(57)【要約】【課題】医療、食品、化粧品分野などに使用することも可能な、下記の要件を充足する新規なヒアルロン酸誘導体とその製造方法の提供。水に可溶。ヒアルロニダーゼにより分解されにくい。非水系溶媒で化学修飾可能。疎水性化合物と親和性を有する。【解決手段】下記式（１）で表される繰り返しユニットを有するヒアルロン酸誘導体。式（１）：2006291097.tif 000015式（１）で表される繰り返しユニットの少なくとも５つに１つはＲ１が式（２）である。2006291097.tif 000016式（２）：【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される繰り返しユニットを有するヒアルロン酸誘導体。
式（１）：
2006291097.tif 000012
（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して式（２）またはＨであり、式（１）で表される繰り返しユニットの少なくとも５つに１つはＲ１が式（２）であり、Ｒ５は独立してカチオン性化合物、Ｈ、または一価の金属イオンである。）
式（２）：
2006291097.tif 000013
(式（２）中、Ｒ６は、独立して炭素数３〜２０のアルキレン、またはアリーレンである。)
【請求項２】
式（１）で表される繰り返しユニットの少なくとも３つに１つは、Ｒ１が式（２）である請求項１記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項３】
Ｒ６が、独立して炭素数３〜１０のアルキレン、またはフェニレンである請求項１記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項４】
Ｒ６が、独立して炭素数３〜６のアルキレン、またはフェニレンである請求項１記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項５】
Ｒ5が、一価の金属イオンである請求項１記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項６】
一価の金属イオンが、ナトリウムイオンである請求項５記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項７】
Ｒ５が、カチオン性化合物である請求項１記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項８】
カチオン性化合物が、第４級アンモニウム塩である請求項７記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項９】
平均分子量が５０００〜３００万の範囲である請求項１記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項１０】
ヒアルロン酸に比べ、ヒアルロニダーゼによる分解速度が遅い請求項１〜９のいずれか１項記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項１１】
下記式（３）で表される化合物の１種以上を用い、ヒアルロン酸またはその塩とカチオン性化合物との複合体を、非水系溶媒中でエステル化するヒアルロン酸誘導体の製造方法。
式（３）：
2006291097.tif 000014
（式（３）中、Ｒ７は、炭素数３〜２０のアルキレン、またはアリーレンである。）
【請求項１２】
Ｒ７が、炭素数３〜１０のアルキレン、またはフェニレンである請求項１１記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【請求項１３】
カチオン性化合物が第４級アンモニウム塩である請求項１１記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【請求項１４】
非水系溶媒が、クロロホルム、トルエン、塩化メチレン、ヘプタン、およびジメチルホルムアミドから選ばれる１種以上である請求項１１記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸誘導体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミンとＤ-グルクロン酸が交互に結合してできた直鎖状の高分子多糖であり、多数の遊離カルボキシル基と多数の遊離ヒドロキシル基を有するために水に対する親和性に富み、水に溶けて高粘度の水溶液を形成する。この遊離カルボキシル基と遊離ヒドロキシル基を封鎖することにより物性の異なるヒアルロン酸を入手することが期待される。そのために、医療、食品、化粧品分野などに使用することを目的として、ヒアルロン酸またはその塩（以下「ヒアルロン酸（塩）」と記述する）の化学修飾が行なわれているが、これまでは、下記の要件を充足するヒアルロン酸誘導体は得られていなかった。
１）水に可溶。
