(57)【要約】【課題】  測定精度の低下が少なく、必要な固定量を確保可能な高さの流路を持つセンサユニットを提供する。【解決手段】  センサ面１３ａの上方には、試料溶液を送液する流路１６が形成された流路部材４１が設けられる。センサ面１３ａには、流路１６を通じてリガンド溶液が送液され、リガンドが固定される。この後、リガンドとアナライトとの反応状況が測定される。流路１６には、固定後いったんバッファが注入され、測定時には、その状態でアナライト溶液が注入される。リガンドの固定量は、リガンド溶液の注入量が多ければ多いほどよいので、流路１６のうち、センサ面１３ａと対向する対向部分１６ｃの流路の高さＨは高い方がよい。他方、測定時には、流路の高さＨが低い方が液置換効率が高く、測定精度がよい。このため、流路の高さＨは、約２００μｍ〜約５００μｍの範囲に決められる。【選択図】        図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明な誘電体と、この誘電体上に形成され一方の面が試料の反応を検知するためのセンサ面となる薄膜と、前記センサ面へ前記試料を含む試料溶液を送液する流路が形成された流路部材とからなり、前記誘電体を通じて前記センサ面の裏面の光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させたときに前記センサ面の裏面で反射した反射光の減衰角が前記試料の反応状況に応じて変化する全反射減衰を利用するセンサユニットにおいて、
前記流路のうち、前記センサ面と対向して配置され、前記試料溶液を前記センサ面と接触させながら平行に流す対向部分の高さが、２００μｍ〜５００μｍの範囲であることを特徴とする全反射減衰を利用するセンサユニット。
【請求項２】
さらに、前記対向部分の高さが、２５０μｍ〜３５０μｍの範囲であることを特徴とする請求項１記載の全反射減衰を利用するセンサユニット。
【請求項３】
前記対向部分の幅は、１ｍｍであることを特徴とする請求項１又は２記載の全反射減衰を利用するセンサユニット。
【請求項４】
前記対向部分は、前記センサ面と対向して当接する前記流路部材の当接面に形成され、前記センサ面との当接により封止される溝であることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の全反射減衰を利用するセンサユニット。
【請求項５】
前記試料として、第１及び第２の２つの試料が用いられ、前記流路を通じて、前記第１の試料を含む第１試料溶液を前記センサ面に送液して前記センサ面に固定する固定処理がなされた後、前記第２試料を含む第２試料溶液を前記センサ面に送液してこれを前記センサ面上の前記第１の試料と接触させてそれらの反応状況を調べる測定処理が行われることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の全反射減衰を利用するセンサユニット。
【請求項６】
透明な誘電体上に形成された薄膜の一方の面を第１及び第２の２つの試料の反応を検知するセンサ面として用い、このセンサ面に第１の試料を含む第１試料溶液を送液して固定した後、前記センサ面に前記第１の試料とは異なる第２の試料を含む第２試料溶液を送液して前記第１及び第２の各試料を接触させるとともに、前記センサ面の裏面に向けて全反射条件を満たすように前記誘電体を通じて光を入射させ、前記センサ面の裏面で反射した反射光を受光して、全反射減衰によって生じる前記反射光の減衰角の変化を調べることにより、前記第１及び第２の各試料の反応状況を測定する全反射減衰を利用する測定方法において、
前記第１及び第２の各試料溶液を前記センサ面へ送液する際に、前記センサ面と対向して配置され、前記各試料溶液を前記センサ面と接触させながら前記センサ面と平行に流す対向部分を持ち、その対向部分の高さが、２００μｍ〜５００μｍの範囲である流路を用いることを特徴とする全反射減衰を利用する測定方法。
【請求項７】
前記対向部分の高さは、２５０μｍ〜３５０μｍの範囲であることを特徴とする請求項６記載の全反射減衰を利用する測定方法。
【請求項８】
前記対向部分の幅は、１ｍｍであることを特徴とする請求項６又は７記載の全反射減衰を利用する測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全反射減衰を利用するセンサユニット及び測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えば、タンパク質やＤＮＡなどの生化学物質の相互作用を調べたり、薬品のスクリーニングを行う場合において、試料の反応を測定する測定装置として、全反射減衰を利用した測定装置が知られている。
【０００３】
全反射減衰を利用した測定装置は、透明な誘電体上に形成された薄膜の一方の面であるセンサ面上において試料の反応を生じさせ、前記センサ面の裏面の光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させ、その反射光の減衰状況を検出することにより前記反応を測定する。こうした全反射減衰を利用した測定装置の１つに、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）現象を利用した測定装置（以下、ＳＰＲ測定装置という）がある。表面プラズモンとは、金属中の自由電子が集団的に振動することによって生じ、その金属の表面に沿って進む自由電子の粗密波である。
