(57)【要約】      （修正有）【課題】環境中に存在する未知の化学物質そのものを同定するよりも、環境中に存在する影響を表現できる指標を確立する方が実用的である。即ち、その特定の環境が人体にとって、どの程度有害であるかを調べる簡単な方法を提供する。【解決手段】メダカを種々の化学物質含有環境で飼育し、特定の１１５６９種のメダカの遺伝子の全部又は１部の発現状況を測定し蓄積データとし、毒性未知の環境下でメダカを飼育し、前記遺伝子の全部又は１部の発現状況を測定し、前記蓄積データと比較することによって該毒性未知の環境の毒性を評価するもの。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メダカを種々の化学物質含有環境で飼育し、表１（表１−１〜１−３０５まで）に記載の１１５６９種のメダカの遺伝子の全部又は１部の発現状況を測定し蓄積データとし、影響未知の環境下でメダカを飼育した際の前記遺伝子の全部又は１部の発現状況を測定し、前記蓄積データと比較することによって該影響未知の環境の影響を評価することを特徴とする環境影響評価方法。
【請求項２】
同時に影響のない環境下でもメダカを飼育し、該遺伝子の全部又は一部の発現状況を測定した際の測定結果を対照区として、前記影響未知の環境下での測定結果をこれで補償するものである請求項１記載の環境影響評価方法。
【請求項３】
雄と雌のメダカを種々の化学物質含有環境で飼育し、表１に記載の１１５６９種のメダカの遺伝子の全部又は１部の発現状況を測定し、雄と雌の蓄積データとし、影響未知の環境下で雄と雌のメダカを飼育した際の前記遺伝子の全部又は１部の発現状況を測定し、雄と雌の測定値の一致程度によって判断することを特徴とする環境ホルモン活性の評価方法。
【請求項４】
雄と雌との蓄積製データから、雄と雌で差のある遺伝子を抽出し性特異遺伝子とし、その性特異遺伝子を判断に使用するものである請求項３記載の環境ホルモン活性の評価方法。
【請求項５】
表１に記載の１１５６９種のメダカの遺伝子から、請求項４記載の性特異遺伝子を除いた性非特異遺伝子のみを用いて請求項１記載の方法を実施することを特徴とする環境ホルモン影響以外の影響評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生態影響試験の信頼性評価方法、即ち環境影響評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、化学物質のデーターベースChemical abstract には約２０００万件の化学物質が登録されている。そのうち、数万種類の合成化学物質が環境中に蓄積しているものと推定され、その数は年々増えている。化学物質の中には、直接または環境中で形を変えた後に生態系や人体に悪影響を与える物質も含まれている。例えば、いわゆる、環境ホルモンといわれるように、従来の毒性学の範囲を超えた、生体に対して影響を与える化学物質も報告されてきている。そのため、種々の高度な測定システムで、環境中に存在する化学物質を同定・定量しようとする試みがなされており、日々新しい手法が開発されている。
【０００３】
しかしながら、どのような高度な技術を用いても、現状では環境中に存在する化学物質のうち約１０％を同定できるにすぎないと言われている。例えば、ダイオキシンの濃度を定量できることは、環境中の毒性を知る上では有益な情報であり、多くの手法が開発されている。しかしながら、ダイオキシンがないからといって、その環境が安全であるという事にはならない。
【０００４】
上述した理由から充分な環境管理には、生物毒性評価試験（バイオアッセイ）を利用した影響の指標化が必要である。バイオアッセイでは「化学物質による生物的応答の変化」を測定し、「影響」を評価する。例えば、環境ホルモン作用の評価には、魚類（オス）を特定の化学物質に暴露し、ビデロジェニンの量を測定することで、環境ホルモン作用の評価を行う。ビデロジェニンは通常オスでは産製されないため、ビデロジェニンの蓄積は、環境ホルモン活性の指標となる。しかしながら、これまでに利用されている手法は、ある特定の指標を観察しているだけで、上記を例に取ると、単にビデロジェニン産製組織を活性化したことを観察しているにすぎないとも考えることが出来る。ビデロジェニンの産製に対する影響を評価したにすぎない。雄の雌化、雌の雄化は、より総合的に評価を行う必要がある。尚、ここで言う環境ホルモンとは以下の定義に従う『生体の恒常性、生殖、発生あるいは行動に関与する種々の生体内ホルモンの合成、貯蔵、分泌、体内輸送、結合、そしてそのホルモン作用そのもの、あるいはクリアランス等の諸過程を阻害する性質を持つ外来性の物質』。
【０００５】
また、特許文献１のように、環境中の化学物質による毒性の性質やその毒性が環境中のいずれの化学物質に起因するかを判定する方法も提案されている。この文献の方法は、ｍＲＮＡが抽出可能な微生物を用いる方法である。よって、微生物の培養に手間と時間がかかる。また、この方法においてもある程度の物質しか判定はできない。
【特許文献１】特開２００４−２４８６３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、環境中に存在する未知の化学物質そのものを同定するよりも、環境中に存在する影響を表現できる指標を確立する方が実用的であることに思い至った。即ち、その特定の環境が人体にとって、どの程度有害であるかを調べるのである。そこで、本発明では、このような環境影響評価方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
