(57)【要約】【課題】血小板数調節薬のヒト血小板に対する効果を動物体内で評価するスクリーニング方法を提供する。【解決手段】ヒト幹細胞を移植したNOGマウスを用いて、実験動物マウス体内にヒト巨核球・血小板造血システムを構築することが可能となり、またヒト幹細胞を移植したNOGマウスにヒト巨核球・血小板造血に作用を有すると期待される化合物、抗体、ペプチドあるいはたんぱく質などを投与して、血小板数の増減をモニターすることが可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト幹細胞を移植したNOG（NOD/Shi-scid, IL-2Rγ KO）マウスに候補物質を投与し、当該マウス中におけるヒト血小板の数および／または機能を測定することを含む血小板数調節薬または血小板数非影響薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
血小板数調節薬が血小板増多薬である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
血小板数調節薬が血小板減少薬である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
血小板数調節薬が血小板機能保持、亢進あるいは低下薬である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
血小板数非影響薬が血小板非増多薬である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
血小板数非影響薬が血小板非減少薬である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
血小板数非影響薬が血小板機能保持、亢進あるいは低下薬である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
NOG（NOD/Shi-scid, IL-2Rγ KO）マウスにヒト幹細胞を移植することを含む、ヒト巨核球・血小板造血システムを有するマウスモデルの作出法。
【請求項９】
ヒト幹細胞が移植され体内にヒト巨核球・血小板造血システムを有するNOG（NOD/Shi-scid, IL-2Rγ KO）マウスモデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト血小板をマウス体内で恒常的に生産させ、ヒト血小板の数を調節する化合物、抗体、ペプチドあるいはたんぱく質などの因子をスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血小板は血液中において止血作用を司る重要な細胞である。その生体内での寿命は短く、造血幹細胞から巨核球を経て血小板が日々生産されている。この血小板を生産する生体内システムは巨核球・血小板造血と呼ばれている。巨核球・血小板造血にはトロンボポエチン（TPO）、インターロイキン１１、インターロイキン３やストローマ細胞由来因子１（SDF1）などの液性因子が関与することが知られている(非特許文献1-2)。特に、TPOは巨核球・血小板造血において重要な役割をはたしていることが知られている。TPOはその受容体であるMpl蛋白を介して造血幹細胞から巨核球への増殖と分化を促し、血小板を生産させる(非特許文献1)。このTPOの作用より、Mpl蛋白を活性化させることは、血小板を増加させ、血小板減少による出血リスクを回避する治療法として有用であると期待される。このことから、例えばMpl蛋白を活性化させる化合物や抗体等がスクリーニングされている(特許文献１)。
【０００３】
一方、血小板が血液中に過剰量に存在すると、血栓を形成するリスクが高まる。そのため、過剰量の血小板を減少させる治療法が必要である。そのような治療法としては、例えばアナグレライドやインターフェロンアルファなどの薬剤投与が試みられている(非特許文献３〜４)。
【０００４】
また、インターフェロンはB型あるいはC型肝炎疾患などに対する治療薬として使用されているが、その主たる副作用として血小板減少症を誘発することが知られている。そのため、血小板減少を誘発しないインターフェロンなどの薬剤の開発が望まれている。
【０００５】
一般的に薬剤としての化合物、抗体、ペプチドあるいはたんぱく質などの物質（以下、化合物等）のスクリーニングにおいては、例えば分子生物学的手法を用いて、ヒトと同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を作製して、試験管内（in vitro）において、活性化能や阻害能を測定する方法がとられる。そのような方法でスクリーニングされた有望な化合物等は生体内での効果を確認するために、動物試験（in vivo）を実施する。しかし、ほとんどの場合、標的とする蛋白質のアミノ酸配列がヒトと実験動物の間では同一ではない。従って、用いる実験動物種のアミノ酸配列を有する標的蛋白質とヒトアミノ酸配列の標的蛋白質とではその活性値がずれることが多く、時としては非常に限定された種のアミノ酸配列標的蛋白質にのみに、有望な化合物等が活性を示すこともあり得る。
【０００６】
このように、種特異的な活性を示す場合、動物試験の実施としては、遺伝子を改変した動物を用いることが出来る。例えば、ヒトアミノ酸配列を発現する遺伝子を導入したトランスジェニックマウスや特定の領域にその遺伝子を導入したノックインマウスなどが利用可能である。しかしこのような遺伝子導入動物においては、標的とする蛋白質のみが目的とする種（例えばヒト）に置き換わっているため、蛋白質と蛋白質の相互作用において発現する機能においては、通常とは異なる反応を示す可能性もある。そのため、有望な化合物等のヒトでの効果を予測するという動物試験本来の意味において十分な知見が得られないこともあり得る。
