(57)【要約】【課題】従来のニードル形ポルフィリン電解重合膜系センサーより柔軟性が高く、かつ細く、しかも人体内で長時間連続使用しても障害の生じないようなセンサーを提供すること。【解決手段】白金線の一端に金属ポルフィリン錯体の電解重合膜が形成され、当該一端および計測器との結合部分以外の部分を非電導性樹脂で被覆されてなるポルフィリン電解重合膜修飾白金線状センサー。【選択図】図１
2006242783.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
白金線の一端に金属ポルフィリン錯体の電解重合膜が形成され、当該一端および計測器との結合部分以外の部分を非電導性樹脂で被覆されてなるポルフィリン電解重合膜修飾白金線状センサー。
【請求項２】
ポルフィリン電解重合膜が、次の式（１）
【化１】
2006242783.tif 000005
（式中、Ｍは、鉄、マンガン、コバルト、クロムおよびイリジウムから選ばれた金属を示し、４つのＲのうち少なくとも１つは、チオフリル基、ピロリル基、フリル基、メルカプトフェニル基、アミノフェニル基およびヒドロキシフェニル基から選ばれるいずれかの基であり、他のＲは、前記の何れかの基またはアルキル基、アリール基もしくは水素原子を示す）
で表される金属ポルフィリン錯体の重合膜である請求項第１項記載のポルフィリン電解重合膜修飾白金線状センサー。
【請求項３】
非電導性樹脂が、実質的に人体に影響を与えない樹脂である請求項第１項または第２項記載のポルフィリン電解重合膜修飾白金線状センサー。
【請求項４】
次の式（２）
【化２】
2006242783.tif 000006
（式中、Ｍ'は、鉄またはマンガンを示し、４つのＲ'のうち少なくとも１つは２−チオフリル基または３−チオフリル基を示し、他のＲ'は前記の何れかの基またはアルキル基、アリール基もしくは水素原子を示す）
で表される金属ポルフィリン錯体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポルフィリン電解重合膜修飾白金線状センサーに関し、更に詳細には、生体中のスーパーオキシドアニオンラジカルを簡単に測定することのできるポルフィリン電解重合膜修飾白金線状センサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
スーパーオキシドアニオンラジカル(Ｏ２−・）などの活性酸素種は生体の維持に不可欠なものであるが、一方では、各種の疾患、癌、老化などの要因になることが知られており、医療等の分野において、その正確な量の計測法が種々検討されている。
【０００３】
従来、スーパーオキシドアニオンラジカルは、ケミルネッセンス法等の分光法が使用されていたが、近年は、シトクロムｃ（ｃｙｔ.ｃ）固定化電極によりスーパーオキシドアニオンラジカルのアンペロメトリーでの電気化学的検出が可能であることが示され、イン・ビボ(in vivo)測定への応用例が報告されている（非特許文献１）。しかし、シトクロムｃは、酵素であるため数日間で失活してしまい、長期の使用は不可能であるという欠点があった。また、エチレンオキサイドガス（ＥＯＧ）滅菌ができないため、実質的にイン・ビボでの使用は困難であった。
【０００４】
一方、本発明者は、先に全合成型の長期間安定なポルフィリン電解重合膜系センサー（ＰＥＰセンサー）を作製し、これをスーパーオキシドアニオンラジカル作用極として用いて三電極式セルを組み、スーパーオキシドアニオンラジカルが計測できることを報告した（特許文献１）。
【０００５】
上記方法により、安定してスーパーオキシドアニオンラジカル量を測定し、医療分野における利用が可能となったが、更にこの技術を改良し、その利用分野を広げることが求められていた。
【特許文献１】ＷＯ ０３／０５４５３６ Ａ１
【非特許文献１】Calum J. McNeil J. Electroanal. Chem. 347,267,(1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、前記のとおり長期間安定なポルフィリン電解重合膜系センサーを開発しており、その形状としてニードル形のものも提案している。しかし、先に提案したセンサーは、ある程度の剛性および太さを有するものであり、人体内に直接挿入し、スーパーオキシドアニオンラジカルを測ることは、被験者にある程度の苦痛を与えるものであった。
