(57)【要約】  【課題】  流路に充填された緩衝剤中で生体サンプルを移動させた際の輸送反応の検出  時に、短時間で正確かつ高感度な検出結果が得られ、取り扱いも容易で且つ小型で軽量  、安価な生体サンプル判別用プレートを提供する。  【解決手段】  濃縮部３０に示すようにサンプル定量部２７から流路１３にかけて徐々  に細くなっている。すなわち、流路断面積がサンプル定量部２７から流路１３に向かっ  て減少する構成となっている。この濃縮部３０においてＤＮＡサンプルは移動しながら  濃縮されていく。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルを緩衝剤中で移動させた際に得られる輸送反応を検出して該生体サンプルの判別を行う生体サンプル判別用プレートにおいて、生体サンプルが流れる第１の流路と、緩衝剤が流れる第２の流路と、前記第１の流路と前記第２の流路との合流部分に一定体積の生体サンプルを保持するサンプル定量部と、を設け、前記サンプル定量部と前記第２の流路との接続部分における流路のうち前記サンプル定量部から前記第２の流路へ前記生体サンプルが流れる流入流路、の流路断面積が前記サンプル定量部からの距離に比例して減少する、ことを特徴とする生体サンプル判別用プレート。
【請求項２】
前記サンプル定量部が複数の部分からなり、前記生体サンプルが前記複数の部分から前記流入流路へ流れる、ことを特徴とする請求項１記載の生体サンプル判別用プレート。
【請求項３】
前記第２の流路が複数の流路からなる、ことを特徴とする請求項２記載の生体サンプル判別用プレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡやタンパクその他の生体サンプルを緩衝剤中で移動させ、その輸送反応を検出して生体サンプルを判別する生体サンプル判別用プレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的な生体サンプルを考えた場合、大きくはＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質が存在している。そして、近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。
【０００３】
ＤＮＡに関しては、現在ＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や副作用をあらかじめ予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。
【０００４】
現在ＳＮＰｓを調べる方法としては、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定方法）が最も一般的に用いられている。そして、前記シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、もっとも一般的に行われているのは、ジデオキシシーケンス法（Ｓａｎｇｅｒ法）である。なお、シーケンシングは、このＳａｎｇｅｒ法を含め何れの方法においても、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、キャピラリー電気泳動によって１塩基の長さの違いを分離・識別する技術が基になって成り立っている。そして、このようなシーケンシングによるＳＮＰｓの解析は、ターゲットとする遺伝子を単離した後、増幅・精製し、遺伝子の塩基配列決定法（装置）を用いて、目的遺伝子の塩基配列を読むことによって行なうものであるため、実験に膨大な作業量と時間、さらには多大のランニングコストを要し、また、その際に使用する塩基配列決定のための自動化装置は、非常に高価で、大きなスペースを占有し、高価な試薬を大量に必要とするという問題を有している。
【０００５】
こうした問題点は、アフィニティキャピラリー電気泳動によってＤＮＡを分離する方法を用いればほぼ解決できる。アフィニティキャピラリー電気泳動は、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力（ＤＮＡとそれを相補するＤＮＡ、ＤＮＡとそのＤＮＡから転写されたＲＮＡ、酵素と基質、抗原と抗体の親和力等）を利用して分離に特異性を持たせるものであり、具体的には、キャピラリー内の泳動溶液に、相互作用する二成分のうちの一方を添加しておき、他方の成分を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じることに着目して分析を行うものである（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
