(57)【要約】【課題】  新規な癌遺伝子、癌抑制遺伝子、癌抑制物質を提供する。【解決手段】  繊維芽細胞にＤＮＡを導入した細胞を、血清を含まず、水溶性高分子を含む動物細胞培養用培地で培養し、非足場依存的に増殖した細胞中の癌遺伝子を同定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）繊維芽細胞にｃＤＮＡライブラリーを導入し；
（２）血清を含まない動物細胞用培地に水溶性の高分子を溶解し、培地の２０℃における粘度を１３０〜１１００センチポアズとし；
（３）（１）に記載の細胞を、（２）に記載の血清を含まず水溶性の高分子を溶解した培地で培養し；
（４）遠心分離により細胞を回収し；
（５）その細胞を、血清を含んだ動物細胞培養用培地で培養し；
（６）培養容器に付着した細胞を取得し；
（７）その細胞中の癌遺伝子を分離し、同定する；
ことを含む癌遺伝子の探索方法。
【請求項２】
繊維芽細胞が株化細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
繊維芽細胞が、ＳＶ４０のＴ抗原を導入し不死化したラット胎児繊維芽細胞であるＲＥＦ（Ｔ）細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
水溶性の高分子が、天然の多糖またはそのエーテルである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
天然の多糖のエーテルが、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ジヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルヒドロキシプロピルセルロースよりなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
天然の多糖がアガロースである請求項４に記載の方法。
【請求項７】
水溶性の高分子がポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、またはポリビニルピロリドンである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
（１）癌遺伝子が導入され足場非依存的増殖能を有する細胞を用意し；
（２）この細胞に他の被検遺伝子を導入し；
（３）その細胞を、血清を含まない動物細胞培養用培地に水溶性の高分子を溶解し、培地の粘度を２０℃で１３０〜１１００センチポアズとした培地で培養し；
（４）その細胞の生存率あるいは増殖能の低下を測定する；
ことを含む癌抑制遺伝子の探索方法。
【請求項９】
（１）癌遺伝子が導入され足場非依存的増殖能を有する細胞を用意し、
（２）血清を含まない動物細胞培養用培地に水溶性の高分子を溶解した、粘度が２０℃で１３０〜１１００センチポアズの培地に被検物質を加えて培養し、
（３）その細胞の生存率あるいは増殖能の低下を測定する
ことを含む癌抑制物質の探索方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は足場非依存増殖能を指標とした癌遺伝子の探索方法、該遺伝子を用いた機能阻害遺伝子または薬剤の探索方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌遺伝子は細胞の癌化の原因遺伝子として知られており、ヒトの多くの癌で癌遺伝子の突然変異などの異常が知られている。癌遺伝子が同定されれば、癌化の分子機序の解明やその癌遺伝子をターゲットとした薬剤の開発が可能となる。そのため、これまで数々の癌遺伝子が探索、同定され、癌化との関わりが研究されてきた。
癌細胞の特徴としては、（１）足場非依存状態における細胞増殖、（２）癌細胞に特徴的に見られる細胞形態の変化、（３）ヌードマウスに移植した場合の腫瘍形成能等が見られる。
これまで、癌遺伝子の同定には、癌細胞で見られる細胞間接触阻止の欠失を指標としたフォーカスアッセイが行われてきた（非特許文献１を参照）。この方法は、癌遺伝子の探索方法として使用することができる。具体的には、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などの細胞に癌遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリーを導入後、２−３週間培養し、細胞接触阻止を打ち破って生じる細胞の塊（フォーカス）を形成させ、そのフォーカスから再度、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、同様のアッセイを繰り返し、癌遺伝子により癌化した細胞を濃縮した後に、導入された遺伝子を同定するものである。しかし、この系では、ｃＤＮＡライブラリーを導入後、細胞がフォーカスを形成するまでに２−３週間かかるため、時間と費用がかかり、癌遺伝子の探索のための簡便な方法であるとは言えない。また、長期間の培養により、細胞が癌遺伝子以外の要因による自発的な変化をした場合も、同様に選択される可能性がある。