【０００７】
そこで、より柔軟性が高く、かつ細く、しかも人体内で長時間連続使用しても障害の生じないようなセンサーの開発が求められており、このようなセンサーを提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、電極金属として白金線を選択し、その円周面を非電導性樹脂で被覆し、白金線の一端にポルフィリン電解重合膜を形成すれば、センサー形状が極めて細く、柔軟性に富み、しかも人体の静脈内で長時間使用可能なスーパーオキシドアニオンラジカル測定用センサーが得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、白金線の一端にポルフィリン電解重合膜が形成され、当該一端および計測器との結合部分以外の部分を非電導性樹脂で被覆されてなるポルフィリン電解重合膜修飾白金線状センサーを提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のポルフィリン電解重合膜修飾白金線状センサー（以下、「Ｐｒ修飾Ｐｔセンサー」ということがある）は、白金線を素材として形成されたものであるので、しなやかでかつ可撓性を有するものであり、その製作も容易である。
【００１１】
そして、白金は電導性が高く、白金線の直径が０.５ｍｍ程度のものであっても十分にスーパーオキシドアニオンラジカルが測定できるので、人体内の静脈等に挿入できるセンサーとすることができ、その場（in situ）での計測が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のＰｒ修飾Ｐｔセンサーは、その実施態様を図１に模式的に示すように、一端が露出し、他の大部分は非電導性樹脂で被覆された白金線の露出部分を、ポルフィリン電解重合膜で修飾することにより調製されたものである。図中、１はＰｒ修飾Ｐｔセンサー、２は白金線、３は非電導性樹脂、４はポルフィリン電解重合膜を意味する。
【００１３】
本発明で使用する白金線２は、スーパーオキシドアニオンラジカルが測定できる程度の電流を流すことができるものであれば良く、例えば、その直径が、０.０５ないし１ｍｍ程度のものであれば良く、好ましくは、０.３ｍｍのものである。
【００１４】
一方、この白金線２を被覆する非電導性の樹脂３としては、非電導性であるほか、実質的に人体に影響を与えないものであることが好ましい。すなわち、免疫源となりにくく、また血小板等の凝集因子が付着しにくいものであることが好ましい。このような非電導性樹脂の例としては、フッ素系樹脂、シリコーン系樹脂等が挙げられる。
【００１５】
更に、上記した白金線２の露出部分を修飾するポルフィリン電解重合膜４としては、例えば、次の式（１）
【化３】
2006242783.tif 000003
（式中、Ｍは、鉄、マンガン、コバルト、クロムおよびイリジウムから選ばれた金属を示し、４つのＲのうち少なくとも１つは、チオフリル基、ピロリル基、フリル基、メルカプトフェニル基、アミノフェニル基およびヒドロキシフェニル基から選ばれるいずれかの基であり、他のＲは、前記の何れかの基またはアルキル基、アリール基もしくは水素原子を示す）
で表される金属ポルフィリン錯体の重合膜が好ましい。また、上記金属ポルフィリン錯体は、イミダゾールやその誘導体、ピリジンやその誘導体、アニリンやその誘導体、ヒスチジンやその誘導体、トリメチルアミンやその誘導体等の窒素系軸配位子；チオフェノールやその誘導体、システインやその誘導体、メチオニンやその誘導体等の硫黄系軸配位子；安息香酸やその誘導体、酢酸やその誘導体、フェノールやその誘導体、脂肪酸やその誘導体、水等の酸素系軸配位子で配位されていても良い。
【００１６】
この金属ポルフィリン錯体による重合膜４の形成方法は、既に公知であり、例えば、前記ＷＯ ０３／０５４５３６ Ａ１等に記載の方法に従って実施することができる。
【００１７】
なお、上記式（１）の金属ポルフィリン錯体のうち、次の式（２）で表される化合物は、いずれも硫黄原子を有するため、他の金属ポルフィリン錯体より厚いポルフィリン重合膜を容易に形成することができる。
