(57)【要約】【課題】  ウシ白血病に対する抵抗性に関連するアリルを見出し、かかる抵抗性を判定する方法及び手段を提供すること。【解決手段】  被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖の７５番目のアミノ酸がバリンであるか否かを判定することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖の７５番目のアミノ酸がバリンであるか否かを判定することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
【請求項２】
被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子における配列番号１に示される塩基配列を有するＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
【請求項３】
被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法であって、
（ａ）被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製するステップ、
（ｂ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出するステップ、
を含み、ＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有することを示すものである、上記方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法（ＰＣＲ−ＳＢＴ）により行われる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）が、
（ｂ１）配列番号３に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、又は
（ｂ２）配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、
あるいは（ｂ１）及び（ｂ２）の両方のステップを含む、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）が、
（ｂ３）得られた増幅産物の塩基配列を決定するステップ、
をさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖の７５番目のアミノ酸がバリンであるか否か、並びにウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖の７４番目、７７番目及び７８番目のアミノ酸がそれぞれグルタミン酸、アルギニン及びバリンであるか否かを判定することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
【請求項８】
被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子における配列番号１に示される塩基配列を有するＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出すること、並びにウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖の７４番目、７７番目及び７８番目のアミノ酸がそれぞれグルタミン酸、アルギニン及びバリンであるか否かを判定することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
【請求項９】
被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子における配列番号１に示される塩基配列を有するＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出すること、及びウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子における配列番号１４に示される塩基配列を有するＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
【請求項１０】
被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法であって、
（ａ）被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製するステップ、
（ｂ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出するステップ、
（ｃ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子のＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出するステップ、
を含み、ＤＱＡ１＊０１０１アリル及びＤＲＢ３＊０７０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有することを示すものである、上記方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）及び（ｃ）が、ポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法（ＰＣＲ−ＳＢＴ）により行われる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子における配列番号１４に示される塩基配列を有するＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出すること；ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子における配列番号１に示される塩基配列を有するＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出すること；ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ２遺伝子における配列番号２２に示される塩基配列を有するＤＱＡ２＊２２０３１アリルを検出すること；及びウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ３遺伝子の存在を検出することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
【請求項１３】
被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法であって、
（ａ）被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製するステップ、
（ｂ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子のＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出するステップ、
（ｃ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出するステップ、
（ｄ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ２遺伝子のＤＱＡ２＊２２０３１アリルを検出するステップ、
（ｅ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ３遺伝子の存在を検出するステップ、
を含み、ＤＲＢ３＊０７０１アリル、ＤＱＡ１＊０１０１アリル及びＤＱＡ２＊２２０３１アリルが存在し、ＤＱＡ３遺伝子が存在しないハプロタイプの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有することを示すものである、上記方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を用いてウシ白血病発症に対する抵抗性を有すると判定されたウシを用いてウシを作出することを特徴とする、ウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有するウシの作出方法。
【請求項１５】
ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段を含むことを特徴とする、ウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定するためのキット。
【請求項１６】
ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段、及びウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子のＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出する手段を含むことを特徴とする、ウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ白血病発症に対する抵抗性の判定方法、並びにそのためのキットに関する。また本発明は、ウシ白血病発症に対する抵抗性を有するウシの作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）に最も近縁なレトロウイルスであり、長い潜伏期間を経てＢ細胞の悪性腫瘍である地方病性ウシ白血病（ＥＢＬ）を引き起こす。ＢＬＶ感染牛は、未発症健康、持続性リンパ球増多症（ＰＬ）、さらに長い潜伏期の後白血病を発症するという、３つの病態を示す。そして、その病態には、ＨＴＬＶ−１と同様に疾患感受性の個体差が存在する。本発明者らは以前、疾患感受性の原因の１つがウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＲ分子の多型性にあることを示している（特許文献１及び２）。
【０００３】
一方、ＢｏＬＡ遺伝子領域は、第２３染色体上に位置し、ヒト、マウスと相同性の高い、クラスＩ、クラスＩＩ及びクラスＩＩＩ遺伝子を含んでいる。その中でも、クラスＩＩｂ亜領域にはＤＲとＤＱの各遺伝子亜領域がマップされている。ＤＱ遺伝子領域には現在までにＤＱＡとＤＱＢ遺伝子が各５個ずつ同定されている。ＤＱＡとＤＱＢ遺伝子は、ハプロタイプによって数や構成が異なっていて、一つあるいは二つのＤＱ分子を形成し、弱いながらも抗原提示能を誘導すると考えられる（非特許文献１〜４参照）。本発明者らは、このようなＢｏＬＡ−ＤＱＡ遺伝子のアリルを効率よく決定する方法を開発している（特許文献３）。
【０００４】
当該技術分野では、より効率的にかつ確実にウシ白血病ウイルスに対する抵抗性を判定する方法が望まれている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−３０１５１８号公報
【特許文献２】特開２００１−２３８６７９号公報
【特許文献３】特願２００４−１０９３８５号（平成１６年４月１日出願）
【非特許文献１】Schneider S., Roessli D.,及びExcoffier L.，A software for population genetics data analysis,  rlequin，Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland，2000年
