(57)【要約】【課題】塩分を含む環境下で汚染物質を分解する能力を有し、分解速度や分解できる汚染物質の種類の点で先の微生物より優れた微生物及びこの微生物を用いた環境修復方法が望まれていた。【解決手段】ペスタロティオプシス(Pestalotiopsis)属に属し、塩分を含む環境下で少なくともリグニン分解活性を有する微生物を提供する。この微生物はリグニン分解酵素のうちでラッカーゼを主に産生する。有性生殖器官を形成しないアナモルフ（anamorph)の菌類であり、分生子の細胞数は６（内、有色細胞４）で３−９本の付属糸を有する。Pestalotiopsis sp. SN-3株（ＦＥＲＭＰ−２０３７５）である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペスタロティオプシス(Pestalotiopsis)属に属し、塩分を含む環境下で少なくともリグニン分解活性を有する糸状菌。
【請求項２】
Kirk培地を用いて培養した場合にNaCl濃度が０〜１２％（W/V)、ｐＨが２〜１１、温度が４〜３７℃の範囲で生育可能な請求項１に記載の糸状菌。
【請求項３】
Kirk培地を用いて培養した場合にラッカーゼを主に産生する請求項１又は２に記載の糸状菌。
【請求項４】
有性生殖器官を形成しないアナモルフ（anamorph)の菌類であり、分生子の細胞数は６（内、有色細胞４）で３〜９本の付属糸を有する請求項１〜３のいずれかに記載の糸状菌。
【請求項５】
Pestalotiopsis sp. SN-3株（ＦＥＲＭＰ−２０３７５）である請求項１〜４のいずれかに記載の糸状菌。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の糸状菌及び／又はその分泌物を有効量含有することを特徴とする環境浄化剤。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の糸状菌及び／又はその分泌物を用いて環境汚染物質を分解させることを特徴とする環境浄化方法。
【請求項８】
前記環境汚染物質がリグニン、色素染料、有機スズ（ＴＢＴ、ＴＰＴ）、ＰＣＢ又はダイオキシンであることを特徴とする請求項７に記載の環境浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は塩分を含む環境下で環境汚染物質分解能の高いペスタロティオプシス(Pestalotiopsis)属に属する新規な糸状菌、この糸状菌及び／又はその分泌物を有効量含有する環境浄化剤及びこれを用いた環境浄化方法（バイオレメディエーション）に関する。
【背景技術】
【０００２】
人類は自己の活動を維持するために地球上の資源を大量に消費し、大量の廃棄物を環境（陸地、海洋、湖沼、河川、大気）中に排出し、環境を汚染してきている。
【０００３】
環境を汚染している廃棄物中の分解され易い有機化合物は微生物により分解されるが、リグニン、各種色素染料、有機スズ（ＴＢＴ、ＴＰＴ）、ＰＣＢ、ダイオキシン等のような有機化合物はなかなか分解されず、長期に亘って環境中に残る。
【０００４】
環境中に残ったこれらの有機化合物中には人類を含む生物全般の生命活動にとって有害なものが多く含まれており、これらが生物の健康に長期に亘って悪影響を及ぼすので、これら有機化合物は速やかに分解・無害化する必要が有る。
【０００５】
そこで、特開平９−１７３０５１号特許出願等、多くの特許出願において、これらの有機化合物を分解する微生物及びこの微生物を用いた環境修復方法が提案されている。
【０００６】
ただ、この微生物は海洋のような塩分を含む環境下ではこれらの有機化合物を分解する能力を有していないか、分解する能力に乏しいので、海洋に投棄された廃棄物中のこれらの有機化合物の分解には利用できない。
【０００７】
しかし、海洋におけるこれらの有機化合物による汚染は深刻な問題であり、特に、水産資源を利用している人類にとって深刻な問題である。
【０００８】
例えば、船底の塗料や漁網の防汚剤として有機スズ（ＴＢＴ、ＴＰＴ）が使用されているが、有機スズは、例えば巻き貝の雌を雄化するなど、海の中に生きる生物の生理活動に悪影響を及ぼし、海の中の生態系が破壊されることが心配されている。
【０００９】
また、これら有害な有機化合物は海の中の食物連鎖の中で水産物中に濃縮され、人間がこの濃縮された有機化合物を含む水産物を摂取しているので、人間の健康に対するこれらの有機物の影響も極めて大きいものがある。
【００１０】
更に、被服生地等の染色で使用された染料色素は１０〜１５％が廃水中へ流出し、海の中に流れ込んで海の水を染料色素で染め、太陽の光が海の水の中に照射されるのを遮って藻類の光合成を妨げ、藻類の生育を阻害し、藻類を食べて生育する海産物の生育を悪化させている。
