(57)【要約】      （修正有）【課題】選択性よく標的分子荷物をハイブリダイゼーションを介して微小管上に固定化することができ、搭載後も、標的分子荷物を移動させる。また、搭載した分子荷物は制限酵素によりリンカー部分のDNAが切断されることから分子荷物の降荷も可能である分子モータシステムを提供する。【解決手段】一本鎖のリンカーDNAが微小管上に結合しているリンカーDNAコンジュゲート微小管、キネシンが塗布された基板、緩衝液からなり、標的DNAを含むサンプルDNAとリンカーDNAコンジュゲート微小管とを反応させ、微小管上のリンカーDNAと相補的なDNA配列が修飾された標的分子荷物がハイブリダイゼーションによりDNAコンジュゲート微小管に固定化され、キネシンを塗布された基板上を移動することにより、選択的に目的の標的分子荷物を移動させ、制限酵素によりリンカーDNAを切断することで分子荷物を降荷する分子荷物の搭載降荷分子モータシステム。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖のリンカーDNAが微小管上に結合しているリンカーDNAコンジュゲート微小管、キネシンが塗布された基板、緩衝液からなり、標的DNAを含むサンプルDNAとリンカーDNAコンジュゲート微小管とを反応させ、微小管上のリンカーDNAと相補的なDNA配列が修飾された標的分子荷物がハイブリダイゼーションによりDNAコンジュゲート微小管に固定化され、キネシンを塗布された基板上を移動することにより、選択的に目的の標的分子荷物を移動させ、制限酵素によりリンカーDNAを切断することで分子荷物を降荷する分子荷物の搭載降荷分子モータシステム。
【請求項２】
標的DNAが蛍光標識されたものである請求項１に記載した分子荷物の搭載降荷分子モータシステム。
【請求項３】
微小管上のリンカーDNAと相補的なDNA配列が修飾された標的分子荷物において、さらに修飾するDNA配列を変更して一つの微小管上に数種類の分子荷物を積む請求項１又は請求項２に記載した分子荷物の搭載降荷分子モータシステム。
【請求項４】
標的分子荷物が、一本鎖のDNAが修飾された量子ドット（Q-dot）を含み、さらに、量子ドット（Q-dot）を修飾するDNAの配列には制限酵素により切断される配列を設計した請求項１ないし請求項３のいずれかに記載した分子荷物の搭載降荷分子モータシステム。
【請求項５】
キネシンが塗布された基板上において、一本鎖DNA標識された標的DNAを含むサンプルDNAを、一本鎖のプローブDNAコンジュゲート微小管と反応させる反応部位、移動したプローブDNAと相補結合した標的DNAを検出する検出部位が、通路で結ばれ、反応と移動と検出が緩衝液中で行われることを特徴とする請求項１に記載した分子モータシステム。
【請求項６】
一本鎖のリンカーDNAと微小管の結合が、アビジン化DNAとビオチン化微小管若しくは、ビオチン化DNAとアビジン化微小管により行われる請求項１ないし請求項５のいずれかに記載した分子荷物の搭載降荷分子モータシステム。
【請求項７】
移動した標的DNA又はサンプル分子荷物を、制限酵素により切断することに代えて、脱ハイブリダイゼーション（脱相補結合）により、微小管から分離する請求項１ないし請求項６のいずれかに記載した分子荷物の搭載降荷分子モータシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子モータシステムとその応用に関し、より詳しくは、DNAコンジュゲート微小管及びこれを移動させる基板を用いて、目的分子荷物を選択性良く搭載、輸送、降荷することができる分子荷物の搭載降荷分子モータシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
チューブリンタンパク質が線維状の会合体を形成している微小管は、分子の運動を誘導する経路として細胞内の輸送機構に携わっている。分子の輸送は、微小管系モータータンパク質であるキネシン及びダイニンによって行われる。これらのタンパク質は、ATP加水分解によるエネルギーを利用して、微小管に沿って一方向に運動して特定の目的地に分子を輸送する。
