(57)【要約】 【課題】  検出時のノイズとなる乱反射を抑え、精度の良い分析を行なうことが出来る生体サンプル測定用プレートを提供する。 【解決手段】  生体サンプル判別用プレート１には流路２５、液だめ２３が形成されている。カバー３２は励起光励起光３３を透過させる材料でできており、空孔２４以外の部分を覆うように貼り付けられて、生体サンプル判別用プレート１とカバー３２の間に流路２５と液だめ２３が形成されている。励起光３３は流路２５を照射し、充填された液体試料に含まれる蛍光標識が蛍光を発生させる。ここで、空孔２４によって生体サンプル判別用プレート内に迷光が発生せず、隣接する液だめ２３から蛍光は発生しない【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルが充填された流路に励起光が照射されるときに前記生体サンプルが発する光を測定して前記生体サンプルを判別する装置における前記流路が形成された生体サンプル判別用プレートにおいて、
前記生体サンプルが発する光の前記生体サンプル判別用プレート内部における透過を制限する乱反射制限手段を備えた、ことを特徴とする生体サンプル判別用プレート。
【請求項２】
前記乱反射制限手段は前記流路に対して相反する側に前記流路から等しい距離をおいて形成された空孔である、ことを特徴とする請求項１に記載の生体サンプル判別用プレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体サンプルを緩衝剤中で移動させ、その輸送反応を検出して生体サンプルを判別する生体サンプル判別用プレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的な生体試料を考えた場合、代表的なものとして、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質が存在する。近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきた。
【０００３】
ＤＮＡに関しては、現在ＳＮＰＳ（ＳＩＮＧＬＥ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＳＭＳの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰＳの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や副作用をあらかじめ予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰＳを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。
【０００４】
現在ＳＮＰＳを調べる方法としては、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定方法）が最も一般的に用いられている。そして、前記シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、もっとも一般的に行われているのは、ジデオキシシーケンス法（ＳＡＮＧＥＲ法）である。なお、シーケンシングは、このＳＡＮＧＥＲ法を含め何れの方法においても、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、キャピラリー電気泳動によって１塩基の長さの違いを分離・識別する技術が基になって成り立っている。
【０００５】
そして、このようなシーケンシングによるＳＮＰＳの解析は、ターゲットとする遺伝子を単離した後、増幅・精製し、遺伝子の塩基配列決定法（装置）を用いて、目的遺伝子の塩基配列を読むことによって行うものであるため、実験に膨大な作業量と時間、さらには多大のランニングコストを要し、またその際に使用する塩基配列決定のための自動化装置は、非常に高価で、大きなスペースを占有し、高価な試薬を大量に必要とするという問題を有している。
【０００６】
こうした問題点は、アフィニティキャピラリー電気泳動によってＤＮＡを分離する方法を用いればほぼ解決できる。アフィニティキャピラリー電気泳動は、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力（ＤＮＡとそれを相補するＤＮＡ、ＤＮＡとそのＤＮＡから転写されたＲＮＡ、酵素と基質、抗原と抗体の親和力等）を利用して分離に特異性を持たせるものであり、具体的には、キャピラリー管中の泳動溶液に、相互作用する二成分のうちの一方を添加しておき、他方の成分を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じることに着目して分析を行うものである（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
ここで、従来のアフィニティキャピラリー電気泳動では、塩基配列を特異的に認識するアフィニティ物質として、被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係にある１本鎖ＤＮＡを使うが、ポリヌクレオチドを成分とするＤＮＡは負電荷を有しているため、電圧を印加すると、このアフィニティ物質として用いているＤＮＡがキャピラリー外に流出してしまう。これを防ぐため、従来では、アフィニティのために用いるＤＮＡである、前記被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係の１本鎖ＤＮＡを、キャピラリー内に固定化している。そして、固定化の方法としては、ビニル化ＤＮＡをリニアポリマー化したポリアクリルアミドと共重合し、それをキャピラリー内壁に共有結合的に固定化するものが提案されている。これにより、前記被検体ＤＮＡは、アフィニティ物質である固定的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）と強く相互作用してキャピラリー内に吸着され、一方ノイズＤＮＡは該固定的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）に吸着されずキャピラリー外に流出され、この結果、前記被検体ＤＮＡを検出することが可能となる（特許文献１参照）。
