(57)【要約】【課題】  被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を高い特異性および高い感度をもって検出する方法を提供すること。【解決手段】  被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出する方法であって、ａ）  前記被検試料の存在下で、アレル特異的プライマー、アレル共通プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、前記アレル特異的プライマーは、標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列およびタグ配列を有しており、前記アレル共通プライマーは、前記アレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有しており；ｂ）  工程ａから得られたＰＣＲ増幅産物およびタグ配列認識プローブの存在下で、二本鎖特異的５’→３’エキソヌクレアーゼを用いてＤＮＡ分解反応を行い；そしてｃ）  工程ｂにおいてタグ配列認識プローブが分解されたか否かを検出することにより、標的塩基配列中の一塩基変異を検出するの各工程を含む方法。【選択図】  図１
2006075126.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出する方法であって、
ａ）  前記被検試料の存在下で、第１および第２のアレル特異的プライマー、アレル共通プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、ここで、前記第１および第２のアレル特異的プライマーは、標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異に対応する塩基を有し、第１および第２のアレル特異的プライマーの３’末端の塩基は互いに異なっており、かつその相補的な配列の５’側にそれぞれ第１および第２のタグ配列を有しており、前記アレル共通プライマーは、前記第１および第２のアレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有しており；そして
ｂ）  工程ａから得られたＰＣＲ増幅産物を検出することにより、標的塩基配列中の一塩基変異を検出する
の各工程を含む方法。
【請求項２】
被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出する方法であって、
ａ）  前記被検試料の存在下で、第１および第２のアレル特異的プライマー、アレル共通プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、ここで、前記第１および第２のアレル特異的プライマーは、標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異に対応する塩基を有し、第１および第２のアレル特異的プライマーの３’末端の塩基は互いに異なっており、かつその相補的な配列の５’側にそれぞれ第１および第２のタグ配列を有しており、前記アレル共通プライマーは、前記第１および第２のアレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有しており；
ｂ）  工程ａから得られたＰＣＲ増幅産物および第１および第２のタグ配列認識プローブの存在下で、二本鎖特異的５’→３’エキソヌクレアーゼを用いてＤＮＡ分解反応を行い、ここで、前記第１および第２のタグ配列認識プローブはそれぞれ前記第１および第２のアレル特異的プライマー中の第１および第２のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有しており；そして
ｃ）  工程ｂにおいて第１および第２のタグ配列認識プローブが分解されたか否かを検出することにより、標的塩基配列中の一塩基変異を検出する
の各工程を含む方法。
【請求項３】
工程ｃにおける第１および第２のタグ配列認識プローブの分解の検出が、分解産物のゲル電気泳動により行われる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程ｂにおける第１および第２のタグ配列認識プローブがそれぞれ蛍光分子および消光分子を有しており、工程ｃにおける第１および第２のタグ配列認識プローブの分解の検出が、蛍光強度の変化の測定により行われる、請求項２記載の方法。
【請求項５】
被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出する方法であって、
ａ）  前記被検試料の存在下で、第１および第２のアレル特異的プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ鎖伸長反応を行い、ここで、前記第１および第２のアレル特異的プライマーは、標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異に対応する塩基を有し、第１および第２のアレル特異的プライマーの３’末端の塩基は互いに異なっており、かつその相補的な配列の５’側にそれぞれ第１および第２のタグ配列を有しており、さらにタグ配列の５’側に第１のユニバーサル配列を有しており；
ｂ）  工程ａから得られた伸長産物の存在下で、アレル共通プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ鎖伸長反応を行い、ここで、前記アレル共通プライマーは、前記第１および第２のアレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有し、かつその配列の５’側に第２のユニバーサル配列を有しており；
ｃ）  工程ｂから得られた伸長産物の存在下で、第１のユニバーサルプライマー、第２のユニバーサルプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、ここで、第１のユニバーサルプライマーは前記第１のユニバーサル配列を含んでおり、第２のユニバーサルプライマーは前記第２のユニバーサル配列を含んでおり；
