(57)【要約】      （修正有） 【課題】ハイブリダイゼーションチャンバー内における気泡の形成をシンプルな仕方で防止できるようにするシステムを提供する。【解決手段】ギャップ型のチャンバーとして形成されており、スライド（２７）のうちの一つとカバー（２６）との間を液体で満たす。カバー（２６）はスライド（２７）との間でハイブリダイゼーションチャンバー（５）が密封されるように位置付けられ、攪拌装置（３２）により液体を該チャンバー（５）内へ移動させる。該チャンバー（５）内における気泡を防止するための装置は、チャンバー圧力を構築するための圧力装置として構成され、大気圧以上であって、システム（１）に含まれているスプリングエレメントのため、攪拌圧力差とは無関係であり、このスプリングエレメントはハイブリダイゼーションに使用される液体容積部と接続されており、また、このスプリングエレメントは、攪拌装置により発生される圧力差を弾力的に相殺する。【選択図】  図４
2006084459.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スライド（２７）上に固定化された核酸サンプル、タンパク質、または組織切片をハイブリッド形成するためのハイブリダイゼーションチャンバー（５）を有するシステム（１）であって、各ハイブリダイゼーションチャンバー（５）は、前記スライド（２７）のうちの一つとカバー（２６）との間を液体で本質的に満たすことができる本質的にギャップ型のチャンバーとして規定されており、前記カバー（２６）は、前記ハイブリダイゼーションチャンバー（５）が周囲の空気に対して密封されるような仕方で該スライド（２７）との関係において位置付けられており、また、前記システム（１）は攪拌装置（３２）を含み、前記攪拌装置（３２）を用いることにより、液体を前記スライド（２７）上に固定化された前記サンプルとの関係において前記ハイブリダイゼーションチャンバー（５）に移動させることができるシステム（１）において、
前記システムが前記ハイブリダイゼーションチャンバー（５）内における気泡を防止するための装置を含み、前記装置が、前記ハイブリダイゼーションチャンバー（５）内のチャンバー圧力を高めるための圧力装置として構成され、前記チャンバー圧力が、周囲の空気に存在する通常の大気圧を上回っており、また、前記チャンバー圧力は、前記システム（１）に含まれているスプリングエレメントのため、攪拌圧力差とは無関係であり、前記スプリングエレメントが、ハイブリダイゼーションに使用される液体容積部と接続されており、また、前記スプリングエレメントが、前記攪拌装置により発生される圧力差を弾力的に相殺することを特徴とするシステム（１）。
【請求項２】
前記圧力装置が、周囲の空気における通常の大気圧を１００ミリバールから１．４バールまでの範囲で上回るチャンバー圧力を生成すべく装備されていることを特徴とする、請求項１記載のシステム（１）。
【請求項３】
前記圧力装置が圧力源（８、３）を含み、前記圧力源が、圧力下に置かれ得るライン（９、５１）を介して前記ハイブリダイゼーションチャンバー（５）に接続可能であることを特徴とする、請求項１記載のシステム（１）。
【請求項４】
前記圧力源が供給ポンプ（８）または加圧ガスボトル（３）を含むことを特徴とする、請求項３記載のシステム（１）。
【請求項５】
圧力下に置かれ得る前記ライン（９、５１）が接続バルブ（１９）、分配ライン（１０）、および収集ライン（１５）、ならびに前記ハイブリダイゼーションチャンバー（５）のそれぞれに対するインレットバルブ（１２）およびアウトレットバルブ（１４）を含むことを特徴とする、請求項３記載のシステム（１）。
【請求項６】
圧力下に置かれ得る前記ライン（９、５１）が、更に、廃液バルブ（１７）を有する廃液ライン（１６）およびリリーフバルブ（２１）を有するリリーフライン（２０）を含むことを特徴とする、請求項５記載のシステム（１）。
【請求項７】
前記攪拌装置（３２）がカバー（２６）の圧力チャンバー（３４）にそれぞれ接続可能な超過圧力ポンプ（４６）および超過圧力容器（４７）を含み、前記カバー（２６）が、更に、前記圧力チャンバー（３４）を攪拌チャンバー（３０）から分離する膜（３３）を含んでいることを特徴とする、請求項１記載のシステム（１）。
【請求項８】
前記攪拌装置（３２）が前記カバー（２６）の圧力チャンバー（３４）にそれぞれ接続可能な部分的真空ポンプ（４８）および部分的真空容器（４９）を含み、前記カバー（２６）が、更に、前記圧力チャンバー（３４）を攪拌チャンバー（３０）から分離する膜（３３）を含んでいることを特徴とする、請求項１記載のシステム（１）。
【請求項９】
前記スプリングエレメントが前記カバー（２６）内に配置された第二の膜（３３’）として装備されていることを特徴とする、請求項１記載のシステム（１）。
【請求項１０】
前記スプリングエレメントが、ハイブリダイゼーションプロセス中に前記ハイブリダイゼーションチャンバー（５）に接続されるガスクッションとして装備されることを特徴とする、請求項１記載のシステム（１）。
【請求項１１】
前記スプリングエレメントが、前記カバー（２６）の前記アウトレットライン（１３）内に配置され、前記ハイブリダイゼーションチャンバー（５）に接続されるガスクッションとして装備されていることを特徴とする、請求項１０記載のシステム（１）。
【請求項１２】
前記スプリングエレメントが、前記廃液バルブ（１７）、前記接続バルブ（１９）、および前記リリーフバルブ（２１）の間の前記収集ライン（１５）内に配置されているエアーチャンバーとして装備されていることを特徴とする、請求項１０記載のシステム（１）。
【請求項１３】
前記システムが、２つまたはそれ以上のハイブリダイゼーションチャンバー（５Ａ、５Ｂ）を規定するカバー（２６）を含むことを特徴とする、請求項１記載のシステム（１）。
【請求項１４】
スライド（２７）上に固定化された核酸サンプル、タンパク質、または組織切片をハイブリッド形成するためのシステム（１）のハイブリダイゼーションチャンバー（５）内における気泡を防止するための方法であって、前記方法により、前記スライド（２７）のうちの一つとカバー（２６）との間に配置された本質的にギャップ型の各ハイブリダイゼーションチャンバー（５）が液体で本質的に満たされ、前記カバー（２６）は、前記ハイブリダイゼーションチャンバー（５）が周囲の空気に対して密封されるような仕方で前記スライド（２７）との関係において位置付けられており、前記システム（１）が攪拌装置（３２）を含み、前記攪拌装置を用いることにより、液体を前記スライド（２７）上に固定化された前記サンプルとの関係において前記ハイブリダイゼーションチャンバー（５）に移動させることができる方法において、
前記システム（１）の圧力装置を用いることにより、前記ハイブリダイゼーションチャンバー（５）内に周囲の空気に存在する通常の大気圧を上回るチャンバー圧力が提供され、また、前記チャンバー圧力は、前記システム（１）に含まれているスプリングエレメントのため、攪拌圧力差とは無関係であり、前記スプリングエレメントが、ハイブリダイゼーションに使用される液体容積部と接続されており、また、前記スプリングエレメントが、前記攪拌装置により発生される圧力差を弾力的に相殺することを特徴とする方法。
【請求項１５】
通常の周囲の圧力よりも少なくとも１００ミリバールから多くても１．４バール高いチャンバー圧力が発生されることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記チャンバー圧力が液体または気体を用いて発生されることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記チャンバー圧力を発生させるための前記液体がハイブリダイゼーション媒質であり、前記ハイブリダイゼーション媒質が、供給ポンプ（８）により分配ライン（１０）に押し入れられ、また、インレットバルブ（１１）を介して前記ハイブリダイゼーションチャンバー（５）内の液体に押し向けられることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記チャンバー圧力を発生させるための前記気体が、エアレーションバルブ（９）を介して供給ポンプ（８）により吸引された空気、または容器（３）内に貯蔵された不活性ガスであり、前記気体が、分配ライン（１０）およびインレットバルブ（１１）を介して、前記ハイブリダイゼーションチャンバー（５）内の液体に押し向けられることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