【非特許文献１】新細胞工学実験プロトコール  第２部2-6  秀潤社
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、繊維芽細胞を用いた、癌遺伝子の新規な探索方法を提供することにある。本発明の別な目的は、癌抑制遺伝子あるいは抗癌剤の新規な探索方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明者らは鋭意検討の結果、血清を含まないメチルセルロース培地において、繊維芽細胞が１日で９０％以上の死滅すること、またＨ−ｒａｓをはじめとする癌遺伝子を細胞に導入すると同じ培養条件において細胞は細胞死に対して抵抗性を示すことを見出した。この特徴を利用して、癌遺伝子の同定またはそれを阻害する遺伝子あるいは化合物の探索が可能となった。
【０００５】
本発明は、
（１）繊維芽細胞にｃＤＮＡライブラリーを導入し；
（２）血清を含まない動物細胞用培地に水溶性の高分子を溶解し、２０℃での培地の粘度が１３０〜１１００センチポアズである培地を調製し；
（３）（１）に記載の細胞を、（２）に記載の血清を含まず水溶性の高分子を含む培地で培養し；
（４）遠心分離により細胞を回収し；
（５）その細胞を、血清を含んだ動物細胞培養用培地で培養し；
（６）培養容器に付着した細胞を取得し；
（７）その細胞中の癌遺伝子を分離し、同定する；
ことを含む癌遺伝子の探索方法に関する。
【０００６】
本発明はまた、
（１）癌遺伝子が導入され足場非依存的増殖能を有する細胞を用意し；
（２）この細胞に他の被検遺伝子を導入し；
（３）その細胞を、血清を含まない動物細胞培養用培地に水溶性の高分子を溶解し、培地の粘度を２０℃で１３０〜１１００センチポアズとした培地で培養し；
（４）その細胞の生存率あるいは増殖能の低下を測定する；
ことを含む癌抑制遺伝子の探索方法に関する。
【０００７】
本発明はさらに、
（１）癌遺伝子が導入され足場非依存的増殖能を有する細胞を用意し；
（２）血清を含まない動物細胞培養用培地に水溶性の高分子を溶解し、培地の粘度を２０℃で１３０〜１１００センチポアズとした培地に被検物質を加えて培養し；
（３）その細胞の生存率あるいは増殖能の低下を測定する；
ことを含む癌抑制物質の探索方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば足場非依存性を利用して癌遺伝子の探索することができる。さらに本発明によれば同じく足場非依存性を利用して癌抑制遺伝子あるいは抗癌剤を探索できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（Ｉ）癌遺伝子の探索
１）細胞
本発明に用いる細胞は、繊維芽細胞、上皮細胞等の動物細胞である。好ましい細胞は繊維芽細胞である。動物細胞は株化細胞を用いるのが好ましい。初代培養細胞を用いる場合には、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｂ、Ｎ−ｍｙｃ等の原癌遺伝子や、ＤＮＡ癌ウイルスの癌遺伝子であるＴ抗原や、アデノウイルスの癌遺伝子であるＥＩＡを導入して細胞を不死化することが好ましい（Varmus and Weinberg, Genes and the biology of cancer, 166-170頁、Scientific American Library）。
【００１０】
２）ｃＤＮＡライブラリーの導入方法
上記細胞にｃＤＮＡライブラリーを導入する。ｃＤＮＡライブラリーはいずれの源のものでもよい。ｃＤＮＡライブラリーの導入方法としては、導入効率の良いレトロウイルス法（Akagiら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA、100巻、13567-13572頁を参照）が最適である。ｃＤＮＡライブラリーの作製にあたっては、ｃＤＮＡライブラリーの供給源となる細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを回収し、それを鋳型として逆転写反応を行い、レトロウイルスベクターに挿入する。次に、ｃＤＮＡライブラリーをパッケージング細胞にトランスフェクションし、約２日後に培養上清を回収し、ウイルス液とする。ウイルス液を繊維芽細胞など感染用の細胞にかけ、２時間暴露し感染させた後に培地交換をする。約２日後にｃＤＮＡライブラリーが導入された細胞を得ることができる。
【００１１】
３）培地の調製と培養方法
上で得られた細胞を、動物細胞培養用培地を用いて培養する。動物細胞培養用培地としてはＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）等がある。この培地には血清を加えない。
【００１２】