一方、タンパク質は、細胞、組織、生体液中に存在し、生体活動の調節、細胞へのエネルギー供給、重要な物質の合成、生物構造体の維持、さらには細胞間でのコミュニケーションや細胞内情報伝達に関与している。現在では、タンパク質が様々な環境や、相互作用する他のタンパク質の存在、タンパク質が受けた修飾の程度や種類に応じて、複数の機能を有することが明らかになってきている。
【０００７】
タンパク質は、２０種類のアミノ酸が遺伝子の指示（配列情報）により順番につながることでつくられており、その種類は数千万種と言われるが、その遺伝子の配列がわかれば、どのアミノ酸がどういう順番でつながってできているかの情報を得ることができる。生物の遺伝子（ゲノム）から作られるタンパク質の一そろいのセットは、プロテオームと呼ばれるが、ヒトゲノムの塩基配列解読が終わった今、プロテオームの解析が盛んに進められている。
【０００８】
そして、このようなタンパク質の機能解析研究としては、同定やキャラクタリゼーションのみならず、生化学アッセイやタンパク質間相互作用研究、タンパク質ネットワーク、または細胞内外のシグナリング解明なども行っていく必要がある。このタンパク質機能の研究には、多方面の技術が使用され、酵素アッセイ、酵母  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  アッセイ、クロマトグラフィーによる精製、情報ツールとデータベース等があるが、特に、電気泳動によるたんぱく質の判別は重要な手法である。そして、電気泳動のように、キャピラリー内のサンプル、分析物、緩衝材、及び試薬等の液体を移動させた際に得られる輸送反応を検出して、該サンプルの分析、判別、判定等を行う場合の前記液体の輸送及び方向付けに関しては、さまざまな報告がある（例えば、特許文献２〜特許文献５）。
【特許文献１】特開平７−３１１１９８号公報
【特許文献２】特表２０００−５１３８１３号公報
【特許文献３】特表２００１−５２３３４１号公報
【特許文献４】特表２０００−５１４９２８号公報
【特許文献５】特開２００３−２８８８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように生体サンプルの分析においては、キャピラリー電気泳動装置を利用した方法が広く使われている。実際に輸送反応を行なう部分であるキャピラリーは、外形３００ミクロン、内径１００ミクロン程度のガラス管が使用される例が多く、折れにくくするために表面はポリイミド等でコーティングされている。
【００１０】
そして、内部試料を検出する場合は、試料自体もしくは試料に修飾した物質の蛍光や吸光度により行なうためコーティングを焼いたり薬品で溶かすなどして一部剥ぎ取る。
【００１１】
しかしながら、この時、コーティングを剥いだ部分は折れやすくなり取り扱いに十分注意する必要がある。折れた場合はなお危険である。
【００１２】
またキャピラリー内への試料注入は、加圧や吸引、落差法などが用いられるが、時間で制御するためキャピラリー内に存在する緩衝剤の粘度により注入量が異なるという問題がある。
【００１３】
以上のような問題を解決するため最近では、キャピラリーとなる流路を形成した樹脂などのプレートがある。特許文献４、特許文献５に記載の方法では、複数のキャビラリーチャンネルを交差させ、且つ少なくとも３つ電極を設けて、該少なくとも３つ設けられた電極のうちの２つの電極に印加して、前記交差部を通して前記試料を移動させているが、この方法では、流路が交差していることから、試料を電気泳動させる際に試料が薄まる可能性があることから、検出感度が低下するという問題がある。
【００１４】
キャピラリーによる電気泳動においても、試料が注入された時キャピラリー内の緩衝液と拡散し、濃度が落ち検出感度が低下するという問題点がある。
【００１５】
また試料の初期濃度が低い場合は、感度が低下により検出自体が困難となる場合もある。
