(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は生化学・分子生物学レベルでの毛質の評価方法の提供を課題とする。【解決手段】本発明は、毛髪のヤング率との相関関係が認められた、毛髪中におけるヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子、ＫＡＰ５．２遺伝子、ＫＡＰ５．３遺伝子、ＫＡＰ５．４遺伝子及び／又はＫＡＰ５．５遺伝子の発現量を、ｍＲＮＡのリアルタイムポリメラーゼ連鎖方法を用いて測定することにより、毛質の指標とする評価方法及び該評価に用いるキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛質の評価方法であって、毛髪中のヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子（配列番号１）、ＫＡＰ５．２遺伝子（配列番号２）、ＫＡＰ５．３遺伝子（配列番号３）、ＫＡＰ５．４遺伝子（配列番号４）及び／又はＫＡＰ５．５遺伝子（配列番号５）の発現を毛質の指標とする評価方法。
【請求項２】
前記測定が、毛髪中のヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子（配列番号１）、ＫＡＰ５．２遺伝子（配列番号２）、ＫＡＰ５．３遺伝子（配列番号３）、ＫＡＰ５．４遺伝子（配列番号４）及び／又はＫＡＰ５．５遺伝子（配列番号５）に由来するｍＲＮＡをリアルタイムポリメラーゼ連鎖方法により測定することにより実施される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子がヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子（配列番号１）、ＫＡＰ５．２遺伝子（配列番号２）及びＫＡＰ５．４遺伝子（配列番号４）から成る群から選ばれる１又複数の遺伝子である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記評価が、毛髪中のヘアケラチンＨａ２又はヘアケラチンＨｂ２の量の測定によりに実施される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
毛質の評価のためのキットであって、毛髪中のヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子（配列番号１）、ＫＡＰ５．２遺伝子（配列番号２）、ＫＡＰ５．３遺伝子（配列番号３）、ＫＡＰ５．４遺伝子（配列番号４）及び／又はＫＡＰ５．５遺伝子（配列番号５）の発現を毛質の指標として測定することにより評価を行うことを特徴とするキット。
【請求項６】
前記遺伝子がヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子（配列番号１）、ＫＡＰ５．２遺伝子（配列番号２）及びＫＡＰ５．４遺伝子（配列番号４）から成る群から選ばれる１又複数の遺伝子である、請求項５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヘアケラチン遺伝子、特にヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子（配列番号１）、ＫＡＰ５．２遺伝子（配列番号２）、ＫＡＰ５．３遺伝子（配列番号３）、ＫＡＰ５．４遺伝子（配列番号４）及び／又はＫＡＰ５．５遺伝子（配列番号５）を指標とした毛質評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪に関する悩みとしては、薄毛、抜け毛といった毛根、毛包の健康状態に関わるものと、硬い、柔らかい、はり・こしがない、枝毛、くせ毛、パサツクといった毛髪の物性に関わるものとがある。また、毛髪の物性に関わる悩みであっても、外的要素に起因するダメージ、例えばパーマ剤やブリーチ剤処理、紫外光暴露、大気汚染物質暴露、コーミング摩擦など、毛髪に対する直接的なダメージによるものと、毛幹形成における内的要素が関与する場合とが考えられる。後者の場合におけるヘアケアでは、毛髪の質の改善を図るだけでなく、毛根、毛包自体の健康状態を良好にする手当てが必要とされる。従って、一口に毛質の状態が良くないといっても、そのケア方法はその原因により様々である。
【０００３】
従来の毛質の評価は、例えば美容師や店頭などでの販促員による触感を頼りとした主観的手法、あるいは各種物性測定器、例えば水分計、硬度計、ヤング率測定器により毛髪の物性を物理的に測定するといった客観的手法を採用する。いずれも適切なアドバイスの提供のために活用され得るが、これらの評価方法では毛質の良し悪しの根本的な原因を解明し、より毛質に合った適切なヘアケアアドバイスを引き出すことはできない。
【０００４】
