(57)【要約】【課題】    放射線照射により滅菌処理され、かつプロテインＣ活性化能をもつ抗血栓性の改質基材を提供すること。【解決手段】  改質基材は、基材にプロテインＣを活性化させる生理活性物質が存在した状態で放射線照射され、プロテインＣ活性化能を持つ。【効果】    放射線により滅菌処理され、かつプロテインＣ活性化能をもつ抗血栓性に優れた改質基材を提供することができる。また、放射線照射されているため、生理活性物質の基材の導入法の如何に関わらず、生理活性物質の溶出量が少ない。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材にプロテインＣを活性化させる生理活性物質が存在した状態で放射線照射され、プロテインＣ活性化能を持つ改質基材。
【請求項２】
前記の放射線照射線量が５ｋＧｙから１００ｋＧｙであること特徴とする請求項１に記載の改質基材。
【請求項３】
前記のプロテインＣを５０％以上活性化させること特徴とする請求項１〜２のいずれかに記載の改質基材。
【請求項４】
前記の生理活性物質がヒト・トロンボモジュリンもしくはその一部を有するペプチドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の改質基材。
【請求項５】
前記の生理活性物質が基材と直接又は炭素数３００以下の有機基からなるスペーサーを介して結合していることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の改質基材。
【請求項６】
前記の改質基材からの生理活性物質の溶出濃度が１０ｎｇ／ｍｌ以下であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の改質基材。
【請求項７】
前記生理活性物質の水溶液を基材と接触させた状態で放射線照射することにより得られた請求項１ないし６のいずれか１項に記載の改質基材。
【請求項８】
前記の基材が分離膜であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の改質基材。
【請求項９】
前記の分離膜が中空糸膜であることを特徴とする請求項８記載の改質基材。
【請求項１０】
請求項９記載の中空糸膜が内蔵された人工腎臓。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインＣ活性化能を有し、かつ放射線照射された改質基材に関する。活性化プロテインＣは血栓形成を阻害するため、抗血栓性が必要な材料に幅広く用いることができる。具体的には、人工血管、カテーテル、血液バッグ、血液浄化用モジュール、人工腎臓、人工肺、手術用補助器具などの医用材料に好適に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
医用材料において生体適合性は重要な問題であり、特に血栓形成を抑制する性質、即ち抗血栓性が要求される。
【０００３】
材料に抗血栓性を付与するために、ヒト・トロンボモジュリンを固定化する方法が開示されている。例えば、特開平４−１５０６３にはスペーサーを介してヒト・トロンボモジュリンを不溶性担体に共有結合により固定化する方法が、特開平９−２９１０４３にはヒト・トロンボモジュリンを疎水化し、有機溶媒中で疎水性基材に被覆させる方法が開示されている。これらは基材にヒト・トロンボモジュリンを固定化することで、プロテインＣを活性化し、材料に抗血栓性を付与させるものである。しかしながら、医療用途に用いる場合には滅菌処理が必要である。滅菌方法としては、放射線滅菌、蒸気滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌が挙げられる。近年では、エチレンオキサイドガス滅菌は、残留毒性の問題からあまり用いられておらず、現在は放射線滅菌処理か蒸気滅菌が主流となっている。蒸気滅菌は基材の制限を受け、ポリメチルメタクリレートや塩化ビニルなどは適用することができない。一方で、ヒト・トロンボモジュリンは、放射線に対する耐性の低さが問題であった。すなわち、これまでに、放射線照射され、かつプロテインＣ活性化能をもつ抗血栓性材料は得られていなかった。
【０００４】
【特許文献１】特開平４−１５０６３
【特許文献２】特開平９−２９１０４３
