(57)【要約】      （修正有）【課題】重要なアレルゲンの一つであるイエダニに対するアレルギーまたは感作に関与する新規アレルゲンを提供する。【解決手段】イエダニに由来する新規なアレルゲン、前記アレルゲンに由来するポリペプチド、およびこれをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに前記アレルゲンに対する抗体、アレルギー性疾患の治療、診断および予防における前記ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／または抗体の用途を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して交差反応性を示すポリペプチド、
ｂ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１８アミノ酸からなる断片を含むポリペプチド、
ｃ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｄ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列の断片を含むポリペプチドであって、前記断片は、イエダニに対してアレルギー性であるかまたは感作された個体からのＩｇＥ抗体に結合することができるポリペプチド、および
ｅ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも７アミノ酸からなる断片で構成されるポリペプチド、
からなる群より選択されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：１に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号：１に示されるアミノ酸２０〜１４０を含むことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
ｂ）請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
ｃ）配列番号：２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
から成る群より選択されることを特徴とするポリヌクレオチド、または、前記ポリヌクレオチドの相補鎖。
【請求項５】
配列番号：２に示されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号：２に示される配列のヌクレオチド８１〜４３４を含むことを特徴とする請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプラスミドまたはベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のプラスミドまたはベクター、および／または、請求項４〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする細胞。
【請求項９】
植物細胞、細菌細胞および酵母細胞からなる群より選択されることを特徴とする請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドの調製方法であって、請求項８または９に記載の細胞を、培地中でポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程と、それに続く随意の該細胞および／または培地からポリペプチドを回収する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
細胞を破壊し、ポリペプチドをイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはアフィニティクロマトグラフィーを用いて回収することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド、および／または請求項４〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項７に記載のプラスミドまたはベクター、および／または請求項８または９に記載の細胞、および／または請求項１２に記載の抗体を、随意で１つ以上の薬学的に許容される担体および／または希釈剤および／またはベヒクル及び／またはアジュバントと組み合わせて含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド、および／または請求項４〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項７に記載のプラスミドまたはベクター、および／または請求項８または９に記載の細胞、および／または請求項１２に記載の抗体を含む診断キット。
【請求項１５】
アレルギー性疾患の治療、および／または予防または診断のための薬剤を調製するための、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド、および／または請求項４〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項７に記載のプラスミドまたはベクター、および／または請求項８または９に記載の細胞、および／または請求項１２に記載の抗体の使用。
【請求項１６】
アレルギー性疾患が、イエダニまたは貯蔵庫ダニに対する感作またはアレルギーであることを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
薬剤が、脱感作すべき個体に投与されることを特徴とする請求項１５または１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イエダニ由来の新規のアレルゲン、前記アレルゲン由来のポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、前記アレルゲンに対する抗体、およびアレルギー性疾患の治療および診断における、前記ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／または抗体の用途を提供する。
【背景技術】
【０００２】
人口の２５％を越える人々が、ＩｇＥ媒介性アレルギーに苦しんでいる。アレルギー患者は、それ自体は無害の抗原（すなわちアレルゲン）に対するＩｇＥ抗体の生産が増加するという特徴を有している。Ｉ型アレルギーの急性症状（アレルギー性結膜鼻炎、ぜんそく、皮膚炎、アナフィラキシーショック）は、肥満細胞に結合したＩｇＥ抗体のアレルゲン誘導性架橋、および生物活性媒体（例えば、ヒスタミン、ロイコトリエン）の放出によって引き起こされる。
【０００３】
イエダニ（Ｈｏｕｓｅ−ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ：  ＨＤＭ）は、世界中で最も重要なアレルゲン源の１つである。人口のほぼ１０％、およびアレルギー患者の５０％以上が、ダニアレルゲンに感受性である。イエダニであるヤケヒョウヒダニ(HDM Dermatophagoides pteronyssinus (Der p))は、中央ヨーロッパにおける主たる室内アレルゲンである（１）。Ｄｅｒ  ｐのアレルゲンは３０を越えるタンパク質または糖タンパク質からなり、他のダニ種由来のアレルゲンに対して交差反応性を示す。これまでに１９群のアレルゲンがキャラクタライズされている。上述の１９群のＨＤＭアレルゲンのなかでは、第１群および第２群（Ｄｅｒ  ｐ  １およびＤｅｒ  ｐ  ２）が、最も重要なアレルゲンであるが、他のＨＤＭアレルゲン（例えばＤｅｒ  ｐ  ５およびＤｅｒ  ｐ７）は、Ｄｅｒ  ｐアレルギー患者の約５０％で認められている重要なＤｅｒ  ｐアレルゲンであることが示されている（２）。
