(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物等から単離・精製して得られるホスホリパーゼＤを、その活性を損なうことなく、長期的に保存できる技術を提供すること。【解決手段】ホスホリパーゼＤを、ストレプトマイセス属細菌の培養液から、ｐＨ３〜８で、二価金属（カルシウム、マグネシウム）塩を添加して単離・精製し、Ｌ−セリン存在下凍結処理する。【選択図】図１
2006271284.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリパーゼＤを、Ｌ−セリン存在下で凍結処理することを特徴とするホスホリパーゼＤの凍結保存方法。
【請求項２】
Ｌ−セリンを、ホスホリパーゼＤ量に対し、０.０１〜３５質量％添加する請求項1記載のホスホリパーゼＤの凍結保存方法。
【請求項３】
ホスホリパーゼＤが、任意の段階で二価の金属塩を添加する工程を具備する製法により取得されたものである請求項１または２記載のホスホリパーゼＤの凍結保存方法。
【請求項４】
ホスホリパーゼＤの製法中、任意の段階で添加される二価の金属塩が、カルシウム塩又はマグネシウム塩である請求項３記載のホスホリパーゼＤの凍結保存方法。
【請求項５】
前記、二価の金属塩をｐＨ３〜８の範囲で添加することを特徴とする請求項３または４記載のホスホリパーゼＤの凍結保存方法。
【請求項６】
ホスホリパーゼＤが、微生物から取得されたものである請求項１〜５のいずれかの項記載のホスホリパーゼＤの凍結保存方法。
【請求項７】
微生物が、ストレプトマイセス属細菌である請求項６記載のホスホリパーゼＤの凍結保存方法。
【請求項８】
ホスホリパーゼＤとＬ−セリンを含有することを特徴とする耐凍結性ホスホリパーゼＤ組成物。
【請求項９】
Ｌ−セリンを、ホスホリパーゼＤに対し０.０１〜３５質量％含有する請求項８記載の耐凍結性ホスホリパーゼＤ組成物。
【請求項１０】
ホスホリパーゼＤが、任意の段階で二価の金属塩を添加する工程を具備する製法により取得されたものである請求項８または９記載の耐凍結性ホスホリパーゼＤ組成物。
【請求項１１】
ホスホリパーゼＤの製法中、任意の段階で添加される二価の金属塩が、カルシウム塩又はマグネシウム塩である請求項１０記載の耐凍結性ホスホリパーゼＤ組成物。
【請求項１２】
前記、二価の金属塩をｐＨ３〜８の範囲で添加することを特徴とする請求項１０または１１記載の耐凍結性ホスホリパーゼＤ組成物。
【請求項１３】
ホスホリパーゼＤが、微生物から取得されたものである請求項８〜１２のいずれかの項記載の耐凍結性ホスホリパーゼＤ組成物。
【請求項１４】
微生物が、ストレプトマイセス属細菌である請求項１３記載の耐凍結性ホスホリパーゼＤ組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の反応を触媒するホスホリパーゼＤの凍結保存方法に関し、更に具体的には、凍結処理によるホスホリパーゼＤの酵素活性の低下或いは失活を抑制する新規な凍結保存方法及び耐凍結性ホスホリパーゼＤ組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然界に存在する多くの微生物は、生命活動を維持するため、酵素を代表とする様々な有用物質を保有又は生産することがよく知られている。また、従来から、これらの微生物が保有又は生産する上記有用物質は、医薬品や食品の分野に活用されており、その中でも、酵素は、医薬品素材や機能性食品素材の原料又はそれらの製造用の触媒として利用されている。
【０００３】
このような酵素の代表的なものとしては、例えば、近年、注目が集まっている種々の生理効果等を奏するリン脂質の製造用に用いる酵素であるホスホリパーゼＤを挙げることができる。
【０００４】
このホスホリパーゼＤは、リン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解してホスファチジン酸と塩基とを遊離させる酵素作用を有するものである。そして、その起源によっては、グルセロール、エタノール等のアルコール性水酸基を有する化合物の共存下でグリセロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解すると同時にホスファチジル基と上記アルコール性水酸基を有する化合物とにより新たなエステルを生成する反応を生起させる特徴を有しており、リン脂質の製造用酵素として利用されることがよく知られている。そして、この酵素を利用して得られる代表的なリン脂質としては、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）等がよく知られている。
