(57)【要約】      （修正有）【課題】  核酸の増幅や核酸の標識などの煩雑な操作を必要としない、簡便な遺伝子検出方法を提供する。【解決手段】  標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る、異なる２つのポリヌクレオチドをサンプルに添加した後、光を照射する。ここで、第１のポリヌクレオチドは、光増感還元剤が連結されており、第２のポリヌクレオチドは、電子受容体−機能性分子複合体が切断可能に連結されており、該複合体は、該光照射に基づいて該光増感還元剤により放出された電子を受容して該機能性分子を遊離させ、その結果、該機能性分子の機能が発現される。【選択図】図１
2006246854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る、異なる２つのポリヌクレオチドを該サンプルに添加する工程、および
該サンプルに光照射する工程
を包含し、
ここで、
第１のポリヌクレオチドは、光増感還元剤が連結されており、
第２のポリヌクレオチドは、電子受容体−機能性分子複合体が切断可能に連結されており、
該複合体は、該光照射に基づいて該光増感還元剤により放出された電子を受容して該機能性分子を遊離させ、その結果、該機能性分子の機能が発現される、
方法。
【請求項２】
上記第１のポリヌクレオチドが上記標的ポリヌクレオチドの有する塩基配列に対する相補配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記第２のポリヌクレオチドが上記標的ポリヌクレオチドの有する塩基配列に対する相補配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記機能性分子が、蛍光性分子、磁性分子または化学発光性分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出するキットであって、
該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る、異なる２つのポリヌクレオチドを備え、
ここで、
第１のポリヌクレオチドは、光増感還元剤が連結されており、
第２のポリヌクレオチドは、電子受容体−機能性分子複合体が切断可能に連結されている、
キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光増感還元反応を利用した遺伝子検出方法および遺伝子検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ある特定の核酸や遺伝子の存在の有無を調べたい場合、標的の核酸や遺伝子を増幅し、その増幅産物を検出する方法が用いられる。標的の核酸や遺伝子を特異的に増幅させる方法としては、ＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法（例えば、非特許文献１、２参照）がよく使われている。これらの方法は、目的とする核酸の塩基配列を含む短い核酸をプライマーとして用いて、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによる鋳型特異的な核酸合成反応をin vitroで行う方法である。さらに、上記核酸増幅方法において、増幅反応中または増幅反応後に、増幅された核酸断片を適当な手段を用いて標識することにより、試料中にわずかしか存在しない核酸を検出することが可能となる。また、近年、遺伝子を網羅的に検出可能なＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）は、非常に注目を集めている。
【０００３】
また、ある特定の核酸や遺伝子を調べたい場合、上記核酸増幅方法以外の方法として、組織や細胞中の標的となる核酸を、それと相補的な塩基配列を含む標識した核酸をプローブとしてハイブリダイゼーション（分子雑種交雑）させるＩＳＨ法（in situ ハイブリダイゼーション法）やＦＩＳＨ法（fluorescence in situ ハイブリダイゼーション法）がある（例えば、非特許文献１参照）。ＩＳＨ法は組織内の特定の遺伝子の発現の有無や量の比較に広く用いられている。ＦＩＳＨ法は染色体上の特定の遺伝子領域の判別に広く用いられている。
【非特許文献１】J. Sambrook et al. 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition」 Cold Spring Harbor Laboratory（2001）
【非特許文献２】監修：真木寿治、「PCR Tips〜使いこなすためのコツとヒント〜」秀潤社（1999）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の遺伝子検出方法は、核酸の増幅や核酸の標識といった煩雑な操作が必要である。
【０００５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、核酸の増幅や核酸の標識などの煩雑な操作を必要としない、簡便な遺伝子検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る方法は、生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る、異なる２つのポリヌクレオチドを該サンプルに添加する工程、および該サンプルに光照射する工程を包含することを特徴としている。ここで、第１のポリヌクレオチドは、光増感還元剤が連結されており、第２のポリヌクレオチドは、電子受容体−機能性分子複合体が切断可能に連結されており、該複合体は、該光照射に基づいて該光増感還元剤により放出された電子を受容して該機能性分子を遊離させ、その結果、該機能性分子の機能が発現される。
【０００７】
本発明に係る方法において、上記第１のポリヌクレオチドは上記標的ポリヌクレオチドの有する塩基配列に対する相補配列を含むことが好ましい。
【０００８】
本発明に係る方法において、上記第２のポリヌクレオチドは上記標的ポリヌクレオチドの有する塩基配列に対する相補配列を含むことが好ましい。
【０００９】
本発明に係る方法において、上記機能性分子は蛍光性分子、磁性分子または化学発光性分子であることが好ましい。
【００１０】
