(57)【要約】      （修正有）【課題】CYP2C19 のエクソン５およびエクソン４における一塩基変異遺伝的多型を、簡便に検出する手段を提供する。【解決手段】該被験体に存在するヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型を検出する方法であって、特定なる配列で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有する塩基配列を含んだ少なくとも一つをプライマーとして用いて、チトクロームＰ４５０2C19 遺伝多型の検査をする方法、および検査キット。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチドのいずれか１種類をフォワードプライマーとし、配列番号３で示される塩基配列の連続する１５〜２６塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることを特徴とする新規なヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型検査用オリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項２】
配列番号１で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチドもしくは配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類をフォワードプライマーとし、配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることを特徴とする新規なヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型検査用オリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項３】
請求項１または２記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、遺伝多型部位に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドプローブが標識または水不溶性担体に固定されていることを特徴とする請求項３記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
【請求項５】
標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである請求項３または４に記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
【請求項６】
配列番号１で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチドのいずれか１種類をフォワードプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
【請求項７】
配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
【請求項８】
請求項６または７記載の３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドの３´末端から３〜５番目の少なくとも１つの塩基が相補的あるいは相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする請求項６または7記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
【請求項９】
請求項６〜８記載のオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする
ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
【請求項１０】
標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである請求項６〜９のいずれかに記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法
【請求項１１】
請求項１または２記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、遺伝多型部位に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドプローブが標識または水不溶性担体に固定されていることを特徴とする請求項３記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
【請求項１３】
標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである請求項１１または１２に記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
【請求項１４】
配列番号１または2で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチドのいずれか１種類をフォワードプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
【請求項１５】
配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
【請求項１６】
請求項１４または１５記載の３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドの３´末端から３〜５番目の少なくとも１つの塩基が相補的あるいは相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする請求項１４または１５記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とするヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
【請求項１８】
標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである請求項１４〜１７のいずれかに記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝子（以下、「CYP2C19 」ということがある）の一塩基変異多型の検査に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー及びそれを用いたヒトチトクロームP450 2C19 遺伝子の一塩基変異多型の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗痙攣剤である(S)-メフェニトインの代謝能力には遺伝的多型が見られる。この遺伝的多型は(S)-メフェニトインの代謝だけではなく、臨床的に重要なラベプラゾール、ランソプラゾール、オメプラゾール及びプロプラノロール等のプロトンポンプ阻害剤（proton pump inhibitor）並びに選択的セロトニン再取込み阻害剤（serotonin reuptake inhibitor) の酸化的代謝能力とともに遺伝的に分離するので、(S)-メフェニトインの代謝異常を調べることは臨床的に重要である。
従来、上記薬剤の代謝異常は、被験者に対象薬剤あるいはプローブ薬剤を経口投与し、８時間後に排泄される尿中に含まれる投与された薬剤を定量することにより行われていた。しかしながら、この方法は時間がかかる上に被験者に無用の薬剤を投与しなければならない。
