(57)【要約】【課題】キャンディダ・ユティリスに導入した異種または同種遺伝子の発現を高める、キャンディダ・ユティリス由来の、高活性のプロモーターＤＮＡを提供する。【解決手段】キャンディダ・ユティリス染色体遺伝子由来の、１４０５ｂｐおよび１４１５ｂｐのリボソームタンパク質遺伝子プロモーター配列。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に記載されるリボソームタンパク質Ｌ３１遺伝子のプロモーター配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）の塩基配列、またはその部分配列を含んでなるプロモーター活性を有するキャンディダ・ユティリス由来のＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載されるリボソームタンパク質Ｌ２９遺伝子のプロモーター配列を有するＤＮＡ。
（ｄ）（ｃ）の塩基配列、またはその部分配列を含んでなるプロモーター活性を有するキャンディダ・ユティリス由来のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２記載のＤＮＡ断片と、その下流に同種または異種遺伝子を含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項４】
シクロヘキシミドにより誘導されるリボソームタンパク質遺伝子のプロモーターを、薬剤耐性遺伝子の発現に用いるキャンディダ・ユティリスの形質転換系。
【請求項５】
薬剤耐性遺伝子がシクロヘキシミド耐性遺伝子である請求項４の形質転換系。
【請求項６】
プロモーターがキャンディダ・ユティリスのリボソームタンパク質遺伝子のプロモーターである請求項４の形質転換系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャンディダ・ユティリス（Candida  utilis）に同種または異種遺伝子を導入して形質転換する際に利用される、選択圧下で発現が誘導されるキャンディダ・ユティリス由来の新規なプロモーターＤＮＡに関する。ベクターに挿入された本発明のプロモーターＤＮＡは、宿主で同種又は異種遺伝子、好ましくは薬剤耐性マーカー遺伝子、の発現に使用される。
【背景技術】
【０００２】
キャンディダ・ユティリスは、炭素資化域が広く、好気的条件下での培養でエタノールを生成せず、その増殖阻害も受けないことから、高濃度での連続培養による菌体製造が可能であり、食飼料用のタンパク質源等として広く使用されているのみならず、グルタチオン、核酸等の生産株として広く工業的に利用されてきた。
【０００３】
組み換えＤＮＡ技術の発展によって、遺伝子を自在に改変しあるいは加工し、これを細胞に導入して遺伝子を組み換え、例えばその発酵特性の改良、工業的有用性の増大、などが行われており、種々の酵母で可能となってきた。中でも、キャンディダ・ユティリスは安全性に優れ、効率的な菌体製造が出来ることから、有用物質生産の宿主生物としての利用が期待されている。
【０００４】
遺伝子導入の際に有効な酵母の薬剤耐性マーカーには、大腸菌由来のＧ４１８耐性遺伝子（ｋａｎＭＸ）（Ｙｅａｓｔ １９９４ １０ １７９３）やハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）（Ｇｅｎｅ  １９８３  ２５  １７９）をはじめ、酵母由来の亜硫酸耐性遺伝子（ＦＺＦ１−４）（Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  １９９９  ３６  ３３９）、ホルムアルデヒド耐性遺伝子（ＳＦＡ１）（Ｙｅａｓｔ  １９９７  １３  ５５１）などが知られており、これらの耐性遺伝子の発現には、同種・異種に関わらず一般的に宿主由来のプロモーターが使われる。
用いるプロモーターの強度に依存して形質転換効率が向上するという報告もあり（Ｙｅａｓｔ  １９９７  １３  ５５１  ）、前記の耐性遺伝子を含めてマーカー遺伝子の発現には、ＧＡＰ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＣＹＣ１（チトクロームＣ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）などの強力なプロモーターがよく用いられている。
アルコールで誘導されるＡＤＨ以外は構成的な転写活性を有するプロモーターであるが、薬剤存在下では生育の遅延が起こることから明らかなように、細胞にはかなりの負荷がかかっており、必ずしもそれらのプロモーターが薬剤の選択圧下で十分な転写活性を発揮しているとは限らない。
