(57)【要約】【課題】  ＤＮＡチップ上でＤＮＡ鎖の伸長反応を行って二本鎖にした後に、アニール処理にてプラスチック基板上で一本鎖ＤＮＡを残すことを可能にする。【解決手段】    ホスホリルコリン基を有する第一単位とアミノ基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板に、ＤＮＡ伸長用のプライマーＤＮＡを固定化させ、所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片を含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げ、前記反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ、前記反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリルコリン基を有する第一単位とアミノ基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板に、ＤＮＡ伸長用のプライマーＤＮＡを固定化させ、所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片を含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げ、前記反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ、前記反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記ＤＮＡ鎖伸長反応は、前記反応系の温度を、前記アニール処理温度から前記熱変性処理温度まで徐々に上昇させて行われることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記ＤＮＡ鎖伸長反応は、前記反応系の温度を、前記アニール処理温度と前記熱変性処理温度との間の所定の温度に変化させて行われることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記プライマーは、所定の着目遺伝子の特徴配列を含む塩基配列の一塩基を他の塩基に置き換えたＤＮＡ断片であることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記プライマーは所定数の塩基配列からなり、各々のプライマーは全組合せのそれぞれの配列を有するＤＮＡ断片であることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記鋳型ＤＮＡ断片は、所定のＲＮＡを逆転写酵素で処理して得られるｃＤＮＡ断片であることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記反応系に導入される試料に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものであることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項８】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記プライマーが、前記基板のアミノ基の部位またはホスホリルコリン基のジメチルアミノ基と水素結合または静電結合して、当該基板の表面に固定化されることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項９】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項１０】
請求項１または９に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項１２】
ホスホリルコリン基を有する第一単位とアミノ基を有する第二単位とを含む高分子物質 
を表面に有する基板に、ＤＮＡ増幅用のプライマーを固定化させ、
所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片を含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げ、
前記反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ、
前記反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行い、
ＤＮＡ鎖の熱変性処理を行って、
および必要に応じてＤＮＡ鎖のアニール処理、伸長反応および熱変性処理を行うことを特徴とするＤＮＡ鎖増幅方法。
【請求項１３】
ホスホリルコリン基を有する第一単位とアミノ基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板と、前記基板の表面に固定化されたＤＮＡ増幅用のプライマーとを含むＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイにおいて、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ。
【請求項１５】
請求項１３に記載のＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイにおいて、
前記プライマーは、５〜５０個の塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ。
【請求項１６】
請求項１３に記載のＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイにおいて、
前記プライマーが、前記基板のアミノ基の部位またはホスホリルコリン基のジメチルアミノ基と水素結合または静電結合して、当該基板の表面に固定化されることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ。
【請求項１７】
請求項１３に記載のＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイにおいて、
前記基板の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ。
【請求項１８】
請求項１３または１７に記載のＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイにおいて、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ。
【請求項１９】
請求項１３に記載のＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイにおいて、