【００１８】
【化４】
2006242783.tif 000004
（式中、Ｍ'は、鉄またはマンガンを示し、４つのＲ'のうち少なくとも１つは２−チオフリル基または３−チオフリル基を示し、他のＲ'は前記の何れかの基またはアルキル基、アリール基もしくは水素原子を示す）
【００１９】
従って、これらにより形成される金属ポルフィリン錯体の重合膜を利用することにより、断面積が小さいことが要求される白金線の端部であっても、十分な検出感度のある、優れたＰｒ修飾Ｐｔセンサーとすることができる。
【００２０】
本発明のＰｒ修飾Ｐｔセンサー１の作製の一例を具体的に説明すれば次のとおりである。すなわち、適当な太さの白金線２を、非電導性樹脂３の熱収縮チューブ、例えば、フッ素系熱収縮チューブ中に挿入し、加熱することで被覆白金線が得られる。
【００２１】
次いで、この被覆白金線を切断し、この切断面を清浄化し、これを作用極として電解重合を行なう。この清浄化は、有機系溶媒を使用し、必要により、超音波洗浄を組み合わせても良い。
【００２２】
更に、清浄化された白金線断面上を、ポルフィリン重合膜４で修飾し、Ｐｒ修飾Ｐｔセンサーを作製する。このポルフィリン重合膜４での修飾は、例えば、上記式（１）の金属ポルフィリン錯体を４７ｍＭ程度で含有する有機溶媒に、必要であれば支持電解質を加え、アルゴンなどの不活性気体中、例えば、５０ｍＶ／ｓｅｃ程度の掃引速度で、２３〜７５回程度、銀／塩化銀電極に対し０Ｖ〜２.０Ｖ程度の電位で電位掃引を行えば良い。
【００２３】
かくして得られた、Ｐｒ修飾Ｐｔセンサー１は、従来公知のアンペロメトリーまたはポテンショメトリーを利用することにより、スーパーオキシドアニオンラジカルの濃度を測定することができる。
【００２４】
そして、本発明のＰｒ修飾Ｐｔセンサー１は、素材である白金線のしなやかさや可撓性を有するものであり、その直径も０.５ｍｍ程度以下のものであっても十分にスーパーオキシドアニオンラジカルが測定できるので、人体内の静脈等に挿入し、その場（in situ）での計測が可能なセンサーとすることができる。
【実施例】
【００２５】
以下、合成例および実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるものではない。
【００２６】
合 成 例  １
５−（３−チエニル）−１０,１５,２０−トリエチルポルフィリン（Ｈ２３
ＴｈＴＥｔＰ）の合成：
３リットルビーカー内で、プロピオン酸１ｌを撹拌しながら約８０℃まで加熱した後、これに３−チオフェンカルバルデヒド２.７ｍｌ（３.０×１０−２ｍｏｌ）とプロピオンアルデヒド６.６ｍｌ（１.２×１０−２ｍｏｌ）を混合させた溶液と、ピロール９.１ｍｌ（１.３×１０−１ｍｏｌ）を同時に少量ずつ加え、８０℃で一時間還流を行った。この後、放冷、氷冷を行い、エバポレーションを行い、クロロホルムに溶解させた。
【００２７】
その溶液を分液ロートに移して、水酸化ナトリウム水溶液を加え、分液を三回行った後、イオン交換水でさらに分液を三回行った。さらに、得られた溶液を大過剰のヘキサンへ滴下した後、ヘキサンで洗浄しながら吸引ろ過を行い、ろ液をエバポレーションし、紫色の結晶を得た。
【００２８】
さらに、得られた結晶をカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム、充填剤：シリカゲル、Ｒｆ値：０.８３）で展開して精製した後、再度、カラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／ヘキサン（５／１）、充填剤：シリカゲル、Ｒｆ値：０.５４）で展開して精製した。減圧乾燥（５０℃、３時間）を経て、５−（３−チエニル）−１０,１５,２０−トリエチルポルフィリン（Ｈ２３ＴｈＴＥｔＰ）が得られた（収量：１４０ｍｇ、収率：１％）。
【００２９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３,３００ＭＨｚ,δ−ｐｐｍ）：
−２.８１（ｓ,２Ｈ）,１.９８（ｑ,９Ｈ）,４.８０（ｔ,６Ｈ）,７.５１（ｓ,１Ｈ
）,７.８２（ｓ,２Ｈ）,８.８１（ｄ,２Ｈ）,９.２４（ｄ,２Ｈ）,９.３１（ｄ,４Ｈ
）.
