(57)【要約】【課題】不規則形状の組織欠損部および空洞部内に充填され、かつ、高濃度に内包される可能性があると同時に、結合組織の細胞外基質に類似した固有の組成を与える原線維コラーゲン微粒子を製造する方法を提供する。【解決手段】酸性の水性媒体中の可溶性コラーゲン溶液は、乳化剤と混ぜられて第１混合物を調製する。第１混合物は、第１混合物と疎水性液体を含む油中水型エマルジョンを調製するのに有効な条件下で、疎水性液体と混ぜられる。油中水型エマルジョンは、連続的な液体で構成された第１相と、可溶性コラーゲン溶液から再構成されたコラーゲン線維を含み、分散的な固体で構成された第２相を含む分散体を調製するのに有効な条件下で、アルコール緩衝溶液に添加される。液体で構成された第１相は、分散体から除去されてコラーゲン小球体を調製する。コラーゲン小球体は架橋されて架橋型コラーゲン小球体を調製する。架橋型コラーゲン小球体は任意に乾燥されて架橋型コラーゲン微粒子を調製する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋型コラーゲン小球体の製造方法において、
酸性の水性媒体中で可溶性コラーゲン溶液を調製するステップと、
前記コラーゲン溶液を乳化剤と混合して第１混合物を調製するステップと、
前記第１混合物と疎水性液体を含む油中水型エマルジョンを調製するのに有効な条件下で、前記第１混合物を前記疎水性液体に混合するステップと、
連続的な液体で構成された第１相と、前記可溶性コラーゲン溶液から再構成されたコラーゲン線維を含む分散的な固体で構成された第２相を含む分散体を調製するのに有効な条件下で、前記油中水型エマルジョンをアルコール緩衝溶液に添加するステップと、
前記分散体から前記液体で構成された第１相を実質的に除去してコラーゲン小球体を調製するステップと、
前記コラーゲン小球体を架橋して架橋型コラーゲン小球体を調製するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、
前記可溶性コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンの精製したアテロペプチド類を含む、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、
前記酸性の水性媒体は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、アスコルビン酸、シュウ酸、コハク酸、マロン酸、アジピン酸、ピルビン酸、グルタール酸、酒石酸、アスパラギン酸、エポキシコハク酸、モノクロロ酢酸、サリチル酸、イタコン酸、ピロリドンカルボン酸、グリコール酸、硝酸、硫酸、リン酸および塩酸からなる群より選択された酸を含む、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、
前記乳化剤は、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ソルビタンエステル類、ポリソルベート類、ポリオキシエチラート化グリコールモノエーテル類、ポリオキシエチラート化アルキルフェノール類およびポロキサマー類からなる群より選択される、方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、
前記疎水性液体は、塩化メチレンおよび酢酸エチルからなる群より選択される、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、
アルコールは、エタノール、メタノールおよびイソプロパノールからなる群より選択される、方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、
架橋剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、クロム塩類およびジイソシアナート類からなる群より選択される、方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、
前記架橋型コラーゲン小球体を洗浄する、方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、