【０００５】
ところで、このホスホリパーゼＤは、キャベツ、にんじん、ピーナッツなどの植物を起源とするものの他に、ストレプトマイセス属、ミクロモノスポラ属、ノルカディオプシス属、アクチノマデューラ属、ノカルディア属等の微生物が産生する酵素の一つとして知られており、従来から、当該植物や微生物から単離・精製して利用することが報告されている。
【０００６】
このような、植物や微生物が生産する酵素等の有用物質は、当該植物を破砕して単離するか、また、当該微生物を培養して得られる菌体或いは培養物から単離・精製されるが、いずれの場合であっても、その工程で、目的とする酵素等の有用物質以外のもの（不純物）を効率よく除去する工程を必要としているのが一般的である。通常、不純物を除去するために使用される手段としては、菌体分離、限外濃縮、精密濾過、塩析、有機溶媒分画、透析、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等がよく知られている。
【０００７】
中でも、精密濾過手段は、簡便で効率よく不純物を除去できるため、精製に好適な手段としてよく利用されている。また、精密濾過手段には、使用するフィルターの種類によって、大きく２つのタイプに分類される。具体的には、フィルターの膜表面で異物を補足するタイプ、もう一つは、フィルターの膜内部で異物を補足するタイプであり、これらは、目的に応じて使用されている。
【０００８】
しかしながら、上記のようなタイプの異なる精密濾過手段を用いても十分に不純物を取り除くことができない場合があった。特に、微生物を培養して得られる培養物から目的とする物質を単離・精製するためには、複数の手段を組み合わせて不純物を除去する作業が必要となってしまい、作業効率の低下を招くだけでなく、得られる微生物由来の酵素のような有用物質の収量・収率に影響を与え、更には、得られた酵素等の有用物質の活性或いはその機能性が低下するという問題が生じることもあった。
【０００９】
そこで、微生物由来の酵素のような有用物質を、医薬品や食品素材製造用として有効に活用するため、微生物菌体そのものを触媒として利用する、不純物の除去工程を簡略化した方法が提案されている。
【００１０】
【特許文献１】特公平５−４２９１７号
【特許文献２】特公平５−６０３５７号
【特許文献３】特開２００２−２１８９９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、微生物が生産する種々の有用物質のうち、ホスホリパーゼＤを当該微生物から簡便に単離・精製し、尚且つ、得られた当該酵素を効率よく種々の用途に活用するための手段について検討を行った。その検討において、微生物由来のホスホリパーゼＤを単離・精製するに当たっては、当該微生物の培養により得られる培養物にゲル状の不純物が生じること、また、単離したホスホリパーゼＤの有効性を保持した状態で、且つ長期間保存した場合に、雑菌による汚染が生じたり、酵素活性が低下する傾向があるという知見を得た。
【００１２】
一般に、微生物から単離・精製した酵素等を保存する場合に採用する方法として、２つの方法が知られている。一つは、グリセロール、ショ糖、グルコース等の糖質を過剰量使用して浸透圧を高めることにより、雑菌汚染を防止する無菌的な液体状態での保存方法であり、もう一つは、凍結処理を施して個体状態で保存する方法である。なお、凍結処理の場合にあっても、凍結処理時の保存対象物の損傷を防止する目的で、上記した糖質を使用することも多い。
【００１３】
しかしながら、微生物から単離・精製した酵素は、様々な反応を触媒する場合があることから、糖質を用いて保存する方法が必ずしも好ましいとはいえず、特に、ホスホリパーゼＤは、アルコール性水酸基を反応の基質とする酵素であるため、保存時に糖質のような化合物を保護剤として使用することが、好ましい方法であるとはいえなかった。
【００１４】
また更に、通常、保存時に添加する保護剤は、その効果を十分に得るために過剰量使用しなければならないため、工業的に大規模なスケールで上記保存方法を適用する場合には、コスト等の経済面でも問題となる場合があった。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、微生物からホスホリパーゼＤを凍結処理して保存する場合に、Ｌ−セリンを保護剤として使用し、凍結処理を施すことにより、当該酵素の活性を損なうことなく、雑菌による汚染も有意に防止することができることを見出した。