我々は、メダカを用いたバイオアッセイ試験について、網羅的遺伝子発現解析手法を用いて研究を行い、１）メダカを用いた生態影響試験の客観的信頼性技術２）メダカの雄と雌の遺伝子発現の差異から、いわゆる環境ホルモン活性の評価に利用できる遺伝子の特定、３）環境ホルモン評価に使えない遺伝子は、当該影響以外の影響評価に使えること、以上を開発した。なお、メダカは、平成１６年度に改正された「化学物質の審査及び製造等軒生に関する法律（化審法）」において義務づけられた、生態毒性試験に利用可能な生物種である。メダカの生態毒性試験はＧＬＰ認定を受けた機関がこれを行う事になっている。また、詳細なメダカの飼育法が標準法として提供されている。しかしながら、メダカが標準状態にあるか否かを客観的に判断する手法は存在しないし、規定されていない。
【０００８】
以上のような現状に鑑み、本発明者等は鋭意研究の結果本発明方法を完成したものであり、その特徴とするところは、環境影響評価方法にあっては、メダカを種々の化学物質含有環境で飼育し、表１に記載の１１５６９種のメダカの遺伝子の全部又は１部の発現状況を測定し蓄積データとし、影響未知の環境下でメダカを飼育した際の前記遺伝子の全部又は１部の発現状況を測定し、前記蓄積データと比較することによって該影響未知の環境の影響を評価する点にあり、環境ホルモン活性の評価方法にあっては、雄と雌のメダカを種々の化学物質含有環境で飼育し、表１に記載の１１５６９種のメダカの遺伝子の全部又は１部の発現状況を測定し、雄と雌との蓄積データとし、影響未知の環境下で雄と雌のメダカを飼育した際の前記遺伝子の全部又は１部の発現状況を測定し、雄と雌の測定値の一致程度によって判断する点にあり、環境ホルモン影響以外の影響評価方法にあっては、表１に記載の１１５６９種のメダカの遺伝子から、請求項４記載の性特異遺伝子を除いた性非特異遺伝子のみを用いて請求項１記載の方法を実施する点にある。
【０００９】
ここで、表１に記載の１１５６９種の遺伝子は、すべて使用する必要はなく、現実的な評価には数百程度で十分である。この一部の選択の方法は、ランダムに選んでも、特定の基準で選んでもよい。
【００１０】
まず、種々の化学物質環境下でメダカを飼育する。この時、この環境下での化学物質がすべて特定、同定されている必要はない。勿論、特定、同定されているに越したことはないが、必ずしもそれは必要ではないということである。即ち、必要なことは、その環境がどの程度生物に影響があるか、即ち生物が生きていく上でどの程度の影響を与えるかが分かればよい。これを判定するには、そのメダカの健康状態を調べるだけでよい場合もあるが、同じ環境下でメダカ以外の生物を飼育しそれの健康状態を調べてデータ化してもよい。この健康状態とは、例えば病気の有無、成長程度その他、及び環境データ等である。
【００１１】
メダカの飼育方法も、再現性があればどのような方法でもよい。
【００１２】
このメダカの特定遺伝子の発現状況を調べる方法は通常の方法でよく、特別な方法を用いる必要はない。例えば、ＤＮＡマイクロアレイ法等でよい。
【００１３】
このようにして、種々の環境下でのデータを蓄積しておく。データはグラフ化して視覚に訴えるようにしても、コンピュータにデータ化しておいてもよい。
【００１４】
次に影響が未知の環境下で同様の方法でメダカを飼育する。そして、特定遺伝子の発現状況を調べる。この時、用いる遺伝子は、前記した蓄積されたデータと同じにするのが好ましいが、異なっていてもよい。まったく重複するものがなければ比較のしようがないが、重複している部分があれば、わずかでも比較、評価は可能である。
【００１５】
比較の方法は蓄積データである表の数値を人間が比較して判断しても、コンピュータで比較してもよい。また、蓄積データがグラフ化されている場合には、視覚的にその形状で簡易判定してもよい。また、コンピュータに判定演算プログラムを内蔵し、それによってどのデータに近いかを判定してもよい。
【００１６】
この方法によって、未知の環境が蓄積データのどれに近いかを判断し、そこからこの環境の生態に対する影響を判断する。ここでいう影響とは、生態に対する影響であり、毒性の場合に限らず、良い影響の場合、さらには影響はあるが、それが生態に良い影響か悪い影響か判断できないようなものでもよい。
よって、どのような化学物質が含まれているかを検討するまでもなく、生物（ひいては人間）にどの程度影響があるかを判断することができる。
ここでいう未知の環境は、新規または不明の化学物質が含まれる環境も含むもので、単に毒性や影響を調べるだけでなく、新規物質の構造予想や定量、不明物質の同定や定量ができれば行ってもよい。
【００１７】
このような方法において、同じ環境ならば同じ遺伝子の発現状況が同じ程度であるかどうかを調べた。これが今回の発明の前提であり、これがなりたたなければ、そのような遺伝子は使えないということになる。
これは、同じ環境下で飼育したメダカを多数使用し、それらの遺伝子の発現状況を調べた。勿論、予想とおりほとんど同じであり、同じ環境下では同じ程度発現することが分かった。
【００１８】
次に、蓄積したデータを測定した時と、未知環境での測定とは、時と所を異にするため、そこでデータをより正確に取るため、対照区として、化学物質のない環境下で同時に同じメダカで実験をして、同じ遺伝子の発現状況を調べ、そのデータによって、未知環境での測定結果を補償する。補償の方法は、公知の方法でよい。
【００１９】
請求項３の第３本発明環境ホルモン活性の評価方法について説明する。
この方法は、特定環境下で、雄と雌のメダカを飼育し、その遺伝子の発現状況を調べ、雄と雌の同一性及び差を記録する。そして、未知の環境下での測定において、雄と雌を飼育し同様に遺伝子の発現状況を調べ、蓄積データと比較して雄雌の同一程度（一致程度）を調べて、雄の雌化、雌の雄化を判定する。このことから、環境ホルモンの活性程度を評価する。
【００２０】
ここで、特定環境下でのデータ蓄積時に、雄と雌に発現量の差があるもの又は大きいもの（性特異遺伝子）だけを抽出し、その遺伝子群のみを測定対象としてもよい。
