(57)【要約】      （修正有）【課題】  自然環境などより得られた被検試料から、目的の機能を有する微生物群を簡便に効率よく取得し、取得した微生物から、目的機能を有する遺伝子を取得する方法を提供することを目的とするものである。【解決手段】  被検試料から機能性遺伝子を取得する方法であって、当該被検試料中に含まれる微生物群を、フローサイトメトリーにより複数群に分離する工程、分離した群から目的機能を有する微生物を含む群を特定する工程、特定した群から、目的機能を有する遺伝子を抽出し、回収する工程を含むことを特徴とする機能性遺伝子取得方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料から機能性遺伝子を取得する方法であって、
当該被検試料中に含まれる微生物群を、フローサイトメトリーにより複数群に分離する工程（以下、「分離工程」という）、
分離した群から目的機能を有する微生物を含む群を特定する工程（以下、「特定工程」という）、および
特定した微生物群から、目的機能を有する遺伝子を抽出し、回収する工程
を含むことを特徴とする機能性遺伝子取得方法。
【請求項２】
上記分離工程および／または特定工程を、少なくとも２回以上行う請求項１に記載の機能性遺伝子取得方法。
【請求項３】
目的機能を有する微生物を含む群の特定を、特定化合物を含む培地での培養により行う請求項１または２に記載の機能性遺伝子取得方法。
【請求項４】
酵素をコードする遺伝子を得るためのものである請求項１〜３のいずれかに記載の機能性遺伝子取得方法。
【請求項５】
目的機能を有する微生物を含む群の特定を、特定化合物に対する酵素活性を指標として行う請求項４に記載の機能性遺伝子取得方法。
【請求項６】
上記酵素が、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）分解酵素である請求項４または５のいずれかに記載の機能性遺伝子取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然環境などから産業上有用な遺伝子を取得する方法に関するものであり、特に、微生物を分取することによって目的機能を有する遺伝子を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、海水、土壌、バイオフィルムから人間の口腔や皮膚に至るまで、様々な自然環境中の微生物から、直接、産業上有用な遺伝子を取得する試みがなされている。例えば、既知遺伝子を利用して有用遺伝子に特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲにより増幅して遺伝子を得る方法がある。
【０００３】
しかし、プライマーが目的とする遺伝子以外の遺伝子と相互作用し得ることから、目的遺伝子と配列は類似するが、目的機能を有しないものが得られてしまう可能性がある。また、この方法では新規な遺伝子の取得は困難である。さらに、自然環境中から培養を経ないで直接取得された微生物の遺伝子は「メタゲノム」と呼ばれており、自然環境中に含まれる微生物やその遺伝子は多種多様である。よって、採取した試料中には目的の機能を有する遺伝子が少量しか含まれていない場合があり、単にランダムスクリーニングを行っても効率的ではない。
【０００４】
その他の方法としては、採取した試料中の微生物の集積培養を繰り返すことによって、目的機能を有する遺伝子を含む微生物を増殖させるものがある。しかし、この方法は微生物の生育速度に大きな影響を受け、コロニーを作らないなど増殖能に劣る微生物由来の遺伝子は得られない。
【０００５】
そこで、微生物を培養することなく効率的に目的遺伝子を取得する方法が開発されてきた。
【０００６】
例えば、特許文献１には、ゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を用いて土壌から培養困難な状態の微生物（ＶＢＮＣ状微生物）を取得し、得られた微生物をカタラーゼ添加法により培養し、新規微生物および遺伝子を取得する技術が開示されている。
【０００７】
しかし、この技術では、アガロースゲル微小粒子（ゲルマイクロドロップ）で微生物を包括し、フローサイトメトリーによって細胞を分取し、得られた細胞をカタラーゼにより培養する必要があるため、工程が極めて煩雑であり、微生物の取得に長時間を要する。
【０００８】
また、自然環境中から微生物を検出または取得する方法として、特許文献２には、自然環境試料に含まれる微生物をビーズに吸着させた後、フローサイトメトリーにより検出する技術が記載されている。さらに、特許文献３には、静圧下で蛍光色素を自然環境試料中の微生物に吸着させ、フローサイトメトリーにより微生物を検出する技術が、特許文献４には、蛍光色素を用いず、レーザー光の照射による錯乱光によってフローサイトメトリーを用いて目的微生物を取得する技術が夫々開示されている。