２）ヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸分解酵素）により分解されにくい。
３）非水系溶媒で化学修飾可能（水および／または原料のヒアルロン酸（塩）に由来する発熱性物質、抗原性物質の混入又は産生を防ぐため）。
４）疎水性化合物と親和性を有する。
【０００３】
たとえば、特許文献１には、ヒアルロン酸(塩)とカチオン性化合物との複合体を非水系溶媒に溶解し、次いでこの複合体をＯ−アシル化反応、アルコキシ化反応または架橋化反応に供することにより得られたヒアルロン酸誘導体が開示されている。このヒアルロン酸誘導体は、反応による分子量低下が抑制され、ヒアルロン酸(塩)本来の保湿性、高粘性といった特性が保持されている。さらに、このヒアルロン酸誘導体には、事実上発熱物質や抗原物質の混入がない。しかしながら、特許文献１に開示されたヒアルロン酸誘導体は１）の要件を満たさない。
【０００４】
特許文献２には、ヒアルロン酸(塩)とカチオン性化合物との複合体を非水系溶媒に溶解し、次いでこの複合体を酸ハロゲン化物と反応させてｎ−アルカノイル化させることにより疎水性が付与されたヒアルロン酸誘導体が開示されている。しかしながら、このヒアルロン酸誘導体は、ｎ−アルカノイル基の導入量が増えると水に不溶性になり１）を満たさない。
【０００５】
特許文献３には、有機塩基の存在下、水及び非プロトン性溶媒中において、ヒアルロン酸(塩)とカチオン性化合物との複合体を、コハク酸無水物を用いて処理したヒアルロン酸のコハク酸ヘミエステルが開示されている。しかしながら、特許文献３に開示されたヒアルロン酸誘導体（ヒアルロン酸のコハク酸ヘミエステル）は、前述の４）および２）の要件を満たさない。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−３５６５０１
【特許文献２】特願２００２−２８５７６９
【特許文献３】特願平８−５３３７６９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、医療、食品、化粧品分野などに使用することも可能な、下記の要件を充足する新規なヒアルロン酸誘導体とその製造方法を提供することである。
１）水に可溶。
２）ヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸分解酵素）により分解されにくい。
３）非水系溶媒で化学修飾可能（水および／または原料のヒアルロン酸（塩）に由来する発熱性物質、抗原性物質の混入又は産生を防ぐため）。
４）疎水性化合物と親和性を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下記の構成を有する。
１）下記式（１）で表される繰り返しユニットを有するヒアルロン酸誘導体。
2006291097.tif 000002
式（１）：
2006291097.tif 000003
（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して式（２）またはＨであり、式（１）で表される繰り返しユニットの少なくとも５つに１つはＲ１が式（２）であり、Ｒ５は独立してカチオン性化合物、Ｈ、または一価の金属イオンである。）式（２）：
(式（２）中、Ｒ６は、独立して炭素数３〜２０のアルキレン、またはアリーレンである。)
２）式（１）で表される繰り返しユニットの少なくとも３つに１つは、Ｒ１が式（２）である前記第１項記載のヒアルロン酸誘導体。
３）Ｒ6が、独立して炭素数３〜１０のアルキレン、またはフェニレンである前記第１項記載のヒアルロン酸誘導体。
４）Ｒ６が、独立して炭素数３〜６のアルキレン、またはフェニレンである前記第１項記載のヒアルロン酸誘導体。
５）Ｒ5が、一価の金属イオンである前記第１項記載のヒアルロン酸誘導体。
６）一価の金属イオンが、ナトリウムイオンである前記第５項記載のヒアルロン酸誘導体。
７）Ｒ5が、カチオン性化合物である前記第１項記載のヒアルロン酸誘導体。
８）カチオン性化合物が、第４級アンモニウム塩である前記第７項記載のヒアルロン酸誘導体。
９）平均分子量が５０００〜３００万の範囲である前記第１項記載のヒアルロン酸誘導体。
１０）ヒアルロン酸に比べ、ヒアルロニダーゼによる分解速度が遅い前記第１項〜第９項のいずれか１項記載のヒアルロン酸誘導体。
【０００９】
１１）下記式（３）で表される化合物の１種以上を用い、ヒアルロン酸またはその塩とカチオン性化合物との複合体を、非水系溶媒中でエステル化するヒアルロン酸誘導体の製造方法。
式（３）：
2006291097.tif 000004
（式（３）中、Ｒ７は、炭素数３〜２０のアルキレン、またはアリーレンである。）
１２）Ｒ７が、炭素数３〜１０のアルキレン、またはフェニレンである前記第１１項記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法。
１３）カチオン性化合物が第４級アンモニウム塩である前記第１１項記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法。