【０００８】
しかしながら、この方法では、アフィニティのために用いるＤＮＡ（以下：アフィニティＤＮＡ）がキャピラリー内壁にしか固定化できないので、アフィニティＤＮＡと試料ＤＮＡとの相互作用が壁面近傍に限られ、測定が難しく、且つ測定精度が悪くなるという問題がある。
【０００９】
そこで、本出願人は、アフィニティＤＮＡと試料との相互作用が壁面近傍に限られないように、該アフィニティＤＮＡをキャピラリー内で擬似的に固定する方法を開発し、それぞれに電極を配置した第１容器と第２容器間を、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液を充たしたキャピラリー管で連絡し、次いで、このキャピラリー管の緩衝液の中に、該ＤＮＡ試料に含まれる異常ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を結合したリニアポリマーからなる分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填した後、続いて被検体であるＤＮＡ試料を充填し、その後、両電極間に電圧を印加して、キャピラリー管内の被検体ＤＮＡ試料を電気泳動させることで、該ＤＮＡ試料を分離する遺伝子診断装置と遺伝子診断方法を提案している（特許文献２参照）。
【００１０】
以下、アフィニティＤＮＡをキャピラリー内で擬似的に固定する方法について説明すると、ＤＮＡは二本鎖を形成するものと一本鎖を形成するものと存在するが、ＤＮＡのもつＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇ４つの塩基は互いにＡとＴ、ＧとＣが結合しペアを形成する性質を有しており、ＤＮＡの二本鎖においてもＡＴ，ＧＣで対をなしている。従って、一方のＤＮＡがＡＴＣＧＣＧＴと配列されている場合、他方のＤＮＡはＴＡＧＣＧＣＡという塩基配列をもっている。
【００１１】
ＤＮＡ試料を分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートは、前述したようなＤＮＡの相補的関係を利用するために、該分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分に、ＤＮＡ試料の異常ＤＮＡと相補的関係をもつＤＮＡ配列を与えている。例えば、ＤＮＡ試料の異常ＤＮＡのＤＮＡ配列がＡＴＣＧＣＧＴを含み、正常ＤＮＡがＡＴＣＡＣＧＴを含む場合、下線で示した部分で異常ＤＮＡと正常ＤＮＡの塩基が異なっている。
【００１２】
このとき、分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分の配列をＴＡＧＣＧＣＡとすると、正常ＤＮＡは下線部においてＤＮＡコンジュゲートと相補的ではなくなる。これにより、全体の結合力は異常ＤＮＡの方が正常ＤＮＡより１塩基分大きくなり、電気泳動時に異常ＤＮＡの方が正常ＤＮＡより遅延して泳動される。
【００１３】
ＤＮＡ試料は血液などから、細胞を破壊してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲなどによって目的のＤＮＡ配列を含む部分を増幅する。このとき、所定の塩基数にして増幅すると相補的配列を持つＤＮＡコンジュゲートの塩基数も決定できる。
【００１４】
前述した方法によれば、負に帯電した分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とを、電気泳動させる際に、アフィニティＤＮＡと被ＤＮＡ検体との相互作用が壁面近傍に限られないように擬似的に固定し、そのＤＮＡ試料の移動速度差から、該正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとを分離することができ、この結果、ＳＮＰＳの遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に判別することが可能になる。
【００１５】
しかし、前述した特許文献２の遺伝子診断装置と診断方法においては、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液を充たしたキャピラリー管に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とを充填する必要がある。このように、キャピラリー管１本１本に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料を充填するのは面倒な作業であるが、この問題に対しては、特許文献３，４に記載されているように、プラットホームであるプレートに微細な流路を形成し、該プレートの回転速度を変化させることで、該回転から生じる向心力を変化させて試料を移動させるという方法が提案されている。
【００１６】
ここまでで説明した方法により、ＤＮＡ試料を分離し、流路と相対的に移動するようにした光学検出部が前記ＤＮＡ試料の蛍光度を検出することで、ＳＮＰＳの有無を判定することができる。
特に、多数の流路を一つのプレート上に形成し、効率よく測定を行なう場合、隣接する流路やプレートの端面など隣接するプレート形状により検出する信号にノイズが含まれるという問題がある。
【００１７】
この隣接する形状によりノイズが発生する問題を解決するために、特許文献５に示すような技術が提案されている。これは、スリットから出てくる光を分光することによってノイズを減らすことが出来る。
【特許文献１】特開平７−３１１１９８号公報
【特許文献２】特開２００２−３４０８５９号公報
【特許文献３】特表２０００−５１３８１３号公報
【特許文献４】特表２００１−５２３３４１号公報