毛髪自体はその表面を覆うキューティクル（毛小皮）、その内部にあって毛髪の大部分を占める毛皮質及び中心部の毛髄質から構成される。毛髪の硬さやはり・こし感にはキューティルが大きく寄与していることが明らかにされている（曽我部敦他、Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．３（２００２）ｐｐ．２０７−２１６「毛髪物性に関する研究１−毛髪の短径・長径測定と曲げ応力評価法」）。キューティクルは酸性ヘアケラチンＨａ１、Ｈａ２、塩基性ケラチンＨｂ１、Ｈｂ２などの繊維タンパク質や修飾酵素、例えばトランスグルタミナーゼ、ペプチジルアルギニンディミナーゼ、さらには顆粒成分トリコヒアリンＳ100など、様々な成分から構成されることまでは知られている。しかしながら、これら各成分と毛質、例えば毛髪のはりやこしとの関係については十分に解明されていない。毛質を左右するメカニズムが生化学・分子生物学レベルにおいて十分には解明されれば、既存の毛質改善剤に比べ一層顕著な効果を奏するものの提供が可能となり得る。
【０００５】
特開2002-97116号公報にはタウリンを有効成分とする細胞賦活剤が、国際公開WO2002/034253号公報にはＮ−メチルタウリンを有効成分とする細胞賦活剤および毛髪はり・こし改善剤が記載されている。これらの薬剤の作用効果として、細胞増殖の活性化による、毛髪細胞コントロール、毛髪成長期延長、毛髪細胞増殖の活性化、毛髪はり・こし改善が記載されているが、ここでの毛髪はり・こし改善効果は、依然として、毛髪の物性試験（ねじりトルク）により評価されている。従って、生化学・分子生物学レベルでの活性評価に基づく新規な毛髪はり・こし改善剤が求められている。
【０００６】
【特許文献１】特開平8-20523
【特許文献２】特開2001-302543
【特許文献３】特開2002-97116
【特許文献４】WO 2002/034253
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は生化学・分子生物学レベルでの毛質の評価方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記問題を鑑み、毛髪のこし・はりの尺度となる硬さ、詳しくはヤング率と、毛髪関連各種遺伝子の発現との相関関係を調べたところ、ヘアケラチン遺伝子、特にヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子（配列番号１）、ＫＡＰ５．２遺伝子（配列番号２）、ＫＡＰ５．３遺伝子（配列番号３）、ＫＡＰ５．４遺伝子（配列番号４）又はＫＡＰ５．５遺伝子（配列番号５）の発現が亢進するほど、より好ましくはヘアケラチンＨａ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子、ＫＡＰ５．２遺伝子又はＫＡＰ５．４遺伝子の発現が亢進するほど、毛髪のヤング率が高くなる、即ち毛髪にはり、こし感がでることを見出した。
【０００９】
その結果、本発明は第一の観点において、毛質の評価方法であって、毛髪中のヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子（配列番号１）、ＫＡＰ５．２遺伝子（配列番号２）、ＫＡＰ５．３遺伝子（配列番号３）、ＫＡＰ５．４遺伝子（配列番号４）及び／又はＫＡＰ５．５遺伝子（配列番号５）の発現を毛質の指標とする方法を提供する。
【００１０】
好適な態様において、前記測定は、毛髪中のヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子（配列番号１）、ＫＡＰ５．２遺伝子（配列番号２）、ＫＡＰ５．３遺伝子（配列番号３）、ＫＡＰ５．４遺伝子（配列番号４）及び／又はＫＡＰ５．５遺伝子（配列番号５）に由来するｍＲＮＡを測定することにより実施される。より好ましくは、上記遺伝子はヘアケラチンＨａ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子、ＫＡＰ５．２遺伝子及びＫＡＰ５．４遺伝子から成る群から選ばれる。より好適な態様において、かかる遺伝子の測定はリアルタイムポリメラーゼ連鎖方法により実施される。
【００１１】
別の態様においては、前記評価は、毛髪中のヘアケラチンＨａ２及び／又はヘアケラチンＨｂ２の量の測定によりに実施される。さらに好適な態様において、上記測定はヘアケラチンＨａ２及び／又はヘアケラチンＨｂ２に特異的な抗体を利用する免疫学的測定方法、例えばELISA法又はRIA法による。
【００１２】
別の観点において、本発明は毛質の評価を実施するためのキット又は装置を提供する。かかるキット又は装置は、毛髪中のヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子（配列番号１）、ＫＡＰ５．２遺伝子（配列番号２）、ＫＡＰ５．３遺伝子（配列番号３）、ＫＡＰ５．４遺伝子（配列番号４）及び／又はＫＡＰ５．５遺伝子（配列番号５）の発現を毛質の指標として測定することにより評価を行うことを特徴とする。より好ましくは、上記遺伝子はヘアケラチンＨａ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子、ＫＡＰ５．２遺伝子及びＫＡＰ５．４遺伝子から成る群から選ばれる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、遺伝子レベルでの毛質の評価方法の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