ｄ）  工程ｃから得られたＰＣＲ増幅産物を検出することにより、標的塩基配列中の一塩基変異を検出する
の各工程を含む方法。
【請求項６】
被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出する方法であって、
ａ）  前記被検試料の存在下で、第１および第２のアレル特異的プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ鎖伸長反応を行い、ここで、前記第１および第２のアレル特異的プライマーは、標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異に対応する塩基を有し、第１および第２のアレル特異的プライマーの３’末端の塩基は互いに異なっており、かつその相補的な配列の５’側にそれぞれ第１および第２のタグ配列を有しており、さらにタグ配列の５’側に第１のユニバーサル配列を有しており；
ｂ）  工程ａから得られた伸長産物の存在下で、アレル共通プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ鎖伸長反応を行い、ここで、前記アレル共通プライマーは、前記第１および第２のアレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有し、かつその配列の５’側に第２のユニバーサル配列を有しており；
ｃ）  工程ｂから得られた伸長産物の存在下で、第１のユニバーサルプライマー、第２のユニバーサルプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、ここで、第１のユニバーサルプライマーは前記第１のユニバーサル配列を含んでおり、第２のユニバーサルプライマーは前記第２のユニバーサル配列を含んでおり；
ｄ）  工程ｃから得られたＰＣＲ増幅産物および第１および第２のタグ配列認識プローブの存在下で、二本鎖特異的５’→３’エキソヌクレアーゼを用いてＤＮＡ分解反応を行い、ここで、前記第１および第２のタグ配列認識プローブはそれぞれ前記第１および第２のアレル特異的プライマー中の第１および第２のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有しており；そして
ｅ）  工程ｄにおいて第１および第２のタグ配列認識プローブが分解されたか否かを検出することにより、標的塩基配列中の一塩基変異を検出する
の各工程を含む方法。
【請求項７】
工程ｅにおける第１および第２のタグ配列認識プローブの分解の検出が、分解産物のゲル電気泳動により行われる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程ｄにおける第１および第２のタグ配列認識プローブがそれぞれ蛍光分子および消光分子を有しており、工程ｅにおける第１および第２のタグ配列認識プローブの分解の検出が、蛍光強度の変化の測定により行われる、請求項６記載の方法。
【請求項９】
請求項２記載の方法により被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出するためのキットであって、
ａ）  標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異に対応する塩基を有し、かつその相補的な配列の５’側にそれぞれ第１および第２のタグ配列を有する第１および第２のアレル特異的プライマー、ただし、前記第１および第２のアレル特異的プライマーの３’末端の塩基は互いに異なっており；
ｂ）  前記第１および第２のアレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有するアレル共通プライマー；
ｃ）  前記第１のアレル特異的プライマー中の前記第１のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有する第１のタグ配列認識プローブ；および
ｄ）  前記第２のアレル特異的プライマー中の前記第２のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有する第２のタグ配列認識プローブ
を含むキット。
【請求項１０】
請求項６記載の方法により被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出するためのキットであって、
ａ）  標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異に対応する塩基を有し、かつその相補的な配列の５’側にそれぞれ第１および第２のタグ配列を有し、さらにタグ配列の５’側に第１のユニバーサル配列を有する第１および第２のアレル特異的プライマー、ただし、前記第１および第２のアレル特異的プライマーの３’末端の塩基は互いに異なっており；
ｂ）  前記第１および第２のアレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有し、かつその配列の５’側に第２のユニバーサル配列を有するアレル共通プライマー；
ｃ）  前記第１のユニバーサル配列を含む第１のユニバーサルプライマー；
ｄ）  前記第２のユニバーサル配列を含む第２のユニバーサルプライマー；
ｅ）  前記第１のアレル特異的プライマー中の前記第１のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有する第１のタグ配列認識プローブ；および
ｆ）  前記第第２のアレル特異的プライマー中の前記第第２のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有する第２のタグ配列認識プローブ
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出する方法、ならびにこれらの方法に用いるプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