【００２１】
このような性特異遺伝子で環境ホルモンの影響が調べられるが、このような遺伝子以外の遺伝子（性非特異遺伝子）を用いれば、環境ホルモン影響以外の影響が評価できることとなる。即ち、この性非特異遺伝子のみを用いれば、環境ホルモンの影響はまったく反映されない。よって、この性非特異遺伝子に影響が出れば環境ホルモン以外の影響があるということである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明では、未知の環境において、そこに存在する化学物質を逐一特定することなく、その環境の影響の種類や程度、さらには環境ホルモン活性の程度を評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、実施例に従って本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００２４】
まず最初に、前記した再現性について実験した。
１１５６９種類の遺伝子（表１）を指標として、メダカの雄と雌数匹について、ＤＮＡマイクロアレイを用いてその発現強度を調べたところ、雄雌で、表１に示す発現強度の結果が得られた。２匹の個体（雄１，雄２）について、散布図を用いて発現強度を比較すると、図１Ａに示すような結果が得られる。縦軸は雄１の各遺伝子の発現強度、横軸は雄２の発現強度である。この散布図から、雄１と雄２はほとんど同じ程度の発現強度であることがわかる。即ち、同じ環境では同じ遺伝子は同じ程度発現するという証明ができたこととなる。
【００２５】
この時のメダカの生育方法は次の通りであった。
土浦金魚養魚場（茨城県土浦市蓮河原町3786）より購入し、株式会社日本紙パルプ研究所において継代飼育して得られたメダカ（Oryzias latipes）を、水温２４±１℃、明１６時間、暗８時間の光周期に維持し、ブラインシュリンプの孵化幼生を1日2回飽食量給餌した。飼育水には飲料用水道水をPESメンブレンカートリッジ（TCS-E020、ADVANTEC）および活性炭カートリッジフィルター（TCC-WL-SOCP、ADVANTEC）で濾過後、一昼夜以上曝気したものを用いた。飼育水槽中の魚体密度は１００尾／５０Lを超えないようにし、溶存酸素濃度が８０％を下回らないようにエアレーションを行った。また、飼育水槽の換水は週1回の頻度で行った。孵化前のメダカ胚の培養には上記の飼育水ではなくOECD人工調製水を用い、親魚と同様に水温２４±１℃、明１６時間、暗８時間の光周期を維持した。なお、本実験には、孵化後約6ヶ月令の雌雄のメダカを用いた。
【００２６】
核酸の抽出は次の方法によった。
メダカtotalＲＮＡを抽出するには、RNeasy Lipid Tissue Midi Kit(QIAGEN)を使用した。概略手順は以下の様である。メダカ凍結組織(体長約３ｃｍ、体重約４００ｍｇ)を乳鉢中で液体窒素を加えながら粉砕し、粉末の半量を５ｍｌの QIAzol Lysis Reagenに加え、速やかに強く攪拌し、室温で５分置いた。１ｍｌのクロロホルムを加えて１５秒ほど攪拌した後、室温で２〜３分置き、遠心で上清を分離した。この上清に７０％エタノール３ｍｌを加えて良く混合させ、全量をRNeasy Midi Spin Columnに通した。４ｍｌ Buffer RW1、２．５ｍｌ Buffer RPEでカラムを洗浄し、最終的には３００ ulのRNase-free waterでＲＮＡを溶出させた。
【００２７】
メダカtotal ＲＮＡの標識
Eberwine,et al.,PNAS 89:3010,1992の方法に準じて、メダカから抽出したtotal ＲＮＡよりビオチン標識化ｃＲＮＡを得た。すなわち、total ＲＮＡ１０μｇよりＴ７-oligo(dT)をプライマーとし逆転写反応によりｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを作製した。その後、Ｔ７−ＲＮＡポリメレースによりIn Vitro Transcription反応を行いｃＲＮＡを作製した。In Vitro Transcription反応の際に基質としてビオチンを結合したシトシンとウラシルを加えることで、ｃＲＮＡにビオチンを取り込ませ標識を行った。ｃＲＮＡは加水分解により約５０から２００塩基の断片化を行った。
【００２８】
メダカＥＳＴ配列搭載マイクロアレイの合成
マイクロアレイの作製は、米国NimbleGen Systems社のマスクレス光合成ＤＮＡマイクロアレイ作製技術（Maskless Array Synthesizer Technology、以下ＭＡＳ）を用いた。本技術は、Singh-Gasson, et al.,Nat.Biotech.17: 974,1999により開発されたマイクロアレイ作製技術であり、ＵＶ光をDigital Light Processor(Texas Instruments社製)で選択的に制御することで異なる塩基配列のオリゴヌクレオチドをスライドグラス上に合成することができる。スライドグラス上に数十万単位の配列の異なるオリゴヌクレオチドを合成することで、網羅的遺伝子発現を検出するためのＤＮＡマイクロアレイの作製が可能である。
【００２９】
今回、メダカのＥＳＴに基づくマイクロアレイの作製に当たり、設計の基本情報となるＥＳＴの塩基配列は、米国ＴＩＧＲ(The Institute for Genomic Reseach)に登録されている情報を使用した。２００３年５月１６日時点で、ＴＩＧＲに登録されているＥＳＴのユニーク配列は２２５８７種類である。これらのＥＳＴ塩基配列情報を基に、６０塩基数を単位として各ＥＳＴ特有な塩基配列部分を１ＥＳＴに対して４種類選択した。選択したＥＳＴ特有な塩基配列をＭＡＳでスライドグラス上にオリゴヌクレオチド合成を行った。最終的にメダカＥＳＴ配列搭載マイクロアレイとして、２２５８７種類のＥＳＴに対し１ＥＳＴ当り４種類の６０塩基配列を２組、スライドグラスに総計１８６９６本の６０塩基のオリゴヌクレオチド（以下プローブ）を合成した。
