(57)【要約】【課題】  マンノースを含有する原料からのエタノール生産、例えば、セルロース系バイオマスからの燃料用エタノール生産に有用な、マンノースからエタノールを生産できるザイモバクター（Zymobacter）属に属する形質転換微生物を提供する。【解決手段】  フルクトースキナーゼおよびホスホマンノースイソメラーゼから選ばれるマンノース代謝系酵素を生産する微生物をＤＮＡ供与体とし、そのＤＮＡ断片をベクターに結合させた組換えＤＮＡおよび該組換えＤＮＡをザイモバクター属微生物に導入して得られたマンノースを基質としてエタノールを生産することができる形質転換微生物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノース代謝系酵素生産菌株をＤＮＡ供与体とし、そのＤＮＡ断片をベクターに結合させることによって得られる組換えＤＮＡであって、フルクトースキナーゼおよびホスホマンノースイソメラーゼのうちの少なくとも１つの酵素の遺伝子を含有することを特徴とする組換えＤＮＡ。
【請求項２】
ＤＮＡ供与体が、ザイモモナス（Zymomonas）属、エシェリヒア（Escherichia）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、リゾビウム（Rhizobium）属、アブロバクテリウム（Abrobacterium）属、サルモネラ（Salmonella）属およびシウドモナス（Pseudomonas）属に属する微生物から選ばれる請求項１記載の組換えＤＮＡ。
【請求項３】
フルクトースキナーゼおよびホスホマンノースイソメラーゼの遺伝子を含有する請求項１記載の組換えＤＮＡ。
【請求項４】
ＤＮＡ供与体が、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）およびエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である請求項３記載の組換えＤＮＡ。
【請求項５】
遺伝子が配列表の配列番号９に示す配列を有する請求項３記載の組換えＤＮＡ。
【請求項６】
フルクトースキナーゼおよびホスホマンノースイソメラーゼのうちの少なくとも１つの酵素の外来遺伝子が導入されたザイモバクター属の微生物であって、マンノースを基質としてエタノールを生産することができる形質転換微生物。
【請求項７】
外来遺伝子がフルクトースキナーゼおよびホスホマンノースイソメラーゼの遺伝子である請求項６記載の形質転換微生物。
【請求項８】
遺伝子が配列表の配列番号９に示す塩基配列を有する請求項７記載の形質転換微生物。
【請求項９】
Zymobactrer palmae T109/pMFY31-manA-frk（識別表示  Zb0501；ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４３７）である請求項７記載の形質転換微生物。
【請求項１０】
以下の(ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号９に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトースキナーゼおよびホスホマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする微生物由来のＤＮＡ
【請求項１１】
配列表の配列番号９に示す塩基配列である遺伝子を含有する組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンノースを含有する原料からのエタノールの効率的な製造、例えば、セルロース系バイオマスを原料とする燃料用エタノールの効率的生産に利用できるマンノース発酵性ザイモバクター属形質転換微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、微生物を用いてセルロース系バイオマス原料から燃料用エタノールの生産を行う場合、まず、バイオマスを単糖まで分解した糖化液を発酵原料として用いる。セルロース系バイオマス中にはセルロースの他にヘミセルロース含量の高いものもあるため、糖化液中にはグルコースの他にヘミセルロースに由来のマンノースが含まれる。燃料用エタノール生産に用いられる主な微生物としてサッカロミセス（Saccharomayces）属の酵母やザイモモナス（Zymomonas）属またはザイモバクター（Zymobacter）属細菌が挙げられるが、これら微生物のうち、サッカロミセス（Saccharomyces）属酵母以外の微生物はマンノースからエタノールを生産することはできず、効率のよいエタノール生産は期待できない。しかしながら、ザイモモナス（Zymomonas）属細菌とザイモバクター（Zymobacter）属細菌のエタノール生産性は酵母よりも優れている
これまで、微生物を用いるセルロース系バイオマスからのエタノール生産の効率向上のために、セロビオース発酵酵母を用いる方法や、クロストリジウム（Clostridium）属の細菌を用いる方法（特許文献１および２参照）等が提案されている。
