(57)【要約】【課題】  必要十分量を低侵襲的かつ簡便に安定供給でき、細胞移植に際して拒絶反応の問題がなく、骨、軟骨、骨格筋、脂肪などの間葉系細胞、血管内皮細胞、心筋細胞、神経細胞など多種類の細胞へと分化する能力を有する多能性細胞や、かかる多能性細胞から分化誘導された間葉系細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、神経細胞や、これらを有効成分とする治療剤・治療方法を提供すること。【解決手段】  末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィブロネクチンでコートしたプラスチックプレート上で７〜１０日間培養し、出現する線維芽細胞様形態を呈する細胞群は循環ＣＤ１４＋単球由来で、ＣＤ１４＋ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋Ｉ型コラーゲン＋という独特のフェノタイプを有し、特定の培養条件により骨、軟骨、骨格筋、脂肪などの間葉系細胞、血管内皮細胞、心筋細胞、神経細胞へと分化する能力を有する。 【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球に由来し、ＣＤ１４とＣＤ３４とを発現する単球由来多能性細胞。
【請求項２】
単球に由来し、ＣＤ１４とＣＤ３４とＣＤ４５とＩ型コラーゲンとを発現する単球由来多能性細胞。
【請求項３】
間葉系組織へと分化誘導する条件下での培養により、間葉系細胞に分化しうることを特徴とする請求項１又は２記載の単球由来多能性細胞。
【請求項４】
間葉系細胞が、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞であることを特徴とする請求項３記載の単球由来多能性細胞。
【請求項５】
培養心筋細胞との共培養等の心筋へと分化誘導する条件下での培養により、心筋細胞に分化しうることを特徴とする請求項１又は２記載の単球由来多能性細胞。
【請求項６】
培養神経細胞との共培養等の神経へと分化誘導する条件下での培養により、神経細胞に分化しうることを特徴とする請求項１又は２記載の単球由来多能性細胞。
【請求項７】
血管内皮細胞を維持する条件下での培養等の血管内皮へと分化誘導する条件下での培養により、血管内皮細胞に分化しうることを特徴とする請求項１又は２記載の単球由来多能性細胞。
【請求項８】
中胚葉系細胞に分化しうることを特徴とする請求項１又は２記載の単球由来多能性細胞。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか記載の単球由来多能性細胞を間葉系組織へと分化誘導する条件下で培養することにより誘導された間葉系前駆細胞、間葉系細胞又は間葉系組織。
【請求項１０】
間葉系細胞が、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞であることを特徴とする請求項９記載の間葉系前駆細胞、間葉系細胞又は間葉系組織。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか記載の単球由来多能性細胞を培養心筋細胞との共培養等の心筋へと分化誘導する条件下での培養により誘導された心筋前駆細胞、心筋細胞又は心筋組織。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか記載の単球由来多能性細胞を培養神経細胞との共培養等の神経へと分化誘導する条件下での培養により誘導された神経前駆細胞、神経細胞又は神経組織。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか記載の単球由来多能性細胞を血管内皮細胞を維持する条件下での培養等の血管内皮へと分化誘導する条件下での培養により誘導された血管内皮前駆細胞、血管内皮細胞又は血管内皮組織。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか記載の単球由来多能性細胞から分化・誘導された中胚葉系前駆細胞、中胚葉系細胞又は中胚葉系組織。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか記載の単球由来多能性細胞、並びに／又は、前記単球由来多能性細胞から分化・誘導された中胚葉系前駆細胞、中胚葉系細胞及び／若しくは中胚葉系組織を有効成分とする治療剤。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか記載の単球由来多能性細胞、並びに／又は、前記単球由来多能性細胞から分化・誘導された神経前駆細胞、神経細胞及び／若しくは神経組織を有効成分とする治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系細胞、心筋細胞、血管内皮細胞等の中胚葉系細胞や神経細胞に分化しうるＣＤ１４+及びＣＤ３４+の単球由来多能性細胞や、該単球由来多能性細胞から分化誘導された間葉系細胞、心筋細胞、血管内皮細胞等の中胚葉系細胞・組織と神経細胞・組織や、これらを有効成分とする治療剤や、これらを投与する治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
末梢血単球は骨髄造血幹細胞に由来し、マクロファージ、樹状細胞、破骨細胞、中枢神経系の小グリア細胞、肝臓のクッパー細胞等の数種の食細胞に分化することが知られている（例えば、非特許文献１〜４参照。）。単球の各種食細胞への分化は、種々の成長因子からのシグナリングによって調節されている。すなわち、マクロファージへの分化はＭ−ＣＳＦ、樹状細胞への分化はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、破骨細胞への分化はＮＦリガンドの受容体活性因子（ＲＡＮＫＬ）やＭ−ＣＳＦ（例えば、非特許文献２、３、５参照。）からのシグナリングによってそれぞれ調節されている。つい最近まで単球の分化能は、組織食細胞に限定的であると考えられてきた。しかし近年の研究成果から、種々の血管由来因子を組合わせた条件下でのインビトロ培養を行うことにより、ヒト単球が血管内皮様細胞へと分化する能力を示すことが明らかになった（例えば、非特許文献６、７参照。）。さらに、肉芽腫のインビトロモデルにおける単球分化プロセスにおいて骨特異的アルカリフォスファターゼが発現されることが報告さている（例えば、非特許文献８参照。）。しかし、単球の分化能は、まだ完全に解明されておらず、単球が食細胞以外の細胞型への分化能を有しているかどうかはよく知られていなかった。
【０００３】
他方、多くの成人組織には、自己複製能、及び不可逆的最終分化を遂げる娘細胞産生能を有する幹細胞群が存在していることが明らかになっている（例えば、非特許文献９参照）。最も特徴づけが進んでいるのが造血幹細胞とその子孫細胞であるが、幹細胞は、間葉系、神経、及び造血幹細胞等、殆どの臓器において同定されている（例えば、非特許文献１０〜１２参照。）。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄における接着線維芽様細胞として同定されており、骨、軟骨、脂肪、筋肉、及び骨髄間質等の間葉組織系統への分化能を有している（例えば、非特許文献１０参照。）。ＭＳＣと似た形態及びフェノタイプ上の特徴並びに分化能を有する間葉系前駆細胞が、臍帯血（例えば、非特許文献１３参照。）、及び胎児（例えば、非特許文献１４参照。）や成人（例えば、非特許文献１５参照。）の末梢血において、著しく低頻度ではあるが存在していることが近年報告されている。しかし、ＭＳＣ及び循環ＭＳＣ様細胞においては、各種造血幹マーカー及び幹細胞／血管内皮マーカーＣＤ３４が発現されることはない（例えば、非特許文献１０、１３〜１５参照。）。
【０００４】
上記のように、組織再生における将来的な治療的介入に対する供給源候補として、種々の出生後の組織特異的幹細胞及び胚幹（ＥＳ）細胞の分析が現在進められている（例えば、非特許文献９参照。）。骨形成不全症のヒト小児の場合（例えば、非特許文献１６参照。）と同様に動物モデルへ骨髄由来ＭＳＣを移植すると、かかるＭＳＣが多くの臓器に移入し、組織特異的系統に従って分化することが報告されている（例えば、非特許文献１７、１８参照。）。しかしＭＳＣは、ヒト成人骨髄では、稀少細胞群であり（０．０１％〜０．００１％）、再生治療に十分数量のＭＳＣを増殖させることは、技術的に困難であり、高価であり、また長時間を要するものであった（例えば、非特許文献１９参照。）。ＥＳ細胞は胚芽細胞由来の多分化能細胞であり、インビトロで未分化のまま無限増殖することができ、インビボで殆どの細胞型へと分化誘導される（例えば、非特許文献２０参照。）。ＥＳ細胞はヒトから単離されたものだが、研究や治療に用いる際には倫理上の問題という足枷がある（例えば、非特許文献２１参照。）。
【０００５】
出生後のヒト末梢血における血管内皮細胞（例えば、非特許文献２２参照。）、平滑筋細胞（例えば、非特許文献２３参照。）、及び間葉系細胞（例えば、非特許文献１５参照。）等の血管内皮あるいは間葉系細胞型への分化能をもつ前駆細胞が数種類、報告されている。内皮前駆細胞及び平滑筋前駆細胞をインビトロで増殖させるためには、成長因子をいくつか組み合わせて用いることが必要である（例えば、非特許文献２２、２３参照。）。間葉系前駆細胞は、外因性成長因子不在下における２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加培地での増殖が可能であるが、ＰＢＭＣ培養における間葉系前駆細胞の発生は、ＣＤ１４+細胞の除去によって影響されないことが報告されている（例えば、非特許文献１５参照。）。しかし、これら血管内皮あるいは間葉系前駆細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３４及びＩ型コラーゲンに対して陽性というフェノタイプ上の特徴を有していない。
【０００６】
【非特許文献１】Bioessays, 17, 977-986, 1995
【非特許文献２】Blood, 98, 2544-5254, 2001
【非特許文献３】BMC Immunol., 3, 15, 2002
【非特許文献４】Microsc Res Tech., 39, 350-364, 1997
【非特許文献５】J Exp Med., 190, 1741-1754, 1999
【非特許文献６】Differentiation, 65, 287-300, 2000
【非特許文献７】Cardiovascular Res., 49, 671-680, 2001
【非特許文献８】Immunobiology, 202, 68-81, 2000
【非特許文献９】Science, 287, 1442-1446, 2000
【非特許文献１０】Science, 284, 143-147, 1999