【特許文献３】特開平１−６２１９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、かかる従来技術の欠点を改良し、放射線照射により滅菌処理され、かつプロテインＣ活性化能をもつ抗血栓性の改質基材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は上記課題を達成するため、以下の構成を有する。
(1) 基材にプロテインＣを活性化させる生理活性物質が存在した状態で放射線照射され、プロテインＣ活性化能を持つ改質基材。
(2) 前記の放射線照射線量が５ｋＧｙから１００ｋＧｙであること特徴とする(1)に記載の改質基材。
(3) 前記のプロテインＣを２０％以上活性化させること特徴とする(1)または(2)のいずれかに記載の改質基材。
(4) 前記の生理活性物質がヒト・トロンボモジュリンもしくはその一部を有するペプチドであることを特徴とする(1)〜(3)のいずれかに記載の改質基材。
(5) 前記の生理活性物質が基材と炭素数３００以下の有機基からなるスペーサーを介して結合していることを特徴とする(1)〜(4)のいずれかに記載の改質基材。
(6) 前記の改質基材からの生理活性物質の溶出濃度が１０ｎｇ／ｍｌ以下であることを特徴とする(1)〜(5)のいずれかに記載の改質基材。
(7)  前記生理活性物質の水溶液を基材と接触させた状態で放射線照射することにより得られた(1)〜(6)のいずれかに記載の改質基材。
(8) 前記の基材が分離膜であることを特徴とする(1)〜(7)のいずれかに記載の改質基材。
(9) 前記の分離膜が中空糸膜であることを特徴とする(8)の改質基材。
(10) (9)に記載の中空糸膜が内蔵された人工腎臓。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によって、放射線により滅菌処理され、かつプロテインＣ活性化能をもつ抗血栓性に優れた改質基材を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、基材にプロテインＣを活性化させる生理活性物質が存在した状態で放射線照射されたことを特徴とする改質基材である。活性化されたプロテインＣは第Ｖ因子と第VIII因子の不活性化により血液凝固を阻害する。プロテインＣを活性化させる生理活性物質（以下、単に生理活性物質という）としては、合成ペプチドやプロテインＣを活性化させる作用のあるヒト・トロンボモジュリンなどのタンパク質もしくはその一部を有するペプチドなどが好適に用いられる。
【０００９】
プロテインＣの活性化はヒト・トロンボモジュリンにトロンビンが結合することによって数千倍に増幅される。ヒト・トロンボモジュリンは、血管内皮細胞膜上の糖タンパク質であり、血管内および体外の血液凝固を制御している。また、トロンビンはヒト・トロンボモジュリンと結合することで、凝固因子であるトロンビンのフィブリン形成作用および血小板凝集作用等を消失される。したがって、トロンビンの凝固作用を消失できる機能を有していれば、抗血栓性にさらに有利であるため、ヒト・トロンボモジュリンもしくはその構造の一部分を有するペプチドが好ましい。
【００１０】
本発明でいうところの基材とは、プロテインＣを活性化させる生理活性物質が存在している担体のことを指し、高分子材料が好ましい。高分子材料の例としては、ポリスルホンやポリスチレン、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニルや、これらの誘導体などが挙げられる。基材の形状としては、繊維、フィルム、樹脂、分離膜などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。具体的には、抗血栓性が必要な材料、例えば、人工腎臓用の中空糸膜や、ケース、人工血管、カテーテル、血液バッグ、血液浄化用モジュール、人工肺、手術用補助器具などの医用材料として好適に用いられる。
【００１１】
また、本発明でいうところの基材に生理活性物質が存在した状態とは、基材と生理活性物質が相互作用している状態を指す。相互作用としては化学結合、吸着などが挙げられる。例えば、基材を成型後、化学反応を用いて生理活性物質を架橋させても良い。このとき、生理活性物質と基材の間に有機基からなるスペーサーを介しても良い。スペーサーとしては、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールおよびそれらの誘導体などを例示することができる。なお、スペーサーの末端部分はアミド結合やエステル結合などが好適に用いられる。