前記架橋型コラーゲン小球体を乾燥させて、架橋型コラーゲン微粒子を調製する、方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、
乾燥は凍結乾燥によって達成される、方法。
【請求項１１】
請求項１記載の方法において、
前記架橋型コラーゲン小球体を、可溶性カルシウムイオン源と可溶性リン酸塩源を含む水中に分散させて、鉱化処理した架橋型コラーゲン小球体を調製する、方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法において、
前記鉱化処理した架橋型コラーゲン小球体を洗浄する、方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の方法において、
前記鉱化処理した架橋型コラーゲン小球体を乾燥させて、鉱化処理した架橋型コラーゲン微粒子を調製する、方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法において、
乾燥は凍結乾燥によって達成される、方法。
【請求項１５】
請求項１記載の方法において、
前記酸性の水性媒体のｐＨは１から４までである、方法。
【請求項１６】
請求項１記載の方法において、
前記可溶性コラーゲン溶液は、酸性の水性媒体１ミリリットルあたり、１ミリグラムから３５ミリグラムまでの可溶性コラーゲンを含む、方法。
【請求項１７】
請求項１記載の方法において、
前記油中水型エマルジョン中における、前記可溶性コラーゲンと前記疎水性液体との体積比は、１：１から１０：１までの範囲である、方法。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔発明の分野〕  この発明は、架橋型コラーゲン小球体および微粒子の製造方法に関するものである。
【０００２】
〔発明の背景〕
コラーゲンは、皮膚、腱、骨、軟骨、血管および靭帯を含む全結合組織の細胞外基質の主要な蛋白質成分である。２５個の型を有するコラーゲンは、蛋白質精製によって、環状ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびゲノムＤＮＡライブラリスクリーニング、および生物情報によって発見されている。
【０００３】
Ｉ型のコラーゲンは、軟組織強化用の注射可能なコラーゲン製剤、術中および損傷後の出血を調節する止血物質、創部包帯剤および血管移植被覆物のような用途において、数十年間、生物医学的用途の生体材料として広く使用されている。また、Ｉ型のコラーゲンは、化学療法薬および抗生物質を調節して放出するための生分解性担体として使用されている。
【０００４】
線維芽細胞で播種されたコラーゲンゲルは、商品名アプリグラフト（ＡＰＬＩＧＲＡＦＴ）（スイス国バーゼルのサンドスＡＧ社（Sandoz）製）で販売された人工皮膚の「真皮」層として使用されており、コラーゲンスポンジは、脊椎固定および長骨骨折治療用の骨形成蛋白質−２（ＢＭＰ−２）の骨伝導性担体として使用されている。
【０００５】
コラーゲン系の生体材料は、原線維からなる線維、薄膜、シート、スポンジおよび分散体に配合されている。注射されるコラーゲン製剤は、最少侵襲性の外科器具で組織領域にアクセスできる能力のために、外科手術において特に有利である。
【０００６】
米国特許第４，４８８，９１１号は、未変性のコラーゲン線維に類似するコラーゲン線維を製造する方法を開示している。沈殿して再構成された線維は、さらに、例えばホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒド等のアルデヒド類のような化学物質、熱あるいは放射線を用いて架橋されてもよい。
【０００７】
コラーゲン原線維分散体は、失禁治療において尿道括約筋の周囲組織に注射され、また美容目的で軟組織の強化のために注射されている。米国特許第４，７７６，８９０号は、骨再建用無機粒子を送出するためのコラーゲン原線維分散体の使用を開示している。このような注射による細胞病変部への薬剤の送出に対する分散体の適用は、米国特許第４，６１９，９１３号および第Ｒｅ．３５，７３８号に開示されている。
【０００８】