【非特許文献１１】Science, 287, 1433-1438, 2000
【非特許文献１２】J. Hepatol., 29, 676-682, 1998
【非特許文献１３】Br. J. Haematol., 109, 235-242, 2000
【非特許文献１４】Blood, 98, 2396-2402, 2001
【非特許文献１５】Arthritis Res., 2, 477-488, 2000
【非特許文献１６】Nat. Med., 5, 309-313, 1999
【非特許文献１７】Nat. Med., 6, 1282-1286, 2000
【非特許文献１８】Science, 279, 1528-1530, 1998
【非特許文献１９】Stem Cells, 19, 180-192, 2001
【非特許文献２０】Trends Biotechnol., 18, 53-57, 2000
【非特許文献２１】Science, 287, 1397, 2000
【非特許文献２２】Science, 275, 964-967, 1997
【非特許文献２３】Circulation, 106, 1199-1204, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在の医学に残された大きな課題は疾患、外傷などによる臓器の欠失や機能障害の克服といわれている。このような状態に対する治療として現時点で施行しうる唯一の方法は臓器移植であるが、脳死判定やドナー供給の問題のため現実的な治療法として普及するには未だ多くの障害がある。一方、最近の幹細胞および発生生物学の進歩に伴って臓器再生を目指した再生医学が注目され、２１世紀に進むべき医療の方向性として期待されている。動物実験レベルでは胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の移植により臓器の機能回復が報告されているが、ヒトへの応用を考えた場合には拒絶反応やＥＳ細胞使用による倫理的な問題で行き詰まっているのが現状である。また、成人の各種組織幹細胞（間葉系、血管、肝など）も生体内にきわめて少数しか存在せず、その単離は技術的に難しく、移植に十分な細胞数を得ることは現時点で困難とされている。したがって、ＥＳ細胞や組織幹細胞を用いた再生医療が実地医療に応用されるためには解決しなければならない多くの問題が山積しており、特に、細胞移植による再生医療が現実のものとなるためには、分化能を有する細胞の安定供給が必要不可欠であると考えられる。
【０００８】
本発明の課題は、必要十分量を低侵襲的かつ簡便に安定供給でき、細胞移植に際してドナー確保や拒絶反応の問題がなく、倫理的な問題も少ない、骨、軟骨、骨格筋、脂肪などの間葉系細胞、血管内皮細胞、心筋細胞、神経細胞など多種類の細胞へと分化する能力を有する多能性細胞や、かかる多能性細胞から分化誘導された間葉系細胞、心筋細胞、血管内皮細胞等の中胚葉系前駆細胞・中胚葉系細胞・中胚葉系組織と神経細胞・組織や、これらを有効成分とする治療剤や、これらを投与する治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィブロネクチンでコートしたプラスチックプレート上で７〜１０日間培養すると線維芽細胞様の細胞が出現することを観察した。この線維芽細胞様形態を呈するヒト細胞群の由来および生理機能に興味を持って解析したところ、これらの細胞は循環ＣＤ１４+単球由来で、ＣＤ１４+ＣＤ４５+ＣＤ３４+Ｉ型コラーゲン+という独特のフェノタイプを有し、特定の培養条件により骨、軟骨、骨格筋、脂肪などの間葉系細胞、血管内皮細胞、心筋細胞、神経細胞へと分化する能力を有することを見い出し、単球由来多能性細胞（monocyte-derived multipotent cell；ＭＯＭＣ）と命名した。このように、循環単球が食細胞だけでなく種々の間葉系細胞等への分化能を有する多能性前駆細胞であることを初めて明らかにした本発明者らによる知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、単球に由来し、ＣＤ１４とＣＤ３４とを発現する単球由来多能性細胞（請求項１）や、単球に由来し、ＣＤ１４とＣＤ３４とＣＤ４５とＩ型コラーゲンとを発現する単球由来多能性細胞（請求項２）や、間葉系組織へと分化誘導する条件下での培養により、間葉系細胞に分化しうることを特徴とする請求項１又は２記載の単球由来多能性細胞（請求項３）や、間葉系細胞が、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞であることを特徴とする請求項３記載の単球由来多能性細胞（請求項４）や、培養心筋細胞との共培養等の心筋へと分化誘導する条件下での培養により、心筋細胞に分化しうることを特徴とする請求項１又は２記載の単球由来多能性細胞（請求項５）や、培養神経細胞との共培養等の神経へと分化誘導する条件下での培養により、神経細胞に分化しうることを特徴とする請求項１又は２記載の単球由来多能性細胞（請求項６）や、血管内皮細胞を維持する条件下での培養等の血管内皮へと分化誘導する条件下での培養により、血管内皮細胞に分化しうることを特徴とする請求項１又は２記載の単球由来多能性細胞（請求項７）や、中胚葉系細胞に分化しうることを特徴とする請求項１又は２記載の単球由来多能性細胞（請求項８）に関する。
【００１１】
また本発明は、請求項１〜８のいずれか記載の単球由来多能性細胞を間葉系組織へと分化誘導する条件下で培養することにより誘導された間葉系前駆細胞、間葉系細胞又は間葉系組織（請求項９）や、間葉系細胞が、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞であることを特徴とする請求項９記載の間葉系前駆細胞、間葉系細胞又は間葉系組織（請求項１０）や、請求項１〜８のいずれか記載の単球由来多能性細胞を培養心筋細胞との共培養等の心筋へと分化誘導する条件下での培養により誘導された心筋前駆細胞、心筋細胞又は心筋組織（請求項１１）や、請求項１〜８のいずれか記載の単球由来多能性細胞を培養神経細胞との共培養等の神経へと分化誘導する条件下での培養により誘導された神経前駆細胞、神経細胞又は神経組織（請求項１２）や、請求項１〜８のいずれか記載の単球由来多能性細胞を血管内皮細胞を維持する条件下での培養等の血管内皮へと分化誘導する条件下での培養により誘導された血管内皮前駆細胞、血管内皮細胞又は血管内皮組織（請求項１３）や、請求項１〜８のいずれか記載の単球由来多能性細胞から分化・誘導された中胚葉系前駆細胞、中胚葉系細胞又は中胚葉系組織（請求項１４）に関する。
【００１２】
さらに本発明は、請求項１〜８のいずれか記載の単球由来多能性細胞、並びに／又は、前記単球由来多能性細胞から分化・誘導された中胚葉系前駆細胞、中胚葉系細胞及び／若しくは中胚葉系組織を有効成分とする治療剤（請求項１５）や請求項１〜８のいずれか記載の単球由来多能性細胞、並びに／又は、前記単球由来多能性細胞から分化・誘導された神経前駆細胞、神経細胞及び／若しくは神経組織を有効成分とする治療剤（請求項１６）に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、細胞治療や再生医療に極めて有用な、骨、軟骨、骨格筋、脂肪などの間葉系細胞、血管内皮細胞、心筋細胞、神経細胞など多種類の細胞へと分化する能力を有する単球由来の多能性細胞ＭＯＭＣを得ることができる。そして、単球は末梢血から簡単に大きな侵襲なく採取することができる上、単球は末梢血単核球の約２０％を占め、必要十分量の細胞を安定供給できる。単球からＭＯＭＣへの分化誘導は簡単、迅速、安価に行え、特殊な装置を必要としない。また、細胞移植に自己の細胞を用いることができることから、ドナー確保や拒絶反応の問題がなく、倫理的な問題も少ない。本発明は、単球／食細胞系に関する伝統的な生物学的知見を覆すものであり、単球の分化能並びに単球の生体恒常性維持及び病態誘導に果たす役割を理解する上で、大きく貢献するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の単球由来多能性細胞（ＭＯＭＣ）としては、単球に由来し、ＣＤ１４とＣＤ３４とを発現する細胞又は細胞群や単球に由来し、ＣＤ１４とＣＤ３４とＣＤ４５とＩ型コラーゲンとを発現する細胞又は細胞群であれば特に制限されるものではなく、上記単球の起源としてはマウス、ラット、イヌ、ブタ、サル、ヒトなど特に限定されないが、ヒトを好適に例示することができ、ヒト単球の場合、ドナー由来でもよいが自己由来が特に好ましい。また、単球の供給源としては末梢血あるいは骨髄由来の単球、又は造血幹細胞からex vivoで分化させた単球を例示することができ、ここで単球とはＣＤ１４又はＣＤ１１ｂ陽性と定義される。
【００１５】
上記ＣＤ１４とＣＤ４５とは単球及び単球由来細胞のマーカーとして、ＣＤ３４は幹細胞のマーカーとして、Ｉ型コラーゲンは間葉系細胞のマーカーとして知られている。本発明の単球由来多能性細胞としては、幹細胞マーカーとしてのＣＤ１０５、Ｓｃａ−１や、間葉系細胞のマーカーとしてのIII型コラーゲン、フィブロネクチンや、血管内皮マーカーとしてのＶＥカドヘリン、Ｆｌｔ−１を発現するものが好ましい。かかるＭＯＭＣは、上記タンパク質の発現パターンから、単球、マクロファージ、樹状細胞とは異なる細胞であり、間葉系細胞、血管内皮細胞、幹細胞の特徴をあわせ持つ新規の細胞群といえる。
【００１６】
本発明のＭＯＭＣは循環ＣＤ１４+単球に由来するが、このことは以下にいくつか列挙する。第一に、ＭＯＭＣは、単球系統マーカーであるＣＤ１４、ＣＤ１３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ６４に対して陽性である。第二に、フィブロネクチン上で培養した末梢血接着細胞のフェノタイプ分析を連続的に行った結果、ＣＤ１４+接着細胞上におけるＣＤ３４の発現が増加していた。第三に、ＣＤ１４+細胞を除去することにより、ＰＢＭＣからのＭＯＭＣ発生は殆ど完全に阻害されたが、ＣＤ３４又はＣＤ１０５陽性細胞を除去しても阻害されなかった。最後に、標識ＣＤ１４+細胞を用いた研究から、ＣＤ１４+単球においてはＣＤ３４発現がアップレギュレートされ、またＣＤ１４-細胞群の中にＰＢＭＣ培養中に急速に増殖する細胞がないことが明らかになった。
【００１７】
本発明のＭＯＭＣとしては、中胚葉系細胞にＭＳＣを分化させることが知られている誘導条件下で中胚葉系細胞に分化しうる多能性を備えた細胞、具体的には、間葉系組織へと分化誘導する条件下での培養により骨芽細胞、骨格筋芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨髄間質細胞、平滑筋細胞等の間葉系細胞に分化しうる多能性や、培養心筋細胞との共培養等の心筋へと分化誘導する条件下での培養により心筋細胞に分化しうる多能性や、血管内皮細胞を維持する条件下での培養等の血管内皮へと分化誘導する条件下での培養により血管内皮細胞に分化しうる多能性の他、培養神経細胞との共培養等の神経へと分化誘導する条件下での培養により、外胚葉系細胞である神経細胞に分化しうる多能性などを備えた細胞が好ましい。
