(57)【要約】【課題】  蛍光の波長分散方向と電気泳動方向（即ち、励起光の照射領域におけるDNAバンドの移動方向）が同一であると、見かけ上、２次元光検出器によって検出された発光スペクトルが経時変化したこととなり、分析精度が悪化することが判明した。本発明の目的は、複数の電気泳動路を有する電気泳動分析において、観測した発光スペクトルを各種蛍光色素あるいは各種塩基に完全に対応させることを容易化することにある。【解決手段】  本発明は、複数の電気泳動路に励起光を照射し、電気泳動方向に対して略垂直方向に、電気泳動路からの蛍光を波長分散し、発光スペクトルを検出することに関する。本発明によると、検出される発光スペクトルが見かけ上の経時変化をしない為、観測した発光スペクトルを各種蛍光色素あるいは各種塩基に完全に対応させることが容易となる。【選択図】  図４
2006292368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の電気泳動路と、所定の間隔にて配列された電気泳動路に励起光を照射する照射手段と、上記電気泳動路からの蛍光を波長分散する波長分散手段と、該波長分散手段からの光を検出して発光スペクトルを得る光検出手段とを有し、上記波長分散手段による波長分散方向は上記電気泳動路における電気泳動方向に略垂直であることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項２】
請求項１に記載の電気泳動装置において、上記波長分散手段は、上記複数の電気泳動路に対応した複数の発光スペクトルが互いに重ならないように、上記蛍光を波長分散することを特徴とする電気泳動装置。
【請求項３】
請求項１に記載の電気泳動装置において、上記波長分散手段はプリズムであることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項４】
請求項１に記載の電気泳動装置において、上記複数の電気泳動路における励起光の照射位置は互いに上記電気泳動方向に沿ってずれていることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項５】
請求項１に記載の電気泳動装置において、上記波長分散手段は回折格子であることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項６】
請求項１に記載の電気泳動装置において、上記電気泳動路はキャピラリであることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項７】
請求項１に記載の電気泳動装置において、上記励起光が、隣接する電気泳動路に次々と伝搬するように照射されることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項８】
複数の電気泳動路と、所定の間隔にて配列された電気泳動路に励起光を照射する照射手段と、上記電気泳動路からの蛍光を波長分散する波長分散手段と、該波長分散手段からの光を検出して発光スペクトルを得る光検出手段とを有し、上記波長分散手段による波長分散方向は上記電気泳動路における電気泳動方向に対して垂直方向より僅かに傾斜した方向であることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項９】
請求項８に記載の電気泳動装置において、上記励起光が、隣接する電気泳動路に次々と伝搬するように照射されることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項１０】
複数の電気泳動路により、複数の蛍光標識試料を電気泳動し、
所定の間隔にて配列された複数の電気泳動路に励起光を照射し、
電気泳動路における電気泳動方向に対して略垂直方向に、上記電気泳動路からの蛍光を波長分散し、
波長分散された光を検出して発光スペクトルを得る
ことを特徴とする電気泳動方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の電気泳動方法において、上記複数の電気泳動路に対応した複数の発光スペクトルが互いに重ならないように、上記蛍光は波長分散されることを特徴とする電気泳動方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の電気泳動方法において、上記複数の電気泳動路における励起光の照射位置は互いに上記電気泳動方向に沿ってずれていることを特徴とする電気泳動方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の電気泳動方法において、上記励起光が、隣接する電気泳動路に次々と伝搬するように照射されることを特徴とする電気泳動方法。