前記基板には一定の区画内に複数のスポットが設けられており、各スポットにプライマーが固定化されていることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライマーＤＮＡ鎖を所定のプラスチック基板表面に固定化してＤＮＡ鎖を伸長するＤＮＡ鎖伸長方法およびＤＮＡ鎖増幅方法、ならびにこれらの方法に用いられるＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイとその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１には、所定のアミノ−シラン試薬を用いて修飾されたガラス基板の表面に、プライマーとなるＤＮＡ鎖を共有結合させたＤＮＡマイクロアレイにて固相ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）によるＤＮＡ増幅を行う技術が開示されている。
【０００３】
また、非特許文献２には、ガラス基板の代わりにポリ（メチルメタクリレート）を用いて、表面にＤＮＡ断片を固定化させたＤＮＡマイクロアレイを用いて、所定のＤＮＡ鎖とのハイブリッド特性およびＰＣＲ様環境下における熱安定性が評価されており、新規のＰＣＲ技術に適用できるデバイスの可能性を示唆する記載がなされている。
【非特許文献１】Adessi, Celine et al, "Solid phase DNA amplification: Characterisation of primer attachment and amplification mechanisms", Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 20, No. 20, e87
【非特許文献２】Fixe, F. et al, "Functionalization of poly(methyl methacrylate) (PMMA) as a substrate for DNA microarrays", Nucleic Acids Research, 2004, January 12, Vol. 32, No.1, e9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者等は、非特許文献１，２などに代表される様々なＤＮＡマイクロアレイを用いてＭＰＥＣ法（Multiple Primer Extension on a Chip）によるＤＮＡ鎖伸長反応を行ったところ、プライマーに鋳型ＤＮＡ鎖を結合させて、すなわちアニール処理してＤＮＡ鎖を伸長させた後に、熱変性処理を行うと鋳型ＤＮＡと共にDNAマイクロアレイ基板に固定したプライマーが脱落するという現象を見出し、表面に所定の高分子物質を配した基板を用いることでこの問題を解決して本発明の完成に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係るＤＮＡ鎖伸長方法は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とアミノ基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板に、ＤＮＡ伸長用のプライマーを固定化させ、
所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片を含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げ、
前記反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ、
前記反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことを特徴としている。
【０００６】
このように、所定の基板にプライマーを固定化させて、このプライマーに鋳型ＤＮＡ断片をアニールさせて、ＤＮＡ鎖伸長反応を行うと、反応後の熱変性処理にて基板上で二本鎖となっているＤＮＡから鋳型ＤＮＡ断片外れて、プライマーから伸長した一本鎖ＤＮＡが基板上で残るようになる。
【０００７】
前記のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記プライマーは、所定の着目遺伝子の特徴配列を含む塩基配列の一塩基を他の塩基に 
置き換えたＤＮＡ断片であってもよい。
【０００８】
これにより、本発明のＤＮＡ鎖伸長方法を、一塩基置換多型（ＳＮＰ：single nucleotide polymorphisms）解析に適用することができるようになる。
【０００９】
また、前記のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記プライマーは所定数の塩基配列からなり、各々のプライマーは全組合せのそれぞれの配列を有するＤＮＡ断片であってもよい。
【００１０】
これにより、本発明のＤＮＡ鎖伸長反応を、ハイブリダイゼーションによる塩基配列決定（ＳＢＨ：sequencing by hybridization）解析に適用することができるようになる。
【００１１】
また、前記のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記鋳型ＤＮＡ断片は、所定のＲＮＡを逆転写酵素で処理して得られるｃＤＮＡ断片であってもよい。
【００１２】
これにより、本発明のＤＮＡ鎖伸長反応を、遺伝子発現プロファイル（gene expression profile）解析に適用して、通常の解析において手間と時間がかかるサンプル調製をほとんど行うことなく、ゲノムＤＮＡ又は全ＲＮＡからの逆転写産物ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡ断片として用い簡便な操作で行うことができるようになる。
【００１３】
また、本発明に係るＤＮＡ鎖増幅方法は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とアミノ基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板に、ＤＮＡ増幅用のプライマーを固定化させ、
所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片を含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げ、
前記反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ、
前記反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行い、
ＤＮＡ鎖の熱変性処理を行って、
および必要に応じてＤＮＡ鎖のアニール処理、伸長反応および熱変性処理を行うことを特徴としている。
【００１４】