本発明は、流路に充填された緩衝剤中で生体サンプルを移動させた際の輸送反応の検出時に、短時間で正確かつ高感度な検出結果が得られ、取り扱いも容易で且つ小型で軽量、安価な生体サンプル判別用プレートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記課題を解決するために、本発明の生体サンプル判別用プレートは、生体サンプルを緩衝剤中で移動させた際に得られる輸送反応を検出して該生体サンプルの判別を行う生体サンプル判別用プレートにおいて、生体サンプルが流れる第１の流路と、緩衝剤が流れる第２の流路と、前記第１の流路と前記第２の流路との合流部分に一定体積の生体サンプルを保持するサンプル定量部と、を設け、前記サンプル定量部と前記第２の流路との接続部分における流路のうち前記サンプル定量部から前記第２の流路へ前記生体サンプルが流れる流路、の流路断面積が前記サンプル定量部からの距離に比例して減少することを特徴とする。
【００１７】
これにより、生体サンプル判別用プレートにおいて低濃度の生体サンプルを濃縮させながら輸送反応を行なうことができる。したがって、従来検出不可能であった濃度のサンプルでも本発明による生体サンプル判別プレートを使用することにより検出可能となる。
【００１８】
さらに、前記サンプル定量部が複数の部分からなり、前記生体サンプルが前記複数の部分から前記流入流路へ流れることを特徴とする。
【００１９】
これにより、複数の部分に保持された生体サンプルを濃縮させながら輸送反応を行うことができる。
【００２０】
さらに、前記第２の流路が複数の流路からなることを特徴とする。これにより、緩衝剤が流れる複数の流路に生体サンプルを流して濃縮させながら輸送反応を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（実施例１）
以下、図１〜図７を用いて、本実施例１における生体サンプル判別用プレートについて説明する。
【００２２】
本発明は、生体サンプルを緩衝剤中で移動させて、生物学的、酵素的、免疫学的、及び化学的反応を行い生体サンプルを容易かつ安価に精度よく短時間で判別することを実現するものである。
【００２３】
なお、本実施例１では、説明を具体的にするために、生体サンプルがＤＮＡサンプルで、緩衝剤が分離用ＤＮＡコンジュゲート及びＤＮＡ結合制御剤を含むものであるとし、本生体サンプル判別用プレートが、流路中に充填させた分離用ＤＮＡコンジュゲート中に、定量されたＤＮＡサンプルを添加して電気泳動させ、流路中の蛍光度あるいは吸光度を検出して、ＤＮＡサンプルのＳＮＰｓ（一塩基多型）の有無を判別するものとする。
【００２４】
まず、図１〜図５を用いて、本実施例１における生体サンプル判別用プレートの構成について説明する。
【００２５】
図１は、本実施例１における生体サンプル判別用プレートの流路形成面からみた図である。図２は、本実施例１における生体サンプル判別用プレートの試料注入面からみた図である。
【００２６】
本実施例１における生体サンプル判別用プレート１の外形は８センチ四方の正方形で４角のうち３角はＲが設けられ、残りの１角は他３角と形状を異なるように形成し、更に穴３および４を設けて外形を非対称にして流路パターン（以下、「パターン」という）の場所を特定できるようにしている。材料はアクリル系の樹脂を使用し、外形は４０ｍｍ四方で厚みは２ｍｍである。流路形成面には溝が形成されさらに厚さ５０μｍのアクリル製フィルムを溶着することで密閉流路が形成されている。
【００２７】
生体サンプル判別用プレート１への試料の注入は、ピペッター等によりＤＮＡ注入口７、緩衝剤注入口８から行なう。電圧印加部９および電圧印加部１０は電気泳動を行なわせる電圧を印加する部分である。
【００２８】
図３は、図１に示す生体サンプル判別用プレート１に形成されたパターン２の詳細形状を示す図である。ここで、パターン２は、生体サンプルの判別に用いる微小な幅と深さを持つ溝によって形成された微細な流路からなる。この生体サンプル判別用プレート１には、図３に示すパターン２が８個放射方向に形成されており、同時に８検体のＤＮＡ判別が可能である。
【００２９】
本実施例１における流路の深さは５０μｍで、幅は１００〜３００μｍからなる。
【００３０】
