(57)【要約】【課題】動物を試験に用いることなく、安価かつ簡便に、多型核白血球の細胞接着及び／又は細胞移動を抑制する物質をスクリーニング可能な薬剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】固体支持体上にコーティングされた接着性基質に、少なくとも多型核白血球と、被験物質と、前記多型核白血球の活性化剤とを添加し、前記接着基質への前記多型核白血球の接着細胞を測定することにより、前記多型核白血球の細胞接着能を評価する。動物実験を行うことなく、安価で、短時間かつ簡便に、多型核白血球の細胞接着及び／又は細胞移動を抑制する物質をスクリーニングすることが可能であり、医薬の開発をより効率的に行うことができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多型核白血球の細胞接着及び／又は細胞移動を抑制するのに有効な薬剤のスクリーニング方法であって、固体支持体上にコーティングされた接着性基質に、少なくとも多型核白血球と、被験物質と、前記多型核白血球の活性化剤とを添加し、前記接着基質への前記多型核白血球の接着細胞数又は接着細胞量を測定することにより、前記多型核白血球の細胞接着能を評価することを特徴とする薬剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記接着性基質が、フィブリノーゲンであることを特徴とする請求項１記載の薬剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記活性化剤が、ホルボールミリスチン酸アセテートであることを特徴とする請求項１又は２記載の薬剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記活性化剤が、ホルボールミリスチン酸アセテート及びマグネシウムイオンであることを特徴とする請求項１又は２記載の薬剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記接着細胞数を、位相差顕微鏡を用いて測定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の薬剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
クリスタルバイオレットを含む水溶液により接着細胞を染色し、前記接着細胞量を分光光度計を用いて測定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の薬剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞接着及び／又は細胞移動を抑制するのに有効な薬剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多型核白血球（以下、ＰＭＮｓと称す）は病原細菌・微生物などに対する感染防御の第一線を担う細胞であり、病原細菌感染などの様々な刺激によって細胞接着分子であるインテグリンを介して細胞接着を起こすことが知られている。また、こうしてインテグリンを介して接着したＰＭＮｓは細胞内アクチン骨格の再編成により伸展（spreading）し、これが基質への強固な接着や細胞移動（遊走）、および貪食の基盤となることが知られている。
【０００３】
具体的には、生体内に病原細菌や微生物等が侵入すると、血管内を循環しているＰＭＮｓがこれを感知して活性化し、（１）血管内皮への接着、（２）血管外への漏出、（３）炎症部位への遊走・集積、（４）細菌・微生物等の貪食、そして（５）殺菌、といった一連の過程を経て生体を防御している。この殺菌の工程では、ＰＭＮｓが貪食された細菌に対して種々の顆粒内酵素や活性酸素を放出することによって、殺菌が行われている。また、これらの顆粒内酵素や活性酸素の作用は病原細菌に対して特異的なものではなく、宿主組織に対しても傷害作用を示すことが知られている。
【０００４】