毛質の評価方法
本発明は、毛髪の硬さ、一般には「はり」や「こし」感と称される物性を評価することを目的とする。以降の実施例において実証するとおり、本発明者は毛髪の硬さと毛髪から抽出される各種遺伝子との相関性を調べるため、毛髪のヤング率を測定し、その測定結果と各種遺伝子のＲＴ−ＰＣＲにより測定した発現量との関係をSpearmanの順位相関係数を用い、統計学的に分析した（Zar, J.H.J.Amer.Stat.Assoc.67:578〜580, 1970「Significance testing of the Spearman rank correlation cofficient」）。その結果、毛髪のヤング率は、ヘアケラチンＨａ２、ＫＡＰ５．１、ＫＡＰ５．２、ＫＡＰ５．４遺伝子の発現量が多いと統計学的に有意に高まることがわかった。また、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子の発現量が多い場合も、統計学的に有意ではないが、毛髪のヤング率が高まることを見出した。一方で、毛皮質のその他の構成タンパク質、例えばヘアケラチンＨａ１については、毛髪の硬さとの間で相関性はなかった。従って、毛皮質と比較して、キューティクル構成タンパク質や関連遺伝子が毛髪の硬さに関与する割合が高いことが示唆された。
【００１５】
ヘアケラチンＨａ２遺伝子（NCBI GenBANK Source 「X90761」）はケラチン遺伝子ファミリーの一構成員である酸性タンパク質をコードする。ヘアケラチンＨａ２はＩ型ケラチンであり、II型ケラチンとヘテロ二量化して毛髪や爪などを構成する。Ｉ型ケラチンは染色体第17q12-q21領域に位置する。
【００１６】
ヘアケラチンＨｂ２遺伝子（NCBI GenBANK Source 「Y19207」）はケラチン遺伝子ファミリーの一構成員である塩基性タンパク質をコードする。ヘアケラチンＨｂ２はII型ケラチンであり、Ｉ型ケラチンとヘテロ二量化して毛髪や爪などを構成する。II型ケラチンは染色体第12q13領域に位置する。
【００１７】
ヒトケラチン関連タンパク質（ＫＡＰ）５ファミリーに属するＫＡＰ５．１〜５遺伝子（配列番号１〜５）（Homo sapiens genomic DNA, chromosome 11 clone:RP11-684B2, complete sequences. ACCESSION:AP000867）は塩基配列のみ既知のヒトＥＳＴであり、機能に関する報告はされていない。ＫＡＰ５．１〜５遺伝子の発現の亢進と毛髪の硬さとの関係は不明であった。特に何らかの理論に拘束されるわけではないが、例えばＫＡＰ５．２遺伝子によりコードされる推定タンパク質はシステインリッチであり（約35.5％）、また低分子アミノ酸であるグリシンとセリンを豊富に含む（それぞれ18.8％及び24.2％）アミノ酸１８６個からなるため、α−ヘリックスなどの二次構造を形成せず、ケラチン繊維の間に容易に入り込むことができ、また多数セリン残基のＯＨ基による多数の水素結合の形成も考えられるため、毛髪の機械的強度に大きく寄与している可能性がある。他のＫＡＰ５遺伝子も同様にシステイン、グリシン、セリンを豊富に含み、発現生成物はＫＡＰ５．２と同様の構造を有し、毛髪の機械的強度に大きく寄与すると考えられる。
【００１８】
本発明でいう毛質とは、主に毛髪の硬さ、即ち、「はり」や「こし」感をいう。毛髪の硬さは例えば曲げ応力測定装置、例えばトルク感知式曲げ応力測定装置KES-SH（カトーテック）を用いてその「曲げかたさ」又は「曲げ応力」を測定することで数値化することができ、好ましくは毛髪径や形状による因子を最小限にするため、毛髪の毛径も測定し、ヤング率で表すことが好ましい。毛髪のヤング率は例えば以降の実施例に記載のとおりにして求めることができる。
【００１９】
毛髪中の各種遺伝子の発現は、例えば遺伝子がヘアケラチンＨａ２、Ｈｂ２の場合、毛髪中の当該タンパク質の量を測定することにより決定してよい。好ましくは、この測定はヘアケラチンＨａ２又はＨｂ２に特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素等を利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等、様々な方法により実施できる。また、例えば、毛髪中のtotal RNAを抽出し、ヘアケラチンＨａ２及び／又はＨｂ２をコードするmRNAの量を測定することにより決定することもできる。mRNAの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばRNAの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、例えばリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われる。ＲＴ−ＰＣＲに適切なプライマーの選定は、当業者周知に方法により実施することができる。