【００１８】
また、本発明は、本発明のＭＯＭＣを、中胚葉系細胞にＭＳＣを分化させることが知られている誘導条件下で分化・誘導された中胚葉系前駆細胞、中胚葉系細胞又は中胚葉系組織、具体的には、ＭＯＭＣを間葉系組織へと分化誘導する条件下で培養することにより誘導された骨芽細胞、骨格筋芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等の間葉系前駆細胞、間葉系細胞又は間葉系組織や、ＭＯＭＣを培養心筋細胞と共培養等の心筋へと分化誘導する条件下での培養により誘導された心筋前駆細胞、心筋細胞又は心筋組織や、ＭＯＭＣを血管内皮細胞を維持する条件下での培養等の血管内皮へと分化誘導する条件下での培養により誘導された血管内皮前駆細胞、血管内皮細胞又は血管内皮組織の他、ＭＯＭＣを培養神経細胞との共培養等の神経へと分化誘導する条件下での培養により誘導された外胚葉系の神経前駆細胞、神経細胞又は神経組織に関する。
【００１９】
骨芽細胞への分化誘導条件下で培養することにより誘導された骨芽細胞としては、類円形の形態となり、アリザリン赤陽性のカルシウム沈着、アルカリフォスファターゼ染色陽性、細胞内Ｃａ濃度の増加、骨芽細胞に特異的な骨シアロタンパク質II、オステオカルシン遺伝子を発現する細胞を好適に例示することができる。軟骨細胞への分化誘導条件下で培養することにより誘導された軟骨細胞としては、細胞質に富むやや大型の類円形の形態となり、軟骨細胞に特異的なII型及びＸ型コラーゲンを発現する細胞を好適に例示することができる。骨格筋細胞への分化誘導条件下で培養することにより誘導された骨格筋細胞としては、紡錘形の細長い形態をとり、骨格筋特異的アクチン、ミオシンを発現する細胞を好適に例示することができる。脂肪細胞への分化誘導条件下で培養することにより誘導された脂肪細胞としては、オイル赤染色陽性の脂肪滴が出現し、ＰＰＡＲγ、ａＰ２遺伝子の発現が増加する細胞を好適に例示することができる。
【００２０】
心筋へと分化誘導する条件下での培養により誘導された心筋前駆細胞や心筋細胞としては、ネスチン及び心筋特異的転写因子Ｎｋｘ２．５、ｅＨＡＮＤを発現し、心筋細胞構造蛋白であるミオシン軽鎖の遺伝子を発現する細胞を好適に例示することができる。神経へと分化誘導する条件下での培養により誘導された神経前駆細胞や神経細胞としては、ネスチン及び神経細胞特異的転写因子Ｎｅｕｒｏ Ｄ、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ ２を発現し、その後神経マーカーのＨｕ、Ｎｅｕ Ｎを発現する細胞を好適に例示することができる。血管内皮へと分化誘導する条件下での培養により誘導された血管内皮前駆細胞や血管内皮細胞としては、小突起を有する多型性の形態となり、血管内皮に特異的なマーカータンパク質ＫＤＲ、ｖＷＦ、ｅＮＯＳを発現する細胞を好適に例示することができる。
【００２１】
上記のように、ＭＯＭＣは、主としてＭＳＣを中胚葉系細胞に分化させることが知られている誘導条件下において間葉系細胞等の中胚葉系細胞への分化能を有しているの他、ＭＯＭＣを神経へと分化誘導する条件下での培養により誘導された外胚葉系の神経細胞への分化能を有している。さらにＭＯＭＣは、系統特異的転写因子の発現タイミングという点において、ＭＳＣ分化と同じ段階を追って各種間葉系細胞等の中胚葉系細胞などへと分化する。例えば、Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２の発現に続いて、シアロタンパク質II及びオステオカルシンが発現され（Cell, 108, 17-29, 2002）、ＳｋＭ−アクチン及びミオシンが発現される前に、ＭｙｏＤが発現される（Front Biosci., 5, D750-767, 2000）。かかる知見は、各種間葉系統への分化プロセスが、ＭＯＭＣとＭＳＣで共通していることを示すものである。
【００２２】
本発明のＭＯＭＣの作製方法としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィブロネクチン上でインビトロ培養、例えば、フィブロネクチンでコートしたプラスチックプレート上で培養、好ましくは５〜１４日間、特に好ましくは７〜１０日間培養し、ＣＤ１４とＣＤ３４とを発現する線維芽細胞様細胞を採取する方法であれば特に制限されるものではないが、ＰＢＭＣを外因性成長因子不在下で培養することが好ましい。上記フィブロネクチンのかわりにコラーゲンやラミニンを用いてもよいが、単球のＭＯＭＣへの分化にはこれらフィブロネクチン等の他に、ＣＤ１４-細胞由来の液性因子が必要とされる。上記ＰＢＭＣの起源としてはマウス、ラット、イヌ、ブタ、サル等の実験動物又はヒトなど特に限定されないが、ヒトＰＢＭＣを好適に例示することができる。また、ヒトＰＢＭＣは、ヒト静脈血から常法により単離することができる。上記培養方法としては特に制限されないが、３７℃、５％ＣＯ2、湿気下にて密度１０4〜１０7／ｍｌ、例えば２×１０6／ｍｌで培養し、２〜４日毎に、特に好ましくは３日毎に非接着細胞を除去するとともに、新鮮培地を補充する培養方法を挙げることができる。このようにして得られる本発明のＭＯＭＣは、その元来のフェノタイプを５世代継代するまで維持しつつ、培養によって増殖させることが可能である。
【００２３】
本発明は、本発明のＭＯＭＣ、並びに／又は、前記ＭＯＭＣから分化・誘導された中胚葉系前駆細胞、中胚葉系細胞及び／若しくは中胚葉系組織、具体的には、ＭＯＭＣを間葉系組織へと分化誘導する条件下で培養することにより誘導された骨芽前駆細胞、骨格筋芽前駆細胞、軟骨前駆細胞、脂肪前駆細胞等の間葉系前駆細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等の間葉系細胞、骨、軟骨、筋肉、脂肪等の間葉系組織や、ＭＯＭＣを培養心筋細胞と共培養等の心筋へと分化誘導する条件下での培養により誘導された心筋前駆細胞、心筋細胞、心筋組織や、ＭＯＭＣを血管内皮細胞を維持する条件下での培養等の血管内皮へと分化誘導する条件下での培養により誘導された血管内皮前駆細胞、血管内皮細胞、血管内皮組織等を有効成分とする治療剤や、本発明のＭＯＭＣ、並びに／又は、前記ＭＯＭＣから分化・誘導された神経前駆細胞、神経細胞及び／若しくは神経組織等を有効成分とする治療剤に関する。また、本発明のＭＯＭＣ、並びに／又は、前記ＭＯＭＣから分化・誘導された、前記中胚葉系前駆細胞、中胚葉系細胞及び／若しくは中胚葉系組織や、前記神経前駆細胞、神経細胞及び／若しくは神経組織等を投与、例えば障害、欠損部位およびその近傍へ直接注入、又は末梢血へ投与することを特徴とする治療方法に関する。ＭＯＭＣ又は分化誘導処理したＭＯＭＣのいずれが治療剤として適しているかは、細胞の種類や疾病の種類や投与方法を考慮して適宜決定することが好ましい。また、ＭＯＭＣは遺伝子導入が比較的簡単な細胞あることから、ヒトへの細胞移植の前に特定の遺伝子を導入した後に組織再生治療等に用いることもできる。例えば、ある種の先天性疾患で骨の形成に障害がある場合に、その遺伝子を是正した上で移植することや、あるいは、特定の蛋白（サイトカイン、成長因子、ホルモンなど）を産生するように調製した上で移植することもできる。
【００２４】
前記のとおり、種々の間葉系組織等の中胚葉系組織や神経組織への分化能をもつことからＭＯＭＣには、先天性疾患、変性疾患及び外傷に対する組織再建治療における細胞供給源として有用である。具体的に本発明の治療剤や治療方法の対象となる疾患又は病態としては、骨形成不全、骨折、関節リウマチなど変性疾患による骨破壊や、軟骨が破壊される関節リウマチ、変形性関節症や、ジストロフィーなどの先天性疾患や筋炎などの後天性疾患による筋萎縮や、心筋梗塞や心筋症による心筋障害や、脳梗塞、パーキンソン病などの脳障害、脊髄損傷などの外傷や、動脈硬化や膠原病による血管障害を挙げることができ、便宜上、豊胸をはじめとした美容形成等も本発明の治療剤や治療方法に含まれる。このようなＭＯＭＣ又は分化誘導処理したＭＯＭＣを使用する細胞治療には、現在提案されている組織特異的幹細胞及びＥＳ細胞を用いる再生治療等にはない大きな利点がある。すなわち、血液採取という低侵襲的に患者本人から大量の単球を採取できることから、循環単球は比較的容易に入手可能な自己細胞供給源ということができ、さらに、単球からＭＯＭＣを作製することは技術的に簡便で迅速に実施でき、また、ＥＳ細胞を使用する際の倫理上のジレンマも回避することができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［方法と材料］
実施例１（ＭＯＭＣの培養）
成人健常ドナーから得たヘパリン添加静脈血を、Lymphoprep（Nycomed Pharma AS社製）を用いた密度勾配遠心分離にかけてＰＢＭＣを単離した。血液検体は全て、倫理委員会が定める書面によるインフォームドコンセントを被験者が提出した後に採血したものである。単離した細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１０％熱不活化ＦＢＳ（JRH Biosciences社製）添加低グルコースＤＭＥＭに懸濁した。ＰＢＭＣを、外因性成長因子不在下、３７℃、５％ＣＯ2、湿気下の諸条件のもと、フィブロネクチンでコートしたプラスチックプレート上にて密度２×１０6／ｍｌで培養し、培養３日目に非接着細胞を除去した。３日毎に新鮮培地に交換しながら、４週間まで細胞を培養した。培養７〜１０日目に接着細胞をＭＯＭＣとして回収し、以下のアッセイに用いたり、或いはフィブロネクチンでコートしたプレートに新たに移し替えて同一培養条件下で１０世代まで維持した。
【００２６】
ＭＯＭＣの由来を考察するため、ＣＤ１４+、ＣＤ３４+、又はＣＤ１０５／エンドグリン／ＳＨ２+細胞を除去したＰＢＭＣをフィブロネクチンでコートしたプレート上で７日間培養した。ＣＤ１４+又はＣＤ３４+細胞は、磁気ビーズを結合させた抗ＣＤ１４モノクローナル抗体又は抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（DynaBeads社製）を用い、製造者のマニュアルに従って磁気分離を行うことにより除去した。ＣＤ１０５+細胞を除去したＰＢＭＣは、先ず抗ＣＤ１０５モノクローナル抗体（Immunotech社製）共存下でインキュベートし、次に磁気ビーズを結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Dynal社製）共存下でインキュベートすることにより調製した。アイソタイプが一致するマウスモノクローナル抗体共存下、さらにビーズ結合抗マウスＩｇＧ抗体共存下でインキュベートしたモック処理ＰＢＭＣを調製し、コントロールとした。フローサイトメトリーにより解析したところ、ＣＤ１４+細胞を除去したＰＢＭＣ画分中のＣＤ１４+細胞の割合は、一貫して０．５％未満であり、ＣＤ３４+細胞除去画分中におけるＣＤ３４+細胞並びにＣＤ１０５+細胞除去画分中におけるＣＤ１０５+細胞の割合は、０．０１％未満だった。１ｃｍ3あたりの付着細胞数を算定し、その結果を無処理のＰＢＭＣ培養における付着細胞数に対する割合で表した。
