(57)【要約】    【課題】  従来技術の問題点を克服し、電子を選択的かつ効率的に透過するユニークな膜を設けた電極基板を提供する。    【解決手段】  本発明は、電極と、前記電極に配設された膜であって、前記電極から順に、−Ａ−Ｂの構造を有する膜（ここで、Ａは、アルキレン基またはアルキレンオキシ基を含み、Ｂは、式（１）【化１】2006242926.tif 000014で表される基[ここで、Ｘは、水素原子、ハロゲン原子またはアルキル基であり、Ｒ１は、リン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを示し、ｌは２以上の整数である。]の繰り返し単位の鎖を含む。）と、を備える電極基板を開示する。【選択図】    図１
2006242926.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極と、
前記電極に配設された膜であって、前記電極から順に、−Ａ−Ｂの構造を有する膜（ここで、Ａは、アルキレン基またはアルキレンオキシ基を含み、Ｂは、式（１）
【化１】
2006242926.tif 000010
で表される基[ここで、Ｘは、水素原子、ハロゲン原子またはアルキル基であり、Ｒ１は、リン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを示し、ｌは２以上の整数である。]の繰り返し単位の鎖を含む。）と、
を備える電極基板。
【請求項２】
前記アルキレン基またはアルキレンオキシ基は、−ＣＨ2−または−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−である、請求項１に記載の電極基板。
【請求項３】
前記Ｂは、前記Ｒ１を介して、メディエーターまたは生体分子をさらに含む、請求項１または２に記載の電極基板。
【請求項４】
前記膜は、前記Ｂを介して、下記式（２）
【化２】
2006242926.tif 000011
で表される基（ここで、Ｘは、水素原子、ハロゲン原子またはアルキル基であり、Ｒ２は、リン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを示し、ｌは２以上の整数である。）の繰り返し単位Ｗをさらに含む、請求項１ないし３のうち何れか一項に記載の電極基板。
【請求項５】
前記Ｗは、前記Ｒ２を介して、メディエーターまたは生体分子をさらに含む、請求項１ないし４のうち何れか一項に記載の電極基板。
【請求項６】
前記電極と前記Ａとは、硫黄原子または酸素原子を介して結合している、請求項１ないし５のうち何れか一項に記載の電極基板。
【請求項７】
前記生体分子は、核酸、酵素および抗体からなる群から選択される、請求項３ないし６のうち何れか一項に記載の電極基板。
【請求項８】
電極上に膜を形成する方法であって、
（１）前記電極上にハロゲン化アルキル誘導体を含む単分子膜を形成するように、ハロゲン化チオール誘導体、ハロゲン化ジスルフィド誘導体およびハロゲン化シラノール誘導体からなる群から選択された一以上の種を含む溶液に、前記電極を浸漬する工程と、
（２）不活性気体の存在下、前記ハロゲン化アルキル誘導体と、式（３）で表される基を反応させる工程と、
【化３】
2006242926.tif 000012
（ここで、Ｚは、水素原子またはアルキル基であり、Ｒ３は、リン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを示し、ｌは２以上の整数である。）
を含む方法。
【請求項９】
（３）前記Ｒ３の水酸基を介して、または前記水酸基から誘導されたマレイミド基あるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を介して、生体分子またはメディエーターを導入する工程を、さらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（４）不活性気体の存在下、式（４）で表される基をさらに反応させる工程と、
【化４】
2006242926.tif 000013
（ここで、Ｚは、水素原子またはアルキル基であり、Ｒ４は、リン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを示し、ｌは２以上の整数である。）
をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（５）前記Ｒ４の水酸基を介して、または前記水酸基から誘導されたマレイミド基あるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を介して、生体分子またはメディエーターを導入する工程を、さらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（２）および（４）は、アトムトランスファーラジカルポリメリゼーション法により実行される、請求項８または１０に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１ないし７のうち何れか一項に記載の電極基板と、
前記電極基板に対するカウンター電極と、
参照電極と、
を備える検出装置。
【請求項１４】
前記電極基板と、前記カウンター電極と、前記参照電極とを個別に電気的に接続した検出回路をさらに備える、請求項１３に記載の検出装置。
【請求項１５】
被検物質の検出キットであって、
請求項１３または１４に記載の検出装置と、
前記被検物質との間で反応する生体分子およびメディエーターと、
を含む、キット。
【請求項１６】
