(57)【要約】【課題】    簡便に効率的に、検査者の熟練を要することなくFISH検査が可能になる、FISH用細胞標本の作製方法を提供すること。【解決手段】  FISH用細胞標本の作製方法は、被検細胞を(1)パラホルムアルデヒドで処理する工程と、次に (2)低張処理する工程と、次に(3)脱水固定する工程とを含む。【効果】  本発明により、簡便に効率的に、検査者の熟練を要することなくFISH検査が可能になる、FISH用細胞標本の作製方法が提供された。本発明の方法により作製した標本は、好中球の分葉核が破壊されず、均一に細胞の重なりが無く固定され、また、細胞も充分な広がりを有し、FISH検査のための良好な標本である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検細胞を(1)パラホルムアルデヒドで処理する工程と、次に (2)低張処理する工程と、次に(3)脱水固定する工程とを含む、FISH用細胞標本の作製方法。
【請求項２】
前記(1)工程は、パラホルムアルデヒドの0.2%〜1%水溶液で被検細胞を処理することにより行なう請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記(3)工程は、低張処理後の被検細胞を、メタノール又はエタノールと酢酸の混合液で処理することにより行なう請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記被検細胞が好中球及び／又はリンパ球である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記被検細胞が好中球である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記被検細胞及び被検細胞以外の細胞を含む試料に対して前記(1)工程を行い、前記(2)工程の前に被検細胞を分取する工程をさらに含む請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記(2)工程の後、１又は複数の試料由来の被検細胞を、１枚のプレートに設けられ、整列された複数のウェルに入れ、該各ウェル内において前記(3)工程を行なう請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記整列した複数のウェルのうちの一部に被検細胞である好中球を入れ、他のウェルに被検細胞であるリンパ球を入れる請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ウェルは、平面基板上に、複数の整列された透孔を有する可撓性パッドを載せることにより形成されたものである請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
前記平面基板がガラス板であり、前記可撓性パッドがシリコーンゴムから成る請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、FISH用細胞標本の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
FISH(fluorescence in situ hybridization)は、蛍光標識された核酸プローブを、細胞や染色体の形態を保ったまま、染色体DNAを露出させた試料とハイブリダイズさせて、直接的に標的遺伝子の座位や分布状況を蛍光顕微鏡下で観察する手法である。好中球に対してFISHを行う好中球FISH検査は、慢性骨髄性白血病の診断、IFN‐α療法及びグリベック(GLIVEC(STI571))等の分子標的療法などのモニタリングのために広く用いられている検査である（非特許文献１〜３）。
【０００３】
従来の末梢血好中球FISH用標本作製方法は、EDTA採血された静脈血をリン酸緩衝液(PBS)で希釈して硫酸デキストランで赤血球層を除き、上清をFicoll比重遠心法で分離し、好中球層をPBSで洗浄した後、サイトスピンを用いて標本を作製する（非特許文献３、４）。
【０００４】
【非特許文献１】Takahashi N, et al : Lineage Involvement of Stem Cells Bearing the Philadelphia Chromosome in Chronic Myeloid Leukemia in the Chronic Phase as Shown by a Combination of Fluorescence-Activated Cell Sorting and Fluorescence in Situ Hybridizatin. Blood 92:4758-4763-1998
