(57)【要約】      （修正有）【課題】高度不飽和脂肪酸をより多い割合で含むワックスエステルを提供する。【解決手段】高級アルコール及び高度不飽和脂肪酸にリパーゼを作用させて、高度不飽和ワックスエステルを製造する方法であって、ムコール属由来のリパーゼ、シュードモナス属由来のリパーゼ及びバークホルデリア属由来のリパーゼからなる群より選択されるリパーゼを用いることを特徴とする、高度不飽和ワックスエステルの製造方法を提供する。また、上記製造方法により得られた高度不飽和ワックスエステルを含む化粧品、医薬品及び医薬部外品を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高級アルコール及び高度不飽和脂肪酸にリパーゼを作用させて、高度不飽和ワックスエステルを製造する方法であって、ムコール属由来のリパーゼ、シュードモナス属由来のリパーゼ及びバークホルデリア属由来のリパーゼからなる群より選択されるリパーゼを用いることを特徴とする、高度不飽和ワックスエステルの製造方法。
【請求項２】
該高度不飽和脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、オクタデカテトラエン酸、オクタデカペンタエン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸もしくはドコサヘキサエン酸、又はホタテガイ中腸腺脂質、マグロ眼窩油、カツオ頭部油もしくはカツオ内臓油由来の高度不飽和脂肪酸である、請求項１に記載の高度不飽和ワックスエステルの製造方法。
【請求項３】
該リパーゼが、ムコール・ミーハイ（Mucor miehei）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、バークホルデリア・セパシア PS（Burkholderia cepacia PS）、バークホルデリア・セパシア PSC1（Burkholderia cepacia PSC1）、バークホルデリア・セパシア PSC2（Burkholderia cepacia PSC2）又はバークホルデリア・セパシア PSD1（Burkholderia cepacia PSD1）由来のリパーゼである、請求項１に記載の高度不飽和ワックスエステルの製造方法。
【請求項４】
該リパーゼを、有機溶剤又はトリス塩酸-カルシウム溶液の存在下で作用させる、請求項１に記載の高度不飽和ワックスエステルの製造方法。
【請求項５】
該高級アルコールが、不飽和高級アルコールを主成分とする高級アルコールである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の高度不飽和ワックスエステルの製造方法。
【請求項６】
該高級アルコールが、イトヒキダラ肝油、オレンジラッフィー油、ハダカイワシ油、ボラ卵油、ホホバ油又は抹香鯨油由来の高級アルコールである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の高度不飽和ワックスエステルの製造方法。
【請求項７】
該高級アルコールが、天然ワックスエステルを水酸化ナトリウム溶液中で加水分解すること、該加水分解生成物をヘキサン層に転溶すること、該ヘキサン層を水洗し、その後ヘキサンを留去することによって生成される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の高度不飽和ワックスエステルの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法で得られた高度不飽和ワックスエステルに含水エタノールを加えて攪拌し、高度不飽和ワックスエステル層と含水エタノール層に静置分離後、高度不飽和ワックスエステル層を得ることを含む、高度不飽和ワックスエステルの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法により得られた高度不飽和ワックスエステルを含む化粧品、医薬品又は医薬部外品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度不飽和ワックスエステルの製造方法に関する。また、本発明は、該高度不飽和ワックスエステルを含む化粧品、医薬品及び医薬部外品に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然ワックスエステルは、機械・金属工業、化粧品工業、医薬品工業、食品工業等に広く使用されており、特に化粧品には、カルナウバロウ、キャンデリラロウ、ホホバ油等の植物性ワックスエステル、またミツロウ、ラノリン等の動物ワックスエステル、オレンジラッフィー油、ハダカイワシ油等由来の魚由来ワックスエステルが使用されている（特許文献１を参照）。