【００２７】
抗ＣＤ１４モノクローナル抗体結合磁気ビーズ（CD14 MicroBeads；Miltenyi Biotech社製）を用い、さらに製造者マニュアルに従ってＭＡＣＳ（磁気細胞分離装置）によるカラム分離を行うことにより、ＰＢＭＣから循環ＣＤ１４+単球及びＣＤ１４-細胞を分離する実験も実施した。フローサイトメトリー分析の結果、単球画分には９８％を越えるＣＤ１４+細胞が、またＣＤ１４-細胞画分には０．５％未満のＣＤ１４+細胞がそれぞれ存在していた。ＰＫＨ６７グリーン（Sigma社製）で単球を標識し、フィブロネクチンでコートしたプラスチックプレート又はコーティングを施していないプラスチックプレート上で非標識ＣＤ１４-細胞と７日間の共培養を行った（比率１：４）。ＰＫＨ６７標識単球もフィブロネクチンでコートしたプレート上で単独培養した。
【００２８】
実施例２（マクロファージ及び樹状細胞の調製）
プラスチックプレート上、２０％ＦＢＳ及び４ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（R&D Systems社製）を添加したＭ１９９培地において接着ＰＢＭＣを７日間培養し、マクロファージを調製した（Differentiation, 65, 287-300, 2000）。プラスチックに接着したＰＢＭＣを連続培養条件下において成熟させることにより、成熟単球由来樹状細胞を得た（J Immunol Methods, 196, 121-135, 1996）。その概要は、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を含む１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地上で接着細胞を７日間培養した（材料は全てPeproTech社製）。次に幼若樹状細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（PeproTech社製）共存下で３日間インキュベートした。フローサイトメトリー分析の結果、マクロファージ画分には、ＣＤ１４+ＣＤ８０+細胞が９８％以上含まれており、樹状細胞画分には、ＣＤ８３+ＨＬＡ−ＤＲ+細胞が９５％以上、ＣＤ１４+細胞が１％未満の割合で含まれていた。
【００２９】
実施例３（細胞株）
健常ドナーに皮膚生検を行ってヒト皮膚線維芽細胞を得て、その初代培養を樹立し、１０％ＦＢＳ添加低グルコースＤＭＥＭ中で維持した。初代ヒト筋芽細胞は、臨床的に筋炎が疑われるが組織学上は正常な患者の筋肉生検を培養することにより作製した（J Cell Biol., 144, 631-643, 1999）。ヒト骨肉腫細胞株ＭＧ−６３、横紋筋肉腫細胞株ＲＤ、及び軟骨肉腫細胞株ＯＵＭＳ−２７は、日本ヒューマンサイエンス研究資源バンク（日本、大阪府）から入手し、１０％ＦＢＳ添加低グルコースＤＭＥＭで維持した。
【００３０】
実施例４（ＭＯＭＣの間葉系細胞へのインビトロ分化）
ＰＢＭＣから新たに作製したＭＯＭＣ、数代にわたり継代培養されたＭＯＭＣ、又は低温保存されていたＭＯＭＣのいずれかを、新たにフィブロネクチンをコートしたプラスチックプレート、又はチャンバースライドに移して１０％ＦＢＳ添加高グルコースＤＭＥＭ（Hyclone Laboratories社製）中でセミコンフルエントになるまで生育させた。次に、下記の種々の間葉系細胞型にＭＳＣを分化させることが知られている誘導条件下（Science,284, 143-147, 1999, J Cell Biol., 144, 631-643, 1999, J Cell Biochem., 64, 295-312, 1997, Muscle Nerve,18, 1417-1426, 1995, Tissue Eng., 4, 415-428, 1998, Arthritis Rheum., 44, 85-95, 2001, J Biol Chem., 275, 9645-9652, 2000）で、上記細胞を培養した。コントロールとして、ＰＢＭＣから新たに単離した単球、マクロファージ及び皮膚線維芽細胞も同一条件下で処理した。
【００３１】
骨形成に関しては、１００ｎＭのデキサメサゾン、１０ｍＭのβ−グリセロホスフェート及び５０μＭのアスコルビン酸を含む骨形成誘導培地（Clonetics社製）上で接着細胞を培養した。１週間に２回培地を交換することを３週間継続した。
【００３２】
筋形成に関しては、接着細胞を１０μＭの５−アザシチジン（Sigma社製）で２４時間処理した。ＰＢＳで細胞を洗浄し、５％ウマ血清（Life Technologies社製）、５０ｍＭのヒドロコルチゾン（Sigma社製）、及び４ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（Sigma社製）を含む培地で培養した。１週間に２回培地を交換することを３週間継続した。
【００３３】
軟骨形成に関しては、接着単層細胞をＴＧＦ−β（R＆D Systems社製）存在下、無血清培地上で３週間培養した。ＴＧＦ−βは１日おきに培養培地に加え、その最終濃度を１０ｎｇ／ｍｌとした。
【００３４】
脂肪形成に関しては、１μＭのデキサメサゾン、０．５ｍＭのメチル−イソブチルキサンチン、１０μｇ／ｍｌのインスリン、及び１００ｍＭのインドメタシン（全てSigma社製）を添加した脂肪誘導培地にて細胞をインキュベートした。７２時間後に上記培地を、１０μｇ／ｍｌのインスリンを単独添加した維持培地と交換して２４時間おいた。脂肪誘導培地で細胞を３回処理し、さらに１週間維持培地において維持した。
【００３５】
実施例５（ＭＯＭＣの心筋細胞へのインビトロ分化）
ＭＯＭＣを8日間ウィスターラット胎児由来の培養心筋細胞とともに共培養を行った。
培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ヒト特異的抗ネスチン（nestin）抗体（Chemicon社）により免疫染色（ＤＡＢ発色）を行った。
【００３６】
ＭＯＭＣを蛍光色素ＰＫＨ６７（Sigma社）により細胞膜を標識した後に、ウィスターラット培養心筋細胞と７〜１０日間、共培養を行った。培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、抗Ｎｋｘ２．５抗体、抗ｅＨＡＮＤ抗体（Santa Cruz社）、抗ＣＤ４５抗体（DAKO社）により、二重蛍光免疫染色を行った。
【００３７】
ＭＯＭＣをウィスターラット培養心筋細胞と３日、６日、９日、１２日間共培養を行った後、ｍＲＮＡを抽出した。心筋細胞構造蛋白であるミオシン軽鎖（ＭＬＣ２ｖ）に対するヒト特異的ＰＣＲプライマー(TGACAAGAACGATCTGAGAG、CAGGTTCTTGTAGTCCAAGT)を作成し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００３８】
実施例６（ＭＯＭＣの神経細胞へのインビトロ分化）
ＭＯＭＣを８日間ウィスターラット培養神経細胞とともに共培養を行った。培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ヒト特異的抗ネスチン抗体により免疫染色（ＤＡＢ発色）を行った。
【００３９】
ＭＯＭＣを蛍光色素ＰＫＨ６７により細胞膜を標識した後に、ウィスターラット培養神経細胞と４日間、共培養を行った。培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、抗NeuroＤ抗体（Santa Cruz社）、抗ＣＤ４５抗体（DAKO社）により、二重蛍光免疫染色を行った。
【００４０】
ＭＯＭＣをウィスターラット培養神経細胞と３日間、共培養を行った。培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ヒト特異的抗ネスチン抗体、抗Neurogenin２抗体（Chemicon社）により、二重蛍光免疫染色を行った。
【００４１】
ＭＯＭＣを蛍光色素ＰＫＨ６７により細胞膜を標識した後に、ウィスターラット培養神経細胞と９〜１０日間、共培養を行った。培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、抗Ｈｕ抗体、抗ＮｅｕＮ抗体（Chemicon社）により二重蛍光免疫免疫染色を行った。
【００４２】
実施例７（ＭＯＭＣの血管内皮細胞へのインビトロ分化）
ＭＯＭＣを付着細胞として血管内皮細胞維持培地ＥＢＭ−２（Clonetics社）中で７〜１０日間培養した。培養細胞を１０％中性緩衝ホルマリンで固定した後、抗ＣＤ３４抗体（Calbiochem-Novabiochem社）、抗ｖＷＦ抗体（Dako社）、抗ｅＮＯＳ抗体（Bechton-Dickinson社）、抗ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体（Sigma社）により免疫染色（ＤＡＢ発色）を行った。
【００４３】
ＥＢＭ−２培地中で７日間培養したＭＯＭＣからＲＮＡを抽出しｃＤＮＡへ逆転写した。血管内皮細胞に発現されるＦｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＣＤ３１、ＣＤ１４４、ｖＷＦおよびＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＧＡＰＤＨに対する特異的プライマーを用いてＰＣＲを行った。コントロールとして分化誘導をかける前のＭＯＭＣ、培養さい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）由来のＲＮＡを用いた。
【００４４】
実施例８（フローサイトメトリー分析）