【請求項１４】
複数の電気泳動路により、複数の蛍光標識試料を電気泳動し、
所定の間隔にて配列された複数の電気泳動路に励起光を照射し、
電気泳動路における電気泳動方向に対して垂直方向より僅かに傾斜した方向に、上記電気泳動路からの蛍光を波長分散し、
波長分散された光を検出して発光スペクトルを得る
ことを特徴とする電気泳動方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の電気泳動方法において、上記励起光が、隣接する電気泳動路に次々と伝搬するように照射されることを特徴とする電気泳動方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸やタンパク質等を電気泳動により分離分析する電気泳動装置に関し、特に、電気泳動装置の蛍光検出技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
特開2004-144479号公報には、キャピラリ電気泳動装置が開示されている。DNAの塩基配列および塩基長の決定等を目的して、石英管およびそれを覆うポリマ被覆からなるキャピラリを用いた電気泳動法が用いられている。石英キャピラリ中のポリアクリルアミド等の分離媒体に測定対象であるDNAを含む試料を注入して、キャピラリの両端部に電圧を印加する。試料中のDNA合成物はキャピラリ内を移動し、分子量の大きさ等によって分離されキャピラリ内にDNAバンドを生じる。各DNAバンドには蛍光色素が加えられており、レーザ光の照射によって発色し、これを蛍光計測手段で読み取り、DNAの配列を決定する。蛋白質の分離・分析も同様に行って、蛋白質の構成を調べることができる。
【０００３】
特開2004-144479号公報に開示されているサンプルへの光照射方式は以下のようなものである。すなわち、平面基板上に並んだ複数のキャピラリからなるキャピラリアレイの一方あるいは両側の端のキャピラリにレーザ光を照射し、レーザ光が隣接するキャピラリに次々と伝搬してキャピラリアレイを横断するものである。また、蛍光検出方式は以下のようなものである。すなわち、キャピラリアレイ上のレーザ光照射部の像を、集光レンズ、透過型回折格子、結像レンズにより2次元CCD上に結像する。2次元CCD上の2軸の内、一軸は複数のキャピラリの発光点が並ぶ軸であり、それと直交する残りの一軸は、透過型回折格子による波長分散軸である。このように、一つ一つのキャピラリからの発光スペクトルが2次元CCD上に結像される。
【０００４】
【特許文献１】特開2004-144479号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来のキャピラリ電気泳動装置では、励起光をキャピラリに照射し、キャピラリ内を移動するDNAバンドからの蛍光を回折格子によって波長分散し、波長分散した蛍光を２次元光検出器によって検出し、発光スペクトルを得ている。
【０００６】
しかし、本願発明者が鋭意検討した結果、蛍光の波長分散方向と電気泳動方向（即ち、励起光の照射領域におけるDNAバンドの移動方向）が同一であると、見かけ上、２次元光検出器によって検出された発光スペクトルが経時変化したこととなり、分析精度が悪化することが判明した。
【０００７】
つまり、蛍光の波長分散方向と電気泳動方向が同一であると、所定の幅を有する励起光の照射領域をDNAバンドが通過する間に、波長分散された蛍光が波長分散方向に移動する為、２次元検出器によって得られる信号は変化する。見かけ上、DNAバンドが励起光を通過する時間において、２次元検出器によって得られる発光スペクトルの波長が経時変化してしまう。
【０００８】
電気泳動分析では、複数の蛍光色素を使用し、それぞれの蛍光色素が４種類の塩基に対応付けられているが、発光スペクトルが見かけ上の経時変化をすると、観測した発光スペクトルを、各種蛍光色素あるいは各種塩基に完全に対応させることが困難になる。すなわち、発光スペクトルの各成分に各塩基を対応させるとき、塩基を対応させることができない残渣成分（擬似ピーク）が生じ、分析精度が悪化する。
【０００９】
本発明の目的は、複数の電気泳動路を有する電気泳動分析において、観測した発光スペクトルを各種蛍光色素あるいは各種塩基に完全に対応させることを容易化することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、複数の電気泳動路に励起光を照射し、電気泳動方向に対して略垂直方向に、電気泳動路からの蛍光を波長分散し、発光スペクトルを検出することに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、検出される発光スペクトルが見かけ上の経時変化をしない為、観測した発光スペクトルを各種蛍光色素あるいは各種塩基に完全に対応させることが容易となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と利益を、図面を参酌して説明する。ただし、図面はもっぱら解説のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１３】