【０００４】
ＳＰＲ測定装置は、透明な誘電体上に形成された薄膜として金属膜を使用し、この金属膜の一方の面をセンサ面として、このセンサ面にＳＰＲを発生させ、そこで生じる物質の反応状況をＳＰＲを検出することにより測定する。
【０００５】
金属膜のセンサ面の裏面から、全反射条件を満足するように（臨界角以上の入射角で）光を照射すると、その光入射面において全反射が起こるが、入射光のうちわずかな光は反射せずに金属膜内を通過して、センサ面に染み出す。この染み出した光波がエバネッセント波と呼ばれる。このエバネッセント波と表面プラズモンの振動数が一致して共鳴すると（ＳＰＲが発生すると）、反射光の強度が大きく減衰する。ＳＰＲ測定装置は、前記光入射面で反射する反射光の減衰を捉えることにより、その裏側のセンサ面で発生するＳＰＲを検出する。
【０００６】
ＳＰＲを発生させるための光の入射角（共鳴角）は、エバネッセント波および表面プラズモンが伝播する媒質の屈折率に依存する。言い換えると、媒質の屈折率が変化すれば、ＳＰＲを発生させる共鳴角が変化する。センサ面と接する物質は、エバネッセント波および表面プラズモンを伝播させる媒質となるので、例えば、センサ面において、２種類の分子間の結合や解離などの化学反応が生じると、それが媒質の屈折率の変化として顕れて、共鳴角が変化する。ＳＰＲ測定装置は、この共鳴角の変化を捉えることにより分子間の相互作用を測定する。
【０００７】
生化学分野の実験や研究においては、タンパク質、ＤＮＡ、薬品などが、リガンドやアナライトとして使用される。例えば、薬品のスクリーニングを行う場合には、リガンドとして、タンパク質などの生体物質を使用し、このセンサ面にアナライトとなる複数種類の薬品を接触させて、それらの相互作用を調べる。
【０００８】
下記特許文献１に記載のＳＰＲ測定装置は、金属膜に光を入射させるための光学系として、Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置を採用している。Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置では、金属膜の光入射面と、この光入射面に向けて全反射条件を満足するように照射された光を集光するプリズムとが接合される。センサ面には、リガンドが固定され、センサ面と対向する位置には、アナライトを流す流路が配置される。この流路にアナライトを送液して、アナライトとリガンドとを接触させ、そのときのＳＰＲの発生を検出することによりそれらの相互作用が測定される。
【０００９】
下記特許文献１記載のＳＰＲ測定装置では、装置本体に、プリズムと、流路が形成された流路部材とが配置された測定ステージが設けられており、この測定ステージに、透明な誘電体であるガラス基板上に金属膜を形成した略平板上のチップ型のＳＰＲセンサ（以下、単にチップ型センサという）を装着して、測定が行われる。このチップ型センサは、前記装置本体に着脱自在であり、センサ面と流路とが対向し、光入射面とプリズムとが対向するように、装着される。測定を行う前には前処理として、チップ型センサの金属膜上にリガンドを固定する処理（リガンド固定処理）が行われるが、下記特許文献１記載のＳＰＲ装置では、このリガンド固定処理についても、チップ型センサを測定ステージに装着した状態で行われる。
【００１０】
前記流路部材には、センサ面と当接する当接面に、前記センサ面に、試料となるリガンド及びアナライトを含む溶液を接触させながら、それらを前記センサ面と平行に流す溝が形成されており、この溝が、前記流路のうち、前記センサ面と対向する対向部分を構成する。チップ型センサは、センサ面が露出されており、チップ型センサが測定ステージに装着されると、センサ面によって流路の開放部位が覆われて、前記対向部分が密閉される。これにより、センサ面への送液が可能となる。
【００１１】
こうした状態で、流路へリガンドを注入して固定処理が行われる。この固定処理が終了した後、流路に洗浄液を注入して洗浄処理が行われる。洗浄液が注入される前には流路内にはリガンド溶液が満たされており、その状態で、流路へ洗浄液が注入される。流路内のリガンド溶液は、新たに注入された洗浄液によって押し出されて流路から排出される。こうして、流路内の液の入れ替え（置換）が行われる。
【００１２】
洗浄後、流路には、いったんバッファ液が注入された後、アナライト溶液が注入されて測定処理が行われる。所定時間経過後、再びバッファ液が注入されて測定処理が終了する。バッファ液は、ＳＰＲ信号のベースラインを検出するために注入される。ＳＰＲ信号の取得は、流路がバッファ液で満たされているときから開始され、アナライト溶液を注入した後、再びバッファ液を注入してアナライト溶液が排出されるまで続く。これにより、アナライトとリガンドとの結合から脱離までの反応状況を調べることができる。
【００１３】
【特許文献１】特開平６−１６７４４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
リガンドのセンサ面への固定量は、リガンドの流路への注入量を多くすれば増える。そのため、注入量を多くするには、対向部分の流路断面積（以下、流路断面積）を大きくして流路の容積を大きくする必要がある。流路断面積は、流路の幅を一定とすれば、流路の高さ（センサ面から流路の天上までの高さ）によって決まるので、流路の高さが高い方がよい。
【００１５】