本発明に係るキットは、生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出するキットであって、該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る、異なる２つのポリヌクレオチドを備えることを特徴としている。ここで、第１のポリヌクレオチドは、光増感還元剤が連結されており、第２のポリヌクレオチドは、電子受容体−機能性分子複合体が切断可能に連結されている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る方法は、２種類のポリヌクレオチドをサンプルに添加した後、光照射するにより標的遺伝子を検出できるものである。それゆえ、煩雑な操作を必要とせず、簡便に遺伝子を検出できるという効果を奏する。また、核酸の二本鎖形成が平衡反応である性質を利用して光増感還元反応が繰り返される結果、標的遺伝子量よりも多くの機能性分子が遊離するので、サンプル中の標的遺伝子が少量であっても増幅検出が可能であるという効果を奏する。さらに、機能性分子を適宜選択することにより、様々な検出手段を適用できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１３】
１．遺伝子検出方法
本発明は、光増感還元反応を利用した遺伝子検出方法を提供する。本発明に係る方法は、生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る、異なる２つのポリヌクレオチドをサンプルに添加する工程、および該サンプルに光照射する工程を包含するものであればよい。
【００１４】
ここで、上記異なる２つのポリヌクレオチドのうち、第１のポリヌクレオチドは、光増感還元剤が連結されており、第２のポリヌクレオチドは、電子受容体−機能性分子複合体が切断可能に連結されている。また、該電子受容体−機能性分子複合体は、光照射に基づいて光増感還元剤により放出された電子を受容して機能性分子を遊離させ、その結果、該機能性分子の機能が発現される。
【００１５】
光増感還元剤は、特定の波長の光を照射されることにより電子を放出する物質を意味する。電子受容体は、電子を受け取り還元される物質である。したがって、該光増感還元剤と該電子受容体とが空間的に接近している場合には、光増感還元剤から放出された電子は、効率良く電子受容体に受け渡される。さらに、電子受容体には、還元されることにより機能性分子を切り離すことができ、かつ、機能性分子の機能を抑制できる物質が用いられる。したがって、機能性分子は該電子受容体−機能性分子複合体から遊離することで、本来の機能を発現することができる。
【００１６】
異なる２つのポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得るものであって、標的ポリヌクレオチドの２つの異なる領域にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであればよい。したがって、異なる２つのポリヌクレオチドとはそれぞれ異なる塩基配列からなる２つのポリヌクレオチドであるといえる。第１のポリヌクレオチドの塩基配列および第２のポリヌクレオチドの塩基配列は、標的ポリヌクレオチドの異なる領域にそれぞれがハイブリダイズし得るように異なっていればよい。また、ハイブリダイズし得る限りにおいて、標的ポリヌクレオチドの標的領域の塩基配列に対する相補配列と１００％の同一性を有するものでなくてもよい。１００％の同一性がなくてもハイブリダイズ可能であることを当業者は容易に理解する。ただし、標的ポリヌクレオチドの検出精度の高さを保証するために、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドとも標的ポリヌクレオチドの標的領域の塩基配列に対する相補配列と１００％同一の塩基配列を有することが最も好ましい。
【００１７】
また、標的ポリヌクレオチドの２つの異なる領域は、近接していることが好ましい。第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとが標的ポリヌクレオチドの近接している領域にハイブリダイズすることで、光増感還元剤と電子受容体とが空間的に接近できるからである。２つの異なる領域の間隔は、０ｂｐ〜５ｂｐであることが好ましく、０ｂｐ〜２ｂｐであることがより好ましく、最も好ましくは０ｂｐ、すなわち隣接している場合である。
【００１８】
標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）のいずれでもよい。また、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドも、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれでもよい。ただし、第１および第２のポリヌクレオチドは、安定性および合成の簡便さからＤＮＡが好適である。第１および第２のポリヌクレオチドの長さは、一旦形成された二本鎖が一本鎖に戻りやすいという点で、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能である限りにおいて短いことが好ましい。具体的には、５ｂｐ〜１００ｂｐが好ましく、５ｂｐ〜５０ｂｐがより好ましく、５ｂｐ〜２０ｂｐが特に好ましい。
【００１９】
ここで、本発明に係る方法の原理について図１を用いて説明する。サンプル中に標的ポリヌクレオチド（図中、標的ＤＮＡ）が存在すると、光増感還元剤が連結された第１のポリヌクレオチド（図中、ＤＮＡ１）および電子受容体−機能性分子複合体が連結された第２のポリヌクレオチド（図中、ＤＮＡ２）が標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。これによって、光増感還元剤と電子受容体とが空間的に近接することができる。この状態で光が照射（図中、ｈν）されると光増感還元剤から電子（図中、ｅ−）が放出され、この電子は近接している電子受容体に効率良く受け渡される。電子を受け取った電子受容体は、機能性分子を切り離す。遊離した機能性分子には電子受容体が有している機能抑制作用が及ばなくなるため、機能性分子が本来有している機能が発現される。例えば、機能性分子が蛍光性分子である場合には、電子受容体と複合体を形成しているときには蛍光発光が抑制されているが、電子受容体から遊離すれば蛍光を発する。したがって、蛍光発光量を測定することにより、標的ポリヌクレオチドを検出することが可能となる。
【００２０】
さらに、ポリヌクレオチドの二本鎖形成は平衡反応であるため、一旦形成された二本鎖が一本鎖に戻り、再度第１のポリヌクレオチドと機能性分子が遊離していない第２のポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、機能性分子が遊離する。光照射中はこれが繰り返され、機能性分子の遊離量が増幅される。したがって、サンプル中の標的ポリヌクレオチドが少量であっても高感度で検出することができる。現に、本発明者らは１μＭの標的ポリヌクレオチドに対して第２のポリヌクレオチドを１０μＭ添加することで、機能性分子としての蛍光性分子が６μＭ以上検出できることを実証している（実施例参照）。