緩衝液をさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
試料中の被検物質の検出方法であって、
請求項１５または１６に記載のキットを準備する工程と、
前記試料を前記キットに接触させる工程と、
を含む検出方法。
【請求項１８】
前記被検物質の存在下での電流値を測定する工程をさらに含む、請求項１７に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種分野における被検物質検出用電極基板および該基板を備える検出装置に係り、より詳細には、被検物質との間での電子などのキャリアの授受を検出する電極基板および該基板を備える検出装置等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ、タンパク質、抗体分子等の生体分子を、短時間に効率よく、かつ、正確に認識して、前記生体分子を含むサンプルの構造、機能、重量、電気的性質や光学的性質を情報として伝達できる検出装置の用途は、ヒトゲノム解析が終了した以降、ますます重要になってきている。たとえば、大量のサンプルを短時間に解析できるバイオチップは、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応を蛍光強度で計測する方法（たとえば、特許文献１参照）や、電界印加によって変化するＤＮＡ移動量の差を計測する方法（たとえば、特許文献２参照）等を利用している。一般的には、これらの文献に開示されているように、蛍光反応の強度変化を監視する方法が主流となりつつある。
【０００３】
また、酵素やＤＮＡ、抗体等の生体分子が関与する生体反応を、in vivo（生体内）ではなく、in vitro（生体外）にて、リアルタイムに検出可能なセンサーまたはマイクロセンサーチップの需要が、昨今、かなり高まってきている。特に、ゲノム解析終了後、そのＤＮＡ鎖の機能解析に比重が移ってきており、とりわけ、ＤＮＡ鎖から形成される酵素、抗体などを含むタンパク質の機能解析、その機能に沿った創薬ターゲットの最適化が大きな比重を占めてくる。その解析を効率よく進めるために、つまり、ハイスループットに、ＤＮＡチップ、プロテインチップを利用することがますます重要になる。このようなチップ技術の核心部分は、検出方法（蛍光等の光検出、電気化学的検出、微小重量の検出等）と生体分子の反応との間における検出機構の役割を担うバイオインターサーフェス（以下、単に「ＢＩ」という。）の性能である。
【０００４】
このＢＩは、生体反応の情報をうまく選択して有用な情報パラメータのみ増幅させ、検出パラメータに変換、移動させる能力を必要とする。
【０００５】
かかるＢＩの機能を備える代表的な検出装置として、酵素分子を利用した電気化学的検出装置が実用化されたものを含めて、今後、大きな需要が期待できる。より具体的には、糖尿病疾患から生じる高血糖値を監視するための検出装置では、グルコース分子をグルコン酸に酸化させるグルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼの酵素分子を電極基板に固定化させ、基板上の酵素分子膜中にて血中に含まれるグルコースをグルコース酸へ酸化反応させ、その結果生じる酸化電流を電極にて捕捉、検出することでリアルタイムに検出できる（たとえば、特許文献３ないし５参照）。
【０００６】
このように、血糖値を監視するための検出装置では、一般的には酵素分子等の生体分子が、セルロースなどの水溶性ポリマー中で分散され、混合分散膜として電極上のスピンコート法等によって形成される。または、自己組織化単分子膜（以下、単に「ＳＡＭ」という。）を利用して、生体分子を電極基板表面に固定化または準固定化状態（非共有結合による緩い保持）にさせ、擬似生体反応を固体表面で起こし、監視する方法がある。そして、現在までのところ、ＳＡＭによる生体分子固定化法が急速に主流になりつつある。
【特許文献１】米国特許第５，４４５，９３４号
【特許文献２】米国特許第６，２８０，５９０号
【特許文献３】特開平６−７８７９１号
【特許文献４】特開平６−９０７５４号
【特許文献５】特表平８−５０５１２３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前述のＳＡＭを電極基板表面に固定化する方法には、後述するように、いくつかの問題点が指摘されている：すなわち、（１）単分子膜のため、電極基板表面と生体分子との間の相互作用の制御が困難である；たとえば、金属表面に生体分子が接触すると、生体分子、特に酵素等が変性し、酵素活性が失活してしまうおそれがある；（２）電極基板表面と生体分子との間の非特異的吸着の制御が困難である；たとえば、生体分子等が電極基板表面に静電的、分子間力的に吸着してしまうおそれがある；（３）単分子膜が極薄のため、酵素反応にて生成した酸化電流を監視しているのか、そのとも、リーク電流を監視しているのか、区別することが困難である；（４）従来のＳＡＭでは絶縁性が高く、膜の下部にある電極基板にて酵素等の酸化還元電流を検出できなくなるか、または、逆にＳＡＭの密度、膜厚が小さくリーク電流等が流れ易く、選択的透過膜を形成することが困難である。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、従来技術の問題点を克服し、電子を選択的かつ効率的に透過するユニークな膜を設けた電極基板を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、かかる事情に鑑み、電子を効率的かつ選択的に透過することができる膜を鋭意検討したところ、電極基板に、特定の構造を有する膜を電極基板に配設させることにより、前記目的を達成し得る知見を得て、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、第一の態様では、本発明は、電極と、前記電極に配設された膜であって、前記電極から順に、−Ａ−Ｂの構造を有する膜（ここで、Ａは、アルキレン基またはアルキレンオキシ基を含み、Ｂは、式（１）