【０００９】
しかし、これら特許文献２〜４の技術では、遺伝子を取得する方法は、何ら開示されていない。さらに特許文献２の技術では、抗体を介して微生物をビーズに吸着する必要があるため、極めて煩雑である。また、特許文献３の技術は、フローサイトメトリーでの検出感度を上げる方法であり、静水圧を必要とする工程は加圧設備が必要となり煩雑である。そして、特許文献４の技術では、取得できる微生物が限られるうえ、類似の微生物同士の分離は困難である。
【特許文献１】特開２００４−８６１０６号公報
【特許文献２】特開２００２−１８１８２３号公報
【特許文献３】特開２０００−６９９９５号公報
【特許文献４】特開２００３−３０４８６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、自然環境等由来の試料から、目的の機能を有する微生物群を簡便に効率よく取得し、取得した微生物群から、目的機能を有する遺伝子を取得する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、フローサイトメトリーを用いることによって、被検試料中の微生物から、目的の機能を有する遺伝子を効率的に取得し得ることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
即ち、本発明の機能性遺伝子取得方法は、被検試料から機能性遺伝子を取得する方法であって、当該被検試料中に含まれる微生物群を、フローサイトメトリーにより複数群に分離する工程（以下、「分離工程」という）、分離した群から目的機能を有する微生物を含む群を特定する工程（以下、「特定工程」という）、および特定した微生物群から、目的機能を有する遺伝子を抽出し、回収する工程（以下、「回収工程」という）を含むことを特徴とする。
【００１３】
上記機能性遺伝子取得方法においては、上記分離工程および／または特定工程を、少なくとも２回以上行うことが好適な場合がある。例えば、試料中での目的遺伝子の存在比が小さい場合などに、目的遺伝子を有する微生物の濃度を高めることによって、目的遺伝子の取得をより一層効率的にできるからである。
【００１４】
上記機能性遺伝子取得方法は、酵素をコードする遺伝子を得るために用いることが好ましい。自然環境中の有害物質等を分解し得る遺伝子などを得ることができるからである。
【００１５】
有用な遺伝子が得られるという観点から、目的機能を有する微生物を含む群の特定を、上記特定化合物に対する酵素活性を指標として行うことが好ましい。また、上記酵素が、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）分解酵素であることが好ましい。当該分解酵素をコードする遺伝子は、近年、環境汚染物質として問題となっているＰＣＥの処理において、非常に有用である。
【００１６】
また、目的機能を有する微生物を含む群の特定を、特定化合物を含む培地での培養により行うことが好ましい。かかる培養により、例えば、特定化合物の酵素といった機能を有する微生物群および遺伝子を特定し易くなる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の機能性遺伝子取得方法により、自然環境などから得られる被検試料より、目的機能を有する微生物を従来より簡便で高効率に取得し、取得した微生物から目的の遺伝子を取得することができる。従って、試料中に目的遺伝子を有する微生物が少量しか存在しない場合でも、目的遺伝子を高効率に取得することが可能となる。また、これまで取得できなかったような新規遺伝子の取得も可能となることから、本発明方法は、自然科学分野における新規有用遺伝子の研究開発の促進に大きく寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の機能性遺伝子取得方法は、被検試料から機能性遺伝子を取得する方法であって、当該被検試料中に含まれる微生物群を、フローサイトメトリーにより複数群に分離する工程（以下、「分離工程」という）、分離した群から目的機能を有する微生物を含む群を特定する工程（以下、「特定工程」という）、および特定した微生物群から、目的機能を有する遺伝子を抽出し、回収する工程（以下、「回収工程」という）を含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明の製造方法に関して、以下、工程ごとに説明する。