蛍光細胞染色は以下の手順で行った。２ｍＭのＥＤＴＡ共存下における氷上インキュベーションにより、接着細胞をプラスチックプレートから脱離させ、正常マウス又はラットの血清を用い、４℃下で１０分間ブロックした。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体（BD Pharmingen社製）、抗ＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ２９抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ８３抗体、抗ＣＤ１０５／エンドグリン／ＳＨ２抗体、抗ＣＤ１１７／ｃ−ｋｉｔ抗体（Immunotech社製）、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ１３３抗体（MiltenyiBiotech社製）、抗ＨＬＡクラスＩ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１抗体、抗Ｆｌｔ−１／ＶＥＧＦＲ１抗体、抗Ｆｌｋ−１／ＶＥＧＦＲ２抗体（Sigma社製）、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ５４抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体（Ancell社製）、抗ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン抗体、抗Ｉ型コラーゲン抗体（Chemicon International社製）を含むマウスモノクローナル抗体、又はラット抗Ｓｃａ−１モノクローナル抗体（Cedarlane Laboratories社製）に、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン（ＰＥ）若しくはＰＣ５を結合させて、又は結合させないで、上記細胞を染色した。非結合モノクローナル抗体を用いた場合には、ＦＩＴＣ若しくはＰＥを結合したヤギ抗マウス抗体若しくはラットＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）2抗体（Immunotech社製）を２次抗体として使用した。IntraPrepTM浸透処理試薬（Immunotech社製）により細胞の浸透処理及び固定化を行い、細胞内染色を行った。細胞の分析は、CellQuestソフトウエアを使用したFACSRCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson社製）により行った。フォワード及びサイドスキャッターでのゲーティングにより可視化細胞を同定し、データは対数ヒストグラム又はドットプロットとして示した。
【００４５】
実施例９（免疫組織化学分析）
サイトスピン法により単球及びマクロファージ、樹状細胞をスライド上に塗抹し、これら細胞以外の細胞型は、フィブロネクチンでコートしたチャンバースライド上で培養したが、フィブロネクチン染色用には、コラーゲンＩ型をコートしたチャンバースライドを用いた。これらの細胞を１０％ホルマリンで固定し、３％過酸化物を用い、外因性ペルオキシダーゼ活性を５分間抑制した。抗ＣＤ４５抗体、抗ビメンチン抗体、抗骨格筋特異的アクチン抗体（ＳｋＭ−アクチン）（Dako社製）、抗ＣＤ３４抗体（Calbiochem-Novabiochem社製）、抗Ｉ型コラーゲン抗体（Chemicon社製）、抗III型コラーゲン抗体、抗フィブロネクチン抗体（Sigma社製）、抗II型コラーゲン抗体（ICN Biomedicals社製）、抗骨格筋特異的ミオシン重鎖抗体（ＳｋＭ−ＭＨＣ）（Zymed Laboratories社製）を含むマウスモノクローナル抗体又はラット抗Ｓｃａ−１モノクローナル抗体共存下にて３０分間スライドをインキュベートし、さらにビオチン標識抗マウス抗体若しくは抗ラットＩｇＧ抗体共存下でのインキュベーションを行った。３，３’−ジアミノベンジジンを基質として用い、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合物（ニチレイ社製）を室温で１０分間反応させることにより、抗体−ビオチン結合体を検出した。核をヘマトキシリンで対比染色した。上記１次抗体の代りに正常マウス若しくはラットのＩｇＧ抗体（Dako社製）共存下でインキュベートした細胞を負のコントロールとした。
【００４６】
蛍光二重染色は以下の方法で行った。４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、ヤギ抗ＰＥＢＰ２αＡ抗体若しくは抗Ｓｏｘ９ポリクローナル抗体（Santa Cruz社製）共存下でインキュベートし、次にAlexa FluorR568ヤギ特異的ＩｇＧ抗体（Molecular Probes社製）共存下でインキュベートし、さらにＦＩＴＣ結合マウス抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（Dako社製）共存化でインキュベートした。同様にマウス抗ＭｙｏＤ抗体（Dako社製）又は抗ペルオキシゾーム増殖活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ遺伝子）モノクローナル抗体（Santa Cruz社製）で染色し、その後テトラメチルローダミン・イソチオシアネート異性体Ｒで標識したマウス特異的ＩｇＧ抗体（Dako社製）共存化でインキュベートし、さらにＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４５モノクローナル抗体共存化でインキュベートした。共焦点レーザー蛍光顕微鏡（LSM5 PASCAL；Carl-Zeiss社製）を用いて、これらの細胞を観察した。所定のマーカーに対して染色陽性を示した細胞の割合を数値化するために、一培養あたり少なくとも３００個の細胞を低倍率で鏡検した。
【００４７】
実施例１０（アセチル化ＬＤＬ（Ａｃ−ＬＤＬ）の摂取）
２．５μｇ／ｍｌのＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ（Molecular Probes社製）共存化で接着細胞を1時間培養し、Ａｃ−ＬＤＬ摂取量をフローサイトメトリーで調べた。
【００４８】
実施例１１（アルカリフォスファターゼ染色）
１０％ホルマリンに細胞を固定し、０．２ｍｇ／ｍｌのナフトールＡＳ−ＴＲホスフェート及び０．５ｍｇ／ｍｌのFast Red RC（全てSigma社製）を含む溶液中で１０分間インキュベートした。
【００４９】
実施例１２（細胞内カルシウムの検出）
細胞内におけるカルシウム沈着を調べるため、細胞を１０％ホルマリンに固定し、２％アリザリンレッドＳ（Sigma社製）で３分間染色し、蒸留水で入念に洗浄した。市販のキット（Sigma社製）を使い、細胞内カルシウム濃度を測定した（J Biol Chem., 275, 9645-9652, 2000）。ウシ血清アルブミンを標準とするブラッドフォード・プロテイン・アッセイキット（Bio-Rad Laboratories社製）を使用し、細胞抽出物におけるタンパク質含量も測定した。カルシウム濃度は、タンパク質含量１μｇあたりのμｇ数として表示した。
【００５０】
実施例１３（オイル-レッドＯ染色）
０．２％グルタルアルデヒドに細胞を５分間固定し、６０％イソプロパノールで洗浄し、０．１％オイル-レッドＯ（Sigma社製）で１０分間覆った。６０％イソプロパノール、次いで蒸留水による洗浄後、細胞のヘマトキシリン対比染色を行った。
【００５１】
実施例１４（透過電子顕微鏡）
培養後のＭＯＭＣを直ちに２．５％グルタルアルデヒドに固定し、２％四酸化オスミウムで２次固定し、エタノール及び酸化プロピレンの一連使用により脱水してエポキシ樹脂に包埋した。ＬＫＢウルトラトーム上で、細胞をダイアモンドナイフで薄切片化した。灰色から銀色の範囲の切片を１５０−メッシュグリッド上に回収し、酢酸ウラニル及び酢酸鉛で二重染色を施し、JEOL-1200EXII電子顕微鏡下で観察した（Jeol社製）。
【００５２】
実施例１５（細胞増殖研究）
ＭＯＭＣの増殖は、文献（Blood, 71, 1201-1210, 1988）記載の方法に従い、ＢｒｄＵで標識することにより検出した。以下簡潔に説明する。１０μＭのＢｒｄＵ（Sigma社製）存在下で、染色するまでの２時間ＭＯＭＣを培養した。Carnoyの固定剤（メタノール／酢酸）で−２０℃で３０分間固定した後、細胞を風乾し、２Ｎ−ＨＣｌで１時間処理してＤＮＡを変性させ、さらに１０分間０．１Ｍのホウ酸塩（ｐＨ８．５）で中和した。これらの細胞をマウス抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体（Chemicon International社製）共存下でインキュベートし、ビオチン−ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体で染色した。核はヘマトキシリンで対比染色した。上記の１次抗体の代りに、アイソタイプが一致するマウスのコントロールモノクローナル抗体共存下でインキュベートした細胞を負のコントロールとした。非固定細胞を、ヨウ化プロピジウム（Sigma社製）共存下で３０分間インキュベートして、蛍光顕微鏡観察を行い、アポトーシスを起こした細胞を検出した。
【００５３】
文献記載（J Exp Med., 183, 2313-2328, 1996）の手法に従い、５−カルボキシフルオレセイン・ジアセテート・スクシンイミジル・エステル（ＣＦＳＥ）で細胞を標識し、細胞分裂の様子を考察した。フィブロネクチンでコートしたプレート上で１、３、５日間、ＣＦＳＥ標識単球と非標識ＣＤ１４-細胞を共培養し、接着細胞を回収してＰＣ５標識抗ＣＤ１４モノクローナル抗体で染色した。ＣＦＳＥ標識ＭＯＭＣについても、１、３、及び５日間の培養を行った。ＣＦＳＥ標識による発色強度をフローサイトメトリーにより解析した。
【００５４】
実施例１６（ＲＴ−ＰＣＲ）
RNeasyキット（Qiagen社製）を用いて分化誘導処理を行った場合と行わなかった場合の双方において、ＭＯＭＣから全ＲＮＡを抽出した。末梢血ＣＤ１４+単球、並びにマクロファージ、樹状細胞、皮膚線維芽細胞、筋芽細胞、骨肉腫、横紋筋肉腫及び軟骨肉腫を含む種々の培養細胞からも全ＲＮＡを抽出した。ヒト筋肉及び脂肪組織由来の全ＲＮＡサンプルは、Clonetech Laboratories社から購入した。Molonyマウス白血病ウイルス・リバーストランスクリプターゼ（Takara社製）を用い、オリゴ−ｄＴをプライマーとして、全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成した。次にこのｃＤＮＡ（５０ｎｇの全ＲＮＡに相当）を、配列番号３〜３４に示される表１記載の各種特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅法にかけた。このＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動分析にかけ、臭化エチジウム染色により可視化した。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
実施例１７（統計分析）
全ての比較における統計有意は、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定により試験した。
【００５７】
［結果］
実施例１８（ＭＯＭＣの作製）