このため、ＰＭＮｓの機能は時間的・空間的に厳密に制御される必要がある。しかし、これらの制御が乱れると宿主組織へのＰＭＮｓの過剰な集積が生じる。そして、ＰＭＮｓは自己の正常な細胞までを攻撃して様々な組織傷害を惹起し各種の炎症疾患、例えば、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の他、喘息などのアレルギー疾患などをもたらす。さらに、医療用器具等の体内移植後のＰＭＮｓの細胞接着に起因した炎症反応をももたらしており、この炎症反応については、主にフィブリノーゲンなどの宿主タンパク質が移植器具をコーティングすることによって、ＰＭＮｓの接着が誘導されるためと考えられている。
【０００５】
上述のＰＭＮｓの過剰な集積を対処するには、ＰＭＮｓの細胞接着及び／又は細胞移動を抑制する必要があり、ＰＭＮｓに対してこのような抑制効果を示す物質の発見や開発が望まれている。
【０００６】
一方、薬効物質のスクリーニング方法として、例えば特許文献１には、アトピー性皮膚炎モデル動物に対して、被験物質を投与し、アトピー性皮膚炎の改善効果を検定することを特徴とするアトピー性皮膚炎の治療用物質のスクリーニング方法が提案されている。このように、薬効物質のスクリーニングは、基本的に種々の物質を、薬効が評価できる病態モデル動物にランダムに投与してその効果を調べ、薬効を発揮する物質を選択していくというものであった。
【特許文献１】特開２００４−４１１２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、病態モデル動物を用いた動物実験によるスクリーニング方法では、無数にある物質から薬効物質をスクリーニングするため、
かなりの手間と多額の費用を要するという問題があった。
【０００８】
本発明は上記問題点を解決しようとするものであり、動物実験を行うことなく、安価かつ簡便に、多型核白血球の細胞接着及び／又は細胞移動を抑制する物質をスクリーニングできる薬剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、多型核白血球（ＰＭＮｓ）の機能過剰によるとされる自己免疫疾患などの疾患への対策として、血管内へのＰＭＮｓの細胞接着及び／又は細胞移動を阻止又は抑制する薬剤を用いることが考えられる。そこで、血管壁を擬似的に再現したプレートを用いて、このプレートに、ＰＭＮｓと、被験物質と、前記ＰＭＮｓの活性化剤とを添加し、その後前記プレートに接着したＰＭＮｓの細胞数又は細胞量を測定することによって、安価かつ簡便に、しかも短時間に薬剤のＰＭＮ機能抑制効果を評価できることを見出し、本発明に想到した。
【００１０】
本発明の請求項１記載の薬剤のスクリーニング方法は、多型核白血球の細胞接着及び／又は細胞移動を抑制するのに有効な薬剤のスクリーニング方法であって、固体支持体上にコーティングされた接着性基質に、少なくとも多型核白血球と、被験物質と、前記多型核白血球の活性化剤とを添加し、前記接着基質への前記多型核白血球の接着細胞数又は接着細胞量を測定することにより、前記多型核白血球の細胞接着能を評価することを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の請求項２記載の薬剤のスクリーニング方法は、請求項１において、前記接着性基質がフィブリノーゲンであることを特徴とする。
【００１２】
さらに、本発明の請求項３記載の薬剤のスクリーニング方法は、請求項１又は２において、前記活性化剤がホルボールミリスチン酸アセテートであることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の請求項４記載の薬剤のスクリーニング方法は、請求項１又は２において、前記活性化剤がホルボールミリスチン酸アセテート及びマグネシウムイオンであることを特徴とする。
【００１４】
さらに、本発明の請求項５記載の薬剤のスクリーニング方法は、請求項１〜４のいずれか１項において、前記接着細胞数を、位相差顕微鏡を用いて測定することを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の請求項６記載の薬剤のスクリーニング方法は、請求項１〜４のいずれか１項において、クリスタルバイオレットを含む水溶液により接着細胞を染色し、前記接着細胞量を分光光度計を用いて測定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の請求項１記載の薬剤のスクリーニング方法によれば、動物実験を行うことなく、安価で、短時間かつ簡便に、多型核白血球の細胞接着及び／又は細胞移動を抑制する物質をスクリーニングすることが可能であり、医薬の開発をより効率的に行うことができる。また、多型核白血球の細胞接着に起因する疾患、例えば慢性関節リウマチ，喘息，アレルギー性疾患，炎症性皮膚疾患，アトピー性皮膚疾患，移植拒絶疾患，移植拒絶疾患などに対する薬剤をスクリーニングするのに有用である。