【００２０】
＜分離工程＞
本発明方法において、分離工程とは、被検試料に含まれる微生物を、フローサイトメトリーにより複数の微生物群に分離する工程である。
【００２１】
被検試料は、主に自然環境から得る。ここで自然環境とは、土壌、泥、河水、沼水、湖水、海水、植物、動物などの温和な生育環境、または深海、深地下、高温多湿地帯、極寒地、火山地、強酸性地、強塩基性地、高塩地、乾燥地および腐敗などにより小数の微生物種が大量に存在する天然環境等の極端な環境を意味する。その他、病院や工場等における空気、活性汚泥および排水、風味付け、果汁等の食品加工産業原料、更に金属表面等の人工的環境、または人間の口腔や皮膚、細胞組織、体内環境からも得ることができる。これら被検試料は、種類に応じて適切な事前処理をしてもよい。
【００２２】
この自然環境中に含まれる微生物群を、フローサイトメトリーを用いて、複数の微生物群に分離する。
【００２３】
フローサイトメトリーは、微生物細胞を浮遊液にし、高速でフローセル中を通過させ、工学的な手法によって細胞の測定および解析を行う方法である。例えば、蛍光色素によって試料を染色し、染色された試料が微細管を通過する過程で発する蛍光を高感度検出器によって測定し、解析する。即ち、フローセルに被検液を流しながらこれに励起光を照射し、流動する被検液中で発せられる蛍光を受光検出する方法が挙げられる。
【００２４】
このように、被検試料を蛍光色素で染色し、フローサイトメーターにより測定および解析を行うことができる。この解析結果によって、例えば、蛍光強度と細胞の大きさに基づいて複数のカテゴリー（本明細書では「リージョン（Ｒｅｇｅｏｎ）」とも称する）に分類され、それぞれのカテゴリーに属する微生物を含む群（以下、「微生物群」という場合がある）に分離することができる。
【００２５】
上記分離工程は、１回あるいは２回以上行ってもよく、特に限定されない。また、連続して分離工程を行っても、後述する特定工程を行った後、再び分離工程を行ってもよく特に限定されない。
【００２６】
上記蛍光色素としては、フローサイトメーターで検出できるものであれば、特に限定されないが、例えば、フィコエリスリン（ＰＥ）、エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド、ヘキスト３３２５８／３３３４２、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、クロモマイシン、ミトラマイシン、オリボマシシン、パイロニンＹ、チアゾールオレンジ、ＦＩＴＣ、ローダミン１０１、イソチオシアネート、ＢＣＥＣＦ、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、Ｃ．ＳＮＡＲＦ−１、Ｃ．ＳＮＡＲＦ−１−ＡＭＡ、エクオリン、Ｉｎｄｏ−１、Ｉｎｄｏ−１−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ、Ｆｕｒａ−２、Ｆｕｒａ−２−ＡＭ、オキソノール、ローダミン１２３、１０−Ｎ−ノニ−アクリジンオレンジ、フルオレセイン、フルオレセインジアセテート、カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）、カルボキシフルオレセインジアセテート（ＣＦＤＡ）、カルボキシジクロロフルオレセインジアセテート（ＣＤＣＦＤＡ）などを用いることができる。
【００２７】
＜特定工程＞
本発明方法において、特定工程とは、上記分離工程で分離した微生物群から目的機能を有する微生物を含む群を特定する工程である。
【００２８】
上記「特定」するとは、上記分離工程で得られた各カテゴリーのうち目的とする機能を有する微生物群を他の微生物群と識別し、分取することを意味する。目的とする機能を特定する方法としては、特に限定されないが、例えば、特定化合物に対する酵素活性を指標とすることができる。特定化合物に対する有用な機能を検出し得るからである。また、目的とする機能を特定する方法としては、抗原抗体反応などの当業者に公知な方法を用いて、各カテゴリーの微生物群が有する機能を特定することができ、特に限定されないが、例えば、各カテゴリーで得られた微生物群を、特定化合物を含む培地で夫々培養することにより特定することが好ましい。当該培地で培養することにより、特定化合物に対する耐性あるいは酵素活性などを評価することができる。例えば、上記指標と培養法を用いれば、培地で特定化合物を分解できる微生物群は、該特定化合物の分解酵素として有用機能を有する可能性がある。
【００２９】