他方、リガンドとアナライトの結合反応や脱離反応は短時間で生じるため、ＳＰＲ信号の測定によって、その反応速度を把握するためには、流路の高さは低い方がよい。というのは、一般に、流路内の液体の流れは、液体が持つ粘性のために流路断面の中心から内壁面に向かって速度勾配が生じ、内壁面に近づくほど流速が低下する。このため、例えば、アナライトで満たされた流路へバッファを注入してアナライトからバッファへ置換を行う場合に、流路の内壁面に相当するセンサ面では、流路の中心付近と比較して置換が遅れるので、センサ面にアナライトが残留する。このアナライトの残留量の多寡は、流路内の液の置換率（以下、液置換率という）で表される。ここで液置換率とは、既に流路へ注入済みの液体が新たに注入された別の液体に置換される割合をいう。液置換率は注入を複数回行ったり時間をかければ上昇するが、前記反応速度を正確に測定するためには、１回の注入でしかも短時間で高い液置換率を確保することが必要となる。流路の高さを低くすると、流路の中心からセンサ面までの距離が短くなり、液体の粘性に起因する速度勾配が抑制されるので、短時間で高い液置換率が確保される。
【００１６】
このように、固定時と測定時においては、それぞれに最適な流路の高さが相反する傾向にあるので、固定時と測定時の両方でバランスのよい流路の高さの最適な範囲が模索されていた。
【００１７】
本発明は、測定精度の低下が少なく、必要な固定量を確保可能な高さの流路を持つ全反射減衰を利用するセンサユニット及び測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明のセンサユニットは、透明な誘電体と、この誘電体上に形成され一方の面が試料の反応を検知するためのセンサ面となる薄膜と、前記センサ面へ前記試料を含む試料溶液を送液する流路が形成された流路部材とからなり、前記誘電体を通じて前記センサ面の裏面の光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させたときに前記センサ面の裏面で反射した反射光の減衰角が前記試料の反応状況に応じて変化する全反射減衰を利用するセンサユニットにおいて、前記流路のうち、前記センサ面と対向して配置され、前記試料溶液を前記センサ面と接触させながら平行に流す対向部分の高さが、約２００μｍ〜約５００μｍの範囲であることを特徴とする。
【００１９】
さらに、前記対向部分の高さは、約２５０μｍ〜約３５０μｍの範囲であることが好ましい。
【００２０】
前記対向部分の幅は、例えば、約１ｍｍである。
【００２１】
前記対向部分は、例えば、前記センサ面と対向して当接する前記流路部材の当接面に形成され、前記センサ面との当接により封止される溝である。
【００２２】
前記試料として、例えば、第１及び第２の２つの試料が用いられ、前記流路を通じて、前記第１の試料を含む第１試料溶液を前記センサ面に送液して前記センサ面に固定する固定処理がなされた後、前記第２試料を含む第２試料溶液を前記センサ面に送液してこれを前記センサ面上の前記第１の試料と接触させてそれらの反応状況を調べる測定処理が行われる。
【００２３】
本発明の全反射減衰を利用した測定方法は、透明な誘電体上に形成された薄膜の一方の面を第１及び第２の２つの試料の反応を検知するセンサ面として用い、このセンサ面に第１の試料を含む第１試料溶液を送液して固定した後、前記センサ面に前記第１の試料とは異なる第２の試料を含む第２試料溶液を送液して前記第１及び第２の各試料を接触させるとともに、前記センサ面の裏面に向けて全反射条件を満たすように前記誘電体を通じて光を入射させ、前記センサ面の裏面で反射した反射光を受光して、全反射減衰によって生じる前記反射光の減衰角の変化を調べることにより、前記第１及び第２の各試料の反応状況を測定する全反射減衰を利用する測定方法において、前記第１及び第２の各試料溶液を前記センサ面へ送液する際に、前記センサ面と対向して配置され、前記各試料溶液を前記センサ面と接触させながら前記センサ面と平行に流す対向部分を持ち、その対向部分の高さが、約２００μｍ〜約５００μｍの範囲である流路を用いることを特徴とする。
【００２４】
さらに、前記対向部分の高さは、約２５０μｍ〜約３５０μｍの範囲であることが好ましい。
【００２５】
前記対向部分の幅は、例えば、約１ｍｍである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、透明な誘電体上に形成され試料の反応を検知するセンサ面に試料溶液を送液する流路について、前記センサ面と対向して配置され、前記試料溶液を前記センサ面と接触させながら平行に流す対向部分の高さを、約２００μｍ〜約５００μｍの範囲にしたから、測定精度の低下が少なく、必要な固定量を確保することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
図１に示すように、ＳＰＲを利用した測定方法は、大きく分けて、固定工程と、測定処工程（データ読み取り工程）と、データ解析工程との３つの工程からなる。ＳＰＲ測定装置は、固定工程を行う固定機１０と、測定工程を行う測定機１１と、測定機１１によって得られたデータを解析するデータ解析機からなる。
【００２８】
測定は、ＳＰＲセンサであるセンサユニット１２を用いて行われる。センサユニット１２は、一方の面がＳＰＲが発生するセンサ面１３ａとなる金属膜１３と、このセンサ面１３ａの裏面の光入射面１３ｂと接合されるプリズム１４と、前記センサ面１３ａと対向して配置され、リガンドやアナライトが送液される流路１６が形成された流路部材４１とを備えている。