【００１７】
本発明の請求項２記載の薬剤のスクリーニング方法によれば、血漿中に多量に存在し、調整が容易なフィブリノーゲンを用いて細胞接着能を評価するので、他の高価な接着性基質（例えば、フィブロネクチン，コラーゲン，ＩＣＡＭ−１など）に比べ多種類の検体のスクリーニングを安価に行うことが可能である。
【００１８】
本発明の請求項３記載の薬剤のスクリーニング方法によれば、ホルボールミリスチン酸アセテートにより、多型核白血球に発現するインテグリンを直接活性化させ、細胞接着を促すことができる。
【００１９】
本発明の請求項４記載の薬剤のスクリーニング方法によれば、ホルボールミリスチン酸アセテートおよびマグネシウムイオンにより、多型核白血球に発現するインテグリンをより活性化させ、細胞接着を促すことができる。
【００２０】
本発明の請求項５記載の薬剤のスクリーニング方法によれば、汎用の実験機器で、安価かつ短時間に測定可能である。
【００２１】
本発明の請求項６記載の薬剤のスクリーニング方法によれば、汎用の実験機器で、安価かつ短時間に測定可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。本発明の薬剤のスクリーニング方法は、多型核白血球の細胞接着及び／又は細胞移動を抑制するのに有効な薬剤のスクリーニング方法であって、固体支持体上にコーティングされた接着性基質に、少なくとも多型核白血球と、被験物質と、前記多型核白血球の活性化剤とを添加し、前記接着基質への前記多型核白血球の接着細胞を測定することにより、前記多型核白血球の細胞接着能を評価することを特徴とするものである。
【００２３】
本発明でいう細胞接着とは、細胞が基質に付着（attachment）し、かつ基質に付着した後扁平に広がって伸展（spreading）を起こしている状態を意味する。なお、細胞が伸展するためには、細胞内アクチン骨格系の再編成が必要である。
【００２４】
本発明で使用される接着性基質とは、多型核白血球（ＰＭＮｓ）の細胞表面に発現している細胞接着分子の一つであるβ２−インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）と結合する種々の基質を包含する。具体的には、細胞外基質であるフィブリノーゲン，血管内皮細胞上に発現しているＩＣＡＭ−１，または補体Ｃ３の分解産物であるｉＣ３ｂなどが挙げられる。
【００２５】
また、本発明で使用される支持体とは、接着性基質を固定化するのに適した培養プレートなどを含む。
【００２６】
本発明で使用される多型核白血球の活性化剤とは、ＰＭＮｓを刺激することによってβ２インテグリンは活性化し、β２インテグリンを介したＰＭＮｓの細胞接着を誘導する物質である。具体的には、ホルボールミリスチン酸アセテート（phorbol 12-myristate 13-acetate、ＰＭＡ）やＭｇ2+などが挙げられる。なお、ＰＭＡでプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を直接活性化することによってインテグリンの活性化を誘導することが知られている（Fagerholm S, et al, J Biol Chem 277(3),1728-1738,2002）。また、Ｍｇ2+がＣＤ１１ｂ鎖の細胞外領域のＭｇ2+／Ｃａ2+結合部位に結合することによって、基質結合能を大幅に増大することが知られている（Yan SR, et al,J Inflamm 45(4),297-311,1995）。さらに、Ｃａ2+はインテグリンの基質結合に直接には関与しておらず、活性化インテグリン分子の構造維持に寄与していると考えられている。
【００２７】
本発明においては、接着基質へのＰＭＮｓの接着細胞を測定することにより、ＰＭＮｓの細胞接着能を評価する。この接着細胞を測定し評価する方法としては、以下に示す２つの方法を挙げることができる。
【００２８】
１．形態学的評価