【非特許文献２】Aida Y.，Characterization and Expression of Bovine MHC Class II Genes，Bulletin de la Societe Franco-Japonaise des Sciences Veterinaires，第6巻，p.17-24，1995年
【非特許文献３】Burke M.G., Stone R.T., 及びMuggli-Cockett N.E.，Nucleotide-sequence and northern analysis of a bovine major histocompatibility class II DR-beta-like cDNA，Animal genetics，第22巻，p.343-352，1991年
【非特許文献４】Fraser D.C., Craigmile S., Campbell J.D.M., Oliver R.A., Brown D.J., Russell G.C., Spooner R.L., 及びGlass E.J.，Functional expression of a cattle MHC class II DR-like antigen on mouse L-cells，Immunogenetics，第43巻，p.296-303，1996年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ウシ白血病に対する抵抗性に関連するアリルを見出し、かかる抵抗性を判定する方法及び手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行い、ウシ白血病ウイルスに感染した健康ウシと白血病発症ウシとを用いてＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＢｏＬＡ−ＤＱＡ２におけるアリルを検出したところ、ＤＱＡ１＊０１０１アリルが健康ウシ群において有意に高頻度に存在するという知見を得た。また本発明者は、ＤＱＡ１＊０１０１アリルと、ＢｏＬＡ−ＤＲＢ３におけるＤＲＢ３＊０７０１アリルの両方を有するウシはウシ白血病ウイルスに対する抵抗性が特に高いという知見を得、これらの知見から本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１４）である。
（１）被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖の７５番目のアミノ酸がバリンであるか否かを判定することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
【０００９】
（２）被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子における配列番号１に示される塩基配列を有するＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
【００１０】
（３）被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法であって、
（ａ）被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製するステップ、
（ｂ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出するステップ、
を含み、ＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有することを示すものである、上記方法。
上記方法において、ステップ（ｂ）は、例えばポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法（ＰＣＲ−ＳＢＴ）により行うことができる。具体的には、ステップ（ｂ）は、（ｂ１）配列番号３に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、又は（ｂ２）配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、あるいは（ｂ１）及び（ｂ２）の両方のステップを含むものである。また、ステップ（ｂ）が、（ｂ３）得られた増幅産物の塩基配列を決定するステップ、をさらに含んでもよい。
【００１１】
（４）被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖の７５番目のアミノ酸がバリンであるか否か、並びにウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖の７４番目、７７番目及び７８番目のアミノ酸がそれぞれグルタミン酸、アルギニン及びバリンであるか否かを判定することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
【００１２】
（５）被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子における配列番号１に示される塩基配列を有するＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出すること、並びにウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖の７４番目、７７番目及び７８番目のアミノ酸がそれぞれグルタミン酸、アルギニン及びバリンであるか否かを判定することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
【００１３】
（６）被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子における配列番号１に示される塩基配列を有するＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出すること、及びウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子における配列番号１４に示される塩基配列を有するＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
【００１４】
（７）被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法であって、
（ａ）被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製するステップ、
（ｂ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出するステップ、
（ｃ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子のＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出するステップ、
を含み、ＤＱＡ１＊０１０１アリル及びＤＲＢ３＊０７０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有することを示すものである、上記方法。
上記方法において、ステップ（ｂ）及び（ｃ）は、ポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法（ＰＣＲ−ＳＢＴ）により行うことができる。
【００１５】
（８）被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子における配列番号１４に示される塩基配列を有するＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出すること；ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子における配列番号１に示される塩基配列を有するＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出すること；ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ２遺伝子における配列番号２２に示される塩基配列を有するＤＱＡ２＊２２０３１アリルを検出すること；及びウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ３遺伝子の存在を検出することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
【００１６】
（９）被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法であって、
（ａ）被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製するステップ、
（ｂ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子のＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出するステップ、
（ｃ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出するステップ、
（ｄ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ２遺伝子のＤＱＡ２＊２２０３１アリルを検出するステップ、
（ｅ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ３遺伝子の存在を検出するステップ、
を含み、ＤＲＢ３＊０７０１アリル、ＤＱＡ１＊０１０１アリル及びＤＱＡ２＊２２０３１アリルが存在し、ＤＱＡ３遺伝子が存在しないハプロタイプの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有することを示すものである、上記方法。
【００１７】
（１０）被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子における配列番号２３に示される塩基配列を有するＤＲＢ３＊１４０１２アリルを検出すること；ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子における配列番号２５に示される塩基配列を有するＤＱＡ１＊１００１２アリルを検出すること；ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ２遺伝子における配列番号２７に示される塩基配列を有するＤＱＡ２＊２２０２１アリルを検出すること；及びウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ３遺伝子の存在を検出することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
【００１８】
（１１）被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法であって、
（ａ）被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製するステップ、
（ｂ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子のＤＲＢ３＊１４０１２アリルを検出するステップ、