【００２９】
金属膜１３としては、例えば、金が使用され、その膜厚は、例えば、５０ｎｍである。この膜厚は、金属膜の素材、照射される光の発光波長などに応じて適宜選択される。プリズム１４は、その上面に前記金属膜１３が形成される透明な誘電体であり、光入射面１３ｂに向けて、全反射条件を満たすように照射された光を集光する。流路１６は、略Ｕ字形に屈曲された送液管であり、両端には、液体を注入する注入口と、それを排出する排出口となる１対の出入口１６ａ，１６ｂが設けられている。
【００３０】
また、流路１６の底部は、後述するように、開放されており、この開放部位はセンサ面１３ａによって覆われて封止される。これら流路１６とセンサ面１３ａによってセンサセル１７が構成される。後述するように、センサユニット１２は、こうしたセンサセル１７を複数個備えている（図３参照）。
【００３１】
固定工程は、センサ面１３ａにリガンドを固定する工程である。固定工程は、センサユニット１２を固定機１０にセットして行われる。固定機１０には、１対のピペット１９ａ，１９ｂからなるピペット対１９が設けられている。ピペット対１９は、各ピペット１９ａ，１９ｂが、それぞれ出入口１６ａ，１６ｂのそれぞれに挿入される。各ピペット１９ａ，１９ｂは、それぞれが流路１６への液体の注入と、流路１６からの吸い出しを行う機能を備えており、一方が注入動作を行っているときには、他方が吸い出し動作を行うというように、互いに連動する。このピペット対１９を用いて、出入口１６ａから、リガンドを溶媒に溶かしたリガンド溶液２１が注入される。
【００３２】
センサ面１３ａのほぼ中央部には、リガンドと結合するリンカー膜２２が形成されている。このリンカー膜２２は、センサユニット１２の製造段階において予め形成される。リンカー膜２２は、リガンドを固定するための固定基となるので、固定するリガンドの種類に応じて適宜選択される。
【００３３】
リガンド溶液２１を注入するリガンド固定化処理を行う前に、前処理として、まず、リンカー膜２２に対して、固定用バッファ液を送液してリンカー膜２２を湿らせた後、リンカー膜２２へリガンドが結合しやすくするためにリンカー膜２２の活性化処理が施される。例えば、アミンカップリング法では、リンカー膜２２としてカルボキシメチルデキストランが使用され、リガンド内のアミノ基をこのデキストランに直接共有結合させる。この場合の活性化液としては、Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）との混合液が使用される。この活性化処理の後、固定用バッファによって流路１６が洗浄される。
【００３４】
固定用バッファや、リガンド溶液２１の溶媒（希釈液）としては、例えば、各種のバッファ液（緩衝液）の他、生理的食塩水に代表される生理的塩類溶液や、純水が使用される。これらの各液の種類、ｐＨ値、混合物の種類及びその濃度等は、リガンドの種類に応じて適宜決められる。例えば、リガンドとして生体物質を使用する場合には、ｐＨを中性付近に調整した生理的食塩水が使用される場合が多い。しかし、上記アミンカップリング法では、リンカー膜２２は、カルボキシメチルデキストランにより負（マイナス）に帯電するので、このリンカー膜２２と結合しやすいようにタンパク質を陽（プラス）に帯電させるため、生理的とはいえない高濃度のリン酸塩を含む緩衝作用の強いリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ：ｐＨosｐＨatic−buffered，saline）などが使用される場合もある。
【００３５】
こうした活性化処理及び洗浄が行われた後、センサセル１７へリガンド溶液２１が注入されてリガンド固定化処理が行われる。リガンド溶液２１が流路１６へ注入されると、溶液中で拡散しているリガンド２１ａが徐々にリンカー膜２２へ近づいて、結合する。こうしてセンサ面１３ａにリガンド２１ａが固定される。固定化には、通常、約１時間程度かかり、この間、センサユニット１２は、温度を含む環境条件が所定の条件に設定された状態で、保管される。なお、固定化が進行している間、流路１６内のリガンド溶液２１を静置しておいてもよいが、流路１６内のリガンド溶液２１を攪拌して流動させることが好ましい。こうすることで、リガンドとリンカー膜２２との結合が促進され、リガンドの固定量を増加させることができる。
【００３６】
センサ面１３ａへのリガンド２１ａの固定化が完了すると、前記流路１６からリガンド溶液２１が排出される。リガンド溶液２１は、ピペット１９ｂによって吸い出されて排出される。固定化が完了したセンサ面１３ａは、流路１６へ洗浄液が注入されて洗浄処理が行われる。この洗浄後、必要に応じて、ブロッキング液を流路１６へ注入して、リンカー膜２２のうち、リガンドが結合しなかった反応基を失活させるブロッキング処理が行われる。ブロッキング液としては、例えば、エタノールアミン−ヒドロクロライドが使用される。このブロッキング処理の後、再び流路１６が洗浄される。この後、後述するように、流路１６には、乾燥防止液が注入される。こうして、センサユニット１２は、センサ面１３ａが乾燥防止液に浸された状態で、測定までの間保管される。
【００３７】