【化１】
2006242926.tif 000003
で表される基[ここで、Ｘは、水素原子、ハロゲン原子またはアルキル基であり、Ｒ１は、リン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを示し、ｌは２以上の整数である。]の繰り返し単位の鎖を含む。）と、を備える電極基板を提供する。かかる構成により、リン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを有するＲ１が、電子伝達機能を果たすために、効率的かつ選択的な電子の透過を可能として、電極にて捕捉される。
【００１１】
本発明に係る電極基板の好ましい態様では、前記アルキレン基またはアルキレンオキシ基は、−ＣＨ2−または−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−である。前記Ａが、−ＣＨ2−または−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−を含むことにより、電極への生体分子等の付着を防止する。
【００１２】
本発明に係る電極基板の好ましい態様では、前記Ｂは、前記Ｒ１を介して、メディエーターまたは生体分子をさらに含む。前記Ｂがメディエーターまたは生体分子を有することで、電極基板上にメディエーターまたは生体分子が確実に存在することになるので、被検物質との反応が迅速に行われる。
【００１３】
本発明に係る電極基板の好ましい態様では、前記膜は、前記Ｂを介して、下記式（２）
【化２】
2006242926.tif 000004
で表される基（ここで、Ｘは、水素原子、ハロゲン原子またはアルキル基であり、Ｒ２は、リン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを示し、ｌは２以上の整数である。）の繰り返し単位Ｗをさらに含む。電子伝達機能を有するリン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを含有させる構成により、電子の効率的かつ選択的な透過が可能となる。
【００１４】
本発明に係る電極基板の好ましい態様では、前記Ｗは、前記Ｒ２を介して、メディエーターまたは生体分子をさらに含む。前記Ｗを介して、電極基板上により多くのメディエーターまたは生体分子が確実に存在することになるので、被検物質との反応がより迅速に行われる。
【００１５】
本発明に係る電極基板の好ましい態様では、前記電極と前記Ａとは、硫黄原子または酸素原子を介して結合している。かかる誘導体を用いることで、強固に、かつ、秩序方向を有する態様で、膜を電極基板に固定することができる。
【００１６】
本発明に係る電極基板の好ましい態様では、前記生体分子は、核酸、酵素および抗体からなる群から選択される。このような分子を用いることで、被検物質との相互作用に基づく電子の授受に起因した電流の検出を可能とする。
【００１７】
また、第二の態様では、本発明は、電極上に膜を形成する方法であって、
（１）前記電極上にハロゲン化アルキル誘導体を含む単分子膜を形成するように、ハロゲン化チオール誘導体、ハロゲン化ジスルフィド誘導体およびハロゲン化シラノール誘導体からなる群から選択された一以上の種を含む溶液に、前記電極を浸漬する工程と、
（２）不活性気体の存在下、前記ハロゲン化アルキル誘導体と、式（３）で表される基を反応させる工程と、
【化３】
2006242926.tif 000005
（ここで、Ｚは、水素原子またはアルキル基であり、Ｒ３は、リン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを示し、ｌは２以上の整数である。）
を含む方法を提供する。かかる形成方法により、電子伝達機能を有するリン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを、電極上に固定化できる。
【００１８】
本発明に係る形成方法の好ましい態様では、
（３）前記Ｒ３の水酸基を介して、または前記水酸基から誘導されたマレイミド基あるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を介して、生体分子またはメディエーターを導入する工程を、さらに含む。かかる工程を採用することで、生体分子またはメディエーターをも電極上に固定することができるとともに、被検物質との迅速な反応を可能とする。
【００１９】
本発明に係る形成方法の好ましい態様では、
（４）不活性気体の存在下、式（４）で表される基をさらに反応させる工程と、
【化４】
2006242926.tif 000006
（ここで、Ｚは、水素原子またはアルキル基であり、Ｒ４は、リン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを示し、ｌは２以上の整数である。）
をさらに含む。このようにして、さらに電子伝達機能を担うリン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを、電極上に設けることができる。
【００２０】
本発明に係る形成方法の好ましい態様では、
