(57)【要約】      （修正有）【課題】検出能の高い改良型ＨＡタグ，及びそのような改良型ＨＡタグを用いた目的タンパク質のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】基本的には，特定なる配列で示されるＨＡタグのアミノ酸配列（YPYDVPDYA）を３回繰り返したアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する改良型ＨＡタグなどを用いれば，目的タンパク質を従来に比べて効果的に検出できるという知見に基づくものである。なお，特定なる配列で示されるアミノ酸配列は，ＨＡタグのアミノ酸配列を３回繰り返すものであるが，その２つの繰り返し地点にアミノ酸残基としてＧ（グリシン）を２個含んでいる。【選択図】  図９
2006271285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド，又はその塩。
【請求項２】
タグとして用いられる請求項１に記載のポリペプチド，又はその塩。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む，組換えベクター。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換させた形質転換体を用いたＨＡタグ認識抗体を有するタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項８】
配列番号１で示されるアミノ酸配列から，１〜４個のアミノ酸が置換，欠失，付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり，ＨＡタグ認識抗体と結合するポリペプチド，又はその塩。
【請求項９】
請求項８に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項８に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む，組換えベクター。
【請求項１２】
請求項８に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
【請求項１３】
請求項８に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換させた形質転換体を用いたＨＡタグ認識抗体を有するタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド，又はその塩。
【請求項１５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列から，１〜４個のアミノ酸が置換，欠失，付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み，ＨＡタグ認識抗体と結合するポリペプチド，又はその塩。
【請求項１６】
タグとして用いられる請求項１４又は請求項１５に記載のポリペプチド，又はその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は，改良型ＨＡタグ及び改良型ＨＡタグを用いたスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
目的タンパク質を分析する目的で，“タグ”が用いられている。このようなタグとして，細胞エピドープやウイルスエピドープを用いたものが知られている。それらのうちでもウイルスエピドープは，アミノ酸配列が通常は細菌や真核生物などのタンパク質中では生じないものであるから，細菌や細胞系において，交差反応が起こりにくいなどの利点がある。
【０００３】
そのようなウイルスエピドープの中で，ＨＡタグが知られている。ＨＡタグは，ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニン由来のものである。このエピトープはアミノ酸配列YPYDVPDYA（98−106：配列番号２）を有する(非特許文献１「Field, J. et. al., (1988),Mol. Cell. Biol. Vol.8, No.5, 2159-2165」及び 非特許文献２「Wilson et. al., Cell 37, 767-778, (1984)」)。
【０００４】
このエピトープに対するモノクローナル抗体（mAB）が報告され，例えばmAB 1 2CA5(P.A.Kolodziej及びYoung,R.A.,Meth.Enzymol. (1991), Vol.194, 508-519; Chen,Y.T.ら，(1993), Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.90, 6508-6512)および抗HA−Bab Coなどが利用できる。しかしながら，これらの抗体を用いても，親和性が十分高いものではないので，したがって融合タンパク質を高感度に検出するためには，このエピトープ特異的抗体を高濃度で使用しなければならず，例えばウエスタンブロットにおける交差反応として顕在化する非特異的相互作用につながり得るという問題があった(Chenら，p.6510を参照のこと)。
【０００５】
なお，ＨＡタグ付きグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの改良ＨＡタグも知られている（下記特許文献１「特表２００１−５０２９０２号公報」）。
【０００６】
【特許文献１】特表２００１−５０２９０２号公報
【非特許文献１】Field, J. et. al., (1988),Mol. Cell. Biol. Vol.8, No.5, 2159-2165