クロードハリー（Crowdhury）およびミトラ（Mitra）（「試験官内放出された架橋不溶性コラーゲンおよびコラーゲン・ゼラチン小球体由来のヌクレオシドデオキシウリジンモデルの流動性」１９９９年、国際製薬誌第１９３巻第１１３頁）は、酸性溶液中に膨潤させた不溶性コラーゲンを用いてコラーゲン微粒子を配合する方法を記述している。コラーゲンの分散体を塩化メチレンと混合し、均質化処理によって乳化する。結果として得られたエマルジョンを、その後、塩化メチレンを蒸発させるために一定速度で撹拌中のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液中に注入する。コラーゲン懸濁液を、その後、グルタルアルデヒドを用いて架橋する。
【０００９】
ロスラー・ビィー（Rossler B）ら（「コラーゲン微粒子：調製および特性」１９９５年、マイクロカプセル誌第１２（１）巻第４９頁）は、コラーゲン微粒子を製造するための同様の方法を開示している。コラーゲン分散体を流動パラフィン中に添加する。この混合物を乳化した後、グルタルアルデヒド溶液を添加してコラーゲンを架橋する。分離したコラーゲン微粒子を２−プロパノールで洗浄する。
【００１０】
米国特許第５，６７２，３０１号は、エマルジョン中に分散させながら、コラーゲンの化学的修飾によってコラーゲン微粒子を製造する方法を開示している。エマルジョンの連続的な相に対して不溶性のアルカン化剤の添加によって、酸溶解性アテロコラーゲンをエマルジョンの分散的な相に対して不溶な状態にする。
【００１１】
従来の技術では、上述したように、注射可能なコラーゲン製剤を製造する方法を開示しているが、原線維微粒子を製造するのに使用可能な方法を開示していない。この発明は、不規則形状の組織欠損部および空洞部内に充填され、かつ、高濃度に内包される可能性があると同時に、結合組織の細胞外基質に類似した固有の組成を与える原線維コラーゲン微粒子を製造する方法を提供するものである。
【００１２】
〔発明の概要〕
この発明は、可溶性コラーゲンから架橋型コラーゲン小球体および微粒子を製造する方法に関するものである。この明細書において使用されているように、可溶性コラーゲンは、同一の水性媒体に対して膨潤可能であるが可溶性でない不溶性コラーゲンとは対照的に、ｐＨが約４以下の酸性媒体に完全に溶解するコラーゲンである。酸性の水性媒体中で可溶性コラーゲン溶液は調製される。この可溶性コラーゲン溶液は、乳化剤と混合して、可溶性コラーゲン溶液と乳化剤との第１混合物を調製する。第１混合物は、この第１混合物と疎水性液体を含む油中水型エマルジョンを調製するのに有効な条件下で、疎水性液体と混合される。油中水型エマルジョンは、連続的な液体で構成された第１相と、可溶性コラーゲン溶液から再構成されたコラーゲン線維を含む分散的な固体で構成された第２相を含む分散体を調製するのに有効な条件下で、アルコール緩衝溶液に添加される。連続的な液体で構成された液相は、その後、分散体から実質的に除去され、これによりコラーゲン小球体を調製することができる。コラーゲン小球体は、その後、架橋され、この架橋型コラーゲン小球体は洗浄される。架橋型コラーゲン小球体は、さらに乾燥され、架橋型コラーゲン微粒子を調製し、任意に無機質を含有するように修飾される。
【００１３】
〔発明の詳細な説明〕
この発明による架橋型コラーゲン小球体を製造する方法では、酸性の水性媒体中に溶解した可溶性コラーゲン溶液は調製され、あるいは乳化剤と混合して与えられる。この溶液は、油中水型エマルジョンを調製するのに有効な条件下で、適切な疎水性液体に添加される。このエマルジョンは、その後、一定速度で撹拌された状態のアルコール緩衝溶液に添加され、これにより上記アルコール緩衝溶液中の可溶性コラーゲンはアルコール緩衝溶液による酸性媒体の中和を経てコラーゲン線維に再構成され、沈殿して小球体の状態となる。上記エマルジョンの連続的な液相は、その後、蒸発させられて実質的に液相のすべてを除去する。架橋剤は、コラーゲン小球体を架橋するために添加される。架橋型コラーゲン小球体は、その後、蒸留水で数回、洗浄されて、すべての残留物を除去する。洗浄済みの小球体は、その後、架橋型コラーゲン微粒子を調製するために乾燥されるか、あるいは後で微粒子に処理するまで、水中に保存されてもよい。
