(57)【要約】【課題】生物学的粒子をソーティングする装置において、シースフローを一定位置に安定して形成することにより、粒子のソーティングの精度を向上する。【解決手段】生物学的粒子を含む液体のフローに光を当て、該生物学的粒子からの光を検出して、該生物学的粒子の生物学的情報を取得し、取得した生物学的情報に基づいて生物学的粒子をソーティングする装置であって、  上記生物学的粒子からの光を検出する光検出部と、  上記フローに振動を与える振動発生器と、  上記フローとこのフローから分離した液滴を撮像する固定撮影部と、  上記撮影部で撮影された画像を利用して、ブレークオフポイントとこれに最も近い液滴との間に形成された、液滴より小さいサテライトドロップの大きさを検出する手段と、  上記サテライトドロップの大きさに応じて上記振動発生器の振動の大きさを制御する手段を備える。【選択図】図８
2006292769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的粒子を含む液体のフローに光を当て、該生物学的粒子からの光を検出して、該生物学的粒子の生物学的情報を取得し、取得した生物学的情報に基づいて生物学的粒子をソーティングする装置であって、
上記生物学的粒子からの光を検出する光検出部と、
上記フローに振動を与える振動発生器と、
上記フローとこのフローから分離した液滴を撮像する固定撮影部と、
上記撮影部で撮影された画像を利用して、ブレークオフポイントとこれに最も近い液滴との間に形成された、液滴より小さいサテライトドロップの大きさを検出する手段と、
上記サテライトドロップの大きさに応じて上記振動発生器の振動の大きさを制御する手段を備えたことを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であって、
上記検出手段は、サテライトドロップのフロー方向に沿った長さを検出することを特徴とする装置。
【請求項３】
生物学的粒子を含む液体のフローに光を当て、該生物学的粒子からの光を検出して、該生物学的粒子の生物学的情報を取得し、取得した生物学的情報に基づいて生物学的粒子をソーティングする方法であって、
上記生物学的粒子からの光を検出する工程と、
上記フローに振動を与える工程と、
上記フローとこのフローから分離した液滴を撮像する工程と、
上記撮影された画像を利用して、ブレークオフポイントとこれに最も近い液滴との間に形成された、液滴より小さいサテライトドロップの大きさを検出する工程と、
上記サテライトドロップの大きさに応じて上記振動の大きさを制御する工程を備えたことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的粒子（例えば、細胞、染色体）の生物学的情報を取得すると共に取得した生物学的情報に基づいて粒子をソーティングする装置と方法に関する。特に、本発明は、蛍光色素などを用いて染色された細胞や染色体を層流状態で流し、その流れにレーザ光などの光を照射して得られる情報光（散乱光、蛍光）を検出し、検出された情報光に含まれる光学的情報を電気信号に変換して細胞や染色体の生物学的情報を取得し、さらに必要であればその生物学的情報をもとに特定の細胞や染色体の集団を採取するフローサイトメータまたはセルソータに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジーの発展に伴い、医学や生物学などの分野では、細胞や染色体など（以下「細胞」という。）の自動分析および分別を行う流動式細胞分析装置（フローサイトメータ）が用いられている。この流動式細胞分析装置は、分析対象である細胞粒子を、細胞整列手段である流路内で一列にして流し、この流れてくる粒子にレーザ光を照射し、粒子より生じる情報光（前方散乱光、蛍光・側方散乱光）を検出して電気信号に変換し、これらの電気信号に基づいて細胞を分析するものであり、多数の細胞を高速で分析し、必要であれば特定の細胞の集団を採取できるものである。
【０００３】
図１６は一般的なフローサイトメータの構成と、その作動を説明するための模式図である。この図に示すフローサイトメータ２００では、容器中にあって細胞を含む懸濁液２０１は、別の容器中にあるシース液２０２とともに、エアーポンプ２０３によって漏斗状のフローチャンバ（ノズル）２０４に導かれる。フローチャンバ２０４の内部では、シース液２０２が懸濁液２０１を円筒状に包み込む層流、すなわち細胞をフローセルの中心軸に沿って一つ一つ正確に流すシースフローが形成される。フローチャンバ２０４の下部ではシースフローの高速流が形成され、そこにレーザ光源２０５から出射されて集束レンズ２０６によって絞り込まれたレーザ光２０７が照射される。懸濁液２０１に含まれる細胞は、多くの場合、蛍光染料や蛍光ラブルモノクロナール抗体などの蛍光物質で蛍光標識されている。したがって、細胞がレーザ光２０７中を経過するとき、散乱光と蛍光が発生する。
【０００４】
散乱光は、集光レンズ２０８とビームブロック２０９からなる集光光学系を経て、例えばフォトダイオードなどの検出器２１０で検出される。一方、蛍光については、赤色蛍光が集光レンズ２１１、ハーフミラー２１２、集光レンズ２１３、フィルタ２１４からなる集光光学系で集められ、光検出器２１５で検出され、また緑色蛍光はハーフミラー２１２から集光レンズ２１６、フィルタ２１７で集められ、光検出器２１８で検出される。通常、蛍光の検出器２１５、２１８には、微弱光の検出が可能な光電子増倍管が用いられる。散乱光を検出する検出器２１０、赤色蛍光を検出する光検出器２１５および緑色蛍光を検出する光検出器２１８からの信号は、それぞれ信号処理回路２１９に送られ、ここで散乱光と蛍光の強度を分析することにより細胞の同定が行われる。
【０００５】