上記特定化合物としては、当業者に公知のあらゆる化合物を用いることができ、特に限定されないが、例えば、環境有害物質、病原菌、再生医療用細胞などに由来する化合物を用いることができる。このうち、環境有害物質を用いることが好ましく、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）を用いることがより好ましい。ＰＣＥに対する機能として、ＰＣＥ脱塩素化（ＰＣＥ分解）作用を有すれば、ＰＣＥにより汚染された土壌や地下水の浄化が可能となるからである。
【００３０】
上記特定工程により、目的機能を有する微生物群を高濃度に含むリージョンを識別し、該リージョンから該微生物群を分取することができる。
【００３１】
上記特定工程は、１回あるいは２回以上行ってもよく、特に限定されない。つまり、特定工程を行った後、上述した分離工程を再度行い、その後、再び特定工程を行ってもよく、特に限定されない。また、上記特定工程は、例えば、１つの特定化合物を含む培地で特定後、更に異なる特定化合物を含む培地で特定するという様に、複数の特定方法を用いて特定を行ってよく、特に限定されない。
【００３２】
本発明方法では、上記分離工程および／または特定工程を、少なくとも２回以上繰り返すことが好適な場合がある。このように繰り返すことにより、目的機能を有する微生物群をより高濃度に分取することが可能となる場合があるからである。
【００３３】
このような態様として、例えば、以下の順に行う様に構成される方法を挙げることができるが、かかる態様に限定されるものではない。
１）分離工程、分離工程、特定工程
２）分離工程、特定工程、分離工程、特定工程
３）分離工程、分離工程、特定工程、分離工程、特定工程
【００３４】
また、上記実施態様において、例えば、分離工程あるいは特定工程を更に連続して行うことも、更に追加することも、必要に応じて適宜行うことができる。また、上記態様以外にも、必要に応じて分離工程と特定工程を適宜組合せて実施することは、本発明方法の技術的範囲に当然含まれる。
【００３５】
＜回収工程＞
本発明方法において、回収工程とは、特定した微生物群から、目的機能を有する遺伝子を抽出し、回収する工程である。
【００３６】
微生物が有する機能の発現は、微生物中の遺伝子に支配されるため、上記特定した微生物群から、遺伝子を取得することは、極めて有用であり、当該遺伝子の塩基配列のうち、機能の中心となる遺伝子部分を増殖することが可能となる。
【００３７】
そこで、上記特定工程により分取した目的機能を有する微生物群から、目的機能を有する遺伝子を抽出し、回収する。
【００３８】
上記遺伝子の抽出方法は、当業者に公知ないかなる方法も用いることができ、特に限定されないが、例えば、プロテアーゼを用いた溶菌法により行うことが好ましい。プロテアーゼにより微生物の細胞壁や細胞膜を破壊でき、遺伝子の抽出をより容易に行うことが可能となる。
【００３９】
このように抽出した遺伝子は、検出感度向上のため、増幅しておくことが好ましい。増幅方法としては、例えば、上記抽出した遺伝子ＤＮＡを鋳型として、センスプライマー、アンチセンスプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼなどを用いて増幅するＰＣＲにより行うことができる。
【００４０】
さらに、例えば、増幅した遺伝子を用いてゲノムライブラリーを構築し、目的とする塩基配列を有する遺伝子を制限酵素により切断し、ベクターへ組み込んだ後、宿主細胞に入れ、目的遺伝子を増殖することにより、目的機能を有する遺伝子をコードする遺伝子を大量に取得することができる。
【００４１】
従って、上記特定工程と相俟って、自然環境などからの試料中に微生物が少量しか含まれていない場合でも、目的遺伝子を大量に取得することができる。
【００４２】
このような本発明方法は、特定化合物に対する有用な機能をコードする遺伝子を得ることができるが、このうち、酵素をコードする遺伝子を得るためのものであることが好ましく、例えば、上述した如く、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）分解酵素をコードする遺伝子を得るためのものであることがより好ましい。
【００４３】
また、本発明方法では、少量の微生物から目的遺伝子を大量に得ることができるため、当業者に公知の例えばランダムスクリーニング法などにより、新規な有用機能を探索することが可能となり、新規有用遺伝子の開発研究に大きく寄与することも可能となる。
【００４４】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、下記実施例によって限定されるものではなく、前・後記の趣旨に適合しうる範囲で適宜変更して実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【実施例】