フィブロネクチンでコートしたプレート上にて、１０％ＦＢＳを単独添加したＤＭＥＭ中でＰＢＭＣを培養すると、一部の細胞が直ちにプレートに付着した。円形細胞の小クラスターが２４時間以内に発生し、そこから細胞突起が伸張した。培養５日目に線維芽細胞様形態を呈する接着細胞が出現した。さらに３日間培養すると、この線維芽細胞様細胞は、培養中の優勢細胞となった（図１ａ）。かかる線維芽細胞はクラスター周辺部に高頻度で観察された（図１ｂ）。線維芽細胞様細胞は、培養１４日目頃までは徐々にその数を増やした。それ以降、増殖能は次第に消失していったが、細胞は４週間まで生存していた。ドナー５０名から得たＰＢＭＣ１０8個を培養したところ、７日目に０．３〜１×１０7個の接着細胞が得られた。フローサイトメトリー分析の結果、培養７日目に回収した細胞は単一のフェノタイプを示し（９５％以上がホモジニアス）、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３４、及びＩ型コラーゲンに対して陽性だった（図２）。このフェノタイプは独特であり、単球／マクロファージ（ＣＤ１４+、ＣＤ４５+、ＣＤ３４-及びＩ型コラーゲン-）、血管内皮前駆細胞（ＣＤ１４-、ＣＤ４５-、ＣＤ３４+及びＩ型コラーゲン-）（Science, 275, 964-967, 1997）、及び間葉系前駆細胞（ＣＤ１４-、ＣＤ４５-、ＣＤ３４-、及びＩ型コラーゲン+）（Arthritis Res., 2, 477-488, 2000）を含む既知の末梢血由来接着細胞のフェノタイプとは異なっている。少なくとも５０名のドナーから得た細胞は、同じフェノタイプを有していた。７日目に、新たにフィブロネクチンでコートしたプレートに細胞を移し替え、同一条件下で培養したところ、殆ど全ての細胞が、細長い線維芽細胞様の形態を現した（図１ｃ）。これらの細胞は、５世代まで増殖することができ、細胞増殖は継代直後に最も盛んになるようだった。しかし５世代継代以降は、細胞増殖速度が徐々に遅くなり、８世代継代を超えると、その増殖能は消失した。特別な処理を施さない限りは、培養期間中に細胞が成熟間葉系細胞へ自然に分化することはなかったが、高いコンフルエンシーとなるように細胞を播種すると、複数の核をもつ細胞の出現が僅かに認められた。インビトロ培養でＰＢＭＣから得られたこれらの線維芽細胞様細胞を、以下の知見に基づき、ＭＯＭＣと名付けた。
【００５８】
電子顕微鏡観察の結果、ＭＯＭＣは、多数の細胞小器官をもつ紡錐形の形態をしていることがわかった（図１ｄ−ｇ）。多数の一次リソソーム、細胞表面にみられる偽足状の突起、また迷路状の細胞小胞は、マクロファージ類及びその他の食細胞類に固有に見られる所見である。ＭＯＭＣにはまた、突出して束をなす中間フィラメント、よく発達した二次リソソーム、伸張して分岐したミトコンドリアといった間葉系由来細胞によく見られる特徴が認められる。殆ど全てのＭＯＭＣに僅かな脂質滴が観察された。また、血管内皮細胞特有の棒状微小管に似た構造も数多く認められた。これらの超微形態所見は、食細胞、間葉系細胞及び血管内皮細胞の特徴を備えたものである。
【００５９】
実施例１９（循環系におけるＭＯＭＣの由来）
フィブロネクチンでコートしたプレート上でＰＢＭＣを培養して得られた接着細胞を、フローサイトメトリーにかけ、その表面におけるＣＤ１４及びＣＤ３４の発現を連続的に調べた（図３ａ）。１時間後にプレートに付着した細胞の大多数はＣＤ１４+及びＣＤ３４-だったが、接着ＣＤ１４+細胞上におけるＣＤ３４の発現は次第にアップレギュレートされていった。培養７日後には、殆ど全ての接着細胞がＣＤ１４及びＣＤ３４に対して陽性を示した。末梢血には、ＣＤ３４+血管内皮細胞前駆細胞（Science, 275, 964-967, 1997）及びＣＤ１０５／エンドグリン／ＳＨ２+間葉系前駆細胞（Science, 284, 143-147, 1999, Arthritis Res., 2, 477-488, 2000, Biochem Biophys Res Commun., 265, 134-139, 1999）が含まれているため、本発明者らは、ＰＢＭＣからＣＤ１４、ＣＤ３４又はＣＤ１０５に対する陽性細胞を除去することによりもたらされるＭＯＭＣのインビトロ誘導における効果を考察した。図３ｂに示したとおり、ＣＤ１４+単球の除去によりＭＯＭＣの出現は、ほぼ完全に阻害されたが、ＣＤ３４+又はＣＤ１０５+細胞を除去しても何の効果も生じなかった。ＭＯＭＣが循環単球由来であることをさらに確認すべく、ＰＢＭＣからＣＤ１４+単球を分離し、ＰＫＨ６７で標識し、非標識ＣＤ１４-細胞共存下においてフィブロネクチンでコートしたプレート上で培養した。図３ｃに示すように、培養一週間後にＰＫＨ６７標識単球はＣＤ３４を発現した。以上の知見を総合すると、ＭＯＭＣが循環ＣＤ１４+単球由来であることが示唆される。しかし、培養３日目に回収された非接着細胞にもＣＤ１４+細胞が有意比率で含まれており、ＣＤ１４+単球の一部のサブセットがフィブロネクチンへの付着能を有し、ＭＯＭＣに分化することが示唆される。
【００６０】
ＰＫＨ６７標識単球単独でフィブロネクチン上における培養を行うと、線維芽細胞様に変化したのは僅かな細胞のみで、ＣＤ３４の発現も培養７日目の時点でアップレギュレートされていなかった（図３ｃ）。この場合、単球におけるＣＤ３４発現を誘導するには、ＣＤ１４-細胞の培養上清を加えるだけで十分であった。さらに、フィブロネクチンコーティング処理を施していないプレート上で、ＣＤ１４-細胞とＰＫＨ６７標識単球を共培養すると、培養７日目にプレートに付着していた細胞数は低く、また、それら付着した細胞はＣＤ３４を発現していなかった（図３ｃ）。このことから、循環単球がＭＯＭＣに分化するには末梢血ＣＤ１４-細胞由来の液性因子（１若しくは２種以上）及びフィブロネクチンへの結合が必須であると考えられる。
【００６１】
ＭＯＭＣの分化プロセスにおいて、ＣＤ１４+単球が増殖するか否かを考察するため、ＣＤ１４+単球のＣＦＳＥ標識を行い、非標識ＣＤ１４-細胞とフィブロネクチン上で共培養した。連続的に接着細胞を回収してＣＦＳＥ標識の発色強度やＣＤ１４の発現をフローサイトメトリーにより調べた（図３ｄ）。殆ど全てのフィブロネクチン付着単球が、主に培養２４時間以内に増殖していたが、それ以降の培養期間においてもゆっくりとではあるが増殖していた。接着細胞は殆ど例外なくＣＦＳＥ標識ＣＤ１４+単球であり、ＣＤ１４-細胞画分において接着細胞が増殖する様子は観察されず、混入したＣＤ１４-細胞群中の特異的前駆細胞が生育する結果として、ＭＯＭＣが発生するのではないことが示唆される。
【００６２】
実施例２０（ＭＯＭＣのフェノタイプ）
ＭＯＭＣにおける種々の細胞表面分子及び細胞内分子の発現を、フローサイトメトリー及び免疫組織化学法により調べ（図２及び図４）、そのタンパク質発現プロフィールを、単球、マクロファージ及び樹状細胞のものと比較した（表２）。ＭＯＭＣは、造血及び単球系統マーカー遺伝子（ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ６４）を発現したが、樹状細胞マーカー遺伝子（ＣＤ１ａ及びＣＤ８３）は発現しなかった。ＭＯＭＣ上においてＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、及び共刺激分子（ＣＤ４０及びＣＤ８６）が発現されることから、ＭＯＭＣは抗原提示細胞として、抗原特異的Ｔ細胞活性の誘導能を有していることが強く示唆される。ＭＯＭＣは、造血幹／血管内皮細胞マーカー遺伝子ＣＤ３４、及び間葉系幹／血管内皮細胞マーカー遺伝子ＣＤ１０５／エンドグリン／ＳＨ２を発現した（Biochem Biophys Res Commun., 265, 134-139, 1999）。またＭＯＭＣは、幹細胞マーカー遺伝子Ｓｃａ−１を発現したが、別の幹細胞マーカー遺伝子であるＣＤ１１７／ｃ−ｋｉｔ及びＣＤ１３３は発現しなかった。またＭＯＭＣは、血管内皮細胞マーカー遺伝子であるＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン及びＦｌｔ−１／ＶＥＧＦＲ１陽性だったが、Ｆｌｋ−１／ＶＥＧＦＲ２及びｖＷＦの発現は認められなかった。ＭＯＭＣは、一般に間葉系由来細胞によって産生される細胞外マトリックスタンパク質であるＩ型及びIII型コラーゲン、フィブロネクチン及びビメンチン陽性だった。これらのタンパク質発現プロフィールは、５世代継代まで変化しなかった。ＭＯＭＣは単球及び単球由来食細胞とは異なるフェノタイプを示した。特に、幹細胞マーカー遺伝子（ＣＤ３４、Ｓｃａ−１及びＣＤ１０５）、血管内皮マーカー遺伝子（ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン及びＦｌｔ−１／ＶＥＧＦＲ１）、及び間葉系マーカー遺伝子（Ｉ及びIII型コラーゲン及びフィブロネクチン）の発現は、ＭＯＭＣ独特の特徴だった。従って、ＭＯＭＣは、食細胞、血管内皮細胞、間葉系細胞及び幹細胞のフェノタイプを併せもつ細胞であるとの認識が成立する。
【００６３】
【表２】
2006014741.tif 000003
【００６４】
実施例２１（ＭＯＭＣの増殖能）
培養中にＭＯＭＣが増加する様子が認められた。この観察結果が細胞分裂に基づくものかを考察すべく、ＭＯＭＣにおける分裂細胞の比率をＢｒｄＵ染色によって連続的に調べた（図５ａ）。半数近くの接着細胞が、継代１日後にＢｒｄＵによって染色されたが、ＢｒｄＵ+細胞は培養５日目に著減した。１、３、５、７及び１０日目に、全接着細胞におけるＢｒｄＵ+細胞の割合を計算したところ、ＢｒｄＵ+細胞の比率は、培養１日目に最大を示し、以後経時的に減少した。ヨウ化プロピジウム染色陽性細胞は、どの時点においても１％未満だった。ＣＦＳＥ標識を行って調べた結果、ＭＯＭＣが継代後に活発かつ同調的に分裂している様子が認められ、優勢的に増殖している細胞部分はなかった（図５ｃ）。以上の知見は、ＭＯＭＣが培養中における増殖能を有し、また、主に継代直後に増殖することを示唆するものである。
【００６５】
実施例２２（ＭＯＭＣの間葉系細胞系統へのインビトロ分化）
ＭＯＭＣは、間葉系細胞にみられるいくつかの形態及びフェノタイプ上の特徴を備えていたことから、ＭＯＭＣは、いくつかの間葉系統へと分化誘導していく能力を有しているとの仮説をたてた。この仮説を確かめるため、ＭＳＣを骨、骨格筋、軟骨及び脂肪へと分化誘導することが知られている各種条件下でＭＯＭＣを培養した。
【００６６】
骨への分化誘導処理を施したＭＯＭＣの形態は、紡錐形から類円形へと変化した。殆ど全ての接着細胞でカルシウム沈着が生じているのが、アリザリンレッド染色から観察され（図６ａ）、それら接着細胞はアルカリフォスファターゼを発現していた（図６ｂ）。この過程で、細胞内カルシウム含量が顕著な増加を示した（図６ｃ）。骨形成誘導後、ＭＯＭＣは、成熟骨細胞が産生する骨シアロタンパク質II、オステオカルシン（Calcif Tissue Int., 62, 74-82, 1998）や、骨特異的転写因子オステリックス（Cell, 108, 17-29, 2002）のｍＲＮＡを発現した。他方、かかる誘導処理後、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＣＤ１４の発現は消失した（図６ｄ）。