図１に、本実施例における電気泳動装置（以下、「本装置」）の概略を示す。本装置は、泳動媒体が充填された複数本のキャピラリを用い、各キャピラリに試料を導入し、試料中の試料成分を電気泳動分離し、分析する。本装置の基本的構成は、キャピラリアレイ、照射光学ユニット、検出光学ユニット、オートサンプラユニット、泳動媒体充填ユニット、電源ユニット、及び温度制御ユニットである。
【００１４】
キャピラリアレイ１０１は、複数本のキャピラリ１０２より構成される着脱可能な交換部材であり、所定回数の分析により品質が劣化し、分離能が低下した際に、新品に交換される。また、測定手法を変更する場合、キャピラリ１０２の長さが異なるキャピラリアレイ１０１に交換することにより、キャピラリ１０２の長さを調節できる。キャピラリアレイ１０１は、試料をキャピラリ１０２内に導入する試料導入部１０４、泳動分離された試料に励起光を照射する照射部１０３、及び、キャピラリを束ねるキャピラリヘッド１０７を有する。
【００１５】
キャピラリ１０２は、内径数十〜数百ミクロン，外形数百ミクロンの細管であり、強度を向上させるために表面がコーティングされている。キャピラリ１０２の内部に泳動媒体を充填することにより、泳動路を形成する。泳動路の両端に電圧を印加することにより、試料を電気泳動分離できる。
【００１６】
本実施例では、外表面をポリイミドコーティングした、全長４０ｃｍ、外径３６０μｍ、内径５０μｍの石英バイプを用いる。このキャピラリ１０２を４本束ねて、キャピラリアレイ１０１を構成している。尚、キャピラリ１０２の本数は、４本に限定されず、例えば、１本、８本、１６本、９６本、１９２本、３８４本等でも良い。また、必要に応じ、キャピラリ１０２をポリイミド以外の樹脂によりコーティングしても良い。
【００１７】
試料導入部１０４は、キャピラリ１０２の試料導入端１０５を、サンプル容器のウェルに合わせて配置しており、各ウェルに保持された複数の試料を泳動路に導入できる。
【００１８】
本実施例では、キャピラリ１０２の先端を中空電極に挿入して試料導入端１０５を形成し、試料導入部１０４を構成している。試料導入端１０５において、キャピラリ１０２の先端は、中空電極から少し突出した状態となっている。ステンレス製パイプから構成される中空電極は、高圧電源に電気的に接続されている。試料導入端１０５を試料に浸し、電圧を印加することにより、試料を電気泳動し、キャピラリ内に導入できる。尚、試料導入の方法は、電気泳動に限定されず、圧力や分注により試料を泳動路に導入してもよい。
【００１９】
キャピラリ１０２の試料導入部１０４から約３０ｃｍ離れた照射部１０３では、ポリイミド被膜が除去されている。照射光学ユニットは、照射部１０３に励起光を照射し、検出光学ユニットは、照射部１０３からの蛍光を検出する。照射部１０３にて、電気泳動分離された試料成分に励起光が照射されると、試料成分に標識された蛍光体は、試料成分に依存した波長の蛍光を放出する。この蛍光を検出することにより、DNAの塩基配列および塩基長が求められる。
【００２０】
キャピラリヘッド１０７は、４本のキャピラリを束ねて保持し、装置本体と着脱することができる。キャピラリヘッド１０７は、ポリマ充填ブロック１５２に耐圧気密で接続できる。そして、泳動媒体充填ユニットにより、終端部１０８より、キャピラリ１０２内に、新しい泳動媒体を充填することができる。
【００２１】
オートサンプラユニットは、サンプル容器をはじめとする電気泳動分析に用いる各容器を、試料導入部１０４の直下等の所定位置に搬送し、保持する機構である。本実施例のオートサンプラユニットは、爪を備えたロボットアームにより、サンプル容器、バッファ容器、洗浄容器、及び廃液容器を搬送する。
【００２２】
ロボットアームは、各容器をその上に固定する爪を備え、３次元的に移動できる。これにより、所定の場所に保管されている各容器を、試料導入部１０４の直下に搬送し、その場所にて各容器を所定時間保持し、所定の場所に返却できる。
【００２３】
バッファ容器は、試料導入端１０５を浸す緩衝液を保持する容器である。泳動分析時、緩衝液が試料導入端１０５を浸すように、バッファ溶液は試料導入部１０４の直下に搬送される。また、装置待機中も、泳動分析時と同様に搬送され、試料導入端１０５を緩衝液に浸し、キャピラリ１０２内の泳動媒体の乾燥を防止している。
【００２４】