【０００４】
現在ＨＤＭアレルギー患者の診断および治療のために用いられている天然ＨＤＭ粗抽出物は、Ｄｅｒ  ｐ  １およびＤｅｒ  ｐ  ２についてしか標準化されておらず、他の重要なアレルゲンは、ＨＤＭ抽出物中には少量しか存在しない。したがって、ＨＤＭ特異的免疫治療は、花粉アレルゲンを用いた免疫治療よりも効率が低いと考えられる。診断および治療のために組み換えアレルゲンを用いることにより、この問題を排除できるかもしれない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の基礎をなす技術的問題は、ＨＤＭに対するアレルギーまたは感作に関与する新しいアレルゲンを同定し、単離することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記技術的問題に対する解決策は、請求項に特徴を記載する本発明の実施形態によって提供される。
【０００７】
特に、本発明者らは、Ｄｅｒ  ｐアレルギー患者の診断および治療に有用な新規なＤｅｒ  ｐアレルゲンの同定に成功した。この新規なダニアレルゲンをコードするｃＤＮＡは、Ｄｅｒ  ｐ発現ｃＤＮＡライブラリより単離し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中において組み換えアレルゲンとして発現させた。１４．７ｋＤａの分子量を有するこの新規なアレルゲンは、３０％程度のダニアレルギー患者由来のＩｇＥに結合する。新規なＤｅｒ  ｐアレルゲンのアミノ酸配列と、異なるＨＤＭおよび貯蔵庫ダニ（すなわち、Ｄｅｒ  ｐ、Lepidoglyphus destructor、Blomia tropicalis）からの５群のアレルゲンのアミノ酸配列の間には、約５０％の同一性が見られた。しかしながら、新たに記載するアレルゲンとＤｅｒ  ｐ  ５との間に交差反応性を認めることはできず、この新しいアレルゲンが、ＨＤＭアレルゲンの新しい群であることが実証された。さらに、本発明者らは、組み換えアレルゲンが生物学的に活性であることを示す。特に、該アレルゲンは、ダニアレルギー患者の好塩基球から、すでに１０ｐｇ／ｍＬの濃度で最大限のヒスタミンを放出しており、場合によっては、１ｎｇ／ｍＬの濃度でしか最大ヒスタミンを放出しないメジャーアレルゲンであるＤｅｒ  ｐ  １よりも活性が高い可能性があることが示されている。
【０００８】
したがって、本発明は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列、特にそのアミノ酸２０〜１４０を含むポリペプチドに対して交差反応性を示すポリペプチドを提供する。「交差反応性」という用語は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列に結合する、特定の免疫グロブリン、好ましくはＩｇＥ抗体、または、完全なイムノグロブリンがもつエピトープへの結合特性を示すその断片または誘導体が、当該ポリペプチドにも結合することを意味する。こうした結合は、前記当該ポリペプチドが、配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド内の前記特定の免疫グロブリン（好ましくはＩｇＥ）によって認識される少なくとも１つのエピトープまたは決定基を含むアミノ酸配列を有しているために起こる。
このことは、交差反応性ポリペプチドが、交差反応性ポリペプチドに曝露された個体においてアレルギー反応か少なくとも感作を誘発しうることを意味している。
【０００９】
本発明はさらに、配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。好ましくは、前記ポリペプチドは、配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％の同一性、より好適には少なくとも８０％の同一性、さらに好適には少なくとも９０％の同一性、最も好適には少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。本明細書中において、「ポリペプチド」という用語は、少なくとも７アミノ酸長を有するタンパク質および／またはペプチドのことをいう。
【００１０】
配列番号：１に対するアミノ酸の同一性の程度は、当該アミノ酸配列と配列番号：１とを、プログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ（ｂｌａｓｔｐ）（Ｔａｔｕｓｏｖａら（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４，２４７〜２５０頁）」により、以下のパラメータを用いて比較することにより決定する。マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２；オープンギャップ１１およびエクステンションギャップ１減点；ギャップ×＿ドロップオフ５０；予想１０．０ワードサイズ３；フィルターなし。
本発明によれば、配列比較は、少なくとも４０アミノ酸、好ましくは少なくとも８０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも１２０アミノ酸をカバーする。
【００１１】
好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列、より好ましくは配列番号：１に示される配列の残基２０〜１４０を含む。
【００１２】
さらに、本発明は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１８の（連続する）アミノ酸の断片を含むポリペプチドを提供する。好ましくは、断片の長さは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも２１アミノ酸、より好ましくは少なくとも２５アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも３５アミノ酸、最も好ましくは少なくとも５０アミノ酸である。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも７つの（連続する）アミノ酸で構成されるポリペプチドである。好ましくは、前記ポリペプチドの長さは、少なくとも１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１５アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも２５アミノ酸、最も好ましくは少なくとも３５アミノ酸である。さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちの、少なくとも８または少なくとも９または少なくとも１１または少なくとも１２または少なくとも１３または少なくとも１４または少なくとも１８または少なくとも２１または少なくとも３０の連続するアミノ酸で構成される。さらなる実施形態において、ポリペプチドの長さは、１００または５０または３０アミノ酸よりも小さい。少なくとも７つのアミノ酸で構成されるポリペプチドは、Ｔ細胞（Ｔ細胞エピトープ）によって認識されることができる。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列の断片であり、イエダニに対してアレルギーを持つかあるいは感作された個体からのＩｇＥ抗体と結合することができる断片を含むポリペプチドであり、「ＩｇＥ」抗体という用語は、それ自体既知の方法によって得ることのできる抗体調製物を意味する。過敏なヒトにおいては、アレルゲンへの曝露により、以下の２段階からなる即時型（ＩｇＥ媒介性）アレルギー反応が起こる。