測定工程は、センサユニット１２を測定機１１にセットして行われる。測定機１１にも、固定機１０のピペット対１９と同様のピペット対２６が設けられている。このピペット対２６によって、出入口１６ａから、流路１６へ各種の液が注入される。測定工程では、まず、流路１６へ測定用バッファが注入される。この後、アナライトを溶媒に溶かしたアナライト溶液２７を注入し、その後、再び測定用バッファが注入される。なお、最初に測定用バッファを注入する前に、いったん流路１６の洗浄を行ってもよい。データの読み取りは、基準となる信号レベルを検出するために、最初に測定用バッファを注入した直後から開始され、アナライト溶液２７の注入後、再び測定用バッファが注入されるまでの間行われる。これにより、基準レベル（ベースライン）の検出、アナライトとリガンドの反応状況（結合状況）、測定用バッファ注入による結合したアナライトとリガンドの脱離までのＳＰＲ信号を測定することができる。
【００３８】
このように、測定工程では、バッファからアナライト溶液２７へ、そして、再びバッファへと、流路１６内の液体が置換される。液置換は、注入済みの液体を流路１６から排出した後、新たに別の液体を注入するのではなく、例えば、流路１６がアナライト溶液２７で満たされている場合には、その状態でバッファを注入し、新たに注入したバッファによってアナライト溶液２７を流路１６から押し出して排出することにより行われる。
【００３９】
測定用バッファや、アナライト溶液２７の溶媒（希釈液）としては、例えば、各種のバッファ液（緩衝液）の他、生理的食塩水に代表される生理的塩類溶液や、純水が使用される。これらの各液の種類、ｐＨ値、混合物の種類及びその濃度等は、リガンドの種類に応じて適宜決められる。例えば、アナライトを溶けやすくするために、生理的食塩水にＤＭＳＯ（ジメチル−スルホ−オキシド）を含ませてもよい。このＤＭＳＯは、信号レベルに大きく影響する。上述したとおり測定用バッファは基準レベルの検出に用いられるので、アナライトの溶媒中にＤＭＳＯが含まれる場合には、そのＤＭＳＯ濃度と同程度のＤＭＳＯ濃度を持つ測定用バッファを使用することが好ましい。
【００４０】
なお、アナライト溶液２７は、長期間（例えば、１年）保管されることも多く、そうした場合には、経時変化によって、初期のＤＭＳＯ濃度と測定時のＤＭＳＯ濃度との間に濃度差が生じてしまう場合がある。厳密な測定を行う必要がある場合には、こうした濃度差をアナライト溶液２７を注入したときの参照信号（ｒｅｆ信号）のレベルから推定し、測定データに対して補正（ＤＭＳＯ濃度補正）が行われる。
【００４１】
ここで、参照信号（ｒｅｆ信号）とは、後述するように、センサ面上に設けられリガンドが固定されない参照領域に対応するＳＰＲ信号であり、リガンドが固定されアナライトとの反応を生じる測定領域の測定信号（ａｃｔ信号）と比較参照される信号である。測定に際しては、前記測定信号と参照信号の２つの信号が検出され、データ解析に際しては、例えば、それら２つのＳＰＲ信号の差分を取り、これを測定データとして解析がなされる。こうすることで、例えば、複数のセンサセル間の個体差や、液体の温度変化など、外乱に起因するノイズをキャンセルすることが可能となり、Ｓ／Ｎ比の良好な信号が得られるようにしている。
【００４２】
ＤＭＳＯ濃度補正のための補正データは、アナライト溶液２７を注入する前に、ＤＭＳＯ濃度が異なる複数種類の測定用バッファをセンサセル１７に注入して、このときのＤＭＳＯ濃度変化に応じた、ｒｅｆ信号のレベルとａｃｔ信号のレベルのそれぞれの変化量を調べることにより求められる。
【００４３】
測定部３１は、照明部３２と検出器３３からなる。上述したとおり、リガンドとアナライトの反応状況は、共鳴角（光入射面に対して照射された光の入射角）の変化として顕れる。そのため、照明部３２は、全反射条件を満足する様々な入射角の光を光入射面１３ｂに対して照射する。照明部３２は、例えば、光源３４と、集光レンズ、拡散板、偏光板を含む光学系３６とからなり、配置位置および設置角度は、照明光の入射角が、上記全反射条件を満足するように調整される。
【００４４】
光源３４としては、例えば、ＬＥＤ（Light Emitting Diode），ＬＤ（Laser Diode），ＳＬＤ（Super Luminescent Diode）などの発光素子が使用される。こうした発光素子を１個使用し、この単一光源から１つのセンサセルに向けて光が照射される。なお、複数のセンサセルを同時に測定するような場合には、単一光源からの光を分光して複数のセンサセルに照射してもよいし、各センサセルに対して発光素子が１つずつ割り当てられるように複数の発光素子を並べて使用してもよい。拡散板は、光源３４からの光を拡散して、発光面内の光量ムラを抑える。偏光板は、照射光のうち、ＳＰＲを生じさせるｐ偏光のみを通過させる。なお、ＬＤを使用する場合など、光源が発する光線自体の偏光の向きが揃っている場合には、偏光板は不要である。また、偏光が揃っている光源を使用した場合でも、拡散板を通過することにより、偏光の向きが不揃いになってしまう場合には、偏光板を使用して偏光の向きが揃えられる。こうして拡散および偏光された光は、集光レンズによって集光されてプリズム１４に照射される。これにより、光強度にバラツキがなく様々な入射角を持つ光線を光入射面１３ｂに入射させることができる。
【００４５】