【０００５】
キャンディダ・ユティリス由来のプロモーターとしては、ＧＡＰ遺伝子のプロモーター、ＰＧＫ遺伝子のプロモーター、および原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子プロモーター等、強力なプロモーターが既に取得されているが、いずれも前述の様に構成的発現を有するものである（特許文献１）。
よって、キャンディダ・ユティリスにおいて効率的形質転換系を構築するために、選択圧下で良好に機能する、薬剤耐性マーカーの発現に適したキャンディダ・ユティリス由来のプロモーターが望まれていた。
【特許文献１】特開２００３−１７４８７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、キャンディダ・ユティリス酵母を宿主とする遺伝子発現系で、同種または異種の薬剤耐性マーカー遺伝子の発現において利用できる、選択圧下の発現に適したプロモーターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、キャンディダ・ユティリス酵母染色体からマーカー遺伝子の発現に適したプロモーターを含むＤＮＡを取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、選択圧下、具体的にはシクロヘキシミド存在下で発現が誘導される、配列表の配列番号１または配列番号２に記載されるリボソームタンパク質遺伝子のプロモーター配列、またはそれらのいずれかの部分配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡに係るものである。
また、本発明は、それらのＤＮＡ配列の下流に同種または異種遺伝子を含むプラスミドに係るものである。
さらに、本発明は、シクロヘキシミドにより誘導されるリボソームタンパク質遺伝子のプロモーター、特にキャンディダ・ユティリス由来のプロモーターを、薬剤耐性遺伝子、たとえばシクロヘキシミド耐性遺伝子の発現に用いるキャンディダ・ユティリスの形質転換系に係るものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によるＤＮＡは、薬剤耐性マーカー遺伝子により耐性が付与される該薬剤の存在下で誘導される高活性のプロモーターを含んでいる。従って、本発明によるＤＮＡの下流に異種遺伝子または同種遺伝子を連結したプラスミドを作製し、それを宿主に導入することによって効率よく形質転換体を取得することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡは、キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株の染色体遺伝子よりスクリーニングされたもので、リボソームタンパク質遺伝子の上流に位置し、プロモーター領域を含む。プロモーター配列の具体例としては、配列番号１並びに２、およびプロモーター活性を有するそれらの部分配列が挙げられる。
【００１１】
染色体遺伝子から目的のＤＮＡ断片をクローニングする手順について、以下、説明する。
１．ゲノムライブラリーの構築
キャンディダ・ユティリスのゲノムＤＮＡを予め選択してある制限酵素で処理し、適当なサイズのＤＮＡを分取して、後述するプロモータースクリーニング用プラスミドＹＲｐΔＰ−ＹＡＰに連結した（図１）。このライゲーション液を用いて大腸菌を形質転換し、薬剤耐性マーカーを利用して得られたコロニーからＤＮＡを回収してゲノムＤＮＡライブラリーとした。
【００１２】
２．プロモーターのスクリーニング
ここで用いたプロモータースクリーニング用のプラスミド（ＹＲｐΔＰ−ＹＡＰ）は、キャンディダ・ユティリスで機能する自律複製起点と、プロモーター領域を欠いた薬剤耐性遺伝子を含んでなる。このプラスミドは、自律複製起点を持ちキャンディダ・ユティリス細胞内で染色体とは独立して複製可能であるが、プロモーター配列を欠き薬剤耐性遺伝子の転写が行われず、よってこのプラスミドを保有する酵母細胞は該薬剤を含む培地上には生育できない。このプラスミドの薬剤耐性遺伝子の上流にある制限酵素サイトを用いて作成したキャンディダ・ユティリスのゲノムＤＮＡライブラリーを、キャンディダ・ユティリス細胞へ導入し、該薬剤耐性コロニーを選択することで、プロモーター活性を持ったＤＮＡ断片を取得することが可能である。