（ｉ）最初の曝露により、アレルギー性タンパク質が、Ｂ細胞によるＩｇＥ合成を誘導する（ＶｅｒｃｅｌｌｉとＧｅｈａ（１９８９），Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，７５〜８３頁）。これらの特異的ＩｇＥ抗体は次に高親和性Ｆｃε受容体（ＦｃεＲＩ）を介して、肥満細胞および好塩基球の表面に結合する。
（ｉｉ）次の曝露により、アレルゲンは上記特異的ＩｇＥ抗体に結合して架橋し、前形成および新しく合成された炎症媒介物（例えばヒスタミン）および化学走化性物質（例えば血小板活性化因子）の放出を導く。
【００１５】
上記の段階（ｉ）において、Ｂリンパ球によるアレルゲン特異的ＩｇＥの産生には、アレルゲンの線形ペプチド断片によって活性化されるＴリンパ球（前掲のＶｅｒｃｅｌｌｉとＧｅｈａ（１９８９）参照）の「助け」を必要とする。これらのペプチドは、抗原プロセシングを介して抗原提示細胞によって生成され、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の分子によって細胞表面上に表示され、ここで認識およびＴ細胞受容体への結合に利用できるようになる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ（１９８５），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，２３７〜２５５頁；Ｒｏｔｈｂａｒｔら（１９８９）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１，４７９〜４８６頁）。上記段階（２）において、Ｂ細胞によって産生されるアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体は、循環して、肥満細胞および好塩基球上のＦｃeＲＩ受容体に結合することにより、アレルゲンに対する受容体として機能する。アレルゲンによるこれらの細胞表面結合ＩｇＥ抗体の架橋は、前形成および新たに合成された炎症媒介物および化学走化性物質の放出に対するシグナルを示し、典型的なアレルギー性炎症反応をもたらす。
【００１６】
「イエダニに対して感作された個体」とは、イエダニ由来のタンパク質を認識するＩｇＥ抗体を示す個体のことをいう。「イエダニに対してアレルギーをもつ個体」は、ＨＤＭに曝露された場合に、上述のようなＩ型アレルギーの即時症状などのアレルギー症状（ＩｇＥ媒介性）をさらに示す。上述したように、そのようなアレルギー反応または少なくとも感作は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列と交差反応性を有する相同ポリペプチドへの曝露によって、引き起こすこともできる。典型的には、ＨＤＭに対してアレルギーをもつ患者は、皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）では陽性を示し、放射性アレルギー吸着試験（ＲＡＳＴ）においては、０．３５ｋＵＡ／Ｌを越える結果を示す。
【００１７】
ポリペプチドは、抗体に対する親和性が該抗体に結合しない対照組成物に比べて有意に高い場合には、「抗体に結合することができる」。特定のポリペプチドまたはアレルゲンへの特異的ＩｇＥ抗体の結合は、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を示さない健常な非アレルギー個体（ＳＰＴ陰性、ＲＡＳＴ陰性によって判定されるような）からの対照血清を用いて、当該技術分野において知られる様々な方法、例えばＲＡＳＴ、イムノブロット、ＥＬＩＳＡなどによって判定することができる。
【００１８】
本発明は、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)および他のＨＤＭにおいて見られる新規なアレルゲン構造を提供する。これらの構造の同定は、イエダニ感作およびアレルギーの診断および治療において利用できる組み換えアレルゲンの選択および製造について特に有用である。
【００１９】
さらに、本発明は、配列番号：１によるポリペプチドの誘導体、類似体および断片を提供する。このような誘導体は、遺伝子操作または化学合成によって生成されてもよく、例えば、配列番号：１に示される配列内に１つ以上のアミノ酸を追加、欠失、および／または置換を行うことによって作成してもよい。好ましい実施形態によれば、配列番号：１によるポリペプチドの誘導体、類似体および断片は、親アミノ酸配列に比べて低いアレルゲン性を示す。このようなポリペプチドは、それぞれのポリペプチドをコードする核酸、例えばｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを使用して作成することが好ましい。そのような核酸（ポリヌクレオチド）は、配列番号：２に示されるヌクレオチド配列から、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、および／または欠失により得られるヌクレオチド配列を有している。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、単離ポリペプチド、すなわち実質的に純粋な形である。「実質的に純粋」という表現は、ポリペプチドを他の化合物から分離することによって、該ポリペプチドが少なくとも７５％の純度、好ましくは少なくとも９０％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度であることを意味する。ポリペプチドの純度は、当業者によって当該技術分野において周知の技術、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くタンパク質染色等によって決定することができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および質量分析が、ポリペプチドや短いペプチドを分析するために適した方法である。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、様々な方法によって調製することができる。ポリペプチドは、化学合成によって、好ましくは固相を適用することにより調製してもよい。化学ペプチド合成の方法は当該技術分野において周知である（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９；Ｓｔｅｗａｒｔら（１９８４）“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，第２版，Ｐｅａｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，米国イリノイ州ロックフォード；ＢａｙｅｒとＲａｐｐ（１９８６）Ｃｈｅｍ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．３，３；Ａｔｈｅｒｔｏｎら（１９８９）“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，英国オックスフォードを参照のこと）。これらの方法は、例えば７〜５０個のアミノ酸の長さを有する短いポリペプチドの調製に特に適している。より長いポリペプチドは、化学合成によって調製したペプチド断片を化学的または酵素的に連結することによって調製しても良い。上述のように、本発明のポリペプチドは、宿主細胞内または無細胞抽出物の補助により、核酸配列、特にＤＮＡ配列の発現によって調製してもよい。
【００２２】