（５）前記Ｒ４の水酸基を介して、または前記水酸基から誘導されたマレイミド基あるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を介して、生体分子またはメディエーターを導入する工程を、さらに含む。かかる工程を採用することで、より効率的な検出のため、生体分子またはメディエーターを、さらに電極上に固定することができる。
【００２１】
本発明に係る形成方法の好ましい態様では、前記工程（２）および（４）は、アトムトランスファーラジカルポリメリゼーション法により実行される。かかる方法により、制御よく、電子伝達機能を有するリン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを有する膜を形成することができる。
【００２２】
さらに、第三の態様では、本発明は、前述の電極基板と、前記電極基板に対するカウンター電極と、参照電極と、を備える検出装置を提供する。かかる検出装置を用いることで、in vitroにて、被検物質のリアルタイムな検出を可能とする。
【００２３】
本発明に係る検出装置の好ましい態様では、前記電極基板と、前記カウンター電極と、前記参照電極とを個別に電気的に接続した検出回路をさらに備える。かかる検出回路を用いることで、発生した電流を検出することが可能となる。
【００２４】
さらにまた、第四の態様では、本発明は、被検物質の検出キットであって、前述の検出装置と、前記被検物質との間で反応する生体分子およびメディエーターと、を含むキット提供する。かかるキットにより、簡易に被検物質の有無の判別することが可能となる。本発明に係るキットの好ましい態様では、前記生体分子は酵素である。酵素を用いることが、試料中に存在する分子との間における、抗原抗体反応や酸化還元反応が行われ、その反応にて生じた電子の授受を電極基板にて、酸化電流もしくは還元電流として検出することが可能となる。
【００２５】
本発明に係る検出キットの好ましい態様では、緩衝液をさらに含む。緩衝液を用いることで、被検物質を含む試料のｐＨの変動を抑制することができ、再現性のある検出が可能となる。
【００２６】
くわえて、第五の態様では、本発明は、試料中の被検物質の検出方法であって、前述のキットを準備する工程と、前記試料を前記キットに接触させる工程と、を含む検出方法を提供する。かかる方法によれば、簡易に試料中の特定の被検物質の検出ができる。
【００２７】
本発明に係る検出方法の好ましい態様によれば、前記被検物質の存在下での電流値を測定する工程をさらに含む。かかる電流値の結果に基づき、試料中に存在する被検物質の有無の検出ができ、さらに被検物質の不存在下での電流値との比較から、被検物質の濃度を算出することも可能となる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明に係る電極基板によれば、電極基板の表面には生体分子等が付着せずに、電子を選択的かつ効率的に透過させることができる電極基板が提供される。また、本発明に係る膜形成方法によれば、特定の分子類を、順序よく制御して、特定に分子類を有する膜を、電極上に形成することができる。さらに、かかる電極基板を用いて、被検物質の検出を容易に可能とする検出装置が実現される。さらにまた、前記検出装置と生体分子およびメディエーターとを組み合わせることにより、グルコースやスーパーオキサイドラジカル等の被検物質の検出を容易に可能とする検出キットおよび検出方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
次に、本発明の実施の形態について、図面を参照しつつ説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。
【００３０】
図１は、本発明に係る電極基板１０の概略断面図を示す。本発明に係る電極基板１０は、電極２０と、前記電極２０に配設された膜３０とを備える。本発明に用いる電極２０の材質としては、特に限定されず、炭素、金、銀、白金、銅等が挙げられる。図１に示す電極の形状は、平板状で例示しているが、この形状に限定されることなく、ピンなどの円柱状等であってもよい。
【００３１】
本発明に用いる膜３０は、少なくとも−Ａ−Ｂの構造を有する。ここで、Ａは、アルキレン基またはアルキレンオキシ基を含み、Ｂは、下記式（１）
【化１】
2006242926.tif 000007
で表される基（ここで、Ｘは水素原子、ハロゲン原子またはアルキル基である。）の繰り返し単位の鎖を含む。本発明で用いるは「ハロゲン原子」には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。本発明で用いる「アルキル基」としては、炭素数が１ないし６個の直鎖状または分枝状のＣ１−Ｃ６アルキル基が好ましく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基等が挙げられる。本発明で用いるＲ１は、電子伝達機能を有するリン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨである（ｌは２以上１０以下の整数である。）。また、本発明で用いる「アルキレン基」としては、Ｃ１−Ｃ４アルキレン基が好ましく、具体的には、メチレン基、エチレン基、メチルエチレン基、トリメチレン基等が挙げられ、好ましくは、メチレン基、エチレン基等である。さらに、本発明で用いる「アルキレンオキシ基」は、前記「アルキレン基」に酸素原子が付いた基であり、具体的には、メチレンオキシ基、エチレンオキシ基、メチルエチレンオキシ基、トリメチレンオキシ基等が挙げられ、好ましくは、メチレンオキシ基、エチレンオキシ基等である。