【００３０】
ハイブリダイゼーション
メダカＥＳＴ配列搭載マイクロアレイ上のプローブと断片化したビオチン標識ｃＲＮＡのハイブリダイゼーションは以下の条件で行った。断片化したビオチン標識ｃＲＮＡ１０μｇを含む４０％フォルムアミド溶液をマイクロアレイと接触させ４２℃、１４〜１６時間インキュベーションした。その後、スライドガラスを洗浄し、ストレプトアビジン−ｃｙ３を室温で２５分間反応させ、マイクロアレイ上のプローブに結合した断片化したビオチン標識ｃＲＮＡにさらにｃｙ３を結合させた。
【００３１】
マイクロアレイのスキャンニングとデータ化
ハイブリダイゼーション後のマイクロアレイは、DNAマイクロアレイスキャナーGenePix 4000B(Axon Instruments社製)にて、マイクロアレイ上のｃｙ３による蛍光強度を測定し数値化処理を行った。各ＥＳＴの遺伝子発現強度は、１ＥＳＴ当り４種類のプローブの発現強度の平均値とした。
【００３２】
次に発明環境ホルモン活性の評価方法について実験した。
１１５６９種類の遺伝子（表１）について、雄と雌を比較したものが図１Ｂである。縦軸は雌１の各遺伝子発現強度、横軸は雄１の各遺伝子発現強度である。また、図１Ｃは、同様に雌同士を比較したものである。このことから、雄１と雌１は、雄１と雄２、雌１と雌２に比べると、相関性の低いことが分かる。この分散している結果は、雄特有に発現している遺伝子、雌特有に発現している遺伝子を反映したものである。そこで、t検定を行い、雄特有の遺伝子（表２）、雌（表３）特有の遺伝子を特定した。これらの遺伝子は、特異遺伝子として、雄の雌化、雌の雄化の評価に用いることができる。究極的には、雄の網羅的遺伝子発現解析結果が、雌の網羅的遺伝子発現解析との相関係数が１となったときに、完全な雌化と判断することができる。
【００３３】
次に、環境ホルモン評価に使えない遺伝子を用いた、環境ホルモン影響以外の影響評価について実験した。
エストラジオールをメダカに暴露すると、雄の雌化が起こることは広く知られている。表４には、エストラジオール処理により、誘導される雌特異的遺伝子を示した。この誘導は、エストラジオールの環境ホルモン活性を示している。また、雄特異的遺伝子について、その抑制が観察されており、抑制された遺伝子を表５で示した。これも、エストラジオールの環境ホルモン活性を示している。一方、雄または雌で特異的に発現されない遺伝子（雄と雌で同程度の発現をしている遺伝子）についてもその誘導と抑制が認められている。これは、エストラジオール過剰暴露による毒性を反映したものと考えられ、共通に発現する遺伝子（雄特異的、雌特異的ではない遺伝子）は、環境ホルモン毒性以外の毒性試験に指標して利用できることを示している。
【００３４】
エストラジオールの処理条件は次の通りであった。
３Ｌのガラスビーカーに活性炭フィルター濾過水２Ｌとエストラジオールストック溶液（２０μｇ／ml in 100% DMSO）１０μＬを加えよく攪拌した。その溶液に７匹のオスメダカを入れ、エアレーションを行った。エサは孵化後２４時間以内のアルテミア幼生を適量一日二回与え、余分なエサは適宜取り除いた。溶液は一日一回同様にして全て交換した。エストラジオール暴露開始後２１日目に３〜４匹の魚を液体窒素で瞬間凍結し、ＲＮＡの調製を行うまで−８０℃のフリーザーで保存した。
【００３５】
【表１−１】
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【００３６】
【表１−２】
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【００３７】
【表１−３】
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【００３８】
【表１−４】
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【００３９】
【表１−５】
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【００４０】
【表１−６】
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【００４１】
【表１−７】
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【００４２】
【表１−８】
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【００４３】
【表１−９】
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【００４４】
【表１−１０】
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【００４５】
【表１−１１】
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【００４６】
【表１−１２】
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【００４７】
【表１−１３】
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【００４８】
【表１−１４】
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【００４９】
【表１−１５】
2006246739.tif 000017
【００５０】
【表１−１６】
