのＳＴ００６４（アルデヒドデヒドロゲナーゼ）、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク、電子キャリアーおよびテトラゾリウム塩を含む）  ５μｌ/ｍｌを含む反応液２００μｌを調製し、７０℃で３０分間反応させた。反応終了後、反応液を手早く氷冷し、反応液の４９０ｎｍにおける吸収を測定した。
【０１２５】
測定結果を表３に示した。なお、表中、目視で着色が認められたものは太字で示した。
【表３】
2006271375.tif 000006
【０１２６】
これとは別に、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク）を含まない他は上記と同様の手法で酵素反応を行い、生成したアミノ酸をマススペクトルにて分析した。その結果、着色が確認できた酵素／ケト酸の組み合わせでは、各アミノ酸に相当する分子量のピークを確認できた。
【０１２７】
本スクリーニング方法を利用することにより、各α−アミノトランスフェラーゼの活性を確認することができた。例えば、ＳＴ１４１１は４−フルオロフェニルグリオキシル酸や４−メトキシフェニルグリオキシル酸を、対応するアミノ酸に変換できることが示された。
【０１２８】
また、本スクリーニング方法を利用することにより、各ケト酸を特異的に基質とするα−アミノトランスフェラーゼが特定され、従って各アミノ酸合成に有用なα−アミノトランスフェラーゼが明らかとなった。例えば、４−メトキシフェニルグリシン（ｇに対応するアミノ酸）の合成にはＳＴ１４１１が有用であり、２，５−ジメチルフェニルグリシン（ｄに対応するアミノ酸）の合成にはＡＰＥ０１６９が有用であることが明らかとなった。
【０１２９】
［３］α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定
（１）好熱菌α−アミノトランスフェラーゼの検量線の作成
１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２ｍＭ  ３−メチル−２−オキソペンタン酸、１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、１００ｍＭ  ５−アミノペンタン酸、５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、１０μＭ  ピリドキサール−５′−リン酸、０．００５〜０．０５μｇ  ＳＴ１４１１、1μｇ  ＳＴ０１９１、１０μｇ  ＳＴ００６４、１５μｌ／ｍｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク、電子キャリアーおよびテトラゾリウム塩を含む）を含む反応液２００μｌをマイクロプレート上に調製し、マイクロプレート対応のサーマルサイクラーを用いて酵素反応を行った。サーマルサイクラーのプログラムは７０℃（１０分）→４℃（１０分）とした。反応終了後、マイクロプレートリーダーを用いてＡ４９０の値を測定し（表４）、検量線を作成した（図２）。
【表４】
2006271375.tif 000007
【０１３０】
表４及び図２に示すように、反応液中の酵素量と上述の反応によって生成されたホルマザンの吸光度（Ａ４９０）の値との間に良好な直線関係が認められたため、本反応系を用いてα−アミノトランスフェラーゼの比活性を測定可能なことが示された。
【０１３１】
次に、検量線作成に用いたＳＴ１４１１の３−メチル−２−オキソペンタン酸からのイソロイシンの生成活性を測定した。１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ピリドキサール−５′−リン酸、２０ｍＭ  ３−メチル−２−オキソペンタン酸、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、１μｇ  ＳＴ１４１１を含む反応液  ２００μｌを７０℃で５分間反応させ、生成したイソロイシンをＨＰＬＣで定量した。その結果、ＳＴ１４１１のイソロイシン合成活性は１３４Ｕ／ｍｇであった。
【０１３２】
（２）好熱菌α−アミノトランスフェラーゼの比活性測定
１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２ｍＭ  表５に示す各ケト酸（非天然アミノ酸合成用ケト酸）、１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、１００ｍＭ  ５−アミノペンタン酸、５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、１０μＭ  ピリドキサール−５′−リン酸、０．０２μｇ  α−アミノトランスフェラーゼ、1μｇ  ＳＴ０１９１、１０μｇ  ＳＴ００６４、１５μｌ／ｍｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク）を含む反応液２００μｌをマイクロプレート上に調製し、マイクロプレート対応のサーマルサイクラーを用いて酵素反応を行った。サーマルサイクラーのプログラムは７０℃（１０分）→４℃（１０分）とした。反応終了後、マイクロプレートリーダーを用いてＡ４９０の値を測定した。
【０１３３】
一方、比活性を容易に求めることができるように、上記検量線（図２）のＸ軸の値を、あらかじめ比活性を表すように変換した。即ち、本実験では、０．０２μｇの酵素を用いたため、上記検量線（図２）のＸ軸の値（α−アミノトランスフェラーゼの添加量：Ｘ１）に対し、１３４Ｕ／ｍｇ・Ｘ１×１０−３ｍｇ（酵素の絶対量）／０．０２×１０−３ｍｇの値（α−アミノトランスフェラーゼの比活性：Ｘ２）を求め、α−アミノトランスフェラーゼの添加量（Ｘ１）をα−アミノトランスフェラーゼの比活性（Ｘ２）に変換して図３のＸ軸とした。
【０１３４】
作成した図３を用いて、測定したＡ４９０の値から各ケト酸に対するＳＴ１４１１とＡＰＥ０１６９との比活性を算出し、定量した。
【０１３５】
結果を表５に示す。
【表５】
2006271375.tif 000008
【０１３６】
［４］α−ケト酸の検出及び定量
１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２ｍＭ  ３−メチル−α−ケト吉草酸、４０ｍＭ  ５−アミノペンタン酸、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、１０μＭ  ピリドキサール−５′−リン酸、２μｇ  ＳＴ１４１１（α−アミノトランスフェラーゼ）、２０μｇ  ＳＴ０１９１（ω−アミノトランスフェラーゼ）、４０μｇ  ＳＴ００６４（アルデヒドデヒドロゲナーゼ）、０−５０μＭ  ２−オキソグルタル酸を含む反応液２００μｌを調製し、７０℃で３０分間反応させた。反応終了後、反応溶液を素早く氷冷して反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）を用いて３４０ｎｍにおける吸光度を測定した（○）。コントロール（▲）として、ＳＴ１４１１を反応液中に加えていないものも同様に行い、加えたものと比較した。結果を図４に示す。
【０１３７】
コントロールでは、２−オキソグルタル酸濃度が１−５０μＭの時、Ａ３４０の増加はほとんど見られなかった。一方、ＳＴ１４１１を入れた実験系では、Ａ３４０の増加が見られ、ＳＴ１４１１の反応により、反応液中の２−オキソグルタル酸が増幅し、その結果測定感度が上昇していることが示された。２−オキソグルタル酸濃度が１−５０μＭの時に、２−オキソグルタル酸濃度とＡ３４０の値には直線的な相関性があり、このことからα−ケト酸の定量が可能であることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】本発明の一実施例において、トランスアミラーゼ（ＡＰＥ２２４８、ＰＨ１３７１、ＡＰＥ０１６９、ＳＴ１２１７、ＳＴ１４１１）活性の測定結果を示した図である。
【図２】本発明の一実施例において、反応液中のＳＴ１４１１の量と、酵素反応によって生成されたホルマザンの吸光度（Ａ４９０）の値との相関関係を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、図２のＸ軸の値をＳＴ１４１１の比活性の値に変換した図である。
【図４】本発明の一実施例において、本発明のケト酸の定量方法に従ってケト酸を定量した実験結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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