固体支持体上にコーティングされた接着性基質に、被験物質，Ｍｇ2+，及びＰＭＮｓを添加し、細胞接着を誘導する。その後、細胞の形態的な変化を、例えば、位相差顕微鏡(例として、倍率：２００−６００倍)などの汎用の実験機器で観察し、接着性基質に接着して扁平している伸展した細胞数および接着していない細胞数を測定し、伸展（spreading）率を算出後、伸展評価を行う。
【００２９】
２．クリスタルバイオレット染色法
固体支持体上にコーティングされた接着性基質に、被験物質，Ｍｇ2+，及びＰＭＮｓを添加し、細胞接着を誘導する。その後、ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄して、非接着細胞を除去し、接着細胞が残存しているプレートに、クリスタルバイオレット染色を添加して細胞核を染色する。染色後、染色液を除去し、ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄することによって、余分な染色液を除去する。次に、溶出液（Elution  buffer）を添加後、攪拌してクリスタルバイオレットを溶出し、波長５４０ｎｍの吸光度を測定し、相対接着率（％）を算出後、細胞接着の評価を行う。
【００３０】
本発明の薬剤のスクリーニング方法は、動物実験を行うことなく、汎用の実験機器を用いて、安価で、短時間かつ簡便に、多型核白血球の細胞接着及び／又は細胞移動を抑制する物質をスクリーニングすることが可能である。さらに、短時間かつ簡便にスクリーニングできる特性を利用して、有効成分の詳細な分析を行うことができる。すなわち、有効成分を有する物質を精製後、得られた各フラクションを本発明のスクリーニング方法にかけることによって候補化合物を絞り込むことにより、有効成分を特定でき、薬剤の開発をより効率的に行うことができる。
【００３１】
また、本発明の薬剤のスクリーニング方法は、ＰＭＮｓによる組織傷害を伴う疾患、例えば慢性関節リウマチ，喘息，アレルギー性疾患，炎症性皮膚疾患，アトピー性皮膚疾患，移植拒絶疾患などに対する薬剤をスクリーニングするのに有用である。
【００３２】
さらに、細胞と細胞外基質の接着に関与する細胞外マトリックス分子（例えば、フィブロネクチンなど）はガンの転移過程においてガン細胞の接着、細胞移動にも関与していることが知られている。そこで、ガン転移抑制剤として作用する薬剤の開発に、本発明のスクリーニング方法における多型核白血球をガン細胞に代替して用いてもよい。
【００３３】
なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は、例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。
【実施例１】
【００３４】
以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。
【００３５】
ＰＭＮｓ細胞接着能試験による薬剤の抗炎症効果の評価：本評価法は、フィブリノーゲンコートを施した表面に対するＰＭＮｓの接着能を測定することにより、抗炎症効果を評価するものである。具体的には、被験物質を含む溶液にＰＭＮｓを懸濁し、ＰＭＮｓの活性化剤であるＭｇ2+とホルボールミリスチン酸アセテート（phorbol 12-myristate 13-acetate、ＰＭＡ）による刺激で接着を誘導し、写真撮影による形態学的評価及び細胞のクリスタルバイオレット染色／染色液抽出による比色定量評価を行った。以下に作業手順を述べる。
【００３６】
（１）フィブリノーゲンコートプレートの作成
フィブリノーゲンをＨＥＰＥＳ緩衝液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ glucose）に溶解し、このフィブリノーゲン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を９６穴プラスチックマイクロプレートに３００μＬずつ分注し、室温にて１時間以上静置後、溶液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液で３回洗浄し、フィブリノーゲンコートプレートを作成した。
【００３７】
（２）接着能試験１：形態学的評価