望ましいチャンバー圧力よりも０．５バールから１バール高い攪拌圧力が圧力チャンバー（３４）内に生成され、前記圧力チャンバー（３４）が前記カバー（２６）内に配置され、膜（３３）を用いて攪拌チャンバー（３０）から分離されていることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
前記カバー（２６）内に配置された第二の膜（３３’）、または収集ライン（１５）もしくはアウトレットライン（１３）のガス充填容積部が、前記攪拌圧力差を相殺するスプリングエレメントとして利用されることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
この特許出願は、２００４年８月４日に出願されたドイツ実用特許出願ＤＥ第２０  ２００４  ０１２  １６３．８号、２００４年７月８日に出願されたスイス特許出願ＣＨ第２００４  １１４４／０４号、および２００５年９月１日に出願された米国特許出願１０／９３１，４３２号の優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、独立請求項１の前文による、スライド上に固定された核酸サンプル、タンパク質、または組織切片をハイブリッド形成するためのハイブリダイゼーションチャンバーを有するシステムに関する。このケースでは、各ハイブリダイゼーションチャンバーは、これらのスライドのうちの一つとカバーとの間の本質的にギャップ型のチャンバーとして規定されており、このギャップ型のチャンバーは本質的に液体で満たすことが可能である。各カバーは、スライドとの関係において、ハイブリダイゼーションチャンバーが周囲の空気から密封されるような仕方で位置付けられている。このようなシステムは攪拌装置を含んでおり、この攪拌装置を用いることにより、液体をスライド上に固定されたサンプルとの関係においてハイブリダイゼーションチャンバー内へ移動させることができる。更に、本発明は、独立請求項１４の前文による、スライド上に固定された核酸サンプル、タンパク質、または組織切片をハイブリッド形成するためのシステムのハイブリダイゼーションチャンバー内における気泡を防止するための対応する方法に関する。この方法によれば、このスライドとカバーとの間に位置付けられたすべての本質的にギャップ型のハイブリダイゼーションチャンバーは本質的に液体で満たすことが可能である。このケースでは、カバーは、スライドとの関係において、ハイブリダイゼーションチャンバーが周囲の空気から密封されるように位置付けられている。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡサンプル（ＤＮＡ＝デオキシリボ核酸）および特にこのようなサンプルのマイクロアレイの使用は、多数の遺伝子を同時に分析する研究にとって重要な技術を提供する。この技術は、多数の遺伝子からのＤＮＡサンプルを固体の基体表面上に、例えば光顕微鏡用のガラス製スライド上に固定化するステップを含む。これらのＤＮＡサンプルは、好適には、アレイ状を為すサンプルスポットまたは「スポット」、即ち、基体上の二次元格子に位置付けられ、このようなアレイ内における特定の位置に基づき、対応するＤＮＡサンプルの起源を後に推断することができる。また、この技術は、典型的には、これによりＤＮＡサンプル中の特定のヌクレオチド配列を検出するために、ＤＮＡサンプルアレイをＲＮＡ試料の懸濁液及び／又は溶液（ＲＮＡ＝リボ核酸）と接触させるステップを含む。典型的には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び／又はタンパク質もしくはポリペプチドを含有する試料懸濁液も使用される。
【０００４】
ＲＮＡ試料は、いわゆる「標識」または「ラベル」と共に、即ち、例えば特定の波長を有する蛍光を発する分子と共に、提供可能である。固定化サンプルは、アミノ酸（例えばタンパク質、ペプチド）または核酸（例えばｃＤＮＡ、ＲＮＡ）を含有するサンプルも含むことができる。固定化サンプルとハイブリッド形成するか、または固定化サンプルに別な仕方で結合するあらゆる随意的な分子及び／又は化学的化合物が、固定化サンプルに加えられる試料に含まれていてよい。
【０００５】
良好な実験条件下においては、ＲＮＡ試料は、固定化ＤＮＡサンプルとハイブリッド形成及び／又は結合し、それらと共にハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ鎖を形成する。それぞれの固定化ＤＮＡサンプルに対する、および特定のＲＮＡ試料に対する、種々のＤＮＡサンプルの中でのハイブリダイゼーションの差異は、それぞれの別個なマイクロアレイエレメントにおける蛍光の強度および波長依存性を測定することにより決定することができ、これにより、検定されたＤＮＡサンプルにおいて遺伝子発現の程度が変動するかどうかを調べることができる。ＤＮＡマイクロアレイを用いることにより、僅かな量の生物学的材料の使用を必要とするだけで、大量の遺伝子の発現およびこれらの遺伝子の発現パターンについての広範囲にわたる言明を為すことができる。
【０００６】
ＤＮＡマイクロアレイは成功裏のツールとして確立されており、ＤＮＡハイブリダイゼーションを実施するための装置は絶えず改善され続けている（例えば、本出願の出願人によるＵＳ第６，２３８，９１０号またはＥＰ第１  ２６０  ２６５  Ａ１号参照）。これらの文献は、スライド上の核酸サンプルをハイブリッド形成するためのハイブリダイゼーションチャンバーを提供する装置を開示している。これらの装置はスライドとの関係において移動可能に構成されており、周囲の空気との関係において、ギャップ型のハイブリダイゼーションチャンバーを密封するための環状のシールまたはシーリング表面を含み、このシールまたはシーリング表面が上述のスライドの表面に適用される。更に、これらの装置は、ハイブリダイゼーションチャンバー内へ媒質を供給するためのライン、およびハイブリダイゼーションチャンバーから媒質を排除するためのライン、更にはサンプルを供給するためのラインを含む。スライド上に固定化されたＤＮＡサンプルとの関係において、例えばＲＮＡ試料を有する液体の改善された温度制御方法および移動方法についても開示されている。
【０００７】
液体がハイブリダイゼーションチャンバー内へ導入されるとき、またはそれ以降においてさえ、気泡が生じる事態が何回も繰り返し発生する。しかし、ハイブリダイゼーションチャンバー内における試薬のより一層完璧な混合を果たすための攪拌手段として、意図的に気泡を使用する試みが為されている（例えば、ＵＳ第６，１８６，６５９号を参照）。しかし、一般的に、ハイブリダイゼーション媒質中に存在する気泡は、これらの気泡が通常は非常に薄い固定化サンプル上の液体膜と干渉するため、望ましくない。この干渉は、ハイブリダイゼーション媒質内における試薬分布の不均一性をもたらしかねず、従って、ハイブリダイゼーション結果にエラーを招くことがある；最悪のケースでは、大きめの気泡がスライド上に固定されたサンプルの部分からハイブリダイゼーション媒質を追いやってしまうことさえあり得る。
【０００８】
更に、自然に生じる気泡の発生またはチャンバー内における気泡の存在を防止するための関連技術から数多くの方法が知られている。従って、例えば、ハイブリダイゼーションチャンバーを定めるスライドとカバーの非平行的な配列が提案されており（ＵＳ第５，９２２，５９１号参照）、または、ハイブリダイゼーションプロセスの全期間を通じてハイブリダイゼーション媒質がチャンバーに出し入れされる。また、気泡の形成を防止することを目的として、ハイブリダイゼーション媒質に対する表面張力を低減する試薬を混ぜ合わせる方法や、チャンバーの表面を撥水性化合物で処理する方法も知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ある構成がＵＳ第６，４５８，５２６号から既知であり、この構成を用いた場合、溶媒で飽和されたガスでできた、ハイブリダイゼーションチャンバー内へ突出する「バブル半球体１４０」が生成される。これらの「バブル半球体」は、実際には、ある定められた曲率半径を有するガスチャンバーの球形キャップ様の形状を為す境界表面である。これらの「バブル半球体」は、サンプルのハイブリダイゼーションを妨害しない、チャンバーの定められたポイントに位置付けられている。ハイブリダイゼーション媒質に含有される溶媒１６０は、ハイブリダイゼーションチャンバーから隔てられたコンパートメントに配置されている。この溶媒により、「バブル半球体１４０」の後に位置するガスチャンバーに常に接続された飽和雰囲気１５０が維持される（ＵＳ第６，４５８，５２６号の図２参照）。従って、溶媒で飽和された雰囲気が球形キャップ様の形状を為す境界表面へ常にもたらされ、これにより、ハイブリダイゼーション媒質中に存在する溶媒の分圧は、存在するあらゆる気泡が収縮し、排除されるように影響を及ぼす。この方法は、特殊な装置を用いて球形キャップ様の形状を為すこれらの境界表面を作り、維持しなければならないという欠点を有している。