（ｃ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊１００１２アリルを検出するステップ、
（ｄ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ２遺伝子のＤＱＡ２＊２２０２１アリルを検出するステップ、
（ｅ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ３遺伝子の存在を検出するステップ、
を含み、ＤＲＢ３＊１４０１２アリル、ＤＱＡ１＊１００１２アリル及びＤＱＡ２＊２２０２１アリルが存在し、ＤＱＡ３遺伝子が存在しないハプロタイプの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有することを示すものである、上記方法。
【００１９】
（１２）上記（１）〜（１１）のいずれかの方法を用いて白血病発症抵抗性を有すると判定されたウシを用いてウシを作出することを特徴とする、ウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有するウシの作出方法。
（１３）ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段を含むことを特徴とする、ウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定するためのキット。
（１４）ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段、及びウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子のＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出する手段を含むことを特徴とする、ウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定するためのキット。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）によるウシ白血病発症に対する抵抗性の判定方法が提供される。該方法は、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖におけるＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在、又はウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖におけるＤＱＡ１＊０１０１アリル及びＤＲ分子β鎖におけるＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出することにより、あるいは特定のアリルからなるハプロタイプを検出することにより、被験ウシの発症抵抗性を簡便かつ迅速に判定することができるため、ウシの白血病発症機構の研究、ウシ白血病発症に対する抵抗性を有するウシの作出などに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ウシ白血病発症に対する抵抗性の判定
本発明は、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法である。本発明の方法は、ウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＱ分子のＤＱＡ１＊０１０１アリルをホモ又はヘテロに有するウシ個体がＢＬＶ感染によるウシ白血病発症に対して抵抗性を示すという知見に基づくものである。
【００２２】
ウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）とは、移植片や細菌、ウイルスなどの外来抗原ペプチドと結合してＴ細胞に提示する膜タンパク質であり、一般には主要組織適合性遺伝子複合体（Major histocompatibity complex；ＭＨＣ）分子と呼ばれるものである。ＢｏＬＡには、多くのアリルが存在することが知られており、これらの情報については、例えばＢｏＬＡ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｗｅｂ ｓｉｔｅ（インターネットサイトhttp://www.projects.roslin.ac.uk/bola/bolahome.html）において公開されている。
【００２３】
ウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＱ分子のα鎖は、ＤＱＡ１〜５によりコードされている。ＤＱ分子のα鎖のアミノ酸配列を配列番号１２に、α鎖をコードする塩基配列を配列番号１３に示す（それぞれ、アクセッション番号ＢＡＡ０９０４５．１及びＤ５０４５４として登録されている）。本明細書において記載する「ＤＱＡ１＊０１０１アリル」とは、このＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１のアリルの１種であり、配列番号１に示される塩基配列及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものである。ここで、このＤＱＡ１＊０１０１アリルは、図１に示す他のアリルのアミノ酸配列との比較により、ＢｏＬＡ−ＤＱ分子のα鎖の７５番目のアミノ酸がバリン（Ｖ）であり（配列番号２における９８番目のアミノ酸）、他のアリルではイソロイシン（Ｉ）である（配列番号１２）という相違を示す。ここで、「７５番目のアミノ酸」とは、配列番号１２において、最初の２３アミノ酸からなるシグナルペプチドを除き、成熟タンパク質の１番目のアミノ酸から数えて７５番目のアミノ酸のことをいう。また、塩基配列において、ＤＱＡ１＊０１０１アリルでは、配列番号１における３０８〜３１０番目の塩基がＧＴＣであるのに対し、他のアリルでは配列番号１３における２９２〜２９４番目の塩基がＡＴＣである点で相違する。この相違点に基づいて、ＨＬＡ−ＤＱ８の３次元立体構造を参照にα鎖の７５番目のアミノ酸残基の機能を予測したところ、この７５番目のアミノ酸残基は抗原ペプチドを直接認識するアミノ酸残基である可能性が示唆された（図２）。
【００２４】
従って、本発明においては、被験ウシにおいてウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖の７５番目のアミノ酸がバリンであるか否かを判定する。好ましくは、被験ウシにおいてＢｏＬＡ−ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子におけるＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する。そして、その判定結果（検出結果）に基づいて該被験ウシがウシ白血病発症に対する抵抗性を示すか否かを判定する。ここで、本明細書においては、「ＤＱＡ１＊０１０１アリルの検出」とは、被験ウシが配列番号１に示される塩基配列を有するＤＱＡ１を有するか否か、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＤＱ分子α鎖を発現するか否かを判定すること、並びにウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖の７５番目のアミノ酸がバリンであるか否か又は該ＤＱ分子α鎖をコードする遺伝子の３０８〜３１０番目（配列番号１）若しくは２９２〜２９４番目（配列番号１３）の塩基がＧＴＣであるか否かを判定することも意味する。また「発症に対する抵抗性」とは、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）感染によるウシ白血病への罹りにくさ（抵抗性）を意味し、「抵抗性を有する」とは、他の被験ウシと比較して、ウシ白血病を発症する確率が低いことを意味する。
【００２５】
本発明において、被験ウシにおけるＤＱＡ１＊０１０１アリルの検出は、遺伝子レベル又はタンパク質レベルで行うことができる。例えば、被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製し、塩基配列に基づいて、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することができる。また、被験ウシからウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＱ分子タンパク質を調製し、例えば抗体などを用いてＤＱ分子におけるＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することができる。これらの方法について、以下簡単に説明する。
【００２６】
（１）被験ウシからのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ調製
本発明の方法では、ウシ白血病発症に対する抵抗性を判定しようとするウシ（被験ウシ）からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡの調製は、公知の方法、例えばフェノール／クロロホルム法、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法などにより調製することができる。また、ｍＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばグアニジンイソチオシアネート法などにより調製することができる。ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製するためのキットも市販されており、ゲノムＤＮＡの調製用には例えばWizard Genomic DNA Purification Kit（Promega）など、ｍＲＮＡの調製用には例えばNucleoTrap(登録商標)mRNA Kit（Clontech）などを使用することができる。
【００２７】
また、後述するアリルの検出のため、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成してもよい。ｃＤＮＡの合成方法は当技術分野で公知であり、例えば、ＲＮＡから、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりランダムプライマー又はポリＴプライマーを使用してｃＤＮＡを合成することができる。
【００２８】
ＤＮＡ又はＲＮＡを調製する供与源もまた特に限定されるものではなく、細胞又は組織、血液、唾液、鼻腔粘膜からこすりとった細胞などを用いることができる。
【００２９】
被験ウシは、反芻類に属するウシ（Bos Taurus、Bos indicus）であればその種は特に限定されるものではない。例えば、エアーシア（Ayrshire）、ブリティッシュフリージアン（British Friesian）、デンマーク黒肢（Danish Black Pied）、デンマーク赤毛（Danish Red）、ヘレフォード（Hereford）、ホルスタインフリージアン（Holstein Friesian）、ジャージー（Jersey）、リムーザン（Limousin）、黒毛和種、日本短角などが挙げられる。
【００３０】
（２）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるアリルの検出
ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるＤＱＡ１＊０１０１アリルの検出は、例えば、当技術分野で公知の遺伝子多型検出手段により行うことができ、限定するものではないが、直接配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用した方法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用した方法、ハイブリダイゼーション法を利用した方法、プライマー伸長反応を利用する方法、質量分光法などが挙げられる。これらの方法はいずれも当業者に周知である。以下にその概要を説明する。
【００３１】
（２−１）直接配列決定法
ＤＱＡ１＊０１０１アリルは、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを用いて直接配列決定法により検出することができる。直接配列決定法においては、最初に、被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを調製し、検出対象となるＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域をベクターにクローニングし、宿主細胞（例えば細菌）において増幅させる。あるいは、検出対象のＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域内のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することも可能である。増幅後、検出対象領域内のＤＮＡを配列決定する。配列決定法としては、限定されるものではないが、手動式配列決定法又は自動配列決定法が挙げられる。手動配列決定法としては、例えば放射性マーカーヌクレオチドを使用する方法などが挙げられ、自動配列決定法としては、ダイターミネーターを使用する方法などが挙げられる。配列決定の結果に基づいて、被験ウシがＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するか否かを判定する。
【００３２】
本発明においては、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域を増幅した後、得られた増幅産物の塩基配列決定を行う、ポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法（ＰＣＲ−ＳＢＴ）が好ましい。ＰＣＲ−ＳＢＴ法によりＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する方法について、以下詳述する。
【００３３】
最初に、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを増幅可能なプライマーを用いて、調製したゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応を行い、第２エクソンの塩基配列を有する核酸断片を増幅する。ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを増幅可能なプライマーは、第２エクソンの全領域を増幅できることが好ましい。従って、第２エクソンの両側に位置するイントロンの配列に基づいてプライマーを設計することができる。あるいは、イントロンとエクソンとの境界領域の配列に基づいてプライマーを設計することもできる。
【００３４】
プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本発明において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。例えば、プライマーとしての機能を有する長さとしては、１０塩基以上が好ましく、さらに好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。また設計の際には、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型となるＤＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができる。設計されたプライマーは、公知のオリゴヌクレオチド合成手法により化学合成することができるが、通常は、市販の化学合成装置を使用して合成される。
【００３５】
本発明において使用可能な、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを増幅することができるプライマーセットとしては、限定するものではないが、以下の（ａ）及び（ｂ）が挙げられる：
（ａ）配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー
5’-CAC AAA TGA AGC CCA CAA TG-3’（配列番号３）
5’-CCC TAG GGA AAA GGG AGT GA-3’（配列番号４）
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー
5’-GCC CAC AAT GTT TGA TAG TC-3’（配列番号５）
5’-GGG RAC ACA TAC TGT TGG T-3’（配列番号６）
（配列中、ＲはＡ又はＧを表す）
【００３６】
増幅反応は、特に限定されないが、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行う。
また、増幅の特異性を高めるために、２組以上のプライマーを用いて２回以上増幅反応を行うことが好ましい。具体的には、最初に、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅する。次いで、増幅された核酸断片を鋳型として、さらにＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅する。このように２回以上増幅反応を行う場合には、各増幅反応で使用するプライマーを、同じ位置に設計してもよいし、あるいは、最初の増幅におけるプライマーの位置よりも内側に設計することができる。
【００３７】
ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１のＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出するために２回増幅反応を行う場合のプライマーセットの例としては、限定するものではないが、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応において以下の（ａ）のプライマーセットを用い、増幅された核酸断片を鋳型とした増幅反応において以下の（ｂ）のプライマーセットを用いることができる：
（ａ）配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー
上述のようにして、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を特異的に増幅することができる。
【００３８】
続いて、増幅した核酸断片の塩基配列を決定し、決定した塩基配列と、既知のＤＱＡ１＊０１０１アリルの塩基配列（配列番号１）とを比較する。これにより、被験ウシのＢｏＬＡ−ＤＱＡ１がＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するかを決定することができる。
【００３９】
配列決定法は当技術分野で周知であり、任意の方法を使用することができる。例えば限定されるものではないが、増幅した核酸断片をベクターにクローニングすることなく配列を決定することができるダイレクト・シーケンス法が挙げられる。かかる配列決定法は、市販のキット、例えばCEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）、BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ABI310（Applied Biosystems）などを用いて簡便に行うことができる。
【００４０】
ダイレクト・シーケンス法を行う場合には、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを特異的に配列決定することが可能なプライマーを用いることが好ましい。
【００４１】
本発明の方法において、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンの塩基配列を決定するために使用可能なプライマーとしては、限定するものではないが、以下の（ｃ）のプライマーセットが挙げられる：
（ｃ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
5’-ACA ATG TTT GAT AGT CAA TTT C-3’（配列番号７）
5’-GGG RAC ACA TAC TGT TGG TAG-3’（配列番号８）
（配列中、ＲはＡ又はＧを表す）
核酸断片の塩基配列（すなわち第２エクソンの塩基配列）を決定した後、その塩基配列と、ＤＱＡ１＊０１０１アリルの塩基配列（配列番号１）を比較する。
【００４２】
（２−２）ＰＣＲ法
ＤＱＡ１＊０１０１アリルは、ＰＣＲ法を利用して検出することもできる。ＰＣＲは、ＤＱＡ１＊０１０１アリルを有する配列又は他のアリルを有する配列にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを利用して行う。そのＤＱＡ１＊０１０１アリル用及びその他のアリル用の両方のプライマーセットを使用して被験ウシ由来のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを増幅する。ＤＱＡ１＊０１０１アリル用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、被験ウシはＤＱＡ１＊０１０１アリルをホモで有し、ＤＱＡ１＊０１０１アリル用プライマーと他のアリル用プライマーからのＰＣＲ産物が生成された場合には、被験ウシはＤＱＡ１＊０１０１アリルをヘテロで有することになる。他のアリル用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、被験ウシはＤＱＡ１＊０１０１アリルを有しない。
【００４３】
（２−３）ＲＦＬＰ法
ＤＱＡ１＊０１０１アリルは、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism；ＲＦＬＰ）を利用して検出することもできる。まず、検出対象のＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域をＰＣＲで増幅する。続いてこのＰＣＲ産物を、ＤＱＡ１＊０１０１アリルに独特な長さの断片を生じることが知られている制限酵素で切断する。制限酵素により消化されたＰＣＲ産物は、一般的にはゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化する。断片の長さを、分子量マーカー、並びに他のアリル及びＤＱＡ１＊０１０１アリルの対照により生じた断片の長さと比較することによって、被験ウシにおけるＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することができる。
【００４４】
（２−４）ハイブリダイゼーション法