上記薬剤の代謝異常の遺伝的な原因は、少なくとも日本人については明らかになっている。すなわち、CYP2C19 のエクソン５中のＧがＡになる点突然変異（部位は、CYP2C19 のｃＤＮＡの６８１nt）（非特許文献１）及びCYP2C19 のエクソン４中のＧがＡになる点突然変異（部位は、CYP2C19 のｃＤＮＡの６３６nt）（非特許文献２）の少なくともどちらかによって薬剤の代謝異常が起きることがわかっている。従って、CYP2C19 のエクソン５及び４中の上記遺伝的多型を調べることにより、薬剤の代謝異常を検査することができ、さらには、その遺伝子型を分類（ジェノタイピング）することもできる。
エクソン4および５における点突然変異を検出する方法として、既にＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により遺伝的多型を検出する方法が報告されている。（非特許文献１、非特許文献２）すなわち、エクソン５及びエクソン４のそれぞれについて各一対のプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を制限酵素で消化して電気泳動で分離することにより、突然変異の有無に応じて異なるサイズの断片が検出される。またＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いる方法（特許文献１）として、ＣＹＰ２Ｃ１９のエクソン５およびエクソン４における遺伝的多型を同時にＰＣＲし、制限酵素を用いて検出する方法が記載されている。
【特許文献１】特開平１０−１４５８５
【非特許文献１】Sonia M.F. de Morais et al., The Journal of Biological Chemistry Vol.269, No. 22, pp.15419-15422, 1994
【非特許文献２】Sonia M.F. de Morais et al., Molecular Pharmaoclogy, 46:594-598,1994
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記既報によるとＰＣＲ増幅後、制限酵素処理を行い電気泳動することによって特別な検出装置を用いることなく遺伝多型の検出が可能である。しかしながら多数の検体について限られた時間内に検査をする場合、効率良く行うことが重要である。これまで報告されている方法では、エクソン４および５の一塩基変異多型を同時に検出するための工夫がされているが、非特異増幅を解消しかつ、制限酵素処理前後の核酸断片を電気泳動で明瞭に分離解析するためには、特別な条件設定が必要であった。
【０００４】
従って、本発明の目的は、CYP2C19 のエクソン５およびエクソン４における一塩基変異遺伝的多型を、簡便に検出する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意検討の結果、CYP２C19のエクソン５および４における遺伝的多型の検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーとして既報に記載のものとは異なる配列を用いることにより、非特異的な増幅産物がなくエクソン５および４における遺伝的多型検出のＰＣＲを同一条件で行うことができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、以下のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型検査用オリゴヌクレオチドプライマーセット、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キットを提供するものである。
１．  配列番号１で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチドのいずれか１種類をフォワードプライマーとし、配列番号３で示される塩基配列の連続する１５〜２６塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることを特徴とする新規なヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型検査用オリゴヌクレオチドプライマーセット。
２．  配列番号１で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチドもしくは配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類をフォワードプライマーとし、配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることを特徴とする新規なヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型検査用オリゴヌクレオチドプライマーセット。
３．  項１または２記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、遺伝多型部位に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
４．  オリゴヌクレオチドプローブが標識または水不溶性担体に固定されていることを特徴とする項３記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
５．  標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである項３または４に記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
６．  配列番号１で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチドのいずれか１種類をフォワードプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
７．  配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
８．  項６または７記載の３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドの３´末端から３〜５番目の少なくとも１つの塩基が相補的あるいは相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする項６または7記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
９．  項６〜８記載のオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする
ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
１０．  標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである項６〜９のいずれかに記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法
１１．  項１または２記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、遺伝多型部位に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
１２．  オリゴヌクレオチドプローブが標識または水不溶性担体に固定されていることを特徴とする項３記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
１３．  標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである項１１または１２に記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