【０００７】
そこで、標的とする蛋白質のみでなく、標的とする巨核球・血小板造血システムそのものを実験動物体内に構築することが必要とされている。
【０００８】
ヒト細胞の増殖と分化を動物体内で解析するには、免疫寛容動物にヒト細胞を移植する必要がある。そのような免疫寛容動物としては、羊胎児や免疫不全マウスが知られている。免疫不全マウスとしてはヌードマウスやC.B-17-scidマウスなどをはじめ、よりヒト細胞が生着しやすい動物としてNOD/shi-Scidマウス、NOD/LtSz-scidマウス、β2m (null) NOD/LtSz-scidマウス、などの改変動物が作製されている。これらの改変マウスに、ヒト造血幹細胞・前駆細胞とよばれるCD34陽性細胞などを移植することにより、ヒトCD45陽性細胞を指標とした移植効率・造血再構築能の測定などが広く実施されている。しかしながら、ヒトCD45を指標としたキメラ率においては、その内訳として多くの細胞がCD19陽性のヒトB細胞系列であり、ヒト骨髄球系細胞の出現率は低いものとされている(非特許文献5)。特に、巨核球・血小板造血においては、マウス骨髄中にヒト巨核球（CD41陽性細胞）が存在することは知られているが、マウス末梢血液に存在するヒト血小板の動態についてはほとんど知られていない。
【０００９】
これまでの報告では、NOD/LtSz-scidマウスあるいはβ2m (null) NOD/LtSz-scidマウスにヒト末梢血CD34陽性細胞を移植した場合には、移植後2-3週にマウス末梢血中にヒト血小板が出現することが知られている。しかし、ヒト血小板が検出されない個体も存在し生着性にばらつきが存在する。また、4週以降には顕著にヒト血小板数は減少し消失していくことがしられている(非特許文献6-8)。さらに、ヒト末梢血CD34陽性細胞を移植したNOD/LtSz-scidマウスにTPOを含むサイトカインを投与することにより、ヒト巨核球・血小板造血は著しく阻害されることが知られている(非特許文献6)。また、Perez L.E.らの報告によれば、NOD/LtSz-scidマウスにヒト臍帯血由来単核球を移植した場合には13週までヒト血小板が出現するがそれ以降の長期については不明である。また、そのマウスにSDF-1発現アデノウイルスを感染させることで、一過性にヒト血小板増加は認められるが、移植初期（3週目）での増加効果は認められない。さらに、該モデルマウスにTPO発現アデノウイルスを感染させた場合には、ヒト血小板の増加はみとめられない(非特許文献9)。これらのことから、いままでの免疫不全マウスを用いたヒト巨核球・血小板造血解析は、ヒト血小板の数を調節する化合物等のスクリーニング系として利用できるものではなかった。
【００１０】
また、WO 2002/062775(特許文献２)の記載によれば、Mpl蛋白質に対するアゴニスト作用を有する化合物には、ヒト血小板生産が認められるマウスにおいて血小板増加作用があるとの記載が認められるが、詳細は不明である。
【００１１】
また、WO 2002/043477(特許文献３)の記載によれば、免疫不全マウス（NOGマウス）にヒト臍帯血由来CD34陽性細胞を移植した場合には、12週目までヒト血小板が出現する。しかし、上記のようにNOD/LtSz-scidマウスあるいはβ2m (null) NOD/LtSz-scidマウスにヒト末梢血CD34陽性細胞を移植した場合においては4週以降には顕著にヒト血小板数は減少し消失していくことから、NOGマウスにおいて12週以降の長期についてヒト血小板が安定的に出現するかは不明である。また、上記のようにNOD/LtSz-scidマウスにおいては、TPOを含むサイトカインを投与することによりヒト巨核球・血小板造血は著しく阻害されること、あるいはTPO発現アデノウイルスを感染させた場合にはヒト血小板の増加はみとめられないという報告があるように、免疫不全マウス体内にヒト血小板の出現がみとめられるという知見のみで、ヒト血小板の数を調節する化合物等のスクリーニング系に利用可能であるかは予測不能であった。
【００１２】
【特許文献１】WO 2004/108683
【特許文献２】WO 2002/062775
【特許文献３】WO 2002/043477
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1995; 92, p. 3234-3238
【非特許文献２】Nat. Med., 2004; 10, p. 64-71
【非特許文献３】Cancer, 2003; 98, p. 100-109
【非特許文献４】Cancer, 2004; 101, p. 2239-2246
【非特許文献５】Leukemia, 2003; 17, p. 960-964
【非特許文献６】Blood, 2001; 97, p. 1635-1643
【非特許文献７】Exp. Hematol., 2003; 31, p. 413-420
【非特許文献８】Transfusion, 2004; 44, p. 555-566
【非特許文献９】Exp. Hematol., 2004; 32, p. 300-307
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