【００２１】
一方、サンプル中に標的ポリヌクレオチドが存在しない場合は、第１および第２のポリヌクレオチドがサンプル中で偶然に接近した場合にのみ機能性分子が遊離し得るが、その頻度は小さく蛍光発光量は非常に少ない。
【００２２】
本発明に係る方法により検出される標的ポリヌクレオチドは、生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドである。ここで、生物学的サンプルは、生物由来の成分が含まれるサンプルが意図される。核酸（ポリヌクレオチド）を有するすべての生物（例えば、動物、植物、微生物、ウイルス等）は、本発明に係る方法の対象となり得る。また、サンプルとしては、生物由来成分から抽出されたポリヌクレオチドが含まれる溶液が好適であるが、これに限定されるものではなく、ポリヌクレオチドを抽出していない細胞、生検組織、外科的に採取された検体、生物体そのもの（動物個体、植物個体等）をサンプルとしてもよい。
【００２３】
例えば、生物由来の成分からポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を抽出する場合は、当業者に周知のＤＮＡ抽出法またはＲＮＡ抽出法を用いてポリヌクレオチドを抽出することができる。また、細胞、生検組織または外科的に採取された検体等を用いる場合には、塗抹標本、パラフィン切片、凍結切片等を公知の方法に従って作製することができる。
【００２４】
本発明に係る方法において、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る、異なる２つのポリヌクレオチドをサンプルに添加する工程では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドをサンプルに添加すればよい。例えば、本発明に係る方法をin vitro 系に適用する場合には、標的ポリヌクレオチドを含む溶液に第１および第２のポリヌクレオチド溶液を添加すればよい。また、塗抹標本、パラフィン切片、凍結切片等をサンプルとする場合（in situ 系）塗抹面や切片上に第１および第２のポリヌクレオチド溶液をマウントすればよい。また、必要に応じて標的ポリヌクレオチドの存在部位に第１および第２のポリヌクレオチドが到達しやすくするための処理を施す工程を設けてもよい。また、生物体そのものに適用する場合には、例えば注射等の手段を用いて投与することができる。
【００２５】
本発明に係る方法において、サンプルに光照射する工程では、例えば、トランスイルミネーター、レーザー発生装置、回折照射分光器などを用いて行うことができる。照射する光は、用いられている光増感還元剤のみを励起させる波長の光が含まれるものであればよい。光照射は、サンプルに対して直接行えばよい。また、生物体そのものに光照射する場合には、標的ポリヌクレオチドが存在する部位を予測して、当該部位にレーザーを照射することが好ましい。
【００２６】
光照射により遊離した機能性分子の検出手法は、機能性分子を適宜選択することにより、それに応じて公知の手段から選択すればよい。
【００２７】
本明細書において、機能性分子とは、光受容体と複合体を形成しているときにはその機能が抑制され、該複合体から遊離することで機能を回復が可能な分子を意味する。有する機能は特に限定されないが、公知の手段を用いて簡便に検出または測定できるものが好ましい。具体的には例えば、蛍光性分子、磁性分子、化学発光性分子などを挙げることができる。蛍光性分子とは、励起光を照射されると蛍光を発光するという機能を有する分子であり、例えば、クマリン、フルオレセイン、アクリジン、メチルオレンジ、メチレンブルー、インジゴゾールＯなどを挙げることができる。また、磁性分子とは、固有のスピン磁気モーメントをもつ元素から成る錯体または分子であり、例えば、ガドリニウムイオン錯体、２、２-テトラメチルピぺリジン-１-オキシル(TEMPO)などのニトロキシラジカル化合物などを挙げることができる。また、化学発光性分子とは、化学反応によって電子励起状態に変化し、光を放出するという機能を有する分子であり、例えば、ルシフェリンなどを挙げることができる。
【００２８】
機能性分子に蛍光性分子を選択した場合には、遊離した蛍光性分子が発する蛍光を検出または測定することで標的ポリヌクレオチドを検出することができる。蛍光の測定には、例えば蛍光分光光度計、ＨＰＬＣ、蛍光顕微鏡などを用いることができる。
【００２９】
機能性分子に磁性分子を選択した場合には、遊離した磁性分子の磁気を検出または測定することで標的ポリヌクレオチドを検出することができる。磁気の測定には、例えば核磁気共鳴（ＮＭＲ）や磁気共鳴画像（ＭＲＩ）などを用いることができる。
【００３０】
機能性分子に化学発光性分子を選択した場合には、遊離した化学発光性分子の発する光を検出または測定することで標的ポリヌクレオチドを検出することができる。化学発光の測定には、例えばルミノメーター、蛍光分光光度計、ＨＰＬＣ、蛍光顕微鏡などを用いることができる。
【００３１】
また、機能性分子として、治療剤成分または診断剤成分を選択してもよい。これらの成分を機能性分子とした場合、本発明に係る方法を動物個体に適用すれば、標的ポリヌクレオチドを有する細胞で治療剤成分または診断剤成分が遊離され、標的治療や病変部の診断に利用することが可能となる。この場合、標的ポリヌクレオチドは、正常細胞には存在せず、病変細胞のみに存在するポリヌクレオチドとすることが好ましい。例えばウイルス感染細胞中のウイルス遺伝子、癌細胞中の癌特異的発現遺伝子などを挙げることができる。
【００３２】
本発明に係る方法に用いられる光増感還元剤は、特定の波長の光を照射されることにより電子を放出する物質であれば特に限定されない。具体的には、例えば、フラビン、置換ナフタレン、置換アニリンなどの各種芳香族化合物を挙げることができる。
【００３３】
本発明に係る方法に用いられる電子受容体は、上記光増感還元剤から放出される電子を受け取って還元されることにより、複合体を形成している上記機能性分子を切り離すことができ、かつ、機能性分子と複合体を形成しているときには該機能性分子の機能を抑制できる物質であればよい。具体的には、例えば、インドールキノン、アントラキノンなどを挙げることができる。
【００３４】
ここで、電子受容体の一例としてインドールキノンについて説明すれば、光増感還元剤より電子を受け取ると、２電子還元反応を経て機能性分子を遊離する反応性を示す。遊離される機能性分子としては、インドールキノンとの電子的な相互作用により消光されるクマリンなどの蛍光性分子、インドールキノンと共有結合していることに起因する構造的な自由度の低さにより磁性発現が抑制されるラジカル化合物、化学発光が抑制されるルシフェリンなどの化学発光性分子などが挙げられる。