１４）非水系溶媒が、クロロホルム、トルエン、塩化メチレン、ヘプタン、およびジメチルホルムアミドから選ばれる１種以上である前記第１１項記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のヒアルロン酸誘導体は、下記の要件を充足し、医療、食品、化粧品分野などに使用することも可能である。具体的には医療では関節炎の治療組成物、ドラッグデリバリーシステム(例えば子宮内膜症の局所投与製剤)の医療用基材として使用することが可能である。また、本発明の製造方法であれば、非水系溶媒中で本発明のヒアルロン酸誘導体を容易に製造することが可能である。
１）水に可溶。
２）ヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸分解酵素）により分解されにくい。
３）非水系溶媒で化学修飾可能（水および／または原料のヒアルロン酸（塩）に由来する発熱性物質、抗原性物質の混入又は産生を防ぐため）。
４）疎水性化合物と親和性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
式（１）：
2006291097.tif 000005
式（１）において、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して式（２）またはＨであり、式（１）で表される繰り返しユニットの少なくとも５つに１つはＲ１が式（２）であり、Ｒ５は独立してカチオン性化合物、Ｈ、または一価の金属イオンである。
【００１２】
本発明においては、式（１）で表される繰り返しユニットの少なくとも５つに１つは、Ｒ１が式（２）である。該ユニットの少なくとも３つに１つＲ１が式（２）であれば、疎水性化合物と親和性が大きくなり、疎水性薬剤の担持能が増す。また、酵素による分解速度が遅いことから、疎水性薬剤の長期にわたる徐放期間を達成することができる。
【００１３】
Ｒ５は、独立してカチオン性化合物、Ｈ、または一価の金属イオンである。本発明のヒアルロン酸誘導体は、Ｒ５がカチオン性化合物である場合には有機溶媒可溶になり、Ｒ５が一価の金属イオンである場合には水可溶となる。
【００１４】
本発明においてカチオン性化合物は、具体的には、第４級アンモニウム塩、アミノ基を２個以上有するアミノ酸、ペプチド、ポリアミノ酸の塩、およびアミノ基を有する糖質の塩などであり、好ましくは第４級アンモニウム塩である。第４級アンモニウム塩とヒアルロン酸との複合体は有機溶媒に溶解する。さらに該複合体は調製簡便である。
【００１５】
本発明において好ましく使用することができる第４級アンモニウム塩は、アルキル基のうちの少なくとも1個が炭素数８個以上からなるものである。具体的には、ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド(Distearyldimethylammonium Chloride)、ジオレイルジメチルアンモニウムクロライド(Dioleyldimethylammonium Chloride)、セチルピリジニウムクロライド(Cetylpyridinium Chloride)、セチルトリメチルアンモニウムクロライド(Cetyltrimethylammonium Chloride)、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(Cetyltrimethylammonium Bromide)、ジテトラデシルジメチルアンモニウムブロミド(Ditetradecyldimethylammonium Bromide)、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド(Didodecyldimethylammonium Bromide)、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド(Didecyldimethylammonium Bromide)、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロライド(Octadecyltrimethylammonium Chloride)、ノルマルオクタデシルトリメチルアンモニウムブロミド(n-Octadecyltrimethylammonium Bromide)、トリドデシルメチルアンモニウムクロライド(Tridodecylmethylammonium Chloride)、トリオクチルメチルアンモニウムブロミド(Trioctylmethylammonium Bromide)、ジオクタノイルL−アルファー−フォスファチジルコリン(Dioctanoyl L-α-Phosphatidylcholine)、ジラウロイル  L−アルファー−フォスファチジルコリン(Dilauroyl