解決しようとする問題点は、従来技術ではヒト巨核球・血小板造血システムそのものを実験動物体内に構築することが出来ていないことである。すなわち、相当数のヒト造血幹細胞を移植した時に全例でヒト巨核球・血小板造血が認められ、ヒト血小板が長期間（6ヶ月以上）にわたり生産され、ヒト巨核球・血小板造血システムに作用する化合物、抗体、ペプチドあるいはたんぱく質などのヒト血小板の数および／または機能の変動に対する作用が移植直後からモニターできることが、強く望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は上記課題を解決し、ヒト血小板をマウス体内で恒常的に生産させ、ヒト血小板の数および／または機能を調節する化合物、抗体、ペプチドあるいはたんぱく質などの因子（以下、化合物等）をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、WO 2002/043477に記載されるNOGマウスをレシピエント動物として用いて、ヒト幹細胞を移植することにより、ヒト巨核球・血小板造血が長期間（6ヶ月以上）にわたり維持されることを見いだした。また、ヒト幹細胞を移植したNOGマウスに、ヒト巨核球・血小板造血に作用を有すると期待される化合物あるいはたんぱく質を投与することによりヒト血小板数の調節が可能となった。また、投与を中止することによりヒト血小板数は投与前値まで戻るという知見を得た。さらに、化合物によるヒト血小板数の調節効果をモニターする際の投与開始時期は移植後日数に影響されないという知見を得た。これらのことから、ヒト巨核球・血小板造血に作用を有すると期待される化合物等を動物体内でスクリーニングする方法が完成された。即ち本発明の態様は以下の通りである。
【００１６】
（１）ヒト幹細胞を移植したNOG（NOD/Shi-scid, IL-2Rγ KO）マウスに候補物質を投与し、該マウス中におけるヒト血小板の数および／または機能を測定することを含む血小板数調節薬または血小板数非影響薬のスクリーニング方法。
（２）血小板数調節薬が血小板増多薬である（１）記載のスクリーニング方法。
（３）血小板数調節薬が血小板減少薬である（１）記載のスクリーニング方法。
（４）血小板数調節薬が血小板機能保持、亢進あるいは低下薬である（１）記載のスクリーニング方法。
（５）血小板数非影響薬が血小板非増多薬である（１）記載のスクリーニング方法。
（６）血小板数非影響薬が血小板非減少薬である（１）記載のスクリーニング方法。
（７）血小板数非影響薬が血小板機能保持、亢進あるいは低下薬である（１）記載のスクリーニング方法。
（８）NOG（NOD/Shi-scid, IL-2Rγ KO）マウスにヒト幹細胞を移植することを含む、ヒト巨核球・血小板造血システムを有するマウスモデルの作出法。
（９）ヒト幹細胞が移植され体内にヒト巨核球・血小板造血システムを有するNOG（NOD/Shi-scid, IL-2Rγ KO）マウスモデル。
【発明の効果】
【００１７】
ヒト幹細胞を移植したNOGマウスを用いて、ヒト巨核球・血小板造血システムを構築し、ヒト巨核球・血小板造血に作用を有すると期待される化合物、抗体、ペプチドあるいはたんぱく質などをそのマウスに投与して、血小板の数の増減および／または機能の保持、亢進あるいは低下という形でその効果を評価するスクリーニング方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
NOG（NOD/Shi-scid, IL-2Rγ KO）マウスの作出
NOGマウスはWO 2002/043477号国際公開パンフレットに記載の方法により作出可能であり、また、（財）実験動物中央研究所から譲渡により入手することも可能である。
WO02/043477に記載の方法に従って、以下のようにNOGマウスを作出することができる。
【００１９】
以下に示すＡのマウスにＢのマウスを戻し交配することによりNOGマウスを作出することが可能である。
Ａ：NOD/ShiマウスにC.B-17/Icr-scid （C.B-17-scidまたはCB17/SCIDマウスとも呼ぶ）マウスを戻し交配することにより得られるマウス、
Ｂ：インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウス。
【００２０】
ここで異種細胞としては、ヒトを始めとしてマウス、ラット等の哺乳動物由来の細胞や組織、特にヒトの幹細胞、リンパ球や腫瘍細胞等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２１】
ＡのマウスにおけるNOD/ShiマウスへのC.B-17/Icr-scidマウスの戻し交配は、当業者に公知の手法、例えばCross Intercross法による戻し交配(Inbred Strains in Biomedical Research, M.F.W.Festing, 1979, ISBN 0-333-23809-5, The Macmillan Press, London and Basingstoke)に従い、C.B-17/Icr-scidマウスとNOD/Shiマウスとを交配し、そのF1マウス同士を更に交配して得たF2マウスの血清中の免疫グロブリン量を測定し、検出できないマウスを選別する。このマウスを再びNOD/Shiマウスと交配する。この操作を９回以上繰り返し(Cross Intercross法)行うことによって実施できる。
【００２２】
尚、NOD/ShiマウスおよびC.B-17/Icr-scidマウスは共に日本クレア株式会社から販売されている。また、これらのマウスの交配により得られるマウスとしては、例えば、NOD-scidマウス(特開平9-94040号公報)があり、これを日本クレア株式会社から入手して直接Ａのマウスとして用いることもできる。
【００２３】
また、Ｂのマウスにおけるインターロイキン２受容体γ鎖遺伝子のノックアウトは、当業者に公知の手法、例えば、マウスES細胞を用いた相同組換えの手法(Capecchi, M. R., Altering the genome by homologous recombination, Science, (1989) 244, 1288-1292)に従い、マウス由来の特定の遺伝子と例えばネオマイシン等の薬剤耐性遺伝子を含む相同遺伝子とをES細胞の段階で置き換えた後、該ES細胞を受精卵に注入することにより実施できる。