【００３５】
２．遺伝子検出キット
本発明は、上述した第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを備える遺伝子検出キットを提供する。本キットを用いることにより、上記本発明の方法を簡便かつ迅速に実施することができる。
【００３６】
上記、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、実際に標的遺伝子（標的ポリヌクレオチド）を検出するときの反応時に同一の溶液中に存在すればよく、反応前はその形態に特に限定はない。したがって、キットにはそれぞれ個別の容器に、または同一の容器に、溶液状態、乾燥状態またはその他の状態で備えられていればよい。
【００３７】
キットの構成としては、少なくとも上記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが含まれていればよく、これら以外の構成は限定されない。例えば、生物学的サンプルからポリヌクレオチドを抽出する試薬、反応用緩衝液、反応に用いられるチューブやプレートなどを挙げることができる。
【００３８】
本発明に係るキットの使用については、上述の遺伝子検出方法の実施形態に準じればよく、ここでの説明は省略する。
【００３９】
なお本発明は上述した各実施形態および以下の実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４１】
〔機器・試薬等〕
融点は、YANAGIMOTO MICROMELTING POINT APPARATUS を用いて測定した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、JMN-GSX-270 (JEOL、270 MHz)またはJMN-AL-300 (JEOL、300 MHz)を用いて、室温で測定した。化学シフトは、内部標準として残渣のクロロホルム（δ= 7.24 in 1H-NMR、δ= 77.0 in 13C-NMR）およびジメチルスルフォキシド（δ= 2.49 in 1H-NMR、δ= 39.5 in 13C-NMR）を用い、テトラメチルシランからのdownfieldをppmで表した。ＦＡＢ質量スペクトルは、JMS-SX102A (JEOL) 質量分析計で記録した。オリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight）質量スペクトルは、2',3',4'-trihydroxyacetophenone をマトリクスとし、JEOL JMS-ELITE MALDI-TOF MASS spectrometer を用いて得た。
【００４２】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーにはWakogel C-300を用いた。反応のモニタリングには、Precoated TLC plates Merck silica gel 60 F254を用いた。オリゴヌクレオチドはInvitrogenから購入した。ＤＮＡ合成用試薬（例えば、A, T, G, C および Abasic Phosphoramidite）はGlen Researchから購入した。ウシ腸由来アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ヌクレアーゼＰ１（Ｐ１）およびホスホジエステラーゼＩは、それぞれPROMEGA、YAMASAおよびICNから購入した。
【００４３】
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、Shimadzu 6A HPLC system、HITACHI D-7000 HPLC systemおよびNANOSPACE SI-1 (Shiseido, Tokyo) HPLC systemを用いて行った。試料溶液は、逆相カラム（Inertsil ODS-3, GL Sciences Inc., φ4.6 mm×150 mm またはφ10 mm×150 mm、UG120 C18 semicolumnφ1.5 mm×250 mm）に注入した。移動相には0.1 M triethylamine acetate (TEAA), pH 7.0 および 100% アセトニトリルの混合溶媒を、２５℃、流速0.6 mL/minまたは3.0 mL/min で用いた。溶出は、245 nmまたは260 nmの紫外線吸収で検出した。
【００４４】
λex=３６５ nmの光照射には、Lourmat TFX-20M トランスイルミネーターを用いた。全ての溶液の調製には、純水(YAMATO, WR600A)を用いた。
【００４５】
化合物１および化合物３は、文献(1: Ikeda, H.; Yoshida, K.; Ozeki, M.; Saito, I. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 2529-2531.; 3: Patrick, J. B.; Saunders, E. K. Tetrahedron Lett. 1979, 42, 4009-4012)に記載の方法で合成した。
【００４６】
〔2,5-Dioxo-pyrrolidine-1-yl(7,8,10-trimethyl-2,4-dioxo-4,10-dihydro-2H-benzo[g]pteridin-3-yl)acetate （化合物２）の合成〕
2-(5,7,8-Trimethyl-1,3-dioxo-2,5-dihydro-2,4-diazaphenazin-2-yl)acetic acid（化合物１）(24.1 mg, 0.0767 mmol) および N-hydroxysuccinimide (14.0 mg, 0.122 mmol) を乾燥DMF (1.0 mL) に０℃で溶解した。一旦、クリアな溶液を得た後、N,N’-dicyclohexylcarbodiimide (24.8 mg, 0.120 mmol) の乾燥DMF (1.0 mL)溶液を滴下し、室温で１５時間攪拌した。水を加えて反応を止め、dicyclohexylurea 体を濾去し、濾液を EtOAc (30 mL × 5)で抽出した。有機層を brine で洗浄し、無水MgSO4で乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(silica gel, acetone:chloroform = 1:2)で精製し、目的の化合物２を黄色固体として得た（収量：14.7 mg, 収率：46%）。