【００１６】
特に、本発明者らは、微生物からホスホリパーゼＤを単離・精製する工程の任意の段階で、二価の金属塩を添加することにより、当該微生物の培養物に生じるゲル状の不純物を簡便に除去することができることを見出していたが、このような工程を経て得られる微生物由来のホスホリパーゼＤは、保存による酵素活性の低下を招きやすく、Ｌ−セリンを保護剤として用いて凍結処理することにより、効果的にその酵素活性の低下を抑制できることを見出し、本発明を完成した。
【００１７】
すなわち本発明は、ホスホリパーゼＤを、Ｌ−セリン存在下で凍結処理することを特徴とするホスホリパーゼＤの凍結保存方法である。
【００１８】
また本発明は、ホスホリパーゼＤが、任意の段階で二価の金属塩を添加する工程を具備する製法により取得されたものである上記のホスホリパーゼＤの凍結保存方法である。
【００１９】
更に本発明は、ホスホリパーゼＤとＬ−セリンとを含有することを特徴とする耐凍結性ホスホリパーゼＤ組成物である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、微生物から単離・精製して得られるホスホリパーゼＤを、その活性を損なうことなく、長期的に保存することが可能となり、工業的なスケールの大きい各種の反応を行う際の触媒として有効なホスホリパーゼＤ組成物を提供することができる。特に、本発明は、Ｌ−セリンが反応の基質となる反応に使用するホスホリパーゼＤの保存方法として非常に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、ホスホリパーゼＤをＬ−セリン存在下で凍結処理するホスホリパーゼＤの凍結保存方法である。より具体的には、微生物から単離・精製した各種のホスホリパーゼＤに、Ｌ−セリンを添加した後、これを凍結処理し、当該ホスホリパーゼＤの酵素活性を維持したまま、長期間の保存を可能とするものである。
【００２２】
本発明において、ホスホリパーゼＤの凍結保存時に添加するＬ−セリンとは、アミノ酸の１つとしてよく知られている化合物であり、広く市販されている。本発明においては、これら市販されているＬ−セリンであれば、いずれであっても好適に使用することができる。
【００２３】
ホスホリパーゼＤ中へＬ−セリンの添加方法は、特に制限されるわけではなく、市販されているＬ−セリンを凍結処理の際にそのまま添加すればよいが、Ｌ−セリンが粉末状等の場合には、均一に分散させるため、適当な水性溶媒に溶解して添加することが好ましい。また、上記Ｌ−セリンの添加時期は、凍結処理を施す前であれば特に制約はなく、凍結処理を施す数時間又は数日前に添加しても、凍結処理を施す直前に添加してもよい。
【００２４】
本発明におけるＬ−セリンの添加量は、特に制限されるわけではないが、凍結処理するホスホリパーゼＤの量に対して、０.０１質量％〜３５質量％程度であり、より好ましくは、０.１質量％〜２０質量％程度、更に好ましくは０．１質量〜１０質量％程度となるように添加すればよい。
【００２５】
上記Ｌ−セリンの添加量が、凍結処理するホスホリパーゼＤの量に対して、０.０１質量％よりも少ない場合には、所望の効果を十分に得ることができず、当該酵素を種々の反応の触媒として用いるのに適さなくなる恐れがあるため、好ましくない。逆に、Ｌ−セリンの添加量が、凍結処理するホスホリパーゼＤの量に対して、３５質量％よりも多くなると、Ｌ−セリンが均一に分散しにくくなるため好ましくない。なお、Ｌ−セリンを３５質量％以上添加しても顕著な効果は認められない。
【００２６】
上記ホスホリパーゼＤとＬ−セリンとの凍結処理方法は、通常の凍結保存を行う際の条件、方法に従って行えばよく、特に制限されることはない。例えば、ホスホリパーゼＤに所定量のＬ−セリンを添加した後、−２０〜−８０℃に設定された冷蔵庫や冷凍凍結乾燥機等を用いて凍結すればよい。
【００２７】
一方、本発明の方法により保存されるホスホリパーゼＤとは、自然界に存在する動植物が保有又は生産するもの、中でも特に、微生物から単離・精製されるものであって、特に、医薬品や食品素材を製造する際に使用することができるものであれば、特に制限されるものではない。
【００２８】