検出器３３は、光入射面１３ｂで反射する光を受光して、その光強度に応じたレベルの電気信号を出力する。光入射面１３ｂには、様々な角度で光線が入射するので、光入射面１３ｂでは、それらの光線が、それぞれの入射角に応じて様々な反射角で反射する。検出器３３は、これらの様々な反射角の光線を受光する。センサ面１３ａ上にアナライトを送液すると、アナライトとリガンドの反応状況に応じて屈折率が変化して、前記共鳴角が変化し、光強度が減衰する反射角も変化する。
【００４６】
検出器３３は、例えば、ＣＣＤエリアセンサやフォトダイオードアレイが使用され、光入射面１３ｂにおいて様々な反射角で反射する反射光を受光し、それらを光電変換してＳＰＲ信号として出力する。リガンドとアナライトの反応状況は、この受光面内における反射光の減衰位置の推移として顕れる。例えば、アナライトがリガンドと接触する前後では、センサ面１３ａ上の屈折率が異なるので、ＳＰＲが発生する共鳴角及びそれに対応する反射角が異なる。そして、アナライトがリガンドと接触して反応を開始すると、それに応じて反射光の共鳴角が変化を開始して、前記受光面内における反射光の減衰位置が移動し始める。こうして得た反応状況を表すＳＰＲ信号が、データ解析機９１に出力される。データ解析工程では、測定機１１で得たＳＰＲ信号を解析して、アナライトの特性を分析する。
【００４７】
なお、測定部３１の構成が明確になるように、便宜的に、図１では、光入射面１３ｂへの入射光線およびそこで反射する反射光線の向きが、流路１６内の液体の流れ方向と平行になるように、照明部３２および検出器３３を配置した形態で示しているが、図２に示すように、本実施形態では、入射光線および反射光線の向きが、前記流れ方向と直交する方向に照射されるように、照明部３２および検出器３３が配置される。もちろん、測定部３１をこの図１に示しているように配置して測定してもよい。
【００４８】
図２に示すように、リンカー膜２２上には、リガンドが固定されアナライトとリガンドとの反応が生じる測定領域（ａｃｔ領域）２２ａと、リガンドが固定されず、前記測定領域の信号測定に際しての参照信号を得るための参照領域（ｒｅｆ領域）２２ｂとが形成される。このｒｅｆ領域２２ｂは、上述したリンカー膜２２を製膜する際に形成される。形成方法としては、例えば、リンカー膜２２に対して表面処理を施して、リンカー膜２２の半分程度の領域について、リガンドと結合する結合基を失活させる。これにより、リンカー膜２２の半分がａｃｔ領域２２ａとなり、残りの半分がｒｅｆ領域２２ｂとなる。
【００４９】
検出器３３は、ａｃｔ領域２２ａに対応するＳＰＲ信号をａｃｔ信号として出力し、ｒｅｆ領域２２ｂに対応するＳＰＲ信号をｒｅｆ信号として出力する。これらａｃｔ信号とｒｅｆ信号は、基準レベルの検出から結合反応を経て脱離に至るまで、ほぼ同時に計測される。データ解析は、こうして得られたａｃｔ信号とｒｅｆ信号の差や比を求めて行われる。データ解析機９１は、例えば、ａｃｔ信号とｒｅｆ信号との差分データを求め、この差分データを測定データとし、これに基づいて解析を行う。こうすることで、上述したとおり、センサユニットや各センサセルの個体差や、装置の機械的な変動や、液体の温度変化など、外乱に起因するノイズをキャンセルすることができるので、精度の高い測定が可能になる。
【００５０】
照明部３２及び検出器３３は、これら各ａｃｔ信号及びｒｅｆ信号の２チャンネルの計測を行うことができるように構成されている。例えば、照明部３２を、１個の発光素子を反射ミラー等を用いて、ａｃｔ領域２２ａとｒｅｆ領域２２ｂのそれぞれに向けて入射する複数の光線に分光する。そして、各チャンネル用の複数のフォトダイオードアレイで構成した検出器３３により、各光線をそれぞれ受光する。
【００５１】
また、検出器３３として、ＣＣＤエリアセンサを用いた場合には、同時に受光した各チャンネルの反射光を画像処理によってａｃｔ信号とｒｅｆ信号として認識することもできる。しかし、こうした画像処理による方法が難しい場合には、ａｃｔ領域２２ａとｒｅｆ領域２２ｂに対して入射させるタイミングを微小時間ずらして、各チャンネルの信号を受光するようにしてもよい。入射タイミングをずらす方法としては、例えば、光路上に、配置角度が１８０℃ずれた位置に２つの孔が形成された円板を配置し、この円板を回転させることにより、各チャンネルの入射タイミングがずらされる。各孔は、中心からの距離が各領域２２ａ，２２ｂの間隔だけ異なる位置に配置されており、これにより、一方の孔が光路内に進入したときには、ａｃｔ領域２２ａに光線が入射し、他方の孔が光路内に進入したときには、ｒｅｆ領域２２ｂに光線が入射する。
【００５２】
図３は、センサユニット１２の分解斜視図である。センサユニット１２は、流路１６が形成される流路部材４１と、上面に金属膜１３が形成されたプリズム１４と、流路部材４１を、その底面をプリズム１４の上面と接合させた状態で、保持する保持部材４２と、保持部材４２の上方に配置される蓋部材４３とからなる。
【００５３】
プリズム１４には、その上面に、蒸着によって金属膜１３が形成される。この金属膜１３は、流路部材４１に形成された複数の流路１６と対向するように短冊状に形成される。さらに、この金属膜１３の上面（センサ面１３ａ）には、各流路１６に対応する部位に、リンカー膜２２が形成される。また、プリズム１４の長手方向の両側面には、保持部材４２の係合部４２ａと係合する係合爪１４ａが設けられている。これらの係合により、流路部材４１が保持部材４２とプリズム１４とによって挟み込まれ、その底面４１ａとプリズム１４の上面とが圧接した状態で保持される。こうして、流路部材４１、金属膜１３およびプリズム１４が一体化される。