【００３２】
図２は、本発明による一の態様の電極基板の概略断面図を示す。図２では、図１に例示したＡの部分は、トリメチレンを含み、Ｂの部分は、下記式（５）
【化５】
2006242926.tif 000008
で表される基を含む（ここで、ｍは４〜１００の整数を示す。）。ｍが４より小さいときは、生体分子等が電極表面に付着し、正確な電流値を測定することが困難であり、ｍが１００より大きいときは、電極基板との電子又はホールなどのキャリアの授受が効率的に行われなくなる。なお、ｍの数を制御することで、本発明に用いる膜３０の膜厚を制御することができる。ここで、Ｒは、電子伝達機能を有するリン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを示し、ｌは、２以上５０以下の整数である。ｌの値が２より小さいときは、電子伝達機能が発揮されず、ｌの値が５０より大きいときは、本発明による膜３０自体の秩序性が乱れる。
【００３３】
図２に例示するように、電極２０の表面と本発明に係る膜３０との間では、電極２０の表面と結合可能な官能基を有している、その官能基は、用いる電極の種類等との関係に応じて選択され得る。本発明で用いるＡの部分において、前記電極と結合可能な官能基を含み、本発明に用いる官能基の具体例として、カルコゲン原子である硫黄原子または珪素原子等が挙げられる。結合に作用する硫黄原子の具体例としては、たとえば、チオール基（−ＳＨ）やジスルフィド（−ＳＳ−）基等を含む化合物が挙げられ、結合に作用する酸素原子の具体例としては、シリル基（−Ｓｉ−）等が挙げられる。
【００３４】
図３は、本発明に係る電極基板１０の別の態様の概略断面図を示す。図３に示す電極基板の構成は、基本的には、図２に示す電極基板と同様に、電極２０と該電極上に配設された、トリメチレンを含むＡと、前述の式（３）を含むＢとから構成される膜３０を有する。さらに、図３に示す膜３０は、式（３）の側鎖であるＲが有する水酸基または該水酸基から誘導されるマレイミド基あるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を介して、メディエーターが有するアミノ基やチオール基等との反応により、電極の近傍にメディエーター（単に、「ＭＥＤ」と称する場合もある。）が導入される。くわえて、図３に示す電極基板１０が有する膜３０は、その表面近傍において、式（３）の側鎖であるＲが有する水酸基または該水酸基から誘導されるマレイミド基あるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を介して、生体分子Ｄが有するアミノ基等との反応により、膜３０の表面近傍に生体分子Ｄが導入される。ここで、本発明で用いる生体分子とは、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸や、酵素や抗体などのタンパク質をいう。なお、メディエーターＭＥＤを電極２０の表面近傍付近に、かつ、生体分子Ｄを膜３０の表面近傍付近に導入する方法については、後述する。
【００３５】
図３に示す構成により、試料中の被検物質と生体分子Ｄとの反応を、膜３０の表面近傍において選択的に行わせ、その結果生じる電子の移動を、膜３０の中であって、電極２０の近傍に存在するメディエーターＭＥＤを介して、効率的に行わせ、電極２０にて酸化電流または還元電流の測定を可能にする。さらに、図３に示すように、ヒドロキシエチレンチオール等で電極２０の表面を処理することにより、生体分子等と電極２０との直接的な接触を回避し、電極に不要な物質が付着することが防止できる。なお、図２に示す電極基板１０を利用する場合であっても、酵素などの生体分子やメディエーターを、電極基板１０が挿入されている、被検物質を含有する試料中に添加することで、図２に示す電極基板１０も、被検物質のセンサーとしての機能を果たすことができる。
【００３６】
本発明に用いるメディエーターは、試料中に含まれる被検物質と生体分子との間の相互作用の結果として生じる電子の移動を補助する機能分子である。本発明に用いるメディエーターの具体例としては、特に限定されないが、後述するように、グルコース濃度の測定の場合、フェロセン、フェロセン誘導体等が挙げられる。
【００３７】
図４は、本発明による電極への膜の形成方法における各工程の概略図を示す。まず、図４の工程１０に示すように、表面を洗浄した電極に、ＳＡＭを形成させるべき機能性分子を有する溶液に浸漬する。ここで、ＳＡＭを形成させるべき機能性分子とは、ハロゲン化チオール誘導体、ハロゲン化ジスルフィド誘導体およびハロゲン化シラノール誘導体からなる群から選択された分子である。本発明に用いる機能性分子の具体例としては、特に限定されないが、後続の重合反応を考慮して、ε−メルカプトウンデシル  ブロモイソブチレート等を挙げることができる。このような浸漬処理により、電極上にハロゲン化アルキル誘導体を含むＳＡＭが形成される。次いで、窒素などの不活性気体により酸素を反応系から排除した雰囲気下において、触媒存在下、式（３）で表される(メタ)アクリレートモノマーを重合させる（工程Ｓ１２参照）。
【化３】
2006242926.tif 000009
（ここで、Ｚは、水素原子またはアルキル基であり、Ｒ３は、リン酸コリンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）lＯＨを示し、ｌは２以上の整数である。）