【特許文献５】特開２００２−１９５９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかしながら、特許文献３、４に記載されているような複雑な形状がプレート上に形成されている構成では、隣接する形状に蛍光を発するサンプルを溜めておくタンクの役割をする形状や蛍光を発する液体が流れる流路が存在する可能性があるので、蛍光を分光によって検出する方法では隣接する形状から発せられる蛍光を検出してしまいノイズとなってしまうという課題を有していた。
【００１９】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、流路に充填された生体サンプルを光を用いて検出する際にプレート上の隣接形状の影響を受けない生体サンプル判別用プレートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
前記従来の課題を解決するために、本発明の生体サンプル判別用プレートは、生体サンプルが充填される流路と、前記流路の測定範囲の両脇に乱反射制限手段を備えたことを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の生体サンプル判別用プレートによれば、流路に隣接する形状により発生する光の乱反射を防ぐことにより、検出時のベースラインノイズを抑え、精度の良い検出を行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
(実施例１)
図１は、本発明の実施例１における生体サンプル判別用プレートの構成例を示した図である。
生体サンプル判別用プレート１には微細な流路２が形成されている。流路２には、DNAにFITC等の蛍光物質を用いて修飾することによって、予め蛍光標識された試料を含む液体が充填されている。試料を蛍光によって検出するために、蛍光物質が蛍光を発するために励起光を照射する必要があり、たとえばFITCを用いる場合は波長が４９５ナノメートルの光を励起光を用いることが出来る。光源４がこの励起光６を照射することにより、試料が蛍光を発する。
【００２３】
受光側では、試料が発した蛍光７を受光素子５で検出する。受光素子はＰＤ（フォトダイオード）やフォトマルチプライヤ、ＣＣＤ等の受光素子を用いることが出来る。生体サンプル判別用プレート１と受光素子５との間には、生体サンプル判別用プレート表面で反射した励起光の成分をカットし蛍光を通すための光学フィルタ３が配置されている。
【００２４】
また、光源４は生体サンプル判別用プレート１と相対的に移動可能であり、流路２をなぞるように、励起光のスポットを移動させる。これにより、流路２上の任意位置の蛍光度を検出することができる。
【００２５】
次に図２を用いて生体サンプル判別用プレート１の詳細な構造について説明する。
【００２６】
図２は生体サンプル判別用プレート１の平面図である。生体サンプル判別用プレート１はアクリルなどの光を透過する材料で形成されており、保持用穴２２を使って分析装置に保持される。試料の液体や、コンジュゲートは注入口２６から注入され、液だめ２３に一旦保持され、その後流路２５に充填される。充填された後電圧を印加し電気泳動を行い、流路２５の蛍光を検出する。
【００２７】
図３は生体サンプル判別用プレート１の流路２５と液だめ２３を含む断面図である。生体サンプル判別用プレート１には流路２５、液だめ２３が形成されている。カバー３２は励起光励起光３３を透過させる材料でできており、空孔２４以外の部分を覆うように貼り付けられて、生体サンプル判別用プレート１とカバー３２の間に流路２５と液だめ２３が形成されている。
【００２８】
空孔２４は流路２５の両側に等しい距離をおいて形成されている。励起光３３は流路２５を照射し、充填された液体試料に含まれる蛍光標識が蛍光を発生させる。ここで、空孔２４によって生体サンプル判別用プレート内に迷光が発生せず、隣接する液だめ２３から蛍光は発生しない。
【００２９】
空孔２４が無い場合、励起光３３は流路２５を通過した後、プレート１表面で全反射したり、プレートに形成された形状の境界面などで乱反射したりしてプレート内部に存在する液だめ２３に届く。これにより、液だめ２３で蛍光が発生し、励起光と同様に反射することで受光素子５で検出されてしまう。
【００３０】
空孔２４によって、上記のように励起光が液だめ２３に届くことが無くなると同時に、液だめ２３で蛍光が発生していた場合でも空孔２４によって遮光され、流路２５を検出する位置にある受光素子５に届くことは無い。
【００３１】
また、液だめ２３などの流路以外の形状による影響を抑えることが出来るだけでなく、流路２５で発生する蛍光や、励起光がプレート内で反射することによって発生する励起光の漏れ込みによるノイズの大きさが流路２５のどの部分を検出しても変化しない。これは、空孔２４は流路２５の両側に等しい距離をおいて形成されている事により実現されている。
【００３２】
以上のように、本実施例１においては空孔２４が流路２５と等間隔に形成されることにより、生体サンプル判別用プレート内の隣接する要素の影響を受けず、精度の良い分析を行なうことが出来る。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明にかかる生体サンプル測定用プレートは、流路に隣接する形状により発生する光の乱反射を防ぐことにより、検出時のベースラインノイズを抑えることができるため、ＳＮＰＳ解析装置などの用途にも使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の実施例１に係る生体サンプル判別用プレートの構成図
【図２】本発明の実施例１に係る生体サンプル判別用プレートの断面図
【図３】本発明の実施例１に係る生体サンプル判別用プレートの断面図
【符号の説明】
【００３５】
１  生体サンプル判別用プレート
２  流路
３  光学フィルタ
４  光源
５  受光素子
６  励起光
７  蛍光  ２２  保持用穴
２３  液だめ
２４  空孔
２５  流路
２６  注入口
３２  カバー
３３  励起光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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