【００２０】
ヘアケラチンＨａ２及びヘアケラチンＨｂ２遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析には例えば以下のプライマーを使用することができる。
ヒトヘアケラチンＨａ２
センス          AACACGCTGGAGATCGA    （配列番号８）
アンチセンス    CACAGGTGGTGCAGGAA    （配列番号９）
ヒトヘアケラチンＨｂ２
センス          CCCGTGAATATCTCAGTGA  （配列番号１０）
アンチセンス    CAAGGAGGGAACACTGGA   （配列番号１１）
【００２１】
毛髪中のＫＡＰ５．１〜５遺伝子の発現は、例えば毛髪中のtotal RNAを抽出し、当該遺伝子又はその一部に対応するmRNAの量を測定することにより決定することができる。mRNAの抽出、その量の測定は当業界において周知であり、例えばRNAの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、例えばリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われる。ＲＴ−ＰＣＲに適切なプライマーの選定は、当業者周知に方法により実施することができる。
各ＫＡＰ５遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析には例えば以下のプライマーを使用することができる。
【００２２】
【表１】
2006014721.tif 000002
【００２３】
本発明に係る毛質評価方法に従えば、例えば、上記のようにして測定したヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子及び／又はＫＡＰ５．１〜５の各遺伝子のいずれかの発現量が所定の基準値に対し高いか低いかにより、遺伝子レベルで毛髪が硬い又は柔らかい、換言すれば「はり」や「こし」感があるかないかが判定できる。基準値としては、例えば統計学的に有意義な人数、例えば５人以上、好ましくは１０人以上、より好ましくは２０人以上の個体由来の毛髪の各遺伝子の発現レベルの平均値であってよい。その基準値は、評価の対象となる個体の性別、年齢、人種、その他の要因に応じて異なることができる。例えば、２０歳の日本人女性の毛質を調べる場合、その基準値は同世代（例えば１５歳から３０歳）の日本人女性のグループの所望の遺伝子発現レベルの平均値であることが好ましい。各遺伝子の発現レベルが標準値に比べて高いか低いかは、例えば標準値と比べて少なくと１０％、又は２０％、又は３０％、又は５０％、又は１００％高ければ有意に高いとし、例えば標準値と比べて少なくとも１０％、又は２０％、又は３０％、又は５０％、又は９０％低れば有意に低いとすることができる。
【００２４】
本発明でいう上記ヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子（配列番号１）、ＫＡＰ５．２遺伝子（配列番号２）、ＫＡＰ５．３遺伝子（配列番号３）、ＫＡＰ５．４遺伝子（配列番号４）及び／又はＫＡＰ５．５遺伝子（配列番号５）には、それらの遺伝子の他に、その変異体、例えば上記各遺伝子において１又は数個のヌクレオチドが置換、付加又は欠失しており、しかもその発現の亢進が毛髪のヤング率と相関する変異遺伝子、又は上記各遺伝子と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の相同を示す、しかもその発現の亢進が毛髪のヤング率と相関する変異遺伝子、又は上記各遺伝子と高ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーション可能であり、しかもその発現の亢進が毛髪のヤング率と相関する変異遺伝子も含まれる。なお、ここでいうハイブリダイゼーションは周知の方法又はそれに準じる方法、例えばJ.SambrookらMolecular Cloning 2nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法に従って行うことができ、そして高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えばナトリウム濃度が約１０〜４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃であることを含む条件をいう。
【００２５】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
遺伝子発現量の測定方法
抜去毛髪検体からのcDNA調製法