直径24 nmの細胞骨格線維である微小管は細胞内で様々な役割を果たしている。例えば、微小管は神経細胞軸索の中を通っており、細胞体と神経末端の間で物質や膜小胞の双方向の輸送を可能にしている。微小管はGTP結合チューブリンタンパク質サブユニットからなる会合体である。各々のサブユニットは、α−チューブリンおよびβ−チューブリンのヘテロ二量体である。チューブリンは2つのGTP分子に2つの異なる部位で結合し、3つのチューブリンは、不変のグリシンリッチ領域を共有し、その領域はヌクレオチド結合部位の1つへのアクセスの制御に関与していると考えられる。
【０００３】
Bachandらは、ビオチン化微小管を用いて、アビジン化されたQ-dotを微小管上に固定化し、輸送することに成功した（非特許文献１）。
【０００４】
Muthukrishnanらは、ガラス基板上に固定化されたプローブDNAと、アビジン結合微小管にビオチン化DNAを修飾したDNA結合微小管とのハイブリッド形成を行い、微小管のパターニングを行い、キネシンモーターを移動させた（非特許文献２）。
【０００５】
上記のキネシン-微小管系を用いて、目的物質を輸送させる研究が盛んに行われている。近年は、微小管を基板上に固定化し、キネシンの運動を観察する方法もあるが、微小管を固定化するのが難しい。そのため多くは、キネシンをガラス基板上に物理的に固定化させ、微小管を運動させるmotility assay(非特許文献３)が一般的に使用されている。
【０００６】
微細加工技術を用いて、単一方向に微小管を運動させる報告もなされており、人工的に離れた別の場所に目的物質を輸送することは可能である（非特許文献４）。
【０００７】
本発明者らは、微小管に一本鎖のプローブとなるDNAを修飾したDNAコンジュゲート微小管を開発し、標的DNAと選択的なハイブリダイゼーションに成功し、一塩基多型の検出に成功している（特許文献１）。
【非特許文献１】Bachand, G. D.; Rivera, S. B.; Boal, A.K.; Gaudioso, J.; Liu, J.; Bunker, B. C.; Nano Lett. 2004, 4, 817-821.
【非特許文献２】Muthukrishnan, G.; Roberts, C.A.; Chen, Y.C.; Zahn,J. D.; Hancock, W. O. Nano lett. 2004, 4, 2127-2132.
【非特許文献３】Vale, R. D.; Reese, T. S.; Sheetz, M. P. Cell.1985, 42, 39-50.
【非特許文献４】Hiratsuka, Y.; Tada, T.; Oiwa, K.;Kanayama, T.; Uyeda, T. Q. Biophys. J.2001．81,1555-1561.
【特許文献１】特願2005-023168
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
微小管の物質輸送能力の高さは公知の事実であり様々な応用例がある。しかし、微小管に直接、輸送したい物質、特に高分子量の物質を修飾することは困難であり、修飾効率も低い。
また一度搭載した分子荷物は共有結合的に微小管に修飾しており、降荷できないシステムである。荷物を搭載して、目的地まで輸送し搭載した分子荷物を降荷するというシステムの構築は不可能であった。本発明者は、これまでにDNAコンジュゲート微小管の開発に成功しており（特許文献１）、新規のDNA解析法を提案している。このDNAコンジュゲート微小管を用いることで、高効率に分子荷物を微小管に搭載することが可能になる。また、この搭載した分子荷物はDNAハイブリダイゼーションを介して微小管に修飾されているため、制限酵素や脱ハイブリダイゼーション（脱相補結合）により切り離すことが可能である。このように、分子荷物を搭載、輸送、降荷した例は知られていない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために本発明は、微小管表面上プローブとなる一本鎖DNAを導入したDNAコンジュゲート微小管を使用し、微小管の運動を妨げることなく選択的な分子荷物（Q-dot）の搭載、降荷を可能にした。このことより、搭載部位から微小管を輸送し目的地（降荷部位）での分子荷物の降荷が可能であることを見出した。