【非特許文献２】Miura I, et al : Molecular Cytogenetics of Stem Cell : Target Cells of Chromosome Aberrations as Revealed by the Application of Fluorescence In Situ Hybridization to Fluorescence-Activated Cell Sortion. Int J Haematol. 72:310-317,2000
【非特許文献３】高橋直人、三浦偉久男：CML分子マーカーの臨床応用 FISH法を用いたINF-α療法の治療効果モニタリング。臨床血液41：272-274、2000
【非特許文献４】検査と技術28 : 1343, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の好中球FISH検査は、操作が煩雑であり、また、好中球に特徴的な分葉核が破壊され易いため、好中球を識別するのに検査者の熟練を要するという問題がある。
【０００６】
本発明の目的は、簡便に効率的に、検査者の熟練を要することなくFISH検査が可能になる、FISH用細胞標本の作製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者は、鋭意研究の結果際、被検細胞をパラホルムアルデヒド処理し、次いで、低張処理及び脱水固定処理を行なうことにより、好中球の分葉核を壊すことなく、均一に細胞の重なりが無く固定が可能であり、また、細胞も充分な広がりを有し、FISH検査のための良好な標本が作製できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、被検細胞を(1)パラホルムアルデヒドで処理する工程と、次に (2)低張処理する工程と、次に(3)脱水固定する工程とを含む、FISH用細胞標本の作製方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、簡便に効率的に、検査者の熟練を要することなくFISH検査が可能になる、FISH用細胞標本の作製方法が提供された。本発明の方法により作製した標本は、好中球の分葉核が破壊されず、均一に細胞の重なりが無く固定され、また、細胞も充分な広がりを有し、FISH検査のための良好な標本である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の方法に供される被検細胞は、FISH検査用の被検細胞であれば特に限定されないが、好中球及びリンパ球が好ましい。特に、本発明の方法は、好中球の分葉核を破壊しないという顕著な効果を奏するので、被検細胞としては好中球が特に好ましい。
【００１１】
本発明の方法では、先ず、(1)被検細胞をパラホルムアルデヒドで処理する。パラホルムアルデヒドとしては、組織標本の固定に常用されているパラホルムアルデヒドを用いることができる。パラホルムアルデヒドは、希薄水溶液、好ましくは、0.2%〜1%(v/v)、特に好ましくは約0.5%(v/v)濃度の水溶液の形態にあることが好ましい。なお、水溶液は、パラホルムアルデヒドの他に緩衝剤を含んでいることが好ましい。パラホルムアルデヒド処理の温度は特に限定されず、室温下で行なうことが簡便で好ましい。処理時間は、特に限定されないが、５分間〜２０分間程度、特に約１０分間程度が好ましい。また、パラホルムアルデヒド水溶液の使用量は、特に限定されないが、細胞の体積に対して500倍〜20000倍程度が適当である。
【００１２】
上記(1)パラホルムアルデヒド処理は、全血等から被検細胞を分取し、分取した被検細胞に対して行なってもよいし、被検細胞及び被検細胞以外の細胞を含む試料に対してパラホルムアルデヒド処理を行ない、後の工程で被検細胞を分取してもよい。下記実施例では、全血から赤血球を除去したものに(1)ホルムアルデヒド処理を行ない、その後、好中球及びリンパ球を分取している。
【００１３】