【００４５】
実施例１
ＰＣＥ脱塩素化細菌として知られているＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌のＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５７３）をモデル微生物として選択して、フローサイトメトリーを用いた微生物群の特定を行った。
【００４６】
＜培地作成条件および培養条方法＞
先ず、ＰＣＥ分解菌を培養するための培地を、以下に示す通り調製した。表１の成分を水に溶解し、１Ｎ  ＫＯＨ水溶液でｐＨを７．２に調整し、更に水を添加して５００ｍＬにメスアップしたものを、２０％ＣＯ2−８０％Ｎ2ガスで液相パージした後、オートクレーブ滅菌した。
【００４７】
【表１】
2006271336.tif 000002
【００４８】
表１中、微量元素溶液は、表２に示す組成を有する。因みに、成分中ＦｅＣｌ2・４Ｈ2Ｏ溶解し難かったため、先ず、塩酸に溶解させた後に蒸留水を加え、更に他の成分を加えて均一溶液とした。
【００４９】
【表２】
2006271336.tif 000003
【００５０】
また、表１中のビタミン溶液は、表３に示す組成からなる均一溶液を２００ｍＬにメスアップした後、フィルター滅菌したものを用いた。
【００５１】
【表３】
2006271336.tif 000004
【００５２】
次に、別途表４に示す溶液を調製して滅菌後、嫌気的に混合した。さらに、滅菌した嫌気水（Ｎ2置換）を加えて約１Ｌに調整した。
【００５３】
【表４】
2006271336.tif 000005
【００５４】
表４中、１ｍＭセレン−タングステン溶液は、表５に示す組成からなる溶液を用いた。
【００５５】
【表５】
2006271336.tif 000006
【００５６】
上記液体培地１８ｍＬを、２５ｍＬ容量のバイアル瓶へ嫌気的に分注した。ここへ、大根畑土壌に由来するＰＣＥ脱塩素機能を有する微生物を含む微生物群（ＰＣＥ脱塩素化微生物群）を接種した後、エタノールで溶解したＰＣＥを５０ｐｐｍとなる様に添加し、バイアル瓶をテフロンコートされたブチルゴム栓を介してアルミシールで密閉して３０℃、１５０ｒｐｍで５週間振とう培養を行い、ＫＢＣ−１株微生物群を培養した。
【００５７】
上記培養後のＫＢＣ−１株微生物群を含む培地を用いて、フローサイトメトリーによる解析を行った。詳しくは、上記培養液に、生細胞検出用の蛍光色素であるＣＦＤＡを最終濃度が１ｍＭとなるように添加し、３０℃で３０分間保温・染色した。染色後の微生物細胞を適当に希釈し、フローサイトメーター（ベックマンコールター社、ＦＰＩＣＳ  ＡＬＴＲＡ）を用いて解析し、縦軸をＣＦＤＡの蛍光強度、横軸を細胞の大きさとしたサイトグラムを作製した（図１（１））。細胞群集を蛍光強度と大きさに基づいてＡ〜Ｅの５種類のリージョンに分類した。
【００５８】
得られた各リージョン中のＫＢＣ−１株微生物群を、ＰＣＥ脱塩素化能を調べることにより同定したところ、ＫＢＣ−１株微生物群は、リージョンＡに集積することがわかった。また、試料中全微生物に対するリージョンＡの微生物群の存在比から、フローサイトメトリーによる分離前のＫＢＣ−１株微生物群の存在率は約０．１％であることがわかった。
【００５９】
更に、リージョンＡから１０個の細胞を分取し、培養し、再びフローサイトメーターにより解析し、サイトグラムを作製したところ、ＫＢＣ−１株微生物群を含むリージョンが特定された（図１（２））。
【００６０】
このリージョン中のＫＢＣ−１株微生物群は、図１（２）で示された全微生物の約３０％であり、上記図１（１）でのリージョンＡの存在比と比べ、フローサイトメトリーにより、はるかに濃縮されていることがわかる。また、フローサイトメトリーによって、１０種類以下の微生物群に絞り込むことができた。
【００６１】
上記実施例１では、モデル化合物を用いたため、予め培養を行ったが、自然環境中からの試料を用いてフローサイトメトリーにより微生物群を分取し、ＰＣＥを含む培地で培養することによって、ＰＣＥ脱塩素化活性に有用な遺伝子を含む微生物群を高効率に取得することができることが示された。
【００６２】
実施例２
ＰＣＥをｃｉｓ−ＤＣＥまで脱塩素化する微生物であるＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＫＢＣ７６株を用いて、フローサイトメトリーによる微生物群および遺伝子の特定を行った。
【００６３】