本発明で用いるホスホリパーゼＤの好ましいものとしては、微生物から単離・精製されるホスホリパーゼＤである。このものは、常法に従って、ホスホリパーゼＤを生産する微生物を所望の培地を用いて培養し、得られた培養物から、目的とするホスホリパーゼＤを単離・精製することにより得ることができる。
【００２９】
ここで、ホスホリパーゼＤを生産する微生物を培養するための培地とは、培養する微生物の種類によって、適宜必要となる栄養素を組み合わせて構成されたものを使用すればよく、特に制限されるものではない。この培地を構成する具体的な栄養素としては、ブドウ糖、果糖、ショ糖、乳糖、糖蜜、デンプン、デキストリン、グリセリンなどの炭素源の他、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール等、また、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カザミノ酸、脱脂大豆粉、大豆蛋白、デスチラーズソリュブル等の窒素源を挙げることができる。
【００３０】
また、さらに培地には、食塩、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、鉄塩、マンガン塩、各種ビタミン類、その他、微生物の生育や目的とするホスホリパーゼＤの生産促進に有効な物質を必要に応じて添加することも可能である。なお、このようにして調製した培地は、培養する微生物に好適なｐＨに調整して使用すればよく、そのｐＨは通常、５〜８程度、好ましくは６〜７程度に調整して使用すればよい。
【００３１】
また、微生物の培養も、常法に従って行えばよく、具体的には、深部培養法や固体培養法を採用して行えばよい。このときの培養温度としては、微生物によって適宜好ましい範囲を設定して行えばよく、通常、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃程度であればよい。また、培養時間も、培養する微生物の種類や使用する培地の組成によっても異なる場合があるため、適宜好適な条件を設定して行うことが好ましく、例えば、微生物が生産するホスホリパーゼＤの生産量が最大となる段階、通常は、１〜６日間程度であれば十分である。
【００３２】
上記のようにして得られる微生物の培養物から、目的とするホスホリパーゼＤを単離・精製するには、当該培養物から微生物菌体を除去した後、限外ろ過、減圧濃縮、遠析、有機溶媒による沈殿処理、透析、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の既存の手段を用いて行えばよい。
【００３３】
微生物が生産するホスホリパーゼＤは、上記の通り、単離・精製して取得することができるが、微生物を培養して得られる培養物には、目的のホスホリパーゼＤ以外の物質がゲル状の不純物として含まれている場合があるため、単離・精製工程でこれを効率よく除去することにより、同工程の効率化を図り、目的とするホスホリパーゼＤの収量や収率を飛躍的に向上させることができる。
【００３４】
微生物の培養物中に生じるゲル状の不純物を除去するためには、微生物を培養して得られる培養物に任意の段階で二価の金属塩を添加することにより容易に行うことが可能である。これにより、培養物中のゲル状物質が沈殿物となって分離するので、ろ過や遠心分離等の簡便な手段で容易に不純物を除去し、ホスホリパーゼＤを精製した状態で得ることが可能となり、このような状態のホスホリパーゼＤに本発明方法を適用することが特に有利である。
【００３５】
微生物由来のホスホリパーゼＤを単離・精製する工程の任意の段階で添加する二価の金属塩とは、特に制限されることなく使用することができる。具体的なものとしては、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、マンガン、銅等の塩類、例えば、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩の他、塩化物、硫化物、水酸化物等を挙げることができ、これらは、単独で或いは２種以上を併用してもよい。また、これらは、そのまま使用してもよいが、粉末や固体である場合には、培養物中に均一に分散されるよう適当な水性媒体に溶解して用いることが好ましい。
【００３６】