【００１４】
この発明で使用するコラーゲンは、すべての型の可溶性コラーゲンが使用可能である。１つの実施の形態では、Ｉ型動物コラーゲンの精製したアテロペプチド類が使用される。ペプシン等の酵素は、上記コラーゲンに適用されて、免疫反応を生じる可能性のある末端テロペプチドを除去し、これによりコラーゲンの免疫原特性をかなり軽減することができる。コラーゲン溶液は、その後、この明細書に記述されているように、この発明の条件下でコラーゲン線維に再構成されることが可能となる。
【００１５】
１つの実施の形態では、コラーゲン溶液は、使用する酸性の水性媒体１ミリリットルあたり、約１ミリグラムから約３５ミリグラムまでの可溶性コラーゲンを含む濃度で調製される。他の実施の形態では、上記濃度は、２０から３０ミリグラム／ミリリットルであってもよい。酸性の水性媒体は、約１から約４までの範囲のｐＨを有している。１つの実施の形態では、上記水性媒体は、約５から約１００ミリモルまでの塩酸水である。酸性溶液を調製するのに適した他の酸としては、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、アスコルビン酸、シュウ酸、コハク酸、マロン酸、アジピン酸、ピルビン酸、グルタール酸、酒石酸、アスパラギン酸、エポキシコハク酸、モノクロロ酢酸、サリチル酸、イタコン酸、ピロリドンカルボン酸、グリコール酸、硝酸、硫酸およびリン酸を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
乳化剤は、上記コラーゲン溶液に添加されて、コラーゲン溶液と、油中水型エマルジョンの調製を促進する乳化剤とを含む第１混合物を調製する。乳化剤の濃度は、可溶性コラーゲン溶液の約０．１から約５重量％までの範囲内、あるいは０．１重量％と１重量％との間の範囲内としてもよい。適切な乳化剤としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ソルビタンエステル類、ポリソルベート類、ポリオキシエチラート化グリコールモノエーテル類、ポリオキシエチラート化アルキルフェノール類およびポロキサマー類を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
第１溶液（第１混合物）は、油中水型エマルジョンを調製するのに有効な条件下で、疎水性液体に混合される。使用可能な疎水性液体としては、水と混和しない有機溶媒を含むものである。また、上記疎水液体は、架橋型コラーゲン小球体および微粒子を調製する過程において、上記疎水性液体の蒸発を促進する相対的に低い沸点を有すべきである。このような有機溶媒としては、塩化メチレンおよび酢酸エチルを含むが、これらに限定されるものではない。この発明に使用される疎水性液体に対するコラーゲン溶液の体積比は、約１：１から約１０：１までの範囲、あるいは約２：１とすることができる。
【００１８】
この発明の油中水型エマルジョンは、疎水性液体および乳化剤を含有するコラーゲン溶液の第１混合物を機械的に撹拌することによって調製される。適切な機械力は、機械的な撹拌、すなわち均質化処理、超音波プローブによって、あるいはコロイドミルの場合のように狭い空間、すなわち細チューブ、弁あるいは他のオリフィスにエマルジョン成分を移すことによって、印加可能である。この発明に使用される乳化技術の１つは、微小乳化針にエマルジョン成分を移すことである。
【００１９】
この発明におけるアルコール緩衝溶液は、油中水型エマルジョン由来の溶解したコラーゲンを個別に取り扱って、小球体に再構成するのに使用される。アルコール緩衝溶液の緩衝成分は、上記エマルジョン中のコラーゲン酸性溶液のｐＨを中和することによって、コラーゲン線維の再構成体を球形状にする。上記アルコール緩衝溶液は、高い中和力用の中性ｐＨおよび濃度で調製される。さらに、アルコール緩衝溶液は、コラーゲン分子を安定化するために、塩、例えば塩化ナトリウムで調製される。この発明に使用される緩衝液の１つは、０．０１モルから０．３モルまでの塩化ナトリウムを含み、６．５と７．５との間あるいは７．２と７．４との間のｐＨを呈し、０．００１モルと１モルとの間の濃度を有するリン酸緩衝生理食塩水である。アルコール成分は、液相中に分散されたコラーゲン固相の球形状を安定化させるのを促進する。アルコール成分は、疎水性液体とも緩衝液とも混和する。適切なアルコール類としては、エタノール、メタノール、イソプロパノールおよびこれらの混合物を含むが、これらに限定されるものではない。アルコール緩衝溶液中における緩衝成分の体積は、アルコール成分の２倍から４倍である。