【非特許文献２】Wilson et. al., Cell 37, 767-778, (1984)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は，検出能の高い改良型ＨＡタグ，及びそのような改良型ＨＡタグを用いた目的タンパク質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は，基本的には配列番号２で示されるＨＡタグのアミノ酸配列（YPYDVPDYA）を３回繰り返したアミノ酸配列を含むアミノ酸配列（配列番号１）を有する改良型ＨＡタグなどを用いれば，目的タンパク質を従来に比べて効果的に検出できるという知見に基づくものである。なお，配列番号１で示されるアミノ酸配列は，ＨＡタグのアミノ酸配列を３回繰り返すものであるが，その２つの繰り返し地点にアミノ酸残基としてＧ（グリシン）を２個含んでいる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば，後述する実施例において証明されたとおり，効果的に目的タンパク質を検出できる改良型ＨＡタグ及びそのような改良型ＨＡタグを用いた目的タンパク質のスクリーニング方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下，本発明の改良型ＨＡタグなどについて説明する。本発明のポリペプチド又はその塩は，「配列番号１で示されるアミノ酸配列（YPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYA）からなるポリペプチド又はその塩」，「配列番号１で示されるアミノ酸配列から，１〜４個のアミノ酸が置換，欠失，付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり，ＨＡタグ認識抗体と結合するポリペプチド，又はその塩」，「配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド，又はその塩」又は「配列番号１で示されるアミノ酸配列から，１〜４個のアミノ酸が置換，欠失，付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み，ＨＡタグ認識抗体と結合するポリペプチド，又はその塩」であり，タグなどとして好適に用いられる。
【００１１】
「配列番号１で示されるアミノ酸配列から，１〜４個のアミノ酸が置換，欠失，付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド，又はその塩」は，「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその塩」と実質的に同質の機能を有するものである。すなわち，ＨＡタグ認識抗体と結合し，タグとして機能するものであり，たとえばＨＡタグを認識するタンパク質との結合能が，「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその塩」とくらべて，０．１倍〜１０倍，０．５倍〜２倍，又は０．８倍〜１．１倍のものをいう。この結合能を測定するためには，公知のスクリーニング方法などを用いることができる。
【００１２】
「ポリペプチド，又はその塩」における塩として，酸または塩基との生理学的に許容される塩があげられ，生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩として，例えば，無機酸（例えば，塩酸，リン酸，臭化水素酸，硫酸）との塩，あるいは有機酸（例えば，酢酸，ギ酸，プロピオン酸，フマル酸，マレイン酸，コハク酸，酒石酸，クエン酸，リンゴ酸，蓚酸，安息香酸，メタンスルホン酸，ベンゼンスルホン酸）との塩などがあげられる。
【００１３】
本発明のポリペプチド又はその塩は，細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって単離精製し，製造することもできるし，本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。
【００１４】
本発明のポリペプチド又はその塩は，公知のタンパク質合成法（例えば，M. Bodanszky 及びM.A. Ondetti，ペプチド合成(Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)に記載の方法）により製造することもできる。反応後は通常の精製法，例えば，溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のペプチドを精製単離することができる。具体的には，下記の実施例における方法により製造できる。
【００１５】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては，上記した本発明のポリペプチドをコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ，好ましくはＤＮＡ）からなるもの，又はそれらを含むものがあげられる。このようなＤＮＡは，たとえば合成することにより作製できる。具体的には，後の実施例で合成された，プライマーＡ，プライマーＢ，または合成オリゴマーａ〜dのいずれか，又はこれらと実質的に同一のポリヌクレオチドなどがあげられる。
【００１６】
公知の方法によりクローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま，または所望により制限酵素で消化したり，リンカーを付加したりして使用することができる。そのＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し，また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは，適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００１７】