頭髪を抜きその毛根部約1ｃｍを液体窒素中で凍結し、そのまま液体窒素中に放置した。凍結した毛根部5本を集め、ＲＮＡ抽出液ISOGEN(ニッポンジーン)１ｍｌの入った1.5mlチューブに入れ、ボルテックスミキサーにて十分に攪拌した。クロロフォルム200μlを加えて再度ボルテックスミキサーにて十分に攪拌した後に、小型微量遠心分離機により遠心分離（15000rm、15分間）し、RNAを含む水相約500μlを回収した。回収した溶液に50μlの３M酢酸ナトリウムと1μlのエタ沈メイト(ニッポンジーン)を添加して十分に攪拌した。さらに1mlのイソプロパノールを加えて攪拌し、小型微量遠心分離機により遠心分離（15000rm、20分間）して、全RNAを沈殿させた。上清を捨てた後に75％エタノールを加え、再び小型微量遠心分離機により遠心分離（15000rm、10分間）した。上清を捨てて沈殿を風乾させ、50μlのnuclease free waterに溶解させた。DNaseＩ処理により混在するゲノムDNAを除去し、再度エタノール沈殿により全RNAを回収して、20μlのnuclease free waterに溶解させた。このうち、1.0μlを用いてNanoDrop（Technologies, Inc．）によりRNAの濃度を測定した。得られた全RNA 100ngからcDNAを合成し、PCRによる各遺伝子発現量の定量に用いた。
【００２７】
リアルタイムPCR法による遺伝子発現の定量化
合成したcDNA、検出・定量化する遺伝子に特異的なプライマー、リアルタイムPCR 試薬(Roche)を混合し、ライトサイクラークイックシステムにて350SにてリアルタイムPCRを行い、検出・定量化する遺伝子の断片を増幅した。この際、濃度既知の同じ遺伝子断片（PCR産物102〜1011コピー相当）を同様にリアルタイムPCRにより増幅して検量線を作成し、サンプル中に含まれる検出・定量化する遺伝子の発現量を、単位（1μg）RNA当たりのコピー数として算出した。
【００２８】
各遺伝子に特異的かつgenomic DNAを増幅しないプライマーとして、以下の組合せのプライマーを用いた。
ヒトヘアケラチンHa1
センス          GGAATGCCAGAGGAGCA    （配列番号６）
アンチセンス    CAGAGAGTTCTCTGGGTGA  （配列番号７）
ヒトヘアケラチンHa2
センス          AACACGCTGGAGATCGA    （配列番号８）
アンチセンス    CACAGGTGGTGCAGGAA    （配列番号９）
ヒトヘアケラチンHb2
センス          CCCGTGAATATCTCAGTGA  （配列番号１０）
アンチセンス    CAAGGAGGGAACACTGGA   （配列番号１１）
ヒトKAP5.2
センス          ACTGTAGCTGTGTCCTGA   （配列番号１４）
アンチセンス    GATGAAGATGAAGGGTGGA  （配列番号１５）
【００２９】
毛髪の硬さ(ヤング率)の測定
測定用サンプルの調製法
毛髪1本ずつについて、両端(間隔3cm)に耐水紙のタグをつけて番号を記入する。シャンプーにて軽く洗浄してから水洗し、イオン交換水に浸した後に恒温・恒湿室(25℃、湿度50％)で風乾させた。
【００３０】
毛径の測定
恒温・恒湿室(25℃、湿度50％)にて、レーザー光を利用した毛径測定装置SK-2000（カトーテック/資生堂）により、毛髪サンプルの長径および短径を2mm間隔にて20mmの長さに亘って測定し、これらの平均値をその毛髪サンプルの長径および短径とした。
【００３１】
曲げ応力測定
毛髪サンプルの曲げ応力は、トルク感知式曲げ応力測定装置KES-SH（カトーテック）により、恒温・恒湿室(25℃、湿度50％)にて測定した。曲げ速さは、0.5cm-1/sec.に設定し、曲率（ρ）±1.0〜2.0cm-1における各毛髪サンプルの曲げ応力(M)を測定した。
【００３２】
ヤング率の算出
各毛髪サンプル１本1本について毛径と曲げ応力を測定し、断面二次モーメント(Ｉ)を用いた以下の算出式により各毛髪サンプル１本1本のヤング率（E）を算出した。
E=M・ρ/I
このとき、毛髪断面を楕円に近似し、さらに毛髪が曲がるときには短径側で曲がると仮定した場合、断面二次モーメント(Ｉ)は次の式で表される。
I=π/4・ａ3・ｂ(ａは毛髪の短半径、bは毛髪の長半径)
【００３３】
遺伝子発現との比較には、まとめてRNA抽出した毛髪サンプル5本それぞれについてヤング率を算出し、それらの平均値を用いた。
【００３４】
ヘアケラチンＨａ１遺伝子、ヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．２遺伝子それぞれの発現量と、毛髪のヤング率との関係を図１〜４に示す。また、以下の表に、各遺伝子発現量と毛髪のヤング率のSpearman順位相関係数ｒsを示す。
【表２】
2006014721.tif 000003
【００３５】