被検細胞及び被検細胞以外の細胞を含む試料に対してパラホルムアルデヒド処理を行なった場合には、次の(2)低張処理に先立ち、被検細胞を分取することが好ましい。被検細胞の分取を(2)低張処理よりも後にすると、セルソーターを用いた分取の精度が低下する傾向があるので、被検細胞の分取は(2)低張処理よりも先に行なうことが好ましい。被検細胞の分取方法自体は、この分野において周知であり、セルソーター、特にFACS(fluorescence activated cell sorter)による方法が好ましい。FACSの手法はこの分野において周知であり、また、FACS装置も市販されているので、FACSは市販の装置を用いて容易に行うことができる。なお、FACSを行なう場合、被検細胞が発現する特異抗原に対する蛍光標識抗体で被検細胞を標識する必要がある。例えば、好中球をFACSで分取する場合には、蛍光標識した抗CD16b抗体等が用いられ、また、リンパ球をFACSで分取する場合には、抗CD19抗体や抗CD3抗体等が用いられる。これらの蛍光標識抗体も市販されているので、市販品を用いることができる。被検細胞と蛍光標識抗体とは、分取工程前のいずれの段階で反応させてもよく、(1)工程の前に反応させてもよい。下記実施例では、(1)工程の前の全血の段階で蛍光標識抗体を作用させている。
【００１４】
次に(2)低張処理工程を行なう。低張処理とは、細胞を低張液、すなわち、生理食塩水よりも浸透圧の低い液で処理することである。低張液としては、特に限定されないが、塩化カリウム、クエン酸ソーダ等の塩の水溶液を好ましく用いることができる。塩濃度は、特に限定されないが、0.05M〜0.1M程度が好ましく、特に約0.075Mが好ましい。低張処理の温度は特に限定されず、室温下で行なうことが簡便で好ましい。処理時間は、特に限定されないが、５分間〜２０分間程度、特に約１０分間程度が好ましい。低張液の量は、特に限定されないが、通常、細胞の体積の50000倍〜2000000倍程度用いられる。低張処理することにより、被検細胞をよく広げることができ、蛍光シグナルが重なることに起因する偽陽性を防止することができる。
【００１５】
次に被検細胞を基体上に置き、(3)脱水固定処理を行なう。ここで、基体としては、従来法と同様にスライドガラス等のガラス板を用いることができる。１つの試料を１枚のスライドガラス上に載せて(3)脱水固定処理を行なうことも可能であるが、本発明の方法の好ましい態様では、被検細胞を、１枚のプレートに設けられ、整列された複数のウェルに入れ、該各ウェル内において(3)工程を行なうことが好ましい。複数のウェルには１又は複数の試料由来の被検細胞を入れることができるが、検査の効率向上及び低コスト化のためには、複数の試料由来の被検細胞を入れることが好ましい。すなわち、１枚の基板上に設けられた複数のウェルに複数の試料を入れると、FISHのハイブリダイゼーション工程を、複数のウェルに収容された複数の試料について同時に行うことができるので、検査の効率が向上し、また、試料当りのコストも低減される。さらに、整列したウェルに被検細胞を入れることにより、検査の半自動化も容易になる。すなわち、蛍光顕微鏡下で任意に設定した範囲内で細胞を自動的にその座標と画像を取り込む画像解析システムが市販されている。試料毎に標本を乗せかえる必要が無くある狭い領域に多試料を整列化することができれば、検査員は記憶されている座標と画像を瞬時に呼び出し細胞上のシグナルをカウントして陽性比率を算出することができる。また、必要な画像をそのまま検査の依頼主に報告することができる。
【００１６】
ウェルのサイズは、特に限定されないが、直径1mm〜3mm程度が適当であり、特に直径約2mmが好ましい。また、高さは、0.1mm〜1.0mm程度が適当であり、特に約0.1mmが好ましい。また、ウェルとウェルの間の間隔は、特に限定されないが、1mm〜2mm程度が好ましい。このようなウェルは、スライドガラスを切削することによっても形成することができるが、平面基板上に、複数の整列された透孔を有する可撓性パッドを載せることにより、より簡便で低コストにウェルの形成することができる。すなわち、透孔の下に位置する平面基板がウェルの底面となり、透孔の側壁がウェルの側壁となる。可撓性パッドとしては、シリコーンゴムのパッドが好ましいがこれに限定されるものではない。可撓性パッドを基板に指で強く押し付ければ、被検細胞を含む液をウェルに入れてもウェルから液が漏れ出すことはない。複数のウェルが整列された基板の好ましい１例を図１に示す。図１中、１０がスライドガラス、１２がシリコーンゴムのパッド、１４（合計１６個の円）が、シリコーンゴムパッドに開けられた直径2mmの透孔（ウェル）である。もちろん、ウェルの個数や配列は図１の例に限定されるものではない。各ウェルに収容する被検細胞の数は、特に限定されないが２０００〜３０００細胞程度が好ましい。