ただし、サンプル注入部１１、緩衝剤注入部１２、サンプルチャンバー部１７、サンプル保持部２０、バッファ部２１およびオーバーフロー部２４は深さ１．５ｍｍであり、サンプル注入口７と緩衝剤注入口８は試料注入面から各試料が注入できるように貫通している。更に、負電極部９と正電極部１０も試料注入面から電圧が印加できるように貫通している。
【００３１】
次に、図３に示すパターンについて説明する。
【００３２】
正電極部１０は正電極の挿入部であり、負電極部９は負電極の挿入部である。これらは流路１３、流路２２およびサンプル定量部１５を介して接続されており、さらには、各電極部ともに流路２５により緩衝剤注入部１２ともそれぞれ接続されている。また緩衝剤注入部１２から充填された緩衝剤が正電極部１０および負電極部９で一定量を超えた場合、オーバーフローにより余分な量を排出するようにオーバーフロー部２４が設けられている。
【００３３】
サンプル保持部２０は、流路１８と流路１９によりサンプルチャンバー部１７と接続されているが、流路１８は細く、流路１９は流路１８に比べ太い。本実施例１では、流路１８の幅が１００μｍに対し、流路１９の幅は２００μｍである。
【００３４】
バッファ部２１は、流路１４、流路１８、流路１９によりサンプルチャンバー部１７、サンプル保持部２０とそれぞれ接続されている。
【００３５】
サンプル定量部１５は流路１３と流路２２との合流部分に設けられており、ＤＮＡサンプルを定量する。
【００３６】
サンプル定量部１５に定量化されたＤＮＡサンプルが、負電極部９と正電極部１０間に電圧を印加することにより緩衝剤で満たされた流路１３中を移動することになる。
【００３７】
サンプル定量部１５と流路１３との関係であるが、サンプル定量部１５から流路１３にかけて徐々に細くなっており、電気泳動した場合ＤＮＡサンプルが濃縮される構造になっている。
【００３８】
そして流路１３中へ濃縮されたＤＮＡサンプルが供給され緩衝剤との結合力の差により正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡの泳動速度に差が生じ高感度なＳＮＰｓの判別が行なえる。
【００３９】
電圧の印加方法については、試料注入面に導電性のフィルムを貼り付け、負電極部９に対して正電極部１０に正電圧を印加する方法や、アクリルやＰＥＴなどのフィルムを試料注入面に貼り付けて先端が鋭利な針状電極により突き破り挿入して電圧を印加する方法などがある。
【００４０】
それでは、以下、前述したＤＮＡサンプルのＳＮＰｓ（一塩基多型）の有無を判別するまでの具体的操作および動作の一例を図３を利用して説明する。
【００４１】
まず、検体となるＤＮＡサンプルを準備する。
【００４２】
本来ＤＮＡは２本鎖の螺旋構造をしたものであるが、本実施例１においては、判別したいＳＮＰｓ部位を含む約６０塩基長の１本鎖ＤＮＡを準備する。
【００４３】
抽出方法や１本鎖化については本発明とは直接関係がないので詳細な説明は省略する。
【００４４】
次に、緩衝剤としてＤＮＡコンジュゲートを準備する。
【００４５】
ＤＮＡコンジュゲートとは、６〜１２塩基長１本鎖ＤＮＡの５’末端に高分子のリニアポリマーが共有結合したものである。さらにＤＮＡは、正常型に対しては相補であるが変異型に対しては相補ではない配列であり、正常型ＤＮＡに対しての結合力が強く、変異型ＤＮＡに対しての結合力が弱い特性がある。また、電気泳動した場合、５’末端に結合したリニアポリマーがおもりとなり泳動速度がかなり遅いという特性もある。
【００４６】
以後に記述する「ＤＮＡコンジュゲート」とは、電解質の役目もするｐＨ緩衝剤およびＭｇＣｌ？などのＤＮＡ結合力制御剤を含んだ物性とする。
【００４７】
試料の準備が終わったところで、ＤＮＡコンジュゲートおよびＤＮＡサンプルをプレート１内へ注入する。ＤＮＡコンジュゲートはピペッター等により定量を緩衝剤注入口８より緩衝剤注入部１２へ分注する。ＤＮＡサンプルも同様に定量をサンプル注入口７よりサンプル注入部１１へ分注する。
【００４８】
分注量としては、パターンのスケールにより異なるが本実施例１においては、ＤＮＡコンジュゲートは１８マイクロリットル、ＤＮＡサンプルは２マイクロリットルとする。
【００４９】