以上の実験から、パネル２０名によるヒト試験において、毛髪の硬さ（ヤング率）とヘアケラチンＨａ２遺伝子及びヒトＫＡＰ５．２遺伝子の発現に有意な相関が認められた。また、毛髪の硬さヘアケラチンＨｂ２遺伝子の発現との間では、有意ではないが、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子の発現量が高いほど、毛髪は顕著に硬くなることも認められた。尚、毛髪の硬さとヘアケラチンＨａ１遺伝子の発現との間では相関は認められなかった。
【００３６】
毛髪のヤング率とＫＡＰ５．１及び５．４遺伝子の発現との関係の検討  
パネル１１名の頭髪の硬さ（ヤング率）を上記のとおりに測定し、ヤング率１１．４以上を「高ヤング率頭髪」、換言すれば「はり・こし感」のある髪、１０．２以下を低ヤング率毛髪、換言すれば「はり・こし感」のない髪にグループ分けし、それぞれのグループについてＫＡＰ５．１及びＫＡＰ５．４遺伝子の発現量を、上記と同様にしてリアルタイムPCR法により調べた。
使用したプライマーは以下のとおりである：
ヒトKAP5.1
センス                               （配列番号１２）
アンチセンス                         （配列番号１３）
ヒトKAP5.4
センス                               （配列番号１８）
アンチセンス                         （配列番号１９）
【００３７】
その結果を図５に示す。図５（ａ）は「高ヤング率頭髪」（High）と「低ヤング率頭髪」（Low）の平均値及び標準偏差（ｐ＜0.05）を示す。この図は、上記グループ分けにより、「高ヤング率頭髪」グループと「低ヤング率頭髪」グループのヤング率において有意な差があることを示している。図５（ｂ）はＫＡＰ５．１遺伝子について、「高ヤング率頭髪」（High）と「低ヤング率頭髪」（Low）における発現量の差を示している。低ヤング率頭髪に比べ、高ヤング率頭髪においてＫＡＰ５．１遺伝子の発現が亢進していることが明らかである。図５（ｃ）はＫＡＰ５．４遺伝子について、「高ヤング率頭髪」（High）と「低ヤング率頭髪」（Low）における発現量の差を示している。低ヤング率頭髪に比べ、高ヤング率頭髪においてＫＡＰ５．４遺伝子の発現が亢進していることが明らかであり、また図５（ｂ）との対比から、高い及び低ヤング率の頭髪におけるＫＡＰ５．４遺伝子の発現量の差はＫＡＰ５．１遺伝子のそれに比べて顕著でもあった。以上の結果から、ヤング率が高い頭髪、即ちはり・こし感のある頭髪においては、ＫＡＰ５．１及びＫＡＰ５．４遺伝子、特にＫＡＰ５．４遺伝子の発現も有意に高まることが明らかとなった。従って、毛質の評価の指標として、ＫＡＰ５．１及びＫＡＰ５．４遺伝子の発現の測定も有意義であることがわかった。
【００３８】
先に記載のとおり、ＫＡＰ５．１〜５．５遺伝子（配列番号１〜５）はヒトケラチン関連タンパク質ＫＡＰ５ファミリーに属する、互いに相同性の比較的高い遺伝子群である。各遺伝子によりコードされる推定タンパク質のアミノ酸配列同士の相同性の高さは、図６及び以下の表から明らかである。
【００３９】
【表３】
2006014721.tif 000004
【００４０】
また、先にも述べたが、ＫＡＰ５．１〜５遺伝子によりコードされる各推定タンパク質は全てシステインリッチであり、また低分子アミノ酸であるグリシンとセリンを豊富に含むため、α−ヘリックスなどの二次構造を形成せず、ケラチン繊維の間に容易に入り込むことができ、また多数セリン残基のＯＨ基による多数の水素結合の形成も考えられるため、毛髪の機械的強度に大きく寄与していると考えられる。以下の表にＫＡＰ５．１〜５遺伝子推定コードタンパク質の一部アミノ酸組成を示す。
【００４１】
【表４】
2006014721.tif 000005
従って、ＫＡＰ５遺伝子ファミリーにおける遺伝子間の相同性の高さ及びコードタンパク質間の構造類似性に基づき、ＫＡＰ５．１、５．２及び５．４に関して得られた上記結果から、ＫＡＰ５．３及び５．５の発現を調べることによっても毛質の評価が可能であるものと類推できる。
【００４２】
in situ  ハイブリダイゼーション法（ISH法）によるヒトKAP5遺伝子発現部位の同定
KAP5.1〜5リボプローブの作製
抜去毛髪より調製したcDNAと、KAP5.1, KAP5.2, KAP5.3, KAP5.4, KAP5.5のそれぞれについて、以下の表に示すプライマーを用いて、T7ポリメラーゼのプロモーター配列をアンチセンス側に付加した形で、各KAP5の遺伝子断片を増幅した。
【００４３】
【表５】
2006014721.tif 000006
増幅した各遺伝子断片を市販のキット（Wizard SV Gel and PCR clean-up System: Promega）で精製した後に、T7ポリメラーゼとDIG  RNAラベリングキット（Roche）により、各KAP5遺伝子特異的なリボプローブを作製した。
【００４４】
各KAP遺伝子の発現部位の同定