ＭＳ（ＦＡＢ,ｍ／ｚ）：
計算値  Ｍ＋  ４７６.４；  実測値  ４７６.
ＵＶ−ｖｉｓ.（λｍａｘ,ｎｍ,  ＣＨＣｌ３）：
４２０,  ５２０,  ５５５,  ５９９,  ６５５。
【００３０】
合 成 例  ２
鉄５−（３−チエニル）−１０,１５,２０−トリエチルポルフィリン（Ｆｅ３
ＴｈＴＥｔＰ）の合成：
５００ｍＬ四つ口フラスコ（中央口にはアルゴンバルーン付きの三方コックを介して真空ポンプをセットし、残りの三口はグリースを塗った平栓を用いて空気の混入を防いだ）を１０分間アルゴン（Ａｒ）脱気した後、４８％臭化水素酸５ｍＬ（６.４×１０−２ｍｏｌ）を加え、さらに５分間Ａｒ脱気した。
【００３１】
脱気後、還元鉄０.２ｇ（３.６×１０−３ｍｏｌ）を加え、９０℃で１５分間還流した。白色のＦｅＢｒ２を確認後、三方コックと真空ポンプで未反応の臭化水素酸を除去した。除去後フラスコ内をＡｒ置換し、あらかじめＡｒ脱気しておいたジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００ｍｌを加えて中和し、さらにＡｒ脱気しておいたＨ２３ＴｈＴＥｔＰ０.３０ｇ（６.３×１０−４ｍｏｌ）を溶解したＤＭＦ溶液１５０ｍＬを加えた。フラスコの中央口の三方コックをジムロート冷却器に換え、１４０℃で４時間還流した。還流はＡｒ雰囲気下で行った。
【００３２】
還流後、室温まで放冷し、エバポレーション・減圧乾燥することでＤＭＦを留去した。さらにクロロホルムで溶解後、濾過で不溶物を除去し、濾液を５％アンモニア水、さらにイオン交換水で抽出を行うことで臭化鉄（III）を除去した。溶出液に４８％臭化水素酸を３滴加え、エバポレーションすることでクロロホルムを留去し、さらに減圧乾燥（１２０℃,６時間）して黒色粉末である鉄５−（３−チエニル）−１０,１５,２０−トリエチルポルフィリン（Ｆｅ３ＴｈＴＥｔＰ）を得た（収量：０.２７ｇ,収率：８２％）。
【００３３】
ＭＳ（ＦＡＢ,ｍ／ｚ）：
計算値；Ｍ＋ ５３０  測定値；５３０。
ＵＶ−ｖｉｓ（λｍａｘ,ｎｍ,ＣＨＣｌ３）：
４２２, ５１９, ５８０。
ＩＲ（ＫＢｒ,ｃｍ−１）：
３１０７,  ２９３１,  １６２３,  １４９８,  １３１９,  １２０５,  １０８０,
１００３,  ９３３,  ８４４,  ７８５,  ７１９,  ６４７。
【００３４】
合 成 例  ３
５,１０,１５,２０−テトラキス−２−チオフリルポルフィリン（Ｈ２Ｔ２ＴｈＰ
）の合成：
プロピオン酸２００ｍｌ中に、２−チオフリルカルバルデヒド４.０ｍｌ（４.２８×１０−２ｍｏｌ）加え、攪拌しながら約１２０℃まで加熱し、ピロール２.８ｍｌ（４.０４×１０−２ｍｏｌ）を少量ずつ加えた後、さらに１６０℃で１時間還流を行った。この後、放冷、氷冷を行い、冷メタノールで洗浄しながら吸引ろ過し、さらに冷メタノールで超音波洗浄した後、減圧乾燥（１２０℃,１時間）することで、黒紫色粉末が得られた。
【００３５】
さらに、得られた粉末をカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム、充填剤：シラカゲル、Ｒｆ値：０.８５）で展開し精製した。溶出液をエバポレーションし、クロロホルム／ヘキサンで再結晶を行った。減圧乾燥（１２０℃、６時間）を経て、５,１０,１５,２０−テトラキス−２−チオフリルポルフィリン（Ｈ２Ｔ２ＴｈＰ）が得られた（収量７４０、収率１１％）。
【００３６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３,３００ＭＨｚ,δ−ｐｐｍ）：
−２.６５（ｓ,２Ｈ）,７.５１（ｔ,４Ｈ）,７.８７（ｄｄ,４Ｈ）,７.９３（ｄ,
４Ｈ）,９.０４（ｓ,８Ｈ）.