【００１０】
本発明の目的は、代替的なシステム及び／又は代替的な方法を提供し、この代替的なシステム及び／又は方法を用いることにより、ハイブリダイゼーションチャンバー内における気泡の形成をシンプルな仕方で防止できるようにすることに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この目的は、第一の態様である独立請求項１の特徴部分により達成され、そこでは、初めの箇所で述べられている通りのシステムがハイブリダイゼーションチャンバー内における気泡を防止するための装置を含み、この装置は、ハイブリダイゼーションチャンバー内におけるチャンバー圧力を高めるための圧力装置として装備される。このチャンバー圧力は、周囲の空気に存在する通常の大気圧以上であって、システムに含まれているスプリングエレメントのため、攪拌圧力差とは無関係である。このスプリングエレメントはハイブリダイゼーションに使用される液体容積部と接続されており、また、このスプリングエレメントは、攪拌装置により発生された圧力差を弾力的に相殺する。更に、この目的は、第二の態様である独立請求項１４の特徴部分により達成することができ、そこでは、初めの箇所で述べられている通りのシステムにおける圧力装置を用いることにより、ハイブリダイゼーションチャンバー内に圧力が生成され、この圧力は、周囲の空気に存在する通常の大気圧以上である。このチャンバー圧力は、上述のシステムに含まれているスプリングエレメントのため、攪拌圧力差とは無関係である。このスプリングエレメントはハイブリダイゼーションに使用される液体容積部と接続されており、また、このスプリングエレメントは、攪拌装置により発生された圧力差を弾力的に相殺する。従属請求項から、本発明による付加的な好ましい特徴がもたらされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
次に、本発明によるシステムおよび本発明による方法を例示的な実施態様の概略図に基づいて詳細に説明するが、この説明は本発明の範囲を制限するものではない。
【００１３】
図１は、本発明による方法を実施することができるシステム１の概略図を示している。洗浄液（Ｗ３、Ｗ２、Ｗ１）、プレハイブリダイゼーション緩衝液（Ｖ−Ｐ）、アルコール洗浄液（Ａ−Ｒ）、蒸留水（Ａ．Ｄ．）などの液体ハイブリダイゼーション媒質を貯蔵するための多数の容器２、および不活性ガス（Ｎ２）を有する容器３が、この概略図の左側に示されている。個々のバルブ４がこれらの各容器２の下流側に接続されており、これらのバルブを介して、これらの媒質をハイブリダイゼーションチャンバー５（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４）（右側に示されている）へ供給することができる。バルブ４を含む媒質ライン６は収集ライン７に注ぎ込み、更に、収集ライン７は供給ポンプ８に注ぎ込んでおり、通気バルブ９が供給ポンプ８から上流に接続されている。この供給ポンプ８は、収集ライン７を介して容器２から液体媒質を吸い出し、分配ライン１０を介してその液体媒質をインレットライン１１にポンピングすべく機能し、これらのインレットライン１１は、インレットバルブ１２を介してハイブリダイゼーションチャンバー５に注ぎ込んでいる。ハイブリダイゼーション媒質はアウトレットライン１３を介してハイブリダイゼーションチャンバー５を去り、各アウトレットライン１３はアウトレットバルブ１４を含んでいて、収集ライン１５に注ぎ込んでいる。更に、この収集ライン１５は廃液ライン１６に注ぎ込んでおり、廃液ライン１６は廃液バルブ１７を用いて閉止可能である。分配ライン１０および収集ライン１５は、接続ライン１８および接続バルブ１９を介して相互に連通させることができる。リリーフバルブ２１を有するリリーフライン２０は、この接続ライン１８から枝分かれし、エアレーション及び／又は通気用開口２３を有する収集容器２２に注いでいる。トランジションライン２５を介して廃液ライン１６へ接続された供給ポンプ２４が収集容器２２の下流側に接続されている。
【００１４】
ハイブリダイゼーション媒質をハイブリダイゼーションチャンバー５に一層良好な状態で分配するため、システム１は、本件特許出願の出願人による欧州特許出願ＥＰ第１  ２６０  ２６５  Ａ１号から既知の如く、攪拌機構及び／又は攪拌装置３２を備えている。ここでこの特許出願ＥＰ第１  ２６０  ２６５  Ａ１号の内容の参照が明確に為され、従って、この内容は本特許出願の一部とみなされる。
【００１５】
図２は、ＥＰ第１  ２６０  ２６５  Ａ１号の図１に相当する、ハイブリダイゼーションチャンバー５を通じる垂直縦方向断面図を示している。この装置のカバー２６は、簡単な動作でハイブリダイゼーションチャンバー５を開け閉めできるように、スライド２７との関係において動かすことができる（ここでは、軸の回りで旋回可能に為されている）。環状のシーリング表面２８は、この表面２８をスライド２７の表面２９に適用することにより、ハイブリダイゼーションチャンバー５を密封するために使用される。このシーリング表面２８は、スライド２７の表面２９に平らに着座するカバー２６の窪んだ表面であってよい；代替的に、例えばリップ型のシールも使用することができる。しかし、好適には、Ｏ−リング型のシールがシーリング表面２８として使用される。この構成は、それぞれ、ハイブリダイゼーションチャンバー５へ媒質を供給するため、およびハイブリダイゼーションチャンバー５から媒質をパージするためのライン１１、１３を含む。このような媒質は、洗浄液または緩衝液などのハイブリダイゼーション反応を実行するための試薬であってよく、更には、スライド２７上のハイブリダイゼーション生成物を乾燥させるための及び／又はハイブリダイゼーションチャンバー５および媒質ライン１１、１３をパージするための不活性ガス（窒素など）であってよい。好適には、ハイブリダイゼーション媒質のためのこれらの供給及び／又はパージライン１１、１３は、それぞれ、攪拌チャンバー３０、３０’に注ぎ込んでいる。この構成は、更に、閉鎖可能な試料供給部３１を含んでおり、この試料供給部３１を通じて、ＲＮＡまたは他の試料液を含有する液体を手操作でピペッティングすることができる。試料供給部３１は、好適には、プラスチック製の栓（図示せず）を用いて閉鎖される。代替的に、ＥＰ第１  ２６０  ２６５  Ａ１号の別の実施態様で開示されているように、自動的及び／又はロボット式の試料供給手段を設けることもできる。
【００１６】
この構成は、スライド２７の表面２９に固定化された核酸、タンパク質、または組織切片のサンプルとの関係において液体を動かすための媒質−分離攪拌装置３２を含んでいる。図２に示されている実施態様では、本構成の攪拌装置３２は膜３３を含んでいる。この膜３３は、圧力ライン３５を介して圧力流体（気体または液体）を充填できるように為されている圧力チャンバー３４を、攪拌ライン３６を介してハイブリダイゼーションチャンバー５に接続されている攪拌チャンバー３０から分離している。本構成が熱平衡に達し、特定の容積のＲＮＡ試料液を加え、試料供給部３１を閉鎖した後、好適には、膜３３が同じ律動的な動きで撓み、従って、攪拌チャンバー３０を収縮及び／又は拡張させるように、空気または別の気体（但し、液体であってもよい）が、パルス的に、圧力ライン３５を介して圧力チャンバー３４に導入され、または圧力チャンバー３４から排出される。従って、試料液は、超過圧力または部分的真空および緩和の同じ律動的な動きでハイブリダイゼーションチャンバー５の一方の端部または他方の端部に向けて動かされ、ここで、好適には、ハイブリダイゼーションチャンバー５の内部に面したカバー２６の表面３７に横方向フローチャンネル３８、３８’が配置されている。
【００１７】
これらの横方向フローチャンネル３８、３８’は、試料溶液中に含有されているＲＮＡ分子の横方向の分配を容易化する。これにより、試料液及び／又は洗浄液をハイブリダイゼーションチャンバー５内に存在する全容積にわたって均一に分配することがもたらされる。更に、これらの横方向フローチャンネル３８、３８’は、ハイブリダイゼーションチャンバー５のパーツが本装置に組み込まれている攪拌装置３２において発生される往復運動（実線の両方向矢印）中に意図せず乾燥状態のまま放置されないようにするための液体レザバーとしても使用される。
【００１８】