１４．  配列番号１または2で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチドのいずれか１種類をフォワードプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
１５．  配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
１６．  項１４または１５記載の３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドの３´末端から３〜５番目の少なくとも１つの塩基が相補的あるいは相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする項１４または１５記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
１７．  項１４〜１６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とするヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
１８．  標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである項１４〜１７のいずれかに記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、被験体から核酸試料を得、前記試料中で、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）の遺伝子多型を簡便でかつ再現性が高い結果が得られるようになり、これらの多型に関連のある薬物使用の際に重要な情報を迅速に提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
アッセイに用いる試料溶液は、患者の血液、組織から、既知の方法により調製してもよい。代表的なものとして、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ 第７２巻、第６１９〜６２９頁、１９６３年）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第７巻、第１５１３〜１５２３頁、１９７９年）等の液相で行う方法がある。また、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．  ＵＳＡ 第７６−２巻、第６１５〜６１９頁、１９７９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。その他の方法としてはシリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 第２８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特開平２−２８９５９６号公報）が挙げられる。
【０００９】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、CYP2C19 の一塩基変異を検出するためのものである。配列番号１または２で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドはforward 側プライマーとして、また配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドは、reverse 側プライマーとして用いられ、CYP2C19のエクソン４の一塩基多型検出に用いられる。配列番号６で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドはforward 側プライマーとして、また配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドまたは配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドはreverse 側プライマーとして用いられCYP2C19のエクソン５の一塩基多型検出に用いられる。また、配列番号１または２で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドはforward 側プライマーとして用い、配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドまたは配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドはreverse 側プライマーとして用いてCYP2C19のエクソン４および５の一塩基多型検出に用いてもよい。
【００１０】
本発明のプライマーと既知のプライマーを組み合わせることにより、CYP2C19 の一塩基多型の検出が簡便に行うことができるようになる。なお、エクソン４中の一塩基変異の検出のためのリバースプライマーは、文献Sonia M.F. de Morais et al., Molecular Pharmaoclogy, 46:594-598,1994に記載されており、エクソン５中の一塩基変異検出のためのフォワードプライマーは文献Sonia M.F. de Morais et al., The Journal of Biological Chemistry Vol.269, No. 22, pp.15419-15422, 1994に記載されているものを使用することも可能である。
【００１１】
更に詳しくは、エクソン４中の一塩基変異（多型）検出には、配列番号９，１０で示されるオリゴヌクレオチドを利用しても良い。
【００１２】
配列番号9は、ＣＹＰ２Ｃ１９の６３６番目の塩基がＧであることを認識するreverseプライマーであり、配列番号１または２で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。
【００１３】
配列番号１０は、ＣＹＰ２Ｃ１９の６３６番目の塩基がＡであることを認識するforwardプライマーであり、配列番号3または配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドまたは配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。
【００１４】
更に詳しくは、エクソン５中の一塩基変異検出には、配列番号７，８で示されるオリゴヌクレオチドを利用しても良い。
【００１５】
配列番号７は、ＣＹＰ２Ｃ１９の６８１番目の塩基がＧであることを認識するreverseプライマーであり、配列番号１または２で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドまたは配列番号6で示されるオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。
【００１６】
配列番号８は、ＣＹＰ２Ｃ１９の６８１番目の塩基がＡであることを認識するforwardプライマーであり、配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドまたは配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-basedamplification method；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁(1993)）ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method :J Clin Microbiol. 2004 第42巻:第1,956頁）、ＩＣＡＮ（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids: Kekkaku. 2003 第78巻、第５３３頁）などが挙げられる。