薬剤耐性マーカー遺伝子としてはキャンディダ・ユティリス由来の酵母ＡＰ−１様転写因子をコードするＹＡＰ１遺伝子を用いた（特許出願中）。シクロヘキシミド耐性の成立には、ＹＡＰ１遺伝子の高発現が必要であり、この遺伝子をレポーターとして用いることで、マーカー遺伝子の発現に適した高活性のプロモーターが取得できるものと期待される。
ＤＮＡライブラリーをキャンディダ・ユティリスに酢酸リチウム法で導入し、シクロヘキシミド耐性コロニーを取得した。その中で高いシクロヘキシミド耐性を示したものについてプラスミドを回収し、インサートサイズやキャンディダ・ユティリスへの形質転換能の有無を調べた。
インサートサイズが小さく良好なシクロヘキシミド耐性を示したＰ２−１とＰ２−３３についてさらに詳細な解析を行った。
【００１３】
３．プロモーター活性を有するＤＮＡ断片の短縮化
適当な制限酵素を用いて、プロモーター活性を有するＤＮＡ断片内の上流部位を欠失させた数種の変異体を作成し、それらの形質転換体のシクロヘキシミド耐性能を調べることでプロモーター機能領域の特定を行った。
短縮化したＰ２−１−２（約５００ｂｐ）やＰ２−３３−２（約１．４ｋｂｐ）由来のクローンはいずれも欠失前と同じ７５μｇ／ｍｌの高いシクロヘキシミド耐性を示し、このＤＮＡ断片にプロモーターの機能領域が存在することが明らかとなった。またこれらは、比較対照として用いたＧＡＰプロモーター由来のクローンと同等以上の耐性を示した。
【００１４】
４．プロモーター活性を有するＤＮＡ断片の塩基配列解析
次に得られたプロモーター活性を示すＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列の解読にはキャピラリーＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ）を用いた。Ｐ２−１は配列番号１に示される１４０５ｂｐ、Ｐ２−３３−２は配列番号２で示される１４１５ｂｐの配列から構成されていた。
【００１５】
５．プロモーター遺伝子の特定
ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲによりプロモーター下流遺伝子の特定を行った。この方法は既に塩基配列が分かっているＤＮＡ断片の両端の配列を基に、それぞれ逆向きになるようにプライマーを作成し、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い、既知のＤＮＡ断片に隣接する遺伝子断片を取得する方法である。
キャンディダ・ユティリスのゲノムＤＮＡを、Ｐ２−１、Ｐ２−３３の両プロモータ配列内の下流領域を切断しないような制限酵素で消化し、セルフライゲーションにより自己環状化させた。このＤＮＡを鋳型として上記の様なプライマーを用いてＰＣＲを行い、各プロモーター遺伝子を含む遺伝子断片を増幅した。
増幅したＤＮＡ断片の部分塩基配列を解読することで、プロモーター遺伝子を含むＤＮＡ断片であることを確認するとともに、その遺伝子から推定されるアミノ酸配列を基にデーターベースによるホモロジー検索を行い、遺伝子を同定した。
ともに下流遺伝子はリボソーム大サブユニットを構成するタンパク質の遺伝子であり、Ｐ２−１はリボソームタンパク質Ｌ３１遺伝子、Ｐ２−３３はリボソームタンパク質Ｌ２９遺伝子であった。
【００１６】
クローニングしたプロモーターに関して以下の機能解析を行った。
まず、プロモーターの活性測定を行った。対象とするプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結して、その酵素活性を測定することで、プロモーターの転写活性を定量化した。レポーターとしてはβーガラクトシダーゼ遺伝子を用いた。
βーガラクトシダーゼ活性測定用ベクターにはＹＩｐｌａｃＺを用いた（図５）。このベクターは、主に以下の三つの部分、すなわち(i)開始コドンを含むｌａｃＺ遺伝子とＧＡＰターミネーターからなるレポーターセットと、(ii)ＧＡＰプロモーターとバクテリア由来のＫＡＮＭＸおよびホスホグリセリン酸キナーゼのターミネーターからなるキメラＧ４１８耐性マーカー遺伝子（出願中の特許参照）、および(iii)３−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（３−ＩＭＤＨ）（Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９８７  １３３  １０８９）の部分配列からなる染色体組み込み用のＤＮＡで構成されている。