洗浄容器は、試料導入端１０５を洗浄する洗浄液を保持する容器であり、泳動媒体充填、予備泳動、及び試料導入の後に試料導入部１０４の直下に搬送される。試料導入端１０５を、洗浄容器中の洗浄液に浸すことにより、試料導入端１０５を洗浄し、コンタミネーションを回避できる。
【００２５】
廃液容器は、使用済の泳動媒体を保持する容器であり、泳動媒体充填時に試料導入部１０４の直下に搬送され、泳動媒体充填時に試料導入端１０４から排出される使用済の泳動媒体を受け止める。
【００２６】
サンプル容器は、複数の微量試料を保持する容器であり、試料導入時に試料導入部１０４の直下に搬送される。本実施例では、数１０μｌの試料を保持できるウェルを２４行１６列備えたサンプルプレートに、樹脂製のシートであるセプタを乗せ、それをホルダとクリップで挟むことにより、サンプル容器を構成している。試料としては、例えば、４種類のヌクレオシド塩基分子を識別するように蛍光標識され、多数の適当な長さ（大きさ）の核酸を含む溶液である。セプタは、ウェルに対応する位置に通常は密閉状態の貫通孔を有しており、ウェル中の試料の蒸発を防止しつつ、試料導入時に試料導入端１０５と試料の接触を可能としている。また、セプタ上面に保護フィルムを貼り付け、試料蒸発を防止することもできる。また、ホルダとクリップは、その間にサンプルプレートやセプタを挟み、一体化することにより、ロボットアームにて搬送可能なサンプル容器を形成する。
【００２７】
泳動媒体充填ユニットは、泳動媒体であるポリマをキャピラリ１０２内に充填する機構である。本実施例の泳動媒体充填ユニットは、ポリマ充填ブロック１５２、シリンジ１５３、チューブ１５５、電磁弁１５６とを含み、分析開始前に新しい泳動媒体をキャピラリ１０２内に自動的に充填できる。
【００２８】
ポリマ充填ブロック１５２は、ポリマ流路１５４を有し、シリンジ１５３とチューブ１５５に接続し、キャピラリヘッド１０７を着脱できる。キャピラリヘッド１０７は、耐圧気密を維持しながらポリマ充填ブロック１５２に装着される。ポリマ流路１５４は、泳動媒体により満たされたシリンジ１５３と、電磁弁１５６を備えたチューブ１５５と連通している。チューブ１５５の他端は、陽極バッファ容器１６３に保持された緩衝液に浸されている。
【００２９】
キャピラリ１０２内に泳動媒体を充填する際には、試料導入部１０４の直下に廃液容器を配置し、電磁弁１５６を閉じ、シリンジ１５３のプランジャを押す。これにより、シリンジ１５３内の泳動媒体が、ポリマ流路１５４を経由して、終端部１０８からキャピラリ１０２内に流入する。また、キャピラリ１０２内の使用済泳動媒体は、試料導入端１０５から排出され、廃液容器にて受け止められる。
【００３０】
電源ユニットは、キャピラリ１０２内の泳動媒体から構成される泳動路に電圧を印加する機構であり、試料を電気泳動できる。本実施例の電源ユニットは、中空電極と陽極電極１６４に電気的接続され、１５ｋＶ前後の高電圧を発生できる高圧電源を含む。
【００３１】
試料導入時は、キャピラリ１０２、ポリマ流路１５４及びチューブ１５５の内部を泳動媒体で満たし、サンプル容器のウェルに保持された試料に試料導入端１０５を浸し、電磁弁１５６を開く。これにより、中空電極、ウェル中の試料、キャピラリ１０２、ポリマ流路１５４、チューブ１５５、陽極バッファ容器１６３内の緩衝液、及び陽極電極１６４からなる通電路が形成される。そして、中空電極を負電位、陽極電極１６４を正電位として、この通電路にパルス電圧を印加する。これにより、ウェル内に存在する負に帯電する試料成分、例えばＤＮＡが、試料導入端１０５から泳動路に導入される。
【００３２】
また、泳動分析時は、試料導入時と異なり、バッファ容器に保持された緩衝液に試料導入端１０５を浸す。これにより、中空電極、バッファ溶液中の緩衝液、キャピラリ１０２、ポリマ流路１５４、チューブ１５５、陽極バッファ容器１６３内の緩衝液、及び陽極電極１６４からなる通電路が形成される。そして、試料導入時と異なり、１５ｋＶ前後の高電圧を印加する。これにより、照射部１０３から試料導入部１０４の方向に電界が生じ、泳動路に導入された負に帯電する試料成分が、照射部１０３の方向に電気泳動する。
【００３３】
温度制御ユニットは、試料成分の泳動速度に影響を与える泳動路の温度を制御する機構である。本実施例における温度制御ユニットは、恒温槽１３０内にキャピラリ１０２を収容する。そして、ペルチェ等の温度制御機構により一定温度に保たれた空気を、ファン等の送風機構により恒温槽内を循環させ、キャピラリ１０２を所定温度に保つ。
【００３４】
以下、電気泳動分析の基本的手順について説明する。電気泳動分析の基本的手順は、事前準備、泳動媒体充填、予備泳動、試料導入、及び泳動分析に大別できる。本装置のオペレータは、分析開始前の事前準備として、試料や試薬を本装置にセットする。より具体的には、まず、バッファ容器と陽極バッファ容器１６３に、通電路の一部を形成する緩衝液を満たす。緩衝液は、例えば、各社から電気泳動用として市販されている電解質液であるである。