すなわち、本発明は、一本鎖のリンカーDNAが微小管上に結合しているリンカーDNAコンジュゲート微小管、キネシンが塗布された基板、リンカーDNA修飾分子荷物（Q-dot）、緩衝液からなり、サンプル分子荷物とリンカーDNAコンジュゲート微小管とを反応させ、サンプル分子荷物がハイブリダイゼーションを介してDNAコンジュゲート微小管に固定化され、キネシンを塗布された基板上を移動することにより、選択的に目的の分子荷物を移動させる分子モータシステムを見出し、本発明の分子モータシステムは、キネシンが塗布された基板上において、DNA標識されたサンプル分子荷物を一本鎖のリンカーDNAコンジュゲート微小管と反応させた後に制限酵素により搭載した微小管上の分子荷物を降荷することが可能であり、搭載と移動と降荷が緩衝液中で行われる。すなわち、本発明は、
一本鎖のリンカーDNAが微小管上に結合しているリンカーDNAコンジュゲート微小管、キネシンが塗布された基板、緩衝液からなり、標的DNAを含むサンプルDNAとリンカーDNAコンジュゲート微小管とを反応させ、微小管上のリンカーDNAと相補的なDNA配列が修飾された標的分子荷物がハイブリダイゼーションによりDNAコンジュゲート微小管に固定化され、キネシンを塗布された基板上を移動することにより、選択的に目的の標的分子荷物を移動させ、制限酵素によりリンカーDNAを切断することで分子荷物を降荷する分子荷物の搭載降荷分子モータシステムである。
また、本発明は、標的DNAを蛍光標識することができる。
さらに本発明は、微小管上のリンカーDNAと相補的なDNA配列が修飾された標的分子荷物において、さらに修飾するDNA配列を変更して一つの微小管上に数種類の分子荷物を積むことができる。
また、本発明は、標的分子荷物が、一本鎖のDNAが修飾された量子ドット（Q-dot）を含み、さらに、量子ドット（Q-dot）を修飾するDNAの配列には制限酵素により切断される配列を設計することができる。
さらに本発明は、キネシンが塗布された基板上において、一本鎖DNA標識された標的DNAを含むサンプルDNAを、一本鎖のプローブDNAコンジュゲート微小管と反応させる反応部位、移動したプローブDNAと相補結合した標的DNAを検出する検出部位が、通路で結ばれ、反応と移動と検出が緩衝液中で行うことができる。
また、本発明は、一本鎖のリンカーDNAと微小管の結合が、アビジン化DNAとビオチン化微小管若しくは、ビオチン化DNAとアビジン化微小管により行うことができる。
またさらに、本発明は、移動した標的DNA又はサンプル分子荷物を、制限酵素により切断することに代えて、脱ハイブリダイゼーション（脱相補結合）により、微小管から分離することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、荷物を搭載して、目的地まで輸送し搭載した分子荷物を降荷するというシステムを構築し、それが現実に実現できることを立証した。さらに、リンカーとなるDNA配列を種々の制限酵素認識サイトにすることで、複数種の分子荷物を搭載後、選択的に任意の分子荷物だけを降荷することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の分子モータシステムの概略を、図１を用いて説明する。
本発明においては、微小管上にリンカーとなる一本鎖リンカーDNAを導入した形のDNAコンジュゲート微小管を用いて、リンカーDNAと相補的なDNAを修飾した分子荷物(Q-dot)とハイブリダイゼーション（相補結合）させることができ、分子荷物を搭載、移動させることができる(図 1A)。    
また、本発明においては、DNA配列に制限酵素で切断される配列を設計することで、ハイブリダイゼーション後リンカーDNAを切断することで搭載した分子荷物の降荷が可能になる(図 1B)。
また、本発明においては、リンカーとなるDNA配列を種々の制限酵素認識サイトにすることで、複数種の分子荷物を搭載後、選択的に任意の分子荷物だけを降荷することも可能である(図 1C)。