したがって、本発明は、先に定義したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。該ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、あるいはＤＮＡおよび／またはＲＮＡ種から誘導される核酸のいずれであってもよい。したがって、一実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列をコードする。遺伝コードの縮重のために、配列番号：１に示されるアミノ酸配列をコードする多くの異なるポリペプチドが予想される。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドは、Ｄｅｒ  ｐに関係する任意のダニまたは他の種における類似の配列を同定し、それにより例えばイエダニまたは貯蔵庫ダニ由来のＤＮＡとハイブリダイズするのに十分な相同性を有する配列を同定し、単離するために用いることができる。このことは、例えば、十分な相同性（一般に４０％を越える）を有し、さらなる評価のために選択できる配列とのハイブリダイゼーションをもたらす、例えば低ストリンジェンシー条件下おいて実施することができる。あるいは、高ストリンジェンシー条件を適用してもよい。一般に、高ストリンジェンシー条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特異的配列に対する熱融解点（ＴＭ）よりも５℃〜１０℃低く選ばれる。ＴＭは、標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨにおいて）である。典型的な高ストリンジェンシーは、塩濃度がｐＨ７において約１５ｍＭＮａ＋（０．１×ＳＳＣ）まで、温度が少なくとも約６０℃のものである。
【００２４】
このように、本発明の核酸は、他の種、特に他の型のＨＤＭまたは貯蔵庫ダニにおいて、本発明に記載の１４．７ｋＤａアレルゲンと類似のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドをコードする配列を同定し、ひいては上記他の種におけるアレルゲンを同定するために用いることができる。したがって、本発明は、１４．６ｋＤａタンパク質および本発明に記載のポリヌクレオチドによってコードされる他のダニアレルゲンのみならず、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる他のダニアレルゲンも含む。
【００２５】
したがって、本発明は、配列番号：２に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。配列番号：２のヌクレオチド配列に対するポリヌクレオチド配列の同一性の程度は、前記ポリヌクレオチド配列と配列番号：２とを、プログラム“ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ（ｂｌａｓｔｎ）”によって比較することにより（Ｔａｔｕｓｏｖａら（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４，２４７〜２５０頁）、以下のパラメータを用いて決定する：一致に対する加点（ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ａ  ｍａｔｃｈ）１；不一致に対する減点（ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ａ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）−２；オープンギャップ（ｏｐｅｎ  ｇａｐ）５減点およびエクステンションギャップ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ）２減点；ギャップ、ｘ＿ドロップオフ５０；予想１０．０；ワードサイズ１１；フィルター；なし。
本発明によれば、配列比較は、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドをカバーする。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、配列番号：２に示されるヌクレオチド配列、好ましくはヌクレオチド２４〜４３４、より好ましくはヌクレオチド８１〜４３４を含む。他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：２に示されるヌクレオチド配列のうちの、少なくとも５０の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドを含む。
【００２７】
本発明は、上述のポリヌクレオチドに縮重するポリヌクレオチドも含む。開示したポリヌクレオチドの各相補鎖も本発明の一部を構成する。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは単離ポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、好ましくは本質的に純粋であり、すなわち少なくとも８０％の純度、より好ましくは少なくとも９０％の純度、最も好ましくは少なくとも９５％の純度を有している。本発明のポリヌクレオチドは、様々な方法によって調製することができる（たとえば、ＧｌｉｃｋとＰａｓｔｅｒｎａｃｋ（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ＤＮＡ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，ワシントンＤ．Ｃ．；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３，３２３〜３５６頁；Ｃｌｉｍｉｅら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，６３３〜６３７頁を参照のこと）。ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成において通常用いられる化学的方法によって合成してもよい。ＰＣＲに基づいた方法を用いて、本発明のポリヌクレオチド、特により長い分子を合成することもできる（たとえば、Ｌｅｅら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｄ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，米国マサチューセッツ州ナティック；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９６）ＰＣＲ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．２  ａｎｄ  ２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，英国オックスフォードを参照のこと）。より長いポリヌクレオチドは、化学的方法を用いて合成した断片を化学的または酵素的に連結することによって調製することもできる。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態は、上記ポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクターである。プラスミドは、該プラスミドの複製またはコードされた配列の転写および／または翻訳を容易化する調節配列を含んでいてもよい。そのような調節配列としては、例えばプロモータ、ターミネータ配列、エンハンサーなどが挙げられる。プラスミドは、宿主細胞内または無細胞発現系において発現される際に、コードされるポリペプチドの精製を容易にするアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。そのような配列としては、例えば、６×Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、およびＧＳＴなどの細菌タンパク質をコードする配列が挙げられる。コードされるポリペプチドの精製は、それぞれのタグまたは細菌配列に対する抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって行うことができる。他のアフィニティマトリックス（例えば、６×Ｈｉｓタグを有するポリペプチド精製用の）は、発現タグとキレート錯体を形成することのできるＮｉ２＋などの結合金属イオンを含む。調節およびタグ配列または細菌配列を含む適切なプラスミドおよびベクターは、当業者にとっては周知である。