頭皮組織の中性フォルマリン固定・パラフィン包埋サンプルをミクロトームにより5μmに薄切して頭髪毛包を含む組織切片（スライドガラス）を作製し、ベンタナ社の自動染色装置（ベンタナHXシステムディスカバリー）およびin situ hybridization 用の試薬リボマップキット（ベンタナ）を用いて、各KAP5遺伝子特異的なリボプローブ（スライド1枚当たり200ng）と反応させた。さらに、プローブと反応させた組織切片を自動染色装置上でアルカリフォスファターゼ標識抗DIG抗体（Roche）と反応させた。自動染色装置より組織切片の載ったスライドガラスを取り出し、トリス-塩酸バッファー（ｐH9.0）で洗浄した後にBM-purple (Roche)と約5時間程度反応させ、各KAP5遺伝子の発現部位を青紫色の染色部位として可視化した。その結果、KAP5.1, KAP5.2, KAP5.3, KAP5.4, KAP5.5遺伝子全てが、キューティクル部位に特異的に存在することが認められた。
【００４５】
種々の薬剤化合物のＫＡＰ５．１遺伝子の発現に対する効果
次に、本発明者は、毛髪の硬さ（ヤング率）との相関性が認められたヘアケラチンＨａ２、Ｈｂ２遺伝子、ヒトケラチン関連タンパク質ＫＡＰ５．１、ＫＡＰ５．２、ＫＡＰ５．４遺伝子のうち、特にＫＡＰ５．１遺伝子について、この毛髪関連遺伝子の発現に各種薬剤が及ぼす効果を評価するためのレポーターアッセイ系を新たに構築した。このアッセイ系を用いて、種々の化合物がＫＡＰ５．１遺伝子の発現に及ぼす効果について鋭意検討した。その結果、ある種の薬剤化合物にＫＡＰ５．１遺伝子の発現を上昇する効果があることを見出した。
【００４６】
先に記載のとおり、ＫＡＰ５．１〜５．５遺伝子（配列番号１〜５）はヒトケラチン関連タンパク質ＫＡＰ５ファミリーに属する、互いに相同性の比較的高い遺伝子群である。また、図８から分かるように、ＫＡＰ５．１遺伝子のプロモーター領域の配列と他のＫＡＰ５．２−５．５遺伝子のプロモーター領域の配列とは互いに非常に近似しており、その制御機構は同等である可能性が高い。従って、ＫＡＰ５．１遺伝子の発現を上昇する薬剤は他のＫＡＰ５遺伝子の発現も亢進している可能性が非常に高いと考えられる。
【００４７】
また、ＫＡＰ５．１遺伝子の発現量が多いほど毛髪のヤング率が統計学的に有意に高まることから、ＫＡＰ５．１遺伝子の発現を上昇する薬剤は毛髪の硬さを向上し、毛髪のはり・こしを改善することが当然に期待される。
【００４８】
ＫＡＰ５．１レポータープラスミドの構築
毛髪の硬さ（ヤング率）と相関性が認められたＫＡＰ５．１について、ＰＣＲ法により転写調節領域を増幅した後、レポータープラスミドの構築を行った。
【００４９】
Ａ．ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅
ＫＡＰ５．１遺伝子とＫＡＰ５．２遺伝子を含む約１５ｋｂのＤＮＡ断片を、５’末端に制限酵素ＮｏｔＩおよびＭｌｕＩの認識サイトを付加したＮＭ−Ｆ１プライマー（配列番号２２）とＲ２プライマー（配列番号２３）を用いて、市販のヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａより入手）を鋳型としてＰＣＲ法により増幅した（図９−Ａ）。
【００５０】
なお、ＰＣＲ反応の条件は下記の表に示す通りである。
【００５１】
【表６】
2006014721.tif 000007
【００５２】
ＮＭ−Ｆ１プライマー（配列番号２２）とＲ２プライマー（配列番号２３）は下記の表に示す通りである。なお、表に示す番号はHomo sapiens genomic DNA, chromosome 11 clone:RP11-684B2, complete sequences. ACCESSION:AP000867.5の配列番号の位置を表示する。
【００５３】
【表７】
2006014721.tif 000008
【００５４】
Ｂ．ＤＮＡ断片のベクターへのクローニング
増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＭｌｕＩとＮｈｅＩで二重消化して、アガロースゲル電気泳動により分離してから約４．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を、ホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）をコードする遺伝子を有するレポーターベクターｐＧＬ−３ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａより入手）のＭｌｕＩとＮｈｅＩサイトの間にクローニングした（図９−Ｂ）。サブクローニング［ステップ１：ＳａｃＩ／ＮｃｏＩ断片（１５４ｂｐ，図１０）をｐＧＬ−３ｂａｓｉｃにサブクローニング。ステップ２：得られたプラスミドにＳａｃＩ断片（約４．０ｋｂｐ，図１０）を挿入］により、ＫＡＰ５．１の５’上流領域（配列番号２４）を含むレポータープラスミドｐＧＬ−３−ＫＡＰ５．１を構築した（図１０）。
【００５５】
ＫＡＰ５．１レポーターアッセイ