【００１１】
従って、海洋に投棄された廃棄物中のこれらの有機化合物を速やかに分解・無害化する微生物及びこの微生物を用いた環境修復方法を見つけることが急務である。
【００１２】
そこで、例えば特開２００１−１６９７７５号特許出願において、塩分を含む環境下でこれらの有機化合物を分解する微生物及びこの微生物を用いた環境修復方法が提案されている。
【特許文献１】特開平９−１７３０５１
【特許文献２】特開２００１−１６９７７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかし、この微生物は塩分を含む環境下でこれらの有機化合物を分解・無害化する能力を備えているが、分解速度、分解出来る有機化合物の種類の点で万能ではない。
【００１４】
塩分を含む環境下でこれらの有機化合物を分解する能力を有し、分解速度や分解できる有機化合物の種類の点で先の微生物より優れた微生物及びこの微生物を用いた環境修復方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この発明に係る糸状菌は、ペスタロティオプシス(Pestalotiopsis)属に属し、塩分を含む環境下で少なくともリグニン分解活性を有することを特徴とするものである。リグニン分解酵素のうちでラッカーゼを主に産生する。有性生殖器官を形成しないアナモルフ（anamorph)の菌類であり、分生子の細胞数は６（内、有色細胞４）で３−９本の付属糸を有する。  Pestalotiopsis sp. SN-3株（ＦＥＲＭＰ−２０３７５）である。
【００１６】
ＮａＣｌ濃度０〜１２％（Ｗ／Ｖ）、ｐＨ２〜１１、４〜３７℃の範囲で生育可能であり、培養液の保存については、５℃冷蔵において全く活性を失わず、−２０℃冷凍では活性を失う。本菌はＮａＣｌ濃度５％まではリグニン分解活性を有する。
【００１７】
また、この発明に係る環境浄化剤は、上記の糸状菌及び／又はその分泌物を有効量含有することを特徴とするものである。
【００１８】
また、この発明に係る環境浄化方法は、上記の糸状菌及び／又はその分泌物を用いて環境汚染物質を分解させ、環境を修復（バイオレメディエーション）することを特徴とするものである。ここで、環境汚染物質とは、例えば、染色に用いる色素染料、船底塗料等に含まれる有機スズ（ＴＢＴ、ＴＰＴ）、内分泌攪乱物質であるノニフェノール、ダイオキシン等をいう。
【発明の効果】
【００１９】
この発明に係る微生物は、これまで知られている微生物と比べて分解され難い有機化合物を分解する能力が高いので、有害な有機化合物で汚染された環境を速やかに修復することができるという効果がある。
【００２０】
この発明に係る微生物は、塩分を含む環境中でも有機化合物を分解する能力が高いので、有害な有機化合物で汚染された塩分を含む環境を速やかに修復することができるという効果がある。
【００２１】
この発明に係る微生物は自己の生命活動を利用して有害な有機化合物を分解するので、石油等の熱エネルギーを使用して有害な有機化合物を熱分解させる場合と比べ、有害ガスの発生による二次汚染を心配することなく低コストで環境を修復することができるという効果がある。
【００２２】
この発明に係る微生物は環境中の有害な有機化合物の濃度を減少させるので、生物中へ蓄積・濃縮される有害な有機化合物の濃度レベルを下げることができ、漁獲物を摂取している人間の健康へのこれら有機物の影響を低減することができるという効果がある。
【００２３】
この発明に係る微生物は、有害な有機化合物が色素染料の場合、化学物質を使うことなく色素染料を脱色することができるので、色素染料を脱色処理するために還元剤を使用し、その廃液を環境中に排出させる従来の場合と比べ、還元剤によって環境を汚染しなくて済むという効果がある。
【００２４】
この発明に係る微生物は、化学物質を使うことなくパルプを漂白することができるので、パルプを漂白するために還元剤を使用し、その廃液を環境中に排出させる従来の場合と比べ、還元剤によって環境を汚染しなくて済むという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
分解速度や分解できる有機化合物の種類の点で先の微生物より優れた微生物を提供するという目的を、塩分を含む環境下でこれらの有機化合物を分解する能力を損なわずに実現した。
【実施例】
【００２６】
リグニン分解菌の分離：  まず、日本各地の沿岸域から土、流木を採取し、これらに付着している種々の菌をグアイヤコール発色法により一次スクリーニングして、リグニンを酸化させる能力を備えた菌（リグニン分解菌）を分離した。リグニン分解菌の一次スクリーニングの手順は次の通りである。
【００２７】