【００５４】
また、プリズム１４の短辺方向の両端部には、突部１４ｂが設けられている。後述するように、センサユニット１２は、ホルダ５２（図４参照）に収納された状態で、固定が行われる。突部１４ｂは、ホルダ５２と係合することにより、センサユニット１２をホルダ内の所定の収納位置に位置決めするためのものである。
【００５５】
保持部材４２の上部には、各流路１６の出入口１６ａ，１６ｂに対応する位置に、ピペット（１９ａ，１９ｂ，２６ａ，２６ｂ）の先端が進入する受け入れ口４２ｂが形成されている。受け入れ口４２ｂは、ピペットから吐出される液体が各出入口１６ａへ導かれるように、漏斗形状をしている。保持部材４２が流路部材４１を挟み込んでプリズム１４と係合すると、受け入れ口４２ｂの下面は、出入口１６ａ，１６ｂと接合して、受け入れ口４２ｂと流路１６とが連結される。
【００５６】
また、これら各受け入れ口４２ｂの両脇には、円筒形のボス４２ｃが設けられている。これらのボス４２ｃは、蓋部材４３に形成された穴４３ａと嵌合して、蓋部材４３を位置決めするためのものである。蓋部材４３は、受け入れ口４２ｂおよびボス４２ｃに対応する位置に穴が空けられた両面テープ４４によって、保持部材４２の上面に貼り付けられる。
【００５７】
蓋部材４３は、流路１６に通じる受け入れ口４２ｂを覆うことで、流路１６内の液体の蒸発を防止する。蓋部材４３は、弾性部材、例えば、ゴムやプラスチックで形成されており、各受け入れ口４２ｂに対応する位置に、十字形のスリット４３ｂが形成されている。蓋部材４３は、流路１６内の液体の蒸発を防止するためのものであるから、受け入れ口４２ｂを覆う必要があるが、完全に覆ってしまっては、ピペットを受け入れ口４２ｂに挿入することができない。そこで、スリット４３ｂを形成することで、ピペットの挿入を可能とするとともに、ピペットを挿入していない状態では、受け入れ口４２ｂが塞がれるようにしている。スリット４３ｂは、ピペットが押し込まれると、スリット４３ｂの周辺が弾性変形（図１参照）して、スリット４３ｂの口が大きく開いて、ピペットを受け入れる。そして、ピペットを抜くと、弾性力によってスリット４３ｂが初期状態に復帰して、受け入れ口４２ｂを塞ぐ。
【００５８】
流路部材４１は長尺状をしており、３つの流路１６が、その長手方向に沿って配列されている。上述したとおり、流路１６は、略Ｕ字形をしており、流路部材４１の底面４１ｂに形成されセンサ面１３ａと対向して液体をセンサ面１３ａと接触させながらそれと平行に流す対向部分１６ｃと、一端が対向部分１６ｃと接続し、他端にそれぞれ出入口１６ａ，１６ｂが形成され、対向部分１６ｃから垂直に立ち上がって流路部材４１を上下方向に貫通する貫通部分１６ｄとからなる。出入口１６ａから流路１６へ注入された液体は、垂直部分を通って対向部分１６ｃに流れ込み、センサ面１３ａに送液される。
【００５９】
図４に示すように、対向部分１６ｃは、底面４１ｂに形成された溝であり、底面４１ｂが金属膜１３と当接すると、溝がセンサ面１３ａによって封止される。こうして流路１６は、金属膜１３とともにセンサセル１７（図１参照）を構成する。そのため、流路部材４１は、金属膜１３との密着性を高めるために、弾性部材、例えば、ゴムや、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）で形成されている。これにより、流路部材４１の底面をプリズム１４の上面に圧接すると、流路部材４１が弾性変形して金属膜１３との接合面の隙間が埋められて、対向部分１６ｃがプリズム１４の上面によって水密に封止される。
【００６０】
図５に示すように、流路１６の１対の出入口１６ａ，１６ｂの間隔は、例えば、約１０ｍｍである。貫通部分１６ｄの直径Ｄは、約０．７〜０．８ｍｍである。対向部分１６ｃの幅Ｗは、約１ｍｍである。また、センサ面１３ａと対向部分１６ｃの天上までの間隔である流路１６の高さ（以下、流路高さという）Ｈは、約０．３ｍｍである。固定処理の際には、この流路高さＨが高い方が、対向部分１６ｃの容積が大きくなるのでより多くのリガンドを注入することができ、センサ面１３ａに固定されるリガンドの固定量が多くなる。
【００６１】
他方、測定処理の際には、固定処理とは反対に、流路高さＨは、低ければ低いほどよい。図６に示すように、例えば、センサ面１３ａからのアナライトの脱離反応を検出する場合には、アナライト溶液２７からバッファ５０へ流路１６内の液体の置換が行われる。対向部分１６ｃを流れるアナライト溶液２７は、粘性のために、流路の中心からその内壁に相当するセンサ面１３ａに向かって速度勾配を持ち、センサ面１３ａ付近の流速は中心と比べて低下する。この流速の低下は流路高さＨが低いほど抑制されるので、新たに注入されたバッファ５０によってセンサ面１３ａ上のアナライトが押し出されて、その残留量が減る。これにより、短時間で高い液置換率が確保される。
【００６２】
図７は、測定時（結合反応から脱離反応まで）のＳＰＲ信号のグラフであり、図７（Ａ）は、流路高さＨが５００μｍの場合のグラフであり、図７（Ｂ）は、流路高さＨが３００μｍの場合のグラフである。ここで、ＳＰＲ信号の単位ＲＵ（レゾナンスユニット）は、センサ面１３ａ上の屈折率変化による減衰角の変化量を表し、それが高ければ高いほど変化量は大きい。
【００６３】