このように、所定の基板にプライマーを固定化させて、このプライマーに鋳型ＤＮＡ断片をアニールさせて、ＤＮＡ鎖伸長反応を行うと、反応後の熱変性処理にて基板上で二本鎖となっているＤＮＡから鋳型ＤＮＡ断片外れて、プライマーから伸長した一本鎖ＤＮＡが基板上で残るようになり、鋳型ＤＮＡ断片は次のアニール処理で未反応のプライマーと二本鎖を形成して、次のＤＮＡ鎖伸長を行う。これを繰り返すことにより、ＭＰＥＣ法によるＤＮＡ鎖増幅反応を行うことができるようになる。
【００１５】
また、本発明に係るＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイは、ホスホリルコリン基を有する第一単位とアミノ基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板と、
前記基板の表面に固定化されたＤＮＡ増幅用のプライマーとを含むものである。
【００１６】
このように、所定の基板にプライマーを固定化させて、このプライマーに鋳型ＤＮＡ断片をアニールさせて、ＤＮＡ鎖伸長反応を行うと、反応後の熱変性処理にて基板上で二本鎖となっているＤＮＡから鋳型ＤＮＡ断片外れて、プライマーから伸長した一本鎖ＤＮＡが基板上で残るようになる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ＤＮＡマイクロアレイ上でＤＮＡ鎖の伸長反応を行って二本鎖にした 
後に、熱変性処理にてＤＮＡマイクロアレイの基板上で一本鎖ＤＮＡを残すことができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１９】
（第一の実施形態）
図１は、第一の実施形態としてのＤＮＡ鎖増幅方法の手順を示すフローチャートである。
このＤＮＡ鎖増幅方法は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とアミノ基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板に、ＤＮＡ増幅用のプライマー（以下、「プライマー」という）を固定化させ（ステップＳ１０）、所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片を含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げ（ステップＳ３０）、この反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ（ステップＳ４０）、当該反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行い（ステップＳ５０）、ＤＮＡ鎖の熱変性処理を行って（ステップＳ６０）、必要に応じてＤＮＡ鎖のアニール処理、伸長反応および熱変性処理を行う（ステップＳ４０〜ステップＳ６０の繰り返し）ものである。
【００２０】
ステップＳ１０では、図２に示したように、基板１２の表面にＤＮＡ増幅用のプライマー１４を固定させる。
【００２１】
ここで使用される基板に表面には、ホスホリルコリン基を有する第一単位とアミノ基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。
【００２２】
このホスホリルコリン基を含む第一単位とアミノ基を含む第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるホスホリルコリン基は鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるアミノ基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、前記このコーティング層のアミノ基の部位またはホスホリルコリン基のジメチルアミノ基と水素結合または静電結合して、当該基板の表面に固定化される。
【００２３】
第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
【００２４】
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、基板表面における鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
【００２５】
アミノ基を含む第二単位は、１級アミノ基、２級アミノ基を含む単位であれば特に限定 
しない。
【００２６】
ホスホリルコリン基を有する第一単位とアミノ基を有する第二単位とを含む高分子物質を得る方法としては、ホスホリルコリン基を有する単量体及びアミノ基を有する単量体との共重合による方法が挙げられる。この場合、更にブチルルメタクリレート基を含む単量体と共重合させて、ブチルメタクリレート基を含む第三単位を高分子物質に導入することも可能である。
【００２７】
他の方法として、また、アミノ基と反応する官能基およびホスホリルコリン基を有する高分子物質を基板表面に塗布することにより、アミノ基と反応する官能基およびホスホリルコリン基を基板表面に導入し、次いでアミノ基を有する化合物を反応させることによりアミノ基を導入することもできる。アミノ基と反応する官能基としては、アルデヒド基、活性エステル基、酸無水物などが挙げられるが、活性エステル基であることが好ましい。
【００２８】
活性エステル基としては、例えば、ｐ-ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドイミドエステル基、コハク酸イミドエステル基、フタル酸イミドエステル基、５−ノルボルネン‐２，３−ジカルボキシイミドエステル基などが好ましく挙げられる。中でもｐ-ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドイミドエステル基がより好ましい。
【００２９】
アミノ基を有する化合物としては、一分子中に２個以上のアミノ基を有する多官能性のアミノ基を有する化合物が好ましい。更に好ましくは、骨格の一部が炭化水素鎖およびエチレングリコール鎖で構成されていることである。また、骨格の一部に窒素原子を少なくとも１つ有する化合物であることがより好ましい。窒素原子の存在により表面が正電荷をより帯びやすくなっているため、生理活性物質がより固定化されやすくなる。
【００３０】
骨格の一部が炭化水素鎖またはエチレングリコール鎖で構成されている化合物として、例えば、エチレンジアミン、N、N−ビス（３−アミノプロピル）メチルアミン、１、４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、エチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテル、ジエチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテル、ポリエチレンイミン等が挙げられ、このうち骨格の一部に窒素原子を少なくとも１つ有する物質としては、N、N−ビス（３−アミノプロピル）メチルアミン、１、４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジンが挙げられる。