しかし、ホホバ油、オレンジラッフィー油及びハダカイワシ油由来のワックスエステル以外の上記ワックスエステルは固体であるため、操作性の面で扱いづらく、また物性に与える影響が限定されるという問題がある。また、ホホバ油、オレンジラッフィー油及びハダカイワシ油由来のワックスエステルは、それらの不飽和度が低いため、液体性が弱い点で問題がある。
【０００３】
【特許文献１】特開平10-203945号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ホホバ油、オレンジラッフィー油、ハダカイワシ油及びボラ卵油由来のワックスエステルの不飽和度に比較して、より高度の不飽和度を有する天然ワックスエステルは知られていない。また、高度不飽和脂肪酸をより多い割合で含むワックスエステルは従来、製造されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、高級アルコール及び高度不飽和脂肪酸にリパーゼを作用させて、高度不飽和ワックスエステルを製造する方法であって、ムコール属由来のリパーゼ、シュードモナス属由来のリパーゼ及びバークホルデリア属由来のリパーゼからなる群より選択されるリパーゼを用いることを特徴とする、高度不飽和ワックスエステルの製造方法を提供する。
また、本発明は、該高度不飽和ワックスエステルを含む化粧品、医薬品及び医薬部外品を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明による高度不飽和ワックスエステルは、機能性脂肪酸であるドコサヘキサエン酸又はエイコサペンタエン酸を多い割合で含む。従って、本発明による高度不飽和ワックスエステルは、従来のワックスエステルに比べて液体性がより強いという物性を有する。従って、本発明による高度不飽和ワックスエステルを用いることにより、従来のワックスエステルにない機能性を備えた化粧品、医薬品及び医薬部外品を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
１．基質
１−１．高級アルコール
本発明で使用できる高級アルコールとは、炭素原子数6以上の不飽和アルコール、飽和アルコール又はそれらの組み合わせのアルコールをいい、好ましくはC14〜C24の炭素原子を含む。高級アルコールの例として、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、イコサノール、ドデセノール、フィセテリルアルコール、ゾーマリンアルコール、オレイルアルコール、ガドレイルアルコール、イコセノール、ドコセノール、ラノリンアルコール、水素添加ラノリンアルコールを挙げることができる。好ましくは、不飽和度の高いワックスエステルを合成するために、不飽和アルコールを主成分とする（すなわち不飽和高級アルコールの含有率の高い）高級アルコールを使用する。さらに好ましくは、該高級アルコールは、75〜99重量％、好ましくは80重量％〜99重量％の一価不飽和アルコール(モノエンアルコール)を含む。
また、本発明で使用できる高級アルコールは、種々の魚類由来の天然ワックスエステルを加水分解することによって得られてもよい。そのような天然ワックスエステルとして、イトヒキダラ肝油、オレンジラッフィー油、ハダカイワシ油、ボラ卵油又は抹香鯨油由来のワックスエステルを使用できる。
イトヒキダラ肝油由来の高級アルコールは、イトヒキダラ肝油を水酸化ナトリウム溶液中で、室温、例えば23℃で1時間加水分解すること、該加水分解生成物をヘキサン層に転溶すること、該ヘキサン層を水洗（2回〜5回）して脂肪酸ナトリウムを除去後、ヘキサンを留去することによって生成される。エタノール性水酸化ナトリウムは、エタノールに水酸化ナトリウムを例えば１重量％溶解したものである。イトヒキダラ肝油から得られる高級アルコールのアルコール組成の例が、下記製造例の表３に示される。