一方、遺伝子マーカーを付与の研究において、ザイモモナス属の細菌に微生物由来のホスホマンノースイソメラーゼとフルクトキナーゼの外来遺伝子を導入してマンノースでの生育を確認したことが報告されている（非特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平５−２０７８８５号公報
【特許文献２】特開平６−５４６９４号公報
【非特許文献１】Appl. Enviro. Microbiol., 1996 Nov; 62(11):4155-61
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、マンノースを利用できないザイモバクター属の微生物に対し、組換えＤＮＡ法によりマンノース代謝系酵素を導入することで、マンノースからエタノールを生産できる形質転換微生物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、バイオマスを原料としたエタノール生産の収率を向上させるためには、エタノール生産に用いられる発酵微生物にマンノース代謝に関与する酵素を導入し、マンノースを基質としてエタノールを生産することができる形質転換微生物を構築する必要があると考え、ザイモバクター属細菌のエタノール生産性が酵母よりも優れていることから、ザイモバクター属細菌を形質転換するために鋭意研究した。
まず、本発明者らは、マンノース分解能を有する微生物に注目し、種々スクリーニングを行ったところ、マンノースの代謝に関与するフルクトースキナーゼとホスホマンノースイソメラーゼの遺伝子を得ることができた。しかし、ザイモバクター属の細菌における宿主−ベクター系が確立されていなかったことから、ベクターの構築、形質転換法およびマンノースの代謝に関与する酵素の遺伝子のクローニングに努力を重ね、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）マンノース代謝系酵素生産菌株をＤＮＡ供与体とし、そのＤＮＡ断片をベクターに結合させることによって得られる組換えＤＮＡであって、フルクトースキナーゼおよびホスホマンノースイソメラーゼのうちの少なくとも１つの酵素の遺伝子を含有することを特徴とする組換えＤＮＡ、
（２）ＤＮＡ供与体が、ザイモモナス属、エシェリヒア（Escherichia）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、リゾビウム（Rhizobium）属、アブロバクテリウム（Abrobacterium）属、サルモネラ（Salmonella）属およびシウドモナス（Pseudomonas）属に属する微生物から選ばれる上記（１）記載の組換えＤＮＡ、
（３）フルクトースキナーゼおよびホスホマンノースイソメラーゼの遺伝子を含有する上記（１）記載の組換えＤＮＡ、
（４）ＤＮＡ供与体が、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）およびエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である上記（３）記載の組換えＤＮＡ、
（５）遺伝子が配列表の配列番号９に示す配列を有する上記（３）記載の組換えＤＮＡ、
（６）フルクトースキナーゼおよびホスホマンノースイソメラーゼのうちの少なくとも１つの酵素の外来遺伝子が導入されたザイモバクター属の微生物であって、マンノースを基質としてエタノールを生産することができる形質転換微生物、
（７）外来遺伝子がフルクトースキナーゼおよびホスホマンノースイソメラーゼの遺伝子である上記（６）記載の形質転換微生物、
（８）遺伝子が配列表の配列番号９に示す塩基配列を有する上記（７）記載の形質転換微生物、
（９）Zymobactrer palmae T109/pMFY31-manA-frk（識別表示  Zb0501；ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４３７）である上記（７）記載の形質転換微生物、
（１０）以下の(ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子、
（ａ）配列表の配列番号９に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトースキナーゼおよびホスホマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする微生物由来のＤＮＡ
（１１）配列表の配列番号９に示す塩基配列である遺伝子を含有する組換えベクター、等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、組換えＤＮＡ法を用いてザイモモナス属の微生物にマンノース発酵性を付与することを可能にする組換えＤＮＡおよびその組換えＤＮＡ断片を含む形質転換微生物が提供できる。該形質転換微生物を用いることによって、セルロース系バイオマス由来等のマンノース含有糖液を原料とした効率的なエタノール製造が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