図１７に示すように、信号処理回路２１９の同定結果は、荷電部２２０に送信される。荷電部２２０は、同定された細胞がシースフロー下端のブレークオフポイント２２１に到達し、同定された細胞を含む液滴が形成される直前に、すなわちシースフロー下端のブレークオフポイント２２１に到達して液滴となる直前に、同定結果に基づいて懸濁液２０１とシース液２０２に所定の極性の電荷を印加する。その結果、ブレークオフポイント２２１でシースフローから分離した液滴は、所定の極性の電荷が与えられている。荷電された液滴は、ブレークオフポイント２２１の下方に配置されるとともに異なる極性の電圧が印加されている一対の電極２２２，２２３の間でそれらの一方に電気的に吸引されて偏向し、電極２２２，２２３の下方にそれぞれ配置されている捕集管２２４又は２２５にソーティングされる。（例えば、特許文献１〜４参照）
【０００６】
【特許文献１】特開昭５９−６４３号公報
【特許文献２】特開昭５９−１８４８６２号公報
【特許文献３】特開昭６０−１９５４３６号公報
【特許文献４】特表平３−５０３８０８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、フローサイトメータでは、検出される細胞の高さ（レベル）（検出位置）と、検出された細胞に電荷が付与される高さ（レベル）（荷電位置）が異なる。そのため、フローサイトメータを稼動する前に、これら検出位置から荷電位置までの距離を正確に測定し、これを装置の固有値として入力する必要がある。ところが、適正な荷電位置は液体（懸濁液とシース液）の粘度や温度、及びジェットノズルの状態によって変動し、それによりソーティングの精度が低下するという問題があった。また、検出位置から荷電位置までの距離を計測するためにカメラを設置し、このカメラを上下して検出位置から荷電位置までの距離を計測することは可能であるが、それにはカメラを昇降する機構が必要であるし、その方法事態は極めて煩雑な作業である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明によれば、生物学的粒子を含む液体のフローに光を当て、該生物学的粒子からの光を検出して、該生物学的粒子の生物学的情報を取得し、取得した生物学的情報に基づいて生物学的粒子をソーティングする装置であって、
上記生物学的粒子からの光を検出する光検出部と、
上記フローに振動を与える振動発生器と、
上記フローとこのフローから分離した液滴を撮像する固定撮影部と、
上記撮影部で撮影された画像を利用して、ブレークオフポイントとこれに最も近い液滴との間に形成された、液滴より小さいサテライトドロップの大きさを検出する手段と、
上記サテライトドロップの大きさに応じて上記振動発生器の振動の大きさを制御する手段を備えた装置を提供することができる。
【０００９】
本発明の装置において、上記検出手段は、サテライトドロップのフロー方向に沿った長さを検出する。
【００１０】
また、本発明によれば、生物学的粒子を含む液体のフローに光を当て、該生物学的粒子からの光を検出して、該生物学的粒子の生物学的情報を取得し、取得した生物学的情報に基づいて生物学的粒子をソーティングする方法であって、
上記生物学的粒子からの光を検出する工程と、
上記フローに振動を与える工程と、
上記フローとこのフローから分離した液滴を撮像する工程と、
上記撮影された画像を利用して、ブレークオフポイントとこれに最も近い液滴との間に形成された、液滴より小さいサテライトドロップの大きさを検出する工程と、
上記サテライトドロップの大きさに応じて上記振動の大きさを制御する工程を備えた方法を提供することができる。
【発明の効果】
【００１１】
このような構成を備えた装置と方法によれば、シースフローを一定位置に安定して形成することができる。そのため、粒子を正確にソーティングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図面を参照して本発明に係る生物学的粒子の情報を得る装置の実施形態であるフローサイトメータを説明する。
【００１３】
（１）光学的要素：
図１は、フローサイトメータの光学的要素を示す。この図に示すように、フローサイトメータ１は、蛍光染料及び蛍光抗体で染色された生物学的粒子（細胞または染色体）を含む液体（通常、細胞を含む懸濁液とシース液とからなる。）が流れる細い流路を形成する流路ブロック（流路形成部）２（図２参照）を有する。流路ブロック２に形成されている流路３の中を流れるシースフロー（流れ）４に光を照射する照明部５は、複数の励起光源を備えている。これら複数の光源には、異なる波長のレーザ光を発生するレーザ発生器が好適に利用される。例えば、本実施の形態では、３つの励起光源を備えており、第１の光源として波長４８８ｎｍの第１のレーザ光（アルゴンレーザ）を発生する第１のレーザ発生器６Ａが使用され、第２の光源には波長６３５ｎｍの第２のレーザ光（ヘリウムネオンレーザ）を発生する第２のレーザ発生器６Ｂが使用され、第３の光源として波長３７５ｎｍの第３のレーザ光（紫外線レーザ）を発生する第３のレーザ発生器６Ｃが使用されている。
【００１４】
照明部５はまた、第１〜第３のレーザ発生器６Ａ〜６Ｃから出射された第１〜第３のレーザ光８Ａ〜８Ｃをシースフロー４に導光するために光ファイバ９Ａ〜９Ｃ、ビームエキスパンダ１０Ａ〜１０Ｃを備えており、レーザ発生器６Ａ〜６Ｃから出射されたレーザ光は光ファイバ９Ａ〜９Ｃを介してビームエキスパンダ１０Ａ〜１０Ｃで調整された後、２つの反射／透過ミラー１１Ｂ，１１Ｃを介して合成され、一つの集光レンズ１２でシースフロー４に集光される。
【００１５】
流路ブロック２の反対側には、流路ブロック２内の流路を流れる粒子に照射された光の前方散乱光（情報光）を検出する第１の検出装置２１が配置されている。この第１の検出装置２１は、図１６を参照して説明した従来のフローサイトメータと同様に、集光レンズ２２、光検出器２３を備えており、細胞からの前方散乱光を集光レンズ２２で光検出器２３に集光するようにしてある。光検出器２３は信号処理部２４に接続されており、光検出器２３で検出された情報が信号処理部２４に送信されて処理されるようにしてある。信号処理部２４における信号処理は後に説明する。一方、細胞の蛍光・側方散乱光（情報光）を検出する第２の検出装置２５は、第１のレーザ光８Ａ〜第３のレーザ光８Ｃの蛍光・側方散乱光をそれぞれ検出する第１の光ファイバ２６Ａ〜第３の光ファイバ２６Ｃを備えており、これら第１〜第３の光ファイバ２６Ａ〜２６Ｃの一端が第１〜第３のレーザ光８Ａ〜８Ｃの集光高さに対応する位置にそれぞれ固定されている（図４参照）。第１〜第３の光ファイバ２６Ａ〜２６Ｃの他端は、それぞれファイバコネクタ２７Ａ〜２７Ｃを介して第１〜第３の分光器２８Ａ〜２８Ｃにそれぞれ光接続されている。