被検試料中に存在する一塩基変異を検出する方法としては、標的塩基配列に特異的なプローブを用いてハイブリダイゼーションにより検出する方法、標的塩基配列に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ等による増幅反応を行い、増幅産物を検出する方法、特定の配列の二本鎖ＤＮＡを特異的に認識しうる蛋白質を用いる方法など、多くの方法が知られている。また、核酸アプタマーを用いて標的塩基配列を検出する方法も開示されている（WO01/44509）。この方法においては、標的塩基配列とプローブとをハイブリダイゼーションさせて核酸アプタマーを生成させ、標的塩基配列の有無によってアプタマーとリガンドとの結合親和性が相違することに基づいて標的塩基配列を検出する。
【０００３】
しかし、被検試料中に少量で存在する特定の標的塩基配列を高い感度で特異的に検出することは依然として困難である。したがって、当該技術分野においては、標的塩基配列の検出に用いることができるさらに別の方法が求められている。
【特許文献１】WO01/44509
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、標的塩基配列中の標的塩基における一塩基変異を検出する簡便な方法、およびこの方法に用いられるプローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出する方法であって、
ａ）  上記被検試料の存在下で、第１および第２のアレル特異的プライマー、アレル共通プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、ここで、上記第１および第２のアレル特異的プライマーは、標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異に対応する塩基を有し、第１および第２のアレル特異的プライマーの３’末端の塩基は互いに異なっており、かつその相補的な配列の５’側にそれぞれ第１および第２のタグ配列を有しており、上記アレル共通プライマーは、上記第１および第２のアレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有しており；そして
ｂ）  工程ａから得られたＰＣＲ増幅産物を検出することにより、標的塩基配列中の一塩基変異を検出する
の各工程を含む方法を提供する。
【０００６】
別の態様においては、本発明は、被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出する方法であって、
ａ）  上記被検試料の存在下で、第１および第２のアレル特異的プライマー、アレル共通プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、ここで、上記第１および第２のアレル特異的プライマーは、標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異に対応する塩基を有し、第１および第２のアレル特異的プライマーの３’末端の塩基は互いに異なっており、かつその相補的な配列の５’側にそれぞれ第１および第２のタグ配列を有しており、上記アレル共通プライマーは、上記第１および第２のアレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有しており；
ｂ）  工程ａから得られたＰＣＲ増幅産物および第１および第２のタグ配列認識プローブの存在下で、二本鎖特異的５’→３’エキソヌクレアーゼを用いてＤＮＡ分解反応を行い、ここで、上記第１および第２のタグ配列認識プローブはれぞれ上記第１および第２のアレル特異的プライマー中の第１および第２のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有しており；そして
ｃ）  工程ｂにおいて第１および第２のタグ配列認識プローブが分解されたか否かを検出することにより、標的塩基配列中の一塩基変異を検出する
の各工程を含む方法を提供する。
【０００７】
この方法において、好ましくは、工程ｃにおける第１および第２のタグ配列認識プローブの分解の検出は、分解産物のゲル電気泳動により行われる。また好ましくは、工程ｂにおける第１および第２のタグ配列認識プローブはそれぞれ蛍光分子および消光分子を有しており、工程ｃにおける第１および第２のタグ配列認識プローブの分解の検出は、蛍光強度の変化の測定により行われる。
【０００８】
さらに別の態様においては、本発明は、被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出する方法であって、
ａ）  上記被検試料の存在下で、第１および第２のアレル特異的プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ鎖伸長反応を行い、ここで、上記第１および第２のアレル特異的プライマーは、標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異に対応する塩基を有し、第１および第２のアレル特異的プライマーの３’末端の塩基は互いに異なっており、かつその相補的な配列の５’側にそれぞれ第１および第２のタグ配列を有しており、さらにタグ配列の５’側に第１のユニバーサル配列を有しており；
ｂ）  工程ａから得られた伸長産物の存在下で、アレル共通プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ鎖伸長反応を行い、ここで、上記アレル共通プライマーは、上記第１および第２のアレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有し、かつその配列の５’側に第２のユニバーサル配列を有しており；
ｃ）  工程ｂから得られた伸長産物の存在下で、第１のユニバーサルプライマー、第２のユニバーサルプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、ここで、第１のユニバーサルプライマーは前記第１のユニバーサル配列を含んでおり、第２のユニバーサルプライマーは前記第２のユニバーサル配列を含んでおり；