【００３１】
なお、本実施形態では、ホスホリルコリン基を含む第一単位とアミノ基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。
【００３２】
このような第二の高分子物質は、鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。
【００３３】
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
【００３４】
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基板は、所定の形状に加 
工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【００３５】
また、基板として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００３６】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、ＤＮＡ鎖の検出反応におけるバックグランドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；
環状ポリオレフィン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、基板の材料として好ましく用いられる。
【００３７】
ここで、飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの樹脂は単独で用いてもよく、2種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、環状オレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオレフィンだけでなく、環状オレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽和環状ポリオレフィンを用いることもできる。
【００３８】
以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料からなる基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【００３９】
なお、基板の材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、たとえばフィルム状やシート状であってもよい。具体的には、基板を可とう性のプラスチックフィルムとすることもできる。また、基板は、一つの部材から構成されていてもよいし、複数の部材から構成されていてもよい。
【００４０】
次に、基板の表面へのプライマーの固定化方法について説明する。
例えば、（ｉ）基板上の高分子物質に含まれる複数のアミノ基のうち、少なくとも一部のアミノ基とプライマーとを反応させて水素結合または静電結合を形成させることにより、基板表面でプライマーを固定化し、続いて（ｉｉ）プライマーを固定化した以外の基板表面のアミノ基を不活性化する、すなわち残りのアミノ基を不活性化することにより、プライマーを基板の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００４１】
上記工程（ｉ）において、鋳型ＤＮＡ断片とアニールするプライマーを基板上に固定化する際には、プライマーを溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。高分子物質が有するアミノ基がプライマーであるＤＮＡと水素結合または静電結合により固定化
される。
【００４２】
また、点着後、基板表面に固定化されなかったプライマーを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
【００４３】
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はプライマーを固定化した以外のプラスチック基板表面のアミノ基の不活性化処理をたんぱく質を有する化合物や無水カルボン酸基を有する化合物を用いて行う。
【００４４】
例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ程度のＢＳＡを所定のバッファー溶液などに溶解し、この溶液中に基板を浸漬するなどしてブロッキング処理を行なう。
【００４５】
無水カルボン酸官能基を有する化合物としては、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水コハク酸,無水マレイン酸などの有機酸を用いることが好ましい。
【００４６】
また、基板に固定化するプライマーには、アミノ基との反応性を高めるため、５`末端にリン酸基を導入しておくことが好ましい。リン酸基はアミノ基との反応性に優れるため、リン酸基が導入されたプライマーを用いることにより、効率よくかつ強固に基板の表面上にプライマーを固定化することができる。リン酸基の導入位置はプライマーの分子鎖５'末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖５'末端に導入されていることが、相補的な鋳型ＤＮＡ断片とのアニーリングをより一層効率よく行うことができるという観点からは、好ましい。
【００４７】
以上により、図２に示したような基板１２の表面上にプライマーＤＮＡ１４が固定化されたＤＮＡマイクロアレイ１０が得られる。
【００４８】
図１に戻り、ステップＳ２０では、ステップＳ１０で得られるＤＮＡマイクロアレイ１０の基板１２の表面に固定化されたプライマー１４にアニールさせるＤＮＡ増幅用の鋳型ＤＮＡ断片１６を含むサンプルが導入される。
【００４９】
この導入されたサンプルからなる反応系としては、耐熱性細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどの存在下で、ヌクレオチドモノマー（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰなど）を含有するＭＰＥＣ用バッファが挙げられる。
【００５０】
また、これらヌクレオチドモノマーの少なくとも一種をラベルしておくことができる。例えば、ｄＴＴＰの塩基の３位を蛍光ラベルしたＣｙ３−ｄＵＴＰをヌクレオチドモノマーとして用いることで、鋳型ＤＮＡ断片のアデニン（Ａ）に対応する伸長（プライマー）側の位置にＣｙ３−ｄＵＴＰが挿入される。これにより、伸長反応が生じたプライマーから形成されるＤＮＡ断片がＣｙ３−ｄＵＴＰで蛍光染色されて、このＤＮＡ断片の検出を行うことができるようになる。
【００５１】