次に、モータ等に生体サンプル判別用プレート１を固定し、プレートの重心である穴３を軸に回転させる。この時、分注されたＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルは、遠心力により外周方向へと移動する。
【００５０】
緩衝剤注入部１２内のＤＮＡコンジュゲートは流路２５による正電極部１２と負電極部１３へ等分され正電極部１２へ移動したＤＮＡコンジュゲートはさらに流路１３を通りサンプル定量部１５まで移動する。負電極部９へ移動したＤＮＡコンジュゲートも同様に流路２２を通りサンプル定量部１５まで移動する。回転開始から２分後のサンプル定量部１５周辺の状態を図４に示す。
【００５１】
ＤＮＡコンジュゲート３１は、図示していないが正電極部１０および負電極部９の７割程度まで充填されており、流路１３および流路２２を満たしている。
【００５２】
この時、ＤＮＡサンプルはサンプルチャンバー部１７とサンプル保持部２０およびそれらをつなぐ流路中に存在している。この時サンプル保持部２０内は、ＤＮＡサンプルが遠心力により注ぎ込まれ、更には空気抜き用の流路や穴がないため大気圧より高い状態で保たれている。
【００５３】
そして、回転を急停止する（例えば、２秒で４０００ｒｐｍより停止まで）。
【００５４】
続いて、図５に示すようにサンプル保持部２０内にあったＤＮＡサンプルが遠心力がなくなることによりサンプル保持部２０内が大気圧になるまで流路１９方向へ逆流し、一部サンプルチャンバー部１７へ、その他はサンプル定量部１５まで到達する。
【００５５】
その時、サンプル定量部１５においてＤＮＡサンプルとＤＮＡコンジュゲートが接触する。このとき、チャンバー部２１へ移動するＤＮＡサンプルも多少存在する。
【００５６】
次に、生体サンプル判別用プレート１を中速にて数秒間もう一度回転させる。そして停止させるが減速を緩やかにすることが重要である。停止後の状態を図６に示す。
【００５７】
サンプル定量部１５に一定量のＤＮＡサンプルを残し、周辺の余分なＤＮＡサンプルが再度サンプル保持部２０やサンプルチャンバー部１７へ戻る。しかしながら停止しても回転速度と停止減速が緩やかなためサンプル定量部１５へ再逆流することはない。
【００５８】
サンプル定量部１５に残存したＤＮＡサンプルは他のＤＮＡサンプルに対して電気的にも絶縁された状態である。
【００５９】
以上の動作で、サンプル定量部１５に残存したサンプルＤＮＡがＳＮＰｓの判別を行なう最終試料となる。
【００６０】
次に、電気泳動を行なう。電気泳動は、正電極部１０に正電極、負電極部９に負電極を挿入し、数百Ｖの電圧を印加する。すると、流路１３、流路２２さらにはサンプル定量部１５において電界が発生し、サンプル定量部１５に一定量残存したＤＮＡサンプルは、流路１３中を正電極側（図６中、Ａ方向）へ泳動する。
【００６１】
この時、図６中の濃縮部３０に示すようにサンプル定量部２７から流路１３にかけて徐々に細くなっている。すなわち、流路断面積がサンプル定量部２７から流路１３に向かって減少する構成となっている。この濃縮部３０においてＤＮＡサンプルは移動しながら濃縮されていくのである。
【００６２】
濃縮されていく状態を図７の（１）〜（３）に示す。
【００６３】
図７は電気泳動開始初期の状態で、（１）は電圧印加１０秒後、（２）は２０秒後、（３）は３０秒後のＤＮＡサンプル２８の状態である。徐々にＤＮＡサンプル２８が流路１３へ移動する様子がわかる。ある体積の部分からＤＮＡサンプルのみが狭い流路へ移動するため濃縮される現象が起きる。つまり検出が困難なほどの低濃度のＤＮＡサンプルであっても流路１３へ達したときは、濃縮され検出が容易になる。
【００６４】
そして流路１３中にはＤＮＡコンジュゲートが充填されており、濃縮されたＤＮＡサンプルはＤＮＡコンジュゲートとの結合を繰り返しながら電気泳動する。この時、上述したようにＤＮＡサンプル中の正常型ＤＮＡはＤＮＡコンジュゲートとの結合力が強いため泳動速度が遅くなり、変異型ＤＮＡは結合力が弱いため正常型に比べ泳動速度は速くなる。つまりＤＮＡサンプル中に正常型、変異型両方が存在した場合は、正常型のＤＮＡと変異型のＤＮＡが分離していくこととなり、ＳＮＰｓの判別が行なえる。
【００６５】
ＤＮＡの検出は、蛍光標識（ＦＩＴＣ）を修飾したＤＮＡを４７０ｎｍの光で励起し、５２０ｎｍ付近の光検出により行なった。ＤＮＡの検出は、２６０ｎｍの吸光度により行なってもよい。
【００６６】