【００４７】
融点は、253〜254 ℃であった。１Ｈ−ＮＭＲ (300 MHz, CDCl3)は、δ8.05 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 5.20 (s, 2H), 4.12 (s, 3H), 2.81 (s, 4H), 2.55 (s, 3H), 2.44 (s, 3H) であった。１３Ｃ−ＮＭＲ (75 MHz, DMSO-d6)は、δ179.9, 168.5, 168.3, 162.3, 160.0, 154.3, 154.2, 133.0, 132.9, 130.8, 115.7, 115.2, 40.2, 38.9, 25.7, 21.6, 19.3であった。ＦＡＢ−ＭＳは、m/z 412 [(M+H)+]であった。ＦＡＢ−ＨＲＭＳは、C19H18N5O6[(M+H)+]412.1257と計算され、実測値は412.1257であった。
【００４８】
〔5-[2-(tert-Butyldimethylsilanyloxy)ethoxy]-1,2-dimethyl-1H-indole-3-carboxylic acid methyl ester（化合物４）の合成〕
5-hydroxy-1,2-dimethyl-1H-indole-3-carboxylic acid methyl ester（化合物３）(16.3 g, 74.3 mmol) を DMF (140 mL) に溶解し、氷水（０℃）にて冷却して60%水酸化ナトリウム (3.6 g, 89.2 mmol) を加え、引き続き室温で４０分間攪拌した。この溶液に、DMF (10 mL) に溶解した(2-bromoethyl)-tert-butyldimethylsilane (26.7 g, 111.5 mmol)を加え、引き続き室温で３時間攪拌した。水(100 mL)を加え、その後に飽和NaHCO3 水溶液(100 mL)を加えて反応を止めた後、EtOAc (100 mL × 3)で抽出した。混合有機層を brine で洗浄し、無水MgSO4で乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(silica gel, EtOAc:hexane:Et3N = 20:80:5)で精製し、目的の化合物４を茶白色固体として得た（収量：10.5 g, 収率：37%）。
【００４９】
融点は、90〜92 ℃であった。Ｒｆは、0.45 (30% EtOAc-hexane)であった。ＩＲ(KBr)は、2950, 1690, 1480, 1270, 1180, 1110, 940, 840, 780 cm-1であった。１Ｈ−ＮＭＲ (300 MHz, DMSO-d6)は、δ7.45 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.82 (dd, J = 2.7, 8.7 Hz, 1H), 4.04-4.00 (m, 2H), 3.94-3.90 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.67 (s, 3H), 2.68 (s, 3H)であった。１３Ｃ−ＮＭＲ (75 MHz, DMSO-d6)は、δ165.4, 154.3, 145.6, 131.4, 126.7, 111.3, 110.7, 104.2, 102.1, 69.6, 61.8, 50.4, 29.7, 25.8, 18.0, 11.7, -5.2であった。ＦＡＢ−ＭＳは、m/z 378 [(M+H)+]であった。ＦＡＢ−ＨＲＭＳは、C20H32NO4Si [(M+H)+] 378.2101と計算され、実測値は378.2105であった。
【００５０】
〔5-[2-(tert-Butyldimethylsilanyloxy)ethoxy]-1,2-dimethyl-4-nitro-1H-indole-3-carboxylic acid methyl ester（化合物５）の合成〕
上記化合物４(2.40 g, 6.4 mmol)および酢酸(1.1 mL, 19.1 mmol)をCH2Cl2 (64 mL)に溶解し、61% 硫酸(0.71 mL, 9.5 mmol)を加えて室温で４５分間攪拌した。飽和NaHCO3水溶液(50 mL)を加えて反応を止め、CH2Cl2 (50 mL × 3)で抽出した。混合有機層を brine で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、濾過した後、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(silica gel, EtOAc:hexane:Et3N = 20:80:5)で精製し、目的の化合物５を黄色固体として得た（収量：1.80 g, 収率：67%）。
【００５１】
融点は、98〜100 ℃であった。Ｒｆは、0.45 (50% EtOAc-hexane)であった。ＩＲ(KBr)は、2950, 1690, 1520, 1440, 1270, 1200, 1100, 950, 840, 780 cm-1であった。１Ｈ−ＮＭＲ (300 MHz, DMSO-d6)は、δ7.73 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.15 (t, J = 4.7 Hz, 2H), 3.86 (t, J = 4.7 Hz, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 2.66 (s, 3H), 0.84 (s, 9H), 0.03 (s, 6H)であった。１３Ｃ−ＮＭＲ (75 MHz, DMSO-d6)は、δ164.0, 147.7, 145.6, 132.8, 132.3, 116.7, 113.2, 109.5, 101.2, 71.8, 61.6, 50.0, 30.2, 25.8, 18.0, 11.7, -5.5であった。ＦＡＢ−ＭＳは、m/z 423 [(M+H)+] であった。ＦＡＢ−ＨＲＭＳは、C20H31N2O6Si [(M+H)+] 423.1952と計算され、実測値は423.1938であった。
【００５２】
〔4-Amino-5-(2-hydroxyethoxy)-1,2-dimethyl-1H-indole-3-carboxylic acid methyl ester（化合物６）の合成〕