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２n倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行う場合、アニーリングは５０〜６５℃で5〜120秒間、伸長は６８〜７２℃で15〜120秒間行う。変性条件は変性が行われればよいので特に限定されないが、通常、９４℃で5〜120秒間行う。サイクル数は特に限定されないが、２０〜４０サイクルが好ましい。また、ＰＣＲバッファー中の塩化マグネシウムの濃度は、1.0 ないし2.0 mMが好ましい。なお、ＰＣＲ法自体はこの分野において周知であり、必要な試薬類のキット及び装置も市販されているので、これらを用いて容易に行うことができる。
【００１７】
遺伝多型部位に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブとしては、一塩基変異（多型）を含み且つ生成物の核酸配列と相同あるいは相補的な塩基配列を備えたオリゴヌクレオチドが広く包含される。
【００１８】
プローブは、標識プローブとして好ましく使用される。標識プローブは新たに生成した配列に対してハイブリダイズするように設計されているので、既に存在している核酸の影響を受けることなく、伸長反応により新たに生成した伸長生成物を、効率よく検出することができる。プローブの標識としては、オリゴヌクレオチドプライマーの標識と同様のものが使用され、プライマーとプローブの両方を標識する場合には、異なる標識を好ましく使用できる。
【００１９】
本発明のプライマーおよび一塩基変異（多型）箇所と相補的あるいは相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、ＰＣＲ後、得られたＰＣＲ産物についてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション法自体は周知の方法である。すなわち、水不溶性担体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブに予め1本鎖にされたPCR産物を添加することにより、担体上にPCR産物が結合される。結合されたPCR産物が予め標識されていれば、その標識を検出することによって、PCR産物の配列を特定することが可能である。また、蛍光色素で予め標識されたオリゴヌクレオチドプローブと、５´ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを利用したいわゆるTaqmanアッセイであれば、ＰＣＲ反応と共に一塩基変異（多型）の検出が可能な試料を解析する上では極めて有効な方法である。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブを用いた融解曲線解析を行なうことによっても、配列を特定することができる。他の方法としては、配列番号1または２のオリゴヌクレオチドと、一塩基変異（多型）配列を特異的に増幅させるオリゴヌクレオチドとを組み合わせて用いることによって、アレル特異的に核酸断片を増幅させることも可能である。得られた核酸断片をＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩやエチレンブロマイドなどのインターカレーターを用いて蛍光検出することも可能であり、電気泳動にて増幅断片を検出しても良い。
点突然変異部位に実質的に相同あるいは相補的なオリゴヌクレオチドプローブは水不溶性担体に固定されていてもよい。水不溶性担体としては、合成高分子、生体高分子、金属、ガラスなどが例示される。すなわち、水不溶性担体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブに予め1本鎖にされたPCR産物を添加することにより、担体上にPCR産物が結合される。結合されたPCR産物が予め標識されていれば、その標識を検出することによって、PCR産物の配列を特定することが可能である。オリゴヌクレオチドプローブは、これらの水溶性担体にアレイ状に配置し、ＤＮＡアレイとして用いてもよい。
本発明に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、標識されていてもよい。標識することで検出操作を簡便化できる。標識は、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質などを用いればよい。例えば、標識が蛍光化学物質または蛍光蛋白質の場合、特定波長の光を照射し蛍光化学物質または蛍光蛋白質を励起させ、基底状態に変換される際に生じる特定波長の蛍光量を測定することが可能である。これらに用いられる蛍光化学物質としては、FITC、FAM、TAMRA、TexasRed、VIC、Cy3、Cy5、HEX等が挙げられ、蛍光蛋白質としては、GFP、YFP、RFP等を挙げることができる。標識が酵素である場合、酵素の基質を添加することによって生成される反応生成物を検出することによって測定が可能である。これらに用いられる酵素と基質の組み合わせとしては、アルカリフォスファターゼとパラニトロフェニルリン酸、CDP-star、AMPPD、DDAOphospate、BCIP-NBT等の組み合わせ、パーオキシダーゼとTMB、Lumi-Light（ロッシュ・ダイアグノスティックス）、SAT-1（同仁化学）等の組み合わせ、ジアホラーゼとNTB等の組み合わせ、各種オキシダーゼと基質、各種デヒドロゲナーゼと基質の組み合わせ等、反応生成物が検出されるものであれば、これらに限定されることはなく用いることが可能である。標識が磁性体の場合、磁気を検出することによって測定が可能である。標識が導電性物質の場合、電流値を検出することによって測定が可能である。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。この実施例に使用したプライマーの位置関係を図３に示す。
［実施例１］
Cytochrome P450 2C19(CYP2C19)遺伝子のエクソン４の塩基多型 (636G→A)の検出
（１）CYP2C19遺伝子の636番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号２，３，９，１０に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ２，３，９，１０と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、ＧＥＮＳＥＴ KK、アマシャムファルマシア バイオテク（株）等）に依頼した。オリゴ２がセンス鎖であり、オリゴ9と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ9は野生型検出用オリゴヌクレオチドであり、オリゴ10は変異型検出用オリゴヌクレオチドでありオリゴ3と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして用いられる。
（２）PCR法によるCYP2C19遺伝子多型の解析
PCR法による増幅反応ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトCYP2C19遺伝子の塩基多型 (636G→A)を解析した。
【００２１】
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。
KOD-plus DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ3および4（または5および6）  5 pmol、×10緩衝液 2.5 μl、2mM dNTP 2.5 μl、25 mM MgCl2 1 μl、KOD-plus DNAポリメラーゼ 0.5 Ｕ、抽出DNA溶液 100 ng
増幅条件
94℃・2分94℃・15秒、60℃・30秒、68℃、30秒（35サイクル）68℃・2分。
（３）電気泳動を用いた検出
増幅反応液5μｌを3％アガロースを用いて電気泳動を行なった（図１）。その結果、塩基多型に応じた特異的な増幅産物が得られることが確認された。