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【００５１】
【表１−１７】
2006246739.tif 000019
【００５２】
【表１−１８】
2006246739.tif 000020
【００５３】
【表１−１９】
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【００５４】
【表１−２０】
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【００５５】
【表１−２１】
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【００５６】
【表１−２２】
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【００５７】
【表１−２３】
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【００５８】
【表１−２４】
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【００５９】
【表１−２５】
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【００６０】
【表１−２６】
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【００６１】
【表１−２７】
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【００６２】
【表１−２８】
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【００６３】
【表１−２９】
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【００６４】
【表１−３０】
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【００６５】
【表１−３１】
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【００６６】
【表１−３２】
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【００６７】
【表１−３３】
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【００６８】
【表１−３４】
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【００６９】
【表１−３５】
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【００７０】
【表１−３６】
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【００７１】
【表１−３７】
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【００７２】
【表１−３８】
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【００７３】
【表１−３９】
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【００７４】
【表１−４０】
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【００７５】
【表１−４１】
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【００７６】
【表１−４２】
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【００７７】
【表１−４３】
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【００７８】
【表１−４４】
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【００７９】
【表１−４５】
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【００８０】
【表１−４６】
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【００８１】
【表１−４７】
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【００８２】
【表１−４８】
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【００８３】
【表１−４９】
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【００８４】
【表１−５０】
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【００８５】
【表１−５１】
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【００８６】
【表１−５２】
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【００８７】
【表１−５３】
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【００８８】
【表１−５４】