化学反応を用いて架橋させる例としては、基材および生理活性物質にアミノ基やカルボキシル基がある場合には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸などの縮合剤を用いて生理活性物質と基材に化学結合を形成させることができる。また、基材成型原液に生理活性物質を混練させ、物理的に生理活性物質を基材に内包させる形にしても良い。さらには、基材に生理活性物質を吸着させても良い。吸着は、間接的な相互作用であってもよい。例えば、生理活性物質が基材と水分子を介した水素結合によって吸着されていても良いし、基材上に電荷をもつ物質を導入し、静電相互作用によって吸着されていてもよい。具体的には、下記のいずれかよって、生理活性物質の基材への吸着が達成できるが、これに限定されるわけではない。１）基材を生理活性物質溶液に浸漬させる。２）基材を生理活性物質溶液に浸漬させた後、溶液からに抜き出し、湿潤状態で保持させる。３）基材を生理活性物質溶液に浸漬させた後、溶液から抜き出し、水に浸漬させる。下記実施例では、生理活性物質水溶液を基材である中空糸膜内を還流させた後、すなわち、生理活性物質水溶液を基材と接触させた状態で放射線を照射しており、このような簡便な方法で本発明の改質基材を得ることができる。この場合、放射線を照射することにより、滅菌と同時に、生理活性物質の固定化も行なわれる。また、放射線を照射する際に用いる生理活性物質水溶液の濃度は、所望のプロテインＣの活性化度を達成できる量が適宜選択され、特に限定されるものではないが、通常、１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ程度の濃度の濃度の水溶液が用いられる。
【００１２】
ここで、湿潤状態とは、基材を浸漬していた溶液を除去して乾燥させない状態のことを言う。特に限定されるものではないが、基材の乾燥重量に対して３重量％以上の水分を含んでいることが好ましい。ここでいう、乾燥重量とは改質基材を乾燥させて、乾燥中の１時間での重量変化率が３％以内になった状態の重量をいう。
【００１３】
本発明の改質基材は、上記のような、基材に生理活性物質が存在した状態で放射線照射して得られる。放射線としてはα線、β線、γ線、Ｘ線、紫外線、電子線などが用いられる。
【００１４】
放射線照射線量としては、基材の材質や形状にも依存するが、５ｋＧｙ以上、多くの基材は１５ｋＧｙ以上の放射線を照射することで、滅菌することができる。
【００１５】
また、放射線によって発生するラジカル反応により、生理活性物質と基材に化学結合が形成される。このため、生理活性物質を基材に吸着させただけでも、放射線照射によって生理活性物質が基材に固定化され、溶出を低減させることができる。つまり、放射線照射によって、滅菌と生理活性物質の基材への固定化を同時に行うことも可能である。
【００１６】
一方で、放射線照射線量が高くなると、プロテインＣを活性化させる生理活性物質の変性が起こり、１００ｋＧｙを越える線量を照射すると、活性化能の低下が顕著になる。
【００１７】
ここで、生理活性物質はなるべく基材近傍に存在したほうが、放射線照射による活性の低下を低く抑えることができる。具体的には、上記のように生理活性物質が基材に吸着しているか、基材に内包させているか、生理活性物質と基材が化学結合していても、生理活性物質と基材の間のスペーサーが無いか、もしく炭素数３００以下の有機基という短いものが好ましい。
【００１８】
この理由は、明らかではないが、放射線照射時に水分子から発生する水酸基ラジカルが関与しているものと考えられる。すなわち、放射線照射による生理活性物質の変性は、生理活性物質に直接生じるラジカルよりも、周囲の水分子から発生する水酸基ラジカルによって攻撃されるためと考えられている。生理活性物質が基材近傍に存在するような状態の場合は、発生した水酸基ラジカルの攻撃は、基材と生理活性物質の双方に分散されるために、生理活性物質へのラジカル攻撃が少なくなったものと推測される。すなわち、基材が生理活性物質に対して放射線保護的な作用を発揮していることが考えられる。ただし、その効果も１００ｋＧｙを越えると顕著に低下することから、限界があると思われる。
【００１９】
以上のことから、放射線照射線量は５ｋＧｙ以上、１００ｋＧｙ未満が好ましく、さらには１５ｋＧｙ以上、８０ｋＧｙ以下、さらに好ましくは２０ｋＧｙ以上、５０ｋＧｙ以下である。なお線量の測定は線量計にて測定することができる。
【００２０】