上記化合物５(0.7186 g, 1.7 mmol)をエタノール(8.5 mL)に溶解し、スズ(1.0092 g, 8.5 mmolおよび 6 N塩酸(1.4 mL, 8.5 mmol)を添加した。５時間、攪拌しながら還流して反応させた。飽和NaHCO3水溶液(10 mL)を加えて反応を止め、CH2Cl2 (20 mL × 3)で抽出した。混合有機層を brine で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、濾過した後、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(silica gel, EtOAc: Et3N = 100:5)で精製し、目的の化合物６を黄色固体として得た（収量：0.4740 g, 収率：100%）。
【００５３】
融点は、175〜176℃であった。Ｒｆは、0.46 (EtOAc)であった。ＩＲ(KBr)は、3400, 3300, 1680, 1600, 1550, 1490, 1440, 1370, 1270, 1230, 1160, 1090, 1040, 1020, 770 cm-1であった。１Ｈ−ＮＭＲ (300 MHz, DMSO-d6)は、δ6.83 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.91 (s, 1H), 4.92 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.90 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.68 (q, J = 4.8 Hz, 2H), 3.59 (s, 3H), 2.60 (s, 3H) であった。１３Ｃ−ＮＭＲ (75 MHz, DMSO-d6)は、δ166.7, 144.0, 139.2, 133.8, 131.5, 113.4, 111.7, 103.0, 96.5, 72.4, 60.0, 51.1, 29.9, 12.7であった。ＦＡＢ−ＭＳは、m/z 279 [(M+H)+] であった。ＦＡＢ−ＨＲＭＳは、C14H19N2O4[(M+H)+] 279.1345と計算され、実測値は279.1353であった。
【００５４】
〔4-Amino-5-[2-(tert-butyldimethylsilanyloxy)ethoxy]-1,2-dimethyl-1H-indole-3-carboxylic acid methyl ester（化合物７）の合成〕
上記化合物６(0.8194 g, 2.9 mmol)およびイミダゾール(0.3007 g, 4.4 mmol)をDMF (15 mL)に溶解し、tert-butyldimethylsilylchloride (0.5326 g, 3.5 mmol)を添加して室温で３時間攪拌した。飽和NaHCO3 水溶液(10 mL)を加えて反応を止め、EtOAc (10 mL × 3)で抽出した。混合有機層を brine で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、濾過した後、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(silica gel, EtOAc:hexane:Et3N = 20:80:5) で精製し、目的の化合物７を茶白色固体として得た（収量：1.1208 g, 収率：97%）。
【００５５】
融点は、95〜96℃であった。Ｒｆは、0.64 (50% EtOAc-hexane)であった。ＩＲ(KBr)は、3350, 3300, 1680, 1600, 1490, 1400, 1230, 1150, 1100, 930, 840, 770 cm-1であった。１Ｈ−ＮＭＲ (300 MHz, DMSO-d6)は、δ6.86 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.59 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.81 (s, 2H), 3.94 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 3.87 (t, J = 4.2 Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.59 (s, 3H), 2.60 (s, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.08 (s, 6H) であった。１３Ｃ−ＮＭＲ (75.5 MHz, DMSO-d6)は、δ166.7, 144.1, 139.0, 134.0, 131.8, 113.5, 112.7, 103.0, 96.7, 72.4, 61.9, 51.1, 29.9, 25.8, 18.0, 12.7, -5.3であった。ＦＡＢ−ＭＳは、m/z 393 [(M+H)+] であった。ＦＡＢ−ＨＲＭＳは、C20H33N2O4Si [(M+H)+] 393.2210と計算され、実測値は393.2209であった。
【００５６】
〔{4-Amino-5-[2-(tert-butyldimethylsilanyloxy)ethoxy]-1,2-dimethyl-1H-indol-3-yl}methanol（化合物８）の合成〕
上記化合物７(0.4702 g, 1.2 mmol)をCH2Cl2(6 mL)に溶解し、ドライアイス−アセトン（−７８℃）にて冷却してDIBAL-H (1.0 M in hexane, 3.6 mL, 3.6 mmol)を添加し、室温で２時間攪拌した。メタノール(5 mL)を加え、その後に飽和NaHCO3 水溶液(10 mL)を加えて反応を止めた後、室温で１時間攪拌した。反応液をEtOAc (10 mL × 3)で抽出した。混合有機層を brine で洗浄し、無水MgSO4で乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(silica gel, EtOAc:hexane:Et3N = 30:70:5)で精製し、目的の化合物８を茶色油状物として得た（収量：0.3946 g, 収率：90%）。
【００５７】