【００１７】
慢性骨髄性白血病の診断のためにFISH検査を行う場合には、好中球とリンパ球のそれぞれについてFISHを行い、慢性骨髄性白血病に特有のフィラデルフィア(Ph)染色体が陽性の細胞の率を測定する。この場合、上記した複数のウェルの一部に好中球を入れ、他の一部のウェルにリンパ球を入れて同時に観察することが簡便でかつ検査の精度も向上するので好ましい。例えば、図１に示す複数のウェルの上段の８個のウェルに８つの検体由来の好中球を入れ、下段の８個のウェルにはこれらの好中球が由来する８つの検体から採取したリンパ球をそれぞれ入れることができる。慢性白血病は臨床的に急性転化を起こしてくる。所謂、急性リンパ性白血病と同じ臨床症状を取ることになる。リンパ球を整列することにより、大別して骨髄性（Myeloid系）への急性転化を起こしたのかリンパ性への急性転化を示したのかを知ることができる。この方法では、リンパ球として、T,B細胞をそれぞれ分取して整列化するとTリンパ性あるいはBリンパ性の急性転化であるのか、さらに詳細な情報を得ることができる。
【００１８】
なお、ウェルの使用は、必ずしも必要ではなく、１枚の基板上に、オートスポッターを用いて、複数の試料の被検細胞をスポットすることができる。例えば、(2)低調処理後、遠心して上清を除去して3μｌとし、0.7μｌづつスライドガラス上に展開する。このことにより、ちょうど直径2mmのスポットを作製することができる。
【００１９】
(3)脱水固定処理自体は、従来の組織標本作製と同様に行うことができる。すなわち、メタノールやエタノールのような水と任意の割合で混じり合う有機溶媒で処理することにより行うことができる。もっとも、ホルマリンは、染色体DNAを破壊する恐れがあるので用いないことが好ましい。細胞膜のタンパク質を破壊して、後のFISHにおいてプローブが細胞内に入りやすくするために、該有機溶媒に酢酸を配合することが好ましく、組織標本の作製に広く用いられているカルノア溶液（メタノール：酢酸＝３：１(v/v)混合液）を特に好ましく用いることができる。脱水固定処理の温度は特に限定されず、室温下で行なうことが簡便で好ましい。処理時間は、特に限定されないが、５分間〜２０分間程度、特に約１０分間程度が好ましい。処理の方法は、特に限定されないが、例えば基板ごと有機溶媒に浸漬することにより行うことができる。
【００２０】
上記のようにして作製されたFISH用細胞標本は、従来のFISH用細胞標本と同様にして、周知のFISH法に付すことができる。
【００２１】
本発明の方法又は上記した好ましい態様は、次のような利点を有する。
１）検査精度が向上する。
検査者の技能によらない客観的データを得ることができる。また、リンパ球を被検細胞とした標本も併せて作製することにより、リンパ性急性転化への移行を正確に判定できる。
２）高付加価値報告が可能となる。
スキャッターグラム(Scattergram)とFISH画像をともに検査依頼主に添付報告することにより、末梢血液検体の全体像が把握できより客観的なデータ解釈が可能となる。
３）分析工数の削減が可能となる。
血液細胞の中から、分葉核細胞を見つけ出して分析する必要がなく、容易にPh染色体陽性比率を算出することができる。
４）FISHの自動化が可能となる。
CD16ｂでソートした好中球細胞とリンパ球細胞を直径２ｍｍ円内にスポット整列化するため、FISH画像解析の半自動化が容易となる。また、本方法は、好中球SORTER FISHのみならず、すべてのSORTER FISHに応用可能である。 
５）検査原価を抑えることができる。
ソーターFISH[CD16ｂ（好中球） FISH]の場合、図１のウェルを用いれば８検体をまとめてハイブリダイゼーションが可能となるため、使用プローブの原価を１/８に削減できる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２３】
I.  材料及び方法
１．好中球分画のScattergram解析
１）抗凝固剤へパリン採血した血液を用いて、採血後の好中球分画の変化をScattergram解析した。
２）へパリン採血後、室温に放置して48時間および72時間後のScattergramを比較した。
【００２４】
2. 低調処理のタイミングと固定方法の選択
１）0.075MKCLによる低調処理を固定の前後で検討した。
２）固定方法について、カルノア、0.5％パラホルムアルデヒド/PBS、及び、ホルマリン固定について比較検討を行った。
【００２５】
3.  プロトコル（本発明の方法の実施例）