本発明で用いるDNAコンジュゲート微小管を製造するに際して、用いられる微小管は、何でも良いが、とくに、蛍光物質であるローダミン、もしくはビオチン修飾チューブリンからなるものを好ましく用いることができる。
また、本発明において一本鎖のプローブDNAと微小管の結合は、どのような結合でも良いが、アビジン化DNAとビオチン化微小管若しくは、ビオチン化DNAとアビジン化微小管により行うことができる。好ましくは、アビジン化DNAとビオチン化微小管が良い。
さらに、本発明の分子モータシステムでは、キネシンが塗布された基板上において、蛍光標識された標的DNAを含むサンプルDNAを一本鎖のプローブDNAコンジュゲート微小管と反応させる反応部位、移動したプローブDNAと相補結合した標的DNAを検出する検出部位が、通路で結ばれ、反応と移動と検出が緩衝液中で行われるが、代表的には図１Dに示される装置が簡便である。すなわち、基板ガラスに一定間隔で２本の両面接着テープを張り付け、上からカバーグラスを載せる。ガラス基板面のカバーグラスに、微細加工により、反応部位と通路と検出部位を刻っておくと良い。
緩衝液としては、一本鎖のプローブDNA、サンプルDNA、キネシン等が活発に動けるものあればどのようなものでも良いが、代表的のものは、アッセイバッファー (10 mM Tris-acetate (pH 7.5), 50 mM potassium acetate, 2.5 mM EGTA, 4 mM magnesium sulfate)を挙げることができる。
蛍光物質としては、何でも良いが、身近にあるものとしては、ローダミン、FITC、BODIPY、Oregon Green 514、Cy dyeシリーズを挙げることができる。とくにローダミンが好ましく用いられる。
微小管を構成するチューブリンモノマーのビオチン化に際して、リンカーの長さは特に限定されるものではないが、身近にあるものとしては、Pierce社製の、Biotin-(Long Arm)-NHS、EZ-link NHS-LC-LC-Biotinを挙げることができる。とくにBiotin-(Long Arm)-NHSが好ましく用いられる。
用いる分子荷物は、特に限定されるものではない。身近にあるものとしては、Quantum dot社製のQ-dot（Qd）シリーズを挙げることができる。とくにQd-525、Qd-655が好ましく用いられる。また、DNA結合タンパク質なども分子荷物として挙げられる。
またさらに、本発明において、制限酵素により切断することに代えて、脱ハイブリダイゼーション（脱相補結合）により、微小管から分離することができるが、脱ハイブリダイゼーション（脱相補結合）は、温度をDNA２重鎖の脱ハイブリダイゼーション温度（Tm.）以上にするか、溶液をアルカリ雰囲気にする等の従来から知られている方法を用いることが出来る。
【実施例１】
【００１２】
（DNA修飾ストレプトアビジン（SA）の調製）
SAに共有結合的にDNAを修飾する方法を用いた(非特許文献  C.M. Niemeyer, T. Sano, C.L. Smith and C.R. Cantor, Nucleic Acid Reserch, 1994, 22, 5530-5539)。
([N-e-maleimidocaproyloxy]sulfosuccinimide ester) (sulfo-EMCS)によってSAにマレイミド基を付与した。得られたマレイミド化SAに末端チオール化DNAを加えて反応させた。未反応のマレイミド基をつぶすために、メルカプトエタノールを添加した。
（Q-dot修飾DNA (Q-DNA)の調製）
市販のQ-dot（抗体標識キット）の表面を4-(maleimidomethyl)-1-cyclohexanecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester  (SMCC)によりマレイミド化し、末端チオール化DNAを共有結合的に修飾した。未反応のマレイミド基をつぶすために、メルカプトエタノールを添加した。
（微小管の調製）