ザイモバクター属の細菌はマンノース発酵性をもたない。その原因としては、添付の図１に示すマンノースからホスホマンノース（マンノース−６−Ｐ）へリン酸化する酵素であるフルクトキナーゼ（ＦＲＫ）、さらにリン酸化したホスホマンノースを、ホスホフルクトース（フルクトース−６）に導き、解糖系（エントナー・ドゥドロフ経路）を経てエタノール生合成へと効率よく導くためのキー酵素となるホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）の欠損、あるいは微弱な活性に起因する。したがって、これら酵素遺伝子を導入して、発現させることにより、マンノースからのエタノール生産能を付与することが可能になる。
ザイモバクター属の細菌の多くは、フルキトキナーゼとホスホマンノースイソメラーゼとの両者を欠損している場合が多いので、本発明においては、両方の遺伝子を導入することが好ましいが、フルクトキナーゼを有する菌株の存在も推定されており、そのような菌株では、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子の導入のみでマンノース発酵性を示す形質転換体が得られる。
【０００８】
本発明に従って所望の形質転換体を得るには、まず、マンノース分解能を有する供与体微生物からフルクトースキナーゼおよびホスホマンノースイソメラーゼをコードするＤＮＡを分離、精製した後、種々の方法で切断して得られるＤＮＡ断片を調製する。さらに同様にして得られるベクターＤＮＡ断片とを、例えばＤＮＡリガーゼなどにより結合させ、フルクトースキナーゼ遺伝子およびホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子のうちの少なくとも1つの遺伝子を含有する組換えＤＮＡを形成する。
【０００９】
本発明において用いる遺伝子供与体微生物としては、特に制限はなく、マンノース分解能を有するものであればよいが、特に、ザイモモナス属、エシェリヒア属、キサントモナス属、クレブシエラ属、ロドバクター属、フラボバクテリウム属、アゼトバクター属、グルコノバクター属、リゾビウム属、アブロバクテリウム属、サルモネラ属およびシウトモナス属に属する微生物が好適に用いられ、その中でもザイモモナス・モビリスおよびエシェリヒア・コリが好ましい。その他の微生物、あるいは上記以外の微生物であって、マンノース分解能を有するもの、さらにはプロモーター部位やリボソーム結合部位の異常などにより、マンノース分解能は有しないが、そのＤＮＡ上にフルクトースキナーゼまたホスホマンノースイソメラーゼの構造遺伝子をコードする微生物であれば遺伝子供与体として使用可能である。また、遺伝子組換えなどにより、フルクトキナーゼまたはホスホマンノースイソメラーゼの構造遺伝子を導入された形質転換微生物なども遺伝子供与体微生物として使用することができる。異なる微生物から得られた複数種のＤＮＡ断片を１つのベクターに結合させることも可能であり、形質転換後、導入された組換えＤＮＡの全て、あるいは一部がザイモバクター属の宿主細胞のゲノム中に取り込まれても、形質転換に用いられたベクター上に存在してもよい。
【００１０】
上記の供与体微生物からのＤＮＡの分離、精製には、斉藤・三浦らの方法(Biochem. Biophys. Acta, Vol. 72, 619〜629, 1963)やその変法、さらには市販のＤＮＡ抽出キットなどを用いることができる。以下に、斉藤・三浦らの方法に準じた方法を例示する。
まず、供与体微生物をグリシン０．５ ％を含むイースト−スターチ培地（組成：イーストエキス０．２％、可溶性澱粉１．０％、ｐＨ７．３）などの適当な液体培地に接種し、４〜６０℃、好ましくは３０℃で８〜４８ 時間、好ましくは一夜攪拌培養する。培養終了後、固−液分離操作、例えば０〜５０℃、好ましくは４℃で回転数３０００〜１５０００ｒｐｍ、好ましくは１００００ｒｐｍの条件で遠心分離を行うことにより集菌する。これをＶＳ緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾチームを加えた後、４〜４５℃、好ましくは３７℃で０．５〜４時間、好ましくは１時間放置してプロトプラスト液を得る。該液に、ＴＳＳ緩衝液（０．１Ｍトリス、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、ｐＨ９．０）および５Ｍ  ＮａＣｌを加えてプロトプラストを溶解させる。ついで、ＴＥ溶液（１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）−飽和フェノールを加え、穏やかに、かつ十分に懸濁する。これを０〜５０℃、好ましくは４℃で回転数３０００〜１５０００ｒｐｍ、好ましくは１２０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた上層（水相)をクロロホルム液で懸濁する。