工程Ｓ１２における重合は、D.M.  Jones  et  al,  Langmuir  2002,  18,  1265 やH.  Ma.  Et  al,  Adv.  Mater.  2004,  16,  338に記載されている、アトムトランスファーラジカルポリメリゼーション法により行うことができる。本重合法に用いる触媒としては、以下に限定されるわけではないが、ＣｕＣｌ（一価）、ＣｕＢｒ（二価）とビピリジンを含む触媒等を挙げることができる。
【００３８】
図５は、図４に示す工程Ｓ１０と工程Ｓ１２とからなる、本発明に係る電極基板１０の具体例な製造例を概略的に説明する図である。洗浄した表面を有する金電極２２を、ε−メルカプトウンデシル  ブロモイソブチレートを含む溶液に浸漬させて、図５に示すように、金電極の表面にＳＡＭを形成させる。このようにして形成されたＳＡＭを有する金電極２２を、シュリンク管チューブに入れ、さらに窒素により酸素が置換され、酸素除去されたモノマー分子（図５参照：式（３）で表されるモノマーであって、Ｚがメチル基である）と、ＣｕＣｌ（一価）、ＣｕＢｒ（二価）、ビピリジンを、同じく酸素除去された脱イオン水と一緒に同じ反応管に入れて、均一にする。さらに、真空乾燥等のプロセスで酸素を除去した後、室温にて、アトムトランスファーラジカルポリメリゼーション反応を行う。なお、膜厚制御は反応時間を変化させることで可能である。このようにして、側鎖に電子伝達機能を有する、第一のポリエチレングリコール鎖または第一のリン酸コリン基を導入することができる。
【００３９】
このようにして、図５に示すように、電極２０に、膜３０が形成された電極基板１０が製造される。その後、必要に応じて、メディエーターおよび/または酵素または抗体などの生体分子を、本発明に用いる膜に導入することができる。メディエーターおよび生体分子の導入方法について、以下に説明する。
【００４０】
図４の工程Ｓ１２まで実行することにより、図５に示す側鎖にポリエチレングリコール鎖またはリン酸コリン基を有する膜３０が、電極上に形成される。この側鎖の末端には水酸基を有することから、その水酸基を、生体分子やメディエーター等が有する活性アミノ基やチオール基と反応するマレイミド基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基に変換する。その後、活性アミノ基やチオール基を有する生体分子および/またはメディエーターと反応させて、側鎖に、酵素などの生体分子および/またはメディエーターを導入することができる（図４の工程Ｓ１４参照）。また、生体分子やメディエーターが有する官能基によっては、側鎖の末端にある水酸基を利用して、膜３０に生体分子やメディエーターを導入することも可能である。
【００４１】
生体分子やメディエーターを導入したあと、図４の工程Ｓ１６に示すように、再度、活性臭素末端により重合反応を開始させ、側鎖に第二のポリエチレングリコール鎖または第二のリン酸コリン基を導入することができる。そして、この第二のポリエチレングリコール鎖または第二のリン酸コリン基の水酸基を、マレイミド基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基に変換後、活性アミノ基やチオール基を有する生体分子やメディエーターと反応させることで、再び、酵素または抗体などの生体分子、またはメディエーターを導入することができる。なお、必要に応じて、生体分子等と電極２０との直接的な接触を回避し、電極に不要な物質が付着することが防止するため、ヒドロキシエチレンチオール等で電極２０の表面を処理してもよい。
【００４２】
本発明の好ましい態様では、本発明に係る電極基板１０は、図４に示す工程Ｓ１４において、メディエーターを導入し、図４に示す工程Ｓ１８において、酵素等の生体分子を導入することで、膜３０の表面近傍には、被検物質と反応する生体分子を有し、電極２０の表面近傍ではメディエーターを有する。このような構成の電極基板により、被検物質の検出が、より効率的な行われる。また、このような構造は、いわゆる、２層構造を有する機能分離型の電極基板である。
【００４３】
次に、本発明による電極基板１０の応用例について説明する。本発明の一の態様によれば、糖尿病患者のグルコース濃度（血糖値）の測定に適用可能である。図６は、本発明による電極基板１０を用いた、グルコース濃度測定の概略模式図を示す。図６の例示では、本発明による電極基板１０の膜３０の表面近傍に、生体分子Ｄであるグルコースオキシターゼ（以下、単に「ＧＯＤ」という。）を導入するとともに、膜３０の電極２０の表面近傍に、メディエーター（ＭＥＤ）を導入した電極基板１０を例として、被検物質としてグルコースの検出を説明する。なお、図６中のＡは、トリメチレンを含み、Ｂは、前記式（５）を含み、式（５）のＲが有する水酸基または該水酸基から誘導されたマレイミド基あるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を介して生体分子ＤおよびＭＥＤを導入したことを概略的に示す。
【００４４】
図６に示すように、本発明に係る電極基板１０は、血液試料中のグルコースが、ＧＯＤの作用によりグルコノラクトンへ酸化すると同時に、酵素であるＧＯＤの活性中心にあるＦＡＤ（Flavin adenine nucleotide）が還元されてＦＡＤＨ（還元体）に変換される。そして、ＦＡＤＨに蓄えられた電子は、ＭＥＤを介して、本発明による基板電極１０へ到達する。その際、電子の動きは、本発明に係る電極基板１０上に設けた膜３０を選択的に透過して電極２０まで移動し、酸化電流として検出される。そのため、測定された電流値の大小から、試料中に含まれる被検物質であるグルコースの量を同定することができる。なお、電流の測定は、サイクリックボルタンメトリーやディフェレンシャルパルスボルタンメトリー等により実行することができる。また、図６では、酵素とＭＥＤを膜３０に導入した電極基板１０を用いて説明したが、酵素とＭＥＤを膜３０に導入せずに、試料中に酵素のＧＯＤと、メディエーターＭＥＤとを添加しても、同様に、電極基板１０にて電流を検出することができる。