前記する二価の金属塩の使用量は、特に制限されるわけではないが、微生物を培養して得られる培養物中に金属塩濃度で５ｍＭ〜１Ｍの濃度、好ましくは、１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度となるように添加すればよい。このとき、二価の金属塩の添加量が、５ｍＭよりも少ないと微生物の培養によって得られる培養物中に生じるゲル状の不純物を十分に除去する効果が得られないため好ましくなく、逆に、添加量が１Ｍよりも多くなると、過剰に添加した金属塩が不純物となってしまい、これを除去するための別途の手段を講じる必要が生じて、却って作業効率の低下を招く場合があるので、好ましくない。更に言えば、二価の金属塩の過剰な添加は、目的とするホスホリパーゼＤの活性を損傷させる原因となる場合もあるため、このことからも１Ｍよりも多く使用することは好ましくない。
【００３７】
また、前記した二価の金属塩の添加時期は、微生物培養物から単離・精製する工程の任意の段階であればよく、例えば、培養して得られる培養物或いは、当該培養物から微生物菌体を除去した後等で添加すればよい。
【００３８】
さらに、二価の金属塩を培養物中に添加する際には、当該培養物のｐＨを特定の範囲に調整しておくことが好ましい。これにより、培養によって生じるゲル状の不純物を除去する効果が顕著になる。具体的なｐＨの範囲は、３〜８、より好ましくは４.５〜６.５程度である。  
【００３９】
なお、培養する微生物の種類によっては、培養時に酸性物質や塩基性物質等を産生するため、培養物のｐＨが前記範囲を外れる場合があるが、その場合には、通常一般的に使用されているｐＨ調整剤を用いて好適な範囲に培養物のｐＨを調整すればよい。また、培養物のｐＨが低いほど、二価の金属塩を添加したときの培養物中に生じる不純物の除去効果が顕著になるが、ｐＨが低すぎると、目的とするホスホリパーゼＤの活性が単離・精製段階で低下或いは失活してしまうため、好ましくない。
【００４０】
以下、実施例、試験例及び参考例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらになんら制約されるものではない。
【００４１】
実 施 例  １
微生物培養によるホスホリパーゼＤの取得：
（Ａ）シードの作製
（１）５００ｍｌの坂口フラスコに、表１に示す酵母エキス培地１００ｍｌをとり、これにストレプトマイセス・プルニカラー(Streptomyces Prunicolor)（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６５）の凍結保存菌液２ｍｌ接種し、２８℃、１２０ｓｐｍの振盪速度で２４時間培養を行ない、培養液を得た。
【００４２】
酵母エキス培地の組成；
【表１】
2006271284.tif 000003
なお、酵母エキス培地は、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌して使用した。
【００４３】
（２）５００ｍｌの坂口フラスコに、表２に示す大豆粉培地１００ｍｌをとり、これに（１）で得た培養液を０.３ｍｌ接種し、２８℃、１２０ｓｐｍの振盪速度で２４時間培養してシードを得た。
【００４４】
大豆粉培地の組成；
【表２】
2006271284.tif 000004
なお、大豆粉培地は、水酸化ナトリウムでｐＨを６.８に調整し、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌して使用した。
【００４５】
（Ｂ）ホスホリパーゼＤの単離・精製
（１）３Ｌジャーに、表１に示す酵母エキス培地を１.５Ｌ入れ、これに前記（Ａ）（２）で調製したシードを３０ｍｌ接種し、２８℃、５００ｒｐｍの攪拌速度、０.５ｖｖｍの通気量で、ホスホリパーゼＤの産生量が最大となるまで培養を行った。得られた培養液から、遠心分離により菌体を除去し、限外濃縮装置により濃縮したのちに、塩化カルシウム溶液をカルシウム濃度として４０ｍＭとなるように添加することにより不純物を除去してホスホリパーゼＤ溶液を得た。
【００４６】
この溶液に、保護剤として、Ｌ−セリン、グルコース、ショ糖、トレハロースをそれぞれ無添加、０.５％、１％、１.５％、２％、２.５％となるように添加した後、−２０℃で凍結処理し、１週間後これらを融解し、ホスホリパーゼＤの酵素活性を測定した。その結果を図１に示す。なお、ホスホリパーゼＤの酵素活性の測定は、次に示す方法により測定した。
【００４７】
＜ホスホリパーゼＤの産生量及び酵素活性の測定＞