１）スピッツ試験管に抗CD16ｂ抗体を5μｌ入れる。
２）全血100μｌを試験管に加え、室温で15分間インキュウベートする。（暗室で）
３）塩化アンモニウム溶血剤を10ml加え、10分間インキュウベートする。（室温、暗室で）
４）スイングローター遠心機を用いて、1500rpmで遠心して上清を除去する。この時、スピッツ管を斜めにして赤血球の残渣を完全に吸引する。
５）PBSを5ml加え細胞を洗浄する。
６）1500rpmで遠心して上清を除去する。この時も、スピッツ管を斜めにして赤血球の残渣を完全に吸引する。
７）0.5％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業社製組織固定用パラホルムアルデヒド）/PBS固定液を500μｌ加え攪拌し、室温で10分間放置する。
８）FACS用試験管に細胞を移し替える。
９）FACSで各細胞分画（好中球、リンパ球など）をソートする。約10000細胞（100〜200μｌ）。
１０）分取した細胞に等量の0.075MKCLを加え室温で10分間低調処理を行う。
１１）遠心して上清を除去し約4μｌとする。
１２）マツナミ白緑磨フロスト（MSAコート付）スライドガラス上にシリコンゴムパッドをスライドガラス上に置き、ゴムパッドとスライドガラスとの間の空気を抜いて密着させる。
１３）シリコンパッドを置いた白緑磨フロスト（MSAコート付）スライドガラス上に1μｌ滴下して風乾する。
１４）スライドガラス上にCD16ｂ好中球、リンパ球をそれぞれ整列化してスポット固定する。この時、1スポットあたり約2000細胞となるように調整する。
１５）風乾した整列化標本をカルノア（メタノール：酢酸＝３：１）溶液に浸し再度10分固定を行う。
１６）風乾してFISH法に用いる。
【００２６】
II.  結果
1. 好中球分画のScattergram解析
1）抗凝固剤へパリン採血した血液を用いて、採血後の好中球分画の変化をScattergram解析した。その結果、採血48時間後の単核球中の好中球及びリンパ球の分画は、好中球が30％、リンパ球が19.8%であった。採血72時間後の分画では、好中球が4.6％、リンパ球が27.1%であった。このことから、採血後の末梢血中の好中球は急速に破壊されることが判明した。したがって、好中球FISHは、採血後少なくとも48時間以内に標本を作製する必要があることが示唆された。
２）そこで、採血後48時間以内のへパリン採血した末梢血液を用いて、SORTER  FISH標本作製方法を開発した。48時間以内のへパリン採血した末梢血液であれば、血液量100μｌから充分に必要な10000細胞以上の好中球及びリンパ球を短時間でFACSソート分取することができた。
【００２７】
2. 低調処理のタイミングと固定方法の選択
１）低調処理をFACSソート前に行うと正確なScattergram解析ができなくなるため、ソート後に低調処理を行った。分取細胞の液量と等量の0.075M KCLを加え室温で10分間低調処理を行った。
２）染色体標本作製と同様なカルノア溶液での固定は、細胞の拡散によるコンタミネーションの危険性から整列化標本の作製には不向きであることが判明した。また、ホルマリンでの固定は、細胞内核酸の破壊につながるため採用しなかった。固定は、まず、FACSソート前に0.5％パラホルムアルデヒド/PBS固定液で室温10分間弱めに固定し風乾した整列化標本をカルノア（メタノール：酢酸＝３：１）溶液に浸し再度10分固定を行うことで良好な標本を作製することができた。すなわち、分葉核を壊すことなく均一に細胞の重なりが無く固定が可能であった。また、細胞も充分な広がりを持っていた。
【００２８】
3. 標本の作製プロトコルの確立
上記の低調処理のタイミングと固定方法の選択から、上記I.材料と方法の項の３に記載したプロトコルを確立した。また、整列化標本を作製するため、図１に示すシリコーンゴムパッドを使用した。このシリコーンゴムパッドを使用することにより、細胞のコンタミネーションを防止して標本を作製することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の好ましい態様において用いられる、被検細胞を収容する複数のウェルを、スライドガラス上にシリコーンゴムパッドを載せることにより形成した状態を示す図である。
【符号の説明】
【００３０】
１０  スライドガラス
１２  シリコーンゴムパッド
１４  シリコーンゴムパッドの透孔（ウェル）
【図１】
2006242588.tif 000003