【００３０】
本発明はさらに、上で定義した本発明のプラスミドまたはベクターおよび／またはポリヌクレオチドを含む細胞にも関する。細胞は、植物細胞、細菌細胞、酵母細胞および他の例えば哺乳動物細胞から選択してもよい。好ましい細胞は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子の発現を行える細胞である。最も好ましくは、細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。本発明によるプラスミド、ベクターおよび／またはポリヌクレオチドは、例えば形質転換、トランスフェクションなどのそれ自体既知の技術によって導入してもよい。細胞は、核酸分子を一時的にしか含まなくてもよいし、該細胞のゲノム内に安定的に統合された状態で含んでいてもよい。特に後者の場合、核酸分子はゲノムへの取り込みプロセスによって切断または断片化されることもある。このような切断または断片化された形の核酸分子を含む細胞は、本発明の範囲に含まれる。
【００３１】
本発明の細胞は、本発明のポリペプチドの発現および精製のために用いることができる。したがって、本発明は上述のポリペプチドの調製方法であって、上記細胞を該ポリペプチドの発現に適した条件下にある培地中で培養する工程と、随意で細胞および／または培地から該ポリペプチドを回収する後続の工程とを含む方法も提供する。細胞は、攪拌しながら液体培地中で培養することが好ましい。必要であれば、標的ポリペプチドの発現は、ＩＰＴＧなどの誘導剤によって誘導する。クローン化ＤＮＡ分子を操作し、外来の核酸を様々な宿主細胞に導入するための技術、これらの宿主細胞の形質転換技術およびその宿主細胞内でクローン化された外来のヌクレオチド配列の発現技術は、当業者によって周知である（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；Ａｕｓｕｂｅｌら（編）（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，米国ニューヨークを参照のこと）。
【００３２】
培養後、細胞を既存の方法を用いて破壊するか、さもなければ開化してもよく、またポリペプチドはアフィニティクロマトグラフィーによって回収してもよい。他の既知のタンパク質精製方法を用いてもよい。精製工程の例として、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣおよび逆相ＨＰＬＣが挙げられる。適切なクロマトグラフィー媒体としては、誘導化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカなどが挙げられる。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、アフィニティクロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィー工程を含む方法によって単離される。アフィニティクロマトグラフィーのために、本発明のポリペプチドに対する１つ以上の抗体を、固体支持体に固定化してもよい。好ましくは、該抗体は本発明のポリペプチドを特異的に認識する。抗体分子を支持媒体に結合させる方法も当該技術分野において周知である。特定の方法の選択は、常套的な設計上の問題であり、一部は選択された支持材料の特性によって決まる。
【００３３】
アフィニティクロマトグラフィーの別の好ましい方法は、結合金属イオンを含むマトリックス上への、ヒスチジンに富むタンパク質、例えばポリＨｉｓタグを含むタンパク質の吸着を利用する。簡単に説明すると、まず最初にゲルに二価金属イオンを導入して、キレートを形成させる。Ｈｉｓに富むタンパク質は、このマトリックスに使用したイオンによって異なるアフィニティで吸着され、ｐＨを下げることにより、あるいは強いキレート剤を用いることによって、競争溶出によって溶出されることになる。本発明のさらなる実施形態において、精製を容易にするために当該ポリペプチドとアフィニティタグとの融合物を構築してもよい。融合タンパク質は、融合タンパク質の各成分を調製して、該成分を化学的に共役させることにより、当業者に周知の方法によって調製することができる。あるいは、適切なリーディングフレーム内に、融合タンパク質の成分をコードするポリヌクレオチドを既知の技術によって作成し、本明細書に記載の方法によって発現させることもできる。
【００３４】
他の好ましいクロマトグラフィー精製工程としては、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。陰イオン交換マトリックスとしては、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）などの正に荷電しうる基を担持するセルロース、セルロース誘導体またはデキストランマトリックスが挙げられる。上記および他のタンパク質精製方法は、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，米国ニューヨーク；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ドイツハイデルベルグ；Ｄｏｏｎａｎ，Ｓ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、例えば、「精製アレルゲン」として用いることができる。このような精製アレルゲンは、ハウスダストアレルギーの診断および治療（または予防）に対する重要な試薬であるアレルゲン抽出物の標準化に有用である。さらに、配列番号：１に示されるアミノ酸配列の断片に基づいたペプチドを用いることにより、標準的な手順を用いて抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体を作成することができる。本発明の１４．７ｋＤａタンパク質に対するこのような血清またはモノクローナル抗体は、アレルゲン抽出物を標準化するために用いることができる。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態は、上記ポリペプチドに対する抗体である。「ポリペプチドに対する」という用語は、その抗体がそれぞれのポリペプチドに結合することができる、すなわち、抗体が該ポリペプチドのアミノ酸配列によって決定される１つ以上のエピトープを認識することを意味する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれであってもよい。さらに、「抗体」という用語は、標的ポリペプチドに対する親和性が維持される限りにおいて、完全な抗体の断片または誘導体も含意する。一例として、酵素的に調製された抗体断片、ならびに遺伝子操作による種、たとえば、ヒト化抗体および一本鎖抗体、例えばｓｃＦｖ構築物などが挙げられる。本発明の抗体は、例えばＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，米国コールドスプリングハーバーに開示されるような、当該技術分野において既知の方法によって調製してもよい。好ましい実施形態において、抗体は実質的に純粋な形態、すなわち少なくとも８０％の純度、好ましくは少なくとも９０％の純度を有する。ポリクローナル抗体の場合、抗体組成物は、複数の異なる抗体分子種を含んでいる。