以上のように、本実施例１によれば、生体サンプル判別用プレート１上においてサンプル定量部１５から泳動流路１３にかけて濃縮部３０をもうけた。そして回転動作のみによってサンプル定量部１５にＤＮＡサンプルを一定量保持し、正電極部１２と負電極部１３と流路１３によって電気泳動できるような構成とした。さらには、電気泳動する流路１４を円弧状としたことで、細胞や血液等から特定のＤＮＡを取り出したＤＮＡサンプルを本生体サンプル判別用プレートにおいて測定する際に、濃度の低いＤＮＡサンプルであっても極めて高感度な検出結果を得ることが可能となる。
（実施例２）
以下、図８〜図１１を用いて、本実施例２における生体サンプル判別用プレートについて説明する。
【００６７】
本発明は、生体サンプルを緩衝剤中で移動させて、生物学的、酵素的、免疫学的、及び化学的反応を行い生体サンプルを容易かつ安価に精度よく短時間で判別することを実現するものである。
【００６８】
なお、本実施例２でも、実施例１と同様の原理を用いてＤＮＡサンプルのＳＮＰｓ（一塩基多型）の有無を判別するものとする。
【００６９】
図８は、本実施例２における生体サンプル判別用プレートの流路形成面からみた図であり、本実施例２における生体サンプル判別用プレート４１の構成について説明する。
【００７０】
本実施例２における生体サンプル判別用プレート４１の外形は、３０ｍｍ×５０ｍｍで厚さは２ｍｍである。生体サンプルが流れる流路４５、緩衝剤が流れる流路４６が形成された面には更に厚さ５０μｍの透明フィルムが溶着されている。
【００７１】
バッファ部４１〜４４は全て貫通穴であり片面のみ上述したフィルムにより密閉されている。
【００７２】
流路４５によりバッファ部４３とバッファ部４４が接続され、流路４６によりバッファ部４１とバッファ部４２が接続されている。更に流路４５と流路４６は中点にて交差している。
【００７３】
本実施例における流路の深さは５０μｍで、幅は１００〜３００μｍからなる。
【００７４】
交差した部分でサンプルを定量化するサンプル定量部４７が形成されており、サンプル定量部４７周辺の拡大図を図９に示す。
【００７５】
図９は、本実施例２における生体サンプル判別用プレートのサンプル定量部周辺の拡大図である。
【００７６】
５０（ａ）、５０（ｂ）、５０（ｃ）が流路４５と流路４６との交点であり、流路４６が交点付近で３つの流路に分かれているため３箇所存在する。
【００７７】
それでは、本実施例２における生体サンプル判別用プレート４１においてＳＮＰｓ分離実験の手順および動作を図１０（１）〜（３）、図１１を利用し具体的に説明する。
【００７８】
図１０（１）〜（３）、図１１は、本実施例２の生体サンプル判別用プレートにおいて電気泳動を開始した後のＤＮＡサンプルの移動状態を示したサンプル定量部周辺の拡大図である。
【００７９】
実施例１と同様にＤＮＡサンプル、ＤＮＡコンジュゲートを準備した後、ＤＮＡコンジュゲートをバッファ部４２より流路４５、４６へ充填する。充填方法としては加圧などを用いるとよい。次にＤＮＡサンプルをバッファ部４４に注入し、バッファ部４３およびバッファ部４１へＤＮＡコンジュゲートを注入する。以上で試料の充填は完了である。
【００８０】
この時のサンプル定量部４７周辺の状態が図１０（１）である。
【００８１】
流路全体へＤＮＡコンジュゲート５１が充填されているのがわかる。
【００８２】
次にバッファ部４４に対してバッファ部４３へ正電位を印加する。ＤＮＡは負に帯電しているため流路４５中を正電位であるバッファ部４３の方向（Ｂ方向）へ電気泳動する。
【００８３】
４００Ｖで３分間電圧を印加した後のサンプル定量部４７周辺の状態が図１０（２）である。
【００８４】
そして一旦上述した電圧印加を停止し、改めてバッファ部４２に対してバッファ部４１、４３、４４に負電位を印加する。すると図１０（３）に示すように流路４５と流路４６との交点付近のＤＮＡサンプル５３（ａ）、５３（ｂ）、５３（ｃ）が流路４６をバッファ部４２方向（Ｃ方向）へと電気泳動する。
【００８５】
更に電気泳動すると流路４６が３本から１本へ収束する部分があり、そこでＤＮＡサンプル５３（ａ）、５３（ｂ）、５３（ｃ）が交わる。この時の状態が図１１であり、図１１中のＤＮＡサンプル５３の濃度は図１０（３）中のＤＮＡサンプル５３（ａ）、５３（ｂ）、５３（ｃ）それぞれに比べはるかに高くなる。