ＭＳ（ＦＡＢ,ｍ／ｚ）：
計算値 Ｍ＋ ６３８.９； 実測値 ６３８.
ＵＶ−ｖｉｓ（λｍａｘ,ｎｍ,ＣＨＣｌ３）：
４２３, ５２３, ５６１, ５９８, ６６１。
【００３７】
合 成 例  ４
鉄５,１０,１５,２０−テトラキス−２−チオフリルポルフィリン（ＦｅＴ２
ＴｈＰ）の合成：
５００ｍＬ四つ口フラスコ（中央口にはＡｒバルーン付きの三方コックを介して真空ポンプをセットし、残りの三口はグリースを塗った平栓を用いて空気の混入を防いだ）を１０分間Ａｒ脱気した後、４８％臭化水素酸５ｍｌ（６.４×１０−２ｍｏｌ）を加え、さらに５分間Ａｒ脱気した。
【００３８】
脱気後還元鉄０.２ｇ（３.６×１０−３ｍｏｌ）を加え、９０℃で１５分間還流し、白色のＦｅＢｒ２を確認後、三方コックと真空ポンプで未反応の臭化水素酸を除去した。除去後フラスコ内をＡｒ置換し、あらかじめＡｒ脱気しておいたジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００ｍｌを加えて中和し、さらにＡｒ脱気しておいたＨ２Ｔ２ＴｈＰ０.２０ｇ（３.１×１０−４ｍｏｌ）を溶解したＤＭＦ溶液１５０ｍｌを加えた。フラスコの中央口の三方コックをジムロート冷却器に換え、１４０℃で４時間還流した。還流はＡｒ雰囲気下で行った。
【００３９】
還流後、室温まで放冷し、エバポレーション・減圧乾燥することでＤＭＦを留去した。さらにクロロホルムで溶解後、濾過で不溶物を除去し、濾液を５％アンモニア水、さらにイオン交換水で抽出を行うことで臭化鉄（III）を除去した。溶出液に４８％臭化水素酸を３滴加えエバポレーションすることでクロロホルムを留去し、さらに減圧乾燥（１２０℃,６時間）し、黒色粉末である最終生成物（ＦｅＢｒ（Ｔ２ＴｈＰ））を得た（収量：０.１３ｇ,収率：６０％）。
【００４０】
ＭＳ（ＦＡＢ,ｍ／ｚ）：
計算値  Ｍ＋  ６９２；  実測値  ６９３.