【０００８】
１−２．高度不飽和脂肪酸
本発明で使用できる高度不飽和脂肪酸に、2以上、好ましくは3以上の炭素−炭素二重結合を有する脂肪酸をいい、好ましくはC14〜C22の炭素原子を含む。高度不飽和脂肪酸として、リノール酸、リノレン酸、オクタデカテトラエン酸、オクタデカペンタエン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸もしくはドコサヘキサエン酸などの高度不飽和脂肪酸、又はホタテガイ中腸腺脂質、マグロ眼窩油、カツオ頭部油もしくはカツオ内臓油由来の高度不飽和脂肪酸を使用することが好ましい（林賢治、「魚油添加煮取法／カラムクロマトグラフ法によるホタテガイ中腸腺脂質の高ＥＰＡ含有トリグリセリドの分離」、日本水産学会誌、60(6)、p.787-788、1994(11)）。ホタテガイ中腸腺脂質は、エイコサペンタエン酸の含有率が高い。マグロ眼窩油、カツオ頭部油もしくはカツオ内臓油は、ドコサヘキサエン酸の含有率が高い。また、エイコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸の含有率がやや低いイワシ油などの魚油をまた、高度不飽和脂肪酸として使用することができる。ホタテガイ中腸腺脂質由来の脂肪酸についての脂肪酸組成の例が、下記実施例１の表４に示される。本発明で使用する高度不飽和脂肪酸の純度は、高純度であることが好ましく、例えば85重量％以上、好ましくは90重量％以上、さらに好ましくは95重量％である。
【０００９】
２．酵素（リパーゼ）
本発明で使用できるリパーゼは、ムコール（Mucor）属由来のリパーゼ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のリパーゼ、バークホルデリア（Burkholderia）属由来のリパーゼである。下記実施例１に示すように、ムコール・ミーハイ（Mucor miehei）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、バークホルデリア・セパシア PS（Burkholderia cepacia PS）、バークホルデリア・セパシア PSC1（Burkholderia cepacia PSC1）、バークホルデリア・セパシア PSC2（Burkholderia cepacia PSC2）又はバークホルデリア・セパシア PSD1（Burkholderia cepacia PSD1）由来のリパーゼが、特にワックスエステルの合成率の点で好ましい。また、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus）は、下記試験例に示すように、トリス-塩酸溶液中で58.5％の合成率とやや低めであるが、本発明のリパーゼとして使用してもよい。
【００１０】
３．ワックスエステルの合成
本発明による高度不飽和ワックスエステルは、次のようにして合成される。基質である不飽和アルコール及び高度不飽和脂肪酸（不飽和アルコールと同モルを使用する）を、有機溶剤又はトリス塩酸-カルシウム溶液中に溶解する。有機溶剤として、高級アルコールと高度不飽和脂肪酸を溶解しうる溶剤であれば特に限定されないが、使用するリパーゼを変性しない（失活させない）、沸点が高い、ヒトへの毒性が低い等の理由により、ヘキサンを使用することが好ましい。トリス塩酸溶液として、50mM〜150mMのトリス塩酸を用いることができる。トリス塩酸溶液は、0.05mM〜0.2mMの塩化カルシウムを含むことができる。
上記基質溶解液にリパーゼを加えて、例えばpH 7〜9、好ましくはpH 7.5〜8.5、更に好ましくはpH 8で、25℃〜35℃で、6〜10時間反応させる。リパーゼの至適温度、至適pHは、使用するリパーゼの種類によって異なる。反応時間は、反応中にサンプリングを行い、薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：例えば、ヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸＝90:10:1、容量:容量:容量）により確認しながら調節してもよい。
反応終了後、有機溶剤を使用した系については、ヘキサンをエバポレーターで留去することによって、高度不飽和ワックスエステルが得られる。