ｄ）  工程ｃから得られたＰＣＲ増幅産物を検出することにより、標的塩基配列中の一塩基変異を検出する
の各工程を含む方法を提供する。
【０００９】
さらに別の態様においては、本発明は、被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出する方法であって、
ａ）  上記被検試料の存在下で、第１および第２のアレル特異的プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ鎖伸長反応を行い、ここで、上記第１および第２のアレル特異的プライマーは、標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異に対応する塩基を有し、第１および第２のアレル特異的プライマーの３’末端の塩基は互いに異なっており、かつその相補的な配列の５’側にそれぞれ第１および第２のタグ配列を有しており、さらにタグ配列の５’側に第１のユニバーサル配列を有しており；
ｂ）  工程ａから得られた伸長産物の存在下で、アレル共通プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ鎖伸長反応を行い、ここで、上記アレル共通プライマーは、上記第１および第２のアレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有し、かつその配列の５’側に第２のユニバーサル配列を有しており；
ｃ）  工程ｂから得られた伸長産物の存在下で、第１のユニバーサルプライマー、第２のユニバーサルプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、ここで、第１のユニバーサルプライマーは前記第１のユニバーサル配列を含んでおり、第２のユニバーサルプライマーは前記第２のユニバーサル配列を含んでおり；
ｄ）  工程ｃから得られたＰＣＲ増幅産物および第１および第２のタグ配列認識プローブの存在下で、二本鎖特異的５’→３’エキソヌクレアーゼを用いてＤＮＡ分解反応を行い、ここで、上記第１および第２のタグ配列認識プローブはそれぞれ上記第１および第２のアレル特異的プライマー中の第１および第２のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有しており；そして
ｅ）  工程ｄにおいて第１および第２のタグ配列認識プローブが分解されたか否かを検出することにより、標的塩基配列中の一塩基変異を検出する
の各工程を含む方法を提供する。
【００１０】
さらに別の態様においては、本発明は、上述の本発明の方法により被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出するためのキットであって、
ａ）  標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異に対応する塩基を有し、かつその相補的な配列の５’側にそれぞれ第１および第２のタグ配列を有する第１および第２のアレル特異的プライマー、ただし、前記第１および第２のアレル特異的プライマーの３’末端の塩基は互いに異なっており；
ｂ）  前記第１および第２のアレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有するアレル共通プライマー；
ｃ）  前記第１のアレル特異的プライマー中の前記第１のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有する第１のタグ配列認識プローブ；および
ｄ）  前記第２のアレル特異的プライマー中の前記第２のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有する第２のタグ配列認識プローブ
を含むキットを提供する。
【００１１】
さらに別の態様においては、本発明は、上述の本発明の方法により被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出するためのキットであって、
ａ）  標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異に対応する塩基を有し、かつその相補的な配列の５’側にそれぞれ第１および第２のタグ配列を有し、さらにタグ配列の５’側に第１のユニバーサル配列を有する第１および第２のアレル特異的プライマー、ただし、前記第１および第２のアレル特異的プライマーの３’末端の塩基は互いに異なっており；
ｂ）  前記第１および第２のアレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有し、かつその配列の５’側に第２のユニバーサル配列を有するアレル共通プライマー；
ｃ）  前記第１のユニバーサル配列を含む第１のユニバーサルプライマー；
ｄ）  前記第２のユニバーサル配列を含む第２のユニバーサルプライマー；
ｅ）  前記第１のアレル特異的プライマー中の前記第１のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有する第１のタグ配列認識プローブ；および
ｆ）  前記第第２のアレル特異的プライマー中の前記第第２のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有する第２のタグ配列認識プローブ
を含むキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図面を参照しながら本発明の構成および効果を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の方法は、タグ配列を含むプライマーによるアレル特異的伸長反応とPCRの組合せにより被検試料に存在する標的塩基配列中の一塩基変異を検出することを特徴とする。「一塩基変異」とは、所定のDNAのある領域中で、塩基配列中の１つの塩基が置換、挿入、または欠失されていることをいう。特に、ゲノムDNA上の一塩基変異であって一般集団中において1%以上の頻度で検出されるものは一塩基多型(SNP)と称される。