【００１６】
第１〜第３の分光器２８Ａ〜２８Ｃは、第１〜第３の光ファイバ２６Ａ〜２６Ｃから出力された光を分光する一つ又は複数の分光フィルタ（ハーフミラー）３０Ａ〜３０Ｃを備えている。これら複数の分光フィルタ３０Ａ〜３０Ｃは、予め決められたそれぞれの周波数領域の波長を反射・透過する性能を備えている。また、光の進行方向に関して分光フィルタ３０Ａ〜３０Ｃの下流側には、各分光フィルタで反射された光の中から特定の波長域の光だけを選択的に透過するバンドパスフィルタ３１Ａ〜３１Ｃが配置されている。さらに、光の進行方向に関して複数のバンドパスフィルタ３１Ａ〜３１Ｃの下流側には各バンドパスフィルタを透過した情報光（側方散乱光と所定の蛍光色素に対応した蛍光）を検出するために複数の光検出器３２Ａ〜３２Ｃ（ＳＳＣ，ＦＬ１〜ＦＬ８）が設けてある。
【００１７】
このように構成されたフローサイトメータ１によれば、第１〜第３のレーザ発生器６Ａ〜６Ｃで生成された第１〜第３のレーザ光８Ａ〜８Ｃは、光ファイバ９Ａ〜９Ｃ、ビームエキスパンダ１０Ａ〜１０Ｃ、集光レンズ１２を介して、流路ブロック２の流路３内を流れるシースフロー４によって導光されて粒子に集光される。このとき、レーザ光８Ａ〜８Ｃは異なる波長を有することから、図示するように一つの集光レンズ１２で集光する場合、波長差に起因する軸上色収差を生じる。そこで、実施の形態では、この波長差に起因する軸上色収差を消去するため、第１〜第３のレーザ光８Ａ〜８Ｃの波長に対応して、それぞれビームエキスパンダ１０Ａ〜１０Ｃで、本来平行光であるべきレーザ光８Ａ〜８Ｃを僅かに非平行光に調整し、調整したレーザ光を集光レンズ１２によって目的の場所に集光するようにしている。
【００１８】
シースフロー４によって搬送される生物学的粒子は、予め決められた複数の蛍光色素または蛍光抗体によって染色されている。そして、入射光の前方に散乱した前方散乱光が第１の検出装置２１の集光レンズ２２によって集光されて光検出器２３に入射され、この光検出器２３によって前方散乱光に含まれる光情報が読み取られて対応する電気信号に変換される。第１のレーザ光８が照射された粒子から出た側方散乱光と蛍光は入射光の側方に配置された第２の検出装置２５の第１〜第３の光ファイバ２６Ａ〜２６Ｃによってそれぞれ受光される。光ファイバ２６Ａ〜２６Ｃに受光された光はファイバコネクタ２７Ａ〜２７Ｃを介して第１〜第３の分光器２５Ａ〜２５Ｃに送られ、そこで分光フィルタ３０Ａ〜３０Ｃによって複数の光に分解された後、バンドパスフィルタ３１Ａ〜３１Ｃを介して光検出器３２Ａ〜３２Ｃによって検出される。各光検出器３２Ａ〜３２Ｃ（ＳＳＣ，ＦＬ１〜ＦＬ８）は、バンドパスフィルタ３１Ａ〜３１Ｃを通過した異なる波長域の光だけを検出する。以上のようにして光検出器３２Ａ〜３２Ｃに検出された光は、その光に含まれる情報に対応した電気信号に変換された後、信号処理部２４に送信されて処理され、処理後の信号が粒子の生物学的性質の同定や後に説明するソーティング処理に利用される。
【００１９】
（２）流体力学的要素：
フローサイトメータの流体力学的要素を説明する。図２は、フローサイトメータ１の層流形成容器４０と該容器４０の下端部に連結された流路ブロック２を模式的に表した図である。この図に示すように、容器４０は、概略、上部の大径筒部４１と、下部の小径筒部４２と、これらの大径筒部４１と小径筒部４２を連結するテーパ部４３を同心的に備えており、内部に層流形成室４４を形成している。容器４０の上端部は、シース液供給部４５に接続されている。容器４０の天井部には容器４０の中心軸に沿って伸びる鞘管４７が固定されており、生物学的粒子（細胞又は染色体）を含む液体を供給する供給部４８に接続された供給管４９が鞘管４７に挿入されている。鞘管４７の内径と供給管４９の外径は、鞘管４７に対して供給管４９が上下に移動できるとともに鞘管４７に対して供給管４９が若干角度調整できるように決められている。そのため、鞘管４７と供給管４９との間には隙間が存在するが、この隙間はゴム製のＯリング等の適宜シール部材（図示せず）によってシールされている。
【００２０】
容器４０の下端部に連結された流路ブロック２は、光を透過できる材料、例えば水晶、ガラス、溶融シリカまたは透明プラスティックからなる群から選択された材料で作られており、容器中心軸と同軸上に細い流路３が形成されている。図３に示すように、流路３は長方形の断面を有し、長手方向の壁面５５，５６をＸ方向に向け、短手方向の壁面５７，５８をＹ方向に向け、一方の短手方向壁面５７から第１〜第３のレーザ光８Ａ〜８Ｃが入射され、前方散乱光５９が対向する他方の短手方向壁面５８から出射するとともに一方の長手方向壁面５６から蛍光・側方散乱光６０が出射するように配置される。
【００２１】
流路ブロック２はまた、図３と図４に拡大して示すように、蛍光・側方散乱光を検出する第１〜第３の光ファイバ２６Ａ〜２６Ｃを保持している。これらの光ファイバ２６Ａ〜６Ｃは、通常の光ファイバと同様に、光を導光するコアと、コアの周囲を被覆するクラッドからなる。これら第１〜第３の光ファイバ２６Ａ〜２６Ｃの一端面６１Ａ〜６１Ｃは、それらの中心軸と直交する方向に加工されており、流路３の長手方向壁面５６と所定の距離をあけて、容器中心軸と直交する水平方向（Ｙ方向）に向けて配置されている。
【００２２】
図２と図４を参照すると、流路ブロック２は、下端オリフィス７４から吐出される液体をそれぞれが細胞を含む液滴に分離するために、上下方向又は半径方向に振動を与える振動発生器８９を保持している。振動発生器８９は、小径筒部４２の周囲に対称に複数配置するのが好ましい。また、振動発生器８９には、ピエゾ素子（ＰＺＴ）を用いるのが好ましい。