ＤＱＡ１＊０１０１アリルは、ハイブリダイゼーションを利用して検出することもできる。ハイブリダイゼーション法は、被験ウシ由来のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡが、それに対し相補的なＤＮＡ分子（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする能力に基づいて、ＤＱＡ１＊０１０１アリルの有無を決定する方法である。ハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーション法を行うことができる。
【００４５】
プローブが検出対象のＤＱＡ１＊０１０１アリルに対しハイブリダイズしたか否かは、その結合したプローブを可視化することにより直接検出することができる。これは、例えば、ノーザン又はサザンアッセイとして知られている（例えば、Ausabel et al. (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1991)参照）。サザンアッセイの場合にはゲノムＤＮＡを、ノーザンアッセイの場合にはＲＮＡを被験ウシから単離する。続いて、単離したＤＮＡ又はＲＮＡを、一連の制限酵素群で切断する。次に、ＤＮＡ又はＲＮＡを分離し、膜に転写する。この分離操作は、例えばアガロースゲル上で行うことができる。膜への転写は、標識化プローブ、又は検出対象のＤＱＡ１＊０１０１アリルに特異的なプローブを、好適なストリンジェンシー条件下で膜に転写して行う。標識は、例えば放射性ヌクレオチドを導入することにより行うことができる。未結合のプローブを除去した後、標識化プローブを可視化することにより、結合の存在を検出することができ、その結合の有無により、ＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するか否かについて判断しうる。
【００４６】
あるいは、ハイブリダイゼーションはＤＮＡチップを利用して検出することもできる。この方法においては、オリゴヌクレオチドプローブを固相支持体に貼り付ける。このプローブは、ＤＱＡ１＊０１０１アリルに特異的なものとなるように設計する。被験ウシ由来のＤＮＡサンプルをＤＮＡチップと接触させ、ハイブリダイゼーションを検出する。
【００４７】
（２−５）タンパク質レベルでの検出
本発明の方法においては、タンパク質レベルでＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することも可能である。具体的には、ＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するＤＱ分子のα鎖を特異的に認識することができる抗体を用いることにより、ＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することができる。
【００４８】
ＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するＤＱ分子のα鎖を特異的に認識することができる抗体は、配列番号１２に示すアミノ酸配列において、７５番目のアミノ酸残基を含み、かつ少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、好ましくは６〜１０個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として動物の免疫に用いることにより、作製することができる。
【００４９】
抗体の作製方法、及び抗体を用いたＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するＤＱ分子のα鎖の検出方法は、当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。
【００５０】
（３）ウシ白血病発症に対する抵抗性の判定
ＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有する可能性を示すものである。このＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在は、ホモ又はヘテロのいずれでもよい。
【００５１】
２．ＢｏＬＡのＤＲ分子β鎖のアリルを利用したウシ白血病発症に対する抵抗性の判定
さらに本発明のウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法は、ウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＱ分子のＤＱＡ１＊０１０１アリル及びＢｏＬＡのＤＲ分子のＤＲＢ３＊０７０１アリルを有するウシ個体がＢＬＶ感染によるウシ白血病発症に対して高い抵抗性を示すという知見に基づくものである。
【００５２】
ウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＲ分子のβ鎖は、ＤＲＢ３によりコードされている。ＤＲ分子のβ鎖の一部（ＤＲＢ３）のアミノ酸配列を配列番号１７に、β鎖の一部（ＤＲＢ３）をコードする塩基配列を配列番号１６に示す（それぞれ、アクセッション番号ＮＰ＿００１０１２６９８及びＮＭ＿００１０１２６８０として登録されている）。本明細書において記載する「ＤＲＢ３＊０７０１アリル」とは、このＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３のアリルの１種であり、配列番号１４に示される塩基配列及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有するものである（それぞれ、アクセッション番号Ｘ８７６４８及びＣＡＡ６０９８８として登録されている）。なお、ＤＲＢ３＊０７０１アリルの配列（配列番号１４及び１５）は、ＤＲ分子β鎖の一部に相当し、そのため本明細書中でいう「７４番目のアミノ酸」は配列番号１５の７４番目には対応するものではない。ＤＲＢ３＊０７０１アリルは、ＢｏＬＡ−ＤＲ分子のβ鎖の７４番目、７７番目及び７８番目のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）及びバリン（Ｖ）であることを特徴とする（配列番号１５における６６番目、６９番目及び７０番目のアミノ酸；配列番号１７における１０３、番目１０６番目及び１０７番目のアミノ酸）。ここで、「７４番目、７７番目及び７８番目のアミノ酸」とは、配列番号１７において、最初の２９アミノ酸からなるシグナルペプチドを除き、成熟タンパク質の１番目のアミノ酸から数えてそれぞれ７４番目、７７番目及び７８番目のアミノ酸のことをいう。
【００５３】
本発明者は、上述したＤＱＡ１遺伝子におけるＤＱＡ１＊０１０１アリルとＤＲＢ３遺伝子におけるＤＲＢ３＊０７０１アリルの両方を有するウシが、特にウシ白血病発症に対する抵抗性が高いことを見出した。従って、本発明においては、被験ウシにおいてウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖の７５番目のアミノ酸がバリンであるか否か、並びにウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖の７４番目、７７番目及び７８番目のアミノ酸がそれぞれグルタミン酸、アルギニン及びバリンであるか否かを判定する。好ましくは、被験ウシにおいてＢｏＬＡ−ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子におけるＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出すること、及びウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子におけるＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出することを含む。そして、その判定結果（検出結果）に基づいて該被験ウシがウシ白血病発症に対する抵抗性を示すか否かを判定する。
【００５４】
被験ウシにおけるＤＱＡ１＊０１０１アリルの検出は、上述したように行うことができる。また、被験ウシにおけるＤＲＢ３＊０７０１アリルの検出は、当技術分野で公知の方法、例えば特許文献１（特開２００４−３０１５１８号公報）、特許文献２（特開２００１−２３８６７９号公報）、国際公開第９８／０３６８０号パンフレット、国際公開第９８／３６０９２号パンフレット、特開２０００−６６９８号公報、特開２００１−１７８４９９号公報に記載の方法などを利用して行うことができる。
【００５５】
ＤＱＡ１＊０１０１アリル及びＤＲＢ３＊０７０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有する可能性が高いことを示すものである。このＤＱＡ１＊０１０１アリル及びＤＲＢ３＊０７０１アリルの存在は、ホモ又はヘテロのいずれでもよい。
【００５６】
３．ハプロタイプを利用したウシ白血病発症に対する抵抗性の判定
さらに本発明のウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法は、ウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＲＢ３＊０７０１アリル、ＤＱＡ１＊０１０１アリル及びＤＱＡ２＊２２０３１アリルが存在し、ＤＱＡ３遺伝子が存在しないハプロタイプ、又はＤＲＢ３＊１４０１２アリル、ＤＱＡ１＊１００１２アリル及びＤＱＡ２＊２２０２１アリルが存在し、ＤＱＡ３遺伝子が存在しないハプロタイプを有するウシ個体が、ＢＬＶ感染によるウシ白血病発症に対して高い抵抗性を示すという知見に基づくものである。
【００５７】
本明細書において記載する「ＤＱＡ２＊２２０３１アリル」とは、ウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ２遺伝子のアリルの１種であり、配列番号２２に示される塩基配列を有するものである（アクセッション番号Ｚ７９５１７として登録されている）。また、本明細書において記載する「ＤＱＡ３遺伝子」とは、ＢｏＬＡのＤＱ分子α鎖をコードするものであり、ＤＱＡ３遺伝子の存在はＤＱＡ＊２７０１１アリル、ＤＱＡ＊２７０１２アリル、ＤＱＡ＊２７０２アリル、ＤＱＡ＊２３０１アリル、ＤＱＡ＊２６０１アリル、ＤＱＡ＊２６０２アリル、及びＤＱＡ＊２６０３アリル等のいずれか１つ以上が検出されることによって表される（Keith et al., Immuno. genetics 1997, 46:237-244参照）。ここで、ＤＱＡ＊２７０１１アリルは、配列番号２９に示される塩基配列を有するものである（アクセッション番号Ｚ７９５２０として登録されている）。
【００５８】
本発明者は、上述したＤＲＢ３遺伝子におけるＤＲＢ３＊０７０１アリル、ＤＱＡ１遺伝子におけるＤＱＡ１＊０１０１アリル、ＤＱＡ２遺伝子におけるＤＱＡ２＊２２０３１アリルを有し、ＤＱＡ３遺伝子を有しないウシが、特にウシ白血病発症に対する抵抗性が高いことを見出した。従って、本発明においては、被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子におけるＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出すること；ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子におけるＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出すること；ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ２遺伝子におけるＤＱＡ２＊２２０３１アリルを検出すること；及びウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ３遺伝子の存在を検出することを含む。そして、その判定結果（検出結果）に基づいて該被験ウシがウシ白血病発症に対する抵抗性を示すか否かを判定する。ここで、ＤＱＡ３遺伝子の存在は、ＤＱＡ＊２７０１１アリル、ＤＱＡ＊２７０１２アリル、ＤＱＡ＊２７０２アリル、ＤＱＡ＊２３０１アリル、ＤＱＡ＊２６０１アリル、ＤＱＡ＊２６０２アリル、及びＤＱＡ＊２６０３アリル等のいずれか１つ以上が検出されることによって表される（Keith et al., Immuno. genetics 1997, 46:237-244参照）。