培地の調製：  Lip medium (Kirk medium) にο-メトキシフェノール（グアイヤコール）１．２４ｇ／リットルを加え、グルコースを除外したものをG-medium とした。また、Lip medium にο-メトキシフェノール（グアイヤコール）０．２５ｇ／リットルを加え、グルコースの量を０．５ｇ／リットルに変えたものをGG-mediumとした。
【００２８】
培養試験：  ５０ミリモルのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、５０ミリモルのＴｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．５）、５０ミリモルのＭＣＨＥＳ（ｐＨ９．０）を調整し、それぞれを２０ｍｌずつ取って１００ｍｌの三角フラスコに入れた。また、ＰＤＡ培地（ポテトデキストロース寒天培地）、G-medium平板寒天培地を準備した。寒天の濃度は２％とした。
【００２９】
次に、上記三角フラスコに土又は流木を砕いたものを適量入れ、２７℃で７日間放置した。そして、この三角フラスコ内の培養液を２００μl取り、これをＰＤＡ培地に塗沫し、２７℃で３日間培養した。
【００３０】
次に、ＰＤＡ培地において生育がよく、目視で有望と思われる菌を、白金耳を用いて G-medium平板寒天培地に植え継いだ。そして、培地において、グアイヤコールを分解し赤く発色した菌（リグニン分解菌）を分離・採取した。
【００３１】
リグニン分解菌の選択：  グアイヤコール発色法で分離・採取したリグニン分解菌をリグニン分解活性法により二次スクリーニングし、リグニン分解能力の高い菌を選び出した。この二次スクリーニングの手順は次の通りである。
【００３２】
一次スクリーニングで分離した各リグニン分解菌をＰＤＡ平板寒天培地に白金耳を用いて塗沫し、２７℃で３日間培養した。１００ｍｌ三角フラスコにLiP mediumを２０ｍｌ入れたものを用意し、ＰＤＡ平板寒天培地で良く生育した菌を掻き取り、これを三角フラスコに植え継ぎ、暗所において、２７℃で４日間振盪培養した。
【００３３】
次に、培養液を１ｍｌ分取し、13,000g、２分、4℃で遠心分離し、上澄に含まれている酵素の活性を調べた。上澄みに含まれているリグニン分解酵素としては、Lignin peroxidase（以下、ＬｉＰという。）、Manganese peroxidase（以下、ＭｎＰという。）、Laccase（以下、Ｌａｃという。）が考えられるので、各々の活性について調べた。
【００３４】
ＬｉＰ活性は、Veratryl alcohol（以後VAと表記）を基質、サンプル（上澄み）を酵素とし、酵素反応により酸化されて生産されるベラトリルアルデヒドを分光光度計によりAbs.310nmで測定した。結果は表１に示す通りであった。
【００３５】
ＭｎＰ活性は、2,6-dimethoxyphenolを基質、サンプル（上澄み）をを酵素とし、酵素反応により酸化されて生産されるdimethoxyphenolを分光光度計によりAbs.469nmで測定した。結果は表１に示す通りであった。
【００３６】
Ｌａｃ活性は、2,2 - azino - bis( 3 - ethybenz - thiazoline - 6 - sulfolic acid) diammonium salt(以後ABTSと表記)を基質、サンプル（上澄み）をを酵素とし、酵素反応により酸化されるABTSを分光光度計によりAbs. 410 nm で測定した。結果は表１に示す通りであった。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
表１に示す結果から、奄美大島の湿地帯から採取した流木に付着していたＳＮ−３菌が最も高いＬａｃ活性を有していることがわかった。また、Ｌｉｐ活性は、この実験で用いた全てのリグニン分解菌について見られなかった。
【００３９】
リグニン分解菌の同定：  現在報告されているリグニン分解菌には、Phanerochaete chrysosporiumを代表的とする担子菌に属するものが多い。ＳＮ−３菌が既知のリグニン分解菌と同一であるか、新規のものであるかを確認するため、菌糸、生殖器官（分生子）等の形態学的特長による属の同定を行った。
【００４０】
同定の方法としては、当該微生物をＰＤＡ，ＭＡ，ＯＡ，ＬＣＡ，１／３ＳＷ・ＬＣＡの各種培地に接種し、２５℃で１週間培養を行い、コロニーの巨視的特長の観察を肉眼及び実体顕微鏡で行った。コロニー色調に関する記述はKornerup and Wanscher(1978)に従った。また、スライド培養検体の微視的特長の観察を光学顕微鏡U-LH1000（オリンパス、東京）で行った。
【００４１】