【００２３】
図４に示すように、フローサイトメータ１はまた、特定の粒子集団を採取するソーティング装置９０を備えている。このソーティング装置９０は、電荷注入回路９１と、電極駆動回路（電源回路）９２を有する。電荷注入回路９１は、オリフィス７４から噴射される液体に接触する注入電極９３に接続されている。また、電極駆動回路９２は、オリフィス７４の下方に該オリフィス７４から噴射される液体の両側に配置された一対の導電性電極板（偏向板）９４，９５に接続されている。なお、注入電極９３の設置場所は限定的ではなく、流路ブロック２内の流路を流れる液体と接触することができればよい。
【００２４】
（３）基本動作：
このような構成を備えたフローサイトメータ１によれば、図２に示すように、シース液供給部４５から供給されたシース液は容器４０の内部を下方に向けて移動する。単位時間当たりのシース液の供給量は、容器４０の内部をシース液が容器中心軸を中心として層流状態で移動するように決定する。一方、供給部４８から供給された懸濁液は、供給管４９を介して、層流状態で流れるシース液の中心に供給される。これにより、シース液が懸濁液の周囲を囲む円筒状の層流、すなわち粒子を容器４０の中心軸に沿って一つ一つ正確に流すシースフローが形成される。次に、懸濁液とシース液は、容器４０のテーパ部４３で加速された後、小径筒部４２に送られた後、流路ブロック２に入ってテーパ流路３で再び加速されて流路３に入る。
【００２５】
図３に示すように、流路３を通過する粒子は第１〜第３のレーザ光８Ａ〜８Ｃが照射されることにより、前方散乱光と蛍光・側方散乱光を生じる。前方散乱光５９は、第１〜第３のレーザ光８Ａ〜８Ｃの延長上にある壁面５８から流路ブロック２の外部に出て、第１の検出装置２１で検出される。他方、第１〜第３のレーザ光８Ａ〜８Ｃによる蛍光・側方散乱光６０は第１〜第３の光ファイバ２６Ａ〜２６Ｃにそれぞれ集光され、第２の検出装置２５で検出される。
【００２６】
図４に示すように、流路３を通過したシース液は、オリフィス７４からジェット噴射される。噴射されたシース液は、振動発生器８９から容器４０の小径筒部４２に加えられた振動によって、それぞれに粒子を収容した液滴となる。特に、本実施の形態では、振動発生器８９が容器４０の小径筒部４２に設けてあるので、振動発生器８９が発生した振動が効率良く層流混合液に伝達され、良好に液滴９６に分離される。
【００２７】
オリフィス７４から噴射されるシース液に含まれる液滴は、電荷注入回路９１から注入電極９３に印加される電圧の正極性又は負極性に荷電される。電極に印加する電圧の極性は、信号処理部２４で検出された粒子の生物学的性質に基づいて決定される。荷電された液滴９６は、電極板９４ａ，９５ａの間を通過する際に偏向され、特定の粒子だけが採取される。
【００２８】
（４）制御回路：
図５は、信号処理部２４とソーティング装置９０の回路構成を示す。図示するように、信号処理部２４は複数のアンプ１０１を備えており、第１の検出部２１と第２の検出部２５の光検出器から出力された信号（前方散乱光、側方散乱光、蛍光に対応する信号）がそれぞれ増幅される。増幅された信号は、Ａ／Ｄ変換器１０２でアナログ信号からデジタル信号に変換された後、メモリ１０３に送信されて記憶される。
【００２９】
上述のように、第２の検出部における３つの光ファイバ２６Ａ〜２６Ｃは、流路３の流れの方向に関して異なる位置に配置されている。したがって、一つの粒子から出た蛍光・散乱光を下流側の光ファイバで検出する時刻は、同一の粒子から出た蛍光・散乱光を上流側の光ファイバで検出する時刻よりも所定時間遅れる。その結果、一つの粒子について、各光ファイバからアンプ１０１に信号が入力される時間に所定時間の差を生じる。そのため、本実施形態ではアンプ１０１がタイミング制御部１０４に接続されており、上記所定の時間遅れを考慮したタイミングをもってタイミング制御部１０４から送信される信号に基づき、一つの粒子に関連した信号が複数のアンプ１０１から同時に出力される。また、メモリ１０３から出力されたデジタル信号はコンペンセーション回路１０５、増幅回路１０６で処理された後、ソーティング装置９０に出力されて上述した液滴（粒子）のソーティング処理に利用される。また、信号処理回路２４から出力される信号は、ソーティング装置９０に出力されて液滴制御及びソーティング制御に利用される。
【００３０】
ソーティング装置９０は、液滴制御部１１０と荷電制御部１２０を有し、これら液滴制御部１１０と荷電制御部１２０は信号処理部２４に接続されている。
【００３１】
ソーティング装置９０は、オリフィス７４から噴射される液体の流れ（シースフロー１１１）の下端部及びその周辺領域を撮影する固定カメラ（撮影部）１１２に接続されている。シースフロー１１０を挟んで固定カメラ１１２の反対側には、シースフロー１１１に向けて所定の周期で光を発するストロボ１１３が固定されている。
【００３２】
カメラ１１２の出力は、カメラ１１２の映像信号をデジタル処理するビデオデジタイザ（ビデオキャプチャ）１１４に接続されており、カメラ１１２で撮影された画像（映像信号）がビデオデジタイザ１１４でデジタル信号に変換される。ビデオデジタイザ１１４は、液滴制御部１１０に内蔵されている記憶部１１６に接続されており、カメラ１１２で撮影された画像が映像情報として記憶部１１６に記憶される。記憶部１１６と共に液滴制御部１１０に内蔵されている中央制御部１１７は記憶部１１６に接続されており、記憶部１１６に記憶されている映像情報をもとに以下に説明する処理を行う。中央制御部１１７は、振動発生器駆動部１１８とストロボ駆動部１１９に接続されており、振動発生器８９とストロボ１１３の駆動を制御する。中央制御部１１７は、粒子が検出位置を通過した時点から、粒子が液滴に含まれた状態でシースフロー１１１から分離する直前までの時間（遅延時間）を制御するドロップディレイ制御部１２１に接続され、さらにドロップディレイ制御部１２１が電荷注入回路９１に接続されている。