２５ｍＬのバイアル瓶に、実施例１で用いた５ｍＬの液体培地を分注し、ＫＢＣ７６株微生物群を含むＰＣＥで汚染された土壌（８ｇ）を添加した。
【００６４】
上記ＫＢＣ７６株微生物群を含む培地を用いて、実施例１と同様にして、フローサイトメトリーによる解析を行い、サイトグラムを作製し（図２（１））、Ａ〜Ｄの４種類のリージョンに分類した。各リージョン中のＫＢＣ７６株微生物群を、ＰＣＥ脱塩素化能を調べることにより同定したところ、リージョンＣに集積することがわかった。リージョンＣから、細胞を分取し、再度フローサイトリーにより解析し、サイトグラムを作製した（図２（２））。この結果、フローサイトメトリーによりＫＢＣ７６株微生物群を含むリージョンが特定され、１００種類以下の微生物群に絞り込むことができることがわかった。
【００６５】
更に、フローサイトメトリーによる分離前のサンプル（以下、分離前サンプル）と、フローサイトメトリーによって得られた微生物群から（以下、分離後サンプル）、ＰＣＥ脱塩化活性を有する遺伝子（以下、ＰＣＥ分解遺伝子）をそれぞれ抽出し、ＫＢＣ７６株が有する脱塩素化（デハロゲナーゼ）遺伝子を特異的に検出することができる下記プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、以下に示す。
【００６６】
＜ＤＮＡの抽出方法＞
ＤＮＡ抽出は、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製のＦａｓｔＤＮＡ  ＳＰＩＮｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ）を用いて行った。
【００６７】
＜ＰＣＲ条件＞
上記キットで得られたＤＮＡを鋳型とし、下記の条件でＰＣＲを行った。
（１）プライマー
ＫＢＣ７６株のデハロゲナーゼ遺伝子検出用プライマー：配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
（２）ＰＣＲ反応液（１００μＬ中）
１×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆ．
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2
０．２μＭ  上記２種類のプライマー
０．２５Ｕ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）
１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）段階希釈ＤＮＡ溶液
（３）ＰＣＲ増幅装置：Ｇｅｎｅａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステムズ）
（４）ＰＣＲサイクル
９４℃×５分を行った後、９４℃×３０秒、５３℃×３０秒、７２℃×３０秒を３０サイクル行い、さらに７２℃×７分の工程を行った後、４℃で保存した。
【００６８】
ＰＣＲの増幅結果を、各希釈率における遺伝子の存在の有無として、表６に示す。評価方法は、○：遺伝子を検出できた、×：遺伝子を検出できなかった、とした。
【００６９】
【表６】
2006271336.tif 000007
【００７０】
この結果、分離前サンプルと分離後サンプルとでは、ＰＣＲ増幅産物であるプライマー由来の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ遺伝子が同じ希釈率で検出され、両者でＰＣＲ増幅（微生物数）は同程度とみなすことができる。ＰＣＥ分解遺伝子をコードする遺伝子を検出した結果、分離前サンプルでは、希釈率１０1までしか検出することができなかったのに対し、分離後サンプルでは、希釈率１０4まで検出することができた。
【００７１】
この結果、自然環境中の試料からＰＣＥ分解機能を有する遺伝子を取得できることがわかった。また、試料中に目的微生物が少ない場合でも、目的遺伝子を高効率に取得することができることがわかった。
【００７２】
従って、本発明方法により、自然環境中の試料から高効率に目的遺伝子を取得することができ、また、従来では取得することが困難であった微量の微生物群に含まれる遺伝子を取得することも可能となり、新規有用遺伝子の取得に繋がる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】実施例１のフローサイトメトリーの解析結果を表すサイトグラム。
【図２】実施例２のフローサイトメトリーの解析結果を表すサイトグラム。
【図１】
2006271336.tif 000008
【図２】
2006271336.tif 000009
【配列表】
2006271336000001.app