さらに、これを０〜５０℃、好ましくは４℃で回転数３０００〜１５０００ｒｐｍ、好ましくは１２０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた上層（水相)を再度フェノールおよびクロロホルムを用いて懸濁処理する。ついで、冷エタノールを加え、生じた白濁の粗染色体ＤＮＡを回収し、該ＤＮＡをＳＳＣ緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）に溶解し、ＳＳＣ緩衝液に対して一晩透析する。この透析内液に、リボヌクレアーゼを終濃度１〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ加え、４〜４５℃、好ましくは３７℃で０．５〜１６時間、好ましくは２時間放置する。さらに、プロテアーゼを終濃度０．１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌ加え、４〜４５℃、好ましくは３７℃で１５分間〜８時間、好ましくは３０ 分間放置する。これを、上記と同様にフェノールおよびクロロホルムを用いて処理し、ＳＳＣ 緩衝液に対して透析し、精製した供与体微生物の染色体ＤＮＡ液とする。
【００１１】
こうして得られた供与体微生物のＤＮＡを制限酵素などにより分解し、蔗糖密度勾配法により１ｋｂｐ未満のＤＮＡ断片を除いたものを、供与体ＤＮＡ断片として用いることが可能である。このとき用いる制限酵素は特に限定はなく、ＤＮＡを切断するＡｃｃＩＩ（別名ＦｎｕＤＩＩ）などの各種酵素類を使用することができる。また、上記した酵素法以外にも超音波処理や物理的剪断力などを用いてＤＮＡを切断することも可能である。この際、例えばクレノーフラグメントやＤＮＡポリメラーゼ、マングビーンのヌクレアーゼなどの酵素で供与体ＤＮＡ断片の末端を処理しておくと、後のベクターＤＮＡとの結合効率が上がり好ましい。さらに、供与体微生物のＤＮＡやその断片をテンプレートとしてＰＣＲ増幅したものについても、そのままあるいは上記の処理を行うことにより供与体ＤＮＡ断片として使用することができる。
【００１２】
このようなＤＮＡ断片の例として、エシェリヒア・コリからのホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子の下流にザイモモナス・モビリスからのフルクトキナーゼ遺伝子が連結してなる配列表の配列番号９に示すＤＮＡおよび、これと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトースキナーゼおよびホスホマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）3rd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001）に記載の方法などに従って行なうことができ、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件が挙げられる。
【００１３】
本発明で用いるベクターＤＮＡ断片としては、グラム陰性細菌間の広宿主域性プラスミド由来のｐＲＫ２９０、ｐＭＦＹ４０およびｐＭＦＹ３１を制限酵素で切断処理したものなどを用いることができる。上記以外のベクターについても、公知のグラム陰性細菌の広宿主域性プラスミドを適宜選択し使用することが可能である。用いる制限酵素についても、粘着末端を生じるものに限らず、ＤＮＡを切断する各種の酵素類も使用できる上、上記の供与体微生物のＤＮＡの切断と同様な方法によるベクターＤＮＡの切断が可能である。得られたベクターＤＮＡ断片は、上記の供与体ＤＮＡ断片との結合反応に先立ち、アルカリ性フォスファターゼ処理する。これにより、該断片と供与体ＤＮＡ断片との結合効率が上昇する。さらに、ＰＣＲ増幅により供与体ＤＮＡ 断片を調製する場合には、予め増幅断片の両末端にＥｃｏＲＩなどの制限酵素部位付与プライマーを用い、その制限酵素切断したＤＮＡ断片と同じ制限酵素で切断したベクター断片を用いると、結合効率を上げることができる。供与体ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との結合反応は、公知のＤＮＡリガーゼを使用する方法等の常法であればよく、例えば供与体ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とをアニーリングした後、生体外で適当なＤＮＡリガーゼの作用により組換えＤＮＡを作成する。また、必要であれば、アニーリングした後、宿主微生物に導入して、生体内のＤＮＡ修復能を利用して組換えＤＮＡにすることもできる。
【００１４】
つぎに、結合した供与体ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを挿入する宿主微生物としては、エタノール発酵能を有し、かつ組換えＤＮＡ が安定に保持されるものであればよく、一般的にはザイモバクター・パルメが用いられる。宿主微生物への組換えＤＮＡ導入は、主に、エレクトロポレーションなどの電気的刺激を利用する方法によっておこなうことができる。