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【００８９】
【表１−５５】
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【００９０】
【表１−５６】
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【００９１】
【表１−５７】
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【００９２】
【表１−５８】
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【００９３】
【表１−５９】
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【００９４】
【表１−６０】
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【００９５】
【表１−６１】
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【００９６】
【表１−６２】
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【００９７】
【表１−６３】
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【００９８】
【表１−６４】
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【００９９】
【表１−６５】
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【０１００】
【表１−６６】
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【表３−１】
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【表３−１７】
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【表３−１８】
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【０３７０】
【表３−１９】
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【０３７１】
【表３−２０】
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【０３７２】
【表３−２１】
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【０３７３】
【表３−２２】
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【０３７４】
【表３−２３】
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【０３７７】
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【表３−２７】
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【０３７９】
【表３−２８】
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【０３８０】
【表３−２９】
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【０３８１】
【表３−３０】
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【０３８２】
【表３−３１】
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【０３８３】
【表３−３２】
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【０３８４】
【表３−３３】
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【０３８５】
【表３−３４】
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【０３８６】
【表３−３５】
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【０３８７】
【表４−１】
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【０３８８】
【表４−２】
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【０３８９】
【表４−３】
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【０３９０】
【表４−４】
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【０３９１】
【表５−１】
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【０３９２】
【表５−２】
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【図面の簡単な説明】
【０３９３】
【図１】遺伝子の発現強度を示すグラフである。
【図１】
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