酵素溶解液※1で適当な濃度に希釈した測定サンプル１６.７μＬが入った試験管に、ホスファチジルコリンを含む基質溶液※2３３.３μＬを加え、３７℃で正確に１０分間反応させた。反応後、予め１３０℃に加熱したブロックヒーターで１０分間加熱し、酵素を失活させた後、１.５ｍｌの発色液※3を加えて３７℃で２０分間反応させ、得られた溶液の５００ｎｍの吸光度を測定した。同時に、既知量の塩化コリンに発色液を加えて反応させ、得られた溶液の５００ｎｍの吸光度を測定して検量線を作成し、そこから測定サンプルの加水分解活性を測定した。なお、事前に基質溶液を加える前の測定サンプルを１３０℃、１０分間加熱失活したものの吸光度をブランクとして、測定サンプルの吸光度の値から差し引いた。また、加水分解活性は、１分間に１μmolのコリンを遊離させる活性を１unitと定義して求めた。
【００４８】
※１  酵素溶解液；０.５％のTriton-X100を含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６.０）
※２  基質溶液；ホスファチジルコリンを１.５％、２−プロパノールを１３.５％、
Triton-X100を０.６％含有する酵素溶解液
※３  発色液；１.５ｍｌ当たり、塩化カルシウム(無水)を０.７４ｍｇ、４−アミノ
アンチピリンを０.３ｍｇ、フェノールを０.４７ｍｇ、コリンオキシ
ダーゼを１.５単位、ペルオキシダーゼを３０単位及びTriton-X100
を１.５ｍｇ含有する５０ｍＭ Tris-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）
【００４９】
図１に示すように、微生物から単離したホスホリパーゼＤをＬ−セリン存在下で凍結処理することにより、凍結融解後の酵素活性の低下を抑制する効果が認められた。また、一般的な凍結保護剤（グルコース、ショ糖及びトレハロース）では、多量に添加した場合に顕著な効果が認められるのに対し、Ｌ−セリンでは、それよりも低濃度で優れた効果が認められた。
【００５０】
実 施 例  ２
Ｌ−セリンの添加濃度とホスホリパーゼＤの凍結保存安定性の関係；
実施例１と同様の方法により、微生物（Streptomyces prunicolor）を培養してホスホリパーゼＤを単離・精製し、０〜１０質量％のＬ−セリンを添加し、凍結処理した。なお、このとき、濃縮液に塩化カルシウムを２０ｍＭとなるように添加してホスホリパーゼＤの単離・精製を行った。これらを融解後、当該酵素の酵素活性を調べた。その結果を図２に示す。
【００５１】
凍結処理時のＬ−セリン添加は、０.１質量％程度で、十分に凍結融解後のホスホリパーゼＤの酵素活性の低下を顕著に抑制する効果があることが認められた。また、Ｌ−セリンの添加濃度が増加することにより、酵素活性の低下を抑制する効果が減少する傾向が見られるのは、添加量が増えることによる酵素液の希釈効果が無視できなくなったことによると考えられる。
【００５２】
試 験 例  １
実施例１と同様の方法に従って、微生物（Streptomyces prunicolor）を培養してホスホリパーゼＤを単離・精製した。このとき、濃縮液に塩化カルシウムを０〜４０ｍＭの範囲となるように添加してホスホリパーゼＤの単離・精製を行った。得られたホスホリパーゼＤ溶液を凍結処理し、１週間後融解して、ホスホリパーゼＤの酵素活性を測定した。その結果を図３に示す。なお、凍結処理を行わない場合についても同様に酵素活性を調べた。
【００５３】
この結果から明らかなように、凍結融解後のホスホリパーゼＤの酵素活性は、単離・精製工程で添加するカルシウム濃度に依存して低下する傾向が認められた。また、カルシウム塩を添加した場合であっても、凍結処理を行わない場合には、酵素活性は損なわれないことが示された。
【００５４】
参 考 例  １
（Ａ）ストレプトマイセス属細菌の培養および培養液の濃縮;
（１)５００ｍｌの坂口フラスコに、表３に示す酵母エキス培地１００ｍｌをとり、これにストレプトマイセス・プルニカラー(Streptomyces prunicolor) （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６５）の凍結保存菌液２ｍｌ接種し、２８℃、１２０ｓｐｍの振盪速度で２４時間培養を行ない、培養液を得た。
【００５５】
酵母エキス培地の組成；
【表３】
2006271284.tif 000005
【００５６】
（２）３０Ｌジャーに、表４に示す大豆粉培地１５Ｌをとり、これに（１）で得た培養液を約５０ｍｌ接種し、２８℃、１５０ｒｐｍの攪拌速度、１.０ｖｖｍの通気量で、２４時間培養を行った。
【００５７】
大豆粉培地の組成；
【表４】
2006271284.tif 000006