なお、他のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよく、また複数の種類のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよい。また、ラベル方法も蛍光体の導入の他に、光吸収体の導入の方法、放射線ラベルの方法（P32-ATP、P32-ｄATP）、酵素標識などの非放射性ラベルの方法などによってもＤＮＡ鎖を検出することができる。
【００５２】
この酵素標識の方法においては、ビオチン（biotin）化またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ：ステロイド系天然物）を結合した核酸（例えば、biotin-dUTP、DIG-dUTP）を使用してプライマーを伸張させた後、蛍光標識化したアルカリフォスファターゼまたはアルカリフォスファターゼ処理しニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）液中で数時間反応させることによってＤＮＡを検出することができる。
【００５３】
ステップＳ３０では、サンプルが導入された反応系の温度を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度（melting temperature：Ｔｍ）以上、例えば９０℃〜９５℃まで上昇させる。この熱変性処理により、自己相補鎖などで見られる折れたたみ構造を有する鋳型ＤＮＡ断片やプライマーが直鎖状の一本鎖になる。
【００５４】
続いて、ステップＳ４０では、反応系の温度をプライマーと鋳型ＤＮＡ断片とがアニールする温度（アニール温度）、例えば４℃〜６５℃、好ましくは５０℃〜６５℃まで下降させる。このアニール処理により、鋳型ＤＮＡ断片の一部と相補的な配列を有するプライマーと、この鋳型ＤＮＡ断片とが二本鎖になる（図３）。
【００５５】
ステップＳ５０では、アニール処理を行った反応系の温度を、前記アニール処理温度から前記熱変性処理温度まで徐々に上昇させるよう制御する。あるいは、当該反応系の温度を、前記アニール処理温度と前記熱変性処理温度との間の所定の温度、例えば６５℃〜７５℃に変化させるように制御する。このように反応系の温度を制御することにより、ＭＰＥＣ法によるＤＮＡ鎖の伸長反応が起こる、すなわち鋳型ＤＮＡ断片１６に相補的なＤＮＡ断片が、基板上に形成され、ＤＮＡの二本鎖が得られるようになる（図４）。
【００５６】
図１に戻り、ステップＳ６０では、伸長反応後の反応系を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度、例えば９０℃〜９５℃で維持する。この熱変性処理により、基板１２の表面では二本鎖ＤＮＡから鋳型ＤＮＡ断片１６（図４）が脱離して、一本鎖ＤＮＡ断片１８が残された状態になる（図５）。
【００５７】
ステップＳ７０では、次の伸長反応を行うか否かが判別される。この判別は、温度調整装置（サーモサイクラー）などを用いて反応回数を指定してその回数に達したか否かを自動で行ってもよいし、毎回操作者の判断によって行ってもよい。
【００５８】
この判別結果がＹＥＳ、すなわち次の伸長反応を行う場合にはステップＳ４０に戻り、アニール処理（ステップＳ４０）−伸長反応（ステップＳ５０）−熱変性処理（ステップＳ６０）が繰り返され、未反応のプライマーでＤＮＡ伸長反応が行われる。このサイクルを１〜５０回繰り返す結果、基板上でＭＰＥＣ法によるＤＮＡ鎖増幅が行われる。
【００５９】
また、ステップＳ７０での判別結果がＮＯ、すなわち次の伸長反応を行わない場合には、ステップＳ８０に進み、反応液を捨てて、ＤＮＡマイクロアレイを、例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄して、終了する。
【００６０】
このＤＮＡ鎖増幅のためには、基板上の一定の区画内に複数のスポットを設けておき、各スポットにプライマーを固定化しておき、マイクロアレイを形成しておくことが好ましい。
【００６１】
また、基板の表面に固定化させるＤＮＡ増幅用プライマーの長さを目的や用途に応じて任意に決定することができ、例えば５〜５０塩基とすることができる。
【００６２】
（第二の実施形態） 
図６は、第二の実施形態としてのＤＮＡ鎖伸長方法の手順を示すフローチャートである。図６において、図１と手順が同様な部分については、図１と同様の符号を付して、説明を省略する。
【００６３】
このＤＮＡ鎖伸長方法は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とアミノ基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板に、ＤＮＡ伸長用のプライマー（以下、「プライマー」という）を固定化させ（ステップＳ１０）、所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片を含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げ（ステップＳ３０）、この反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ（ステップＳ４０）、この反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行う（ステップＳ５０）ものである。
【００６４】
前述したように、ステップＳ２０では、基板の表面に固定化されたプライマーにアニールさせるＤＮＡ伸長用の鋳型ＤＮＡ断片を含むサンプルを導入し、このサンプルおよびこのサンプルが導入されてなる反応系は、前述したのと同様のものを適用することができる。
【００６５】
また、ステップＳ５０での伸長反応の後に、ステップＳ５５にて反応液を捨てて、ＤＮＡマイクロアレイを、例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄して、終了する。
【００６６】
以下に、本実施形態のＤＮＡ鎖伸長方法の適用例について説明する。
【００６７】
（ＳＮＰ解析）
所定の着目遺伝子の特徴配列を含む塩基配列と相補的な配列を完全マッチ配列とするとき、プライマーをこの完全マッチ配列の一塩基を他の塩基に置き換えることで、ＳＮＰ解析を行うことが可能になる。なお、プライマーは２５塩基以内の長さを有するものを用いることが好ましい。
【００６８】
すなわち、ステップＳ１０にて、ある着目遺伝子の特徴配列と一塩基だけミスマッチとなるＤＮＡ断片をプライマーとして基板の表面に固定化する。このとき、例えば３８４穴（各穴２５６スポット）、９６穴（各穴１０２４スポット）のマイクロアレイを用いて、各スポットに固定化されたプライマーの配列を把握しておくようにする。ステップＳ２０にて、この特徴配列を含むＤＮＡ鎖を鋳型ＤＮＡ断片として用いてサンプル導入を行い、ステップＳ３０にて熱変性処理を行って、ステップＳ４０ではアニール処理を行う。ステップＳ５０では、アニール処理により鋳型ＤＮＡ鎖断片と二本鎖を形成したプライマーにだけ伸長反応が起こる。