こうして得られた形質転換微生物の増殖培地としては、例えばＲＭ培地などが用いられる。培養温度等の培養条件は宿主微生物の性質に応じて適宜設定できる。また、用いたベクターＤＮＡ断片が、各種の抗生物質耐性遺伝子をコードしているものであれば、培地中に、相当する抗生物質を適量加えることで、組換えＤＮＡをより安定的に保持することができる。さらに、用いたベクターＤＮＡ が、宿主微生物の栄養要求性を補う遺伝子をコードしているものであれば、その要求される栄養素を含まない培地を用いることにより、同様に組換えＤＮＡの安定性が向上する。
【００１５】
得られた形質転換体は、公知のザイモバクター属細菌と同様に、マンノースを含有する原料からのエタノールの製造に使用することができる。
以下に、実施例を用いて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例においては、マンノースリン酸化反応を触媒することが報告されているザイモモナス由来のフルクトキナーゼ遺伝子をザイモモナス菌のゲノムＤＮＡ、また、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子をエシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いてクローニングした。また、導入した２種の酵素遺伝子ザイモバクター・パルメ細胞内で発現させるために、ザイモバクター・パルメに近縁とされるザイモモナス・モビリス細胞内で大量発現が報告されているグリセルアルデヒド-３-リン酸脱水素酵素の発現を制御するプロモーター遺伝子（ＧＡＰプロモーター）を利用した。
【実施例１】
【００１６】
ザイモモナス属細菌由来フルクトキナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドＤＮＡの作製
ザイモモナス菌由来のフルクトキナーゼ遺伝子はＰＣＲによりクローニングした。すなわち、ザイモモナス・モビリス由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子のプロモーター遺伝子の下流にフルクトキナーゼ遺伝子をタンデムに連結し、かつ、そのＤＮＡ断片の両末端にクローニングのためのＢａｍＨＩとＳａｌＩ制限酵素切断部位を付与したＤＮＡ断片を調製するために、公知のザイモモナズ・モビリス由来グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子配列（J. Bacteriol. Vol.169 (12), 5653-5662, 1987）と公知のザイモモナス・モビリス由来のフルクトキナーゼ遺伝子の塩基配列（J. Bacteriol. 174 (11), 3455-3460 (1992)）に基づき、４種のＰＣＲRプライマー
ＢＺＧｆ（配列番号１）：CGCGGATCCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATC
ＧＺＦｆ（配列番号２）：CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGAAAAACGATAAAAAAATTTATGGA
ＧＺＦｒ（配列番号３）：TCCATAAATTTTTTTATCGTTTTTCATGTTTATTCTCCTAACTTATTAAG
ＺＦＳｒ（配列番号４）：GGCGTCGACTTCCAAAATCCCTTTTCGGTTAAGAA
を設計した。一次ＰＣＲとして、ザイモモナス・モビリス菌体（Zymomonas mobiliz IFO 13756）から調製したゲノムＤＮＡをテンプレートに、プライマーＢＺＧｆとＧＺＦｒを用いて、プロモーターとフルクトキナーゼ遺伝子のＮ末部位を含む約３００ｂｐＤＮＡ断片を増幅した。一方、エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡ（Escherichia coli K12）をテンプレートにプライマーＧＺＦｆとＺＦＳｒを用いて、プロモーター遺伝子の一部とフルクトキナーゼ遺伝子を含む約１．０ｋｂｐＤＮＡ断片を増幅した。つぎに、プロモーター遺伝子を含むＤＮＡ断片とフルクトキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を混合して９４℃で２０分間加熱後、３７℃で１５分間保持することによりヘテロデュープレックスを形成させた後、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ存在下、７２℃で３分間反応させた。この反応液に、プライマーＢＺＧｆとプライマーＺＦＳｒを添加して二次ＰＣＲを行い、Ｇａｐプロモーター遺伝子、フルクトキナーゼ遺伝子の順に連結した約１．３  ｋｂｐＤＮＡ断片を増幅させた。このＤＮＡ断片の両末端を平滑化反応後、エシェリヒア・コリ用ベクタープラスミドＤＮＡ、ｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩ制限酵素切断片と混合してＴ４リガーゼにより連結させて組換えプラスミドＤＮＡを作製した。作製した組換えプラスミドを用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９を常法に従い形質転換した後、形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド、２０  μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むＬＢ平板培地（１％バクトトリプトン（Bacto Tripton）、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に塗布して、コロニーを形成させた。白色コロニーを形成した形質転換株から抽出した組換えプラスミドをｐＵＣ１１８−ｆｒｋとした。