好適には、同じく膜３３’を備えた第二の攪拌チャンバー３０’が第二の攪拌ライン３６’を介してハイブリダイゼーションチャンバー５に接続されている。圧力チャンバー３４へのある圧力パルス出力が第一の膜３３を第一攪拌チャンバー３０に押し込む場合、このパルスは、第一攪拌ライン３６を介してハイブリダイゼーションチャンバー５内の試料液へ伝達される。試料液は、第二攪拌ライン３６’に向けて幾分偏倚し（第二攪拌ライン３６’を部分的に満たすことさえあり得る）、第二攪拌チャンバー３０’の圧力を増大させる。従って、第二の膜３３’は上向きに撓み、同時に、弾性的に伸張される。圧力チャンバー３４内の超過圧力が解放されるとすぐに、両方の膜３３、３３’がこれらの膜の静止位置へ跳ね戻り、ハイブリダイゼーションチャンバー４内の試料液を反対方向に動かす。この往復運動により、極少量の容積（約１００μｌの範囲）を有する試料液を、図示されている構成を用いて１分未満でハイブリダイゼーションチャンバー４内に実際的に均一に分配することができる。好適には、先行する圧力パルスに対抗するハイブリダイゼーションチャンバー５内への試料液の逆方向運動を更に増幅することができるように、圧力チャンバー３４内の圧力が低減した直後に、圧力チャンバー３４内で部分的な真空が発生される。
【００１９】
図３は、下側から見た、図２の構成の水平方向投影図を示している。Ｏ−リングシール２８は、横方向フローチャンネル３８、３８’を有するハイブリダイゼーションチャンバー５の側面境界を定めており、これらのフローチャンネル３８、３８’は、カバー２６の表面３７の互いに正反対の対向する各端部における窪みとして設けられている。スライド２７（ここでは光顕微鏡検査用のガラス製スライド）およびスライドの把持領域５５が破線で示されている。スライド２７の把持領域５５を押さえつけている固定用スプリング５６も明確に図示されている。ハイブリダイゼーションチャンバー５を開く際、この固定用スプリング５６は、スライド２７をカバー２６から自動的に分離することを容易化する。インレットライン１１、アウトレットライン１３、および圧力ライン３５のレイアウト、ならびに攪拌チャンバー３０、３０’および試料供給部３１の配列も明示されている。攪拌ライン３６、３６’および試料供給部３１は横方向フローチャンネル３８、３８’に注いでいる。
【００２０】
媒質を供給及び／又はパージするためのすべてのライン１１、１３、３５は、好適には、カバー２６の共用接続平面５７に注いでおり、この共用接続平面５７は、ハイブリダイゼーションチャンバー５に本質的に平行に配置されており、好適には、ハイブリダイゼーションチャンバー５と同じ高さに配置されている。ライン１１、１３、３５の吐出口は、（図示されているように）相互にずらした状態で配置されてよく、または装置１を横断的に走る線上に配置（図示せず）してもよい。凹部（参照番号の付いていない矢印、図２参照）は、カバー２６から、またはカバー２６への熱の流れを低減する。
【００２１】
そのうちの一つがそれぞれのハイブリダイゼーションチャンバー５用に意図されている圧力ライン３５は、図１に破線で示されており、圧力分配ライン３９に端を発している。均圧化バルブ４１を有する均圧化ライン４０、超過圧力バルブ４３を有する超過圧力供給ライン４２、および部分的真空バルブ４５を有する部分的真空供給ライン４４は、この圧力分配ライン３９に注いでいる。超過圧力は、好適には、超過圧力ポンプ４６内の費用有効性ガス（例えば空気）を用いて発生され、超過圧力容器４７に貯蔵され、超過圧力供給ライン４２へ送られる。部分的な真空は、部分的真空ポンプ４８において発生され、部分的真空容器４９に貯蔵され、部分的真空供給ライン４４へ送られる。
【００２２】
不活性ガス容器３はガスバルブ５０およびガスライン５１を介して分配ライン１０へ接続されており、分配ライン１０はインレットライン１１およびそれぞれ１個のインレットバルブ１２を介してハイブリダイゼーションチャンバー５に注いでいる。すべてのハイブリダイゼーションチャンバー５（バルブの設定に依存して、個々にまたはグループとして）は、分配ライン１０およびインレットライン１１を通じ、アウトレットライン１３および収集ライン１５を介して、不活性ガス（例えば窒素ガス）を用いてパージすることができる。
【００２３】
ガスバルブ５０、接続バルブ１９、およびリリーフバルブ２１が開いている場合にのみ、分配ライン１０を収集容器２２にパージすることができる。ガスバルブ５０、接続バルブ１９、および廃液バルブ１７が開いている場合にのみ、廃液ライン１６を介して分配ライン１０および収集ライン１５をパージすることができる。
【００２４】
図４は、図２に対応する、ハイブリダイゼーションチャンバー５および折りたたみ式フレーム５４を有する構成を通じる垂直縦方向断面図を示しており、折りたたみ式フレーム５４は、そこに挿入された本システム１のカバー２６を有しており、折り上げられた状態で示されている。カバー２６は、好適には、４個が一つのグループとなって相互に平行に位置付けられ、それは、このように配列することにより、温度制御用サーモスタットの接触プレート５３がある特定の寸法を有し、相互に平行に位置付けられた４つのスライド２７を有するマイクロプレートのサイズの輸送フレーム５２をその上に精確に嵌め込むことが可能になるためである。これらの各４個のグループが温度制御ユニットに接続された接触プレート５３に割り当てられる。従って、このような接触プレート５３は、輸送フレーム５２の４つのスライド２７を平らに受け入れることができるように構成されている。フレーム５２は、縦方向の壁、横方向の壁、および横方向の壁に本質的に平行に走る中間の壁を含む。これらの壁は、フレーム５２を完全に貫通している開口を取り囲んでおり、これらの開口により、サーモスタットの接触プレート５３とスライド２７との直接的な接触が可能に為されている。スライド２７はフレーム５２に柔軟に弾性的に保持されているため、また、接触プレート５３は、フレーム５２が接触プレートとの関係において幾分下げることができるように為されているため、スライド２７は、接触プレート５３の表面上に直接的に着座している。一つの方法のユニットを為す各４個のグループは折りたたみ式フレーム５４を含み、この折りたたみ式フレーム５４は、軸５８の回りで旋回可能であって、また、ベースプレート５９との関係においてロック可能であり、４つの着座箇所を有していて、これらの各着座箇所にカバー２６を挿入することができるように為されている。このような方法の各ユニットは、更に、システム１のインレットライン１１、アウトレットライン１３、および圧力ライン３５とカバー２６のインレットライン１１、アウトレットライン１３、および圧力ライン３５とを密封された状態で接続するための接続プレート６０を含んでいる。本システムの側面に配置されたＯ−リングはこれらの接続（図示せず）に対するシール部として好適である。
【００２５】
図５は、図２に対応する、ハイブリダイゼーションチャンバー５および折りたたみ式フレーム５４に挿入された本システムのカバー２６を有する構成を通じる垂直縦方向断面図を示しており、折りたたみ式フレーム５４が閉じられた状態で図示されている。従って、接触プレート５３およびこのような折りたたみ式フレーム５４により規定された４個のグループの４つすべてのハイブリダイゼーションチャンバー５は、温度制御ユニットの温度制御下に置かれる。一つの方法のユニットを為す各４個のグループは、上で説明されているように、折りたたみ式フレーム５４を含み、この折りたたみ式フレーム５４は、軸５８の回りで旋回可能であって、また、ベースプレート５９との関係においてロック可能であり、４つの着座箇所を有していて、これらの各着座箇所にカバー２６を挿入することができるように為されている。カバー２６をスライド２７に対して面平行に配置できることを確実化するため、折りたたみ式フレーム５４は、更に、軸５８に対して平行な可動性を有する中間接合部（図示せず）を有している。シール２８が信頼性高くハイブリダイゼーションチャンバー５を密封できるようにするため、ネジ、ロッカーアーム、または同様な既知の装置（図示せず）により生成され得る付加的な圧力が折りたたみ式フレーム５４を介してカバー２６に及ぼされる。
【００２６】
本発明は、ハイブリダイゼーション中に自然に生じる気泡の発生を、ハイブリダイゼーションチャンバー５内に超過圧力を発生させることにより防止することができるという認識に基づいている。この場合、チャンバー圧力は、周囲の空気に存在する通常の大気圧以上であるべきである。周囲の圧力より少なくとも１００ミリバールから多くても１．４バール高いチャンバー圧力が好適である。チャンバーを密封状態に保つ以上に充分に高い接触圧力がこれらのチャンバー圧力を相殺する場合には、チャンバー圧力をそれ以上に高くすることも可能である。
【００２７】