【００６９】
また、前述したようにステップＳ２０にて導入されるサンプル中にラベルされたヌクレオチドモノマーを含めておくことで、プライマーから伸長反応により得られるＤＮＡ断片がラベルされ、ステップＳ５５で洗浄後の基板に残った蛍光ＤＮＡ断片を含むスポットの検出を行い、各アレイに固定化されたプライマーの配列が把握されていることから、検出されたスポットに固定化されたプライマーの配列を知ることができる。これにより、伸長反応が起こったプライマーの塩基配列がわかり、前記着目遺伝子の特徴配列を含む鋳型ＤＮＡ断片に対する一塩基多型を解析することが可能になる。
【００７０】
（ＳＢＨ解析）
所定数、例えば６〜１０ｍｅｒ、好ましくは８ｍｅｒの塩基配列を有するプライマーを、全組合せ、例えば８ｍｅｒのプライマーを用いた場合には、全組合せである４8＝６５５３６種類のプライマーを用意して、各々のプライマーがマイクロアレイのひとつのスポットに固定化させることにより、塩基配列決定（ＳＢＨ）解析を行うことが可能になる。
【００７１】
すなわち、ステップＳ１０にて前記の各プライマーをマイクロアレイの各スポットにそれぞれ固定化する。このとき、各スポットに固定化されたプライマーの配列を把握しておくようにする。ステップＳ２０にて、未知の塩基配列のＤＮＡ断片を鋳型ＤＮＡ断片として用いてサンプル導入を行い、ステップＳ３０にて熱変性処理を行って、ステップＳ４０ではアニール処理を行う。ステップＳ５０では、アニール処理により鋳型ＤＮＡ鎖断片と二本鎖を形成したプライマーにだけ伸長反応が起こる。
【００７２】
また、前述したようにステップＳ２０にて導入されるサンプル中にラベルされたヌクレオチドモノマーを含めておくことで、プライマーから伸長反応により得られるＤＮＡ断片がラベルされ、ステップＳ５５で洗浄後の基板に残った蛍光ＤＮＡ断片を含むスポットの検出を行い、各アレイに固定化されたプライマーの配列が把握されていることから、検出されたスポットに固定化されたプライマーの配列を知ることができる。これにより、伸長反応が起こったプライマーの塩基配列がわかる。
【００７３】
ここで、図７に示したように、基板４１上で伸長反応が起こったスポットを検出した後、検出されたスポットに固定化されているプライマーのランダム配列群４５の各配列を取り出し、配列の前後で一塩基ずらしてオーバーラップするように順番付けして順番付け配列群４７が得られる。この順番付け配列群４７に示された順番にしたがって、各プライマーの先頭の塩基を読んで行き、最後のプライマーについては全塩基配列を読んで得られる塩基配列に基づいて、未知の塩基配列４３を有する鋳型ＤＮＡ断片の塩基配列４９を決定することができる。
【００７４】
なお、プライマーが６塩基長の場合は４０９６種類のプライマーを用意する必要があり、プライマーが７塩基長の場合は１６３８４種類のプライマーを用意する必要がある。これらのプライマーは、機能未知（ｎｃ）ＲＮＡおよびマイクロ（ｍｉ）ＲＮＡなどの２０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒの比較的小分子の探索、遺伝子配列解析に用いることができる。
【００７５】
また、プライマーが８塩基長の場合は６５５３６種類のプライマーを用意する必要があり、プライマーが９塩基長の場合および１０塩基長の場合は、それぞれ２６２１４４および１０４８５７６種類のプライマーを用意する必要がある。これらのプライマーは、通常の遺伝子配列解析に用いることができる。
【００７６】
（遺伝子発現プロファイル解析）
図８は、遺伝子発現プロファイル用サンプルとして、ラベルを導入したサンプルを調整および発現プロファイル解析するための従来の方法を示す。
【００７７】
目的に応じた生体組織から全ＲＮＡ（totalＲＮＡ）を抽出する。さらに全ＲＮＡからは逆転写反応によって、ｃＤＮＡを合成する（第一鎖合成）。逆転写反応の際にはｄＮＴＰとアミノアリルｄＵＴＰを一定の割合で混合したものを加えて、アミノアリルｄＵＴＰを取り込んだｃＤＮＡを合成する。
【００７８】
なお、組織から得た全RNA量が少ない場合は、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後、2本鎖のｃＤＮＡ（転写鋳型ＤＮＡ断片）を合成し（第二鎖合成）、それを鋳型としてアンチセンス鎖のＲＮＡ（ａＲＮＡ）を増幅する。このＲＮＡ増幅の際にｄＮＴＰとアミノアリルｄＵＴＰとを一定の割合で混合したものを加えることで、アミノアリルｄＵＴＰを取り込んだａＲＮＡを合成することができる。
【００７９】
続いて、上記のｃＤＮＡまたはアンチセンスアミノアリルＲＮＡ（ａＲＮＡ）をエタノール沈殿した後、０．２Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（NaHCO3−Na2CO3（pH9．0））に溶解する。ＤＭＳＯに溶解しておいた蛍光色素（Ｃｙ３またはＣｙ５）を加えて、常法に従 
い、ｃＤＮＡまたはａＲＮＡに取り込ませておいたアミノアリルｄＵＴＰとカップリング反応させ、ｃＤＮＡまたはａＲＮＡを蛍光標識する。遊離の蛍光色素をゲルろ過カラムまたはフィルターなどを用い常法の精製により除去した後、ａＲＮＡについてはさらにフラグメンテーションバッファー（終濃度０．０４Ｍ酢酸トリアミノメタン（ｐＨ８．１）、０．１Ｍ酢酸カリウム、０．０３Ｍ酢酸マグネシウム）を加えて９５℃で１５分間反応後、クラッシュアイスで急冷してａＲＮＡを断片化する。ゲル電気泳動などの方法によりフラグメント化を確認した後、ゲルろ過フィルターで精製・濃縮する。
【００８０】
次に、調製したｃＤＮＡまたはａＲＮＡとマイクロアレイのプライマーとのハイブリダイゼーションを行う。ｃＤＮＡまたはａＲＮＡにハイブリダイゼーションバッファー（最終濃度５×ＳＳＣ、０．５（ｖ／ｖ）％ＳＤＳ、４×Denhardt's solution）及びホルムアミド（Formamide）を適宜混合し、ＤＮＡマイクロアレイと４５℃〜６０℃で一晩ハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ−０．１（ｖ／ｖ）％ＳＤＳ溶液、２×ＳＳＣ溶液、１×ＳＳＣ溶液で５分間ずつ洗浄したのち、蛍光読取装置(例えば、CRBIOR IIe；日立ソフトウエアーエンジニアリング製)を用いて画像をスキャンし、解析ソフト（例えば、DNASISRArray；日立ソフトウエアーエンジニアリング製）を用いてシグナル強度を定量化する。
なお、図８においては、ａＲＮＡの合成を示しているが、途中の工程で得られるｃＤＮＡが解析に十分な量であれば、このｃＤＮＡを直接解析してもよい。
【００８１】
この方法では、複雑な前処理工程を行うため、それぞれの試料で条件選定など設定条件が多くなる上に、全工程で少なくとも５日〜一週間はかかってしまうのが迅速な遺伝子検査の上で問題であった。
【００８２】