【００１１】
４．合成された高度不飽和ワックスエステルの精製
例えば分液漏斗を用いて、合成された高度不飽和ワックスエステルに含水エタノール（例えば85〜95％）を加えて撹拌し、高度不飽和ワックスエステル中の不純物、例えば未反応の高級アルコール及び高度不飽和脂肪酸を含水エタノール層に移行させる。静置分離後、下層の高度不飽和ワックスエステル層を得ることによって、高度不飽和ワックスエステルをさらに精製することができる。該操作によって、高度不飽和ワックスエステルを、99.0重量％以上、好ましくは99.5重量％以上に精製することができる。
【００１２】
５．高度不飽和ワックスエステルの組成
本発明による高度不飽和ワックスエステルのアルコール組成及び脂肪酸組成は夫々、基質の高級アルコール組成及び脂肪酸組成にほぼ一致する（下記実施例１の表７、８と下記製造例の表３、表２を参照）。
下記実施例１の表５に示すように、基質としてイトヒキダラ肝油ワックスエステル由来の高級アルコール及びホタテガイ中腸腺脂質の脂肪酸を用いた場合において、ヘキサン溶液中での高度不飽和ワックスエステル合成率（重量％）は、Mucor miehei、Burkholderia cepacia PSC1、Burkholderia cepacia PSC2及びBurkholderia cepacia PSD1由来のリパーゼの場合、約88〜96重量％である。同様に、トリス塩酸-カルシウム溶液中での高度不飽和ワックスエステル合成率（重量％）は、Mucor miehei、Pseudomonas fluorescens、Burkholderia cepacia PS、Burkholderia cepacia PSC 1、Burkholderia cepacia PSC2及びBurkholderia cepacia PSD1由来のリパーゼの場合、約75〜95重量％である。
有機溶剤（好ましくはヘキサン）又はトリス塩酸-カルシウム溶液の何れを用いて基質にリパーゼを作用させるかは、使用するリパーゼによって異なる。
下記実施例１の表５に示すように、基質としてイトヒキダラ肝油ワックスエステル由来の高級アルコール及びホタテガイ中腸腺脂質の脂肪酸を用いた場合、合成された高度不飽和ワックスエステルの炭素数組成は、C34、C36、C38、C40を主成分とし（下記表６を参照）、そのアルコール組成は、22:1n-11、20:1n-11、16:0を主要成分とし（下記表７を参照）、その脂肪酸組成は、エイコサペンタエン酸（20:5n-3酸）及びパルミトレイン酸（16:1n-7酸）を主要成分とする（下記表８を参照）。また、その不飽和度指数は、約330〜390である（下記表９を参照）。
【００１３】
５．高度不飽和ワックスエステルの用途
本発明による高度不飽和ワックスエステルは、高度不飽和脂肪酸、特にエイコサペンタエン酸又はドコサヘサエン酸を多量に含有する。従って、不飽和度が高いことから、本発明による高度不飽和ワックスエステルは、イトヒキダラ肝油、オレンジラッフィー油、ハダカイワシ油、ボラ卵油、又はホホバ油由来のワックスエステルに比較して、より液体性が強い。よって、液体性の強い本発明による高度不飽和ワックスエステルを化粧品、医薬品、医薬部外品、香水及び皮革油剤の基材油として使用することにより、従来にはない機能性を備えた化粧品、医薬品、医薬部外品、香水及び皮革油剤を製造することが可能になる。化粧品としては、例えばベビー製品（ベビーシャンプー、ローション、オイル、パウダー及びクリーム）、アイメイクアップ製品（アイクリーム、睫ペンシル、アイライナー、アイシャドー、アイローション、アイメイクアップ除去剤、マスカラ）、日焼け止めクリーム（リキッド、ゲル）、口紅及びファウンデーション製品を挙げることができる。医薬品としては軟膏、座薬などを挙げることができる。医薬部外品としては、入浴剤、毛髪調整剤（ヘアコンディショナー、ヘアスプレー、リンス、シャンプー、トニックなど）、洗顔クリーム（リキッド、ゲル）、アフターシェーブローション、プレシェーブローションなどを挙げることができる。本発明による高度不飽和ワックスエステルを油性原料として化粧品に配合すると、その強い液体性により感触に優れ、油のべたつき感が少なく、さらに皮膚へのエモリエント性のよい化粧品になる。化粧品には、化粧品の安定性を向上するために、ビタミンE、BHT、BHA、アントシラン等の酸化防止剤を添加してもよい。また、本発明による高度不飽和ワックスエステルは、エモリエント組成物のワックスエステル成分として使用されてもよい。医薬品及び医薬部外品には、薬効成分の他、薬事法により定められている所定の医薬品添加物（賦形剤、安定剤など）を含んでもよい。