図２に得られた組換えプラスミドｐＵＣ１１８−ｆｒｋの制限酵素地図を示す。
【実施例２】
【００１７】
エシェリヒア・コリ由来ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドＤＮＡの作製
エエシェリヒア・コリ由来ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子はＰＣＲによりクローニングした。すなわち、ザイモモナス・モビリス由来グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子のプロモーター遺伝子の下流にホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子をタンデムに連結し、かつ、そのＤＮＡ断片の両末端にクローニングのためのＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を付与したＤＮＡ断片を調製するために、公知のザイモモナス・モビリス由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子配列と公知のエシェリヒア・コリ由来のホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子の塩基配列（Gene 32 (1-2), 41-48 (1984)）に基づき、４種のＰＣＲプライマー
ＥＺＧｆ（配列番号５）：CGGAATTCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATCG
ＧＥＭｆ（配列番号６）：CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGCAAAAACTCATTAACTCAGTGCAA
ＧＥＭｒ（配列番号７）：TTGCACTGAGTTAATGAGTTTTTGCATGTTTATTCTCCTAACTTATTAAG
Ｅｍｂｒ（配列番号８）: CGCGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACGCGCTA
を設計した。一次ＰＣＲとして、上記ザイモモナス・モビリス菌体から調製したゲノムＤＮＡをテンプレートにプライマーＥＺＧｆとＧＥＭｒを用いて、プロモーターとホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子のＮ末部位を含み、そのプロモーター遺伝子上流末端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を付加した約３００ｂｐＤＮＡ断片を増幅した。一方、上記エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡをテンプレートにプライマーＧＥＭｆとＥＭＢｒを用いて、プロモーター遺伝子の一部とホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子を含み、そのホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子のＣ末端にＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を付加した約１．５ｋｂｐＤＮＡ断片を増幅した。つぎに、プロモーター遺伝子を含むＤＮＡ断片とホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を混合して９４℃で２０分間加熱後、３７℃で１５分間保持することによりヘテロデュープレックスを形成させた後、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ存在下、７２℃で３分間反応させた。この反応液に、プライマーＥＺＧｆとプライマーＥＭＢｒを添加して二次ＰＣＲを行い、Ｇａｐプロモーター遺伝子とホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子の順に連結した約１．５ｋｂｐＤＮＡ断片を増幅させた。このＤＮＡ断片の両末端を平滑化反応後、エシェリヒア・コリ用ベクタープラスミドＤＮＡ、ｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩ制限酵素切断片と混合してＴ４リガーゼにより連結させて組換えプラスミドＤＮＡを作製した。