Ｒｆは、0.33 (50% EtOAc-hexane)であった。ＩＲ(KBr)は、3350, 2300, 2100, 1600, 1560, 1500, 1460, 1400, 1320, 1250, 1100 cm-1であった。１Ｈ−ＮＭＲ (300 MHz, DMSO-d6)は、δ6.74 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.51 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.22 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 4.98 (s, 2H), 4.59 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.93-3.88 (m, 2H), 3.88-3.83 (m, 2H), 3.50 (s, 3H), 2.27 (s, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.08 (s, 6H) であった。１３Ｃ−ＮＭＲ (75.5 MHz, DMSO-d6)は、δ137.7, 133.9, 131.8, 131.3, 116.8, 112.1, 110.6, 97.2, 73.0, 61.9, 55.1, 29.3, 25.8, 18.0, 9.7, -5.3であった。ＦＡＢ−ＭＳは、m/z 365 [(M+H)+] であった。ＦＡＢ−ＨＲＭＳは、C19H33N2O3Si [(M+H)+] 365.226と計算され、実測値は365.227であった。
【００５８】
〔5-[2-(tert-Butyldimethylsilanyloxy)ethoxy]-3-hydroxymethyl-1,2-dimethyl-1H-indole-4,7-dione（化合物９）の合成〕
上記化合物８(0.1981 g, 0.54 mmol)およびtrioctylmethylammonium chloride (0.2748 g, 0.68 mmol)をTHF (2.7 mL)に溶解し、氷水（０℃）にて冷却してpotassium nitrosodisulfonate (Fremy’s salt) (0.2430 g, 0.54-0.68 mmol) のsodium dihydrogenphosphate (0.3 M, 2.7 mL)水溶液を添加し、０℃に維持したまま１時間攪拌した。飽和NaHCO3水溶液(3 mL)を加えて反応を止めた後、EtOAc (10 mL × 3)で抽出した。混合有機層を brine で洗浄し、無水MgSO4で乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(silica gel, EtOAc:hexane:Et3N = 20:80:5)で精製し、目的の化合物９を茶色油状物として得た（収量：0.0775 g, 収率：38%）。
【００５９】
Ｒｆは、0.42 (70% EtOAc-hexane)であった。ＩＲ(KBr)は、1640, 1610, 1580, 1460, 1300, 1260, 1220, 1140, 1070, 960, 840 cm-1であった。１Ｈ−ＮＭＲ (300 MHz, DMSO-d6)は、δ5.63 (s, 1H), 5.47 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.08-4.04 (m, 2H), 4.00-3.90 (m, 2H), 3.82 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 0.86 (s, 9H), 0.07 (s, 6H) であった。１３Ｃ−ＮＭＲ (75.5 MHz, DMSO-d6)は、δ177.4, 159.3, 154.6, 135.3, 125.9, 122.4, 120.7, 104.9, 71.0, 60.9, 54.4, 31.8, 25.7, 18.0, 9.3, -5.3であった。ＦＡＢ−ＭＳは、m/z 380 [(M+H)+] であった。
【００６０】
〔Coumarin-3-carboxylic acid 5-[2-(tert-butyldimethylsilanyloxy)ethoxy]-1,2-dimethyl-4,7-dioxo-4,7-dihydro-1H-indol-3-ylmethyl ester（化合物１０）の合成〕
上記化合物９(0.1765 g, 0.47 mmol)、DCC (0.1919 g, 0.93 mmol)およびDMAP (0.1136 g, 0.93 mmol)をCH2Cl2 (4.7 mL)に溶解し、coumarin-3-carboxylic acid (0.1769 g, 0.93 mmol)を添加して、室温で１４時間攪拌した。飽和NaHCO3水溶液(3 mL)を加えて反応を止めた後、EtOAc (5 mL × 3)で抽出した。混合有機層を brine で洗浄し、無水MgSO4で乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(silica gel, 30% EtOAc-hexane)で精製し、目的の化合物１０を赤橙色固体として得た（収量：0.1538 g, 収率：60%）。
【００６１】
融点は、158〜159℃であった。Ｒｆは、0.33 (50% EtOAc-hexane)であった。１Ｈ−ＮＭＲ (400 MHz, CDCl3)は、δ8.47, 7.65-7.53 (m, 2H), 7.33-7.25 (m, 2H), 4.01-3.96 (m, 2 H), 3.96-3.92 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 2.34 (s, 3H), 0.85 (s, 9H), 0.07 (s, 6H)であった。ＦＡＢ−ＭＳは、m/z 552 [(M+H)+] であった。ＦＡＢ−ＨＲＭＳは、C29H34NO8Si [(M+H)+] 552.2054と計算され、実測値は552.2055であった。
【００６２】
〔Coumarin-3-carboxylic acid 5-(2-hydroxyethoxy)-1,2-dimethyl-4,7-dioxo-4,7-dihydro-1H-indol-3-ylmethyl ester（化合物１１）の合成〕
上記化合物１０(0.0506 g, 0.092 mmol)をCH2Cl2-methanol-H2O (3 mL:2 mL:0.2 mL)に溶解し、PPTS (0.0461 g, 0.18 mmol)を添加して、室温で６３時間攪拌した。この反応液を減圧濃縮し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(silica gel, 5% methanol-CHCl3)で精製し、目的の化合物１１を橙色固体として得た（収量：0.0392 g, 収率：98%）。
【００６３】