L-α-Phosphatidylcholine)、1,2−ジミリストイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(1,2-Dimyristoyl-3-Trimethylammonium Propane)、1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium Propane)、1,2−ジパルミトイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(1,2-Dipalmitoyl-3-Trimethylammonium Propane)、1,2−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(1,2-Distearoyl-3-Trimethylammonium Propane)、ベンザルコニウムクロライド(Benzalkonium Chloride)、ベンゼトニウムクロライド(Benzethonium Chloride)などである。
【００１６】
本発明において好ましく使用することができる一価の金属イオンは、ナトリウムイオンである。
【００１７】
式（２）：
2006291097.tif 000006
式（２）においてＲ６は、炭素数３〜２０のアルキレン、またはアリーレンである。
【００１８】
Ｒ６が炭素数３〜１０のアルキレン、またはフェニレンであれば、化学修飾によりカルボキシル基を増やすことで、水溶性を維持しつつ疎水核を形成することができる。炭素数３〜１０のアルキレンは、プロピレン、ブチレン、ヘキサメチレン、オクタメチレンなどである。フェニレンとしては、フェニレン、４−カルボキシフェニレン、４−ヒドロキシフェニレン、４−メチルフェニレンなどである。特にプロピレン、ブチレン、２−メチルプロピレン、２，２−ジメチルプロピレン、フェニレンなどは分子内で酸無水物を形成している原料を用いることができるため副反応や不純物の混入が生じにくくより好ましい。
【００１９】
本発明のヒアルロン酸誘導体の分子量は特に限定されるものではないが、ＨＰＬＣ法により測定される平均分子量が５０００〜３００万の範囲であることが好ましく、より好ましくは５０００〜１５０万の範囲である。
【００２０】
該ＨＰＬＣ法による平均分子量の測定には、多糖類の分子量測定に適する任意のカラムを用いることができるが、例えばShodex Ionpak KS806およびIonpak KS-G等のカラムを用いることが好ましい。この場合、溶出液としては０．２ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム水溶液を用い、流速１．０ｍｌ／分で流し、ヒアルロン酸誘導体の検出は２０６ｎｍで行うことができる。平均分子量は分子量既知のヒアルロン酸ナトリウムで作製した検量線より計算できる。
【００２１】
本発明のヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロニダーゼによる分解を受けにくいものである。その分解速度は、ヒアルロン酸よりも遅いことが好ましい。分解速度はＥ型回転粘度計で１００ｒｐｍ、２５℃の条件でヒアルロニダーゼ濃度１００Ｕ/ｍｌで粘度を測定することによって求めることができる。
【００２２】
本発明のヒアルロン酸誘導体の製造方法は、式（３）で表される化合物を用い、ヒアルロン酸（塩）とカチオン性化合物との複合体を、非水系溶媒中でエステル化することを特徴とするものである。
【００２３】
式（３）：
2006291097.tif 000007
式（３）において、Ｒ7は、炭素数３〜２０のアルキレン、またはアリーレンである。
【００２４】
Ｒ７は、炭素数３〜１０のアルキレン、またはフェニレンであることが好ましい。炭素数３〜１０のアルキレンは、プロピレン、ブチレン、ヘキサメチレンなどである。フェニレンとしては、フェニレン、４−カルボキシフェニレン、４−ヒドロキシフェニレン、４−メチルフェニレンなどである。本発明に好ましく使用することができるアルキレンは、プロピレン、ブチレン、２−メチルプロピレン、２，２−ジメチルプロピレンなどである。Ｒ７がプロピレンや２−メチルプロピレン、２，２−ジメチルプロピレンである場合、本発明のヒアルロン酸誘導体は水に溶解しやすく、ヒアルロニダーゼによる分解も遅い。
【００２５】
本発明に使用するヒアルロン酸(塩)の起源は特に限定されるものではなく、鶏の鶏冠など各種動物組織由来であっても、ヒアルロン酸(塩)の生産能を有する微生物由来であってもよいが、本発明に使用するヒアルロン酸(塩)は微生物由来であることが好ましい。
【００２６】
ヒアルロン酸生産能を有する微生物として例えばストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・エクイシミリス(Streptococcus equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・デイスガラクテイエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Streptococcus zooepidemicus)などを挙げることができる。