【００２０】
この発明における架橋剤は、コラーゲンを球形状に架橋するために使用される。適切な架橋剤としては、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、クロム塩類、ジイソシアナート類およびこれと同等物を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
この発明の他の実施の形態では、架橋型コラーゲン小球体は、実質的に親油処理すなわち凍結乾燥されて、不規則形状の微粒子を調製する。水分を除去した結果として、これらの微粒子は、皺になり、収縮した球体に見える。この微粒子は、再水和化後においても、その不規則形状を保っている。この形状は、体積に対してその表面積が大きいために、損傷組織の再生／修復に関して特に有利である。このような微粒子の凝集は、組織の浸潤および成長を可能にするのに十分な有孔性および表面積を有する三次元構造を形成することになる。
【００２２】
この発明のさらに他の実施の形態では、コラーゲン微粒子には、コラーゲン基質中に無機質のリン酸カルシウムを固定するために更なる処理が施される。結果として調整される鉱化コラーゲン微粒子は、骨の欠陥を修復するのに適している。コラーゲン微粒子の鉱化処理は、米国特許第５，２３１，１６９号に記述された方法によって達成される。リン酸カルシウムは、可溶性カルシウム源と可溶性リン酸塩源の段階的な同時添加、好ましくは連続的な添加によって、コラーゲン微粒子の分散体中に調製される。カルシウム源およびリン酸塩源に加えて、炭酸塩、塩化物、フッ化物、ナトリウム塩あるいはアンモニウム塩等の他のイオン源も使用可能である。無機質のリン酸カルシウムの特性は、ヒドロキシアパタイトカルシウム、ヒドロキシ／フロロアパタイト、ブラッシュ石、ダーライト、モネタイト、リン酸カルシウム炭酸塩（方解石）、オスタカルシウムリン酸塩、リン酸３カルシウムを含み、広く多様なものであってもよい。ここで、カルシウムとリン酸塩との化学量論的な選択並びに他のイオンの存在は特定の組成物をもたらすことになる。無機質相は、通常、１．２：１．８のカルシウム：リンの比を有し、六角対称形状であり、ヒドロキシアパタイト無機質群の１つとなる。無機質相の粒子サイズは、約５ミクロン以下となる。無機質のリン酸カルシウムは、コラーゲンに対するリン酸カルシウムの重量比は、概ね、約４：１から１：１までの範囲となり、典型的には約７：３である。鉱化生成物中に存在するコラーゲンの量は、概ね、約８０％から約３０％までの範囲となる。
【００２３】
この発明のさらに他の実施の形態では、注射可能であり、生分解性である組織修復または再生用の充填物は、コラーゲン微粒子（鉱化処理あるいは鉱化未処理）と生体適合性の液状担体とから構成される。このような手段用の理想的な担体は、生分解性であり、かつ、粘性を呈するものである。この液状担体は、粒子を完全に湿潤させるように十分に流動性を有すべきである。担体としては、ヒアルロン酸、スクシニル基を有するコラーゲン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ゼラチン、コラーゲンゲル類、フィブリノーゲン、トロンビン、そして液状アルキドポリエステル類および液状ポリヒドロキシ化合物を含むポリマーを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