ＰＣＲで取得した各種プロモーターＤＮＡ断片を、βーガラクトシダーゼ活性測定用ベクターのｌａｃＺ遺伝子直前に挿入した。これらのベクターをキャンディダ・ユティリスへ導入して得たＧ４１８耐性を示す形質転換体の中からサザン解析によりβーガラクトシダーゼ発現ベクターが染色体へ１コピー組み込まれたクローンを選択した。
これらのクローンについて通常の条件下と最少阻止濃度以下のシクロヘキシミド存在下でのβーガラクトシダーゼ活性を定量した結果、スクリーニングしたプロモーターでは、シクロヘキシミド存在下において選択圧のない条件に比べ約４〜５倍転写活性が増加することを明らかとした。
【００１７】
さらに、各種プロモーターにより構成されるＹＡＰ１発現ベクターをキャンディダ・ユティリスに形質転換して、スクリーニングしたプロモーター由来のベクターはいずれもＧＡＰプロモーター由来のベクターより優れた形質転換効率を示すことを確認した。
【００１８】
以上から、スクリーニングしたプロモーターは、シクロヘキシミド存在下で転写活性が誘導され、シクロヘキシミドを選択圧とする形質転換において好適であることが明らかとなった。また、このプロモーターは形質転換時のみ活性が誘導され、通常は発現が抑えられることから、細胞への負担が少ないという利点がある。具体的には、このプロモーターはＹＡＰ１遺伝子をマーカーとするシクロヘキシミド選択圧下でのキャンディダ・ユティリスの形質転換系に適していると言える。
【００１９】
またさらに、スクリーニングしたプロモーター下流に挿入したバクテリア由来のＧ４１８耐性遺伝子がキャンディダ・ユティリス内で機能することを確認し、異種遺伝子の発現も可能であることが示された。
【００２０】
本発明において提供されるキャンディダ・ユティリス由来のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片は、キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株から得られたものであるが、キャンディダ・ユティリスに属する他の菌株においてもプロモーター活性を有する。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例１
１−１．ゲノムライブラリーの構築
プロモーターのスクリーニングに用いるキャンディダ・ユティリスのゲノムＤＮＡライブラリーを作成した。
自律複製型の高発現プラスミドＹＲｐＧＡＰ（特許出願中）のＧＡＰプロモーター配列をＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで消化した後、末端を平滑化して自己会合させることで除去し、次いでＧＡＰターミネーター上流のＳｍａＩとＸｂａＩサイトにＹＡＰ１構造遺伝子（特許出願中）を連結して、プロモーターレスのプラスミド（ＹＲｐΔＰ−ＹＡＰ）を作成した。
キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株のゲノムＤＮＡを、段階的に希釈したＳａｕ３ＡＩで部分消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。１ｋｂｐ前後のＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮキット（ＱＩＡＧＥＮＥ製）を用いて回収して、ＹＲｐΔＰ−ＹＡＰのＹＡＰ１構造遺伝子の直前に存在するＢｇｌＩＩサイトに挿入した（図１）。
この反応液をエレクトロポレーションにて大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ'に形質転換して、アンピシリン耐性コロニーを取得した。これらのコロニーを掻き集めて得た培養液を基に再度プレート上で菌体を増幅させＤＮＡを回収して、ゲノムＤＮＡライブラリーとした。得られたライブラリーの平均インサートサイズは１．０ｋｂｐ、組み込み率は８７．５％であった。
【００２２】
１−２．プロモーターのスクリーニング
ゲノムライブリーＤＮＡ４３．４μｇを酢酸リチウム法でキャンディダ・ユティリスＡＨＵ３０５３株へ形質転換した。３０℃、３日間の培養により、シクロヘキシミドを終濃度が４μｇ／ｍｌとなるように添加したＹＰＤ寒天培地上に５７個のコロニーが生育した。ＤＮＡ無添加のコントロールでもコロニーの生育が認められたので自然耐性株が混入していると予想された。
そこで、得られた耐性株についてシクロヘキシミド添加培地でシングルコロニー化した後、各株のシクロヘキシミド耐性濃度を測定した。コントロールで得られた自然耐性株(１０μｇ／ｍｌまで生育)と比較して明らかに高い耐性(５０μｇ／ｍｌまで生育)を示した１４株からプラスミドＤＮＡを回収した。このうち酵母へ再度形質転換し耐性を付与できたものが１２株であった。これらについて制限酵素消化によるフラグメント解析や、部分塩基配列の解析の結果、８種類に分類できることが明らかとなった。