本発明のポリペプチドの発現ベクター（組換ベクター）は，例えば，本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ（例えば，ｃＤＮＡ）から目的とするＤＮＡ断片を切り出し，その後にそのＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００１８】
具体的な組換えベクターとして，後の実施例において作製されたプラスミドpCST2,pCM530, p3HA-N1,又はp3HA-C1があげられる。
【００１９】
ベクターとして，大腸菌由来のプラスミド（例えば，ｐＣＲ４，ｐＣＲ２．１，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３），枯草菌由来のプラスミド（例，ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４），酵母由来プラスミド（例，ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５），λファージなどのバクテリオファージ，レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他，ｐＡ１−１１，ｐＸＴ１，ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲｃ／ＲＳＶ，ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
【００２０】
宿主としては，例えば，エシェリヒア属菌，バチルス属菌，酵母，昆虫細胞，昆虫，動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては，エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１などを用いることができる。酵母としては，分裂酵母があげられ，例えば，サッカロマイセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ- ，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２，シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６，ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などを用いることができる。
【００２１】
本明細書において「組換えベクターで形質転換させた形質転換体」とは，所定の配列を含むベクターを用いて，遺伝子組換えによって目的とするアミノ酸配列を含む形質転換体を作成することを意味する。具体的には，実施例において，作出された改良型ＨＡタグ配列を含む分裂酵母などがあげられる。
【００２２】
エシェリヒア属菌を形質転換するには，例えば，プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００２３】
バチルス属菌を形質転換するには，例えば，モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００２４】
酵母を形質転換するには，例えば，メッソズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１），プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８)などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００２５】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては，例えば，グルコース，カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために，例えば，３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【００２６】
宿主がエシェリヒア属菌の場合，培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない，必要により，通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合，培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない，必要により通気や撹拌を加えることもできる。
【００２７】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際，培地としては，例えば，バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.ら，「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)」や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら，「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）」があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約