【００３３】
ストロボ１１３の発光周期ｔは、振動発生器８９に印加する信号の周期、すなわち振動発生器８９の振動周期と同一に固定されており、この周期ｔと液滴が形成される周期は完全に一致している。したがって、固定カメラ１１２で撮影されるシースフロー１１１は、図６に示す一定の形を有する。
【００３４】
ところで、シースフロー１１１の流速ｖは、次の式（１）で与えられる。
2006292769.tif 000003
Ｌ：レーザ集光位置（検出位置）ＬＩＰ（Laser Intercept Point）からシースフローの下端位置（ブレークオフポイント）ＢＰ（Breakoff Point）までの距離
Ｔ：粒子が検出位置ＬＩＰから下端位置ＢＰまで移動する時間
【００３５】
また、粒子の移動速度（液滴の落下速度）は、ストロボ１１３の発光周期を用いて、次の式（２）で表すことができる。
2006292769.tif 000004
λ：液滴の間隔
ｔ：ストロボの発光周期
【００３６】
式（１）、（２）より、次の式（３）が導かれる。
2006292769.tif 000005
【００３７】
また、式（３）は、次の式（４）に変形できる。
2006292769.tif 000006
【００３８】
式（４）における（Ｔ/ｔ）は、粒子が検出位置ＬＩＰからブレークオフポイントＢＰまで移動する時間（Ｔ）をストロボ発光周期（ｔ）で割ったもので、検出位置ＬＩＰからブレークオフポイントＢＰまでの間に存在し得る粒子の数に対応しており、以下の説明では必要に応じて「ドロップディレイＤＤ」という。ただし、ドロップディレイＤＤは、整数ではなく、小数点以下の値を含み得る数である。したがって、ドロップディレイＤＤを用いると、式（４）は次の式（５）に変形できる。
2006292769.tif 000007
【００３９】
図６は、カメラ１１２の撮影領域を併せて示しており、四角の枠１３０で囲まれた領域１３１が撮影された画像である。上述のように、振動発生器８９の発振周波数とストロボ１１３の発光周波数は完全に一致しているため、カメラ１１２で撮影されたシースフロー及び該シースフローから分離した液滴の画像は、他の原因（例えば、振動発生器８９に印加するパルスの電圧）が変化しない限り、図示する状態に留まる。また、図示するように、カメラ１１２で撮影されるのはブレークオフポイントＢＰを含むシースフロー１１１の一部であり、後に説明する画像処理で所定の分解能を得るために、検出位置ＬＩＰは含めない。
【００４０】
ブレークオフポイントＢＰから撮影画像上端１３２までの距離ＬＢは、例えば、シースフロー１１１に沿ってその近傍に適当なスケール又はこれに代わる基準寸法物を配置し、撮影された画像の大きさ（画素数）と対比することにより計測することができる。
【００４１】
画像上端１３２から検出位置ＬＩＰまでの距離ＬＢ０は、以下に説明する計算過程１〜３に基づいて計算することができる。これらの計算過程は、中央制御部１１７で自動的に行われる。
【００４２】
計算過程１：
計算過程１は、粒子が検出位置ＬＩＰからブレークオフポイントＢＰまで移動する時間Ｔを計算する過程である。この計算過程１では、粒子間隔を十分あけた状態で粒子を流し、遅延時間Δｔ’を変化させながら、注入電極９３に所定の極性（正極性又は負極性）の電荷を注入し、目的の方向に偏向した粒子の数をカウントする。目的の方向に偏向する粒子の数が最も多い状態は遅延時間Δｔ’が移動時間Ｔに一致した状態であり、その状態から電荷注入タイミングがずれると液滴及び粒子に電荷が適正に注入されず、目的の方向に偏向されない。したがって、遅延時間Δｔ’を変化すると、ガウス分布状態の時間遅れ（Δｔ’）−粒子数（カウントされた粒子数）特性（図示せず）が得られ、ガウス分布のピークに対応する時間遅れΔｔ’(peak)が移動時間Ｔに相当し、中央制御部１１７は時間遅れΔｔ’(peak)を計算し、これを移動時間Ｔとして記憶部１１６に記憶させる。
【００４３】
計算過程２：
計算過程２は、検出位置ＬＩＰからブレークオフポイントＢＰの間に存在し得る又は存在する複数の粒子の粒子間平均距離（これは、液滴の間隔に相当する。）λを計算する過程である。図６を参照すると、シースフロー１１１から形成される液滴１３３に対応して、シースフロー１１１には一定の間隔をあけて大径部分と小径部分が交互に形成されており、粒子間距離がシースフローにおける大径部分（又は小径部分）の間隔に対応している。したがって、中央制御部１１７は、画像データを二値化してシースフロー１１１を背景の画像から区別する。カメラ１１２で撮影したシースフロー１１１の撮影画像を二値化して得られた画像データの編集結果を図７に示す。この図７は、撮影画像の上下方向の各高さ〔ｙ（ｉ）〕を縦軸、横方向の画素数〔ｘ（ｉ）〕を横軸に示している。また、図に示されたＹ（１）‥Ｙ（４）‥が各大径部の最大径部分（ピーク）の高さを表し、ピーク間の距離（平均距離）が間隔λを表す。
【００４４】
具体的に、計算過程２では、図９のフローチャートに示すように、中央制御部１１７は、後の処理に必要なデータ（ｉ：Ｙ軸方向の列番号、Ｉ：ピーク番号、Ｆ１：フラグ）を初期化し（１００１）、ｉ＋１列に含まれるシースフローの画素数とｉ列に含まれるシースフローの画素数を比較する（１００２）。ｉ＋１列の画素数ｘ（ｉ＋１）がｉ列の画素数ｘ（ｉ）よりも大きい場合（画素数が増加傾向にある場合）、フラグＦ１を１に設定し（１００３）、列番号ｉをカウントアップする（１００４）。一方、ｉ＋１列の画素数ｘ（ｉ＋１）がｉ列の画素数ｘ（ｉ）よりも小さい場合（画素数が減少傾向にある場合）、フラグＦ１が１か否か判断する（１００５）。すなわち、判断ステップ１００２，１００５では、列番号ｉまで増加傾向にあった画素数が、列番号ｉ＋１から減少傾向に移ったか否か判断する。次に、画素数ｘ（ｉ）が閾値ｘ（ｔｈ１）（図７参照）を越えているか否か判断し（１００６）、閾値ｘ（ｔｈ１）を越えていれば、Ｙ（Ｉ）に列番号ｉを与えて記憶し（１００７）、ピーク番号Ｉを更新し（１００８）、フラグＦ１を「０」に設定し（１００９）、ｉ＋１が最終列番号ｎに達したか否か判断する（１０１０）。ｉ＋１が最終列番号に達していない場合、列番号をカウントアップし（１００４）、判断ステップ１００２を実行する。そして、ｉ＋１が最終行番号ｎに達すると、上述のようにして求めたピーク番号Ｙ（Ｉ）〔Ｙ（１）‥Ｙ（４）‥〕をもとに、ピーク間の平均距離、すなわち間隔λを計算する（１０１１）。なお、閾値ｘ（ｔｈ１）は、大径部と以下に説明するサテライトドロップ（小液滴）を区別するもので、通常形成されるサテライトドロップの大きさ及びその画素数よりも大きい値に設定される。