本発明の改質基材においては、前述したように、放射線照射されているため、生理活性物質の基材の導入法の如何に関わらず、生理活性物質の溶出量が少ないことが特長である。溶出量が多いと、患者によっては出血傾向を助長するなど、安全性に問題が生じる可能性がある。そのため、溶出は少ないことが望まれる。溶出量の測定方法の詳細については後述するが、体液と基材の接触部分の面積１ｍ２あたり４Ｌ以上の水で洗浄した後、室温で５００ｍＬ以上の水を用いて２時間抽出した水中の濃度が、１０ｎｇ／ｍｌ以下であることを言う。ここで、水の代わりに生理食塩水もしくは緩衝液を用いても良い。
【００２１】
なお、ここでいう表面積とは、体液との接触部分の面積をさす。基材の形状が多孔質体であり、体液との接触部分に血小板よりも小さい孔を有する場合、多孔質内部の面積は考慮しない。例えば人工腎臓用中空糸膜の場合は、中空糸内表面だけの面積をさし、中空糸膜厚部分の細孔面積は考慮しない。
【００２２】
本発明の改質基材は、プロテインＣを５０％以上、好ましくは１００％以上、さらに好ましくは２００％以上活性化させる。改質基材のプロテインＣの活性化測定についての詳細は後述するが、405nmの吸光度で比較する。プロテインＣが５０％活性化しているとは、ブランクの吸光度の値よりも1.5倍の値を示していることをいう。ここで、ブランクとは、後述する測定方法のなかで、基材を用いずに、同様の測定を行った場合のことをいう。プロテインＣの活性化が５０％未満の場合は、十分な抗血栓性の効果が得られない場合が多い。
【実施例】
【００２３】
以下実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
【００２４】
１．基材の作成
（１）ポリスルホンフィルム
抗血栓性を付与する基材にポリスルホンを用いた。実験はモデルとして行うため、フィルムに成形して行った。フィルムの成形方法は以下の通りである。まず、ポリスルホン（ソルベイ社製ユーデルポリスルホン（登録商標）Ｐ−３５００）１０部をジメチルアセトアミド９０部に加え室温にて溶解し、成型溶液とした。この溶液をホットプレートにて、表面温度が１００度になっているガラス板上で厚さ２０３μｍでキャストした。表面の温度は、接触式温度計により測定した。キャスト後、５分間ホットプレート上で放置し、溶媒を蒸発させた後、ガラス板ごと、水浴へ浸漬し透明フィルムを得た。（水浴に浸漬させるのは、フィルムをガラス板からはがしやすくさせるためである。）
【００２５】
（２）ポリスルホン／ポリビニルピロリドン混合中空糸膜ミニカラム
抗血栓性を付与する基材に、これは、人工腎臓のモデル実験として、ポリスルホン／ポリビニルピロリドン混合中空糸膜を用いたミニカラムを作成した。ポリスルホン（ソルベイ社製ユーデルポリスルホン（登録商標）Ｐ−３５００）１８重量部およびポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製Ｋ３０）９重量部をＮ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド７２重量部および水１重量部の混合溶媒に加え、９０℃で１４時間加熱して溶解し、製膜原液を得た。この製膜原液を外径０．３ｍｍ、内径０．２ｍｍのオリフィス型二重円筒型口金の外側の管より吐出した。芯液としてＮ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド５８重量部および水４２重量部からなる溶液を内側の管より吐出した。吐出された製膜原液は、乾式長３５０ｍｍを通過した後、水１００％の凝固浴に導かれ、中空糸が得られた。
【００２６】
中空糸膜を１００本束ね、直径約７ｍｍ、長さは１２ｃｍのプラスチック管ミニカラムケースに挿入した。中空糸膜の両末端を、中空糸膜中空部を閉塞しないようにウレタン系ポッティング剤で固定し、ミニカラムを作成した。該カラムの中空糸内表面積は７５ｃｍ２である。ミニカラムの中空糸膜内側および外側を３７℃の超純水を１ｍｌ／ｍｉｎの流速で３０分間洗浄した。
【００２７】
２．ヒト・トロンボモジュリン
プロテインＣを活性化させる生理活性物質として、ヒト・トロンボモジュリンを使用した。ヒト・トロンボモジュリンとしては、特開平１−６２１９号公報の記載に従い、遺伝子工学的手法によって得たヒト・トロンボモジュリンを用いた。
【００２８】
３．改質基材の作成
（１）ポリスルホンフィルム
ヒト・トロンボモジュリン１２５μｇをリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略記）５ｍｌに溶解させたヒト・トロンボモジュリン水溶液に片面の面積が１ｃｍ２の前記１（１）で作成したポリスルホンフィルムを浸漬させた状態でγ線照射した。