【００２７】
また本発明において原料として使用するヒアルロン酸(塩)はＨＰＬＣ法により測定される平均分子量が５０００から３００万の範囲であることが好ましい。該ＨＰＬＣによる平均分子量の測定には、多糖類の分子量測定に適する任意のカラムを用いることができるが、例えばShodex Ionpak KS806およびIonpak KS-G等のカラムを用いることが好ましい。この場合、溶出液としては０．２ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム水溶液を用い、流速１．０ｍｌ／分で流し、ヒアルロン酸(塩)の検出は２０６ｎｍで行うことができる。平均分子量は分子量既知のヒアルロン酸ナトリウムで作製した検量線より計算できる。
【００２８】
本発明において用いられる１価の金属イオンとしては、特に限定されないがアルカリ金属イオン、例えばカリウム、ナトリウムなどを挙げることができ、本発明においてはナトリウムであることが好ましい。
【００２９】
本発明において用いるカチオン性化合物は、具体的には第４級アンモニウム塩、アミノ基を２個以上有するアミノ酸、ペプチド、ポリアミノ酸の塩、およびアミノ基を有する糖質の塩などを挙げることができ、好ましくは第４級アンモニウム塩である。
【００３０】
本発明において好ましく使用することができる第４級アンモニウム塩は、アルキル基のうちの少なくとも1個が炭素数８個以上からなるものである。具体的には、ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド(Distearyldimethylammonium Chloride)、ジオレイルジメチルアンモニウムクロライド(Dioleyldimethylammonium Chloride)、セチルピリジニウムクロライド(Cetylpyridinium Chloride)、セチルトリメチルアンモニウムクロライド(Cetyltrimethylammonium Chloride)、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(Cetyltrimethylammonium Bromide)、ジテトラデシルジメチルアンモニウムブロミド(Ditetradecyldimethylammonium Bromide)、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド(Didodecyldimethylammonium Bromide)、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド(Didecyldimethylammonium Bromide)、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロライド(Octadecyltrimethylammonium Chloride)、ノルマルオクタデシルトリメチルアンモニウムブロミド(n-Octadecyltrimethylammonium Bromide)、トリドデシルメチルアンモニウムクロライド(Tridodecylmethylammonium Chloride)、トリオクチルメチルアンモニウムブロミド(Trioctylmethylammonium Bromide)、ジオクタノイルL−アルファー−フォスファチジルコリン(Dioctanoyl L-α-Phosphatidylcholine)、ジラウロイル  L−アルファー−フォスファチジルコリン(Dilauroyl L-α-Phosphatidylcholine)、1,2−ジミリストイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(1,2-Dimyristoyl-3-Trimethylammonium Propane)、1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium Propane)、1,2−ジパルミトイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(1,2-Dipalmitoyl-3-Trimethylammonium Propane)、1,2−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(1,2-Distearoyl-3-Trimethylammonium Propane)、ベンザルコニウムクロライド(Benzalkonium Chloride)、ベンゼトニウムクロライド(Benzethonium Chloride)などである。
【００３１】
ヒアルロン酸(塩)とカチオン性化合物との複合体とはヒアルロン酸のアニオン性部位(カルボキシル基)とカチオン性化合物がイオン的に結合したものをいう。その調製法の一例を以下に説明する。