【００２４】
具体的には、例えば、129/SVマウスのゲノムライブラリーからヒトのIL-2RγcDNAをプローブとしてマウスIL-2Rγを含む遺伝子クローンを単離し、該クローンのうちIL-2Rγ全長を含む8.6kbの大きさの断片を使用してターゲッティングベクターを作製する。すなわち、前記断片のIL2Rのエクソン７と８との間にネオマイシン耐性遺伝子を発現するpMC1-neoポリＡを挿入し、またエクソン８から1kb離れた3'側にジフテリア毒素-Ａ遺伝子を配置する。次いで、前記ベクターを直鎖状にし、E14 ES細胞１×107個に電気穿孔法で導入する。その後、G418を含む培養液の中で相同的組換えを起こしたESクローンを選択し(PCRまたはサザン法で確認)、該ESクローンをC57BL/6マウスの胚盤胞に注入した後、仮親マウスの子宮に移植する。この仮親マウスから生まれたキメラマウスを更にC57BL/6マウスと交配することによって、生殖細胞系に伝達したIL2RγKOヘテロマウスを得ることができる。
【００２５】
あるいは、既に確立されているインターロイキン２受容体γ鎖遺伝子ノックアウトマウス系統を直接入手して用いてもよく、こうしたマウス系統として、例えば、IL2RγKOマウス系統(菅村和男教授[東北大学医学部生体防御学講座・免疫分野]より作出されたインターロイキン２受容体γ鎖ノックアウトマウス(Ohbo K, Suda T, Hashiyama Mら、Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood 1996;87(3):956-67))がある。尚、IL2RγKOマウスは、作出者である菅原教授の委嘱によって、現在は(財)実験動物中央研究所の胚保存バンクの中で保存されており、必要に応じていつでも凍結胚または融解復元マウスとして入手することができる。
【００２６】
さらに、ＡのマウスへのＢのマウスの戻し交配は、上記と同様に、当業者に公知の手法、例えば、上述の戻し交配に従い、すなわちNOD-scidマウスとIL2RγKOマウスとを交配し、そのF1マウスをNOD-scidマウスに戻し交配することにより実施できる。
【００２７】
本発明のヒト巨核球・血小板造血システムの構築
用いるマウスの週齢は8週齢から14週齢が好ましいが、これらに限定はされず、例えば生後1〜3日目のマウスを利用することも可能である。マウスは免疫不全であるために、微生物等の感染から防御可能な飼育施設にて飼育することが望ましい。
【００２８】
移植効率を向上させる目的として、マウス骨髄破壊操作を実施してもよい。マウス骨髄破壊操作としては例えば、放射線照射あるいは抗癌剤投与などで実施出来る。放射線はガンマ線やエックス線などを用いてマウスに全身照射する。放射線の線量としては、3.4グレイ以下が用いられ、好ましくは1.0グレイから3.0グレイが用いられるが、これらに限定はされない。放射線の線量率としては、好ましくは0.1グレイ/分から0.8グレイ/分を用い、さらに好ましくは0.2グレイ/分から0.6グレイ/分を用いるが、これらに限定はされない。エックス線を用いる場合の電圧と電流の設定においては、電圧は好ましくは100キロボルトから150キロボルトを用い、さらに好ましくは125キロボルトから140キロボルトを用い、また電流は好ましくは2ミリアンペアから20ミリアンペアを用い、さらに好ましくは5ミリアンペアから10ミリアンペアを用いるが、これらに限定はされない。
【００２９】
ここで、ヒト幹細胞とは主にヒト造血幹細胞を意味するが、ヒト造血システムを支持する細胞、例えばヒト間様系幹細胞やヒト血管内皮前駆細胞などと混合することも出来る。
【００３０】
ヒト造血幹細胞とは抗体によって同定される特異的なエピトープ部位と関連する細胞表面マーカーによって、例えば、CD34陽性細胞として、あるいはCD133陽性細胞として同定することが出来る(Stem Cells, 1998; 16, p. 387-396、Ann. N. Y. Acad. Sci., 1999; 872, p. 25-39)。また、例えばCD34陽性細胞あるいはCD133陽性細胞内の一部分の集団を細胞表面マーカーの存在の有無により、例えば、CD38陰性細胞、あるいはCD33陰性細胞、またはそれらの組み合わせとして同定することが出来る（Bone Marrow Transplant., 2002; 30, p. 851-860）。同定されたヒト造血幹細胞は、例えばフローサイトメーターを用いたソーティング技法やマグネットビーズに結合した抗体を用いる技法により分離することが可能であり、または例えばヒトCD34陽性細胞やCD133陽性細胞はCambrex Bio Science Walkersville, Inc. (MD,USA) 社やAll Cells,LLC (CA,USA)社などから購入することが出来る。細胞の由来としては、例えば、ヒト骨髄、ヒト臍帯血あるいはヒト末梢血などから採取することが可能であり、あるいはヒト骨髄、ヒト臍帯血あるいはヒト末梢血などから採取した後に試験管内で増幅させて採取することが可能であり、あるいはヒトES細胞から試験管内で分化させて採取することが可能であり（Blood, 2004; 104, Abstract #564）、あるいは得られたヒト造血幹細胞を羊胎児や免疫不全マウスなどの免疫寛容動物に移植して動物体内で増幅させた後に採取することも可能である。また、採取した細胞はウイルスベクターあるいはエレクトロポレーションあるいはリポソームあるいは遺伝子銃などを用いて外来的に遺伝子を導入した後に用いることも可能である。
【００３１】