【００１４】
以下に、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらによって何ら制限されるものではない。
【００１５】
実施例
［製造例］
（天然ワックスエステルからの高級アルコールの生成）
下記表１〜２に夫々示す炭素数組成、脂肪酸組成を有するイトヒキダラ肝油ワックスエステル0.2gに、1％水酸化ナトリウム／エタノール溶液20mlを加え、室温（23℃）下で1時間、攪拌しながら加水分解をおこなった。加水分解後、エタノールを、エバポレーター（減圧蒸発器）を用いて留去し、得られた反応生成物をヘキサン50mlに溶解後、この溶液を水洗（2ml、5回）した。静置後、下層（水層）を除去し、上層（ヘキサン層）を、エバポレーターを用いて留去し、高級アルコールを得た。
該高級アルコールの収率は、原料である肝油ワックスエステルに対して57.4重量％であった。また、該高級アルコールの成分は、高級アルコールが99.6重量％、脂肪酸が0.4重量％であった（TLC/FID（薄層クロマトグラフィー/水素炎イオン化検出）法（イアトロスキャン）による）。該高級アルコールの高級アルコール組成を表３に示す。
【００１６】
【表１】
2006246743.tif 000002
【００１７】
【表２】
2006246743.tif 000003
【００１８】
【表３】
2006246743.tif 000004
【実施例１】
【００１９】
製造例で製造した高級アルコール50mg及びホタテガイ中腸腺脂質の脂肪酸（その脂肪酸組成を下記表４に示す）50mgをヘキサン2mlに溶解し、下記表５に示す６種類のリパーゼ50mgを夫々加え、30℃で8時間振とうして反応させ、ワックスエステルを合成した。
同様に、実施例１で製造した高級アルコール50mg及びホタテガイ中腸腺脂質脂肪酸（上記）50mgを、100mMトリス-塩酸溶液(pH8.0)1.5ml、0.1mM塩化カルシウム溶液0.5mlに溶解し、下記表５に示す６種類のリパーゼ50mgを夫々加え、30℃で8時間振とうして反応させ、ワックスエステルを合成した。
ワックスエステルの合成率を下記表５に示す。
【００２０】
【表４】
2006246743.tif 000005
【００２１】
【表５】
2006246743.tif 000006
【００２２】
表５より、ヘキサン溶液中でのワックスエステル合成率（重量％）は、使用するリパーゼの種類によって異なり、反応溶液としてヘキサン又はトリス−塩酸のいずれを用いるかは一概にいえない。従って、基質、リパーゼの性質を考慮するとともに、実際に試験を実施して、反応溶液を選択することが好ましい。
【００２３】
トリス-塩酸溶液中でMucor miehei、Pseudomonas fluorescens、Burkholderia cepacia PS由来のリパーゼを用いて合成されたワックスエステルの炭素数組成（重量％）、アルコール組成（重量％）、脂肪酸組成（重量％）及び不飽和度指数（TUI）を夫々下記表６〜９に示す。
【００２４】
【表６】
2006246743.tif 000007
【００２５】
【表７】
2006246743.tif 000008
【００２６】
【表８】
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【００２７】
【表９】
2006246743.tif 000010
【００２８】
表６より、合成されたワックスエステルの炭素数組成は、C34、C36、C38、C40を主成分とした。また、表７より、合成されたワックスエステルのアルコール組成は、22:1n-11、20:1n-11、16:0の順に主要成分とし、そのアルコール組成は、表２に示す基質のアルコール組成に一致した。表８より、合成されたワックスエステルの脂肪酸組成は、エイコサペンタエン酸（20:5n-3酸）及びパルミトレイン酸（16:1n-7酸）を主要成分とし、その脂肪酸組成は、表４に示す基質の脂肪酸組成にほぼ一致した。