融点は、204〜205℃であった。Ｒｆは、0.30 (2% methanol-CHCl3)であった。１Ｈ−ＮＭＲ (400 MHz, DMSO-d6)は、δ8.64, 7.90 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.72 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.43-7.35 (m, 2H), 5.79 (s, 1H), 5.39 (s, 2H), 4.94 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.94 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.70 (q, J = 4.8 Hz), 2.31 (s, 3H)であった。ＦＡＢ−ＭＳは、m/z 438 [(M+H)+] であった。ＦＡＢ−ＨＲＭＳは、C23H20NO8 [(M+H)+] 438.1189と計算され、実測値は438.1174であった。
【００６４】
〔Coumarin-3-carboxylic acid 5-[2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yloxycarbonyloxy)ethoxy]-1,2-dimethyl-4,7-dioxo-4,7-dihydro-1H-indol-3-ylmethyl ester（化合物１２）の合成〕
上記化合物１１(0.0126 g, 0.029 mmol)およびEt3N (0.020 mL, 0.14 mmol)をDMF (0.5 mL)に溶解し、DSC (0.0369 g, 0.14 mmol)を添加して、室温で１５時間攪拌した。この反応液を減圧濃縮し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(silica gel, 1% methanol-CHCl3)で精製し、目的の化合物１２を橙色固体として得た（収量：0.0120 g, 収率：72%）。
【００６５】
融点は、157〜158℃であった。Ｒｆは、0.20 (2% methanol-CHCl3)であった。１Ｈ−ＮＭＲ (300 MHz, DMSO-d6)は、δ8.65, 7.95-7.80 (m, 1H), 7.74-7.60 (m, 1H), 7.43-7.33 (m, 2H), 5.87 (s, 1H), 5.39 (s, 2H), 4.75-4.60 (m, 2H), 4.30-4.20 (m, 2H), 3.87 (s, 3H), 2.79 (s, 4H), 2.35 (s, 3H)であった。ＦＡＢ−ＭＳは、m/z 601 [(M+ Na)+] であった。ＦＡＢ−ＨＲＭＳは、C28H22N2NaO12[(M+ Na)+] 601.1070と計算され、実測値は601.1060であった。
【００６６】
〔ＤＮＡ１およびＤＮＡ２の調製〕
下記式（１）に示される構造を有するＤＮＡ１および下記式（２）に示される構造を有するＤＮＡ２を以下の手順で調製した。
【００６７】
【化１】
2006246854.tif 000003
【００６８】
化合物２溶液または化合部１２溶液（いずれも4 mM in MeCN, 150 μL）に、3'-amino-linked DNA (200 μM in H2O, 150 μL)および飽和NaHCO3 水溶液(75 μL)を添加し、遮光下、室温で１時間インキュベートした。反応液を逆相ＨＰＬＣで精製した。溶出には0.1 M TEAA buffer (pH 7.0)およびアセトニトリル混合溶媒を用い、アセトニトリル濃度を100分以上で0% 〜100%のリニアグラジエントとした。流速は3.0 mL/minとした。以上により、ＤＮＡ１およびＤＮＡ２を得た。ＤＮＡと機能分子との結合は、酵素による消化およびMALDI-TOF mass（DNA1: calcd. 5017.39, found 5018.40; DNA 2 calcd. 3032.14, found 3032.46）により確認した。
【００６９】
〔光照射による機能分子の遊離〕
下記の塩基配列からなるＤＮＡを合成し、標的ＤＮＡとした。
5'-AGAGTCCAGCGTAATTGACAGGA-3'（配列番号１）
また、上記により得られたＤＮＡ１は標的ＤＮＡの相補配列
5'-ATTACGCTGGACTCT-3'（配列願号２）
を有しており、ＤＮＡ２は標的ＤＮＡの相補配列
5'-TCCTGTCA-3'（配列番号３）を有している。
【００７０】
０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液 (10 mM, pH 6.5)に標的ＤＮＡ(1 μM)、ＤＮＡ１(1 μM)およびＤＮＡ２(10 μM)を添加し、２０℃で、トランスイルミネーターを用いて365 nmの光を照射した。照射開始３０分後および６０分後にＤＮＡ溶液をサンプリングし、逆相ＨＰＬＣに供し、ＤＮＡ２から遊離したクマリン分子を検出した。ＨＰＬＣにはUG120 C18 semicolumn (1.5 mmφ×250 mm)を装着したNANOSPACE SI-1 (Shiseido, Tokyo)を用いた。溶出ピークはUV-VIS detector 2002を用いて波長290 nmで検出した。溶出液には11.5% MeCN (pH 7)を含むTEAA bufferを用いた。
【００７１】
また、ＤＮＡ１を含まない溶液を用いた場合、標的ＤＮＡを含まない溶液を用いた場合および３種類のＤＮＡを含む溶液に光照射しない場合についても上記と同様の実験を行った。
【００７２】
結果を図２および表１に示した。図２および表１から明らかなように、３種類のＤＮＡを含む溶液に光照射を行うことにより、クマリン分子が効率良く遊離することが明らかとなった。また、図２から明らかなように、１μＭの標的ＤＮＡに対して６μＭを超えるクマリン分子が遊離していることから、光反応の繰り返しにより微量の標的ＤＮＡにおける変異を検出可能であることが示唆された。
【００７３】
【表１】
2006246854.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明に係る遺伝子検出方法は、遺伝子診断、遺伝子解析等、遺伝子が関与するすべての分野に利用可能である。したがって、本発明は医療、製薬、試薬分野をはじめ、広く生物関連産業に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明に係る方法の原理を示す模式図である。
【図２】光照射により遊離するクマリン濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図１】
2006246854.tif 000005
【図２】
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【配列表】
2006246854000001.app