【００２９】
（２）ポリスルホン／ポリビニルピロリドン混合中空糸膜ミニカラム
前記１（２）で得られた中空糸膜ミニカラムの中空糸内側にヒト・トロンボモジュリンのＰＢＳと溶液（ヒト・トロンボモジュリン濃度は２５μｇ／ｍｌ）２．５ｍｌを１ｍｌ／ｍｉｎの流速で１０分間、室温で灌流させた後、γ線照射した。
【００３０】
４．ヒト・トロンボモジュリンの溶出実験
（１）ポリスルホンフィルム
前記３（１）で得られたフィルムを１０ｍｌのＰＢＳにて２回リンスした。この後、１ｍｌのＰＢＳに室温で２時間浸漬させ、このＰＢＳ中に溶出したヒト・トロンボモジュリン溶出濃度を測定した。ヒト・トロンボモジュリンの濃度は、ＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【００３１】
（２）ポリスルホン／ポリビニルピロリドン混合中空糸膜ミニカラム
前記３（２）で得られた中空糸膜ミニカラムについて、ヒト・トロンボモジュリン溶出試験を始める直前に、ＰＢＳ３０ｍｌ（中空糸内表面１ｍ２換算でＰＢＳ４Ｌに相当する）を室温にて１ｍｌ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ循環し、洗浄した。ＰＢＳ５ｍｌ（中空糸内表面１ｍ２換算で６６７ｍＬに相当する）を０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で、室温で２時間循環させた。なお、後述する血液循環試験と対応させるために、循環開始後の最初の１ｍｌは廃棄した後、循環した。２時間循環させた液に溶出したヒト・トロンボモジュリンの濃度は、ＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【００３２】
５．ヒト・トロンボモジュリン濃度測定
ヒト・トロンボモジュリンの濃度は、ヒトＣＤ１４１  ＥＬＩＳＡキット（ＤＩＡＣＬＯＮＥ社製造）を使用した。実験手順は、以下の通りである。ＥＬＩＳＡプレートのウェルにサンプルを１００μｌずつ加えた。ビオチン化ａｎｔｉ−ＣＤ１４１を調整し、５０μｌずつウェルに加えた。プレートカバーでカバーし、１時間室温下で定温放置した。カバーを外し、プレートをマイクロプレートウオッシャー（ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＩｍｍｕｎｏＷａｓｈ  Ｍｏｄｅｌ  １５７５）にて、以下のように洗浄した。
【００３３】
１）  全てのウェルから溶液を吸い出した。
２）  全てのウェルに洗浄液を３００μｌずつ満たした。
３）  再度全てのウェルから溶液を吸い出した。
４）  手順２）と３）を二度繰り返した。
【００３４】
洗浄操作後、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ溶液を調整し、ウェルに１００μｌ加えた。プレートカバーでカバーし、３０分間室温下で定温放置した。カバーを外してウェルを、上記洗浄操作１）〜４）と同様に洗浄を行った。ｒｅａｄｙ−ｕｓｅ  ＴＭＢ基質溶液をウェルに１００μｌ加えた。プレートをアルミホイルで包んで光を遮断し１５分間室温で定温放置した。ウェルに１００μｌの停止試薬Ｈ２ＳＯ４を加えて、酵素基質反応を停止した。停止試薬Ｈ２ＳＯ４を加えた後に、速やかにマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ  マイクロプレートリーダー  モデル６８０）を用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取った。既知濃度の吸光度の値から検量線を引き、サンプルのヒト・トロンボモジュリン濃度を算出した。
【００３５】
６．プロテインＣ活性化度の測定
（１）ポリスルホンフィルム