上記（１）のように作製したフィブリノーゲンコートプレートに、被験物質，Ｍｇ2+（終濃度０．６ｍＭ），及びＰＭＮｓ（終濃度３×１０6cells／ｍＬ）を添加し、ＨＥＰＥＳ緩衝液でメスアップして最終容量を１００μＬとした。次に、攪拌後、３７℃で１０分間プレインキュベーションし、ＰＭＡをＨＥＰＥＳ緩衝液で５０μｇ／ｍＬに希釈して、このＰＭＡをＰＭＮｓなどを添加したフィブリノーゲンコートプレートに終濃度１μｇ／ｍＬとなるように添加した。さらに３７℃で２０分間インキュベートして細胞接着を誘導した。位相差顕微鏡による細胞の顕微鏡像をデジタルカメラで撮影し、写真よりそれぞれフィブリノーゲンに接着後扁平している伸展した細胞数および接着していない細胞数を測定して、伸展評価を行った。なお、伸展率は、伸展したＰＭＮｓ数／全ＰＭＮｓ数×１００（％）として、伸展率（Spreading）（％）を算出した。細胞数のカウントにおいては、ランダムに撮影したものについてそれぞれ行い、その平均値±標準偏差で示した。
【００３８】
（３）接着能試験２：クリスタルバイオレット染色法
上記（２）に示したように、ＰＭＡによる接着誘導後、１００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液で３回洗浄して、非接着細胞を除去した。接着細胞が残存しているプレートに、クリスタルバイオレット染色の０．４ｗｔ／ｖ％水溶液１００μＬを添加して細胞核を３０分間染色した。染色後、染色液を除去し、ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄することによって、余分な染色液を除去した。溶出液１００μＬを添加後、攪拌してクリスタルバイオレットを溶出し、波長５４０ｎｍの吸光度を測定した。なお、細胞接着の評価は、フィブリノーゲンコートプレートに０．６ｍＭのＭｇ2+および１μｇ／ｍＬのＰＭＡを添加したときの細胞接着（ポジティブコントロール）を１００％として、相対接着率（％）を算出した。
【００３９】
（４）細胞外ｐＨの影響
ＨＥＰＥＳ緩衝液のｐＨをそれぞれ７．２，６．９，６．６，６．３，６．０に変化させた時のＰＭＮｓの伸展率および相対接着率について調べた。なお、被験物質としては各ｐＨのＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて、ｐＨ以外の条件は上述した接着能試験１および２と同様の方法で伸展率および相対接着率を算出した。
【００４０】
その結果を図１〜３に示す。図１は、形態学的評価においてＨＥＰＥＳ緩衝液のｐＨを（ａ）ｐＨ７．２，（ｂ）ｐＨ６．９，（ｃ）ｐＨ６．６，（ｄ）ｐＨ６．３，（ｅ）ｐＨ６．０に変化させたときの細胞の顕微鏡像を示す。図中、黒色の細胞はフィブリノーゲンに接着・扁平して伸展した細胞を示し、一方、白色の細胞は扁平していない細胞を示す。図２は、図１の写真から伸展したＰＭＮｓ数および全ＰＭＮｓ数をカウントして伸展率（％）を算出し、伸展に対する細胞外ｐＨの影響を示すグラフである。なお、検定は４回行いスタンダードエラー・バーを付した。図３は、細胞接着に対する細胞外ｐＨの影響を示すグラフである。図１〜３に示すように、ｐＨの低下にしたがって、細胞接着および接着後の伸展の減少が見られた。なお、図２の形態学的評価と図３のクリスタルバイオレット染色法とを比較すると、クリスタルバイオレット染色法によって得られた相対接着率の方が、形態学的評価から得られた伸展率よりもｐＨの影響が少なかった。これは、ＰＭＮｓ細胞が偏平まで至らないが、フィブリノーゲンに接着しているＰＭＮｓが存在するためであると考えられる。
【実施例２】
【００４１】
被験物質としてクレソン抽出物を用いた多型核白血球の細胞接着能試験：
クレソン粉末を熱湯抽出し、凍結乾燥によって抽出物を粉末後、更に１００％メタノールで抽出したメタノール抽出物を回収した。その後、メタノール抽出物に含まれるメタノールを蒸発除去した。このメタノールを除去した抽出物をＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解（１００ｍｇ当量／ｍＬ）したものを被験物質として用いた。また、実施例１記載の形態学的評価法と同様の方法で伸展率（％）を算出した。なお、検定は４回行いスタンダードエラー・バーを付した。結果を図４に示す。さらに、実施例１記載のクリスタルバイオレット染色法と同様の方法で相対接着率（％）を算出した。なお、検定は３回行いスタンダードエラー・バーを付した。結果を図５に示す。