【００６７】
ＭＯＭＣを５−アザシチジンで処理し、筋への分化誘導条件下で３週間培養したところ、細胞は細長くなったものの筋細胞のような複数核をもつ細胞は出現しなかった。この時点で、検体によってその割合は異なるが、４５〜６０％の接着細胞においてＳｋＭ−アクチン及びＳｋＭ−ＭＨＣの発現が誘導されていた（図６ｅ及びｆ）。ＲＴ−ＰＣＲを行った結果、筋特異的転写因子マイオジェニンのｍＲＮＡ及びＳｋＭ−ＭＨＣのｍＲＮＡが誘導後に検出された（図６ｇ）。ＣＤ３４、ＣＤ１４及びＣＤ４５の発現は減少したが消失はしなかった。免疫組織化学分析の結果、ＣＤ３４は殆ど全ての接着細胞で発現したが、ＣＤ１４及びＣＤ４５は、ＳｋＭ−ＭＨＣを発現しなかった細胞でその発現をみた（データは示さず）。培養した筋芽細胞、筋組織、さらには横紋筋肉腫細胞株においてさえ検出可能レベルのＣＤ３４が発現され、これは原始筋細胞のサブセットにおけるＣＤ３４発現と一致するものだった（J Cell Biol., 150, 1085-1100, 2000）。
【００６８】
軟骨形成を誘導するため、ＭＯＭＣをＴＧＦ−β１の存在下、マイクロマス懸濁液中で培養した。これは、ＭＳＣにおいて軟骨細胞の分化を誘導するための標準的な手法である（Science, 284, 143-147, 1999, Tissue Eng., 4, 415-428, 1998, Arthritis Rheum., 44, 85-95, 2001）。しかし、プレート上での液滴マイクロマス、及び円錐管中でのペレットマイクロマスによるいくつかの別のプロトコールに従った場合においても、ＭＯＭＣは１週間以内に死滅した。そこで、ＴＧＦ−β１存在下で単層ＭＯＭＣを３週間培養した。図６ｈに示すように、関節軟骨特有のII型コラーゲンは、無処理のＭＯＭＣで弱く発現していたが、その発現は誘導処理後に顕著にアップレギュレートされた。ＲＴ−ＰＣＲの結果からさらに、誘導処理後に軟骨細胞特異的II型及びＸ型コラーゲンの発現がアップレギュレートされていることが明らかになった（図６ｉ）。ＣＤ４５及びＣＤ１４の発現は消失したが、ＣＤ３４の発現は誘導処理後も保持された。他方、ＣＤ３４は軟骨肉腫細胞株においても発現がみられた。
【００６９】
電子顕微鏡観察の結果、ＭＯＭＣには脂質滴が僅かに認められたが（図１ｄ、ｆ及びｇ）、誘導処理後に脂質液胞が出現し、その大きさ、数量ともに経時的に増加した。これら脂質液胞はオイル-レッドＯで染色された（図６ｊ）。この誘導処理の結果、検体によって割合は異なるが、５０〜８０％の接着細胞が、この系統にコミットしていた。ＰＰＡＲγ遺伝子のｍＲＮＡ及び脂肪酸結合タンパク質ａＰ２のｍＲＮＡは、ＭＯＭＣによって弱く発現されたが、これらの遺伝子発現は上記誘導処理後、顕著にアップレギュレートされた（図６ｋ）。ＣＤ４５及びＣＤ１４のｍＲＮＡ発現は消失したが、ＣＤ３４発現は、誘導処理後も保持された。他方、ＣＤ３４は脂肪組織においても発現がみられた。
【００７０】
ＰＢＭＣから新たに産生されたＭＯＭＣ、５世代まで継代培養したＭＯＭＣ、又は低温保存されたＭＯＭＣにおいても同様に間葉系細胞系統への分化が観察された。さらに、ドナー５名から得たＭＯＭＣも同様の多分化能を有していた。成熟間葉系細胞であるヒト皮膚線維芽細胞株２種と、新たに単離したＣＤ１４+単球及びマクロファージを同一誘導条件下でそれぞれ培養した。３週間後、皮膚線維芽細胞は、上記条件下において外見は健常だったものの分化傾向は示さなかった。１週間後、上記培養条件下にあった循環単球及びマクロファージは、何ら外見上の分化傾向をみせないままに脱離していた。系統特異的分化は、培養３週間後に付着細胞の半分以上で観察された。しかし付着細胞数は、培養当初の細胞数より２０〜５０％減少し、ＭＯＭＣの多くが誘導処理の過程において脱離していったと考えられた。
【００７１】
ある系統への分化が各種誘導処理特異的であるかどうかを調べるために、各処理における培養物をアリザリンレッド、オイル-レッドＯで交叉染色し、また、ＳｋＭ−ＭＨＣ若しくはII型コラーゲン免疫染色も行った。これらの細胞は目的とする系統に特異的な染色に対してのみ陽性で、それ以外の染色に対してはすべて陰性だった（データは示さず）。さらに、インビトロアッセイにおいて、目的とする系統以外の系統に一部のサブセットが分化する可能性を探るため、３週間分化誘導処理した細胞を高感度ＲＴ−ＰＣＲにかけて、その発現が骨形成（オステオカルシン）、筋形成（ＳｋＭ−ＭＨＣ）、軟骨形成（II型コラーゲン）、又は脂肪形成（ａＰ２）系統に限定的な複数遺伝子の転写物を増幅した。系統特異的遺伝子の発現は、目的とする系統に特異的であり（データは示さず）、分化が、施した処理に特異的に起きることが示唆された。
【００７２】
分化した間葉系細胞が、ＭＯＭＣ画分に混入したＭＳＣとしての分化能をもつ細胞に由来する可能性を除外するために、誘導処理を行う前にＭＡＣＳ分離システムにより、ＭＯＭＣからＣＤ１４+細胞をポジティブに精製した。その結果は予想どおり、かかる選択処理をしないＭＯＭＣにおけると同様に、骨形成、筋形成、軟骨形成、及び脂肪形成への分化が認められた。また、ＣＤ３４又はＣＤ１０５／エンドグリン／ＳＨ２を発現する細胞を、ＰＢＭＣ培養開始時に除去しても、間葉系細胞への分化には影響がなかった。さらに、系統特異的転写因子であるＣｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２（Cell, 89, 755-764, 1997）、ＭｙｏＤ（Front Biosci., 5, D750-767, 2000）、Ｓｏｘ−９（Osteoarthritis Cartilage, 8, 309-334, 2000）、及びＰＰＡＲγ（J Biol Chem., 276, 37731-37734, 2001）の、誘導処理１週間後におけるＭＯＭＣ上での発現を調べた。この時点でＭＯＭＣはＣＤ４５を発現しているので、骨形成、筋形成、軟骨形成、及び脂肪形成誘導処理を行ったＭＯＭＣに二重染色を施し、ＣＤ４５及び個々の転写因子の発現を調べた。図７に示すように、１週間にわたる骨形成分化を経たＭＯＭＣは、細胞膜及び細胞質にＣＤ４５を発現し、核にＣｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２を発現した。同様に、ＣＤ４５／ＭｙｏＤとＣＤ４５／Ｓｏｘ−９の同時発現が、それぞれ１週間の筋形成及び軟骨形成分化誘導を受けたＭＯＭＣで認められた。ＰＰＡＲγは、無処理ＭＯＭＣの核において弱く発現されていたが、１週間の脂肪形成誘導後、ＰＰＡＲγの発現は増加し、ＣＤ４５の発現が減少した。これらの知見は、特異的分化誘導条件下でＣＤ４５+造血細胞の系統特異的分化が生じることを示唆するものである。免疫組織化学法及びＲＴ−ＰＣＲ法による測定の結果、ＰＰＡＲγ以外の上記系統特異的転写因子の発現は、誘導処理３週間後に消滅していることがわかった（データは示さず）。これらの知見より、ＭＯＭＣが、誘導処理過程の初期分化段階において、上記系統特異的転写因子を一過性に発現することが示唆される。
【００７３】
実施例２３（ＭＯＭＣの心筋細胞へのインビトロ分化）
神経、心筋前駆細胞に発現するマーカーであるネスチン（Brown）が、共培養８日目のＭＯＭＣに発現し、周囲ラット培養心筋細胞との結合が観察された（図８Ａ）。
【００７４】
ＰＫＨ６７（Green）で標識されたＭＯＭＣが心筋細胞特異的転写因子であるＮｋｘ２．５、ｅＨＡＮＤ（Red/Alexa568：Molecular Probe社）を発現し、同時に血球系マーカーであるＣＤ４５（Blue/Alexa660：Molecular Probe社）を発現していた（図８Ｂ、図８Ｃ）。これはヒト末梢血血球細胞由来のＭＯＭＣの心筋細胞への分化過程を示すものである。
【００７５】
ヒト特異的ＰＣＲプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲでは、陽性コントロールのヒト心筋では心筋細胞構造蛋白であるミオシン軽鎖（ＭＬＣ２ｖ）の発現が認められ、陰性コントロールのラット心筋、共培養前のＭＯＭＣでは発現が認められない。共培養後１２日目のＭＯＭＣにおいてヒトＭＬＣ２ｖの発現が認められた（図８Ｄ）。
【００７６】
これらのことから、ＭＯＭＣをラット心筋細胞と共培養することにより、ＭＯＭＣの心筋細胞への分化が誘導され、共培養８−１０日目には心筋前駆細胞のマーカーが発現され、１２−１４日目には心筋構造蛋白が発現されることが証明された。
【００７７】
実施例２４（ＭＯＭＣの神経細胞へのインビトロ分化）
神経、心筋前駆細胞に発現するマーカーであるネスチン（Brown)が、共培養８日目のＭＯＭＣに発現し、周囲ラット培養神経細胞へ向かう神経突起の伸長が観察された（図９Ａ）。
【００７８】
共培養４日目にはＰＫＨ６７（Green）で標識されたＭＯＭＣが神経細胞特異的転写因子であるＮｅｕｒｏＤ（Red/Alexa568：Molecular Probe社）を発現し、同時に血球系マーカーであるＣＤ４５（Blue/Alexa660：Molecular Probe社）を発現していた（図９Ｂ）。これはヒト末梢血血球細胞由来のＭＯＭＣの神経細胞への分化過程を示すものである。
【００７９】
共培養３日目にはＭＯＭＣがネスチン（Green/Alexa488：Molecular Probe社）を発現すると同時に神経細胞特異的転写因子であるNeurogenin2 （Red/Alexa568：Molecular Probe社）を発現していた（図９Ｃ）。このことから、ＭＯＭＣが神経細胞への分化が決定された神経細胞の前駆細胞であることが示された。
【００８０】
ウィスターラット培養神経細胞と９日間の共培養では、ＫＨ６７（Green）で標識されたＭＯＭＣにおいて成熟した神経のマーカーであるＨｕ、ＮｅｕＮ(Red/Alexa568：Molecular Probe社)の発現が認められた（図９Ｄ、図９Ｅ）。このことからＭＯＭＣが成熟した神経細胞まで分化することが証明された。
【００８１】
実施例２５（ＭＯＭＣの血管内皮細胞へのインビトロ分化）
ＥＢＭ−２培地で７日間分化誘導したＭＯＭＣは紡錘形から多数の突起を有する形態に変化し、もともと発現していなかった血管内皮細胞に特異的なｖＷＦ、ｅＮＯＳ、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を発現した。
【００８２】
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析では、ＥＢＭ−２培地で７日間分化を誘導したＭＯＭＣで血管内皮に特徴的なＦｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＣＤ３１、ＣＤ１４４、ｖＷＦの遺伝子発現を認めた。Ｆｌｔ−１とＣＤ３１はＭＯＭＣで発現がみられたが、他の遺伝子は誘導後に発現された。分化誘導後にＣＤ３４の発現は増強し、ＣＤ４５、ＣＤ１４の発現は消失した。