ＵＶ−ｖｉｓ（λｍａｘ,ｎｍ,ＣＨＣｌ３）：
４２６,  ５８１。
【００４１】
実 施 例  １
ポルフィリン電解重合膜修飾白金ワイヤーセンサー作製：
白金ワイヤー（φ０.３０ｍｍ）を、フッ素系熱収縮チューブの内径に挿入、加熱することで被覆した。これを切断し、切断面をアセトン中で１０秒間超音波洗浄した。これを作用極とし、下記条件で電解重合を行い、白金ワイヤーの一方の切断面上にポルフィリン（ＦｅＢｒ（Ｔ２ＴｈＰ））重合膜を形成し、ポルフィリン電解重合膜修飾白金ワイヤーセンサーを作製した。なお、白金上へのポルフィリン修飾は、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）で確認した。
【００４２】
重合条件：
電解質：        ＦｅＢｒ（Ｔ２ＴｈＰ）      ４７ｍＭ
Ｉｍ                      ２５０ｍＭ
支持電解質：    ＴＢＡＰ                  ０.０１Ｍ
溶  媒：        ジクロロメタン
セ  ル：        アルゴン雰囲気
電解条件：      走引速度        ５０ｍＶ／ｓｅｃ
電    位        ０〜２.０Ｖ
（ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）
重合時間        ７５サイクル
【００４３】
実 施 例  ２
アンペロメトリーによるスーパーオキシドアニオンラジカルの測定：
キサンチン３００μＭを含むリン酸塩緩衝測定溶液（ｐＨ７.４）を用い、実施例１で得たポルフィリン電解重合膜修飾白金ワイヤーセンサーを作用極、白金ワイヤー（φ０.３０ｍｍ）を対極、別の白金ワイヤー（φ０.３０ｍｍ）を参照極として３電極式セルを構成した。この３電極式セルの各配線を、アンペロメーターの各端子に接続し、リン酸塩緩衝測定溶液を入れた微小サンプルホルダーに参照極を入れた後、白金に対し１４０ｍＶの電位を印加し、電流値の経時変化の測定を開始した。
【００４４】
測定開始後、電流値が定常状態になってから、セル中にＸＯＤ ２５ｍＵ／ｍｌをマイクロシリンジで添加し、そのときの電流変化を測定し、スーパーオキシドアニオンラジカルを検出した。このときのクロノアンペトメトリーを図２に示す。
【００４５】
実 施 例  ３
ポテンショメトリーによるスーパーオキシドアニオンラジカルの測定：
上記（１）と同様にして３電極式セルを構成し、この電極の各配線をポテンショメーターの各端子に接続した。スーパーオキシドアニオンラジカル測定の前処理として、実施例１で得たポルフィリン電解重合膜修飾白金ワイヤーセンサーをリン酸塩緩衝測定溶液（ｐＨ７.４）中で、白金に対し９０ｍＶの電位を３００秒間印加した。
【００４６】
セル中のリン酸緩衝測定溶液を、キサンチン３００μＭを含むリン酸塩緩衝測定溶液に変え、参照極を、リン酸緩衝測定溶液を入れた微小サンプルホルダーに入れた後、３電極式セルにて開回路電圧の変化を測定した。測定開始後、電圧が定常状態になってから、ＸＯＤ１２.５〜７５ｍＵ／ｍｌをマイクロシリンジで添加し、そのときの開回路電圧の変化を測定してスーパーオキシドアニオンラジカルを検出した。このときのポテンショメトリーを図３に示す。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明のＰｒ修飾Ｐｔセンサーは、その素材が白金であるのでしなやかさや可撓性を有し、また、その太さは直径で０.５ｍｍ程度以下にできるものである。
【００４８】
従って、このＰｒ修飾Ｐｔセンサーは、通常のスーパーオキシドアニオンラジカル測定用の他、人体内の静脈等に挿入し、その場（in situ）での計測が可能なセンサーとすることができるので、医療の分野の臨床や研究に利用することが可能なものである。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明のＰｒ修飾Ｐｔセンサーの構造を模式的に示す図面である。
【図２】実施例２のクロノアンペトメトリーの結果を示す図面である。
【図３】実施例３のポテンショメトリーの結果を示す図面である。
【符号の説明】
【００５０】
１ … … Ｐｒ修飾Ｐｔセンサー
２ … … 白金線
３ … … 非電導性樹脂
４ … … ポルフィリン電解重合膜
【図１】
2006242783.tif 000007
【図２】
2006242783.tif 000008
【図３】
2006242783.tif 000009