これらの圧力条件下では、ハイブリダイゼーション中に気泡は実際に生じない。この現象が基づく機能的なメカニズムは、これまでのところ完全には説明されていない。しかし、周囲の空気の気体分子がもはやハイブリダイゼーションチャンバー５内へ拡散し得ないように、高められた圧力がＯ−リングシール２８の領域内における拡散方向を決定及び／又は規定するものと考えられる。更に、ハイブリダイゼーション媒質における相境界が圧力依存性であるため、必ずや、自然発生的な気泡形成が抑制されるようなハイブリダイゼーション媒質における相境界のシフトが存在する。従って、本発明との関係においては、（ハイブリダイゼーションチャンバー５内における発生プロセスにもかかわらず）ハイブリダイゼーション媒質中に存在するすべての気泡を「気泡」と呼ぶ。
【００２８】
本発明によれば、ハイブリダイゼーションチャンバー５内における必要な超過圧力は、液体を用いて、例えば、供給ポンプ８を用いてハイブリダイゼーションチャンバー５内へ押し込まれる容器２のうちの一つからのハイブリダイゼーション媒質を用いて達成することができる（図１参照）。このハイブリダイゼーションチャンバー５を含むシステム１が、固定化されたサンプルとの関係においてハイブリダイゼーション媒質を動かすための攪拌装置３２を有している場合には、このシステムは、好適には、攪拌装置３２により発生される圧力差を弾力的に相殺するスプリングエレメントも含んでいる。このようなスプリングエレメントは、ハイブリダイゼーションチャンバー５に対する対応する供給ラインまたは除去ラインにおける弾性的な管状部分（図示せず）であってよい；しかし、あるラインを介してハイブリダイゼーションチャンバー５へ接続される、弾力的に影響を及ぼす膨張容器（図示せず）を設けることもできる。
【００２９】
これの代替手段として、容器３から分配ライン１０およびインレットライン１１へ不活性ガスを押し込み、サンプルおよびそれぞれ一つのインレットバルブ１２を介してハイブリダイゼーション媒質が既に充填されているハイブリダイゼーションチャンバー５に必要な圧力を構築することもできる。ハイブリダイゼーション媒質とどんな化学的相互作用または反応も起こさないＮ２（窒素）などの不活性ガスが好適である。更に、不活性ガスがハイブリダイゼーション媒質に溶解しない場合も有利であり得る。（図１で４６および４７の参照番号が付されたエレメントと同様な）圧力ポンプおよび圧力容器に端を発する気体を、分配ライン１０へ導入することも可能である。圧力が構築された後、すべてのバルブを再び閉じ、ハイブリダイゼーションを実施することができる。この場合、ハイブリダイゼーションに使用される液体容積部と直接的に接続されている、このようにして構築されたガスクッションは、攪拌圧力差を弾力的に相殺するためのスプリングエレメントとして使用される。極少量ではあるがＯ−リングシール２８を介する一定の圧力損失が存在するため、必要な場合には、例えば、典型的には何時間もかかるハイブリダイゼーション中に、必要なチャンバー圧力を散発的に補正するか、もしくは更新及び／又は一定に保持することもできる。このため、バルブ１２、１４（図１参照）のうちの一方または両方を交互に開いた状態に保つことができる。
【００３０】
更なる代替的な方法（図示されていない）は、（図１で４６および４７の参照番号が付されたエレメントと同様な）圧力ポンプおよび圧力容器または（図１のＮ２容器３などの）ガス容器を収集ライン１５へ接続し、アウトレットバルブ１４を開くことにより、ハイブリダイゼーションチャンバー５に圧力を構築する方法である。攪拌圧力差を弾力的に相殺するためのスプリングエレメントとして使用されるガスクッションを提供するための更なる代替的な方法は、（図１で４６および４７の参照番号が付されたエレメントと同様な）圧力ポンプおよび圧力容器または（図１のＮ２容器３などの）ガス容器に端を発する気体を、分配ライン１０または収集ライン１５のうちの少なくとも一方に注ぎ込んでいるラインのうちの一つに導く方法である。これに対応して、バルブ１２、１４（図１参照）のうちの一方または両方を開いた状態に保つことができる。
【００３１】
（上で説明されているように）２つの攪拌膜３３、３３’を含む配列を有するシステム１が使用される場合、攪拌装置３２は、ハイブリダイゼーションチャンバー５内におけるハイブリダイゼーション媒質の予備攪拌中に使用することができ、またはハイブリダイゼーション自体が行われている間においてさえ使用することができる。このため、攪拌圧力は圧力チャンバー３４内において容易に発生させられねばならず、その圧力は、周囲の圧力を１００ミリバールから１．４バール上回る望ましいチャンバー圧力よりも約０．５バールから１バール高い。従って、攪拌用に加えられるべき圧力は、（周囲の圧力に依存して）約１．６−２．４バールの範囲で変動する。このケースでは、第二の膜３３’が、この攪拌圧力を弾力的に相殺するスプリングエレメントを形成する。
【００３２】
典型的には、ハイブリダイゼーションは以下のステップａ）〜ｈ）のようにして実行される：
ａ）分配ライン１０および収集ライン１５から気泡および液体残分をパージするステップ。このために、バルブ４（Ａ．Ｄ．）、１９、および１７のみが開かれ、蒸留水が、供給ポンプ８を用いて、容器２（Ａ．Ｄ．）からバルブ４（Ａ．Ｄ．）を介して分配ライン１０にポンピングされる。蒸留水は、接続バルブ１９を通じて収集ライン１５に流れ、そこから廃液バルブ１７を介して廃液ライン１６に流れる。ハイブリダイゼーションチャンバー５が同時に構成される。これは、その上に固定化されたサンプルを有する（好適には輸送フレーム５２に保持された）スライド２７をサーモスタットの接触プレート５３上に置き、スライド２７上に固定化された核酸サンプル、タンパク質、または組織切片をハイブリッド形成するためのシステム１の折りたたみ式フレーム５４にカバー２６を挿入し、カバー２６をスライド２４上に折り下げることによってハイブリダイゼーションチャンバー５を閉じることにより、実行される（図４および５参照）。この折り下げにより、それぞれの別個なハイブリダイゼーションチャンバー５のインレットライン１１、アウトレットライン１２、および攪拌装置３２の圧力ライン３５の端部が、本システム１の対応するラインの端部に接続される。好適には、４つのカバー２６は、（輸送フレーム５２に受け入れられた４つのスライド２７に対応する）一つの折りたたみ式フレームに挿入される。
【００３３】
ｂ）プレハイブリダイゼーション緩衝液を用いてハイブリダイゼーションチャンバー５を満たし、温度制御を行うステップ。このために、バルブ４（Ｖ−Ｐ）、１２、１４、および１７のみが開かれ、供給ポンプ８を用いて、プレハイブリダイゼーション緩衝液が容器２（Ｖ−Ｐ）からバルブ４（Ｖ−Ｐ）を介して分配ライン１０にポンピングされ、そこからインレットバルブ１２を介してハイブリダイゼーションチャンバー５にポンピングされる。プレハイブリダイゼーション緩衝液の一部は、アウトレットバルブ１４および収集ライン１５を介してハイブリダイゼーションチャンバー５を去り、廃液バルブ１７を介して廃液ライン１６に達する。ここで初めて気泡がハイブリダイゼーションチャンバー５に共に搬送されてしまう可能性があるため、この手順は特別な注意を払う必要がある。
【００３４】
ｃ）分配ライン１０および収集ライン１５をパージするステップ。このために、バルブ９、１９、および１７のみが開かれ、供給ポンプ８を用いて空気がエアレーションバルブ９を介して吸引され、分配ライン１０および接続バルブ１９を介して収集ライン１５にポンピングされ、そこから廃液バルブ１７を介して廃液ライン１６にポンピングされる。
【００３５】
ｄ）サンプルをハイブリダイゼーションチャンバー５に供給するステップ。このために、バルブ１４および２１のみが開かれる。サンプルは、ピペットを用いて、カバー２６の試料供給部３１を介してハイブリダイゼーションチャンバー５に押し入れられる。従って、プレハイブリダイゼーション緩衝液の対応する容積部がハイブリダイゼーションチャンバー５から、開いたアウトレットバルブ１４を有するアウトレットライン１３に押しやられる。これは、順に、対応する容積部の空気を収集ライン１５から押しやる。この押しやられた空気は、開いたリリーフバルブ２１を通じてリリーフライン２０に流れ、収集容器２２に達し、通気用開口２３を介して収集容器２２を去る。ここで二度目に気泡がハイブリダイゼーションチャンバー５に共に搬送されてしまう可能性があるため、この手順は特別な注意を払う必要がある。
【００３６】
ｅ）ハイブリダイゼーションチャンバー５内における、およびスライド２７に固定化されたサンプルとの関係におけるハイブリダイゼーション媒質の均一な分配ステップ。このために、すべてのバルブが最初に閉じられる。次いで、既に説明されているようにしてチャンバー圧力が高められ、攪拌装置３２の操作が開始される。
この圧力を高めることにより、ハイブリダイゼーションチャンバー５内に存在している可能性のあるすべての気泡が排除される。
【００３７】