【００３５】
また、サンプル容器のウェル内に、分析対象である試料を分注する。試料は、例えば、DNAのPCR産物である。また、洗浄容器に、試料導入部１０４を洗浄する為の洗浄溶液を分注する。洗浄溶液は、例えば、純水である。また、シリンジ１５３内に、試料を電気泳動する為の分離媒体を注入する。泳動媒体は、例えば各社から電気泳動用として市販されているポリアクリルアミド系分離ゲルであるである。さらに、キャピラリ１０２の劣化が予想される場合や、キャピラリ１０２の長さを変更する場合、キャピラリアレイ１０１を交換する。そして、事前準備が完了した後、オペレータは本装置を操作して、分析を開始する。泳動媒体充填とは、キャピラリ１０２内に新しい泳動媒体を充填し、泳動路を形成する手順である。
【００３６】
本実施例における泳動媒体充填では、まず、オートサンプラユニットにより廃液溶液を試料導入部１０４の直下に運び、試料導入端１０５から排出される使用済の泳動媒体を受け止められるようにする。そして、シリンジ１５３を駆動して、キャピラリ１０２内に新しい泳動媒体を充填し、使用済の泳動媒体を廃棄する。最後に、洗浄容器内の洗浄溶液に試料導入端１０５を浸し、泳動媒体により汚れた試料導入端１０５を洗浄する。予備泳動とは、泳動媒体に所定の電圧を印加し、泳動媒体を電気泳動に適した状態にする手順である。本実施例における予備泳動では、まず、オートサンプラユニットにより、バッファ容器内の緩衝液に試料導入端１０５を浸し、通電路を形成する。そして、電源ユニットにより、泳動媒体に数〜数十キロボルト程度の電圧を数〜数十分間加え、泳動媒体を電気泳動に適した状態とする。最後に、洗浄容器内の洗浄溶液に試料導入端１０５を浸し、緩衝液により汚れた試料導入端１０５を洗浄する。試料導入とは、試料成分を泳動路に導入する手順である。
【００３７】
本実施例における試料導入では、まず、オートサンプラユニットにより、サンプル容器のウェル内に保持された試料に試料導入端１０５を浸す。これにより、通電路が形成され、泳動路に試料成分を導入することが状態となる。そして、電源ユニットによりパルス電圧を通電路に印加し、泳動路に試料成分を導入する。最後に、洗浄容器内の洗浄溶液に試料導入端１０５を浸し、試料により汚れた試料導入端１０５を洗浄する。泳動分析とは、電気泳動により、試料中に含まれる各試料成分を分離分析する手順である。本実施例における泳動分析では、まず、オートサンプラユニットにより、バッファ容器内の緩衝液に試料導入端１０５を浸し、通電路を形成する。
【００３８】
そして、電源ユニットにより、通電路に１５ｋＶ前後の高電圧を印加し、泳動路に電界を発生させる。発生した電界により、泳動路内の各試料成分は、各試料成分の性質に依存した速度で照射部１０３へ移動する。つまり、試料成分は、その移動速度の差により分離される。そして、照射部１０３に到達した試料成分から順番に検出される。例えば、試料が、塩基長の異なるＤＮＡを多数含む場合は、その塩基長により移動速度に差が生じ、塩基長の短いＤＮＡから順に照射部１０３に到達する。各ＤＮＡに、その末端塩基配列に依存した蛍光物質を取り付けておけば、照射部１０３に到達した順に、その末端塩基配列を検出できる。そして、予定していたデータを取り終えたら電圧印加を停止し、泳動分析を終了する。以上が、一連の分析手順である。さらに分析を実施する場合は、泳動媒体充填から分析手順を進める。
【実施例１】
【００３９】
以下、図２を参照して、本発明によるキャピラリ電気泳動装置の照射光学ユニットの実施例を説明する。図２Ａは、ガラス基板２０３上に４本のキャピラリ３０５が装着された状態を示す平面図、図２Ｂは、その断面図である。４本のキャピラリ３０５は、ガラス基板２０３上にて、所定の間隔にて、実質的に平行に配列されている。ポリイミド皮膜が除去された部分にキャピラリ照射部３０５ａがある。
【００４０】
LED光源２０１から照射されたLED光は、レンズ２０２によって集光され、キャピラリ照射部３０５ａに照射され、試料の蛍光色素を励起する。キャピラリ照射部３０５ａからの蛍光は、光源２０１とは反対側に設けられた検出光学系に導かれる。検出光学系については以下に詳細に説明する。
【００４１】
LED光源２０１は、例えば、波長505nm、出力1ｍＷである。尚、光源としては、レーザを用いてもよい。光源２０１は、キャピラリの数だけ設けてもよいが、１つの光源からの光をビームスプリッタにより４分割し、それぞれの分割光を各キャピラリに照射してもよい。
【００４２】