【００４５】
計算過程３：
計算過程３は、中央制御部１１７が、計算された時間Ｔと間隔λ等を用いて距離ＬＢ０を計算する過程である。具体的に、この計算過程３では、上述の式（４）を以下のように変形して得られる式（６）を用いて、距離ＬＢ０を計算する
2006292769.tif 000008
上述のように、式（５）に含まれる時間Ｔ、間隔λ及び距離ＬＢは上述のように計算され、ストロボ発光周期ｔは既知である。したがって、これらの計算された諸数値を用いて、距離ＬＢ０が計算される。また、計算された距離ＬＢ０、ＬＢを用いて距離Ｌが計算できる。
【００４６】
中央制御部１１７は、以上のようにして決定された距離Ｌと間隔λを式（５）に代入してドロップディレイＤＤを決定する。決定されたドロップディレイＤＤは、ドロップディレイ制御部１２１に基準値ＤＤとして記憶部１１６に記憶され、後に説明するドロップディレイ調整制御に利用される。
【００４７】
（５）ソーティング制御：
粒子のソーティング制御において、液滴制御部１１０と荷電制御部１２０は、検出器が粒子を検出したことを示す信号（検出信号）を、信号処理部２４から受信する。検出信号を受信すると、液滴制御部１１０は、ドロップディレイ制御部１２１を駆動し、記憶されているドロップディレイＤＤに対応する遅延時間Ｔの経過後、電荷注入回路９１を起動し、液体に電荷を注入する。注入される電荷の極性は、信号処理回路２４から出力された信号に基づいて、荷電制御回路１２０が決定する。そして、荷電制御回路１２０で決定された極性の電荷が、電荷注入回路９１から液体に注入される。したがって、電荷注入直後にシースフロー１１１から分離される液滴（検出された粒子を含む液滴）は、粒子について検出された生物学的性質に対応した極性の電荷が注入され、電極板９４，９５の間を通過する際に偏向され、対応する容器（図示せず）に採取される。
【００４８】
（６）フィードバック制御（ドロップディレイ制御）：
フローサイトメータ１で使用するシース液の粘度は環境（例えば、温度）によって変化する。シース液の粘度が変化するとブレークオフポイントＢＰが上下に移動し、液滴の形成されるタイミングが変化する。したがって、液滴制御部１１０は、カメラ１１２の画像を利用して、ブレークオフポイントＢＰから撮影画像上端までの距離ＬＢ＊を計算する。この計算は、上述のように、シースフロー１１１に沿ってその近傍に適当なスケール又はこれに代わる基準寸法物を配置し、カメラ１１２で撮影された基準寸法物の大きさ（画素数）を基準として計測することができる。具体的には、図１０に示すように、液滴制御部１１０は、列番号ｉを「１」に設定し（１０１１）、当該列番号の画素数ｘ（ｉ）が「０」か否か判断する（１０１２）。画素数ｘ（ｉ）が「０」でない場合、列番号ｉを更新し（１０１３）、同様の判断処理（１０１２）を行う。画素数ｘ（ｉ）が「０」と判断されると、その列番号ｉをＹＢＰ（図８参照）に設定し、このＹＢＰの値と基準寸法物の寸法から比例計算によって距離ＬＢ＊を計算する。
【００４９】
次に、液滴制御部１１０は、カメラ１１２から得られた画像をもとに間隔λ＊を計算する。粒子間距離を計算する方法は、上述の計算過程２と同一である。
【００５０】
続いて、液滴制御部１１０は、計算された距離ＬＢ＊と間隔λ＊をもとに、式（５）を変形した次の式（７）から新たなドロップディレイＤＤ＊を計算する。
2006292769.tif 000009
【００５１】
そして、以上のようにして計算された新たなドロップディレイＤＤ＊に基づいて、液滴制御部１１０は、液体に電荷を注入するタイミング（時間遅れΔｔ）を調整する。なお、式（７）から明らかなようにＬＢ＊＋ＬＢ０は長さの単位を有する固有値であるため、液滴が形成される周波数やシース液の供給圧力を変えても、上述のようにして間隔λ＊は正確に求めることができるので、ドロップディレイＤＤ＊は正確に求めることができる。その結果、ソーティングを高精度に維持できる。
【００５２】
（７）フィードバック制御（電圧制御）：
図６に示すように、シースフロー１１１から液滴１３３が分離する際、分離した液滴１３３とこれに続く分離していない液滴１３３との間には、粒子を含まない小さな液滴のサテライトドロップ１３４が発生する。図面では、サテライトドロップ１３４が液滴１３３から分離して独立している理想的な状態で示されており、この独立した理想的な状態でシースフロー１１１に電荷を注入するのが最も好ましい。そこで、液滴制御部１１０は、カメラ１１２が撮影した画像を処理した二値画像データからサテライトドロップ１３４の状態を検出しながら、図６に示すようにサテライトドロップ１３４が独立した状態が得られるように、振動発生器８９に印加する電圧を制御し、振動発生器８９が発生する振動の大きさを調整する。
【００５３】