ｆ）サンプルを例えば１７時間ハイブリダイゼーションするステップ。ハイブリダイゼーションの間、ハイブリダイゼーションチャンバー５内における媒質は絶えず、または間欠的に攪拌されてよい。ここでハイブリダイゼーションチャンバー５内に気泡が自然発生的に生じる可能性があるため、この手順は特別な注意を払う必要がある。これを防止するため、チャンバー圧力は補正できるように適合化されてよく、ハイブリダイゼーションの間、個々のプログラムにより一定に保持され及び／又は変えられてよい。このようなプログラムは、このような特別な取り扱いを必要とするサンプルの慎重なハイブリダイゼーションを保証することができるように、特定の圧力および時間ステップにおけるチャンバー圧力の上昇および低下を定めてよい。
【００３８】
ｇ）ハイブリッド形成されたサンプルを緩衝液で洗浄するステップ。このために、最初に、アウトレットバルブ１４および廃液バルブ１７を開くことにより、チャンバー圧力が通常の圧力に調節される。次いで、洗浄液が、供給ポンプ８を用いて逐次的におよび必要に応じて、容器２から適切に開いたバルブ４を通じて分配ライン１０にポンピングされ、そこから開いたインレットバルブ１２およびインレットライン１１を介してハイブリダイゼーションチャンバー５内にポンピングされる。洗浄液および洗浄廃液は、アウトレットライン１３および既に開いているアウトレットバルブ１４を介してハイブリダイゼーションチャンバー５を去り、収集ライン１５で合わさり、開いた廃液バルブ１７を通じて廃液ライン１６に排除される。
【００３９】
ｈ）スライド２７上のハイブリッド形成されたサンプルを乾燥させるステップ。このために、バルブ１２、１４、および１７のみが開かれる。次いで、不活性ガスバルブ５０が開かれ、分配ライン１０、インレットライン１１、ハイブリダイゼーションチャンバー５、アウトレットライン１３、および収集ライン１５が、サンプルが乾燥するまで、開いた廃液バルブ１７および廃液ライン１６を介して不活性ガスでフラッシュされる。
この後、仕上げられたサンプルを取り出すことができる。
【００４０】
すぐ上で説明されているこの方法のステップｈ）に対する一つの代替的な手段として、ハイブリッド形成されたサンプルは、バルブ１２、１４、および２１のみを開くことにより、スライド２７上で乾燥される。次いで、不活性ガスバルブ５０が開かれ、分配ライン１０、インレットライン１１、ハイブリダイゼーションチャンバー５、アウトレットライン１３、および収集ライン１５が、サンプルが乾燥するまで、開いたリリーフバルブ２１、リリーフライン２０、収集容器２２、および通気用開口２３を介して不活性ガスでフラッシュされる。
【００４１】
攪拌装置３２の第二の膜３３’なしで済ませる、本発明によるこの方法の一つの代替的な実施態様も好適である。このためには、別の媒質がこのスプリングエレメントの機能を負わなければならない。これは、ハイブリダイゼーションにおいて役割を果たすすべてのサンプルおよび媒質をハイブリダイゼーションチャンバー５に注いだ後、すべてのバルブを閉じ（ステップａ〜ｄ参照）、次いで、アウトレットバルブ１３を再び開くことで達成される。従って、空気で満たされた収集ライン１５の容積部と廃液ライン１６の直接的に隣接した部分は、液体で満たされたハイブリダイゼーションチャンバー５の容積部と接続される。閉じられたバルブ１７、１９、および２１とハイブリダイゼーションチャンバー５内の試料液とで取り囲まれた空気は弾力的に圧縮可能であり、従って、望ましいスプリングエレメントを形成する。代替的に、ステップｃ）は不活性ガス（例えば、Ｎ２）を用いて果たすこともできる；このケースでは、気体の弾性エレメントＮ２とサンプルとの化学的な相互作用は除外することができる。
【００４２】
物理的な例示的実施形態
最初の一連の実験では、物理的な基礎を調べた。このために、数百個のスライドをサンプルなしで処理した。好適には、ネオプレン、シリコーン、旋盤加工ＰＴＦＥ、ポリエチレン、またはＶｉｔｏｎでできたＯ−リングシール２８はすべて液体損失を成功裏に防止した。基本的な要件は、勿論、カバー２６、Ｏ−リング２８、およびスライド２７の接触圧力が充分に大きいこと、即ち、発生されるチャンバー圧力よりも有意に高いことである。使用したハイブリダイゼーションチャンバー５は、カバー２６とスライド２７との間に２１×６５ｍｍの面積を含む。チャンバー圧力は、周囲の通常の圧力を１バールだけ、即ち、１０５Ｎ／ｍ２だけ上回って高められた。１３．６５ｃｍ２または１．３６５×１０−３ｍ２の実際の有効面積の場合には、ハイブリダイゼーションチャンバー５が自然に開いてしまわないように、１つのハイブリダイゼーションチャンバー５当たり１３６．５Ｎ及び／又は約１３．９ｋｐより大きな力を加えなければならない。ハイブリダイゼーションチャンバー５内における超過圧力に対応して選択された閉止力がカバー２６、シール２８、およびスライド２７に加えられるのであれば、他のタイプのシールおよびシーリング材料も充分に液漏れを防止するであろう。
【００４３】
疎水性表面を有するスライドを処理する過程で、標準的な装置ＳＮ２２では気泡がいつも観測されたが、本発明によるプロトタイプでは、この種の気泡が全く検出されなかった。
【００４４】
生物学的な例示的実施形態
高められた圧力下で本発明により実施されるハイブリダイゼーションの例を実行するため、２つのシステムを時間的に並行して相互に独立的に使用した。これらのシステムは、通常の圧力で操作された、本出願人の標準的な装置（Ｔｅｃａｎ  ＨＳ  ４００、シリアル番号２２；短縮してＳＮ２２と呼ぶ）と、０．８バールから１．０バールだけ高められたチャンバー圧力で操作された、本発明によるプロトタイプ（短縮してＰＴ３と呼ぶ）であった。両装置とも、上で更に詳細に説明されている通りの、相互に対応する攪拌機構を備えていた。ＳＮ２２の攪拌装置３２は約０．５バールの攪拌圧力を用いて操作され、ＰＴ３の場合には約１．５バールの攪拌圧力を用いた。両方の装置において、前もって精確な温度のメンテナンスをチェックした；両装置を（試験のための記されている相違点を除き）全く同一のパラメーター（例えば温度）を用いて操作した。この試験により、得られた結果からもたらされるべき原因を直接的に結論付けることが可能になった。
【００４５】
Ａｌｏｐｅｘ（ＡＬＯＰＥＸ  ＧｍｂＨ、Ｆｒｉｔｚ−Ｈｏｒｎｓｃｈｕｃｈ−Ｓｔｒ．９、Ｄ−９５３２６  Ｋｕｌｍｂａｃｈ、Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ  ｏｆ  Ｇｅｒｍａｎｙ）の技術的な指示に従ってハイブリダイゼーション手順（緩衝液の調製、試料の注入、使用されるハイブリダイゼーションシステムについてのプログラムの定義）を実施した。ハイブリダイゼーションシステムＳＮ２２およびＰＴ３のそれぞれに２つのスライド２７を挿入し、４３℃または６１℃で処理した。以下のプロセスサンプルの結果を検討した：
４３℃                     ４３℃
ＨＳ  ４００  ＳＮ２２  ＨＳ  ４００  ＰＴ３
スライド＃２９、＃３１  スライド＃２４、＃２７
６１℃                     ６１℃
ＨＳ  ４００  ＳＮ２２  ＨＳ  ４００  ＰＴ３
スライド＃３３、＃３４  スライド＃３５、＃３７
【００４６】
キットバッチ番号０４０５２４を有する、Ａｌｏｐｅｘから入手した試験キット「ＨｙｂＣｈｅｃｋ」を使用した。この試験キットは、ハイブリダイゼーションシステムをチェックするために使用され、ハイブリダイゼーション温度が予め定められ、もたらされた温度、ならびに洗浄、攪拌、および試行に関する関連試験パラメーターが正確に維持されている場合にのみ「ＯＫ」信号が出力されるように設計されている。ここでは、スライド２７上に固定化されたサンプルは、温度差に対する感度が既知のオリゴヌクレオチドであった。
【００４７】
各サンプルの運転で実行されたプログラムの詳細は以下のａ）〜ｈ）の通りであった：
ａ）製造業者の指示に従って「ＨｙｂＣｈｅｃｋ」洗浄緩衝液１および２を調製する；
ｂ）凍結乾燥された蛍光標識オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション用のハイブリダイゼーション温度（４３℃または６１℃）に予め加熱された２５０μｌのＨｙｂＣｈｅｃｋ緩衝液に溶解する；
ｃ）大きなハイブリダイゼーションチャンバー（６３．５ｍｍ×２０ｍｍ）を用い、２つのスライド（それぞれが６つのサブ−アレイを有する）をそれぞれのハイブリダイゼーションシステムの位置１および２に挿入する；
ｄ）ハイブリダイゼーションチャンバーを閉じ、ハイブリダイゼーションプログラムを開始する；
ｅ）ハイブリダイゼーションプログラム：
１．先ず、４３℃または６１℃で３０秒間洗浄する；
２．４３℃または６１℃におけるそれぞれのチャンバーに１０５μｌのオリゴヌクレオチド溶液を注入する；
３．４３℃または６１℃におけるハイブリダイゼーション；強力な攪拌を伴い、６０分間；