【００８６】
そして更に電気泳動することで流路４６中の緩衝液と反応し正常型と変異型のＤＮＡが
分離する。分離したＤＮＡサンプルは検出部４８に達した時に検出されることになる。
【００８７】
以上のように、本実施例２によれば、泳動するＤＮＡサンプルは、定量部を複数個設けることで電気泳動中に濃縮されるので、検出を高感度で行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の生体サンプル判別用プレートは、ＤＮＡサンプル等の生体サンプルの判別を、安価で、且つ簡便に行えるようにするものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別用プレートのパターン形成面を示す図
【図２】本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別用プレートの試料注入面を示す図
【図３】本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別用プレートに形成されるパターンを示す図
【図４】本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別用プレートにＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルを充填し、４０００ｒｐｍにて回転中の各試料の状態を示した図
【図５】本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別用プレートにＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルを充填し、４０００ｒｐｍにて回転後、急停止したときの各試料の状態を示した図
【図６】本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別用プレートにＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルを充填し、４０００ｒｐｍにて回転停止後、再回転した直後の各試料の状態を示した図
【図７】本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別用プレートに形成されたサンプル定量部にＤＮＡサンプルが充填されて、該ＤＮＡサンプルが第１の流路に充填された分離用ＤＮＡコンジュゲート中を移動していく様子を示す図
【図８】本発明の実施例２にかかる生体サンプル判別用プレートの流路形成面からみた図
【図９】本発明の実施例２にかかる生体サンプル判別用プレートのサンプル定量部周辺の拡大図
【図１０】本発明の実施例２の生体サンプル判別用プレートにおいて電気泳動を開始した後のＤＮＡサンプルの移動状態を示したサンプル定量部周辺の拡大図
【図１１】本発明の実施例２の生体サンプル判別用プレートにおいて電気泳動を開始した後のＤＮＡサンプルの移動状態を示したサンプル定量部周辺の拡大図
【符号の説明】
【００９０】
１    生体サンプル判別用プレート
２    パターン
３    回転部固定用穴
４    位置決め穴
５    サンプル定量部
６    試料注入口
７    サンプル注入口
８    緩衝剤注入口
９    負電極部
１０  正電極部
１１  サンプル注入部
１２  緩衝剤注入部
１３  流路
１５  サンプル定量部
１７  サンプルチャンバー部
１８  流路
１９  流路
２０  サンプル保持部
２１  バッファ部
２２  流路
２４  オーバーフロー部
２５  流路
２７  サンプル定量部
２８  ＤＮＡサンプル
３０  濃縮部
３１  円弧部分
４０  プレート
４１  バッファ部
４２  バッファ部
４３  バッファ部
４４  バッファ部
４５  流路
４６  流路
４７  定量部
４８  検出部
５０（ａ）  定量部
５０（ｂ）  定量部
５０（ｃ）  定量部
Ａ  泳動方向
Ｂ  泳動方向
Ｃ  泳動方向
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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