２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない，必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２８】
上記の培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには，例えば，下記の方法により行なうことができる。本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては，培養後，公知の方法で菌体あるいは細胞を集め，これを適当な緩衝液に懸濁し，超音波，リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち，遠心分離やろ過によりレセプタータンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や，トリトンＸ−１００TM などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には，培養終了後，公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し，上清を集める。このようにして得られた培養上清，あるいは抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は，公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離，精製法としては，塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法，透析法，限外ろ過法，ゲルろ過法，およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法，イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法，アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法，逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法，等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００２９】
このようにして製造される本発明のポリペプチド又はその塩は，タグとして有効に利用できる。その用途のひとつとして，本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換させた形質転換体を用いたＨＡタグ認識抗体を有するタンパク質のスクリーニング方法があげられる。
【００３０】
より具体的には，本発明の改良型ＨＡタグを用いれば，目的タンパク質を発現する誘導性のクローンを同定できる。また，免疫共沈降を用いれば，タンパク質相互作用を分析でき，また目的タンパク質が細胞内で局在している様子を検出することもできる。さらにＨＡタグに特異的に反応するポリクローナル抗体を用いてウェスタン分析などを行なうことにより，タンパク質を発現するコロニーなどを直接スクリーニングすることもできる。
【００３１】
配列表の配列番号は，以下の配列を示す
[配列番号１]  本発明の改良型ＨＡタグに含まれるアミノ酸配列
[配列番号２]  ＨＡタグのアミノ酸配列
[配列番号３]  実施例におけるプライマー３ＨＡ−Ｂａｍの塩基配列
[配列番号４]  実施例におけるプライマー３ＨＡ−Ｂｇｌの塩基配列
[配列番号５]  実施例における合成オリゴマーａの塩基配列
[配列番号６]  実施例における合成オリゴマーｂの塩基配列
[配列番号７]  実施例における合成オリゴマーcの塩基配列
[配列番号８]  実施例における合成オリゴマーdの塩基配列
【実施例１】
【００３２】
＜改良型ＨＡタグ含有ベクター（pCST2）の製造＞改良型ＨＡタグ含有ベクター（pCST2），及びそのプラスミドベクターを用いた形質転換体を以下のようにして製造した。まず，改良型ＨＡタグとなる塩基配列を含む，３ＨＡ−Ｂａｍ（配列番号３）及び３ＨＡ−Ｂｇｌ（配列番号４）を合成した。それぞれの濃度は，１００ピコモル／マイクロリットルであった。３ＨＡ−Ｂａｍ（配列番号３）及び３ＨＡ−Ｂｇｌ（配列番号４）を同量ずつ混和した。混和液を100℃で5分間ボイルした後，自然冷却させた。この冷却液をＡ液とし，フラグメントとして用いた。
【００３３】
プライマー：３ＨＡ-Ｂａｍ（100pmol/マイクロリットル）：（配列番号３）
GATCCTATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCTGGTTACCCTTATGACGTCCCTGACTACGCTGGTTATCCATACGATGTTCCAGATTATGCAGGAA
プライマー：３ＨＡ-Ｂｇｌ（100pmol/マイクロリットル）：（配列番号４）
GATCTTCCTGCATAATCTGGAACATCGTATGGATAACCAGCGTAGTCAGGGACGTCATAAGGGTAACCAGCATAATCAGGAACATCATAAGGATAG
【００３４】
プラスミドpCST3（図１参照）,を制限酵素BamHIで切断した。この制限酵素で消化された液をＢ液とした。Ａ液，Ｂ液，及びライゲーションハイ（Ligation High）（宝酒造：TaKaRa）を5:1:4の割合で混和し，16℃で2時間反応させてＤＮＡ結合反応を行った。反応液を大腸菌に形質転換し，大腸菌を増殖し，増幅された大腸菌からＤＮＡを精製した。そして，シークエンサーを用いて，その配列を確認した。なお，図中，Plasmid nameは，プラスミドの名前を示し，Plasmid sizeは，プラスミドのサイズを示し，Constructed by は，作出者を示し，Constructed date は，作出日を示し，Commnet&Referenceは，コメントと参照文献を示す（以下の図においても同様である）。