【００４５】
前述のグルコース濃度の測定の場合、本発明で用いるメディエーターの具体例としては、特に限定されないが、フェロセン、フェロセン誘導体等を挙げることができ、反応補酵素として、ピロキノリンキノン、ニコチンアミドアデニンヌクレオチド等を共存させてもよい。
【００４６】
また、本発明に係る電極基板１０を用いて、活性酸素種の検出にも適用可能である。ここで、活性酸素種とは、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ2-）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、過酸化水素などをいう。このような活性酸素種を生体内で多量に摂取すると組織障害を起こし、炎症、老化、発癌、心筋梗塞などの様々な疾患を引き起こすことが知られている。特に、ヒドロキシラジカルは、活性酸素種の中でも活性が高く、拡散律速的に生体にアタックして細胞等の脂質から水素を引き抜き、脂質を過酸化脂質ラジカルとして炎症や各種疾患を引き起こすと考えられている。他方、生体は各種活性酸素を低減するためのいくつかの酵素を有している。たとえば、スーパーオキサイドディスムターゼ（以下、単に「ＳＯＤ」という。）は、スーパーオキサイドアニオンを不均化反応で過酸化水素に変換するが、カタラーゼやグルタチオンペルオキシダーゼは、過酸化水素を消失させる。
【００４７】
かかる現象を利用して、後述するように、スーパーオキサイドラジカルの検出が可能となる。図７（Ａ）および７（Ｂ）は、本発明による電極基板１０を用いた、スーパーオキサイドラジカルの検出を説明する概略模式図である。図７（Ａ）は、ＳＯＤ４０とカタラーゼ５０の組み合わせで修飾された電極基板１０の概略図であり、図７（Ｂ）は、ＳＯＤ４０とホースラディッシュパーオキシダーゼ６０との組み合わせで修飾された電極基板１０の概略図である。各種酵素により電極基板の修飾は、本発明による膜３０を有する電極基板１０において、前記膜３０の末端にある水酸基を介して、または該水酸基から誘導されたマレイミド基あるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を介して行うことができる。なお、図７中に示すＡおよびＢは、図６の場合と同様である。
【００４８】
図７（Ａ）に示すように、スーパーオキサイドラジカルを含む試料溶液を、酵素としてＳＯＤやカタラーゼが固定化された電極基板１０と接触させると、そのラジカルは、最初にＳＯＤ酵素の反応部位に取り込まれ、活性部位中に存在する亜鉛、マンガンまたは銅原子の触媒作用により過酸化水素に還元される。この過酸化水素は、ＳＯＤと同様に電極基板１０に固定化されているカタラーゼ５０によってさらに還元されて水と酸素に変換される。その際、電極基板１０から供給される電子によって酵素触媒反応が活性化されるため、その際、電極基板１０から供給される還元電子の量を還元電流として測定できる。この還元電流の大小により、試料中に存在するスーパーオキサイドラジカルの量を同定することができる。なお、電流の測定は、サイクリックボルタンメトリーやディフェレンシャルパルスボルタンメトリー等により実行することができる。
【００４９】
図７（Ｂ）は、図７（Ａ）におけるカタラーゼ５０に代えてホースラディッシュパーオキシダーゼ（以下、単に「ＨＲＰ」という。）６０を用いて修飾した電極基板１０を利用した場合における、スーパーオキサイドラジカルの検出の概略図である。なお、図７（Ｂ）におけるスーパーオキサイドラジカルの反応機構は、図７（Ａ）にて説明したカタラーゼ５０を用いた場合と同様である。また、図７では、酵素を膜３０に固定した例で説明したが、被検物質であるスーパーオキサイドラジカルを含む試料を、本発明に係る電極１０に接触させた際に、ＳＯＤおよびカタラーゼ、またはＳＯＤおよびＨＲＰを添加してもよい。
【００５０】
図７（Ａ）および図７（Ｂ）に例示する本発明の実施形態において、さらにフェロセン等の電子移動を補助するメディエーターが含まれてもよい。
【００５１】
図８は、本発明に係る電極基板１０と、前記電極基板１０に対するカウンター電極７０と、参照電極８０とを備える、本発明に係る検出装置１００の概略平面図を示す。図８に示す検出装置１００は、主要な電極構成のみを例示するが、本発明に用いるカウター電極７０は、特に限定されないが、白金から構成され、本発明に用いる参照電極８０は、電極基板１０とカウンター電極７０の電位の基準となる電極であり、特に限定されないが、塩化銀から構成される。たとえば、被検物質を含む試料を、前記カウンター電極７０および前記参照電極８０と、前記被検物質と反応する生体分子が固定化された、本発明による電極基板１０とを覆うように滴下すると、本発明による電極基板１０にて電子の授受が行われる。図８には不図示であるが、前記カウンター電極７０および前記参照電極８０と、本発明による電極基板１０とを、個別に検出回路１２０と電気的に接続することにより、検出された電流を検出回路１２０にて測定できる。本発明で用いる検出回路１２０の具体例としては、特に限定されないが、薄膜トランジスタ等が挙げられる。なお、電流の測定は、電気化学的な測定で可能であり、たとえば、サイクリックボルタンメトリーやディフェレンシャルパルスボルタンメトリー等により行うこともできる。
【００５２】