ヒト造血システムを支持する細胞としては、試験管内にて接着し増殖するヒト間質系細胞や細胞表面マーカーによって、例えば、CD105陽性、CD166陽性、CD29陽性かつCD44陽性細胞として同定されるヒト間様系幹細胞などを使用することが出来る（Exp Hematol., 2004; 32, p. 657-664）。または例えば、CD34陽性かつ血管内皮増殖因子受容体-2 (KDR)陽性細胞として同定されるヒト血管内皮前駆細胞などを使用することが出来る（Blood. 2005; 105, p. 199-206）。
【００３２】
本発明の方法においては、上記のようにして同定・単離したヒト幹細胞またはヒト幹細胞とヒト造血システムを支持する細胞を混合したものをNOGマウスに移植すればよい。
【００３３】
ヒト幹細胞の移植細胞数については、マウス1個体あたり、好ましくは1,000細胞から10,000,000細胞、さらに好ましくは20,000細胞から200,000細胞にて実施するが、これらに限定はされない。ヒト幹細胞の移植時期については、放射線照射後の時間として、好ましくは直後から96時間以内、さらに好ましくは４時間後から72時間以内に実施するが、これらに限定はされない。
【００３４】
ヒト幹細胞の移植方法としては、例えば生後8週齢から14週齢のマウスの場合には27ゲージの注射針を用いて、マウスの尾静脈内あるいは眼窩静脈嚢内あるいは大腿骨内などに移植することが可能であり、また、例えば生後1〜3日目のマウスの場合には27あるいは30ゲージの注射針を用いて、マウスの腹腔内あるいは肝臓内あるいは側頭静脈内などに移植することが可能であるが、これらに限定はされない。
【００３５】
移植後のマウス血液内に存在するヒト血小板の測定法としては、例えば、フローサイトメーターを用いた方法が可能である。尾静脈、眼窩静脈嚢あるいは心臓などからEDTA、クエン酸あるいはヘパリン加血として採血し、全血あるいは多血小板血漿（PRP）を用意する。次に血小板特異的に発現する表面マーカー例えばCD41a、CD61あるいはCD42bなどに対する蛍光色の異なる種特異的な抗体を用いて染色する。フローサイトメーターを用いて、前方散乱光および側方散乱光により血小板の領域にゲートをかけた後にヒト特異的抗体あるいはマウス特異的抗体のいずれかに反応する細胞をそれぞれヒト血小板あるいはマウス血小板として認識することが可能であり、それぞれの種の血小板数の比率よりキメラ率を算出することが出来る。また、ヒト血小板の絶対数は、例えば、自動血球計算機などにより測定した全血小板数に先に算出したキメラ率を乗じることにより算出することが出来る。
【００３６】
移植後のマウス血液内に存在するヒト血小板の機能の測定法としては、例えば、フローサイトメーターを用いた方法が可能である。移植後のマウスの尾静脈、眼窩静脈嚢あるいは心臓などからEDTA、クエン酸あるいはヘパリン加血として採血し、全血あるいは多血小板血漿（PRP）を用意する。次に血小板活性化因子、例えばアデノシン2リン酸（ADP）、トロンビン、トロンビン受容体活性化ペプチド（TRAP）あるいはエピネフリンなどによりマウスから採血した全血またはPRP中の血小板を活性化させる。その際、フィブリン重合阻害剤などを添加してもよい。次に血小板特異的に発現する表面マーカー例えばCD41a、CD61あるいはCD42bなどに対する蛍光色の異なる種特異的な抗体、および活性化した血小板特異的に存在する表面マーカー例えば活性化インテグリン（gpIIb/IIIa）あるいはCD62pなどに対する蛍光色の異なる抗体を用いて染色する。フローサイトメーターを用いて、前方散乱光および側方散乱光により血小板の領域にゲートをかけた後にヒト特異的抗体あるいはマウス特異的抗体のいずれかに反応する細胞をそれぞれヒト血小板あるいはマウス血小板として認識した後に活性化gpIIb/IIIaあるいはCD62pの発現量を測定することでヒト血小板の活性化能を測定することが出来る。
【００３７】
本発明は、NOGマウスにヒト造血幹細胞を移植することを含む、体内でヒトの巨核球・血小板が形成される、ヒト巨核球・血小板造血システムを有するNOGマウスの作出方法、および該方法により得られた体内にヒト巨核球・血小板造血システムを有するNOGマウスをも包含する。
【００３８】
本発明のヒト血小板の数の増減および／または機能の保持、亢進あるいは低下という形で候補化合物等の効果を評価するスクリーニング方法
ヒト幹細胞を移植したNOGマウスに、ヒト巨核球・血小板造血に作用を有する、あるいは有さないと期待される候補化合物、抗体、ペプチドあるいはたんぱく質などの物質（化合物等）を投与する。化合物等は適当な溶媒、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水液あるいはメチルセルロース溶液などに溶解あるいは懸濁する。その際に溶解補助剤、例えばポリエチレングリコールあるいはエタノールなど、あるいは安定化剤、例えば牛血清アルブミンなどを添加してもよい。投与経路としては、皮下、腹腔、尾静脈、あるいは経口などから投与が可能である。また、浸透圧ポンプに化合物等を充填してマウス皮下内に留置してもよい。投与量は、投与する化合物等の種類により適宜決定することができる。
【００３９】
1群の例数としては2例以上にて効果の確認は可能である。投与期間としては、化合物等の特性により、単回投与あるいは連続投与が選択される。ヒト巨核球・血小板造血システムが構築されたNOGマウス1個体について、投与期間に限定はなく、また投与される化合物等の種類についても限定はなく、自然死あるいは犠死するまで、化合物等の効果を評価することが出来る。
【００４０】