具体的に、図１１のフローチャートに示すように、液滴制御部１１０は、上述したブレークオフポイントＢＰの列番号ＹＢＰを列番号ｉに与えるとともに、フラグＦ２を「１」に設定する（１０２１）。次に、列番号ｉをインクリメントし（１０２２）、ブレークオフポイントＢＰより下にある各列番号ｉの画素数ｘ（ｉ）が所定の閾値ｘ（ｔｈ２）（図８参照）を越えているか否か判断する（１０２３）。画素数ｘ（ｉ）が所定の閾値ｘ（ｔｈ２）を越えていない場合、フラグＦ２が「０」か否か判断し（１０２７）、フラグＦ２が「０」でなければ列番号ｉをインクリメントする（１０２２）。上述のように、ブレークオフポイントＢＰは画素数ｘ（ｉ）が「０」になった点である。したがって、図８に示すように、ブレークオフポイントＢＰに続く複数の列番号では、画素数ｘ（ｉ）が所定の閾値ｘ（ｔｈ２）を超えないので、ステップ１０２２→１０２３→１０２７を繰り返す。しかし、画素数ｘ（ｉ）が所定の閾値ｘ（ｔｈ２）を越えたと判断すると（１０２３）、フラグＦ２が「１」か否か判断し（１０２４）、フラグＦ２が初期状態（フラグＦ２＝１）であれば、そのときの列番号ｉをサテライトドロップ上端列番号ＹＳ１に設定し（１０２５）、フラグＦを「０」に切り換える（１０２６）。画素数ｘ（ｉ）が閾値ｘ（ｔｈ２）を一度越えると、その状態がしばらく維持される（図８参照）。したがって、画素数ｘ（ｉ）が閾値ｘ（ｔｈ２）を超えている間、ステップ１０２２→１０２３→１０２４が繰り返される。列番号ｉがサテライトドロップ下端部近傍の列番号になると、画素数ｘ（ｉ）が閾値ｘ（ｔｈ２）以下となる（１０２３）。その結果、処理１０２２から処理１０２７に進み、フラグＦ２が「０」に設定されているか否か判断する。このとき、フラグＦは「０」に設定されている（１０２６）。したがって、列番号ｉをサテライトドロップ下端列番号ＹＳ２に設定する（１０２８）。また、サテライトドロップ下端列番号ＹＳ２からサテライトドロップ上端列番号ＹＳ１を引いて、サテライトドロップ上端からサテライトドロップ下端までの画素数ＹＳを計算する（１０２９）。そして、液滴制御部１１０は、画素数ＹＳからサテライトドロップ１３４の長さを計算する。次に、液滴制御部１１０は、計算されたサテライトドロップ１３４の長さＹＳと記憶されている基準長さＹｒｅｆとを比較し、駆動部１１８から振動発生器８９に印加する電圧を調整してサテライトドロップ１３４の長さを一定に維持する。なお、サテライトドロップ１３４の長さに代えて、図８に示す画像の面積（大きさ）Ａを次の式（８）に従って計算し、その面積Ａを液滴制御部１１０で一定に維持するように制御してもよい。
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【００５４】
このように、フローサイトメータ１では、カメラ１１２で撮影した画像に基づいて振動発生器８９に印加する電圧がフィードバック制御されるので、理想的な形のシースフローが一定位置に安定して自動的に形成される。また、カメラ１１２で撮影した画像を利用してドロップディレイＤＤ（遅延時間Δｔ）が調整されるので、粒子は正確にソーティングされる。
【００５５】
（８）懸濁液／シース液供給部：
図１２は、シース液供給部４５と供給部４８の詳細を示す。図示するように、シース液供給部４５はシース液容器１４０を備えており、このシース液容器１４０にシース液１４１が収容されている。シース液容器１４０には２本のチューブ１４２，１４３が接続されている。チューブ１４２は、一端がシース液１４１の上部密閉空間に接続され、他端が圧力源１４４に接続されている。また、チューブ１４３は、一端がシース液１４１に浸けてあり、他端がバッファ容器１４５に接続されている。バッファ容器１４５は、シース液容器１４０の容量よりも遥かに小さな容量の容器であり、シース液容器１４０からチューブ１４３を介して供給されたシース液１４１が収容されている。バッファ容器１４５はまた、別のチューブ１４６を介して容器４０に接続されている。図示するように、チューブ１４３、１４６の一端は、バッファ容器１４５に収容されているシース液１４１に浸けられている。
【００５６】
供給部４８は、生物学的粒子（細胞または染色体）であるサンプル液１４７を収容するサンプル容器１４８を備えている。サンプル容器１４８は、一端を供給管４９に接続したサンプルチューブ１４９が接続されており、このサンプルチューブ１４９の他端がサンプル液１４３に浸けられている。サンプル容器１４８に収容されているサンプル液１４７の上部密閉空間には、チューブ１５０の一端が接続されている。チューブ１５０の他端は圧力調整部１５１に接続され、さらに圧力調整部１５１が別のチューブ１５２を介して圧力源１５３に接続されている。そして、圧力調整部１５１とバッファ容器１４５の上部密閉空間がチューブ１５４で連結されている。
【００５７】
以上の構成によれば、シース液供給部４５において、シース液容器１４０に収容されているシース液１４１は、圧力源１４４からチューブ１４２を通じて加えられる圧力Ｐ１０によって加圧され、チューブ１４３を通じてバッファ容器１４５に圧力Ｐ１１で供給される。また、バッファ容器１４５のシース液１４１は、シース液容器１４０から供給されるシース液１４１の圧力Ｐ１１によって、チューブ１４６を通じて圧力Ｐ１２で容器４０に供給される。一方、供給部４８において、圧力源１５３から提供された圧力Ｐ２０は圧力調整部１５１で調整され、調整された圧力Ｐ２１がサンプル容器１４８の上部密閉空間に加えられる。その結果、サンプル容器１４８のサンプル液１４７は、所定の圧力Ｐ２２で、チューブ１４９を介して鞘管４９に供給される。このとき、鞘管４９から噴射されるサンプル液１４７の圧力Ｐ２２は、容器４０に供給されたサンプル液１４７がシース液１４１によって乱されることなく真っすぐに流れる必要がある。そのため、サンプル液１４７の圧力Ｐ２２は、シース液１４１の圧力Ｐ１２よりも所定の圧力ΔＰだけ大きく設定されている。
【００５８】
具体的に、実施形態において、シース液供給部４５におけるチューブ１４２，１４３，１４６の管内圧力Ｐ１０，Ｐ１１，Ｐ１２はほぼ同一である。一方、供給部４８において、圧力調整部１５１の下流側に接続された２つのチューブ１５０、１４９の管内圧力はほぼ同一である。そして、圧力調整部１５１は、チューブ１５４を通じて提供されるバッファ容器１４５の内部圧力Ｐ１２’（この圧力は、圧力Ｐ１１，Ｐ１２とほぼ同一である。）を基準とし、これに必要な差圧ΔＰを加えた圧力を、圧力調整部１５１から出力される圧力Ｐ２１とする。
【００５９】