【００５９】
また、本明細書において記載する「ＤＲＢ３＊１４０１２アリル」とは、ウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子のアリルの１種であり、配列番号２３に示される塩基配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するものである（それぞれアクセッション番号Ｚ８２０３５及びＣＡＢ５２１８７．１として登録されている）。また、本明細書において記載する「ＤＱＡ１＊１００１２アリル」とは、ＢｏＬＡのＤＱ分子α鎖をコードするものであり、配列番号２５に示される塩基配列及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有するものである（それぞれアクセッション番号Ｕ８０８８１及びＡＡＢ６２０２６．１として登録されている）。また本明細書において記載する「ＤＱＡ２＊２２０２１」とは、ＢｏＬＡのＤＱ分子α鎖をコードするものであり、配列番号２７に示される塩基配列及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するものである（それぞれアクセッション番号Ｄ５００４５及びＢＡＡ０８７６５．１として登録されている）。
【００６０】
本発明者は、上述したＤＲＢ３遺伝子におけるＤＲＢ３＊１４０１２アリル、ＤＱＡ１遺伝子におけるＤＱＡ１＊１００１２アリル、ＤＱＡ２遺伝子におけるＤＱＡ２＊２２０２１アリルを有し、ＤＱＡ３遺伝子を有しないウシが、特にウシ白血病発症に対する抵抗性が高いことを見出した。従って、本発明においては、被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子における配列番号２３に示される塩基配列を有するＤＲＢ３＊１４０１２アリルを検出すること；ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子における配列番号２５に示される塩基配列を有するＤＱＡ１＊１００１２アリルを検出すること；ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ２遺伝子における配列番号２７に示される塩基配列を有するＤＱＡ２＊２２０２１アリルを検出すること；及びウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ３遺伝子の存在を検出することを含む。そして、その判定結果（検出結果）に基づいて該被験ウシがウシ白血病発症に対する抵抗性を示すか否かを判定する。
【００６１】
被験ウシにおけるＤＲＢ３遺伝子のアリル（ＤＲＢ３＊０７０１又はＤＲＢ３＊１４０１２）の検出、並びにＤＱＡ１遺伝子のアリル（ＤＱＡ１＊０１０１又はＤＱＡ１＊１００１２）の検出は、上述したように行うことができる。また、被験ウシにおけるＤＱＡ２遺伝子のアリル（ＤＱＡ２＊２２０３１又はＤＱＡ２＊２２０２１）の検出、及びＤＱＡ３遺伝子（ＤＱＡ＊２７０１１アリル、ＤＱＡ＊２７０１２アリル、ＤＱＡ＊２７０２アリル、ＤＱＡ＊２３０１アリル、ＤＱＡ＊２６０１アリル、ＤＱＡ＊２６０２アリル、及びＤＱＡ＊２６０３アリル等）は、ＤＱＡ２遺伝子を増幅することができるプライマーセットを用いてＤＱＡ２遺伝子の全体又は一部を増幅し、その増幅産物の配列を決定し、特定のアリルの配列を有するか否か確認することにより行うことができる。また、本発明において使用可能な、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２の第２エクソンを増幅することができるプライマーセットとして、限定するものではないが、以下の（ｄ）〜（ｇ）が挙げられる：
（ｄ）配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー
5’-TTT TCC ACC TTY CTG CTC CT-3’（配列番号９）
5’-CAC TTA CCA TTG ATA ACA GG-3’（配列番号１０）
（配列中、ＹはＣ又はＴを表す）
（ｅ）配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマー
5’-TTT TCC ACC TTY CTG CTC CT-3’（配列番号９）
5’-TTG ATA ACA GGG GTA AAG TTG GA-3’（配列番号１１）
（配列中、ＹはＣ又はＴを表す）
（ｆ）配列番号３０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー
5’-TTT GCT TAG AGA CAT TGT GC-3’（配列番号３０）
5’-CAC TTA CCA TTG ATA ACA GG-3’（配列番号１０）
（ｇ）配列番号３１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー
5’-TTT TCC ACC TTY YTG CTC CT-3’（配列番号３１）
5’-CAC TTA CCA TTG ATA ACA GG-3’（配列番号１０）
（配列中、ＹはＣ又はＴを表す）。
【００６２】
また本発明の方法において、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンの塩基配列を決定するために使用可能なプライマーとしては、限定するものではないが、上記の（ｅ）又は（ｇ）のプライマーセットが挙げられる。
【００６３】
ＤＲＢ３＊０７０１アリル、ＤＱＡ１＊０１０１アリル及びＤＱＡ２＊２２０３１アリルが存在し、ＤＱＡ３遺伝子が存在しないハプロタイプ、又はＤＲＢ３＊１４０１２アリル、ＤＱＡ１＊１００１２アリル及びＤＱＡ２＊２２０２１アリルが存在し、ＤＱＡ３遺伝子が存在しないハプロタイプは、被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有する可能性が高いことを示すものである。このハプロタイプにおけるアリルの存在は、ホモ又はヘテロのいずれでもよい。
【００６４】
４．キット
本発明のキットは、ウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定するために用いることができ、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖におけるＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段を含むものである。
【００６５】
ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖におけるＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段としては、例えば限定されるものではないが、ＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域を増幅することができるプライマー、ＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域を配列決定することができるプライマー、ＤＱＡ１＊０１０１アリルに特異的に結合することができるプライマー又はプローブ、ＤＱＡ１＊０１０１アリルを含むＢｏＬＡ−ＤＱ分子に対して特異的に結合することができる抗体、などが含まれる。
【００６６】
ＰＣＲ−ＳＢＴ法によりＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する場合には、本発明のキットは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを増幅するためのプライマーセットとして、以下の（ａ）又は（ｂ）の少なくとも１つのプライマーセットを含むことが好ましく、また、（ａ）及び（ｂ）の両方のプライマーセットを含むことがさらに好ましい：
（ａ）配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー
さらに本発明のキットは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを配列決定するためのプライマーセットとして、以下の（ｃ）のプライマーセットを含むことが好ましい。
（ｃ）配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマー
また本発明のキットは、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段、及びウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子のＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出する手段を含むものであってもよい。
【００６７】
ＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出する手段としては、例えば限定されるものではないが、ＤＲＢ３＊０７０１アリルを含む領域を増幅することができるプライマー、ＤＲＢ３＊０７０１アリルを含む領域を配列決定することができるプライマー、ＤＲＢ３＊０７０１アリルに特異的に結合することができるプライマー又はプローブ、ＤＲＢ３＊０７０１アリルを含むＢｏＬＡ−ＤＲ分子に対して特異的に結合することができる抗体、などが含まれる。
【００６８】
さらに本発明のキットは、ウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子のＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出する手段、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ２遺伝子のＤＱＡ２＊２２０３１アリルを検出する手段、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ３遺伝子を検出する手段を含むものであってよい。かかる手段を含むキットにより、ウシ主要組織適合抗原におけるウシ白血病発症に対する抵抗性に関連するハプロタイプを判定することができる。
【００６９】
またさらに本発明のキットは、ウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖をコードするＤＲＢ３遺伝子のＤＲＢ３＊１４０１２アリルを検出する手段、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊１００１２アリルを検出する手段、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ２遺伝子のＤＱＡ２＊２２０２１アリルを検出する手段、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ３遺伝子を検出する手段を含むものであってよい。かかる手段を含むキットにより、ウシ主要組織適合抗原におけるウシ白血病発症に対する抵抗性に関連するハプロタイプを判定することができる。