なお、大豆粉培地は、水酸化ナトリウムでｐＨを６.８に調整したのちに滅菌処理を行った。
【００５８】
（３）２００Ｌジャーに、表３に示す酵母エキス培地を１８０Ｌ入れ、これに前記（２）で調製したシードを３０ｍｌ接種し、２８℃、２００ｒｐｍの攪拌速度、０.５ｖｖｍの通気量で、２４時間培養を行った。得られた培養液から遠心分離により菌体を除去し、菌体分離後の濃縮液を限外濃縮装置により濃縮した。さらに、濃縮液に対する５倍容のＲＯ水を濃縮液に添加し、再度濃縮操作を行い、低分子物質の除去を行った。この回分加水後濃縮操作を３回繰り返してサンプルを得た。
【００５９】
（Ｂ）塩化カルシウムによるストレプトマイセス属細菌培養液中のゲル状物質
の除去効果：
上記（Ａ）（３）で得た濃縮サンプルに1Ｍ塩化カルシウム溶液を最終濃度で１０、５０、１００、２５０および５００ｍＭになるように添加し、添加直後、１.５時間後、３時間後、一晩放置後（約１８時間）に遠心分離操作を行い、上清の濁度（０.Ｄ. ６６０ｎｍ）とＰＬＤ活性を測定した。最終的に５ｍｌの液量になるように各サンプルを調製し、水を1 Ｍ 塩化カルシウム溶液と同量加えたものを対照としてＰＬＤ活性収率を求めた。遠心分離操作は１５,０００×ｇ、８分間の条件で行った。その結果を図４に示した。
【００６０】
遠心分離操作を行う前の濃縮液サンプルのＯ.Ｄ. ６６０ｎｍが１.２８であったのに対して、塩化カルシウムを添加したものでは、同量の水を添加したものに比べて、顕著に遠心上清の濁度が低下していることが分かる。すなわち、このことは、塩化カルシウムを添加することにより、ゲル状物質を除去することができることを示している。
【００６１】
なお、高濃度の塩化カルシウムを添加したものでは、添加直後の遠心分離操作では遠心上清の濁度が水を添加したものと変わらないが、１.５時間後以降では水を添加したものに比べて遠心上清濁度が低下した。遠心管の底に残った沈殿物は、ゲル状であり、粘土のような状態であった。また、濃縮液サンプル中のホスホリパーゼＤの活性を評価したところ、遠心分離操作前の濃縮液サンプルの活性に対して、どの条件でも９５％以上の活性を示したことから、この操作により濃縮液サンプル中のホスホリパーゼＤの活性が損なわれないことが確認された。
【００６２】
参 考 例  ２
塩化カルシウム添加濃度の詳細な検討；
参考例１と濃縮倍率以外は同様の方法で得られた濃縮液サンプルに、１Ｍ塩化カルシウム溶液を最終濃度で０、５、１０、２０、４０、１００および２００ｍＭになるように添加し、添加直後に遠心分離操作を行い、上清の濁度（Ｏ.Ｄ.  ６６０ｎｍ）を測定した。遠心分離操作は３,０００×ｇ、２.５分間の条件で行った。その結果を図５に示した。
【００６３】
遠心分離操作を行う前の濃縮液サンプルのＯ.Ｄ.  ６６０ｎｍが４.６であったのに対して、１０〜１００ｍＭの濃度になるように塩化カルシウムを添加したものでは、塩化カルシウムを添加しなかった０ｍＭに比べて顕著に遠心上清の濁度が低下していることが分かる。２００ｍＭの添加濃度では遠心上清の濁度が遠心前よりも上昇していることから、添加直後に遠心を行う場合の塩化カルシウムの添加濃度には最適範囲があることが確認された。
【００６４】
参 考 例  ３
他の金属塩との比較；
塩化カルシウム以外の金属塩の影響を評価するために、塩化カルシウムのほか、塩化マグネシウム、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムを使用し、遠心上清の清澄化に与える影響について評価を行った。
【００６５】
試験例２と同様の方法により得られる濃縮液サンプルに、２０ｍＭおよび４０ｍＭの最終濃度になるように塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを添加した。また、４０ｍＭの塩化カルシウム量とモル数が同じになるように４０ｍＭの塩化ナトリウムおよび塩化カリウムを添加したもの、４０ｍＭの塩化カルシウムの濃度に含まれる塩素量と同じになるように８０ｍＭの塩化ナトリウムおよび塩化カリウムを添加したものを調製した。これらは全て金属塩添加直後に遠心分離操作を行い、上清の濁度（Ｏ.Ｄ.  ６６０ｎｍ）を測定した。遠心分離操作は３,０００×ｇ、２.５分間の条件で行った。その結果を図６に示した。
【００６６】