化合物等をマウスに投与後、マウス体内のヒト血小板の数および／または機能を測定することにより、前記化合物等が血小板数調節薬として、あるいは血小板数非影響薬として作用を有するか否かを判定することができる。たとえば血小板の数の変動作用を有するものを血小板数調節薬として選択すればよく、あるいは血小板の数の変動作用を有しないものを血小板数非影響薬として選択すればよい。例えば、ヒト幹細胞を投与したNOGマウスを２群に分け、一方の群に化合物等を投与し（化合物等投与群）、他方の群に溶媒を投与した場合（溶媒投与群）、化合物等投与群マウスにおけるヒト血小板数が溶媒投与群と比べて有意に多いかまたは少ない場合に、前記化合物等は血小板数調節薬として血小板の数の変動作用を有すると判断できる。あるいは、ヒト血小板数に有意な差が生じない場合に、前記化合物等は血小板数非影響薬として血小板の数の変動作用を有さないと判断できる。また、この際、血小板の数だけでなく、マウス体内でのヒト血小板の機能が保持、亢進、あるいは低下するか否かも判定の基準となり得る。
【００４１】
スクリーニングによって効果の認められる候補化合物等は、血小板数調節薬として、すなわち血小板減少症に対する治療薬としての血小板増多薬、血小板増加症に対する治療薬としての血小板減少薬、および／または血小板機能低下症、あるいは血小板機能亢進症に対する治療薬としての血小板機能亢進薬、あるいは血小板機能低下薬として利用することが可能であり、または血小板数非影響薬として、すなわち血小板数減少症、あるいは血小板数増加症、および／または血小板機能低下症、あるいは血小板機能亢進症を誘発しない血小板非影響薬として利用することが可能である。血小板減少症としては、例えば特発性血小板減少性紫斑病、または骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、慢性肝炎、肝硬変、播種性血管内凝固症候群に起因する血小板減少症、または出血に伴う血小板減少症、または化学療法、造血幹細胞移植あるいは放射線療法に起因する血小板減少症などがあげられるがこの限りではない。また、血小板増加症としては、例えば本態性血小板血症、または慢性骨髄性白血病、骨髄増殖症候群、骨髄線維症あるいは真性多血症に起因する血小板増加症、または肝移植後に発生する血小板増加症などがあげられるがこの限りではない。
【００４２】
ここで、血小板数非影響薬とは、血小板機能低下症、あるいは血小板機能亢進症を誘発しない物質であり、血小板を増加させない血小板非増多薬と血小板を減少させない血小板非減少薬がある。例えば、ある種のサイトカイン、抗がん剤、抗生物質製剤、中枢神経用剤は血小板を増加または血小板を減少させるという副作用がある。本発明によれば、血小板の数や機能に影響を与える薬剤に修飾を加え、その薬剤の本来の効果が減少せずに血小板への影響のみが減少した薬剤をスクリーニングすることができる。例えば、インターフェロンのようなたんぱく質の場合、一部のアミノ酸を置換、欠失もしくは付加し、または修飾したインターフェロンを作製し、本発明の方法により、血小板数または機能に影響するか否かを測定すればよい。また、化合物の場合、化合物の基を修飾等し、同様に血小板数または機能に影響するか否かを測定すればよい。血小板数または機能に影響を与える医薬としてはインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、セルモロイキン、テセロイキン等のサイトカイン、ブスルファン、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、シスプラチンなどの各種抗がん剤、ヘパリン等があり、本発明の方法により、血小板数または機能に影響を与える医薬の誘導体であって、血小板数に影響を与えない薬剤、例えば、血小板数を増加させまたは減少させるという副作用を有する医薬の誘導体であって、医薬効果を維持しているが、血小板数を増加させまたは減少させるという副作用が低減された医薬をスクリーニングすることができる。このような医薬の具体例として、インターフェロンの誘導体であって、血小板数を変化させるという機能が低下したインターフェロンが挙げられる。
【実施例１】
【００４３】
NOGマウス（12週齢、雌；財団法人実験動物中央研究所より入手）にエックス線（2.4グレイ、0.6グレイ/分;125キロボルト, 10ミリアンペア；日立メディカル製MBR-1520R-3を使用）を照射し、4時間後にマウス1個体あたり115,000個のヒト臍帯血由来CD34陽性細胞（AllCells,LLC社より入手）を尾静脈より移植した。移植した細胞の表面マーカーはPE標識抗ヒトCD34抗体、FITC標識抗ヒトCD33抗体およびPE-Cy5標識抗ヒトCD38抗体（BD Pharmingen社より購入）を用いて染色し、フローサイトメーター（ベックマンコールター社）で解析した。結果、83％の細胞がCD34陽性であり、49％の細胞がCD34陽性かつCD38陰性かつCD33陰性であった。
【００４４】
移植後10週目にヒト血小板のキメラ率をフローサイトメーターを用いて測定した。尾静脈あるいは眼窩静脈嚢あるいは心臓などからEDTAあるいは0.38％クエン酸加血として採血した。2から10マイクロリットルの全血を用いて、血小板特異的に発現する表面マーカーであるCD41aに対する抗体（PE標識抗ヒトCD41a抗体およびFITC標識抗マウスCD41抗体；いずれもBD Pharmingen社より購入）にて染色した。フローサイトメーターにより、前方散乱光および側方散乱光により血小板の領域にあらかじめかけられたゲートを用いて、PE標識抗ヒトCD41a抗体あるいはFITC標識抗マウスCD41抗体のいずれかに反応する細胞をそれぞれヒト血小板あるいはマウス血小板として認識し、それぞれの種の血小板数の比率よりキメラ率を算出した。また、ヒト血小板の絶対数は、自動血球計算機などにより測定した全血小板数に先に算出したキメラ率を乗じることにより算出した。その結果、6例中6例にてヒト血小板が確認され、ヒト血小板のキメラ率の平均と標準偏差は0.47±0.37％であり、ヒト血小板の絶対数の血液１マイクロリットルあたりの平均と標準偏差は2,500±1,800個であった。