【００７０】
上記アリルを検出する手段としては、例えば限定されるものではないが、上記アリルを含む領域を増幅することができるプライマー、上記アリルを含む領域を配列決定することができるプライマー、上記アリルに特異的に結合することができるプライマー又はプローブ、上記アリルを含むＢｏＬＡ−ＤＲ分子に対して特異的に結合することができる抗体、などが含まれる（例えばDa Mota, AF et al., Eur. J. Immunogenet. 2004, 31, 31-35；Takeshima et al., Immunogenet. 2001, 53, 74-81；van Eijk et al., Anim. genet. 1992, 23, 483-496などを参照）。
【００７１】
本発明のキットは、特定のアリルを検出する手段のほか、さらに、反応液を構成するバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類（ポリメラーゼなど）などを含んでもよい。
【００７２】
５．ウシ白血病発症に対する抵抗性を有するウシの作出
上述のように、ＤＱＡ１＊０１０１アリル、又はＤＱＡ１＊０１０１アリルとＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出することにより、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）によるウシ白血病発症の抵抗性を判定することができるため、この判定結果を利用して、ウシ白血病発症の抵抗性を有するウシを作出することができる。また、ＤＲＢ３＊０７０１アリル、ＤＱＡ１＊０１０１アリル及びＤＱＡ２＊２２０３１アリルが存在し、ＤＱＡ３遺伝子が存在しないハプロタイプ、又はＤＲＢ３＊１４０１２アリル、ＤＱＡ１＊１００１２アリル及びＤＱＡ２＊２２０２１アリルが存在し、ＤＱＡ３遺伝子が存在しないハプロタイプを検出することにより、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）によるウシ白血病発症の抵抗性を判定することができるため、この判定結果を利用して、ウシ白血病発症の抵抗性を有するウシを作出することができる。
【００７３】
例えば、ウシの受精卵においてＤＱＡ１＊０１０１アリル、又はＤＱＡ１＊０１０１アリルとＤＲＢ３＊０７０１アリルを検出し、ＤＱＡ１＊０１０１アリル、又はＤＱＡ１＊０１０１アリルとＤＲＢ３＊０７０１アリルを有する受精卵を選択して雌ウシの子宮に移植することによって、ウシ白血病発症の抵抗性を有するウシを作出することができる。あるいは、ＤＲＢ３＊０７０１アリル、ＤＱＡ１＊０１０１アリル及びＤＱＡ２＊２２０３１アリルを有し、ＤＱＡ３遺伝子を有しない受精卵、又はＤＲＢ３＊１４０１２アリル、ＤＱＡ１＊１００１２アリル及びＤＱＡ２＊２２０２１アリルを有し、ＤＱＡ３遺伝子を有しない受精卵を選択して雌ウシの子宮に移植することによって、ウシ白血病発症の抵抗性を有するウシを作出することができる。
【００７４】
また、ウシ白血病発症の抵抗性を有すると判定された雄ウシ及び雌ウシ由来の精子及び卵子を用いることによって、ウシ白血病発症の抵抗性を有するウシを作出することも可能である。
【００７５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７６】
本実施例においては、国際ＢｏＬＡワークショップにてタイピングされた標準ウシのＤＮＡ５２サンプル（ＷＫシリーズ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。
【００７７】
全血からのゲノムＤＮＡの抽出は、Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega）を使用した。３００μｌの血液に対し、９００μｌのCell Lysis Solutionを加え転倒攪拌し、１０分間室温で静置した。２０，４００×ｇ、４℃で２０秒間遠心後上清を除き、沈殿を３００μｌのNuclei Lysis Solutionで溶解した。１．５μｌの分解酵素（RNase A Solution）を加え３７℃で１時間反応した。１００μｌのProtein Precipitation Solutionを加え良く混合した後、２０，４００×ｇ、室温で３分間遠心した。３００μｌのイソプロパノールの入ったチューブに上清を加え混合した後、２０，４００×ｇ、４℃で１分間遠心しＤＮＡの沈殿を得た。７０％エタノール３００μｌで洗浄し、乾燥させた後、蒸留水５０ｍｌを加え４℃で一晩かけて溶解した。ＤＮＡの濃度は分光光度計により２６０ｎｍでの吸収量を測定することにより算出した。
【実施例２】
【００７８】
実施例１で調製した５２頭由来のＤＮＡサンプルについて、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１のアリルを決定した。
（１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１  １ｓｔＰＣＲ
１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び１．２５ユニットのｒＴａｑ  ＤＮＡ伸長酵素（TOYOBO）、１μｌのゲノムを含む２５μｌの1×rTaq緩衝液を９４℃で２分間の変性処理後、９４℃で２０秒；６０℃で２０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして１５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンをＰＣＲ法により特異的に増幅できるＤＱＡ１ｉｎｔＬ２及びＤＱＡ１−６７７Ｒを用いた（配列番号３及び４）。
【００７９】
（２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１  ２ｎｄＰＣＲ
１ｓｔＰＣＲ産物のうち１μｌを１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び０．５ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素（Applied Biosystems）を含む２４μｌのGene AmpR Gold緩衝液を９５℃で１０分間の変性処理後、９４℃で２０秒；６０℃で２０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できるＤＱＡｉｎｔＬ３及びＤＱＡ１ｅｘＲＥＶｖｅｒ２．１を用いた（配列番号５及び６）。これによって、３５５ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。
【００８０】
（３）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーとしてＤＱＡｉｎｔＬ３．１及びＤＱＡ１ｅｘ２ＲＥＶｖｅｒ１．１を用いた（配列番号７及び８）。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９５℃で２０秒；５０℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用してアリルの塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、アリルを決定した。
【００８１】
その結果、全てのサンプルにおいてＤＱＡ１の増幅が確認できた。また、図３に示すようなアリルが検出された。
【実施例３】
【００８２】
実施例１で調製した５２頭由来のＤＮＡサンプルについて、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２のアリルを決定した。
（１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  １ｓｔＰＣＲ
１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び０．５ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素（Applied Biosystems）、１μｌのゲノムを含む２５μｌのGene AmpR Gold緩衝液を９５℃で１０分間の変性処理後、９５℃で１分間；５５℃で３０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして１５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２第２エクソンをＰＣＲ法により特異的に増幅できるＤＱＡ２ｉｎｔＬ０６及びＱＡ００６を用いた（配列番号９及び１０）。
【００８３】
（２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ２  ２ｎｄＰＣＲ
１ｓｔＰＣＲ産物のうち１μｌを同条件の試薬２４μｌに混和し、９５℃で１０分間の変性処理後、９５℃で１分間；６３℃で３０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして３５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できるＤＱＡ２ｉｎｔＬ０６及びＤＱＡ２ｅｘｏｎ２＜−１を用いた（配列番号９及び１１）。これによって、２８３ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。
【００８４】
（３）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーとしてＤＱＡ２ｉｎｔＬ０６及びＤＱＡ２ｅｘｏｎ２＜−１を用いた（配列番号９及び１１）。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９５℃で２０秒；５０℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用してアリルの塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、アリルを決定した。
【００８５】
その結果、５２サンプル中４１サンプルにＤＱＡ２の増幅が認められた。また、図３に示すようなアリルが検出された。
【実施例４】
【００８６】
実施例１で調製した５２頭由来のＤＮＡサンプルについて、公知の方法（特許文献１（特開２００４−３０１５１８号公報）、国際公開第９８／０３６８０号パンフレット、国際公開第９８／３６０９２号パンフレット、特開２０００−８６６９８号公報、特開２００１−１７８４９９号公報、及び特開２００１−２３８６７９号公報）に従ってＢｏＬＡ−ＤＲＢ３のアリルを決定した。その結果、図３に示すようなアリルが検出された。
【実施例５】
【００８７】
本実施例においては、ウシが有するアリルの比較を行った。実施例２及び３の結果、ウシ５２サンプルのアリルの検出に成功し、ＤＱＡ１の既知アリル３１種類のうち１４種類が、ＤＱＡ２の既知アリル１３種類のうち７種類が検出された（図４）。また、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）感染健康ウシ２９頭及び白血病発症ウシ２３頭の合計５２頭のＤＱＡ１及びＤＱＡ２のアリルについて比較した。その結果を図３に示す。ＢＬＶ感染ウシにおいては、ＤＱＡ１＊０１０１を有する個体の頻度が有意に高かった（図３及び４；健康ウシ３７％、発症ウシ０％、ｐ＝０．００１１８５）。