そして、実施形態において、シース液容器１４５とバッファ容器１４８の容積は、シース液容器１４０の約１／１０〜約１／１０００、好ましくは約１／５００に設定されている。したがって、シース液１４１が消費されることによりシース液容器１４５のレベルが下がっても、バッファ容器１４５が無い場合に比べて、容器４０に供給されるシース液１４１とサンプル液１４７の差圧を安定的に確保することができる。
【００６０】
（９）容器：
シース液供給部４５のシース液容器１４５と供給部４８のサンプル容器１４８の少なくともいずれか一方は、図１３に示す容器を採用するのが好ましい。図１３に示す容器１５５は、外側容器１５６と内側容器１５７からなる。外側容器１５６は、金属又はプラスチックなどの比較的剛性の高い材料で形成されている。内側容器１５７は、ガラスなどの材料で形成することができる。外側容器１５６は、内側容器１５７を収容可能な容器本体１５８と、容器本体１５８の上端口部に着脱自在にかつ密閉可能に装着される蓋１５９からなる。蓋１５９を容器本体１５８に取り付ける機構は、通常のねじ構造を用いるのが好ましい。また、蓋１５９と容器本体１５８の間をシールするために、図示するように、両者の間にＯリング１６０を配置するのが好ましい。蓋１５９は、内側容器１５７に液体（シース液又はサンプル液）を供給し、また収容されている液体を加圧するために、複数のチューブ挿入孔１６１，１６２を有し、チューブ挿入孔１６１，１６２に挿入されたチューブ１６３，１６４の周囲がゴム等の弾性環状部材１６５，１６６でシールされている。このような構成の容器をシース液供給容器１４５やサンプル容器１４８に使用すれば、比較的剛性の高い材料で形成された外側容器１５６に囲まれた内部空間に圧力が加えられても、通常は割れ易いプラスチックなどの材料で形成されている内側容器１５７に亀裂が入っている場合でも、外側容器１５６の圧力は所定の値に維持されるので、安定してサンプル液が供給できる。また、容器１５５をサンプル容器に使用する場合、サンプル液に含まれる生物学的粒子が凝集して固まるのを防止するため、周期的に加振して粒子を攪拌する必要がある。この場合、外側容器１５６は剛性の高い材料で形成されているので、周期的な振動を加えても割れるという問題がない。なお、実施形態では蓋１５９に孔１６１，１６２を設け、これらにチューブ１６３，１６４を挿入しているが、蓋１５９にチューブを貫通した状態で固定し、この貫通チューブの両端（蓋の内側と外側）に別のチューブを接続してもよい。
【００６１】
（１０）分光フィルタの配置：
フローサイトメータ１において、検出装置２５の分光フィルタ３０Ａ〜３０Ｃには、通常ダイクロックミラーが用いられる。このダイクロックミラーは、一般に、反射率が透過率よりも大きいという特性を有する。例えば、反射率Ｒは約０．９、透過率は約０．８である。したがって、例えば、図１４に示すように、３つの分光フィルタ１６７，１６８，１６９を直列に配置し、各分光フィルタ１６７，１６８，１６９の透過光を検出器ＦＬ１〜ＦＬ４で検出するとともに分光フィルタを透過した光を下流側へ伝送すると、最後の分光フィルタ１６９で反射する光の強度と該分光フィルタ１６９を透過する光の強度はそれぞれ、検出装置２５に入射する光の強度を１とした場合、０．５７６（＝０．８×０．８×０．９）、０．５１２（＝０．８×０．８×０．８）まで減少する。これに対し、図１５に示すように、分光フィルタ１６７，１６８，１６９の反射光を下流側に伝送すると、最後の分光フィルタ１６９で反射する光の強度と該分光フィルタ１６９を透過する光の強度はそれぞれ０．７２９（＝０．９×０．９×０．９）、０．６４８（＝０．９×０．９×０．８）となり、図１４に示す配置に比べて光の強度低下が少なく、そのため検出装置２５の検出感度が高くなる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明に係る装置の光学的要素を示す図。
【図２】本発明に係る装置の流体力学的構成を示す側面図。
【図３】図１に示す装置の検出流路とその近傍に配置された光ファイバの一部を拡大した拡大横断面図。
【図４】図１に示す装置の検出流路とその近傍に配置された光ファイバの一部を拡大した拡大縦断面図。
【図５】図１に示す装置の回路図。
【図６】シースフローの拡大正面図及びカメラの撮影画像を示す図。
【図７】撮影画像をデータ処理した後の画素数を横軸に表した図。
【図８】サテライトドロップの画素数を横軸に表した図。
【図９】λ検出処理のフローチャート。
【図１０】ブレークオフポイントを検出するフローチャート。
【図１１】サテライトドロップの大きさを検出するフローチャート。
【図１２】容器にサンプル液とシース液を供給する装置を示す図。
【図１３】サンプル液容器又はサンプル液容器の断面図。
【図１４】検出装置における分光フィルタの配置を示す図。
【図１５】検出装置における分光フィルタの好適な配置を示す図。
【図１６】生物学的粒子の生物学的性質を得る従来装置を示す斜視図。
【図１７】生物学的粒子のソーティングを説明する図。
【符号の説明】
【００６３】
１：装置
２：流路形成部材（流路ブロック）
４：シースフロー
５：照明部
６：第１のレーザ発生器
７：第２のレーザ発生器
８：第１のレーザ光
９：光ファイバ
１１：集光レンズ
１２：第２のレーザ光
１３：光ファイバ
１４：ビームエキスパンダ
１５：集光レンズ
２１：第１の検出部
２２：集光レンズ
２３：光検出器
２４：信号処理部
２５：第２の検出器
９０：ソーティング装置
１１０：液滴制御部
１１２：固定カメラ
１１３：ストロボ
１１４：ビデオデジタイザ
１１７：中央制御部
１１８：振動発生器駆動部
１１９：ストロボ駆動部
１２０：荷電制御部
１２１：ドロップディレイ制御部
１３３：液滴
１３４：サテライトドロップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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