各プレートにおいて培養1週間後および2週間後に巨視的観察を行い、コロニー直径・色調・表面性状・可溶性色素産生の有無等の点に関して記録を行った。結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
培養１週間目に１／３ＳＷ・ＬＣＡのみで黒色の分生子塊の形成がわずかに認められ、培養2週間目にＰＤＡ培地およびＯＡ(Bacto Oatmeal Agar)培地で形成が認められた。特にＯＡでその形成率が高い傾向が認められた。
【００４４】
更に微視的観察を行った結果、図１に示すように、栄養菌糸は寒天表面上もしくは寒天内に形成され、無色の有隔壁菌糸の形成が認められた。菌糸幅は細く、ほぼ同じ幅であり、厚壁菌糸の形成は確認されなかった。
【００４５】
分生子果は分生子層様で、黒色で培地にやや埋没して形成され、黒色の分生子塊を出す様子が認められた。分生子形成構造としては、分生子柄は無色で、層状に集合して形成される様子が認められた。分生子形成細胞は無色で円筒形、１細胞から１つの分生子を形成する様子が認められた。分生子は紡錐体で、真っ直ぐかやや曲がり、５細胞性で、真ん中の３細胞が褐色で両端の２細胞が無色を示した。
【００４６】
分生子の頂端細胞からは２〜３本の付属糸が形成され、基端細胞からは１本の非分岐の刺状の付属糸が形成される様子が認められた。微分干渉顕微鏡（2000倍）で撮影した分生子の写真を図２に示す。分生子は黒色ドロップ状の分生子塊となり形成される様子が認められた。長期培養検体からはテレオモルフの形成は確認できなかった。
【００４７】
以上、ＳＮ−３菌の観察された形態的特徴を踏まえて、Arx(1981)、Kiffer and Morelet(2000)、Sutton(1980)に記載されている菌類の検索表を用いて、ＳＮ−３菌の属までの帰属分類群を推定した。その結果、有性生殖器官を形成しないアナモルフ（anamorph）の菌類、不完全菌類（anamorphic fungi）のなかでも分生子果不完全菌類（Coelomycetes）であるPestalotiopsis属の形態的特長とほぼ一致した。
【００４８】
Pestalotiopsis属に形態的に類似した菌としてPestalotia属、Truncatella属、Monochaetia属等が知られている．これらの属とPestalotiopsis属は「分生子の細胞数および有色細胞の数、頂端付属糸の数」といった形態的特徴から識別されている。Pestalotia属は６細胞（有色細胞４）で３−９本の付属糸、Truncatella属は4細胞（有色細胞2）で１〜本の付属糸、Monochaetia属は5細胞（有色細胞3）で１本の付属糸という特徴を持ち、Pestalotiopsis属と区別することができる。Pestalotiopsis属は研究者によってはPestalotia属に含まれる場合もあるが、今回はSutton(1980)らの見解に従い、ＳＮ−３菌をPestalotiopsis属と同定した。
【００４９】
そして、このＳＮ−３菌は平成１７年１月２４日（受領日）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３７５として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
【００５０】
次に、このＳＮ−３菌の生理学的な性状について検討した。
【００５１】
生育温度の検討：  LiP mediumのみからなる培養液（Ａ）と、ＮａＣｌを３％を含むLiP mediumからなる培養液（Ｂ）と、１４本の１００ｍｌフラスコを準備し、７本のフラスコに培養液（Ａ）を２０ｍｌずつ入れ、ＳＮ−３菌を植菌し、別の７本のフラスコに培養液（Ｂ）を２０ｍｌずつ入れ、ＳＮ−３菌を植菌し、培養液（Ａ），（Ｂ）毎に４℃，５℃，１０℃，２０℃，２７℃，３７℃又は４５℃で各フラスコを静置し、二週間培養した。結果は表３に示す通りであった。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
表３に示された結果から、ＳＮ−３菌の生育可能温度は、ＮａＣｌの有無にかかわらず、５〜３７℃の範囲であり、２０〜２７℃の範囲が最適生育温度であることがわかる。なお、表３中、−、＋、＋＋、＋＋＋の印は、−が生育せず、＋が生育、＋＋が生育良好、＋＋＋が非常に良く生育するを意味する。
【００５４】
生育ｐHの検討：  LiP medium (Kirk medium)にGood's Bufferを基本とし、初発pHを2〜11に調整し、この培地でＳＮ−３菌を、２７℃で５日間振盪培養し、その後、吸引濾過して菌体を取り出し、これを１０５℃で９０分間乾燥させ、重量を測定した。結果は表４及び図３に示す通りであった。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