不死化外毛根鞘細胞（ＩＯＲＳ）（特開2000-89号公報）を７５ｃｍ2 フラスコに８０万細胞播種し、３７℃・５％ＣＯ2 の条件下で６日間培養する。培地はＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いる。
１日目：プラスミドＤＮＡ導入（一過性）。培養したＩＯＲＳ細胞を、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）のマニュアルに従って、上記の構築したレポータープラスミドｐＧＬ３−ＫＡＰ５．１（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）と、市販の内部標準プラスミドｐＲＬ−ＴＹ（ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）で、Ｄｕａｌに形質転換した。
２日目：形質転換した細胞を２４ウェルのマルチウェルプレートに１ウェル当たり１０〜１６万細胞となるように播き直し、３７℃・５％ＣＯ2 の条件下で一晩培養する。
３日目：各ウェルの培地を、各種薬剤を溶解させた基礎培地と交換し、３７℃・５％ＣＯ2 の条件下で一晩培養する。
４日目：アッセイ。デュアル−ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、該製造者のマニュアルに従って各ウェルごとのルシフェラーゼ活性を測定する。ルミノメーターはＡｕｔｏＬｕｍａｔ  ＬＢ９５３（ＢＥＲＴＨＯＬＤ）を用いる。
【００５６】
試験に用いた薬剤は、下記の通りである。
試験薬剤：
タウリン（Ｓｉｇｍａより入手）（純度９９％）
Ｎ−メチルタウリン（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒより入手）（ナトリウム塩、純度９８％）
塩酸−Ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａより入手）（純度９９％）
Ｌ−シトルリン（Ｓｉｇｍａより入手）（純度９８％）
Ｌ−スレオニン（Ｓｉｇｍａより入手）（純度９８％）
チアミン（Ｓｉｇｍａより入手）（塩酸塩、純度９９％）
Ｌ−チロシン（Ｓｉｇｍａより入手）（純度９８％）
塩化コリン（Ｓｉｇｍａより入手）（純度９８％）
【００５７】
ネガティブコントロールとして、薬剤を含有しないことを除いて同じ条件のアッセイを行った（Ｋ−ＳＦＭ(−)）。
【００５８】
アッセイ結果を表８及び表９に示す。表８に示す各種薬剤はＫＡＰ５．１の遺伝子発現を亢進する効果が認められた。これに対し、表９に示す薬剤はＫＡＰ５．１の遺伝子発現の亢進効果が認められなかった。
【表８】
2006014721.tif 000009
【表９】
2006014721.tif 000010
【００５９】
本例ではＫＡＰ５．１についてのみアッセイ結果を示したが、先に述べたように、ＫＡＰ５．１遺伝子のプロモーター領域の配列と他のＫＡＰ５．２−５．５遺伝子のプロモーター領域の配列が互いに非常に近似しており（図８）、その制御機構は同等である可能性が高いことから、ＫＡＰ５．１の発現を亢進する薬剤は他のＫＡＰ５遺伝子の発現も亢進している可能性が非常に高い。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ヘアケラチンＨａ１遺伝子の発現量と、毛髪のヤング率との関係。
【図２】ヘアケラチンＨａ２遺伝子の発現量と毛髪のヤング率との関係。
【図３】ヘアケラチンＨｂ２遺伝子の発現量と毛髪のヤング率との関係。
【図４】ＫＡＰ５．２遺伝子の発現量と毛髪のヤング率との関係。
【図５】ＫＡＰ５．１及びＫＡＰ５．４遺伝子の発現量と毛髪のヤング率との関係。
【図６】ヒトＫＡＰ５．１〜５．５遺伝子の推定コードタンパク質のアミノ酸配列比較。
【図７】ヒトＫＡＰ５．１〜５．５遺伝子の推定コードタンパク質のアミノ酸配列の相同性。
【図８】ＫＡＰ５遺伝子群の発現調節。
【図９】ＫＡＰ５．１レポータープラスミドの構築および構成を示す概略図。図９−ＡはＫＡＰ５．１遺伝子とＫＡＰ５．２遺伝子を含むＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を示し、図９−Ｂは増幅したＤＮＡ断片のレポータープラスミドベクターｐＧＬ−３ｂａｓｉｃへのクローニングを示す。
【図１０】図９に続くＫＡＰ５．１レポータープラスミドの構築図であり、サブクローニングによるＫＡＰ５．１遺伝子翻訳領域（開始コドン以降）の削除を示す。
【図１】
2006014721.tif 000011
【図２】
2006014721.tif 000012
【図３】
2006014721.tif 000013
【図４】
2006014721.tif 000014
【図５】
2006014721.tif 000015
【図６】
2006014721.tif 000016
【図７】
2006014721.tif 000017
【図８】
2006014721.tif 000018
【図９】
2006014721.tif 000019
【図１０】
2006014721.tif 000020
【配列表】
2006014721000001.app