まず、流路１６をバッファ５０で満たして、ＳＰＲ信号のベースラインが測定される。この状態で、流路１６へアナライト溶液２７が注入されると、バッファ５０が押し出されてセンサ面１３ａにアナライト溶液２７が送られる。そうすると、センサ面１３ａ上でリガンドとアナライトの結合反応が生じ、ＳＰＲ信号のレベルが上昇する。この後、アナライト溶液２７を流路１６内に満たした状態で、バッファ５０が流路１６へ注入されて、アナライト溶液２７からバッファ５０へ置換される。この置換時の測定信号から脱離反応が解析される。図７（Ａ），（Ｂ）の各グラフからわかるように、バッファを１回注入したときの信号レベルが、図７（Ａ）に示す流路高さＨ＝５００μｍの場合の方が、図７（Ｂ）に示す流路高さＨ＝３００μｍの場合よりも高い。これは、センサ面１３ａ上のアナライトの残留量が多いことを意味し、液置換が遅れていることを表している。流路高さＨ＝５００μｍの場合でも、２回目のバッファ注入により、信号レベルがベースラインに復帰するが、このように置換が遅れると、流路高さＨ＝３００μｍの場合と比較して、脱離反応の反応速度の測定精度が低下する。
【００６４】
図８のグラフに示すように、曲線Ｃ１は、測定時において、所定の液交換率（本例では９９．７％）を達成するための置換時間と流路高さＨとの関係を表す。この曲線Ｃ１から分かるように、流路高さＨは高いほど置換時間が長くなり、リガンドとアナライトの結合反応を高速で測定することができなくなるので、測定精度の許容レベルを考慮すると、流路高さＨの上限値は、約５００μｍが好ましく、より測定精度を重視する場合には、約３５０μｍが好ましい。他方、流路高さＨが低ければ、測定精度が上がるが、固定量が減るので、必要な固定量を確保するために、流路高さＨの下限は、約２００μｍが好ましく、より固定量を重視する場合には、さらに、約２５０μｍが好ましい。すなわち、測定精度と固定量とをバランスよく確保できる好ましい流路高さＨの範囲Ｒとしては、約２００μｍ〜約５００μｍであり、より好ましくは、約２５０μｍ〜約３５０μｍである。
【００６５】
また、曲線Ｃ２は、固定時におけるリガンドの拡散距離と固定時間の関係を表す曲線Ｃ２とを示す。この曲線Ｃ２から、リガンド溶液中のリガンドは時間とともにその拡散距離が延びる（センサ面１３ａに到達するリガンドの量が増える）ので、固定時間を長くすれば、固定率（注入したリガンド溶液の量に対する固定量の割合）が高くなることがわかる。なお、図８のグラフは、リガンドの分子量が５００００の場合を示している。
【００６６】
上記実施形態では、３つの流路を１列に並べたセンサユニットを使用した例で説明しているが、１ユニットに含まれる流路の数は３つに限らず、１つでもよいし、３つ以上設けてもよい。
【００６７】
また、センサユニットとして、金属膜、流路、プリズムを一体化した例で説明したが、これらのうち、プリズムをセンサユニットの構成要素から除いて、装置側に組み込んでもよい。また、流路と金属膜とが一体化されたセンサユニットを用いずに、上記チップ型センサを用いて測定を行う場合にも本発明を適用することもできる。チップ型センサを用いる場合には、測定装置に流路が設けられており、その流路の高さが上記範囲に決められる。
【００６８】
また、本実施形態では、センサ面上にＳＰＲを発生させて、そのときの反射光の減衰を検出するＳＰＲセンサを例に説明したが、本発明のセンサユニット及び測定方法は、ＳＰＲセンサに限らず、全反射減衰を利用した測定に用いられる他のセンサ及び測定方法にも適用することができる。全反射減衰を利用するセンサとしては、ＳＰＲセンサの他に、例えば、漏洩モードセンサが知られている。漏洩モードセンサは、誘電体と、この上に順に層設されたクラッド層と光導波層とによって構成された薄膜とからなり、この薄膜の一方の面がセンサ面となり、他方の面が光入射面となる。光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させると、その一部が前記クラッド層を透過して前記光導波層に取り込まれる。そして、この光導波層において、導波モードが励起されると、前記光入射面における反射光が大きく減衰する。導波モードが励起される入射角は、ＳＰＲの共鳴角と同様に、センサ面上の媒質の屈折率に応じて変化する。この反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の反応が測定される。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＳＰＲ測定方法の説明図である。
【図２】リンカー膜上のａｃｔ領域とｒｅｆ領域の説明図である。
【図３】センサユニットの構成図である。
【図４】流路部材の底面を示す斜視図である。
【図５】流路の寸法の説明図である。
【図６】液置換時における速度勾配の説明図である。
【図７】測定時のＳＰＲ信号波形を示すグラフである。
【図８】流路高さと置換時間との関係を表すグラフである。
【符号の説明】
【００７０】
１０  固定機
１１  測定機
１２  センサユニット
１３  金属膜
１３ａ  センサ面
１６  流路
１６ｃ  対向部分
１７  センサセル
２２  リンカー膜
３１  測定部
３２  照明部
３３  検出器
４１  流路部材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006242916.tif 000009
【図８】
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