【実施例２】
【００３５】
＜改良型ＨＡタグ含有ベクター（pCM530）の製造＞改良型ＨＡタグ含有ベクター（pCM530），及びそのプラスミドベクターを用いた形質転換体を以下のようにして製造した。プラスミドpCST2（図２参照）を制限酵素PstIとSacIで切断した。これらの制限酵素により切り出された約2.3Kbの断片を回収し，A液とした。プラスミドpRK405（図３参照），を制限酵素PstIとSacIで切断した。これらの制限酵素により切り出された液をB液とした。A液とB液とLigation High（TaKaRa）を5:1:4の割合で混和した。混和液を16℃で2時間反応させてDNA結合反応を行った。反応液を大腸菌に形質転換し，大腸菌を増殖し，増幅された大腸菌からDNAを精製した。そして，シークエンサーを用いて，フラグメントが挿入されていることを確認した。なお，得られた改良型ＨＡタグ含有ベクター（pCM530）の開裂地図を図４に示す。
【実施例３】
【００３６】
＜C末端融合型改良型ＨＡタグ含有ベクターp3HA-C1の作製＞哺乳類細胞発現系の改良型ＨＡタグ含有ベクターをクローンテック（Clontech）社のpEGFP-N1，及びpEGFP-C1のEGFP部分を合成した改良型ＨＡタグ含有フラグメントに組換えることで作製した。まず，改良型ＨＡタグをコードする配列の各末端に制限酵素AgeI認識部位およびBglII認識部位を持つ合成DNAオリゴマーa（配列番号５）および，その相補鎖である合成オリゴマーb（配列番号６）を合成した。準備した。合成オリゴマーaと合成オリゴマーbとを同量ずつ混合し，100℃の湯浴中で5分加熱し，室温まで自然冷却してアニーリングさせ，フラグメントを調製した。
【００３７】
合成オリゴマーa(100 pmol/マイクロリットル)：配列番号５CCGGTCGCCACCATGTATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCTGGTTACCCTTATGACGTCCCTGACTACGCTGGTTATCCATACGATGTTCCAGATTATGCAGGATCCGGACTCA
合成オリゴマーb(100 pmol/マイクロリットル)：配列番号６GATCTGAGTCCGGATCCTGCATAATCTGGAACATCGTATGGATAACCAGCGTAGTCAGGGACGTCATAAGGGTAACCAGCATAATCAGGAACATCATAAGGATACATGGTGGCGA
【００３８】
制限酵素AgeIおよびBglIIによりプラスミドDNA pEGFP-C1(Clontech)1マイクロgを50マイクロリットルの反応系で消化し，生じたEGFP断片をアガロースゲル電気泳動により取り除き，EGFP以外のベクター画分をQIAquick （ゲル抽出キット：Gel Extraction Ki；tキアゲン：QIAGEN社製)により精製した。このようにして得られた(1)フラグメント，(2)ベクター，(3)Ligation High(TAKARA)を，4：1：5の容量比で混合し，Ligation High(TAKARA)の製品マニュアルに従い，16℃で2時間反応させDNA結合反応を行った。得られた反応産物を大腸菌DH5αに導入して形質転換させた。反応産物のプラスミドベクターが持つカナマイシン耐性を獲得した大腸菌のクローンを選択し，フラグメントが組み込まれたことを確認した。このクローンから調製したプラスミドDNAのシークエンス解析を行い，構造を確認した。このシークエンス情報とpEGFP-C1のシークエンス情報をもとに，得られたC末端融合型改良型ＨＡタグ含有ベクターp3HA-C1の構造を模式的に図５に示す。図５は，実施例で得られたプラスミドp3HA-C1の開裂地図である。
【実施例４】
【００３９】
＜N末端融合型改良型ＨＡタグ含有ベクターp3HA-N1の作製＞改良型ＨＡタグをコードする配列の各末端に制限酵素AgeI認識部位およびNotI認識部位を持つ合成DNAオリゴマーc（配列番号７）および，その相補鎖である合成オリゴマーd（配列番号８）を準備し，上記の実施例（p3HA-C1作製）の場合と同様にしてフラグメントを調製した。
【００４０】
合成オリゴマーc(100 pmol/マイクロリットル)：配列番号７CCGGTCGCCACCATGTATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCTGGTTACCCTTATGACGTCCCTGACTACGCTGGTTATCCATACGATGTTCCAGATTATGCAGGATAAAGC
合成オリゴマーd(100 pmol/マイクロリットル)：配列番号８GGCCGCTTTATCCTGCATAATCTGGAACATCGTATGGATAACCAGCGTAGTCAGGGACGTCATAAGGGTAACCAGCATAATCAGGAACATCATAAGGATACATGGTGGCGA
【００４１】
クローンテック社製プラスミドpEGFP-N1を制限酵素AgeIおよびNotIで消化し，生じたEGFP断片をアガロース電気泳動により取り除き，EGFP以外のベクター画分をQIAquick Gel Extraction Kit(GIAGEN)により精製した。以下，p3HA-C1と同様の手順でN末端融合型改良型ＨＡタグ含有ベクターp3HA-N1を作製し，構造を確認した。このシークエンス情報とpEGFP-N1のシークエンス情報をもとに，プラスミドp3HA-N1の構造を模式的に図６に示す。図６は，実施例で得られたプラスミドp3HA-N1の開裂地図である。
【実施例５】