【００４５】
これらのマウスを3匹と3匹の２つの群に分け、WO 2004/108683に記載されるMpl蛋白質に対してアゴニスト作用を有する5-[(2-{1-[5-(3,4-ジクロロフェニル)-4-ヒドロキシ-3-チエニル]エチリデン}ヒドラジノ)カルボニル]-2-チオフェンカルボン酸  カリウム塩（以下、化合物Ａ）投与群と溶媒投与群とした。溶媒はリン酸緩衝生理食塩水液（PBS）に1.6％のポリエチレングリコール400と2.4％のエタノールが添加された溶液（PBS-PE）を用いた。化合物Aはマウス体重１キログラムあたりに30ミリグラムが投与されるように皮下内に注射した。投与は移植後10週目より1日1回で、8回行った。図1で示すようにヒト血小板数は2週間目までに4.5倍と有意に上昇し、その後、上昇したヒト血小板の数は投与前の値および溶媒投与群の値とほぼ同等の値を示した。また、このときマウス血小板には影響を及ぼさなかった。
【実施例２】
【００４６】
NOGマウス（11週齢、雌）にエックス線（2.4グレイ、0.6グレイ/分;125キロボルト, 10ミリアンペア）を照射し、4時間後にマウス1個体あたり60,000個のヒト臍帯血由来CD34陽性細胞（AllCells,LLC社より入手）を尾静脈より移植した。移植した細胞の表面マーカーをフローサイトメーターで解析した結果、79％の細胞がCD34陽性であり、56％の細胞がCD34陽性かつCD38陰性かつCD33陰性であった。
【００４７】
移植後10週目にヒト血小板のキメラ率をフローサイトメーターを用いて測定し、絶対数を算出した。その結果、6例中6例にてヒト血小板が確認され、ヒト血小板のキメラ率の平均と標準偏差は0.42±0.13％であり、ヒト血小板の絶対数の血液１マイクロリットルあたりの平均と標準偏差は2,800±800個であった。
【００４８】
これらのマウスを3匹と3匹の２つの群に分け、化合物A投与群と溶媒投与群とした。溶媒はPBS-PEを用いた。化合物Aはマウス体重１キログラムあたりに30ミリグラムが投与されるように皮下内に注射した。投与は移植後10週目より1日1回で5週間、27回行った。図２で示すようにヒト血小板数は2週間目までの投与で4.5倍と有意に上昇し、5週目までの投与で6.4倍と有意に上昇した。また、5週目以降投与を中止し、最初の投与から10週目に再度ヒト血小板の数を測定すると、上昇していた数は投与前の値および溶媒投与群の値とほぼ同等の値を示した。
【実施例３】
【００４９】
NOGマウス（10週齢、雌）にエックス線（3.0グレイ、0.2グレイ/分;145キロボルト, 5ミリアンペア）を照射し、4時間後にマウス1個体あたり85,000個のヒト臍帯血由来CD34陽性細胞（AllCells,LLC社より入手）を尾静脈より移植した。
【００５０】
移植後19週目にヒト血小板のキメラ率をフローサイトメーターを用いて測定し、絶対数を算出した。その結果、4例中4例にてヒト血小板が確認され、ヒト血小板のキメラ率の平均と標準偏差は1.86±1.39％であり、ヒト血小板の絶対数は血液１マイクロリットルあたりの平均と標準偏差は9,700±7,200個であった。
【００５１】
これらのマウスを3匹と1匹の２つの群に分け、化合物A投与群(3匹)と溶媒投与群(1匹)とした。溶媒はPBS-PEを用いた。化合物Aはマウス体重１キログラムあたりに30ミリグラムが投与されるように皮下内に注射した。投与は移植後20週目より1日1回で2週間、14回行った。図３で示すようにヒト血小板数は2週間目までの投与で4.8倍と有意に上昇した。
【実施例４】
【００５２】
実施例２で使用したマウス6匹を2ヶ月間休薬し、3匹と3匹の2つの群に分け、化合物A投与群と溶媒投与群とした。溶媒はPBS-PEを用いた。化合物Aはマウス体重１キログラムあたりに30ミリグラムが投与されるように皮下内に注射した。投与は移植後26週目より1日1回で約2.5週間、17回行った。ヒト血小板数は17日目までの投与で化合物A投与群は4.1±0.6倍、溶媒投与群は1.5±0.5倍（平均±標準誤差）となり、溶媒投与群と比べ有意（p値<0.05；Student t-test）に上昇した。
【実施例５】
【００５３】
NOGマウス（10週齢、雌）にエックス線（2.4グレイ、0.2グレイ/分;145キロボルト, 5ミリアンペア）を照射し、4時間後にマウス1個体あたり120,000個のヒト臍帯血由来CD34陽性細胞（Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.社より入手）を尾静脈より移植した。移植した細胞の表面マーカーをフローサイトメーターで解析した結果、76％の細胞がCD34陽性であり、47％の細胞がCD34陽性かつCD38陰性かつCD33陰性であった。
【００５４】
移植直後にマウスを5匹と5匹の２つの群に分け、化合物A投与群と溶媒投与群とした。溶媒はPBS-PEを用いた。化合物Aはマウス体重１キログラムあたりに３０ミリグラムが投与されるように皮下内に注射した。投与は移植後1日目より1日1回で約2週間、11回行った。
【００５５】
移植後13日目にヒト血小板のキメラ率をフローサイトメーターを用いて測定し、絶対数を算出した。その結果、10例中10例にてヒト血小板が確認された。溶媒投与群のヒト血小板の血液１マイクロリットルあたりの絶対数の平均と標準偏差は2,500±1,000 個であり、化合物A投与群のヒト血小板の血液１マイクロリットルあたりの絶対数の平均と標準偏差は5,600±1,200 個（ｐ値＝0.02;Student t-test）であり、有意な上昇が認められた。
【００５６】