用いた微小管は、ローダミン修飾／ビオチン化チューブリン (仕込み比 1:1)を BRP80 (80 mM PIPES, pH 6.8, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10 % glycerol, 5 mM GTP) 緩衝液に懸濁し 37 °C で40分間  インキュベートさせ、最後にタキソールで微小管を安定させることでローダミン修飾／ビオチン化-微小管(以下微小管)を調製した。 
微小管の運動性を評価するために、キネシンをガラス基板上に固定化して微小管の観察を行う方法(motility assay)を採用した。微小管には蛍光物質であるローダミンが修飾してあるため顕微鏡でその運動を可視化できる。
スライドガラス、カバーガラスを用いて作製した図１Dのようなフローチャンバーを用いてDNAコンジュゲート微小管の特性評価を行った。フローチャンバー内にアッセイバッファー (10 mM Tris-acetate (pH 7.5), 50 mM potassium acetate, 2.5 mM EGTA, 4 mM magnesium sulfate) 中に溶解したキネシン溶液を挿入し物理的に基板にキネシンを固定化した。その後、微小管溶液を同様にフローチャンバー内に挿入し微小管を基板上に固定化した。
(DNAコンジュゲート微小管の調製と運動確認)
SA-DNAを上記の微小管固定化基板に加えて微小管上に一本鎖のリンカーDNAを固定化した。
（Qd-DNAのハイブリダイゼーション（搭載）と制限酵素による切断（降荷））
DNAコンジュゲート微小管と、Qd-DNAとのハイブリダイゼーションを行った。キネシン固定化基板に前述と同様にDNAコンジュゲート微小管を調製し、続けてQd-655または、Qd-525修飾DNA［完全相補鎖、非相補鎖I（ポリチミン配列）、］の２種類（10 ng mL-1）の混合溶液を加えて、30分間、室温でインキュベートした。洗浄後、蛍光顕微鏡を用いて、微小管の運動、DNAのハイブリダイゼーションを観察した。ハイブリダイゼーションによる分子荷物の搭載を確認後、制限酵素（Eco RIまたは、Eco RV）を基板に導入し、１０分間３７°Cでインキュベーションした。その後、蛍光顕微鏡にて微小管上のQ-dotの存在を確認した。
【００１３】
微小管（図２A-I）上からQd-655（完全相補鎖DNAが修飾）の蛍光が観察された（図２A-II）。しかし、Qd-525（非相補鎖DNAが修飾）（図２A-III）の蛍光は観察されなかった。これらより、DNAコンジュゲート微小管が、選択性よく完全相補鎖のみとハイブリダイゼーションして、分子荷物であるQdを搭載していることが確認できる。
Qdの種類によって搭載、降荷に影響がないことを証明するために、Qd-525（完全相補鎖DNAが修飾）、Qd-655（非相補鎖DNAが修飾）の組み合わせでも同等の実験を行った。結果、Qd-525（完全相補鎖DNAが修飾）の蛍光は観察されたがQd-655（非相補鎖DNAが修飾）の蛍光は観察されなかった。このことより、分子荷物の種類に応じてDNAコンジュゲート微小管が、選択性よく完全相補鎖のみとハイブリダイゼーションして、分子荷物であるQdを搭載していることが確認できる。
次に、この分子荷物搭載後のDNAコンジュゲート微小管の運動性能について評価した。実験は、ATP存在下で行った。結果より、DNAコンジュゲート微小管はハイブリダイゼーション後もキネシン固定化基板上を移動することができた（図３）。その際の速度は、0.43±0.057  mm s-1であった。これは、微小管のみの速度（0.5 mm s-1）とほぼ同等であることから、分子荷物を搭載したことで微小管の輸送能力には影響がないことがわかる。
【００１４】
（制限酵素によるQ-dot DNAの微小管上からの切り離し）
本発明の分子モータシステムで用いるDNAコンジュゲート微小管が、分子荷物を搭載するだけでなく、制限酵素により、リンカーDNAを切断することで分子荷物を降荷できること確認した。Eco RVをQd-655搭載微小管固定化基板にインジェクションし、洗浄後基板を観察すると、Qd-655の蛍光は観察されなかった（図２B-I, II）。このことより、制限酵素による分子荷物の降荷に成功した。