また培地の粘度を上げて細胞を浮遊状態に保つために、水溶性の高分子を加える。浮遊状態に保つのは増殖に足場を必要とせず増殖する癌化細胞を選択するためである。水溶性高分子としては、水溶性の天然の多糖、水溶性の多糖のエーテル、または水溶性の合成高分子を用いることができる。水溶性の天然の多糖のエーテルの例は限定するものではないがメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ジヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルヒドロキシプロピルセルロースである。メチルセルロースが最も好ましい。水溶性の天然の多糖にはアガロースを含む。水溶性の合成高分子の例は限定するものではないがポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、およびポリビニルピロリドンを含む。
【００１３】
細胞を浮遊状態に保つために、２０℃での粘度を、好ましくは１３０〜１１００センチポアズとする。粘度が低すぎると培養中細胞は浮遊状態を保てず沈降する。他方、粘度が高すぎると次の工程の遠心分離による細胞の回収が困難となる。粘度を測定する方法は当業者によく知られており、落球粘度計、毛管粘度計、回転粘度計などを用いて容易に測定できる。
一般に高分子溶液の粘度は高分子の種類、分子量、濃度に依存し、高分子の分子量が高いほど、また濃度が高いほど粘度は高くなる。したがって上記の粘度の範囲となるように、用いる高分子の分子量および／または濃度を選択する。一定の分子量の高分子を用いる場合、濃度を調節して上記の粘度となるようにする。
【００１４】
培養は静置培養でも振とう培養でもよい。上記粘度範囲においては、静置培養でも細胞は浮遊状態を保持できる。培養は通常、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターで行う。培養時間は、本方法（血清非存在下、足場欠損状態）でcDNAライブラリーを入れていない細胞（コントロールの細胞）が90%以上死滅するのに十分な時間である。培養時間は繊維芽細胞の種類に依存し、1日〜6日の範囲である。
【００１５】
４）細胞の回収
培養終了後、培養液に、例えばＰＢＳ緩衝液を加えて希釈し、遠心分離により細胞を回収する。
【００１６】
５）細胞の培養
遠心分離により回収した細胞を、動物細胞培養用培地を用いて再び培養する。しかしこの培養では培地に血清を加える。通常、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター中で静置培養する。この場合、回収した細胞を通常の培養条件下で培養することで細胞の生死を選り分けるため、用いた細胞の至適な血清濃度で培養する。
培養終了後、培地を捨て、培養容器に付着した細胞を回収する。この細胞が３）において足場非依存的条件下で増殖した細胞である。
【００１７】
６）癌遺伝子の分離、同定方法
足場非依存的増殖能を有する細胞からゲノムＤＮＡを回収する。このゲノムＤＮＡには、ウイルスベクターによりインテグレーションしたＤＮＡ配列を含むため、その挿入部分を増幅できるウイルスベクタープライマーを用いたＰＣＲ法で目的遺伝子を増幅させ、ＤＮＡシークエンシングにより配列を決定し、目的遺伝子を同定する（Brummelkampら,Nature Reviews Cancer、3巻、781-789頁を参照）。
【００１８】
（ＩＩ）癌抑制遺伝子の探索
本発明はまた、
（１）癌遺伝子が導入され足場非依存的増殖能を有する細胞を用意し；
（２）この細胞に他の被検遺伝子を導入し；
（３）その細胞を、血清を含まない動物細胞培養用培地に水溶性の高分子を溶解し、培地の粘度を２０℃で１３０〜１１００センチポアズとした培地で培養し；
（４）その細胞の生存率あるいは増殖能の低下を測定する；
ことを含む癌抑制遺伝子の探索方法に関する。
被検遺伝子を導入するには、癌遺伝子を導入した際と挿入部分の前後の配列が異なるレトロウイルスベクターを用いて、レトロウイルス法にて（Ｉ）２）と同様に行う。
（３）の培養条件は（Ｉ）で説明したのと同様である。
コントロールとする細胞と被検細胞を同様に回収後、およそ１ｍｌの動物細胞培養用培地に細胞を懸濁し、１００μｌを９６穴マイクロタイタープレートのウエルに播き、生細胞数測定試薬を１０μｌ添加する。次に、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター中で１時間培養し呈色反応を行い、マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定する。細胞の生存率を調べるには、コントロール細胞の吸光度を１００％とした時の被検細胞の値を生存率として計算する。細胞の生存率あるいは増殖能の顕著な低下が認められれば当該被検遺伝子は癌抑制遺伝子である。
【００１９】
（ＩＩＩ）癌抑制物質の探索
本発明はさらに、