作製した組換えプラスミドを用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９を常法に従い形質転換した後、形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド、２０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むＬＢ平板培地（１％バクト・トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に塗布して、コロニーを形成させた。白色コロニーを形成した形質転換株から抽出した組換えプラスミドをｐＵＣ１１８−ｍａｎＡとした。
図３に得られたｐＵＣ１１８−ｍａｎＡの制限酵素地図を示す。
【実施例３】
【００１８】
マンノース発酵性遺伝子を含む組換えプラスミドDNAの作製
2種のマンノース代謝系酵素遺伝子をザイモバクター・パルメに導入して発現させるために、これら遺伝子を広宿主域性プラスミドベクターに挿入して組換えプラスミドを作製した。組換えプラスミドｐＵＣ１１８−ｆｒｋをＢａｍＩ制限酵素とＳａｌＩ制限酵素を用いて切断することにより、ＧＡＰプロモーター遺伝子、およびフルクトキナーゼ遺伝子を含む約１．３ｋｂｐＤＮＡ断片を調製した。また、組換えプラスミドｐＵＣ１１８−ｍａｎＡをＥｃｏＲＩ制限酵素とＢａｍＨＩ制限酵素を用いて切断することにより、ＧＡＰプロモーター遺伝子、およびホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子を含む約１．５ｋｂｐＤＮＡ断片を調製した。これら両ＤＮＡ断片と広宿主域性ベクタープラスミドｐＭＦＹ３１（Agric. Boil. Chem., Vol.49(9), 2719-2724, 1985）をＥｃｏＲＩ制限酵素とＳａｌＩ制限酵素により切断して調製した約１１．６ｋｂｐＤＮＡ断片を混合してＴ４リガーゼにより連結させて組換えプラスミドＤＮＡを作製した。作製した組換えプラスミドを用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９を常法に従い形質転換した後、形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド、２０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むＬＢ平板培地（１％バクト・トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に塗布して、コロニーを形成させた。コロニーを形成した形質転換株から抽出した組換えプラスミドに、ＧＡＰプロモーター、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子、フルクトキナーゼ遺伝子、ＧＡＰプロモーター、トランスアルドラーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子が、この順番で連結していることを確認して、ｐＭＦＹ３１−ｍａｎＡ−ｆｒｋとした。
図４に得られたｐＭＦＹ３１−ｍａｎＡ−ｆｒｋの制限酵素地図を示す。
【実施例４】
【００１９】
マンノース発酵性ザイモバクター・パルメの作製
エシェリヒア・コリ内で構築した組換えプラスミドｐＭＦＹ３１−ｍａｎＡ−ｆｒｋをザイモバクター・パルメに形質転換した。ザイモバクター・パルメ（Zymobacter palmae T109）ＡＴＣＣ５１６２３株をＲＭ培地（２．０％グルコース、１．０％バクト酵母エキス、０．２％ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０）で一晩静置培養した５ｍｌの前培養液を、５０ｍｌのＴ培地（２．０％グルコース、１．０％バクト酵母エキス、１．０％ＫＨ２ＰＯ４、０．２％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０）に植え継ぎ、３０℃で９０分間培養した。培養液を４℃で、３００ｒｐｍの１０分間の遠心分離により菌体を集め、２０ｍｌの冷却した１０％グリセロールを加え、懸濁・洗浄した。再び、４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心してコンピテントセルとした。２００μｌのコンピテントセルと１０μｌのｐＭＦＹ３１−ｘｔＤＮＡ溶液を氷上にて混合した後、エレクトロポレーション装置付属のキュベットに移して、電圧が２００Ｖ、キャピタンシーが２５０μＦＤ、抵抗値が２００Ωの条件下で電気的パルスを陰荷した。直ちに１ｍｌのＴ培地をキュベットに添加して、３０℃で１時間静置培養した後、選択培地上でコロニーを形成させた。マンノース発酵性の形質転換体はマンノースを唯一の炭素源とし、１００μｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＴ寒天平板培地（２．０％マンノース、１．０％バクト酵母エキス、１．０％ＫＨ２ＰＯ４、０．２％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５％寒天、ｐＨ６．０）上で選択し、形質転換株細胞内での２種の酵素遺伝子の発現を確認した。得られた形質転換体は、Zymobactrer palmae T109/pMFY31-manA-frk（識別表示Zb0501)と命名し、平成１７年３月４日から、茨城県つくば市東１−１−１  中央第６の、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４３７の下で寄託してある。