［実施例２］
Cytochrome P450 2C19(CYP2C19)遺伝子の塩基多型 (681G→A)の検出
（１）CYP2C19遺伝子の681番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号５〜８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ５〜８と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、ＧＥＮＳＥＴ KK、アマシャムファルマシア バイオテク（株）等）に依頼した。オリゴ６がセンス鎖であり、オリゴ７と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ7は野生型検出用オリゴヌクレオチドであり、オリゴ８は変異型検出用オリゴヌクレオチドでありオリゴ５と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして用いられる。
（２）PCR法によるCYP2C19遺伝子多型の解析
PCR法による増幅反応ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトCYP2C19遺伝子の塩基多型 (681G→A)を解析した。
【００２２】
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。
KOD-plus DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ7および8（または9および10）  5 pmol、×10緩衝液 2.5 μl、2mM dNTP 2.5 μl、25 mM MgCl2 1 μl、KOD-plus DNAポリメラーゼ 0.5 Ｕ、抽出DNA溶液 100 ng
増幅条件
94℃・2分94℃・15秒、60℃・30秒、68℃、30秒（35サイクル）68℃・2分。
（３）電気泳動を用いた検出
増幅反応液5μｌを３％アガロースを用いて電気泳動を行なった（図２）。その結果塩基多型に応じた特異的な増幅産物が得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明により、被験体から核酸試料を得、前記試料中で、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）の遺伝子多型を簡便でかつ再現性が高い結果が得られるようになり、これらの多型に関連のある薬物使用の際に重要な情報を迅速に提供することができることからも産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Cytochrome P450 2C19(CYP2C19)遺伝子の塩基多型 (636G→A)の検出結果。図１中、レーン１〜４はオリゴ３及びオリゴ４を用いPCR増幅後、電気泳動した。レーン５〜８はオリゴ５及びオリゴ６を用いPCR増幅後、電気泳動した。
【００２５】
レーン１及び５には試料としてミリQ水を、レーン２及び６には野生型ホモ試料を、レーン３及び７にはヘテロ型試料を、レーン４及び８には変異型ホモ試料を、各々用いた。電気泳動結果より、特異的な増幅断片が得られるとともに非特異的な増幅断片もないことより、明瞭な解析が可能である。
【図２】Cytochrome P450 2C19(CYP2C19)遺伝子の塩基多型 (681G→A)の検出結果図２中、レーン１〜４はオリゴ３及びオリゴ４を用いPCR増幅後、電気泳動した。レーン５〜８はオリゴ５及びオリゴ６を用いPCR増幅後、電気泳動した。
【００２６】
レーン１及び５には試料としてミリQ水を、レーン２及び６には野生型ホモ試料を、レーン３及び７にはヘテロ型試料を、レーン４及び８には変異型ホモ試料を、各々用いた。電気泳動結果より、特異的な増幅断片が得られるとともに非特異的な増幅断片もないことより、明瞭な解析が可能である。
【図３】プライマー１〜１０の位置関係を示す。
【図１】
2006271288.tif 000003
【図２】
2006271288.tif 000004
【図３】
2006271288.tif 000005
【配列表】
2006271288000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月28日(2005.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明のプライマーおよび一塩基変異（多型）箇所と相補的あるいは相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、ＰＣＲ後、得られたＰＣＲ産物についてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション法自体は周知の方法である。すなわち、水不溶性担体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブに予め1本鎖にされたPCR産物を添加することにより、担体上にPCR産物が結合される。結合されたPCR産物が予め標識されていれば、その標識を検出することによって、PCR産物の配列を特定することが可能である。また、蛍光色素で予め標識されたオリゴヌクレオチドプローブと、５´ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを利用したいわゆるTaqmanアッセイであれば、ＰＣＲ反応と共に一塩基変異（多型）の検出が可能な試料を解析する上では極めて有効な方法である。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブを用いた融解曲線解析を行なうことによっても、配列を特定することができる。他の方法としては、配列番号1または２のオリゴヌクレオチドと、一塩基変異（多型）配列を特異的に増幅させるオリゴヌクレオチドとを組み合わせて用いることによって、アレル特異的に核酸断片を増幅させることも可能である。得られた核酸断片をＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩやエチレンブロマイドなどのインターカレーターを用いて蛍光検出することも可能であり、電気泳動にて増幅断片を検出しても良い。
点突然変異部位に実質的に相同あるいは相補的なオリゴヌクレオチドプローブは水不溶性担体に固定されていてもよい。水不溶性担体としては、合成高分子、生体高分子、金属、ガラスなどが例示される。すなわち、水不溶性担体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブに予め1本鎖にされたPCR産物を添加することにより、担体上にPCR産物が結合される。結合されたPCR産物が予め標識されていれば、その標識を検出することによって、PCR産物の配列を特定することが可能である。オリゴヌクレオチドプローブは、これらの水不溶性担体にアレイ状に配置し、ＤＮＡアレイとして用いてもよい。
本発明に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、標識されていてもよい。標識することで検出操作を簡便化できる。標識は、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質などを用いればよい。例えば、標識が蛍光化学物質または蛍光蛋白質の場合、特定波長の光を照射し蛍光化学物質または蛍光蛋白質を励起させ、基底状態に変換される際に生じる特定波長の蛍光量を測定することが可能である。これらに用いられる蛍光化学物質としては、FITC、FAM、TAMRA、TexasRed、VIC、Cy3、Cy5、HEX等が挙げられ、蛍光蛋白質としては、GFP、YFP、RFP等を挙げることができる。標識が酵素である場合、酵素の基質を添加することによって生成される反応生成物を検出することによって測定が可能である。これらに用いられる酵素と基質の組み合わせとしては、アルカリフォスファターゼとパラニトロフェニルリン酸、CDP-star、AMPPD、DDAOphospate、BCIP-NBT等の組み合わせ、パーオキシダーゼとTMB、Lumi-Light（ロッシュ・ダイアグノスティックス）、SAT-1（同仁化学）等の組み合わせ、ジアホラーゼとNTB等の組み合わせ、各種オキシダーゼと基質、各種デヒドロゲナーゼと基質の組み合わせ等、反応生成物が検出されるものであれば、これらに限定されることはなく用いることが可能である。標識が磁性体の場合、磁気を検出することによって測定が可能である。標識が導電性物質の場合、電流値を検出することによって測定が可能である。