また、注射可能であり、生分解性である組織修復または再生用の上記充填物は、生理活性因子を含めてもよい。この発明の使用に適した生理活性因子の例としては、細胞接着に影響を与えることが知られた「ＲＧＤ」インテグリン結合配列を有するペプチド含有変異物等の細胞接着媒介物、生物学的に活性なリガンド類、および細胞または組織の内殖の特定変異を強化あるいは排除する物質を含む。このような物質の例としては、インテグリン結合配列、リガンド類、骨形態発生蛋白質、上皮成長因子、インスリン様成長因子ＩＧＦ−Ｉ、インスリン様成長因子ＩＧＦ−ＩＩ、治療効果因子ＴＧＦ−βＩ−ＩＩＩ、成長分化因子、副甲状腺ホルモン、血管内皮成長因子、ヒアルロン酸、糖蛋白質、リポ蛋白質、線維芽細胞成長因子ｂＦＧＦ、治療効果因子ＴＧＦ−βスーパーファミリー因子、骨形成蛋白質ＢＭＰ−２、骨形成蛋白質ＢＭＰ−４、骨形成蛋白質ＢＭＰ−６、骨形成蛋白質ＢＭＰ−１２、骨形成蛋白質ＢＭＰ−１４（ＭＰ５２としても公知）、ソニックヘッジホッグ、象牙質形成因子ＧＤＦ５、象牙質形成因子ＧＤＦ６、象牙質形成因子ＧＤＦ８、血小板由来成長因子ＰＤＧＦ、特定の成長因子の産生調節に影響を与える小さな分子、テナスシン−Ｃ、フィブロネクチン、トロンボエラスチン、トロンビン由来ペプチド類、ヘパリン結合ドメインおよびこれらの同等物を含む。さらに、上記注射可能な物質としては、脱鉱化処理した骨基質（ＤＢＭ）、血小板多血漿、骨髄穿刺液および骨片からなる群から選択された生物由来物質と混合した鉱化処理済みコラーゲン粒子を含めてもよく、上記群に含まれる物質のすべては自己原生、同種異系および異種の源由来ものであってもよい。
【００２５】
他の実施の形態では、架橋型コラーゲン微粒子は、細胞系治療用の輸送手段としての役割を果たす可能性がある。この発明の上記コラーゲン微粒子内で接種あるいは培養可能な細胞は、骨髄細胞、間葉細胞、間質細胞、幹細胞、胚幹細胞、骨芽細胞、脂肪組織由来前駆細胞、骨髄細胞由来前駆細胞、末梢血前駆細胞、成人組織単離幹細胞、形質転換細胞およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
この発明の骨組織修復用の実施の形態は、鉱化処理済みコラーゲン粒子と新鮮な骨髄穿刺液との組み合わせであり、これにより骨髄は、液状担体並びに骨形成性成長因子および前駆細胞の源としての役割を果たすことができる。
【００２７】
この発明の実施の形態は、必要があれば容易に調製可能である。架橋型コラーゲン微粒子は、上記液状担体および生理活性剤を閉鎖システム内で添加しかつ混合することができる注射器に予め内包しておくことが可能である。好適な閉鎖システムは、２つの注射器と、共通の接続栓とで構成され、これによりコラーゲンおよび液状成分は別の注射器内に収容される。液状成分は、上記栓を通過させることによってコラーゲン充填注射器内に添加される。液状成分が架橋型コラーゲン微粒子を十分に湿潤させた後に、両者は、２つの注射器間であちらこちらに移すことによって、さらに混合させることができる。これらの実施の形態は、後の使用のために無菌状態で製造され、かつ梱包される。ある特定の場合には、上記実施の形態は、期限が切れる可能性のある細胞物質を含めない。このような実施の形態は、架橋型コラーゲン微粒子と、サイトカイン類あるいは遺伝子構成成分を含有する液状担体とを含むものである。
【００２８】
〔実施例〕
実施例１  架橋型コラーゲン小球体
２００ミリモルのリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）を含有する１０％（体積／体積）液（ｐＨ１１．２）を、商品名ヴィトロゲン（ＶＩＴＲＯＧＥＮ）（米国カリフォルニア州パロアルトのコヒージョンテクノロジー社（Cohesion Technologies Inc.）製）で販売されている２．９ミリグラム／ミリリットルのコラーゲン溶液に添加し、これにより固形状の可溶性コラーゲンを上記コラーゲン溶液から沈殿させた。この固形状の可溶性コラーゲンを遠心力および脱イオン水での洗浄によって分離した。１モルの塩酸と、水／塩酸によって調製される水性媒体中で上記可溶性コラーゲンを溶解して３０ミリグラム／ミリリットルの可溶性コラーゲンおよび２０ミリモルの塩酸を含有する濃度の可溶性コラーゲン溶液を調製するのに十分な量の水とを、上記固形状の可溶性コラーゲンに添加した。４ミリリットルの可溶性コラーゲン溶液に、乳化剤としての０．４４ミリリットルの１０％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液（米国ミズーリ州セントルイスのシグマ社（Sigma）製、ポリビニルアルコール：分子量３０，０００〜７０，０００）を添加して約１％（重量／体積）濃度のポリビニルアルコールを得た。可溶性コラーゲン溶液とポリビニルアルコール系乳化剤との混合物を一方のガラス製注射器内に充填した。