そこで、本実施形態では、全ＲＮＡからｃＤＮＡを得る第一鎖合成を行った後に、図１のステップＳ１０と同様の方法にて基板の表面に、解析対象となる遺伝子の特徴配列に相当する塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いて、各々のプライマーをマイクロアレイのひとつのスポットに固定化させ、第一鎖合成により得られるｃＤＮＡ（または必要に応じて増幅させて得られるａＲＮＡ）を鋳型ＤＮＡ断片として用いて、発現遺伝子を特定することが可能になる。
【００８３】
すなわち、既知の遺伝子が有する特徴配列と相補的な塩基配列を有するプローブが、特定の細胞由来の全ＲＮＡから得られる鋳型ＤＮＡ断片中に存在するか否かが分かる。
【００８４】
すなわち、ステップＳ１０にて前記の各プライマーをマイクロアレイの各スポットにそれぞれ固定化する。このとき、各スポットに固定化されたプライマーの配列を把握しておくようにする。ステップＳ２０にて、前述したようにして得られる所定の全ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡ断片として用いてサンプル導入を行い、ステップＳ３０にて熱変性処理を行って、ステップＳ４０ではアニール処理を行う。ステップＳ５０では、アニール処理により鋳型ＤＮＡ鎖断片と二本鎖を形成したプライマーにだけ伸長反応が起こる。
【００８５】
また、前述したようにステップＳ２０にて導入されるサンプル中にラベルされたヌクレオチドモノマーを含めておくことで、プライマーから伸長反応により得られるＤＮＡ断片がラベルされ、ステップＳ５５で洗浄後の基板に残った蛍光ＤＮＡ断片を含むスポットの検出を行い、各アレイに固定化されたプライマーの配列が把握されていることから、検出されたスポットに固定化されたプライマーの配列を知ることができる。これにより、伸長反応が起こったプライマーの塩基配列がわかり、全ＲＮＡがどの遺伝子から発現されて得られたものであるか、すなわち遺伝子発現プロファイルを解析することが可能になる。
【００８６】
この方法によれば、遺伝子発現プロファイル（gene expression profile）解析を、通常の解析において手間と時間がかかるサンプル調製をほとんど行うことなく、ゲノムＤＮＡ又は全ＲＮＡからの逆転写産物ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡ断片として用い簡便な操作で行うことができるようになる。
【００８７】
以上の用途のほかには、
マイクロサテライト解析、染色体異常解析（ＣＧＨ：Comparative Genomic Hybridization）、機能未知（ｎｃ）ＲＮＡ探索などの遺伝子解析用基本ツールへの適用；
これらツールを使用した臓器・疾患別遺伝子発現解析チップ、変異原性試験キット（環境ホルモン）、遺伝子組換え食品検査キット、ミトコンドリア遺伝子配列解析キット、親子鑑定・犯罪捜査のための解析キット、先天性疾患解析キット、染色体・遺伝子異常解析キット、遺伝子診断（着床前・出生前）キット、薬物反応関連遺伝子多型解析キット、脂質代謝関連遺伝子多型解析キット、耳鼻科・眼科領域遺伝子多型解析キットなどの用途別カスタムチップへの適用；
ガン予後予測チップ、医薬品開発（臨床・創薬）用チップ、健康食品開発用チップなどの診断・臨床用カスタムチップへの適用；
微生物限度試験や食品飲料水中の微生物検査などの薬品・食品製造工程、およびう蝕・歯周病関連菌の検出、日和見感染菌の検出などの歯科領域の臨床検査、および食品工場・厨房施設環境検査、飲料・公衆浴場、井戸水などの水質検査における環境検査、および感染症・食中毒の予防、会社従業員の衛生管理などの保健衛生、および耐性菌を含む一般細菌同定、肝炎ウイルス、ヘリコバクターピロリ、肝炎クラミジア菌、エイズウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ウエストナイルウイルス、ノロウイルス（生カキ由来の食中毒）、インフルエンザウイルス、真菌・カビなどの臨床検査などの微生物同定検査キットへの適用
などが挙げられる。
【実施例１】
【００８８】
（実験例１）
以下の手法にて、プライマーを、第一単位としてホスホリルコリン基を第二単位としてアミノ基を含有した高分子物質を表面に有するプラスチック基板、ｐｏｌｙ−Ｌ−ＬｙｓｉｎeによるコーティングされたｃＤＮＡ固定マイクロアレイ用基板 (Ｍａｔｓｕｎａｍｉ製)の各基板の表面に固定化して、各基板上でＤＮＡ鎖伸長反応を行って、プライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を検出した。
【００８９】
（プラスチック基板の製造）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状に加工して固相基板を作成した。固相基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。次いで、前記基板をN、N−ビス（３−アミノプロピル）メチルアミンの２体積％水溶液に3時間浸漬し、純水で洗浄後、８０℃、２時間真空乾燥することにより、基板表面にホスホリルコリン基およびアミノ基を有する高分子物質が導入されたプラスチック基板を作成した。
【００９０】
（プライマー固定）
５’末端がアミノ基及びリン酸基で修飾されたオリゴＤＮＡと無修飾の3種類のオリゴＤＮＡ（20および30塩基鎖）をｃＤＮＡ用スポッティングバッファー(pH8)を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。この溶液０．５μｌをマイクロピペッター（エッペンドルフ社製）を用い、前記プラスチック基板ならびにｐｏｌｙ−Ｌ−ＬｙｓｉｎeによるコーティングされたｃＤＮＡ用基板 (Ｍａｔｓｕｎａｍｉ製)の表面上に、それぞれスポットした。オリゴＤＮＡをスポットした各基板を、８０℃のオーブン内でベーキ 
ングし、オリゴＤＮＡ（プライマー）を固定化した。
【００９１】
（ＤＮＡ鎖伸長反応）
図６のステップＳ２０で導入する鋳型ＤＮＡ断片として、所定の５０ｍｅｒの、予め５’末端をＣｙ５にて標識したＤＮＡ断片を用いて、鋳型ＤＮＡ断片の濃度が１００ｐＭとなるような反応系とした。
【００９２】
続いて、図６のステップＳ３０の熱変性処理、ステップＳ４０のアニール処理、ステップＳ５０の伸長反応をそれぞれ９５℃５分（変性）−９５℃１分（変性）−５０℃３分（アニール）−９５℃１分（変性）とした。
【００９３】
以下、サンプル中にbiotin−ｄＵＴＰを含めておいて各基板において行った。ＤＮＡ鎖伸長反応検出はＣｙ３で蛍光標識化しアビジンを用い、ビオチンとの特異的結合をおこさせ、スポットのＣｙ３の蛍光強度を測定した。結果を表１に示す。
【００９４】
【表１】
2006246774.tif 000002
【００９５】
プラスチック基板では、基板上でのＤＮＡ鎖伸長が検出された一方で、この高分子物質による表面処理がなされていないｃＤＮＡ用基板ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎe(Ｍａｔｓｕｎａｍｉ製)基板ではＤＮＡ鎖伸長は検出されていない。