Zymobactrer palmae T109/pMFY31-manA-frkをＴ培地で培養した後、無細胞抽出液を調製して２種の酵素活性を測定した。結果を表１に示す。なお、対象菌株として、親株（Zymobactrer palmae T109）を用いて同様に活性測定を行い、比較した。
【表１】
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表１から明らかなごとく、ホスホマンノースイソメラーゼおよびフルクトースキナーゼはザイモバクター・パルメ細胞内で効率よく発現しており、エシェリヒア・コリに比べて著しく高い活性を示した。
【実施例５】
【００２０】
実施例４における組換えＤＮＡの導入による２種の酵素の高発現が確認できたことから、組換え株によるマンノースからのエタノール生産を行った。マンノースを唯一の炭素源とした発酵性試験を検討した。２％グルコース、２％マンノースおよび２％グルコース＋２％マンノースを炭素源とした培地に植菌し、菌体の生育、およびエタノールの生成量を経時的に測定した。
結果を図５に示す。図５から明らかなごとく、マンノースを唯一の炭素源とした培地ではグルコースのみに比べて生育速度は低下したものの、培養５日目で約２％を消費し、約１．０％のエタノールを生産しており、収率は９５％以上であった。また、グルコース＋マンノース培地では、培養５日目にはグルコースを完全に消費するとともに、１％のマンノースを消費して、理論収率に近いエタノールの生産に成功した。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
以上記載したように、本発明によれば、マンノースを含有する原料からのエタノールの効率的な製造、例えば、セルロース系バイオマスを原料とする燃料用エタノールの効率的生産に利用できるマンノース発酵性ザイモバクター属形質転換微生物が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】マンノースからエタノールの生合成経路を示す図である。
【図２】実施例１で得られた組換えプラスミドｐＵＣ１１８−ｆｒｋの制限酵素地図である。
【図３】実施例２で得られた組換えプラスミドｐＵＣ１１８−ｍａｎＡの制限酵素地図である。
【図４】実施例３で得られた組換えプラスミドｐＭＦＹ３１−ｍａｎＡ−ｆｒｋの制限酵素地図である。
【図５】実施例４で得られた形質転換体株によるマンノースからのエタノール生産の結果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００２３】
配列番号１：ザイモモナス・モビリスのフルクトキナーゼをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号２：ザイモモナス・モビリスのフルクトキナーゼをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号３：エシェリヒア・コリのフルクトキナーゼをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号４：エシェリヒア・コリのフルクトキナーゼをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号５：ザイモモナス・モビリスのホスホマンノースイソメラーゼをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号６：ザイモモナス・モビリスのホスホマンノースイソメラーゼをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号７：エシェリヒア・コリのホスホマンノースイソメラーゼをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号８：エシェリヒア・コリのホスホマンノースイソメラーゼをコードするＤＮＡ増幅用に設計したオルゴヌクレオチド・プライマー。
配列番号９：ザイモモナス・モビリス由来のフルクトキナーゼとエシェリヒア・コリ由来のホスホマンノースイソメラーゼとの両方をコードするために設計したＤＮＡ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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