【００３２】
＜ヒアルロン酸(塩)とカチオン性化合物との複合体の調製法＞
Ａ）ヒアルロン酸(塩)を蒸留水またはこれに相当する純水に０．０１〜１０重量％の濃度、好ましくは０．０５〜１重量％の濃度にて溶解する。なお、本発明において、蒸留水に相当する純水とは、例えば、連続イオン交換(Electric Deionization)および逆浸透(Reverse Osmosis)等により精製した水を意味する（以下「純水」ということがある）。
【００３３】
Ｂ）一方、ヒアルロン酸(塩)と複合体を形成させるカチオン性化合物、好ましくは第４級アンモニウム塩を、蒸留水または純水に添加均一に分散させる。Ｂ)で調製したカチオン性化合物の水溶液中のカチオン基：Ａ）で調製したヒアルロン酸(塩)の水溶液中のカルボキシル基のモル比が、０．５〜５：１、好ましくは０．７〜１．５：１、例えば１：１になるように２つの水溶液を混合する。なお、混合する際の温度は室温でも良いが、好ましくは使用するカチオン性化合物のゲル−液晶転移温度以上に両液を加温して行う。
【００３４】
混合により発生した水不溶物は通常化学実験で使用する分離法、例えば遠心分離、吸引ろ過、加圧ろ過等の方法にて混合液より回収する。回収した水不溶物は、当該カチオン性化合物のゲル−液晶転移温度以上に加温した蒸留水または純水にて洗浄した後、乾燥に供する。乾燥は、通常化学実験で使用する乾燥手段、例えば常圧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等により行うことができる。
【００３５】
また、本発明において使用しうる非水系溶媒の例には、ジメチルホルムアミド、エタノール、メタノール、アセトン、クロロホルム、塩化メチレン、トルエン、へプタン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジメチルスルオキシド、テトラヒドロフラン等、およびこれらの２種以上の混合溶媒が包合される。本発明においてはジメチルホルムアミド、エタノール、メタノール、アセトン、クロロホルム、塩化メチレン、トルエンもしくはヘプタン、およびこれらの混合溶媒が好ましい。非水系溶媒に溶解させるヒアルロン酸(塩)とカチオン性化合物の複合体の濃度は、特に限定するものではないが、１〜１０００ｍｍｏｌ／ｌの範囲であることが好ましい。
【００３６】
ヒアルロン酸（塩）とカチオン性化合物との複合体の非水系溶媒への溶解は、非水系溶媒に該複合体を加え、攪拌することで行う。攪拌は、通常の化学実験で行われる機器、例えばマグネティックスターラー、メカニカルスターラー、振とう式混合器等を用いて行うことができる。
【００３７】
溶解は、室温から溶媒の沸点付近までの温度で行うことができるが、高温でのヒアルロン酸の分子量低下を避けるために６０℃以下であることが好ましい。
【００３８】
さらに溶解したか否かは、目視により溶液が均一になったのをもって確認する。撹拌は１〜２時間以上行うことができるが、ヒアルロン酸の分子量低下を避けるために２時間以下であることが好ましい。
【００３９】
ヒアルロン酸（塩）とカチオン性化合物との複合体の、非水系溶媒への溶解後に行う該複合体と酸無水物との反応は、ピリジンなどの塩基性溶剤の存在下、酸無水物を用いて行う。ここでの酸無水物とは具体的にグルタル酸、アジピン酸、シトラコン酸、フタル酸の無水物等をあげることができる。
【００４０】
反応の停止は、ヒアルロン酸と複合体を形成しているカチオン性化合物をナトリウム塩に交換し、溶液からヒアルロン酸誘導体を析出させることで行う。塩交換は、反応溶液と均一に混合可能な有機溶媒に有機酸のアルカリ金属塩を溶解した溶液を反応系に加えることで行う。ここではナトリウム塩に交換するために酢酸ナトリウム飽和エタノール溶液の使用が好ましい。
【００４１】
反応後の精製は、例えば、グルタリル化ヒアルロン酸(塩)の製造の場合は、上述のように得られたヒアルロン酸(塩)のカチオン性化合物複合体を窒素雰囲気下、ジメチルホルムアミドに溶解し、ピリジン、グルタリル酸無水物を加えて撹拌し、反応液に酢酸ナトリウム飽和エタノールを加え、析出した沈殿をアセトン／水＝９／１で洗浄後、真空乾燥し、グルタリル化ヒアルロン酸(塩)を得ることができる。
【００４２】
本発明のヒアルロン酸誘導体の用途は特に限定されるものではないが、医薬品、食品、化粧品分野等に用いられる各種材料として使用可能である。ヒアルロン酸誘導体が生体内分解性であれば、飽和含水率を選ぶことにより生体内での分解速度を制御でき、さらに体内で代謝されるため、例えば、手術時等の保湿剤、潤滑剤、創傷被覆剤、ＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）材料等の医薬分野で用いることが可能である。なかでもその子宮内における分解速度が、人体（子宮）内のバイオリズムと高い相関性を示すことが期待されていることから、例えば子宮内膜症治療薬を担持する子宮内または膣内埋植用製剤のデバイスとして極めて有効に利用できる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例をもって本発明を詳細に説明する。