【００４２】
＜改良型ＨＡタグを用いた蛍光測定＞プラスミドpYC36を制限酵素BamHIで切断し，切り出される約350bpの断片を回収した。なお，図７は実施例で用いたプラスミドpYC36の開裂地図であり，BAFをencodeする部位を含み，制限酵素BamHIで消化すると，BAFを含むDNA断片が切り出されるようになっている。このようにして回収された液をA液とした。実施例２で得られた改良型ＨＡタグ含有ベクターpCM530を制限酵素bglIIで消化し，B液とした。A液とB液とLigation High（TaKaRa）を5:1:4の割合で混和した。混和液を16℃で2時間反応させてDNA結合反応を行った。反応液を大腸菌に形質転換し，大腸菌を増殖した。増殖した大腸菌からDNAを精製し，そのシークエンスから，フラグメントが挿入されていることを確認した。
【００４３】
このようにして得られたフラグメントを分裂酵母に形質転換し，EMM2-Leu+Thiプレートにまいて32℃で3-4日培養した。プレートに形成されたシングルコロニーをEMM2-Leu+Thiプレートに塗り広げ，32℃で3日間培養した。その後，プレートからPEMで菌体を回収した。回収した菌液の中に以下の直接固定液を加えた。すなわち，１０分の１容量の３７％ホルマリン及び２５０分の１容量の２５％グルタルアルデヒドを加え，32℃で10分間反応させた。PEMで１時間程度，液を１０分か１５分おきに交換しながら菌を洗った。１ｍｌのＰＥＭＳに，0.5 mg/ml Zymolyase 100T と 0.2 mg/ml ノボザイム（Novozyme） を加えた溶液を用いて，36℃で反応させることにより消化をおこなった。１時間後に等量の酵素をくわえて，さらに１時間反応させた。その後，PEMで2回菌を洗った。100分の1容量のトリトン（Triton）X-100を加え，室温で５分間反応させた。その後，PEMで2回菌を洗った。0.1Ｍ グリシン（Glycine）PEM  で１０分間菌を洗った。この作業を２回繰り返し集菌した。PEMBL+250分の1容量のバブコ（Babco）anti-HA（一次抗体）を室温で数時間反応させた。その後，PEMで３回菌を洗って集菌した。PEMBLと250分の1容量のテキサスレッド（TexasRed） anti-mouse IgG（二次抗体）を室温で数時間反応させた。その後，PEMで３回菌を洗って集菌した。適量のPEMに菌を懸濁した。なお，本実施例において用いた各試薬は以下のとおりである。
PEM: 100 mM PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH6.9
PEMS: PEM + 1.2 M ソルビトール（sorbitol）
PEMBL: PEM + 1% BSA, 100 mM リジン塩酸塩（lysine hydrochloride）
【００４４】
先の実施例で得られた改良型ＨＡタグに分裂酵母タンパク質Ｘを連結させたＨＡ-Ｘタンパク質を分裂酵母の細胞に発現させて，ＨＡを認識する抗ＨＡ抗体を用いた間接蛍光抗体法により，ＨＡ-Ｘの細胞内局在位置を検出した。その結果を図８（A）に示す。図８（A）は，ＨＡ-Ｘタンパク質を発現させた分裂酵母細胞を示す図面に変わる蛍光顕微鏡写真である。図８（B）は，図８（A）のうち白く抜けている部分の輪郭を模写した図である。図８（A）において，白く抜けた部分（図８（B）を参照）が，改良型ＨＡタンパク質が局在する場所である。
【００４５】
分裂酵母の場合と同様にして，先の実施例で得られた改良型ＨＡタグにヒトタンパク質Ｘを連結させたＨＡ-Ｘタンパク質をヒト細胞に発現させて，ＨＡを認識する抗ＨＡ抗体を用いた間接蛍光抗体法により，ＨＡ-Ｘの細胞内局在位置を検出した。その結果を図９（A）に示す。図９（A）は，ＨＡ-Ｘタンパク質を発現させたＨｅＬａ細胞（ヒト細胞）の図面に変わる蛍光顕微鏡写真である。図９において，緑色で示されるはずのものが改良型ＨＡタンパク質である。なお，細胞の位置を見るためのマーカーとして，細胞核を赤色で着色した。図９（B）は，図９（A）の緑色部分だけを抜き出して白黒表示した写真である。白で表した部分が、改良型HAタンパク質が局在する部分を示す。図８（A）と図９（A）から，本発明の改良型ＨＡタグは，タンパク質の細胞内局在の決定に有用であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は，実施例で用いたプラスミドpCST3の開裂地図である。
【図２】図２は，実施例で用いたプラスミドpCST2の開裂地図である。
【図３】図３は，実施例で用いたプラスミドpRK405の開裂地図である。
【図４】図４は，実施例で得られたプラスミドpCM530の開裂地図である。
【図５】図５は，実施例で得られたプラスミドp3HA-C1の開裂地図である。
【図６】図６は，実施例で得られたプラスミドp3HA-N1の開裂地図である。
【図７】図７は，実施例で用いたプラスミドpYC36の開裂地図である。
【図８】図８（A）は，ＨＡ-Ｘタンパク質を発現させた分裂酵母細胞を示す図面に変わる蛍光顕微鏡写真である。図８（B）は，図８（A）のうち白く抜けている部分の輪郭を模写した図である。
【図９】図９（A）は，ＨＡ-Ｘタンパク質を発現させたＨｅＬａ細胞（ヒト細胞）の図面に変わる蛍光顕微鏡写真である。図９において，緑色で示されるはずのものが改良型ＨＡタンパク質である。なお，細胞の位置を見るためのマーカーとして，細胞核を赤色で着色した。図９（B）は，図９（A）の白黒写真に関する図面に変わる白黒写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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