（１）癌遺伝子が導入され足場非依存的増殖能を有する細胞を用意し、
（２）血清を含まない動物細胞培養用培地に水溶性の高分子を溶解し、培地の粘度を２０℃で１３０〜１１００センチポアズとした培地に被検物質を加えて培養し、
（３）その細胞の生存率あるいは増殖能の低下を測定する
ことを含む癌抑制物質の探索方法に関する。
（２）の培養条件および（３）の測定方法は（Ｉ）および（ＩＩ）の場合と同様である。
細胞の生存率あるいは増殖能の顕著な低下が認められれば当該被検物質は癌抑制物質である。
【実施例】
【００２０】
実施例１
ｃＤＮＡライブラリー導入ＲＥＦ（Ｔ）細胞の作製
まず、ＳＶ４０のＴ抗原をコードする遺伝子配列をレトロウイルスベクターに挿入し、レトロウイルス法を用いて、ラット胎児繊維芽細胞であるＲＥＦ細胞にＳＶ４０のＴ抗原を導入し（Akagiら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA、100巻、13567-13572頁を参照）、不死化させたＲＥＦ（Ｔ）細胞を調整した。次に、活性型Ｈ−ｒａｓを過剰発現したヒト胎児肺繊維芽細胞であるＭＲＣ５細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーをレトロウイルスベクターに挿入し、レトロウイルス法を用いてｃＤＮＡライブラリーを導入したＲＥＦ（Ｔ）細胞を作製した。レトロウイルス感染後のＲＥＦ（Ｔ）細胞は、１０％血清を含むＤＭＥＭ培地中で、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター中で静置培養を行った。ウイルス感染後２日目に細胞を継代した。
【００２１】
実施例２
足場非依存的増殖能を付与する癌遺伝子の探索
ｃＤＮＡライブラリーを導入したＲＥＦ（Ｔ）細胞がおよそ１ｘ１０８個になったところで、１．２ｗ／ｖ％メチルセルロース（ＳＩＧＭＡ社  製品番号Ｍ０５１２、２０℃での２ｗ／ｖ％水溶液の粘度が４０００ センチポアズ）を含む、２０℃での粘度が２７０センチポアズであるＤＭＥＭ培地５ｍｌに５ｘ１０６個ずつ混合し、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター中で３日間培養した。培養終了後、４５ｍｌの冷ＰＢＳを加え懸濁し、細胞を１５０００×ｇ、４℃、３分間の遠心分離で回収した。回収した細胞を１０％血清を含むＤＭＥＭ培地１０ｍｌに懸濁し１０ｃｍディッシュに撒いて５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター中で静置培養した。培養終了後、ディッシュに付着した細胞を観察した。
その結果、細胞はＲＥＦ（Ｔ）にＨ−ｒａｓを導入したＲＥＦ（Ｔ／ｒａｓ）細胞と同様の細胞形態を示した。細胞を、２ｘＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅバッファーを加え９８℃で１０分間煮沸した後に細胞溶解液とした。細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗Ｒａｓ抗体を用いたウエスタンブロッティングを行ったところ、ＲＥＦ（Ｔ／ｒａｓ）と同程度のＨ−ｒａｓの発現が認められた。このことは、本探索系を用いることでＭＲＣ５（ｒａｓ）ｃＤＮＡライブラリーから足場非依存的増殖能を付与するＨ‐ｒａｓ遺伝子が効率的に選択されたことを意味する。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明によれば、遺伝子の集団から癌遺伝子を探索できる。本発明によれば癌抑制遺伝子あるいは抗癌剤を探索することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ａ）１０％血清を含むＤＭＥＭ培地中、５％ＣＯ２下に３７℃で静置培養したＲＥＦ（Ｔ）細胞の顕微鏡写真である。Ｂ）Ａの細胞に、ＭＲＣ５（ｒａｓ）細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを導入し、１０％血清を含むＤＭＥＭ培地中、５％ＣＯ２下に３７℃で静置培養したＲＥＦ（Ｔ）細胞の顕微鏡写真である。Ｃ）Ｂの細胞を血清不含のメチルセルロース培地で培養後、生存する細胞を１０％血清を含むＤＭＥＭ培地中、５％ＣＯ２下に３７℃で静置培養したＲＥＦ（Ｔ）細胞の顕微鏡写真である。
【図２】実施例２に記載した方法で作成し、スクリーニングして生存した細胞中のＨ−Ｒａｓ蛋白質の量をＨ−Ｒａｓ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより調べた図である。ぞれぞれの細胞のクローンにおいて、ＲＥＦ（Ｔ）細胞に予めＨ−ｒａｓを導入した細胞であるＲＥＦ（Ｔ／ｒａｓ）と同等のＨ−Ｒａｓの発現が見られる。
【図１】
2006246715.tif 000002
【図２】
2006246715.tif 000003