フィルムを１０ｍｌのＰＢＳにて２回リンスした。その後、混合緩衝液Ａ（２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｍｉｎ（フラクションＶ、和光純薬工業(株)、以下、ＢＳＡと略記）、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２）１０ｍｌを用いて洗浄した。フィルムを５ｕｎｉｔ／ｍｌのトロンビン溶液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１％ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ２）１ｍｌ中３７℃で１時間インキュベートした。フィルムを混合緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１％ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ２）１０ｍｌを用いて洗浄した。フィルムを１００ｎMのプロテインC溶液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１％ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ２）０．５ｍｌ中３７℃で１時間インキュベートした。この上清５０μｌに１ｍＭのＳ−２２３８（２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１％ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡの混合溶液）１００μｌを加えて４０５ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の値が大きいほど、プロテインＣが活性化されていることを示す。
【００３６】
（２）ポリスルホン／ポリビニルピロリドン混合中空糸膜ミニカラム
中空糸膜ミニカラムについて、ＰＢＳ３０ｍｌを室温にて１ｍｌ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ循環し、洗浄した。５（１）と同様の液を用いた。すなわち、中空糸膜カラムの中空糸内側を、混合緩衝液Ａ  １０ｍｌを用いて洗浄した。中空糸内側を５ｕｎｉｔ／ｍｌのトロンビン溶液５ｍｌで３７℃、１時間、０．５ｍｌ／ｍｉｎで循環させた。その後、中空糸内側を混合緩衝液Ｂ  １０ｍｌを用いて洗浄した。中空糸内側を１００ｎMのプロテインC溶液２．５ｍｌで３７℃、１時間０．５ｍｌ／ｍｉｎで循環させた。この循環後の液、５０μｌに１ｍＭのＳ−２２３８  １００μｌを加えて４０５ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の値が大きいほど、プロテインＣが活性化されていることを示す。
【００３７】
７．抗血栓性の評価
（１）ポリスルホンフィルム
フィルムを１０ｍｌのＰＢＳにて２回リンスした。フィルムについたＰＢＳをよく切った後、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）チューブ（１８ｍｍφ、Ｎｏ．２０５１）の中に移した。健常者ボランティアから静脈血を採血後、すみやかに５ｍｌを該ファルコンチューブに入れた。３０分間、室温で静置した後、フィルムを取り出し、ＰＢＳ１０ｍｌで軽くリンスし、フィルムに付着した血栓の状態を観察した。
【００３８】
（２）ポリスルホン／ポリビニルピロリドン混合中空糸膜ミニカラム
中空糸膜ミニカラムの片側に、内径１ｍｍ、外径２ｍｍ、長さ５０ｃｍのシリコーンチューブ（製品名ＡＲＡＭ（登録商標））を接続した。中空糸膜ミニカラムについて、血液循環試験を始める直前に、ＰＢＳ３０ｍｌを室温にて１ｍｌ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ循環し、洗浄した。
【００３９】
健常者ボランティアから静脈血を採血後、十秒内にヘパリンを０．５Ｕ／ｍｌになるように添加した。採血後、実験開始までに、ある程度の時間が経過してしまうことなど、循環実験以外の要因で血液が活性化される。ヘパリンを0.5U/ml程度添加することで、そのような活性化を抑制できると考えられる。ヘパリン添加後、数分以内に、該血液をカラムで循環させた。循環は５ｍｌの血液を、垂直に立てた中空糸膜ミニカラムの上から下に、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で、室温で行った。なお、ミニカラム内および回路内には、はじめはＰＢＳが充填してあるので、循環開始後の最初の１ｍｌは廃棄した後、循環した。該条件での、循環可能時間を測定した。なお、ここでいう循環可能時間とは、回路中もしくはミニカラム中に血栓などが生じて血液が流れなくなるまでの時間、もしくは血液が流れにくくなったため、回路接続部などから血液が漏れだしてくるまでの時間をいう。
【００４０】
実施例１