表４及び図３に示された結果から、ＳＮ−３菌はpH２〜１１の範囲で生育可能であり、Ｌａｃ活性の限界ｐＨは１１であった。ただし、中性付近では生育が良好であるが、Ｌａｃ活性は低く、反対に酸性、アルカリ性側では生育が不良であったが、Ｌａｃ活性は高く、最適生育条件と最適分解条件は異なっていることがわかる。
【００５７】
耐ＮａＣｌの検討：  ＬｉＰ培地にNaClを濃度が０，１．５，３，５，１０，１２，１５％となるように加え、この培地でＳＮ−３菌を、２７℃で５日間振盪培養し、その後、吸引濾過して菌体を取り出し、これを１０５℃で９０分間乾燥させ、重量を測定した。結果は表５及び図４に示す通りであった。
【００５８】
【表５】
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【００５９】
表５及び図４に示された結果から、ＳＮ−３菌はＮａＣｌ濃度０〜１２％（Ｗ／Ｖ）の範囲で生育可能であることがわかった。また、ＳＮ−３菌はＮａＣｌの上限濃度５％まで分解活性を有することが分かる。また、ＳＮ−３菌がＬａｃを産生する限界ＮａＣｌ濃度は５％(w/v)であることがわかった。
【００６０】
色素染料を分解する能力の検討：  次に、培地としてLiP mediumを用い、この培地に表６に示す色素を初期濃度７０ｐｐｍで添加し、温度２７℃、ｐＨ３の条件でＳＮ−３菌を培養し、２４時間後の培養液を12000rpm、２分の条件で遠心分離し、上澄液の吸光度（各色素染料の最大吸収波長における吸光度）を測定した。結果は表６に示す通りであった。
【００６１】
【表６】
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【００６２】
ここで、色素脱色率（％）は，各色素染料の最大吸収波長における吸光度の減少を分光光度計により測定して求めた。また、脱色速度は、初期の培養上清の吸光度と、ある時間経過後の各培養上清の吸光度との差を測定し、染料濃度の変化（ppm/h）として求めた。
【００６３】
表６に示された結果から、インクに使用されているリアクティブ色素（Reactive Green 5, Reactive Black 5, Reactive Blue 5，Reactive Red 120），微生物検査で汎用されるクリスタルバイオレッド（Crystal Violet），タール色素（赤色2号，赤色3号，赤色104号，赤色105号），タンパク検出等で汎用されるクマージーブリリアントブルー（Coomassie Brilliant Blue）など，発色団にかかわらず，広範囲の色素が脱色されることがわかった。
【００６４】
ＴＢＴ、ＴＰＴを分解する能力の検討：  次に、培地としてKirk mediumを用い、この培地に初期濃度０．１ｐｐｍのＴＢＴ、ＴＰＴを添加し、温度２７℃、ｐＨ３の条件でＳＮ−３菌を培養し、２４時間後の培養液を12000rpm、２分の条件で遠心分離し、上澄液のＴＢＴ、ＴＰＴをガスクロマトグラフィーにより測定した。結果は表７に示す通りであった。
【００６５】
【表７】
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【００６６】
表７に示された結果から、ＳＮ−３菌はＴＢＴ、ＴＰＴをいずれも約１週間で約８０％分解することがわかった。
【００６７】
分泌された酵素の特性：  ＳＮ−３菌から分泌された酵素はラッカーゼ(Lac, EC 1. 10. 3. 2)のみからなる。最適条件下での本酵素の活性は、３３０Ｕ／Ｌであり、代表的なリグニン分解微生物である Phanerochaete chrysosporium が産生する酵素の活性と比べて、短期間で高い酵素活性を示す。５℃冷蔵では活性を失わないが、−２０℃冷凍では活性を失う。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
この発明に係る糸状菌及び／又はその分泌物は色素染料を漂白する作用を有しているので、環境修復（レメディエーション）に利用するだけでなく、パルプを漂白したり、衣服に付いたしみを選択的に抜く手段として利用する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＳＮ−３菌の顕微鏡写真である。
【図２】ＳＮ−３菌の分生子の顕微鏡写真である。
【図３】ｐＨとＳＮ−３菌の成長量（ｇ／ｌ）及びＬａｃ活性（Ｕ／Ｌ）との関係を示すグラフ。
【図４】ＮａＣｌ濃度とＳＮ−３菌の成長量（ｇ／ｌ）及びＬａｃ活性（Ｕ／Ｌ）との関係を示すグラフ。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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