【００８３】
これらの成績から、ＭＯＭＣを血管内皮細胞維持培地で培養することにより、血管内皮細胞への分化が誘導されることが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明のＭＯＭＣの形態を示す図である。（ａ，ｂ）ＰＢＭＣをフィブロネクチン上、１０％ＦＢＳ添加低グルコースＤＭＥＭにおいて７日間培養し、位相差顕微鏡下での観察を行った。原倍率は、ａが×８０、ｂが×４０である。フィブロネクチンでコートした新たなプレートにＭＯＭＣを移し替え、２４時間培養した。（ｃ）位相差顕微鏡観察結果を示す画像である（×４０）。（ｄ、ｅ）電子顕微鏡観察結果を示す画像である（ｄ及びｅ、×５０００；ｆ及びｇ、×３００００）。中間フィラメントの束を矢印で示し、棒状微小管に似た構造物を矢頭で示した。Ｌは迷路状の細胞小胞、ＬＤは脂質滴、Ｎは核、ＰＳは偽足をそれぞれ示している。
【図２】本発明のＭＯＭＣのフローサイトメトリー分析結果を示す図である。ＰＢＭＣをフィブロネクチンでコートしたプレート上で培養し、７日目に接着細胞を回収し、図中に示した一連のモノクローナル抗体で染色してフローサイトメトリー分析を行った。斜線を施したヒストグラムは、目的分子の発現を示している。白抜きのヒストグラムは、アイソタイプが一致するコントロールモノクローナル抗体で染色したコントロールを示している。この結果は、少なくとも３回実施した実験から得たものである。
【図３】本発明のＭＯＭＣが循環ＣＤ１４+単球由来であることを説明する図である。（ａ）ＰＢＭＣをフィブロネクチン上で、１時間、１日、３日、５日、７日、１０日及び１４日間、それぞれ培養した。接着細胞を回収し、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１４抗体及びＰＣ５結合抗ＣＤ３４モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーにかけた。この結果は、個別に３回行った実験から得たものである。（ｂ）ＣＤ１４+細胞、ＣＤ３４+細胞又はＣＤ１０５+細胞を消失させたＰＢＭＣ、並びにモック処理を施した細胞を、フィブロネクチン上で７日間培養した。１ｃｍ3あたりに付着した細胞数を数え、その結果を無処理ＰＢＭＣ培養における付着細胞数に対する割合として表した。この結果は、３名のドナーから得た数値の平均及びＳＤである。図中のアステリスクは、モック処理ＰＢＭＣ培養と比較したときの有意差を示す。（ｃ）ＭＡＣＳ（磁気細胞分離装置）でソーティングしたＣＤ１４+単球を、ＰＫＨ６７染色し、非標識ＣＤ１４-細胞の存在／非存在下（割合１：４）にて、フィブロネクチンでコートした、若しくはコーティングを施していないプラスチックプレート上で７日間培養した。接着細胞を回収し、ＰＣ５結合抗ＣＤ３４モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を行った。この結果は、３回の実験から得たものである。（ｄ）ＭＡＣＳでソーティングしたＣＤ１４+単球のＣＦＳＥ染色を行い、フィブロネクチン上で、０、１、３、５日間それぞれ培養した。接着細胞を回収し、ＰＣ５結合抗ＣＤ１４モノクローナル抗体で染色した。これらの細胞のフローサイトメトリー分析を行った。この結果は、実験を３回実施して得たものである。
【図４】本発明のＭＯＭＣの組織免疫化学分析結果を示す図である。ＰＢＭＣをフィブロネクチンでコートしたプレート上で７日間培養して得られたＭＯＭＣを、フィブロネクチンでコートしたチャンバースライド上に移した（Ｉ型コラーゲンをコートしたスライドは、フィブロネクチン染色のためにだけ用いた）。培養２４時間後に、上記スライドを１０％ホルマリンに固定し、図中に示したモノクローナル抗体でそれぞれ染色した。ヘマトキシリンで核を対比染色した。原倍率は、×１００である。この結果は、少なくとも３回実施した実験から得たものである。
【図５】本発明のＭＯＭＣが増殖する様子を示した図である。フィブロネクチンでコートしたプレート上、ＰＢＭＣを７日間培養して得られたＭＯＭＣを、フィブロネクチンでコートしたチャンバースライド上に移した。ＭＯＭＣをさらに１、３、５、７、１０日間培養し、ＢｒｄＵ染色を行った。核は、ヘマトキシリンで対比染色した。（ａ）１日目及び５日目における代表的な図である。矢印は、ＢｒｄＵ染色陽性の核を示す。（ｂ）ＢｒｄＵ染色の結果をみるために少なくとも２００個の細胞を数え、１、３、５、７、１０日間培養した各スライド上のＢｒｄＵ+細胞数を算定した。結果は、５回行った実験から得た結果の平均及びＳＤである。（ｃ）ＭＯＭＣをＣＦＳＥで標識し、フィブロネクチンでコートした新たなプレート上で、０、１、３、５日間培養した。接着細胞を回収し、フローサイトメトリー分析にかけた。この結果は３回実施した実験から得たものである。
【図６】本発明のＭＯＭＣが、骨、筋、軟骨、及び脂肪細胞へと分化する様子を示す図である。３週間の骨形成誘導を行う前後のＭＯＭＣをアリザリン赤で染色し（ａ、倍率×１００）、又はアルカリフォスファターゼ染色を行った（ｂ、×１００）。骨形成誘導処理前後のＭＯＭＣ及び線維芽細胞における細胞内カルシウム沈着量を測定し、タンパク質含量１μｇあたりのμｇ数として表した（ｃ）。３週間の骨形成誘導前後のＭＯＭＣと、骨肉腫細胞株におけるオステリックス、骨シアロタンパク質II（ＢＳＰ  II）、オステオカルシン、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現を調べた（ｄ）。３週間の筋形成誘導前後のＭＯＭＣを染色し、ＳｋＭ−アクチン（ｅ、×２００）又はＳｋＭ−ＭＨＣ（ｆ、×２００）染色を調べた。３週間の筋形成誘導前後のＭＯＭＣと、筋芽細胞、筋組織及び横紋筋肉腫細胞株におけるマイオジェニン、ＳｋＭ−ＭＨＣ、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現を調べた（ｇ）。３週間の軟骨形成誘導前後のＭＯＭＣを染色し、II型コラーゲン染色を調べた（ｈ、×４０）。３週間の軟骨形成誘導前後のＭＯＭＣと、軟骨肉腫細胞株におけるα１（II型）及びα１（Ｘ型）コラーゲン、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４並びにＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現を調べた（ｉ）。３週間の脂肪形成誘導前後のＭＯＭＣをオイル-レッドＯで染色した（ｊ、×２００）。３週間の脂肪形成誘導前後のＭＯＭＣと、脂肪組織におけるＰＰＡＲγ、ａＰ２、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現を調べた（ｋ）。この結果は、少なくとも５回行った実験から得たものである。
【図７】本発明のＭＯＭＣを、それぞれ一週間、間葉系へ分化させた後の、ＣＤ４５（緑）と組織特異的転写因子（赤）の共発現の様子を示す図である。誘導処理前のＭＯＭＣ（ａ−ｄ）と、骨形成（ｅ）、筋形成（ｆ）、軟骨形成（ｇ）若しくは脂肪形成（ｈ）の各誘導処理を１週間行ったＭＯＭＣにおいてみられるＣＤ４５と、Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２（ａ及びｅ）、ＭｙｏＤ（ｂ及びｆ）、Ｓｏｘ−９（ｃ及びｇ）若しくはＰＰＡＲγ（ｄ及びｈ）のそれぞれとの共局在性を免疫組織化学法で調べた。共焦点レーザー蛍光顕微鏡下（原倍率×２００）で細胞観察を行った。この結果は、３回行った実験から得られたものである。
【図８】本発明のＭＯＭＣが、心筋細胞へと分化する様子を示す図である。8日間ウィスターラット培養心筋細胞とともに共培養を行ったＭＯＭＣに発現したネスチン（茶）を免疫染色した（Ａ；×２００）。ＭＯＭＣを蛍光色素ＰＫＨ６７（緑）により細胞膜を標識した後に、ウィスターラット培養心筋細胞と７日間共培養を行い、心筋細胞特異的転写因子であるＮｋｘ２．５（赤）と、血球系マーカーであるＣＤ４５（青）の二重蛍光免疫染色を行った（Ｂ；×２００）。ＭＯＭＣを蛍光色素ＰＫＨ６７（緑）により細胞膜を標識した後に、ウィスターラット培養心筋細胞と８日間共培養を行い、心筋細胞特異的転写因子であるｅＨＡＮＤ（赤）と、血球系マーカーであるＣＤ４５（青）の二重蛍光免疫染色を行った（Ｃ；×２００）。ＭＯＭＣをウィスターラット培養心筋細胞と３日、６日、９日、１２日間、共培養を行い、心筋細胞構造蛋白であるミオシン軽鎖（ＭＬＣ２ｖ）のｍＲＮＡ発現を調べた（Ｄ）。この結果は、３回行った実験から得られたものである。
【図９】本発明のＭＯＭＣが、神経細胞へと分化する様子を示す図である。8日間ウィスターラット培養神経細胞とともに共培養を行ったＭＯＭＣに発現した、神経・心筋前駆細胞に発現するマーカーであるネスチン（茶）を免疫染色した（Ａ；×２００）。ＭＯＭＣを蛍光色素ＰＫＨ６７（緑）により細胞膜を標識した後に、ウィスターラット培養神経細胞と４日間共培養を行い、神経細胞特異的転写因子であるＮｅｕｒｏＤ（赤）と、血球系マーカーであるＣＤ４５（青）の二重蛍光免疫染色を行った（Ｂ；×２００）。ＭＯＭＣをウィスターラット培養神経細胞と３日間共培養を行い、ネスチン（茶）と神経細胞特異的転写因子であるNeurogenin２（赤）の二重蛍光免疫染色を行った（Ｃ；×２００）。ＭＯＭＣをウィスターラット培養神経細胞と３日間共培養を行い、ＰＫＨ６７（緑）と成熟した神経のマーカーであるＨｕ（赤）の二重蛍光免疫染色を行った（Ｄ；×２００）。ＭＯＭＣをウィスターラット培養神経細胞と９日間共培養を行い、ＰＫＨ６７（緑）と成熟した神経のマーカーであるＮｅｕＮ（赤）の二重蛍光免疫染色を行った（Ｅ；×２００）。この結果は、３回行った実験から得られたものである。
【図１０】本発明のＭＯＭＣが、血管内皮細胞へと分化する様子を示す図である。血管内皮細胞維持培地ＥＢＭ−２培地で７日間分化誘導したＭＯＭＣは紡錘形から多数の突起を有する形態に変化した（左；×２００）。ＥＢＭ−２培地で７日間分化誘導したＭＯＭＣに発現した、ＣＤ３４と血管内皮細胞に特異的なｖＷＦ、ｅＮＯＳ、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を免疫染色（茶）した（中；×２００）。ＭＯＭＣをＥＢＭ−２培地中で７日間培養し、血管内皮細胞に発現されるＦｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＣＤ３１、ＣＤ１４４、ｖＷＦおよびＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現を調べた（右）。この結果は、３回行った実験から得られたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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