ガラス基板２０３は、背面ミラーの機能とBP（バンドパス）光学フィルタの機能を有する。先ず、背面ミラーの機能を説明する。ガラス基板２０３の一方の面には球面２０５が形成されている。この球面２０５は、キャピラリ照射部３０５ａ上に中心を有する反射面である。球面２０５は、キャピラリ照射部３０５ａから光源２０１方向に戻る蛍光を反射し、それを再びキャピラリ照射部３０５ａに集光する。こうして反射した蛍光は、キャピラリ照射部３０５ａを経由して、光源２０１とは反対側に設けられた検出光学系に導かれると共に、キャピラリ照射部３０５ａにおける蛍光色素を励起する。従って、誘導放出効果により、蛍光強度が増大する。
【００４３】
次に、BP光学フィルタの機能を説明する。ガラス基板２０３の球面２０５及びその反対側の平面２０４には、BP光学フィルタとして機能する干渉フィルタが形成されている。BP光学フィルタは、LED光源２０１からの光のうち、所定の波長領域の光のみを透過する。即ち、BP光学フィルタは、蛍光色素を励起するための励起光のみをキャピラリ照射部３０５ａに導き、観測対象の蛍光の波長領域の光がキャピラリ照射部３０５ａに到達することを阻止する。
【００４４】
図示のように、LED光源２０１の光軸２１０は、ガラス基板２０３の平面２０４の法線、即ち、検出光学系の光軸２１１に対して所定の角度にて傾斜している。従って、ガラス基板２０３の平面２０４からの反射光束が、光源２０１からの入射光束と重ならないため、戻り光によるLED光源２０１の不安定化を回避することができる。
【００４５】
図３は、特開2004-144479号公報に記載されている検出光学ユニットの例を示す。図３Ａは、検出光学ユニットをＹＺ平面に沿って切断した断面構成を示し、図３Ｂは、検出光学ユニットをＸＺ平面に沿って切断した断面構成を示す。検出光学系は、LP光学フィルタ３０６、第１カメラレンズ３０１、回折格子３０２、第２カメラレンズ３０３、２次元光検出器３０４を含む。キャピラリ照射部３０５ａから放出された蛍光は、LP光学フィルタ３０６を経由し、第１カメラレンズ３０１に入射し、平行光束となる。
【００４６】
この平行光束は、回折格子３０２により波長分散され、第２カメラレンズ３０３により、２次元検出器３０４上に結像される。２次元検出器３０４からの信号を、コンピュータにより演算処理して、試料を分析する。回折格子３０２に代えて、プリズムやフィルタを適宜組み合わせて波長分散手段を構成してもよい。２次元検出器３０４として、通常、ＣＣＤカメラが用いられるが、一次元検出器、フォトマル、フォトダイオード等と、光学機構を適宜組み合わせて構成してもよい。
【００４７】
LP光学フィルタ３０６は、観測対象の蛍光の波長より短い波長の光を遮断する。即ち、蛍光に比べて非常に強度の強い励起光が２次元検出器３０４に到達することを阻止する。
【００４８】
図３Ａ及び図３Ｂの右側に示すように、キャピラリ３０５はX軸に平行に延び、且つ、Ｙ軸方向に沿って所定の間隔にて配列されている。従って、電気泳動方向ＥはＸ軸方向である。従来の検出光学系では、図３Ｃに示すように、回折格子３０２の刻線４０１はY軸に平行に延び、且つ、Ｘ軸方向に沿って所定の小さな間隔にて配列されている。従って、キャピラリ照射部３０５ａからの蛍光はX軸方向に波長分散される。即ち波長分散方向Ｗは、X軸方向である。
【００４９】
図３Ｄに示すように、２次元検出器３０４によって得られる画像５０１には、４本のキャピラリからの蛍光を示す４本の発光スペクトル６０１が、Ｙ軸方向に沿って所定の間隔にて表示されている。４本の発光スペクトル６０１のＹ軸方向の間隔は、４本のキャピラリのＹ軸方向の間隔に対応している。４本の発光スペクトル６０１は、図示のように赤から青まで、Ｘ軸方向に延びている。即ち、波長分散方向Ｗは、電気泳動方向Ｅと同一のＸ軸方向である。
【００５０】
図８Ａは、電気泳動によって分離されたDNAバンド９０１がキャピラリ９０２内を移動する状態を示す。キャピラリ９０２の照射部には、集光された励起光９０３が照射されるが、この励起光９０３は、所定の幅を有する。従って、DNAバンド９０１が励起光９０３の照射領域に入ってから、それを出るまでの間、２次元検出器３０４によって得られる信号は、変化する。
【００５１】
上述のように電気泳動方向Ｅは波長分散方向Ｗに等しいから、DNAバンド９０１は励起光９０３の照射領域を通過する間、波長分散方向Ｅに移動する。従って、図８Ｂに示すように、見かけ上、２次元検出器３０４によって得られる発光スペクトル９０４の波長が変化する。これは、DNAバンド９０１が励起光９０３を通過する間に、発光スペクトルの波長が経時変化するのと同様の効果を与える。電気泳動法では、複数の蛍光色素を使用し、それぞれの蛍光色素が４種類の塩基に対応付けられている。従って、発光スペクトルが、見かけ上変化すると、観測した発光スペクトルを各種蛍光色素あるいは各種塩基に完全に対応させることが困難になる。すなわち、発光スペクトルの各成分に各塩基を対応させるとき、塩基を対応させることができない残渣成分（擬似ピーク）が生じる。