【００４２】
図４に示されるように、クレソン抽出物を添加していないもの（濃度０ｍｇ当量／ｍＬ）は約７８％が伸展を示したのに対し、クレソン抽出物を添加したもの（濃度１００ｍｇ当量／ｍＬ）は約１０％のみが伸展を示した。一方、図５に示されるように、クレソン抽出物を添加していないもの（濃度０ｍｇ当量／ｍＬ）はＰＭＮｓ細胞が約１００％フィブリノーゲンに接着し、クレソン抽出物を添加したもの（濃度１００ｍｇ当量／ｍＬ）はＰＭＮｓ細胞が約８０％フィブリノーゲンに接着した。この結果より、有意にクレソン抽出成分が多型核白血球の伸展を抑制していることが認められた。また、細胞接着とは、細胞が基質に付着し、かつ伸展を起こしている状態を示すものであるため、クレソン抽出物は伸展のみを抑制し、付着は抑制していないと考えられる。また、クレソンは従来、喘息に効果があると言われており、本発明の方法においてもクレソン抽出物が多型核白血球の細胞伸展を抑制していることから、本発明の方法は喘息などのアレルギー疾患に有効な薬剤のスクリーニングに有用であると考えられる。
【実施例３】
【００４３】
被験物質としてアクチンの重合阻害剤であるサイトカラシン（cytochalasin）Ｂを用いた多型核白血球の細胞接着能試験：
まず、実施例１記載の形態学的評価法と同様の方法で伸展率（％）を算出した。なお、検定は４回行いスタンダードエラー・バーを付した。結果を図６に示す。次に、実施例１記載のクリスタルバイオレット染色法と同様の方法で相対接着率（％）を算出した。なお、検定は３回行いスタンダードエラー・バーを付した。結果を図７に示す。
【００４４】
図６に示されるように、サイトカラシンＢを添加しないとき（濃度０μＭ）およびサイトカラシンＢを添加したとき（濃度２μＭ）の伸展率は、それぞれ約７７％および約２１％であった。一方、図７に示されるように、サイトカラシンＢを添加しないとき（濃度０μＭ）およびサイトカラシンＢを添加したとき（濃度２μＭ）の相対接着率（％）はそれぞれ約１０９％および約１１８％であった。これより、細胞接着とは、細胞が基質に付着し、かつ伸展を起こしている状態を示すものであるため、サイトカラシンＢは伸展のみを抑制し、付着は抑制していないと考えられる。また、細胞接着後の伸展が細胞内アクチン骨格系の再編成を必要とすることから、アクチンの重合阻害剤として知られているサイトカラシンＢがアクチンの重合を阻害したことにより伸展が抑制されたことが本発明の方法により認められた。したがって、本発明の方法は、被験物質（薬剤など）の多型核白血球の機能抑制効果を評価し、さらに細胞接着のみならず細胞移動を抑制するのに有効な薬剤のスクリーニングが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の実施例１の形態学的評価においてＨＥＰＥＳ緩衝液のｐＨを（ａ）ｐＨ７．２，（ｂ）ｐＨ６．９，（ｃ）ｐＨ６．６，（ｄ）ｐＨ６．３，（ｅ）ｐＨ６．０に変化させたときの細胞の顕微鏡像を示す。
【図２】本発明の実施例１の細胞伸展に対する細胞外ｐＨの影響を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例１の細胞接着に対するに対する細胞外ｐＨの影響を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例２のクレソン抽出物による細胞伸展の結果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例２のクレソン抽出物による細胞接着の結果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例３のサイトカラシンＢによる細胞伸展の結果を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例３のサイトカラシンＢによる細胞接着の結果を示すグラフである。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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