前記３（１）のフィルムにおいて２５ｋＧｙのγ線を照射した。該フィルムについてヒト・トロンボモジュリンの溶出実験の結果、ヒト・トロンボモジュリン濃度は１ｎｇ／ｍｌ以下であった。また、プロテインＣ活性化度を測定した結果、４０５ｎｍの吸光度は０．２６であり、ブランクは０．１１であった。すなわち、プロテインＣを１３６％活性化するものであった。さらにフィルムの抗血栓性を評価した結果、フィルムには血栓がほとんど付着していなかった。すなわち、ヒト・トロンボモジュリンの溶出は、ほとんどないうえに、プロテインＣを活性化することで抗血栓性を有するフィルムを得ることができた。
【００４１】
実施例２
前記３（１）のフィルムにおいて４０ｋＧｙのγ線を照射した。該フィルムについてヒト・トロンボモジュリンの溶出実験の結果、ヒト・トロンボモジュリン濃度は１ｎｇ／ｍｌ以下であった。また、プロテインＣ活性化度を測定した結果、４０５ｎｍの吸光度は０．２７であった。すなわち、プロテインＣを１４５％活性化するものであった。さらに該フィルムの抗血栓性を評価した結果、フィルムには血栓がほとんど付着していなかった。すなわち、ヒト・トロンボモジュリンの溶出は、ほとんどないうえに、プロテインＣを活性化することで抗血栓性を有するフィルムを得ることができた。
【００４２】
実施例３
前記３（２）の中空糸膜ミニカラムにおいて２５ｋＧｙのγ線を照射した。該中空糸膜ミニカラムについてヒト・トロンボモジュリンの溶出実験の結果、ヒト・トロンボモジュリン濃度は１ｎｇ／ｍｌ以下であった。また、プロテインＣ活性化度を測定した結果、４０５ｎｍの吸光度は０．３３であった。すなわち、プロテインＣを２００％活性化するものであった。さらに該中空糸膜ミニカラムの抗血栓性を評価した結果、循環可能時間は１時間５０分であった。すなわち、ヒト・トロンボモジュリンの溶出は、ほとんどないうえに、プロテインＣを活性化することで抗血栓性を有する中空糸膜ミニカラムを得ることができた。
【００４３】
比較例１
前記３（１）のフィルムにおいて１５０ｋＧｙのγ線を照射した。該フィルムについてヒト・トロンボモジュリンの溶出実験の結果、ヒト・トロンボモジュリン濃度は１ｎｇ／ｍｌ以下であった。また、プロテインＣ活性化度を測定した結果、４０５ｎｍの吸光度は０．１５であった。さらに該フィルムの抗血栓性を評価した結果、フィルムには全面に血栓の形成が認められた。すなわち、該フィルムはヒト・トロンボモジュリンの溶出は、ほとんどないが、プロテインＣ活性能を有しておらず、抗血栓性もなかった。
【００４４】
比較例２
前記３（１）のフィルムにおいてヒト・トロンボモジュリン水溶液の代わりに、水にポリスルホンフィルムを浸漬させた状態で２５ｋＧｙのγ線を照射した。該フィルムについてプロテインＣ活性化度を測定した結果、４０５ｎｍの吸光度は０．１５であった。さらに該フィルムの抗血栓性を評価した結果、フィルムには全面に血栓の形成が認められた。すなわち、該フィルムはプロテインＣ活性能を有しておらず、抗血栓性もなかった。
【００４５】
比較例３
前記３（１）のフィルムにおいてヒト・トロンボモジュリン水溶液に浸漬させただけで、γ線照射は行わなかった。該フィルムについてヒト・トロンボモジュリンの溶出実験の結果、ヒト・トロンボモジュリン濃度は２１ｎｇ／ｍｌであった。また、プロテインＣ活性化度を測定した結果、４０５ｎｍの吸光度は０．２９であった。該フィルムの抗血栓性を評価した結果、フィルムには血栓がほとんど付着していなかった。すなわち、プロテインＣを活性化することで、抗血栓性を有するが、ヒト・トロンボモジュリンの溶出も多いフィルムであった。
【００４６】
比較例４
前記３（２）の中空糸膜ミニカラムにおいてヒト・トロンボモジュリン水溶液の代わりに、水を用いて、２５ｋＧｙのγ線を照射した。該中空糸膜ミニカラムについてヒト・トロンボモジュリンの溶出実験の結果、ヒト・トロンボモジュリン濃度は１ｎｇ／ｍｌ以下であった。また、プロテインＣ活性化度を測定した結果、４０５ｎｍの吸光度は０．１４であった。さらに該中空糸膜ミニカラムの抗血栓性を評価した結果、循環可能時間は１時間２０分であった。すなわち、プロテインＣを活性化しないため、抗血栓性の低い中空糸膜ミニカラムであった。
【００４７】
比較例５
ヒト・トロンボモジュリンのＰＢＳ溶液（ヒト・トロンボモジュリン濃度は２５μｇ／ｍｌ）１０ｍｌを２５ｋＧｙのγ線を照射した。該溶液について、プロテインＣ活性化度を測定した結果、４０５ｎｍの吸光度は０．１３であり、放射線照射によって、活性が消失していた。すなわち、生理活性物質の近くに基材がないため、活性の保持ができなかったと考えられる。