【００５２】
図４は、本発明によるキャピラリ電気泳動装置の検出光学ユニットの第１の実施例を示す。図４Ａは、本実施例の検出光学ユニットをＹＺ平面に沿って切断した断面構成を示し、図４Ｂは、本実施例の検出光学ユニットをＸＺ平面に沿って切断した断面構成を示す。本発明によると、DNAバンドの移動方向、即ち、電気泳動方向Ｅと波長分散方向Ｗを直交させるように構成した。即ち、図４Ｃに示すように、回折格子３０２の刻線４０２はＸ軸に平行に延び、且つ、Ｙ軸方向に沿って所定の小さな間隔にて配列されている。従って、キャピラリ照射部３０５ａからの蛍光はＹ軸方向に波長分散される。DNAバンドの移動方向は、Ｘ軸方向であるから、波長分散方向Ｗと直交する。従って、図４Ｄに示すように、２次元検出器３０４によって得られる画像５０２には、４本のキャピラリからの蛍光を示す４本の発光スペクトル６０２がＹ軸方向に沿って所定の間隔にて表示される。４本の発光スペクトル６０２のＹ軸方向の間隔は、４本のキャピラリ３０５の配列ピッチに対応している。４本の発光スペクトル６０２の各々は、赤から青まで、Ｙ軸方向に延びている。４本の発光スペクトル６０２は、Ｙ軸方向に沿って重なって表示される。尚、４本の発光スペクトル６０２は、DNAバンド９０１が励起光９０３の照射領域を通過する間、画像５０２上をＸ方向に移動するが、波長分散方向に変化することはない。従って、見かけ上の発光スペクトルの変化が起きないため、擬似ピークの発生を抑えることができる。
【実施例２】
【００５３】
図５を参照して、本発明によるキャピラリ電気泳動装置の検出光学ユニットの第２の実施例を説明する。図５Ａは、本実施例の検出光学ユニットをＹＺ平面に沿って切断した断面構成を示す。図４に示す実施例では、４本のキャピラリからの４本の発光スペクトルは重なり合うため、各キャピラリからの発光スペクトルを読み取ることは困難である。そこで、本実施例では、回折格子３０２の代わりに、プリズム３０７によって波長分散を行う。プリズム３０７の波長分散力は、回折格子３０２の波長分散力より小さい。従って、図５Ｂに示すように、２次元検出器３０４によって得られる画像５０３にて、赤から青まで延びる発光スペクトル６０３の長さは小さくなり、４本のキャピラリからの蛍光を示す４本の発光スペクトル６０３は、互いに重ならない。従って、４本の発光スペクトル６０３をそれぞれ読み取ることができる。尚、プリズム３０７の表面には反射防止膜３０８が形成してあり、多重反射による迷光が発生しないようにしている。
【実施例３】
【００５４】
図６を参照して、本発明によるキャピラリ電気泳動装置の検出光学ユニットの第３の実施例を説明する。図６Ａは、図２Ａと同様であり、ガラス基板２０３上に４本のキャピラリ３０５がX軸に平行に延び、且つ、Ｙ軸方向に沿って所定の間隔にて配列されている状態を示す。図６Ｂは回折格子３０２及び刻み線４０３の方向を示す。本実施例では、図４Ｃに示した第１の実施例と比較して、回折格子３０２及び刻み線４０３が僅かに傾斜している。即ち、回折格子３０２の刻線４０３はＸ軸方向より僅かに傾斜した方向に延び、且つ、Ｙ軸方向より僅かに傾斜した方向に沿って所定の小さな間隔にて配列されている。従って、波長分散方向Ｗは、キャピラリ３０５に対し、完全に垂直方向ではなく、略垂直方向に配置される。キャピラリ３０５はＸ軸方向に延びているから、波長分散方向Ｗは、Ｙ軸方向に対して僅かに傾斜している。図６Ｃに示すように、２次元検出器３０４によって得られる画像５０４では、４本のキャピラリからの蛍光を示す４本の発光スペクトル６０４は、僅かに傾斜し、且つ、Ｙ軸方向に沿って互いに僅かにずれている。従って、４本の発光スペクトル６０４は、互いに重ならない。
【００５５】
本実施例では、キャピラリからの蛍光を回折格子３０２によって波長分散する。従って、得られる発光スペクトル６０４は十分長い。
【００５６】
本実施例では、波長分散方向Wを電気泳動方向Ｅに対して略垂直方向に設定するから、DNAバンドが励起光の照射領域を通過するとき、発光スペクトルの波長分散方向の移動量は極めて小さい。従って、擬似ピークの発生を抑えることができる。
【実施例４】
【００５７】
図７を参照して、本発明によるキャピラリ電気泳動装置の検出光学ユニットの第４の実施例を説明する。図７Ａに示すように、本実施例では、４本のキャピラリ３０５の照射部３０５ａを、互いに、Ｘ軸方向にずらせる。図７Ｂに示すように、波長分散方向Ｗは、図４の例と同様に、Ｙ軸方向である。即ち、回折格子３０２の刻線４０４はＸ軸に平行に延び、且つ、Ｙ軸方向に沿って所定の小さな間隔にて配列されている。
【００５８】