【００３７】
抗体は好ましくは配列番号：１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して特異的である。さらなる好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちの残基２０〜１４０によって決定される１つ以上のエピトープに対するものである。
【００３８】
本発明の特に好ましい実施形態において、そのようなエピトープは、処置対象の患者において中和抗体を引き出す治療のために用いられる。このような抗体は、患者をアレルギー反応から守る。したがって、第１の段階において、例えば疎水性ブロットを用いて、おそらくはエピトープを示すポリペプチド内の領域を同定することができる。さらに、そのようなエピトープが、アレルギー患者のパネルにおいて防護的効果を有するかどうかについても調べる。
【００３９】
本発明の抗体は、イエダニおよび貯蔵庫ダニなどの関連種のさらなるアレルゲン性成分を単離するために用いることができる。このような追加のアレルゲンは、このアレルゲンのファミリーのさらなる特性の定義のために用いることができる。さらに、本発明のポリペプチドに対する抗ペプチド血清またはモノクローナル抗体は、皮膚試験試薬の内容を標準化および定義するために用いることができる。
【００４０】
本発明のさらなる実施形態は、本発明によるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドおよび／または抗体および／またはベクターまたはプラスミドおよび／または宿主細胞を、随意で１つ以上の薬学的に許容される担体および／または希釈剤および／またはベヒクル及び／またはアジュバントと組み合わせて含む医薬組成物である。勿論、本発明の医薬組成物は、上記各分子／種の１つ以上を含んでいてもよい。
【００４１】
本発明によって提供される材料、ならびに前記材料を含む組成物は、ＨＤＭアレルギーの診断、治療および予防方法において用いることができる。したがって本発明の別の態様は、本発明によるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドおよび／または抗体および／またはベクターまたはプラスミドおよび／または宿主細胞を、アレルギー性疾患の治療または診断または予防のために用いることである。さらに、本発明は、本発明の上記実施形態を、アレルギー性疾患の治療または予防または診断のための薬剤の調製のために使用することを含む。好ましくは、本発明の材料は、イエダニまたは貯蔵庫ダニに対する感作またはアレルギーの治療および／または予防および／または診断（または対応する薬物の生産のため）のために用いられる。
【００４２】
本発明による医薬組成物または薬剤は、好ましくは脱感作すべき個体に投与される。
【００４３】
本発明のポリペプチド（ならびに対応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を用いて、矛盾のない明確な組成と生物学的活性を有するアレルゲン調製物を作成し、治療または予防目的で（例えば、イエダニおよび／または関連種に対して感作された個体のアレルギー反応を緩和するため）投与することができる。このようなポリペプチドまたはその修飾物、特に低アレルゲン性誘導体（例えば、野生型配列と比べて１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、および／または置換を含む変異体、ならびに化学的修飾誘導体）は、例えば、ＨＤＭおよび関連種（例えば、貯蔵庫ダニ）に対するＢ細胞反応および／またはＴ細胞反応を緩和するかもしれない。すでに述べたように、精製アレルゲンは、修飾前の天然（野生型）ペプチドまたはポリペプチドよりも免疫治療においてより有用な修飾誘導体またはアナログを設計するために用いることができる。
【００４４】
高用量のアレルゲンは一般に最良の症状緩和を与える。しかしながら、多くの患者はアレルゲンに対するアレルギー反応のために、高用量のアレルゲンに耐えられない。したがって、天然のアレルゲンの修飾は、修飾ポリペプチドが、対応する野生型アレルゲンに比べて、同一または強化された治療特性を有しながらも副作用の低減、特にアナフィラキシー潜在性が低いか全くないなどの低アレルゲン性を示すように設計することができる。このような修飾アレルゲンは、例えば、本発明のポリペプチドまたは修飾アナログ（例えば、アミノ酸配列が免疫原性を修飾および／またはアレルゲン性を低減するように変更されているポリペプチド、またはある成分が同じ目的で付加されているポリペプチド）であってよい。たとえば、該ポリペプチドは、Ａ．Ｓｅｈｏｎらのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法を用いて修飾することができる。短いセグメントの欠失またはポリペプチド配列のアミノ酸置換により、抗体結合が弱められる（すなわち減少または全くなくなる）。このような修飾により、低ＩｇＥ結合がもたらされ、低い副作用のため免疫治療においては非常に有用である。
【００４５】
本発明の（ポリ）ペプチドまたは医薬組成物（薬剤）の個体、好ましくは脱感作すべき個体への投与は、既知の技術を用いて行うことができる。ペプチドまたは異なるペプチドの組み合わせを、例えば、希釈剤（適当なバッファなど）、担体、および／またはアジュバントを含む組成物中で、個体に投与することができる。このような組成物は、一般に注射、経口投与、吸入、経皮適用または直腸投与によって投与される。本発明によって提供される構造情報を用いて、ＨＤＭ感受性の個体に十分量投与された場合に、該個体のダニアレルゲンに対するアレルギー反応を緩和するダニポリペプチドを設計することができる。このことは、例えば、ダニタンパク質の構造を調べ、ＨＤＭ感受性個体におけるＢ細胞および／またはＴ細胞反応に影響を与えうるかを調べるペプチドを生産し、細胞によって認識される適当なエピトープを選択することによって、行うことができる。アレルゲンのエピトープを模倣し、ダニアレルゲンに対するアレルギー反応をダウンレギュレートすることのできる合成アミノ酸配列もまた用いることもできる。
【００４６】
本発明のポリペプチドまたは抗体は、ＨＤＭアレルギーまたは感作を検出および診断するために用いることもできる。例えば、ＨＤＭアレルゲンに対する感受性の検査対象個体からの血液または血液製剤を、血液中の成分（例えば、抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）とポリペプチドとの結合に適した条件下で、ダニアレルゲンの単離されたアレルゲン性ペプチドと混合し、このような結合の起こる程度を判定することによる。
【００４７】
ダニ感受性個体におけるアレルギー反応を誘導するダニアレルゲンの能力を、阻止または阻害することのできる薬剤またや医薬品を設計することもできる。このような薬剤は、例えば、関連する抗ダニＩｇＥに結合することにより、ＩｇＥ−アレルゲン結合およびこれに続く肥満細胞脱顆粒を阻害するように設計することができる。あるいは上記のような薬剤は、免疫系の細胞性成分に結合して、ダニアレルゲンに対するアレルギー反応を抑制または脱感作するようなものであってもよい。本発明のこの実施形態の例としては、限定はされないが、ＨＤＭアレルゲンに対するアレルギー反応を抑制するために、本発明のｃＤＮＡ／ポリペプチド構造に基づいた、適切なＢおよびＴ細胞エピトープペプチド、またはその修飾物を用いることである。このことは、ダニ感受性個体からの血液細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究において、ＢおよびＴ細胞機能に影響を与えるＢおよびＴ細胞エピトープペプチドを明らかにすることによって行うことができる。