【００１５】
（複数種の分子荷物の搭載と、選択的降荷）
Qd-DNA 655はEco RIで、Qd-DNA 525はEco RVで切断されるように配列を設計し、双方のQdを微小管上に搭載させた、表１に代表的なものを示す。
【表１】
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上記のDNA配列は、次のような意味を持つものである。DNA配列 (A) Qd側修飾DNA（含Eco RV切断配列）、DNA配列（B）SA側修飾DNA（含Eco RV切断配列）、DNA配列（C）Qd側修飾DNA（コントロール配列）、DNA配列（D）Qd側修飾DNA（含Eco RI切断配列）、DNA配列（E）SA側修飾DNA（含Eco RI切断配列）。５末端はすべてチオール化されたものを使用している。
結果より、双方のQdの蛍光が微小管上から観察された（図４A）。続いて、Eco RVをインジェクションし洗浄後、基板を観察すると、微小管上からQd-525の蛍光が観察されなくなった。しかし、Qd-655の蛍光は観察された（図４B）。この基板にEco RIをインジェクションし洗浄後、微小管上からQd-655の蛍光が観察されなくなった。以上のことより、複数種の分子荷物(Qd)をDNA配列と制限酵素の種類によって、選択的に微小管上から降ろすことに成功した。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明の分子モータシステムは、標的分子荷物をDNAハイブリダイゼーションを利用して簡便に微小管上に搭載することができ、また、制限酵素により搭載した分子荷物を降ろすこともできる。また、複数種の分子荷物を同時に搭載することも可能であり、選択性よく任意の分子荷物を降ろすことも可能である。基板に制限酵素を固定化する技術を併せて用いれば、分子荷物を輸送するばかりか、任意の場所に、任意の分子荷物だけを降ろすことも可能になり、バイオマシンとして有用なばかりか、この分野に広く応用できる可能性を秘めたものであり、産業上の利用可能性は極めて高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】本発明のDNAコンジュゲート微小管の分子荷物搭載概念図
【図１Ｂ】本発明のDNAコンジュゲート微小管の分子荷物降荷概念図
【図１Ｃ】本発明のDNAコンジュゲート微小管の複数種の分子荷物搭載と選択的降  荷概念図
【図１Ｄ】検出システムの概念図
【図２Ａ】分子荷物の搭載：DNAコンジュゲート微小管の蛍光像  (I)微小管に修飾されているローダミンの蛍光、(II)Qd-655(完全相補鎖)の蛍光、(III)Qd-525(コントロール配列)の蛍光。
【図２Ｂ】分子荷物の降荷（制限酵素をインジェクション後）：DNAコンジュゲート微小管の蛍光像  (I)微小管に修飾されているローダミンの蛍光、(II)Qd-655(完全相補鎖)の蛍光。
【図３】Q-dot搭載DNAコンジュゲート微小管のキネシン固定化基板上での輸送の様子。（＊写真は微小管に修飾されているローダミンの蛍光を観察）（A）０秒後、（B）６０秒後。
【図４Ａ】複数種の分子荷物の搭載：DNAコンジュゲート微小管の蛍光像  (I)微小管に修飾されているローダミンの蛍光。(II)Qd-655(含EcoRIで切断配列)の蛍光、(III)Qd-525(含EcoRVで切断配列)の蛍光。
【図４Ｂ】選択的分子荷物の降荷（制限酵素Eco RVをインジェクション後）：DNAコンジュゲート微小管の蛍光像  (I)微小管に修飾されているローダミンの蛍光。(II)Qd-655の蛍光、(III)Qd-525の蛍光。
【図４Ｃ】選択的分子荷物の降荷（制限酵素Eco RIをインジェクション後）：DNAコンジュゲート微小管の蛍光像  (I)微小管に修飾されているローダミンの蛍光。(II)Qd-655の蛍光。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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