上記結果に示すように、塩化カルシウムと同様、二価の金属塩である塩化マグネシウムを添加した場合にも、塩化カルシウムと同等の効果が得られることが分かった。また、塩素量を揃えた８０ｍＭの塩化ナトリウムおよび塩化カリウムの添加では効果が見られなかったことから、この作用が塩素の作用によるものではないことと同時に、一価の金属塩では効果が見られないことが示された。
【００６７】
参 考 例  ４
添加時の培養液のｐＨが効果に与える影響；
試験例２と同様の方法で得た濃縮液サンプルのｐＨを４.５〜６.５の任意のｐＨに調整し、２０ｍＭの最終濃度になるように塩化カルシウムを添加した。また、ｐＨのみを調整し、塩化カルシウムを添加しないものも調製した。これらは全て金属塩添加直後に遠心分離操作を行い、上清の濁度（Ｏ.Ｄ.  ６６０ｎｍ）を測定した。遠心分離操作は３,０００×ｇ、２.５分間の条件で行った。その結果を図７に示した。
【００６８】
この結果より、塩化カルシウムの遠心上清清澄化に与える効果は、ｐＨが低いほど強いことが確認された。また、塩化カルシウムを添加しないものでもｐＨを５以下にすることにより、清澄化できることが分かったが、ｐＨ５以下では遠心上清中のホスホリパーゼＤ活性の低下が認められ、失活していることが示唆された。このことから、酵素などの活性がｐＨに影響を受けるような有用物質を得る場合は、塩化カルシウムを添加することによりｐＨを極端に下げた場合と同等以上の効果が得られることが分かった。
【００６９】
実 施 例  ３
金属塩の添加濃度とＬ−セリンの凍結保護作用の関係；
実施例１と同様の方法により、微生物（Streptomyces prunicolor）を培養してホスホリパーゼＤを単離・精製し、無添加もしくは１質量％のＬ−セリンを添加し凍結処理した。このとき、濃縮液に塩化カルシウムを１０〜１００ｍＭとなるように添加してホスホリパーゼＤの単離・精製を行った。これらを融解後、当該酵素の酵素活性を調べた。その結果を図８に示す。
【００７０】
この結果に示されるように、Ｌ−セリンを添加せずに凍結処理を行ったホスホリパーゼＤの融解後の活性は、塩化カルシウム濃度依存的に低下したが、１質量％のＬ−セリンを添加して凍結処理を行ったものでは、酵素活性の低下が抑制された。特に４０ｍＭまでの塩化カルシウム濃度に対しては、完全に酵素活性の低下を抑制した。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の方法によれば、ホスホリパーゼＤ、具体的には、微生物から単離・精製したホスホリパーゼＤを凍結保存により当該酵素活性を損なうことなく、長期的に保存することが可能となり、工業的なスケールの大きい各種の反応を行う際の触媒として有効なホスホリパーゼＤ組成物を提供することができる。
【００７２】
特に、本発明の方法は、微生物から単離・精製する工程で、不純物を取り除くために二価の金属塩を伴う工程を具備する製法により得られるホスホリパーゼＤに対する保存方法に好適である。また更に、本発明の方法は、Ｌ−セリンが基質となる反応に用いられるホスホリパーゼＤの保存方法としても非常に有効で、医薬品や食品素材の製造において有利に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】種々の凍結保護剤によるホスホリパーゼＤの凍結保存安定性を示す図面である。
【図２】Ｌ―セリンの添加濃度とホスホリパーゼＤの凍結保存安定性の関係を示す図面である。
【図３】カルシウム塩の添加量と凍結処理の有無がホスホリパーゼＤ活性に与える影響を示す図面である。
【図４】塩化カルシウムによるストレプトマイセス属細胞培養液中のゲル状物質の除去効果を示す図面である。
【図５】遠心上清の濁度と塩化カルシウム濃度の関係を示す図面である。
【図６】各種金属塩の清澄化に与える影響を示す図面である。
【図７】カルシウム塩添加時の培養ｐＨと遠心上清濁度の関係を示す図面である。
【図８】カルシウム塩添加濃度とＬ−セリンの凍結保護作用の関係を示す図面である。                                                         以    上
【図１】
2006271284.tif 000007
【図２】
2006271284.tif 000008
【図３】
2006271284.tif 000009
【図４】
2006271284.tif 000010
【図５】
2006271284.tif 000011
【図６】
2006271284.tif 000012
【図７】
2006271284.tif 000013
【図８】
2006271284.tif 000014