【００４８】
最後に、本発明は、本発明によるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドおよび／または抗体および／またはベクターまたはプラスミドおよび／または宿主細胞を含む、アレルギー性疾患の診断、治療、および／または予防に有用なキットに関する。本発明によって提供される材料、ならびに該材料を含む組成物およびキットは、ＨＤＭまたは貯蔵庫ダニなどの関連種に対するアレルギーまたは感作を診断、治療および予防する方法において用いることができる。
【００４９】
本発明は、イエダニであるヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus (Der p))に由来する１４．７ｋＤａアレルゲンをコードする組み換えＤＮＡ分子およびその断片に基づいている。新規なダニアレルゲンは、ＨＤＭアレルギー患者の診断および治療に用いることができる。本発明により、新しいダニアレルゲンは、ウサギにおいて強力かつ特異的なＩｇＧ反応を誘導することを証明できた。これは、この新規なダニアレルゲンを用いた特異的免疫治療がヒトにおいてＩｇＧ抗体の阻止を誘導するであろうことを示すものである。この新規なアレルゲンの配列に基づいて作成した低アレルゲン性誘導体を、免疫治療に使用することによって、アナフィラキシー副作用の危険がさらに低減されることであろう（３）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
本発明は以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【実施例１】
【００５１】
新規な組み換えヤケヒョウヒダニアレルゲンの発現および精製
成熟型の新規アレルゲンをコードするクローン２５（図１Ａ）のｃＤＮＡを、発現ベクターｐＥＴ−１７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ，ウィスコンシン州マジソン）中にクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州ラ・ホヤ）中で発現させた。細菌細胞は、ＯＤ600が０．６〜０．８に達するまで、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地中で培養した。組み換えタンパク質の発現は、イソプロピル−ベータ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．５ｍＭとなるように加え、３７℃でさらに３時間培養することによって誘導した。１リットルの培養液からの大腸菌細胞を遠心分離により回収し、１０ｍＬの２５ｍＭイミダゾールｐＨ７．４，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００中に再懸濁し、室温で２０分間、１００μｇリゾチームによる処理を行った。細菌細胞の溶解物を液体窒素中で凍結させ、５０℃の水槽中で解凍した。ゲノムＤＮＡは、１μｇ  ＤＮａｓｅを添加することにより、室温で１０分間分解させ、２００μＬの５Ｍ  ＮａＣｌにより反応を停止させた。溶解した細菌細胞を１８，０００ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ５Ｃ，ＳＳ３４）、４℃で２０分間遠心分離した後、可溶性タンパク質を含む画分を得た。クローン２５由来アレルゲンを含む可溶性画分をバッファＡ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．０，４％イソプロパノール、１ｍＬ／Ｌフェニル−メチル−スルフォニル−フルオリド，ＰＭＳＦ）に対して透析し、ＤＥＡＥセファロースファストフローカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，スウェーデン国ウプサラ）にアプライした。クローン２５由来アレルゲンは、０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ勾配によって溶出した。組み換えアレルゲンを含む画分をプールし、バッファＢ（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ４．０、５ｍＭβ−メルカプトエタノール、１ｍＬ／Ｌ  ＰＭＳＦ）に対して透析し、ＳＰセファロースファストフローカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にアプライした。クローン２５由来アレルゲンをｐＨ４．０〜７．０と０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの組み合わせ勾配によって溶出し、純度９０％超のクローン２５でコードされたアレルゲンを含む画分をプールし、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０）に対して透析し、−２０℃で保存した。タンパク質試料の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびクーマシーブルータンパク質染色（図１Ｂ）によって分析した。
【実施例２】
【００５２】
新規なＤｅｒ  ｐアレルゲンのＩｇＥ結合能および生物活性
（ｉ）新規のアレルゲンはダニアレルギー患者血清からのＩｇＥと結合する
クローン２５ｃＤＮＡによってコードされる新規なＤｅｒ  ｐアレルゲンのＩｇＥ結合能を、１１７人のダニアレルギー患者からの血清を用いたドットブロット実験によって解析した。新しいアレルゲンをニトロセルロース条片（１μｇ／ドット）上にドット状に配置し、条片をＤｅｒ  ｐアレルギー患者の血清とともにインキュベートした。結合したＩｇＥ抗体を、125Ｉ−標識抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて検出した。
【００５３】
１１７のうちの３０の（２６％）の血清が、新規なＤｅｒ  ｐアレルゲンに対するＩｇＥ結合を示した（図２Ａ）。
【００５４】
（ｉｉ）新規のＤｅｒ  ｐアレルゲンは、ダニアレルギー患者の好塩基球からのヒスタミン放出を誘導する
イエダニＤｅｒ  ｐのメジャーアレルゲンｎＤｅｒ  ｐ  １（４）およびマイナーアレルゲンｒＤｅｒ  ｐ  ５（５）と、クローン２５ｃＤＮＡによってコードされる新規なアレルゲンとを、Ｄｅｒ  ｐアレルギー個体の好塩基球からのヒスタミン放出の誘導能力について比較した。
【００５５】
顆粒球は、Ｄｅｒ  ｐアレルギー個体のヘパリン化血液試料から、デキストラン沈降によって単離した。細胞をそれぞれ増加濃度（１０-6〜１μｇ／ｍｌ）のｎＤｅｒ  ｐ  １、ｒＤｅｒ  ｐ  ５およびクローン２５由来アレルゲンとともにインキュベートした。無細胞培養上清中に放出されたヒスタミンをラジオイムノアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，フランスマルセイユ）によって測定し、全ヒスタミン放出の百分率として示した。結果は、３回の測定の平均値として示している。図２に示すように、クローン２５ｃＤＮＡによってコードされる新規なアレルゲンも、ｒＤｅｒ  ｐ  ５も、１０ｐｇ／ｍＬにおいてすでに最大ヒスタミン放出を誘導していたが、メジャーアレルゲンｎＤｅｒ  ｐ  １は、１ｎｇ／ｍＬの濃度でしか最大ヒスタミン放出を誘導しなかった。
【実施例３】
【００５６】
新規な組み換えアレルゲンは、Ｄｅｒ  ｐ  ５との交差反応性を欠如する