実施例１
（１）ヒアルロン酸(塩)の製造(ヒアルロン酸とジステアリルジメチルアンモニウムクロライドとの錯体の作製)
ヒアルロン酸ナトリウム(チッソ  ＣＨＡ、平均分子量９万、以下「ＣＨＡ」ということがある)  ７．１２５ｇを純水７５０ｍｌに溶解するとともに、ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド(以下「ＤＳＣ」ということがある)  １０．４ｇを２０００ｍｌの純水に分散させた。両液を４５℃に加温後撹拌しながら混合し、５分間撹拌を続け、ヒアルロン酸とジステアリルジメチルアンモニウムクロライドとの錯体（白色固体、以下「ＣＨＡ−ＤＳＣ」ということがある）を遠心分離(５０００ｒｐｍ、室温、３０分)にて回収し、４５℃の温水にて洗浄した。洗浄終了後、一夜凍結乾燥、その後５０℃で６時間減圧乾燥した。収量１７．０ｇ
【００４４】
（２）グルタリル化ヒアルロン酸(塩)（以下「ＧｌＨＡ」ということがある）の製造
得られたＣＨＡ−ＤＳＣ４８０ｍｇを６０℃、窒素下でＤＭＦ５０ｍｌに溶解し、ピリジン、無水グルタル酸を加え２時間撹拌した。反応溶液に酢酸ナトリウム飽和エタノール溶液６０ｍｌ加え、析出した沈殿をアセトン／水＝９／１で洗浄した。これを５０℃で４時間減圧乾燥して白色固体としてグルタリル化ヒアルロン酸を得た。ＮＭＲにより目的物であることを確認し、ヒアルロン酸二糖単位あたりの導入モル数（以後「ＤＳ」ということがある）を決定した。結果を表１に示した。
【００４５】
実施例２〜９、比較例１〜３
無水グルタル酸を表１に示した酸無水物に変えた以外は実施例１準じて各種エステル化ヒアルロン酸を製造した。ＮＭＲにより目的物であることを確認し、ＤＳを決定した。また、ステアロイル化及びバレロイル化ヒアルロン酸は重水に溶解しないためアルカリで分解後遊離した酸をＮＭＲにて測定しＤＳを決定した。結果を表１に示した。
【００４６】
【表１】
2006291097.tif 000008
ＧｌＨＡ：グルタリル化ヒアルロン酸（塩）
ＭＧＨＡ：３−メチルグルタリル化ヒアルロン酸（塩）
ＡｄＨＡ：アジポイル化ヒアルロン酸（塩）
ＰｈＨＡ：フタロイル化ヒアルロン酸（塩）
ＳｕＨＡ：スクシニル化ヒアルロン酸（塩）
ＶａＨＡ：バレロイル化ヒアルロン酸（塩）
ＳｔＨＡ：ステアロイル化ヒアルロン酸（塩）
【００４７】
４．ヒアルロン酸誘導体の溶解性
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５、ｐＨ７）および精製水に、実施例１〜９および比較例１〜３のヒアルロン酸誘導体を、５ｗｔ％濃度で溶解させ、６０℃で２時間後の溶液状態を観察した。結果を表２に示した。
修飾基にカルボキシル基を持たない比較例２および比較例３のヒアルロン誘導体は水に溶解しなかった。
【００４８】
【表２】
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溶解：透明    不溶：白濁
【００４９】
５．ヒアルロニダーゼによる分解実験
平均分子量９万のヒアルロン酸（以下「ＨＡ」ということがある）、実施例３および比較例１のヒアルロン酸誘導体を、０．１４ＭＰＢＳ(ｐＨ４．５)に２．５ｗｔ％の濃度になるように水に溶解させた。但し、ＨＡは５．０ｗｔ％に調製した。
各水溶液と１０００Ｕ/ｍｌヒアルロニダーゼ０．１４ＭＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液を９:１の割合で混合し、Ｅ型回転粘度計で２５℃における経時的に粘度を測定した。結果を表３に示した。
比較例１のヒアルロン酸誘導体は、水溶性が増加し元のＨＡよりも酵素分解が速くなったが、実施例３のヒアルロン酸誘導体は、ＨＡよりも酵素分解が遅くなった。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
６．疎水性化合物徐放試験
ダナゾール１ｍｇ／ｍｌメタノール溶液（溶液Ａ）、ヒアルロン酸誘導体またはヒアルロン酸の１．５％純水溶液（溶液Ｂ）を調整し、それぞれ３ｍｌずつ混合し激しく攪拌した。溶液Ａと溶液Ｂとの混合液から減圧乾燥によりメタノールを除去した後凍結乾燥を行い、ヒアルロン酸誘導体またはヒアルロン酸とダナゾールとの混合物を得た。この混合物に純水３ｍｌを加え溶液とした後、該溶液０．１ｍｌを透析カセット（ＰＩＥＲＣＥ製：Slide−A-LyzerMWCO:10K）に入れ、３７℃、０．１４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に、１日後および１４日後までに放出されたダナゾール量を測定し、１日後、１４日後までに放出されたダナゾールの放出率を算出した。
【００５２】
【表４】
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