このうちサイズが小さく、良好なシクロヘキシミド耐性を示した約１．４ｋｂｐのＰ２−１と約３．６ｋｂｐのＰ２−３３についてさらに解析を進めた。
【００２３】
１−３．プロモーター活性を有するＤＮＡ断片の短縮化
プロモーター活性を有するＰ２−１とＰ２−３３のＤＮＡ断片について短縮化を行った。
数種のプロモーターの欠失変異体は、ＹＡＰ１発現ベクターの各プロモーター内部の上流配列を、制限酵素を用いて欠失させ作成した。
Ｐ２−１については、プロモーター内部で切断するＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩサイトを利用し、ＳｍａＩからＥｃｏＲＩ部分を欠失させた約０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片からなるＰ２−１−１を、ＳｍａＩからＸｂａＩ断片を欠失させた約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片からなるＰ２−１−２をそれぞれ有するＹＡＰ１発現ベクターを作成した。
同様にＰ２−３３については、約１．３ｋｂｐのＳｍａＩからＥｃｏＲＩ断片を削った約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片からなるＰ２−３３−２を持つＹＡＰ１発現ベクターを作製した。
これらをＡＨＵ３０５３株に導入してシクロヘキシミド耐性株を取得した。比較としてＧＡＰプロモーターによるＹＡＰ１発現ベクターを用いた。得られた形質転換体はシングルコロニー化した後、各種３〜６コロニーについてシクロヘキシミドに対する耐性能 （５０，７５，１００μｇ／ｍｌ）を比較した。培養８日目における結果を図２に示した。
スクリーニングしたプロモーターおよびその上流領域を欠失させたプロモーターを持つ株では全て７５μｇ／ｍｌまで生育し、機能領域がＰ２−１ではＰ２−１−２に、Ｐ２−３３ではＰ２−３３−２に含まれると推定された。また、スクリーニングしたプロモーターはＧＡＰプロモーター由来のクローンより生育速度が速くかつ高濃度のシクロヘキシミド耐性を示したことから、シクロヘキシミド存在下ではＧＡＰプロモーターと同等以上の活性を持つことが示唆された。
【００２４】
１−４．プロモーター活性を有するＤＮＡ断片の塩基配列解析
次に得られたプロモーター活性を示すＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
プロモーター領域を含むＰ２−１フラグメントは、配列番号１で示される１４０５ｂｐの塩基配列で構成されていた。一方、Ｐ２−３３−２フラグメントは配列番号２で示される１４１５ｂｐの塩基配列で構成されていた。
【００２５】
１−５．プロモーター遺伝子の同定
ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲによってプロモーター下流ＤＮＡ断片を取得し、その塩基配列を解読することでプロモーター遺伝子の同定を行った。
さまざまな制限酵素でキャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４のゲノムＤＮＡを消化し、セルフライゲーションにより自己会合させた。この自己環状化させたゲノムＤＮＡ３０ｎｇを鋳型として、ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ製）を用いてＰＣＲを行った。Ｐ２−１の下流ＤＮＡ断片の取得には以下に示す、（１）と（２）を、同様にＰ２−３３には（３）と（４）を用いた。
【００２６】
プライマー
（１）Ｐ２−１ｕｐ
5'-TTGCGGCCGCGCCGTTCACATCCTAATGCA-3'
（２）Ｐ２−１ｄｏｗｎ
5'-TTGCGGCCGCCCCCATATACTCATCAAAGA-3'
（３）Ｐ２−３３ｕｐ
5'-TTGCGGCCGCGCTCCAATTGGCCCAGAAAA-3'
（４）Ｐ２−３３ｄｏｗｎ
5'-TTGCGGCCGCTAACGAACGCTTCCACACTG-3'
それぞれの末端にＮｏｔＩサイトを付加してある。
【００２７】
増幅が見られたもののうちサイズの小さい断片、Ｐ２−１ではＥｃｏＲＩで消化し自己会合させた約２．５ｋｂｐ、同様にＰ２−３３ではＥｃｏＲＶ由来の３．２ｋｂｐをクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＮｏｔＩサイトへ挿入した。
これらの塩基配列の一部を解析し、推定されるアミノ酸配列を基にコンピューターを使ったホモロジー検索を行った結果、ともにリボソームの大サブユニットを構成するリボソームタンパク質と高い相同性を示した。Ｐ２−１とＰ２−３３の下流遺伝子がコードするタンパク質はリボソームタンパク質Ｌ３１、Ｌ２９とそれぞれ極めて高い相同性を確認した（図３，４）。
【００２８】
実施例２
以下、スクリーニングした各種プロモーターの機能を解析した。
２−１．プロモーター転写活性測定
プロモーター活性測定用ベクターを構築した。まずレポーター遺伝子をＰＣＲにより取得した。鋳型には大腸菌のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）を保有するｐＭＣ１８７１を用いた。このＬａｃＺには開始コドンが存在しないので、ＢａｍＨＩサイトの直前に開始コドン（ＡＴＧ）を付加した。
【００２９】
（５）ｌａｃＺ−Ｆ
5'-AACTGCAGATGGATCCCGTCGTTTTACAACGTCGTG-3'
（６）ｌａｃＺ−Ｒ
5'-GGTCTAGACGGTTATTATTATTTTTGACACCAGA-3'
上流にはＰｓｔＩサイトを、下流にはＸｂａＩサイトを付加するようにプライマーを設計した。
【００３０】
上記プライマーを基にＰｙｒｏｂｅｓｔ(ＴＡＫＡＲＡ製)を用いたＰＣＲによりＬａｃＺ構造遺伝子−付加したＡＴＧからストップコドンＴＡＡの下流９塩基までの３０６６ｂｐ−を増幅した。
このＬａｃＺ遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに挿入し、その下流にＧＡＰターミネーターと、相同組み換えのターゲットを有するキメラＧ４１８耐性選択マーカー（３−ＩＭＤＨ：：Ｐｇａｐ−ＫＡＮＭＸ−Ｔｐｇｋ）とを順に連結して、ＬａｃＺ活性測定用ベクターＹＩｐｌａｃＺを構築した（図５）。各種プロモーターＤＮＡは以下のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。
【００３１】
（７）Ｐ２−１−Ｆ
5'-AGGGTCGACCCCGGGAGATCTTGCAATGCTCAG-3'
（８）Ｐ２−１−Ｒ
5'-AACTGCAGAGATCTGTTAGAAGACATCTTTGA-3'
（９）Ｐ２−３３−２−Ｆ
5'-GAATTCGCGAAACGCTGCTCTGTG-3'
（１０）Ｐ２−３３−２−Ｒ
5'-AACTGCAGAGATCCTTTCAATTCAACATTTAA-3'
Ｐ２−１の上流にはＳａｌＩサイトを、Ｐ２−３３−２の上流にはＥｃｏＲＩサイトを、また、両断片の下流にはともにＰｓｔＩサイトをそれぞれ付加するようにプライマーを設計した。
【００３２】
Ｐ２−１の増幅にはプライマー（７）と（８）を、Ｐ２−３３−２には（９）と（１０）をそれぞれ用いた。これらのプライマーを用いたＰＣＲによって増幅されるＰ２−１とＰ２−３３−２のＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＳａｌＩ−ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位にそれぞれ連結した。
Ｐ２−１−２ＤＮＡ断片は、クローニングしたＰ２−１をＸｂａＩとＥｃｏＲＶで消化し平滑化した後、セルフライゲーションを行うことで作成した。ＧＡＰプロモーターに関してはＰＣＲで増幅したＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を使用した（出願中の特許参照）。
以上の様に取得した各種プロモーター断片をＹＩｐｌａｃＺのＬａｃＺ遺伝子直前に挿入することで、各々のＬａｃＺ発現プラスミドを作成した。
【００３３】
これらのベクターをキャンディダ・ユティリスの染色体に組み込むため、３−ＩＭＤＨ遺伝子のみを１箇所切断するＮｓｐＶを用いて消化し、ＡＨＵ３０５３株へ酢酸リチウム法により形質転換した。Ｇ４１８耐性を示し、しかもサザン解析によりＬａｃＺ発現プラスミドが染色体ＤＮＡに１コピー組み込まれたことが確認できたクローンを活性測定に供した。
【００３４】