【００８８】
また、実施例４において調べたように、ＢｏＬＡ−ＤＲＢ３に存在する抵抗性アリルＤＲＢ＊０７０１、＊０９０２及び＊１４０１（ＤＲβ鎖の７１番、７７番及び７８番にＥＲＶのアミノ酸を有する、特許文献１）も含めて解析した結果（図３）、ＤＲＢに存在する抵抗性アリル（ＤＲＢ＊０７０１、＊０９０２及び＊１４０１）又はＤＱＡに存在する抵抗性アリル（ＤＱＡ１＊０１０１）のいずれか一方、又は両方を有する個体の頻度は、発症ウシが９％であるのに対して健康ウシは６７％であった（ｐ＝０．００００１９）。
【実施例６】
【００８９】
実施例５において、ウシＢｏＬＡにおけるＤＱＡ１＊０１０１アリルがウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）感染による白血病の発症に対して抵抗性を示すことが明らかとなったので、このＤＱＡ１＊０１０１アリルについてさらに解析した。
【００９０】
ＤＱＡ１＊０１０１アリルと他のＤＱＡ１アリルの予想アミノ酸配列を比較したところ、ＤＱＡ１＊０１０１アリルでは７５番目のアミノ酸残基がバリンであるのに対し、他のアリルではイソロイシンであった（図１）。そこで、ＨＬＡ−ＤＱ８の３次元立体構造を参照しながらＤＱα鎖の７５番目のアミノ酸残基の機能を予測した結果を図２に示す。図２において、右図は、ＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するα鎖を示し、左図は他のアリルを有するα鎖を示す。また、上側がＤＱ分子のα１ドメインを、下側がＤＱ分子のβ１ドメインを表す。中央部分の細長い配列は抗原ペプチドを表し、右上はα鎖の７５番目のアミノ酸残基を表す。図２の右図から、この７５番目のアミノ酸残基が抗原ペプチドと直接相互作用していることが示された。従って、このアミノ酸残基は抗原ペプチドを直接認識するアミノ酸残基である可能性が示唆された。
【実施例７】
【００９１】
本実施例においては、ＤＱＡ１＊０１０１アリルとＤＲＢ３＊０７０１アリルの存在と白血病抵抗性との関連性について解析した。
【００９２】
実施例１〜５に記載の方法に従って、５３頭の被験ウシにおけるＤＱＡ１遺伝子に存在するアリルを検出し、また特許文献２（特開２００１−２３８６７９号公報）に記載のＰＣＲ−ＳＢＴ法（具体的には、特許文献２の［００２９］の項に記載のプライマーを使用）に従って、被験ウシにおけるＤＲＢ３遺伝子に存在するアリルを検出した。
【００９３】
次に、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）に感染した白血球の割合（％）を調べるため、リアルタイム定量ＰＣＲ（LightCycler System; Roche Diagnostics）システムを使用した。被験ウシの血液から、LyghtCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I（Roche Diagnostics）、並びにＢＬＶ ＬＴＲの一部の増幅用のプライマー２５６（GAGCTCTCTTGCTCCCGAGAC；配列番号１８）及び４５３（GAAACAAACGCGGGTGCAAGCCAG；配列番号１９）の存在下で、３０ｎｇの総ＤＮＡを増幅した。また、鋳型ＤＮＡの濃度をモニターするためプライマーＰＣ０３（ACACAACTGTGTTCACTAGC；配列番号２０）及びＰＣ０４（CAACTTCATCCACGTTCACC；配列番号２１）を用いて各サンプル中のウシβグロビン遺伝子を増幅した。ＢＬＶに感染した胎仔ヒツジ腎細胞（ＦＬＫ）１細胞当たり６コピーのＢＬＶがintegrateしていることが報告されている（Astier, T. et al., Amn. Rech. Vet. 9:643-649, 1978）ため、６コピーのＦＬＫ−ＢＬＶゲノムを有するＢＬＶ細胞からの総ＤＮＡを、ＦＬＫ細胞由来の総ＤＮＡで希釈し、これらのサンプルをＢＬＶ陽性細胞の割合（％）を計算するための標準として使用した。
【００９４】
５３頭の被験ウシのＢＬＶ感染細胞率（％）とＤＱＡ１遺伝子のアリル及びＤＲＢ３遺伝子のアリルについての分析結果を図５に示す。また、図５に示す結果に基づいて、ＤＲＢ３＊０７０１アリル及びＤＱＡ＊０１０１アリルを有する個体、ＤＲＢ３＊０７０１アリルのみを有する個体、ＤＲＢ３＊０７０１アリルもＤＱＡ＊０１０１アリルも有しない個体について、ＢＬＶ感染細胞率（％）をプロットしたグラフを図６に示す。これらの結果から、ＤＲＢ３＊０７０１アリルとＤＱＡ＊０１０１アリルの両方を有する個体は、ＢＬＶ感染細胞率が有意に低く（ｐ＝０．００１５）、そのため、これらのアリルを有する個体は、ＢＬＶによるウシ白血病発症に対する抵抗性が高いことが示された。
【実施例８】
【００９５】
本実施例においては、ウシ主要組織適合抗原をコードする遺伝子のうち、ＤＲＢ３、ＤＱＡ１、ＤＱＡ２及びＤＱＡ３に存在するアリルの頻度とウシ白血病抵抗性との関連性について調べた。
【００９６】
実施例１〜５に記載の方法に従って、５３頭の被験ウシ（ＢＬＶ感染健康ウシ３０頭及び白血病発症ウシ２３頭）におけるＤＱＡ１及びＤＱＡ２遺伝子に存在するアリルを検出し、また特許文献２（特開２００１−２３８６７９号公報）に記載のＰＣＲ−ＳＢＴ法（具体的には、特許文献２の［００２９］の項に記載のプライマーを使用）に従って、被験ウシにおけるＤＲＢ３遺伝子に存在するアリルを検出した。さらに、実施例２に記載の方法に従って、ＤＱＡ＊２７０１１アリルの有無を調べることにより、ＤＱＡ３遺伝子を検出した。
【００９７】
ＤＲＢ３、ＤＱＡ１、ＤＱＡ２、及びＤＱＡ３の遺伝子に存在するアリルの分析の結果を図７に示す。図７において、ＤＱＡ２の欄に記載されている「＊２７０１１」はＤＱＡ３のアリルを表す。またこの分析結果からウシ白血病の発症に関連していると考えられるハプロタイプを予測した（図８）。
【００９８】
ＢＬＶ感染健康ウシとＢＬＶ感染白血病発症ウシにおける予測したハプロタイプの存在を整理した結果を図９に示す。この分析の結果、ＤＲＢ３＊０７０１−ＤＱＡ１＊０１０１−ＤＱＡ２＊２２０３１−ＤＱＡ３（−）のハプロタイプ、及びＤＲＢ３＊１４０１２−ＤＱＡ１＊１００１２−ＤＱＡ２＊２２０２１−ＤＱＡ３（−）のハプロタイプが、健康ウシでそれぞれ１０％及び１２％で存在するのに対して、白血病発症ウシではいずれも０％で存在し、その存在頻度が有意に減少していた（ｐ＝０．０３５、ｐ＝０．０１８）。ここでＤＱＡ３遺伝子についての（−）は、ＤＱＡ３遺伝子が存在しないことを表す。
【００９９】
続いて、実施例６に記載のように、新たにＢＬＶ感染ウシ５３頭におけるＤＲＢ３、ＤＱＡ１、ＤＱＡ２及びＤＱＡ３遺伝子のアリルをタイピングし、ＢＬＶ感染細胞数の割合との相関性を解析した。その結果、ＤＲＢ３＊０７０１−ＤＱＡ１＊０１０１−ＤＱＡ２＊２２０３１−ＤＱＡ３（−）のハプロタイプ、又はＤＲＢ３＊１４０１２−ＤＱＡ１＊１００１２−ＤＱＡ２＊２２０２１−ＤＱＡ３（−）のハプロタイプ（以下、抵抗性ハプロタイプという）を有する個体は、これを持たない個体と比較して、ＢＬＶ感染細胞数の割合が有意に減少していることが示された（図１０、ｐ＝０．００１４４６）。このことから、抵抗性ハプロタイプを有するウシは、ＢＬＶ感染細胞数が低く抑えられ、その結果、白血病発症のリスクが低下し、白血病発症に抵抗性を示すことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明により、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）によるウシ白血病発症に対する抵抗性の判定方法が提供される。該方法は、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖におけるＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在、又はＤＱＡ１＊０１０１アリルとウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子β鎖におけるＤＲＢ３＊０７０１アリルの存在、あるいは特定のアリルからなるハプロタイプを検出することにより、被験ウシの発症抵抗性を簡便かつ迅速に判定することができるため、ウシの白血病発症機構の研究、ウシ白血病発症に対する抵抗性を有するウシの作出などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】ＢｏＬＡ−ＤＱ分子のα鎖のアミノ酸配列の一部について、ＤＱＡ１＊０１０１アリルと他のアリルとの比較を行った結果を示す。７５番目のアミノ酸残基は、ＤＱＡ１＊０１０１アリルにおいてバリン（Ｖ）であるのに対し、他のアリルにおいてはイソロイシン（Ｉ）である。
【図２】ＨＬＡ−ＤＱ８の三次元立体構造における、ＤＱ分子のα鎖の７５番目のアミノ酸残基の位置を示す。右図は、ＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するα鎖を示し、左図は他のアリルを有するα鎖を示す。上側がＤＱ分子のα１ドメインを、下側がＤＱ分子のβ１ドメインを表す。また、中央部分の細長い配列は抗原ペプチドを表し、右上はα鎖の７５番目のアミノ酸残基を表す。
【図３】ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）に感染した健康ウシと白血病発症ウシにおける、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＤＱＡ２、並びにＢｏＬＡ−ＤＲＢ３のアリルを示す。
【図４】ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）に感染した健康ウシと白血病発症ウシにおけるＢｏＬＡ−ＤＱＡ１及びＤＱＡ２のアリルの存在頻度の比較を示す。
【図５】ＢＬＶ感染細胞率（％）とＤＱＡ１＊０１０１アリル及びＤＲＢ３＊０７０１アリルの存在についての分析結果を示す。
【図６】ＤＲＢ３＊０７０１アリル及びＤＱＡ＊０１０１アリルを有する個体、ＤＲＢ３＊０７０１アリルのみを有する個体、ＤＲＢ３＊０７０１アリルもＤＱＡ＊０１０１アリルも有しない個体について、ＢＬＶ感染細胞率（％）をプロットしたグラフを示す。
【図７】ＢＬＶ感染健康ウシ３０頭とＢＬＶ感染白血病発症ウシ２３頭のＤＲＢ−ＤＱＡ１−ＤＱＡ２−ＤＱＡ３のアリルのタイピング結果を示す。
【図８】図７の結果に基づいて予測したハプロタイプを示す。
【図９】健康ウシ及び白血病発症ウシが有するハプロタイプをまとめた結果を示す。
【図１０】抵抗性ハプロタイプ（ＤＲＢ３＊０７０１−ＤＱＡ１＊０１０１−ＤＱＡ２＊２２０３１−ＤＱＡ３（−）、又はＤＲＢ３＊１４０１２−ＤＱＡ１＊１００１２−ＤＱＡ２＊２２０２１−ＤＱＡ３（−））を有する個体と他のハプロタイプを有する個体のＢＬＶ感染細胞数を比較した結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１０２】
配列番号３〜１１、１８〜２１、３０及び３１：合成オリゴヌクレオチド（配列中、ＲはＡ又はＧを表す）
【図１】
2006246881.tif 000002
【図２】
2006246881.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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