【００２９】
８ミリリットルの塩化メチレンを他方のガラス製注射器内に充填した。１６ゲージで、７３ミリメートルの微小乳化針（米国ニューヨーク州ニューハイドパークのポッパー・エンド・サンズ社（Popper & Sons Inc.）製）を上記２つの注射器間に接続した。２つの注射器間であちらこちらに上記混合物を移すことによって球状の小球体エマルジョンを調製した。エマルジョンを調製するために、２つの注射器間であちらこちらに上記材料を移すのは１０回で十分である。上記乳化針を注射器から外した後、５０％エタノールを含有し、かつ一定速度で撹拌中の１００ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）に上記エマルジョンを素早く注入した。５分後、０．２５ミリリットルのグルタルアルデヒド溶液（米国ミズーリ州セントルイスのシグマ社製、５０％水溶液）を浴中に添加してコラーゲン小球体を架橋した。４時間後、架橋型コラーゲン小球体に対して、２回にわたって、遠心分離および脱イオン水による洗浄を施した。上記架橋型コラーゲン小球体を水中で保存し、かつ４℃を維持した。図１は、この実施例１の処理工程によって調製された洗浄済みの架橋型コラーゲン小球体を示す光学顕微鏡写真を示している。
【００３０】
実施例２  架橋型コラーゲン微粒子
実施例１のコラーゲン小球体を、研究室スケールの凍結乾燥器（米国ニューヨーク州ストーンリッジのエフティーエスシステム社（FTS Systems）製のデュラストップ／デュラドライ凍結乾燥システム）で凍結乾燥させた。この凍結乾燥サイクルを次のようにした。上記粒子分散体をドライアイスで急冷して上記分散体を急速冷凍した。その後、上記分散体の粒子を、−４０℃の凍結乾燥器内での予冷状態に１時間、置いた。チャンバ内を１００ミリトールの減圧とした。その後、上記粒子を−４０℃で３時間、−２５℃で２４時間、−１５℃で３時間、−５℃で３時間、５℃で４時間および２０℃で１時間乾燥させた。図２は、不規則形状の架橋型コラーゲン微粒子を示す走査型電子顕微鏡写真を示している。
【００３１】
実施例３  架橋型コラーゲン小球体の鉱化処理
実施例１で記述されたように調製された５００ミリグラムの架橋型コラーゲン小球体を２００ミリリットルの脱イオン水中に分散させた分散体を５００ミリリットルの反応容器内に移した。上記分散体のｐＨを１規定の水酸化ナトリウム溶液で１１．４に調整した。上記反応容器に、１６時間にわたって、塩化カルシウムおよびリン酸ナトリウムをそれぞれ０．１１グラム／分および０．０９グラム／分の速度で添加した。この添加中に、上記ｐＨを、１規定の水酸化ナトリウム溶液および、ｐＨコントローラを備えた蠕動性ポンプ（米国ウィスコンシン州ミドルトンのサイログ社（SciLog）製のエキスパートポンプ）で１１．４±０．２に維持した。その後、スラリー状の分散体を７５マイクロメートルの篩にかけると共に、上記分散体の導電率が導電メーター（米国マサチューセッツ州ビバリーのサーモ電子株式会社（Thermo Electron Corporation）製：オリオン１１５Ａ＋）で５０マイクロジーメンス以下となるまで、脱イオン水で洗浄を繰り返した。
【００３２】
その後、上記小球体を実施例２に記述されたサイクルを用いて凍結乾燥させた。図３は、鉱化処理したコラーゲン微粒子を示す走査型電子顕微鏡写真を示している。鉱化処理した粒子のエネルギー分散性Ｘ線分析は、コラーゲン基質上にリン酸カルシウムの存在を示した。
【００３３】
以下、この発明の実施の態様を説明する。
（１）架橋型コラーゲン小球体の製造方法において、
酸性の水性媒体中で可溶性コラーゲン溶液を調製するステップと、
前記コラーゲン溶液を乳化剤と混合して第１混合物を調製するステップと、
前記第１混合物と疎水性液体を含む油中水型エマルジョンを調製するのに有効な条件下で、前記第１混合物を前記疎水性液体に混合するステップと、
連続的な液体で構成された第１相と、前記可溶性コラーゲン溶液から再構成されたコラーゲン線維を含む分散的な固体で構成された第２相を含む分散体を調製するのに有効な条件下で、前記油中水型エマルジョンをアルコール緩衝溶液に添加するステップと、