表９より、合成されたワックスエステルの不飽和度指数（TUI）は336.2〜385.6を示し、イトヒキダラ肝油ワックスエステルのTUI 224.0（アルコール組成TUI 86.9（表２）と脂肪酸組成TUI 137.1（表３）との和）よりも高かった。従って、合成されたワックスエステルは、その分子内に、イトヒキダラ肝油ワックスエステルよりも多くの二重結合を有し、従って不飽和度が高い。
以上より、エイコサペンタエン酸（20:5n-3酸）を17.2重量％〜30.2重量％含む高度不飽和ワックスエステルが合成された。
【００２９】
［試験例］
実施例１で使用したリパーゼの代わりに、下記表１０に示す10種類のリパーゼを使用した以外は実施例１と同じ方法でワックスエステルを合成した。
ワックスエステルの合成率を下記表１０に示す。
【００３０】
【表１０】
2006246743.tif 000011
【００３１】
表１０より、トリス塩酸-カルシウム溶液での合成率は、ヘキサン溶液中での合成率よりも良い結果を示している。しかし、Mucor javanicus（トリス-塩酸溶液の場合、58.5%）を除き、その合成率は、せいぜい45.3%(トリス-塩酸溶液の場合、Rhizopus oryzae)である。トリス塩酸-カルシウム溶液中でPorcine pancreas由来のリパーゼを用いて合成されたワックスエステルの炭素数組成（重量％）、アルコール組成（重量％）、脂肪酸組成（重量％）及び不飽和度指数（TUI）を夫々下記表１１〜１４に示す。
【００３２】
【表１１】
2006246743.tif 000012
【００３３】
【表１２】
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【００３４】
【表１３】
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【００３５】
【表１４】
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【００３６】
Porcine pancreas由来のリパーゼにより合成されたワックスエステルの炭素数組成は、表１１より、C36、C34、C38を主要成分とし、アルコール組成は、表１２より、22:1n-11、20:1n-11、16:0を主要成分とした。従って、該ワックスエステルは、基質脂肪酸の炭素数組成（表２）と比較して、エイコサペンタエン酸（20:5n-3酸）を低い割合で含む。
また、試験例の表１１より、Porcine pancreas由来のリパーゼにより合成されたワックスエステルのTUIは276であった。一方、実施例１の表９より、Mucor miehei、Pseudomonas fluorescens、Burkholderia cepacia由来のリパーゼにより合成されたワックスエステルのTUIは336.2〜385.6であり、従って、Porcine pancreas由来のリパーゼを用いたワックスエステルでは、その不飽和度が低かった。また、Porcine pancreas由来のリパーゼでは、合成率が20％と低いことから、ホタテ中腸腺脂質脂肪酸のうち、エイコサペンタエン酸などの不飽和の高い脂肪酸が結合されず、不飽和度の低い脂肪酸が多く結合したと考えられる。
【実施例２】
【００３７】
実施例１で合成されたワックスエステル（ヘキサン、Mucor miehei由来のリパーゼを使用、合成率95.5％）について、さらに該ワックスエステルの純度を高めるために、以下の処理を行った。
該ワックスエステル100mgに90％含水エタノール3mlを加えて攪拌し、静置分離した。下層の高度不飽和ワックスエステル層を上層の含水エタノール層と分離して、精製ワックスエステルを得た。精製ワックスエステルの収率は92.0重量％、純度は99.8重量％（残りは、未反応のアルコールと脂肪酸）であった。
【実施例３】
【００３８】
コールドクリーム
実施例１で合成されたワックスエステル（ヘキサン、Mucor miehei由来のリパーゼを使用）13重量％、サラシミツロウ12重量％、アルモンド油55重量％、ホウ砂0.5重量％、水19.5重量％の割合で混合した。
その結果、液体性がより強く、油のべた付き感が少なく、皮膚へのエモリエント性もよい乳化液が得られた。