図７Ｃに示すように、２次元検出器３０４によって得られる画像５０５には、４本のキャピラリからの蛍光を示す４本の発光スペクトル６０５が、Ｘ軸方向及びＹ軸方向に沿って所定の間隔にて表示されている。４本の発光スペクトル６０５は、図示のように赤から青まで、Ｙ軸方向に延びている。４本の発光スペクトル６０５のＸ軸方向の間隔は、４本のキャピラリ３０５の照射部３０５ａのＸ軸方向のずれ量に対応している。４本の発光スペクトル６０５のＹ軸方向の間隔は、４本のキャピラリ３０５の配列ピッチに対応している。
【００５９】
本実施例では、４本のキャピラリのサンプル注入端からキャピラリ照射部３０５ａまでの距離、即ち、電気泳動長は、互いに異なる。４本のキャピラリにおける電気泳動長の差は、４本のキャピラリ３０５の照射部３０５ａのＸ軸方向にずれ量に対応している。
【００６０】
４本のキャピラリ３０５の照射部３０５ａのＸ軸方向にずれ量を十分小さくすれば、電気泳動長の差は十分小さくなる。従って、電気泳動長の差に起因した、検出誤差を小さくすることができる。尚、電気泳動長の差に起因した検出誤差が無視できない場合には、キャピラリ毎に泳動時間とDNA長を校正することにより、電気泳動長の差を補正することができる。あるいは、サンプル注入端からキャピラリ照射部３０５ａまでのどこかでキャピラリのたるみを調整することにより、電気泳動長を正確にあわせることもできる。
【実施例５】
【００６１】
本実施例では、励起光の照射方法を変え、複数のキャピラリを照射するようにスプレッドビームを照射する例である。以下、実施例1から実施例４との相違点を中心に説明する。
【００６２】
本実施例では、レーザ光源から発振したレーザをビームエキスパンダーによって広げ、シリンドリカルレンズによってライン状に収束させ、キャピラリの配列面と垂直方向からすべてのキャピラリを同時に照射する。これにより、キャピラリのばらつきに関係なく、すべてのキャピラリにほぼ同じレーザ強度で照射することが可能となる。
【実施例６】
【００６３】
本実施例では、励起光の照射方法を変え、複数のキャピラリをスキャンするようにレーザ光を照射する例である。以下、実施例1から実施例５との相違点を中心に説明する。
本実施例では、レーザ光源から発振したレーザ光を、ミラーで反射させ、対物レンズにより集光させ、キャピラリのレーザ照射位置に照射させる。ミラーと対物レンズは駆動ユニットを構成し、各キャピラリが並んでいる配列方向と同方向に高速往復駆動する。これにより、各キャピラリをレーザ光で次々とスキャン照射できる。
【００６４】
以上、本発明の例を説明したが、本発明は上述の例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは当業者に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明によるキャピラリ電気泳動装置の概略を示す図である。
【図２】本発明によるキャピラリ電気泳動装置の照射光学系の概略を示す図である。
【図３】従来のキャピラリ電気泳動装置の検出光学系の構造と２次元検出器上の像の関係を示す図である。
【図４】本発明によるキャピラリ電気泳動装置の検出光学系の第１の実施例の構造と２次元検出器上の像の関係を示す図である。
【図５】本発明によるキャピラリ電気泳動装置の検出光学系の第２の実施例の構造と２次元検出器上の像の関係を示す図である。
【図６】本発明によるキャピラリ電気泳動装置の検出光学系の第３の実施例の構造と２次元検出器上の像の関係を示す図である。
【図７】本発明によるキャピラリ電気泳動装置の検出光学系の第４の実施例の構造と２次元検出器上の像の関係を示す図である。
【図８】擬似ピーク発生のメカニズムの説明図である。
【符号の説明】
【００６６】
101…キャピラリアレイ、102…キャピラリ、103…励起光を照射する照射部、104…試料導入部、105…キャピラリの試料導入端、107…キャピラリを束ねるキャピラリヘッド、108…キャピラリ終端部、152…ポリマ充填ブロック、153…シリンジ、154…ポリマ流路、155…チューブ、156…電磁弁、163…陽極バッファ容器、164…陽極電極、130…恒温槽、201…LED光源、202…レンズ、203…ガラス基板、204…ガラス基板のLED側の平面、205…ガラス基板の球面、207…球面の中心、301…第１カメラレンズ、302…回折格子、303…第２カメラレンズ、304…２次元検出器、305…キャピラリ、305a…キャピラリ照射部、306…LP光学フィルタ、401,402,403,404…回折格子の刻線、307…プリズム、308…反射防止膜、901…DNAバンド、902…キャピラリ、903…励起光、904…発光スペクトル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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