前記分散体から前記液体で構成された第１相を実質的に除去してコラーゲン小球体を調製するステップと、
前記コラーゲン小球体を架橋して架橋型コラーゲン小球体を調製するステップと、
を含む、方法。
（２）実施態様１記載の方法において、
前記可溶性コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンの精製したアテロペプチド類を含む、方法。
（３）実施態様１記載の方法において、
前記酸性の水性媒体は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、アスコルビン酸、シュウ酸、コハク酸、マロン酸、アジピン酸、ピルビン酸、グルタール酸、酒石酸、アスパラギン酸、エポキシコハク酸、モノクロロ酢酸、サリチル酸、イタコン酸、ピロリドンカルボン酸、グリコール酸、硝酸、硫酸、リン酸および塩酸からなる群より選択された酸を含む、方法。
（４）実施態様１記載の方法において、
前記乳化剤は、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ソルビタンエステル類、ポリソルベート類、ポリオキシエチラート化グリコールモノエーテル類、ポリオキシエチラート化アルキルフェノール類およびポロキサマー類からなる群より選択される、方法。
（５）実施態様１記載の方法において、
前記疎水性液体は、塩化メチレンおよび酢酸エチルからなる群より選択される、方法。
【００３４】
（６）実施態様１記載の方法において、
アルコールは、エタノール、メタノールおよびイソプロパノールからなる群より選択される、方法。
（７）実施態様１記載の方法において、
架橋剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、クロム塩類およびジイソシアナート類からなる群より選択される、方法。
（８）実施態様１記載の方法において、
前記架橋型コラーゲン小球体を洗浄する、方法。
（９）実施態様１記載の方法において、
前記架橋型コラーゲン小球体を乾燥させて、架橋型コラーゲン微粒子を調製する、方法。
（１０）実施態様９記載の方法において、
乾燥は凍結乾燥によって達成される、方法。
【００３５】
（１１）実施態様１記載の方法において、
前記架橋型コラーゲン小球体を、可溶性カルシウムイオン源と可溶性リン酸塩源を含む水中に分散させて、鉱化処理した架橋型コラーゲン小球体を調製する、方法。
（１２）実施態様１１記載の方法において、
前記鉱化処理した架橋型コラーゲン小球体を洗浄する、方法。
（１３）実施態様１１記載の方法において、
前記鉱化処理した架橋型コラーゲン小球体を乾燥させて、鉱化処理した架橋型コラーゲン微粒子を調製する、方法。
（１４）実施態様１３記載の方法において、
乾燥は凍結乾燥によって達成される、方法。
（１５）実施態様１記載の方法において、
前記酸性の水性媒体のｐＨは１から４までである、方法。
【００３６】
（１６）実施態様１記載の方法において、
前記可溶性コラーゲン溶液は、酸性の水性媒体１ミリリットルあたり、１ミリグラムから３５ミリグラムまでの可溶性コラーゲンを含む、方法。
（１７）実施態様１記載の方法において、
前記油中水型エマルジョン中における、前記可溶性コラーゲンと前記疎水性液体との体積比は、１：１から１０：１までの範囲である、方法。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】洗浄済みの架橋型コラーゲン小球体を示す光学顕微鏡写真である。
【図２】凍結乾燥によって調製された架橋型コラーゲン微粒子を示す走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。
【図３】鉱化処理したコラーゲン微粒子を示す走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。
【図１】
2006291198.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【外国語明細書】
2006291198000001.pdf