また、本発明は、本発明による検出装置１００を備える検出キットを提供する。具体的には、本発明に係る検出キットは、前記検出装置１００と、被検査物質と反応する酵素等の生体分子と、被検物質と生体分子との間で生じた電子の移動を補助するメディエーターとを備える。本発明に係る検出キットは、図６および図７で説明したように、簡易にグルコース濃度の測定や、食品に含まれる活性酸素種の検出が可能となる。また、本発明に係る検出用キットは、水溶液である反応場のｐＨを制御する目的から、緩衝液、たとえば、リン酸緩衝液をさらに含む。なお、本発明に係る電極基板１０、カウンター電極７０、参照電極８０および検出回路１２０を薄膜構造とすることで、本発明に係るキットの小型化が実現される。
【００５３】
さらに、本発明は、試料中の被検物質の検出方法であって、前述の本発明に係るキットを準備する工程と、生体試料、食品試料や、水や空気中の成分を含む環境試料などの、被検物質を含有する試料を、前記キットの電極基板１０と接触させる工程を含む検出方法を提供する。そして、前記被検物質の存在下において、前記電極基板１０にて観測された酸化電流または還元電流を、サイクリックボルタンメトリーやディフェレンシャルパルスボルタンメトリー等により測定することにより、被検物質の有無を観測することができる。くわえて、被検物質の検量線を事前に準備し、被検物質の不存在下と存在下の双方の場合において、本発明に係る電極基板１０を介して酸化電流または還元電流を測定することにより、被検物質の濃度をも算出することが可能となる。
【００５４】
図９は、複数の本発明に係る検出装置１００と、各検出装置１００と個別に電気的に接続された検出回路１２０とを備える装置１５０の概略平面図を示す。また、検出回路１２０と検出装置１００との電気的接続は、検出装置１００のうち、本発明に係る電極基板１０、カウンター電極７０および参照電極８０のそれぞれから個別に、検出回路１２０と接続されている。検出回路１２０として薄膜トランジスタを用いた場合、本発明による電極基板１０を、薄膜トランジスタのドレイン部に接続し、電極基板１０にて測定された電流値を受け、さらに増幅させることもできる。
【００５５】
図９に示すように、かかる装置は、個別に検出装置１００毎に、同一または異なる試料と接触させることで、同時に同一試料または複数の試料における被検物質の検出が可能となる。さらに、同一の試料でも、濃度を変化させて個別の検出装置１００と接触させて測定することも可能である。なお、各検出装置１００と検出回路１２０を接続する回路は、特に限定されないが、銀配線１６０等で接続されている。
【００５６】
図１０は、図９に示した装置１５０を、パーソナルコンピュータ（以下、単に「ＰＣ」という。）１６０に接続して、ＰＣにて駆動可能にしたシステム２００の概略斜視図を示す。なお、装置１５０は、たとえば、プラスチック基板で覆われた構造であり、ディスポーザブル化した構成を示す。本発明で用いるプラスチック基板の具体例としては、特に限定されないが、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂等が挙げられる。かかる構成により、装置１５０のみを使い捨て構造にし、図６および７にて説明したように、血糖値の管理や、食品に含まれる活性酸素種の検出を、簡易に行うことができる。特に、ＰＣとの接続により、検出回路１２０として薄膜トランジスタを介して、薄膜トランジスタにて得られた情報をＵＳＢ等のインタフェースでＰＣに送信することができ、もってＰＣ駆動による検出が可能となる。また、装置１５０に、薄膜トランジスタと接続したＲＦタグを配して、薄膜トランジスタにて得られた情報を無線通信により、ＰＣへ送信することができる。試料の検出をする際、マイクロスポッティング法やインクジェット法等により、試料の液滴を、本発明による電極基板１００と接触させて検出することも可能である。かかるシステム２００により、in vitroにて、リアルタイムに検出可能なセンサーシステム２００が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、本発明に係る電極基板の概略断面図を示す。
【図２】図２は、本発明による一の態様の電極基板の概略断面図を示す。
【図３】図３は、本発明に係る電極基板の別の態様の概略断面図を示す。
【図４】本発明による電極への膜の形成方法における各工程の概略図を示す。
【図５】図５は、図４に示す工程Ｓ１０と工程Ｓ１２とからなる、本発明にかかる電極基板の具体的な製造例を、概略的に説明する図である。
【図６】図６は、本発明による電極基板を用いた、グルコース濃度測定の概略模式図である。
【図７】図７（Ａ）および図７（Ｂ）は、本発明による電極基板を用いた、スーパーオキサイドラジカルの検出を説明する概略模式図である。
【図８】図８は、本発明に係る電極基板と、前記電極基板に対するカウンター電極と、参照電極と、を備える、本発明による検出装置の概略平面図である。
【図９】図９は、複数の本発明に係る検出装置と、各検出装置と個別に電気的に接続された検出回路とを備える装置の概略平面図である。
【図１０】図１０は、図９に示した装置を、パーソナルコンピュータにて接続したシステムの概略斜視図である。
【符号の説明】
【００５８】
１０・・・電極基板、２０・・・電極、３０・・・膜、７０・・・カウンター電極、８０・・・参照電極、１００・・・検出装置、１２０・・・検出回路、１５０・・・装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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