クローン２５によってコードされる新規のアレルゲンは、他のチリダニアレルゲン（図３Ａ）、すなわち、サヤアシニクダニ(Lepidoglyphus destructor (Lep d 5))、ネッタイタマニクダニ(Blomia tropicalis (Blo t 5))およびヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides
pteronyssinus (Der p 5))に由来する第５群アレルゲンに対しても相同性を示した。新規なアレルゲンとＤｅｒ  ｐ  ５との間のアミノ酸同一性は３０％であるため、クローン２５由来のアレルゲンは、いまのところは、未知の新しい群のチリダニアレルゲンに属する。ドットブロット阻害実験からは、Ｄｅｒ  ｐ  ５と新規なアレルゲンがＩｇＥエピトープを共用しないことが実証された。１μｇのＤｅｒ  ｐ  ５，クローン２５由来アレルゲンおよびＢＳＡを、ニトロセルロース条片上にドット状に配置した。条片を、Ｄｅｒ  ｐ  ５と新規なアレルゲンの両方に反応性を有する９人の患者の血清とともに、およびｒＤｅｒ  ｐ  ５、クローン２５由来アレルゲン、およびＢＳＡのそれぞれ１０μｇ／ｍｌで予備吸着させた１つの非アレルギー患者の血清とともにインキュベートした。結合したＩｇＥ抗体を、125Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体（図３Ｂ）を用いて検出した。
【００５７】
新規なアレルゲンを用いたダニアレルギー患者からの血清の予備吸着により、ドット状に配置された新規なアレルゲンへのＩｇＥの結合が阻害され、ｒＤｅｒ  ｐ  ５との該血清の予備吸着でも、ドット状に配置されたｒＤｅｒ  ｐ  ５へのＩｇＥの結合が阻害される。しかしながら、ｒＤｅｒ  ｐ  ５の予備吸着では、新規なアレルゲンへのＩｇＥの結合またはその逆が阻害されず、ｒＤｅｒ  ｐ  ５と新規なアレルゲンとの間に交差反応性が欠如していることが実証された。
【実施例４】
【００５８】
新規なダニアレルゲンによる免疫化は、新規なアレルゲンを認識するウサギにおけるＩｇＧ抗体を誘導する
新規なダニアレルゲンが免疫原性を有するかどうかを調べるために、１匹のウサギをフロイントアジュバントを用いて新規なアレルゲンで免疫化した。このウサギをフロイント完全アジュバントで１回、フロイント不完全アジュバントで２回、２００μｇ／注射により免疫化した（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，ドイツ国キスレッグ）。
【００５９】
ＩｇＧ抗体の誘導は、ＥＬＩＳＡによって調べた。それぞれ５μｇ／ｍｌの濃度の組み換えＤｅｒ  ｐ  ２、ｒＤｅｒ  ｐ  ５およびクローン２５由来アレルゲンで、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，デンマーク国ロスキルデ）を４℃で一晩コーティングし、１：１００００希釈したウサギクローン２５由来アレルゲン抗血清、および対照としてウサギ前免疫血清とともにインキュベートした。結合したウサギ抗体をＨＲＰ共役ロバ抗ウサギＩｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって検出した。
【００６０】
高力価の特異的ＩｇＧ抗体が、新規のダニアレルゲンによって誘導された。クローン２５由来アレルゲンを用いて誘導した抗血清は、クローン２５由来アレルゲンと特異的に反応し、ｒＤｅｒ  ｐ  ２およびｒＤｅｒ  ｐ  ５との交差反応性は検出されなかった（図４）。
【００６１】
参照文献
１．  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃａｌｄａｓ  Ｅ．Ｍｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｉｃ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅ．Ａｌｌｅｒｇｙ  １９９７；５２：３８３−６．
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【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１Ａ】本発明による好ましいアレルゲンのｃＤＮＡ（配列番号：２）および推定アミノ酸配列（配列番号：１）を示す図。開始コドン、終止コドン、およびポリアデニル化シグナルを下線で示している。シグナル配列をコードする配列（アミノ酸１〜１９）は、ヌクレオチド２４〜８０からなる。開裂部位はアミノ酸残基１９（Ｇ）と２０（Ｆ）の間にある（太字）。配列の左側の数は、ヌクレオチド位置を示し、配列の右側の数はアミノ酸位置を示す。
【図１Ｂ】クーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡゲルおよび同定されたアレルゲンの質量分析の結果を示すず。左側：クーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。レーン１には分子量マーカー、レーン２には３μｇの精製アレルゲンが示されている。右側：本発明による精製アレルゲンのＭＳ分析を示す。質量／電荷（ｍａｓｓ／ｃｈａｒｇｅ）比をｘ軸、シグナル強度をｙ軸に、測定対象質量範囲内で得られる最も強いシグナルの百分率として示す。１４７２４．９におけるピークは、１４７２６．１の推定アミノ酸配列の質量の理論値に相当する。
【図２Ａ】新規なダニアレルゲンのＩｇＥ反応性を示す図。同定されたアレルゲンをニトロセルロース条片にドット配置し、Ｄｅｒ  ｐアレルギー患者からの血清とともにインキュベートした。結合したＩｇＥを125Ｉ−標識抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて検出した。
【図２Ｂ】Ｄｅｒ  ｐアレルギー患者の好塩基球からのヒスタミン放出の誘導を実証するものである。Ｄｅｒ  ｐアレルギー患者の顆粒球を様々な濃度のｎＤｅｒ  ｐ  １、本発明のアレルゲン、およびｒＤｅｒ  ｐ  ５（ｘ軸）とともにインキュベートした。無細胞培養上清中に放出されたヒスタミンの百分率をｙ軸上に示す。
【図３Ａ】本発明によるアレルゲンのアミノ酸配列（配列番号：１）と、同種のチリダニアレルゲンとのアライメントを示した図。本発明によるアレルゲンのアミノ酸配列を、サヤアシニクダニ（Ｌｅｐ−ｄ−５）（配列番号：３）、ネッタイタマニクダニ（Ｂｌｏ−ｔ−５）（配列番号：４）およびＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ（Ｄｅｒ  ｐ  ５）（配列番号：５）からの第５群アレルゲンと比較した。本発明のアレルゲンと同一のアミノ酸は、ハイフンで示し、点は最大一致のために導入されたギャップを示す。
【図３Ｂ】新規なダニアレルゲンとＤｅｒ  ｐ  ５の間の交差反応性の欠如を実証するものである。Ｄｅｒ  ｐアレルギー患者（１〜９）および１人の非アレルギー患者（１０）からの血清をＢＳＡ、ｒＤｅｒ  ｐ  ５および本発明のアレルゲンにそれぞれ予備吸収させた。組み換えＤｅｒ  ｐ  ５、新規なダニアレルゲンおよびＢＳＡをニトロセルロース条片上に点状に配置し、予備吸着させた血清とともにインキュベートし、結合したＩｇＥを125Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体によって検出した。
【図４】異なるＤｅｒ  ｐアレルゲンによって、新たに同定されたアレルゲンに対して高められたウサギ抗血清のＩｇＧ反応性を示す。前免疫血清および抗血清について、ＰＢＳ（対照として）、ｒＤｅｒ  ｐ  ２、ｒＤｅｒ  ｐ  ５および本発明のアレルゲンに対するＩｇＧ反応性を調べた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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