【００９６】
（実験例２）
実験例１でＤＮＡ鎖伸長が検出されたプラスチック基板を用いて、２０ｍｅｒ、２５ｍｅｒ、３０ｍｅｒの各プローブについてＭＰＥＣ法によるＤＮＡ鎖伸長を１サイクル、５サイクル、１０サイクル、２０サイクルで行って、ＤＮＡ鎖増幅反応を行って、各区切りのサイクル終了後に蛍光強度を測定する。
【００９７】
なお、図１のステップＳ３０の熱変性処理、ステップＳ４０のアニール処理、ステップＳ５０の伸長反応、ステップＳ６０の熱変性処理をそれぞれ９５℃５分（変性；初回のみ）−９５℃１分（変性）−５０℃３分（アニール）−９５℃１分（変性）とする。
【００９８】
（実験例３）
図９に示したように、5'-Cy5-AAGGCGGGAGGGAGCGCAATCCGGGAGTTTACAAATGGACAAACTTCTAT-3'の５’位から２１番目の塩基Ｃを変異部位としたＳＮＰタイピングを行う目的で、計５種類のプローブ（２１ｍｅｒ）を設計し、プラスチック基板上に固定化した。このマイクロアレイを用いて、ＭＰＥＣ（multiple primer extension on a chip）反応によるＳＮＰタイピング（伸張反応）を行う。
【００９９】
このＳＮＰタイピングは、ＤＮＡポリメラーゼ（０．０５Ｕ／ｍｌ）、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（０．０５ｍＭ）、５０μｌのＰＣＲバッファ中にｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ（各０．２ｍＭ）の存在下で、９５℃（１分）−５０℃（３分）の温度サイクルで行う。
この伸長反応の結果、上記の５０ｍｅｒのＤＮＡ断片をターゲットとして、このターゲットと相補的な配列を有する完全マッチ配列プローブのみが伸長し、その結果蛍光発色する。
【０１００】
（実験例４）
実験例１のＭＰＥＣ反応をｐ５３ガン抑制遺伝子の検出に応用する。
このｐ５３遺伝子の異常は大腸がんや肺がんで高頻度に求められており、ｐ５３遺伝子に異常（一塩基多型：ＳＮＰ）があると、抗がん剤が効きにくくなり、ガン細胞の細胞死（アポトーシス）を起こせずガン細胞が増殖することになる。
【０１０１】
そこで、正常なｐ５３遺伝子およびがん細胞のｐ５３遺伝子を用いたＳＮＰタイピング（伸張反応）を行う。ｐ５３遺伝子の９９３番目と１０６９番目に変異があることは公知であり、この位置の塩基を３’末端とし、Ｔｍ値をほぼ一定となるようなプローブ設計を行い、プラスチック基板上に固定した。設計した計１６種のプローブ5'-ATGGGCGGCATGAACN-3', 5'-TGAGGATGGGCCTCCN-3', 5'-GGAACAGCTTTGAGGTGCN-3', 5'-CCAGGACAGGCACAAACAN-3' (N=A,G,C,T)を用い、ＭＰＥＣ反応によるＳＮＰタイピングを行う。
【０１０２】
（実験例５）
ＳＢＨ法による塩基配列決定解析のシュミレーション実験を行う。
図１０に示したように、３’末端がＣｙ５でラベルされた５０塩基長のターゲットの塩基配列が決定できるように、一塩基ずつ３’末端方向にずらした８塩基（８ｍｅｒ）のプローブ（計５０）をプラスチック基板上に固定したマイクロアレイを用いて、ＭＰＥＣ反応によるＳＢＨを行う。各プローブの３’末端の一塩基にミスマッチを設定した８塩基（８ｍｅｒ）の５０種類のプローブも加え基板上に固定した。このＳＢＨシュミレーション用アレイを用いた塩基配列決定を行う。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】本発明の第一の実施形態に係るＤＮＡ鎖増幅方法を示すフローチャートである。
【図２】前記第一の実施形態で用いるＤＮＡマイクロアレイの一部を模式的に示す図である。
【図３】前記ＤＮＡマイクロアレイのプライマーに鋳型ＤＮＡをアニールさせた状態を示す図である。
【図４】前記プライマー上でＤＮＡ鎖の伸長反応を行った状態を示す図である。
【図５】前記伸長反応後得られた二本鎖を変性した状態を示す図である。
【図６】本発明の第二の実施形態に係るＤＮＡ鎖伸長方法を示すフローチャートである。
【図７】前記第二の実施形態の一適用例を示す図である。
【図８】従来の遺伝子発現プロファイル用サンプルを調製する例を示す図である。
【図９】前記第二の実施形態のその他の一適用例を示す図である。
【図１０】前記第二の実施形態のその他の一適用例を示す図である。
【符号の説明】
【０１０４】
１０  ＤＮＡマイクロアレイ
１２  基板
１４  プライマー
１６  鋳型ＤＮＡ断片
１８  一本鎖ＤＮＡ断片
【図１】
2006246774.tif 000003
【図２】
2006246774.tif 000004
【図３】
2006246774.tif 000005
【図４】
2006246774.tif 000006
【図５】
2006246774.tif 000007
【図６】
2006246774.tif 000008
【図７】
2006246774.tif 000009
【図８】
2006246774.tif 000010
【図９】
2006246774.tif 000011
【図１０】
2006246774.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月10日(2006.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
（実験例３）
図９に示したように、5'-Cy5-AAGGCGGGAGGGAGCGCAATCCGGGAGTTTACAAATGGACAAACTTCTAT-3'（配列番号１）の５’位から２１番目の塩基Ｃを変異部位としたＳＮＰタイピングを行う目的で、計５種類のプローブ（２１ｍｅｒ）を設計し、ガラス基板上に固定化した。このマイクロアレイを用いて、ＭＰＥＣ（multiple primer extension on a chip）反応によるＳＮＰタイピング（伸張反応）を行う。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
そこで、正常なｐ５３遺伝子およびがん細胞のｐ５３遺伝子を用いたＳＮＰタイピング（伸張反応）を行う。ｐ５３遺伝子の９９３番目と１０６９番目に変異があることは公知であり、この位置の塩基を３’末端とし、Ｔｍ値をほぼ一定となるようなプローブ設計を行い、基板上に固定した。設計した計１６種のプローブ5’-ATGGGCGGCATGAACN-3’（配列番号２）, 5’-TGAGGATGGGCCTCCN-3’（配列番号３）, 5’-GGAACAGCTTTGAGGTGCN-3’（配列番号４）, 5’-CCAGGACAGGCACAAACAN-3’（配列番号５） (N=A,G,C,T)を用い、ＭＰＥＣ反応によるＳＮＰタイピングを行う。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006246774000001.app