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月27日(2005.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドの３´末端から３〜５番目の少なくとも１つの塩基が相補的あるいは相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする請求項６または7記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１６】
３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドの３´末端から３〜５番目の少なくとも１つの塩基が相補的あるいは相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする請求項１４または１５記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
すなわち本発明は、以下のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型検査用オリゴヌクレオチドプライマーセット、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キットを提供するものである。
１．  配列番号１で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチドのいずれか１種類をフォワードプライマーとし、配列番号３で示される塩基配列の連続する１５〜２６塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることを特徴とする新規なヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型検査用オリゴヌクレオチドプライマーセット。
２．  配列番号１で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチドもしくは配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類をフォワードプライマーとし、配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることを特徴とする新規なヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型検査用オリゴヌクレオチドプライマーセット。
３．  項１または２記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、遺伝多型部位に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
４．  オリゴヌクレオチドプローブが標識または水不溶性担体に固定されていることを特徴とする項３記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
５．  標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである項３または４に記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
６．  配列番号１で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチドのいずれか１種類をフォワードプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
７．  配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
８．  ３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドの３´末端から３〜５番目の少なくとも１つの塩基が相補的あるいは相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする項６または7記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
９．  項６〜８記載のオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする
ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法。
１０．  標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである項６〜９のいずれかに記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査方法
１１．  項１または２記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、遺伝多型部位に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
１２．  オリゴヌクレオチドプローブが標識または水不溶性担体に固定されていることを特徴とする項３記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
１３．  標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである項１１または１２に記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
１４．  配列番号１または2で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチドのいずれか１種類をフォワードプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
１５．  配列番号４で示される塩基配列の連続する１５〜３５塩基を有するオリゴヌクレオチド、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
１６．  ３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドの３´末端から３〜５番目の少なくとも１つの塩基が相補的あるいは相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする項１４または１５記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
１７．  項１４〜１６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とするヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。
１８．  標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである項１４〜１７のいずれかに記載のヒトチトクロームP450 2C19 遺伝多型の検査キット。