フローサイトメーターにてモニターされているヒト血小板が、機能を有した血小板であることを検討した。16日目に化合物A投与群と溶媒投与群より各1匹を犠死させ、心臓より0.38％クエン酸加血を得た。遠心により多血小板血漿（PRP）を得、10マイクロモル/リットルのADPにて15分刺激し、抗体（PE標識抗ヒトCD62p抗体、PE-Cy5標識抗ヒトCD41a抗体およびFITC標識抗マウスCD41抗体あるいはPE標識抗ヒトCD42b抗体およびFITC標識抗ヒト活性化CD41a抗体(クローン名PAC-1)；いずれもBD Pharmingen社より購入）にて染色した。刺激停止は0.5％パラホルムアルデヒド固定で行った。フローサイトメーターにより、前方散乱光および側方散乱光により血小板の領域にあらかじめかけられたゲートを用いて、PE-Cy5標識抗ヒトCD41a抗体あるいはFITC標識抗マウスCD41抗体のいずれかに反応する細胞をそれぞれヒト血小板あるいはマウス血小板として認識し、それぞれにゲートをかけ、PE標識抗ヒトCD62p抗体の反応性を検討した。その結果、化合物A投与群と溶媒投与群いずれのマウス由来のPRPにおいても、約50％のヒト血小板でのADP刺激によるCD62p抗原の細胞表面発現上昇が認められた。また、PE標識抗ヒトCD42b抗体にてヒト血小板として認識し、ゲートをかけFITC標識PAC-1抗体の反応性を検討した。その結果、化合物A投与群と溶媒投与群いずれのマウス由来のPRPにおいても、約70％のヒト血小板でのADP刺激による活性化CD41a抗原の上昇が認められた。一方、ADP未刺激のPRPを用いた場合のCD62p抗原あるいは活性化CD41a抗原の陽性率は10％以下であった。以上のことから、ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞を移植したNOGマウス体内に存在するヒトCD41陽性の血小板は機能を保持するものであることが判明した。
【実施例６】
【００５７】
NOGマウス（生後36-48時間、雌雄）にエックス線（1.0グレイ、0.6グレイ/分;125キロボルト, 10ミリアンペア）を照射し、4時間後にマウス1個体あたり110,000個のヒト臍帯血由来CD34陽性細胞（Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.社より入手）を腹腔より移植した。移植した細胞の表面マーカーをフローサイトメーターで解析した結果、62％の細胞がCD34陽性であり、45％の細胞がCD34陽性かつCD38陰性かつCD33陰性であった。
【００５８】
移植後27週目にヒト血小板のキメラ率をフローサイトメーターを用いて測定し、絶対数を算出した。その結果、雌4例中4例にてヒト血小板が確認され、ヒト血小板のキメラ率の平均と標準偏差は5.21±3.44％であり、ヒト血小板の絶対数の血液１マイクロリットルあたりの平均と標準偏差は30,000±17,000個であった。
【００５９】
また、上記とは異なる雌個体の移植後45週目にヒト血小板のキメラ率をフローサイトメーターを用いて測定し、絶対数を算出した。その結果、4例中4例にてヒト血小板が確認され、ヒト血小板のキメラ率の平均と標準偏差は4.44±3.40％であり、ヒト血小板の絶対数の血液１マイクロリットルあたりの平均と標準偏差は31,000±26,000個であった。
【００６０】
これら移植後45週目のマウスを2匹と2匹の2つの群に分け、インターフェロンアルファ-2b（商品名イントロンA、シェーリング・プラウ株式会社、以下INF）投与群と溶媒投与群とした。溶媒はPBSに0.1％の牛血清アルブミンが添加された溶液を用いた。INFはマウス体重１キログラムあたりに100万国際単位が投与されるように皮下内に注射した。投与は1日1回で、9回行った。ヒト血小板数は10日目までの投与でINF投与群は0.4±0.2倍、溶媒投与群は1.1±0.1倍（平均±標準偏差）となり、有意（p値<0.05；Student t-test）に減少した。また、このときマウス血小板には影響を及ぼさなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ヒト臍帯血CD34陽性細胞を移植後10週目より化合物Aを投与した時のヒト血小板数の変化度を示した。投与は約1週間8回実施した。縦軸は各個体で投与前のヒト血小板数を1としたときの変化度（倍数）を示す。横軸は投与開始日（1日）からの日数を示す。■は化合物A投与群（3例）、○は溶媒投与群（3例）の平均値を示す。エラーバーは標準偏差を示す。＊はp値＜0.05を示す（Student t-test）。2週間目には溶媒投与群と比べ化合物Aは有意なヒト血小板の増加効果を示した。
【図２】ヒト臍帯血CD34陽性細胞を移植後10週目より化合物Aを投与した時のヒト血小板数の変化度を示した。投与は5週間27回実施した。縦軸は各個体で投与前のヒト血小板数を1としたときの変化度（倍数）を示す。横軸は投与開始日（1日）からの日数を示す。■は化合物A投与群（3例）、○は溶媒投与群（3例）の平均値を示す。エラーバーは標準偏差を示す。＊はp値＜0.05、＊＊はp値＜0.01を示す（Student t-test）。1週間目には溶媒投与群と比べ化合物Aは有意なヒト血小板の増加効果を示した。
【図３】ヒト臍帯血CD34陽性細胞を移植後20週目より化合物Aを投与した時のヒト血小板数の変化度を示した。投与は2週間14回実施した。縦軸は各個体で投与前のヒト血小板数を1としたときの変化度（倍数）を示す。横軸は投与開始日（1日）からの日数を示す。■は化合物A投与群（3例）の平均値、□は溶媒投与群（1例）を示す。化合物A投与群のエラーバーは標準偏差を示す。＊はp値＜0.05を示す（Paired t-test）。2週間目には溶媒投与群と比べ化合物Aは有意なヒト血小板の増加効果を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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