４．２３℃（チャンネル１）で３０秒間の洗浄ステップ１；３０秒間吸引；２回繰り返す；
５．２３℃（チャンネル２）で３０秒間の洗浄ステップ２；３０秒間吸引；２回繰り返す；
６．２３℃で３分間スライドを乾燥させる；
ｆ）ハイブリダイゼーションの終了後、両スライドを取り出し、レーザースキャナー（Ｔｅｃａｎ  ＬＳ４００）に挿入した；
ｇ）レーザースキャナーの測定条件設定：
１．スキャンモード：  単波長
２．レーザー波長：    ５４３ｎｍ（緑）
３．フィルター波長：  ５９０ｎｍ
４．ゲイン：          １６５
５．オートフォーカスモード：            ＨＳオートフォーカス、レベル１
６．スキャン分解能：  １０μｍ
７．ピンホール：    小
８．オーバーサンプリングファクター：        １
ｈ）レーザースキャナーでの測定後、得られた生データを以下の通りに分析した：
４３℃におけるハイブリダイゼーション：
１．１つのスライド（マイクロスライド）で６つのサブ−アレイ（６×９個のスポット）
２．４３℃におけるパーフェクトマッチ（ＰＭ）：１つのスライド当たり２４個のスポット（１つのサブ−アレイ当たり４個）
３．４３℃におけるミスマッチ１（ＭＭ１）：１つのスライド当たり２４個のスポット（１つのサブ−アレイ当たり４個）
４．４３℃におけるミスマッチ２（ＭＭ２）：１つのスライド当たり２４個のスポット（１つのサブ−アレイ当たり４個）
５．陰性対照：１つのスライド当たり３６個のスポット（１つのサブ−アレイ当たり６個）
６．１つのマイクロスライド当たりのすべてのＰＭｓおよびＭＭ１ｓ（２４個の別個な値）に対して算術平均、標準偏差、およびＣＶを算出した。このケースでは：ＣＶ＝（標準偏差／算術平均）×１００
７．識別値ＰＭ：ＭＭ１（１：５）および識別値ＰＭ：ＭＭ２（１：２０）を算出した。
８．ＣＶ値および識別値は、「ＯＫ」（一つのスライド全体でのＣＶ＜１８％の場合）または「不合格」と特定された。
６１℃におけるハイブリダイゼーション：
１．１つのスライド（マイクロスライド）で６つのサブ−アレイ（６×９個のスポット）
２．６１℃におけるパーフェクトマッチ（ＰＭ）：１つのスライド当たり２４個のスポット（１つのサブ−アレイ当たり４個）
３．６１℃におけるミスマッチ１（ＭＭ１）：１つのスライド当たり２４個のスポット（１つのサブ−アレイ当たり４個）
４．６１℃におけるミスマッチ２（ＭＭ２）：１つのスライド当たり２４個のスポット（１つのサブ−アレイ当たり４個）
５．陰性対照：１つのスライド当たり３６個のスポット（１つのサブ−アレイ当たり６個）
６．１つのマイクロスライド当たりのすべてのＰＭｓおよびＭＭ１ｓ（２４個の別個な値）に対して算術平均、標準偏差、およびＣＶを算出した。このケースでは：ＣＶ＝（標準偏差／算術平均）×１００
７．識別値ＰＭ：ＭＭ１（１：５）および識別値ＰＭ：ＭＭ２（１：２０）を算出した。
８．ＣＶ値および識別値は、「ＯＫ」（一つのスライド全体でのＣＶ＜１８％の場合）または「不合格」と特定された。
【００４８】
以下の結果が得られた：
４３℃／ＨＳ  ４００  ＳＮ２２
ＣＶパーフェクトマッチ  ＯＫ
ＣＶミスマッチ１  ＯＫ
識別パーフェクトマッチおよびミスマッチ１  ＯＫ
識別パーフェクトマッチおよびミスマッチ２  ＯＫ
スポットの質  ＯＫ
陰性対照  ＯＫ
勾配は観測されなかった。
４３℃／ＨＳ  ４００  ＰＴ３
ＣＶパーフェクトマッチ  ＯＫ
ＣＶミスマッチ１  ＯＫ
識別パーフェクトマッチおよびミスマッチ１  ＯＫ
識別パーフェクトマッチおよびミスマッチ２  ＯＫ
スポットの質  ＯＫ
陰性対照  ＯＫ
勾配は観測されなかった。
６１℃／ＨＳ  ４００  ＳＮ２２
ＣＶパーフェクトマッチ  ＯＫ
ＣＶミスマッチ１  ＯＫ
識別パーフェクトマッチおよびミスマッチ１  ＯＫ
識別パーフェクトマッチおよびミスマッチ２  ＯＫ
スポットの質  ＃３３不合格、＃３４ＯＫ
陰性対照  ＯＫ
勾配は観測されなかった。
６１℃／ＨＳ  ４００  ＰＴ３
ＣＶパーフェクトマッチ  ＯＫ
ＣＶミスマッチ１  ＯＫ
識別パーフェクトマッチおよびミスマッチ１  ＯＫ
識別パーフェクトマッチおよびミスマッチ２  ＯＫ
スポットの質  不合格
陰性対照  ＯＫ
勾配は観測されなかった。
【００４９】
示されている結果は、使用した２つの装置が非常に使用するのに適した結果をもたらすことを確証しているだけではない。むしろ、（温度により管理された）２つの装置ＳＮ２２およびＰＴ３で得られた結果は、ハイブリダイゼーションに及ぼす高められた圧力の影響を排除し得ることと非常に似通っている。
【００５０】
本発明による方法は、ハイブリダイゼーションチャンバーにおける使用に制限されるものではない。本方法は、望ましくない気泡の発生を防止すべく、他の装置でも適用及び／又は使用することができる。そのような装置または機器は、例えば「ラブ・オン・チップ」システムなどのマイクロフルイディクス技術の分野からもたらされ得る。
【００５１】
図６は、本発明による方法を実行することができる第二の装置及び／又はシステムの概略図を示している。このシステム１’は、各カバー２６に２つのハイブリダイゼーションチャンバー５Ａ、５Ｂが割り当てられている点において、図１に描かれているシステム１と本質的に異なっている。これら２つのハイブリダイゼーションチャンバー５Ａ、５Ｂは、例えば２つの全く同じＤＮＡマイクロアレイを担持した単一の試料担体またはスライド上に配置することができる。しかし、それぞれのスライドまたは試料担体がそれぞれのケースにおいてカバー２６と共に単一のハイブリダイゼーションチャンバー５を定めているにすぎないもっと小さな２つのスライドまたは試料担体２７を利用することもできる（図示せず）。
【００５２】
どのハイブリダイゼーションチャンバー５Ａ、５Ｂにも、個々のインレットバルブ１２Ａ、１２Ｂおよび個々のインレットライン１１Ａ、１１Ｂを介して、分配ライン１０により洗浄緩衝液またはハイブリダイゼーション媒質などの液体が供給される。従って、すべてのハイブリダイゼーションチャンバーは、選択的におよび自律的に使用することができ、即ち、相互に独立しているが、これらのハイブリダイゼーションチャンバーを共通に、即ち、同時に利用することもできる。
【００５３】
ハイブリダイゼーションチャンバー５Ａ、５Ｂの内部にあり、それぞれのケースにおけるカバーの下側に存在する液体を、スライド上に固定化されているサンプルに関して動かすことができるようにするため、この特に好適なシステム１’の各カバー２６は、好適には、膜３３を備えた一つの個別的な攪拌チャンバー３０を含んでいる。この攪拌チャンバー３０は攪拌ライン３６を介してそれぞれのケースにおけるハイブリダイゼーションチャンバー５Ａ、５Ｂと接続されており、膜３３が攪拌チャンバー３０を圧力チャンバー３４から分離している。これらの圧力チャンバー３４は、圧力ライン３５を介して圧力流体で満たされており、散発的に、例えば間欠的に攪拌圧力が充填される。図６では、ハイブリダイゼーションチャンバー５Ａ、５Ｂの膜３３のこの充填は、逐次的に、即ち、同期的に実施される。これは、超過圧力バルブ４３の下流側に位置する圧力分配ライン３９または圧力チャンバー３４に至る圧力ライン３５内に配置される付加的なバルブまたはモニタリングエレメントを伴うことなく構築することができるといった更にずっとシンプルな構造になるという利点を提供する。また、別々の圧力ライン３５（並行動作）を伴う各単一の膜３３に攪拌圧力を充填することも想定することができる（図示せず）。
【００５４】
一つのカバー２６のアウトレット１３Ａ、１３Ｂは同じカバーのアウトレットライン１３に口を開いており、アウトレットバルブ１４を介して収集ライン１５へ向けて導かれている。このシステム１’の一つの好適な実施形態によれば、アウトレットライン１３は拡大された直径を有しており、従って、スプリングエレメントとして機能するガスクッションがその場所を見出すスペースを提供する。このスプリングエレメントは、開いた流体ラインを介して直接的に、または（膜により分離された状態で）間接的に、ハイブリダイゼーションに使用される液体容積部と接続されている。このスプリングエレメントは、攪拌装置３２により発生され、（図１との関係で既に説明されているのと同様な仕方で）圧力チャンバー３４に作用する圧力差を弾力的に相殺する。このスプリングエレメントの作用があれば、ハイブリダイゼーションチャンバー５内の気泡を防止すべく圧力装置により構築されるチャンバー圧力を、どんな攪拌圧力差にも関係なく、環境の通常の大気圧以上に維持することができる。また、ハイブリダイゼーションチャンバー５の内部に存在する媒質で直接的に充填されている膜、または液体もしくはガスクッションでこれらの媒質から分離されている膜も、スプリングエレメントとして機能することができる。スプリングエレメントは、それが詳細にどのように構成されているかにかかわらず、チャンバー圧力を予め定められた時間にわたり、例えばハイブリダイゼーションプロセスの全期間にわたり、周囲の環境空気の大気圧を上回って高く、ハイブリダイゼーション媒質内に気泡が全く構築され得ないようなレベルに維持するため、好適には、弾力性があり、圧縮可能であり、または膨張可能であって、ハイブリダイゼーションチャンバー５の内部における攪拌圧力差を相殺することができるように構築される。