各種プロモーターを持ったクローンをＹＰＤ液体培地（２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）で、３０℃のもと振とう培養した。ＯＤ６００が０．８前後に達した時点（約４時間）でサンプリングして、常法であるｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＯＮＰＧ）アッセイによりβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。結果を下表１に示した。
【００３５】
【表１】
2006075123.tif 000002
【００３６】
選択圧のないＹＰＤ液体培地で培養した条件においては、スクリーニングしたプロモーターはいずれもＧＡＰプロモーターの約１／１０以下の低調な転写活性を示した。
【００３７】
次いで、各種プロモーターを持ったクローンを、最少阻止濃度以下のシクロヘキシミド（終濃度１μｇ／ｍｌ）を添加したＹＰＤ液体培地で同様に培養し、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果を下表２に示した。
【００３８】
【表２】
2006075123.tif 000003
【００３９】
シクロヘキシミドの添加により、培養時間の遅延が見られ、ＯＤ６００が０．８前後に達するまで約２１時間を要した。シクロヘキシミド添加によりスクリーニングしたプロモーターはいずれも、選択圧のないＹＰＤ液体培地で培養した条件に比べて転写活性が約４〜５倍増大した。一方のＧＡＰプロモーターは３割程度の活性の減少が認められた。
【００４０】
２−２．各種プロモーターを持ったＹＡＰ１発現プラスミドによるＡＨＵ３０５３株の形質転換
Ｐ２−１−２，Ｐ２−３３−２，Ｐｇａｐの３種類のプロモーターを持った各ＹＡＰ１発現プラスミドのキャンディダ・ユティリスＡＨＵ３０５３株に対する酢酸リチウム法による形質転換効率を調べた。結果を下表３に示した。
【００４１】
【表３】
2006075123.tif 000004
【００４２】
ＧＡＰプロモーターと比較してスクリーニングしたプロモーターの方が明らかに高い形質転換効率を示した。中でもＰ２−１−２は、ＧＡＰプロモーターの約１０倍と極めて良好な効率を示した。
【００４３】
２−３．Ｐ２−１−１による異種遺伝子の発現
スクリーニングしたプロモーターが他の遺伝子に対しても転写活性を有するか確認した。Ｐ２−１−１の下流にＧ４１８耐性遺伝子(ＫＡＮＭＸ)を挿入した自律複製型のプラスミド（図６）を構築し、キャンディダ・ユティリスＡＨＵ３０５３株へ導入した。約０．２μｇ−ＤＮＡあたり６５０〜８００個のＧ４１８耐性（４０μｇ／ｍｌ）耐性株が出現した。Ｐ２−１−２が異種遺伝子に対しても転写活性を持つことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
以上、述べてきた通り、本発明によれば、キャンディダ・ユティリス由来の、薬剤存在下で誘導される活性の高いプロモーター遺伝子ＤＮＡが提供され、その下流に異種または同種の該薬剤耐性マーカー遺伝子を連結することにより、効率的にキャンディダ・ユティリスの形質転換体を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】プロモータースクリーニング用プラスミドＹＲｐΔＰ−ＹＡＰに、キャンディダ・ユティリスのゲノムＤＮＡを連結した、プロモータースクリーニング用ＤＮＡライブラリーの構築図。
【図２】各種プロモーター下で発現するＹＡＰ１発現プラスミドを導入したキャンディダ・ユティリスのシクロヘキシミド耐性能を比較した図。
【図３】Ｐ２−１下流遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列のホモロジー検索結果を示す。Sc，Sp，Rn，Hsは、それぞれ  Saccharomyces  cerevisiae，Schizosaccharomyces  pombe，Rattus  novvegicus，Homo  sapiens  を示す。
【図４】Ｐ２−３３下流遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列のホモロジー検索結果を示す。Sc，Spは、それぞれ  Saccharomyces  cerevisiae，Schizosaccharomyces  pombe  を示す。
【図５】プロモーター活性測定用プラスミドＹＩｐｌａｃＺの構成を示した図。
【図６】Ｐ２−１−１によるＧ４１８耐性遺伝子発現プラスミドの構成を示した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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