【００５５】
システム１（図１参照）に加え、次に説明する好適なシステム１’はパージライン６２を含み、このパージライン６２は、好適には、パージ用バルブ６３を介して、まさにアウトレット１３Ｂがアウトレットライン１３に口を開いている部位につながっている。
【００５６】
このパージライン６２は以下のようにして使用される：
先ず、各ハイブリダイゼーションチャンバー５Ａ、５Ｂに洗浄緩衝液を充填する。こうすることにより、インレットライン１１Ａ、１１Ｂならびにアウトレット１３Ａ、１３Ｂおよびアウトレットライン１３も洗浄緩衝液で満たされる。試料液をハイブリダイゼーションチャンバーにピペッティングした後、試料供給部３１およびインレットバルブ１２Ａ、１２Ｂを閉鎖する。アウトレットバルブ１４は開いたままにしておく。パージ用バルブ６３を開くやいなや、コンプレッサーまたは蓄圧機からもたらされるガスが個々のパージライン６４を介してアウトレットライン１３に入り、これらのアウトレットライン１３から洗浄緩衝液を駆逐する。このガスは、後に、アウトレットライン１３の内部に位置付けられたガスクッションを提供する。アウトレットライン１３の直径が大きく為されているため、このガスクッションは、スプリングエレメントとして効果的に機能するのに必要な容積を有している。攪拌中に生じる圧力ピークにより、アウトレットライン内の気体はこれに相応して圧縮され、攪拌圧力が解放されると跳ね戻る。このようにして、ハイブリダイゼーションチャンバーの内部にある媒質の好適な振り子運動が達成される。ここで説明されている実施形態の場合、このスプリングエレメントは攪拌装置の一部とみなすことができる。実際、第二の膜３３’の提供を取りやめることができる。しかし、アウトレットライン１３の断面積がスプリングエレメントを効果的であるようにするのに必要な全スペースを提供するには小さすぎるときには、補助的な第二の膜３３’（例えば、図１参照）を付加的に配列することができる。
【００５７】
図７は、下側から見た、一つのハイブリダイゼーションチャンバー５を伴うカバー２６の特殊な第一の配列の概略図を示している。図３で既に示されている実施形態との主な相違は、ここで示されているように、アウトレットライン１３が拡大された直径を有していることであり、これにより、スプリングエレメントとして機能するガスクッション用のスペースを提供することができる。このアウトレットライン１３の端部に近接して、ハイブリダイゼーションチャンバー５の個々のアウトレット１３’がアウトレットライン１３に口を開いている。同じ領域で、このハイブリダイゼーションチャンバー５専用の個々のパージライン６４がアウトレットライン１３に口を開いている。それぞれのケースにおけるすべての媒質ラインは、それぞれ、カバー２６の共用接続平面５７内にある接続用開口または排出用開口を含んでいる。これらの開口は、好適には、一列に整列している；しかし、これらの開口は任意に配列されてもよい。すべての他の部分は図３の実施形態と同様である。この実施形態では、第二の攪拌チャンバー３０’を密封する第二の膜３３’が設けられる。この第二の膜３３’は、アウトレットライン１３に位置付けられるガスクッションとして具体化されるスプリングエレメントに対する支持体として機能する。このケースでは、第二の攪拌チャンバー３０’は密封された空間として成し遂げられ、膜３３’により再度圧縮および膨張され得るガスクッションを含む。アウトレットライン１３が充分に大きなガスクッションを提供する場合には、システム１’は第二の膜３３’およびこの第二の攪拌チャンバー３０’を伴うことなく成し遂げることができる（図８を比較参照のこと）。
【００５８】
図８は、下側から見た、２つのハイブリダイゼーションチャンバー５Ａ、５Ｂを伴うカバー２６の特殊な第二の配列の概略図を示している。図７に示されている実施形態と同様に、このカバー２６も、拡大された直径を有するアウトレットライン１３を含んでおり、これにより、スプリングエレメントとして機能するガスクッション用のスペースが提供される。このケースでは、スプリングエレメントの効果的な働きを保証するため、この中空スペースは充分に大きく為されている。このため、互いに裏側に位置する２つのハイブリダイゼーションチャンバー５Ａ、５Ｂは、第二の膜３３’または第二の攪拌チャンバー３０’を含んでいない。２つの個別的なアウトレット１３Ａ、１３Ｂはアウトレットライン１３に口を開いており、一方のマウスピースはアウトレットライン１３の端部付近に位置付けられ、もう一方のマウスピースはアウトレットライン１３の中央領域のどこかに位置付けられている。ハイブリダイゼーションチャンバー内の液体の攪拌は共用の攪拌ライン３５を介して実行される。
【００５９】
一つの代替的手段として、ハイブリダイゼーションチャンバー５Ａ、５Ｂの各攪拌チャンバー３０が個々の攪拌ライン（図示せず）を備えていてもよい。この代替的な実施形態では、カバー２６の内部の圧力ライン３５は、個々の圧力ラインを接続するために一つの共通のアクセスポートのみが共用アクセス平面５７上に必要となるように、分岐させることができるであろう。しかし、２つのハイブリダイゼーションチャンバー５Ａ、５Ｂが一つの個別的な独立した攪拌装置３２を備えていることも想定することができる。これは、付加的な圧力ライン４２’および圧力分配ライン３９’を伴い、更には共用アクセス平面５７における付加的なアクセスポートを介して満たされ得る個別的な攪拌ライン３５’を伴う各ハイブリダイゼーションチャンバー５Ａ、５Ｂで実現することができるであろう。
【００６０】
説明されている種々の実施形態に類似して、１つのカバー２６につき２つより多く、例えば３つのハイブリダイゼーションチャンバー５を配列することもできる。１つのカバー２６当たりのハイブリダイゼーションチャンバー５の個数は、その際に必要となるインレットおよびアウトレットライン、シール、ならびに攪拌装置の実現可能性によってのみ制限される。このようなケースでは、単一の試料担体またはスライド２７は、一つのセグメント化されたカバー２６（例えば、図８参照）を用いて、１つのカバー２６当たり、および１つの試料担体またはスライド２７当たり多数のハイブリダイゼーションチャンバー５を操作することができる可能性を提供するため、好適には各々がヌクレオチドアレイを備えた幾つかの領域を含むことができる。しかし、１つのカバー２６当たり多数のハイブリダイゼーションチャンバー５を幾つかの比較的小さな試料担体またはスライド２７で操作することができるように、単一の比較的小さなハイブリダイゼーションチャンバー５を規定するにすぎない比較的小さな試料担体またはスライド２７’を配置することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明による方法を実施することができる第一の装置及び／又はシステムの概略図を示している。
【図２】ＥＰ第１  ２６０  ２６５  Ａ１号の図１に相当するハイブリダイゼーションチャンバーを有するシステムを通る垂直縦方向断面図を示している。
【図３】図２に対応する、下側から見た、ハイブリダイゼーションチャンバーを有するシステムの概略図を示している。
【図４】本システムのカバーが折り上げられた状態の、図２に対応する、ハイブリダイゼーションチャンバーを有するシステムを通る垂直縦方向断面図を示している。
【図５】本システムのカバーが閉じられた状態の、図２に対応する、ハイブリダイゼーションチャンバーを有するシステムを通る垂直縦方向断面図を示している。
【図６】本発明による方法を実施することができる第二の装置及び／又はシステムの概略図を示している。
【図７】下側から見た、一つのハイブリダイゼーションチャンバーを伴うカバーの特殊な第一の配列の概略図を示している。
【図８】下側から見た、二つのハイブリダイゼーションチャンバーを伴うカバーの特殊な第二の配列の概略図を示している。
【符号の説明】
【００６２】
１  システム、    ５  ハイブリダイゼーションチャンバー、    ２６  カバー、    ２７  スライド、    ３２  攪拌装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【外国語明細書】
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