【００１４】
「標的塩基配列」とは、検出が望まれる特定の配列を含む塩基配列を指し、そのような検出が望まれる特定の配列としては、例えばウイルス、細菌、真菌、動物、植物などのゲノムＤＮＡ中の特定の配列、ヒトのゲノムＤＮＡ中の多型配列などが挙げられる。
【００１５】
「被検試料」とは、標的塩基配列が存在するか否かを判定することが望まれる試料を指し、代表的には、生体試料（例えば全血、血漿、血清、尿、体液、唾液など）や、動物又は植物の細胞又は組織の培養物など、核酸を含有するものであれば特に限定されない。被検試料は、当技術分野で周知の方法を適宜使用して調製することができる。一般的には、被検試料はＤＮＡを抽出して調製する。例えば、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法などによりＤＮＡを抽出することができる。あるいは、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はＡＧＰＣ法などを利用してＲＮＡを抽出した後に、これをテンプレートとして逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成してもよい。
【００１６】
図１−６は本発明の第１の態様を示す。この方法においては、まず、被検試料の存在下で、アレル特異的プライマー、アレル共通プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。「アレル特異的プライマー」とは、検出すべき一塩基変異部位に対応して設計されるプライマーである。図１および２においては、一塩基変異部位がＣである遺伝子を検出するためのアレル特異的プライマーをプライマー１（Ｇ）、一塩基変異部位がＴである遺伝子を検出するためのアレル特異的プライマーをプライマー１（Ａ）として示す。アレル特異的プライマーは、標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異部位の塩基と塩基対形成しうる塩基を有する。すなわち、プライマー１（Ｇ）はその３’末端にＧを、プライマー１（Ａ）はその３’末端にＡを有する。アレル特異的プライマーはさらに、標的塩基配列と相補的な配列の５’側にタグ配列を有する。「タグ配列」は標的塩基配列と相補的ではないように選択する。
【００１７】
標的塩基配列およびアレル特異的プライマーの存在下でＤＮＡポリメラーゼを作用させると、一塩基変異部位において標的塩基配列とマッチするプライマーからはＤＮＡ伸長反応が進行するが、標的塩基配列とミスマッチのプライマーからはＤＮＡ伸長反応がほとんど進行しないか、進行したとしてもその速度が遅い（図１および２）。
【００１８】
次に、ＤＮＡ伸長反応が生じた場合には、伸長産物にアレル共通プライマー（プライマー２）がプライミングして、ＤＮＡポリメラーゼにより第２鎖のＤＮＡ伸長反応が進行する（図３および４）。「アレル共通プライマー」とは、上記アレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列、すなわち、標的塩基配列の一塩基変異部位より５’側の配列の一部と同一の配列を有するプライマーである。アレル共通プライマーを設計する位置は、アレル特異的プライマーとアレル共通プライマーとの間のＰＣＲが効率的に進行し、適切な大きさのＰＣＲ増幅産物が生成するように、適宜選択することができる。
【００１９】
被検試料の存在下で、アレル特異的プライマー、アレル共通プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行うと、標的塩基配列とマッチするアレル特異的プライマーからはＰＣＲ増幅産物が生成し、標的塩基配列とミスマッチのプライマーからはＰＣＲ増幅産物がほとんどまたは全く生成しない（図５および６）。すなわち、ＰＣＲ増幅反応はアレル特異的に進行する。したがって、２種類のアレル特異的プライマーのいずれかを加えたときにＰＣＲ増幅産物が生成したかを検出することにより、一塩基変異部位の塩基を同定することができる。アレル特異的ＰＣＲ増幅産物は、分光光学的手法、電気泳動、蛍光標識、ハイブリダイゼーションなどの、当該技術分野においてよく知られる手法により容易に検出することができる。
【００２０】
好ましくは、本発明の方法においては、２種類のアレル特異的プライマーを被検試料に同時に加えてＰＣＲを行う。この場合、２種類のアレル特異的プライマーは、タグ配列の塩基配列が互いに異なるように設計する。このことにより、２種類のアレルに対応したPCR産物を区別することができる。
【００２１】
さらに、２種類のアレル特異的プライマーは、タグ配列の長さが異なるように、または適当なスペーサー配列をさらに含むように設計することができる。このことにより、これらのプライマーを１つの反応チューブで同時に用いてＰＣＲを行って、生成したＰＣＲ増幅産物の長さを測定することにより、一塩基変異の同定を行うことが可能となる。ＰＣＲ増幅産物の長さは電気泳動などの当該技術分野においてよく知られる手法により容易に測定することができる。後述の実施例１および２に示されるように、ＰＣＲ増幅産物を電気泳動で分析することにより、ホモおよびヘテロの一塩基変異を簡単に同定することができる。
【００２２】
図７は本発明の方法の第２の態様を示す。この方法は、上述の第１の態様の方法において生成したＰＣＲ増幅産物を、タグ配列認識プローブ（蛍光プローブ）および二本鎖特異的５’→３’エキソヌクレアーゼを用いて検出することを特徴とする。「タグ配列認識プローブ」とは、上記アレル特異的プライマー中のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有するプローブである。「二本鎖特異的５’→３’エキソヌクレアーゼ」とは、二本鎖ＤＮＡを認識して、その５’末端から３’方向にＤＮＡを分解する酵素であり、例えば、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ等を用いることができる。ＰＣＲ増幅産物に二本鎖特異的５’→３’エキソヌクレアーゼを作用させると、二本鎖の両方の５’末端からＤＮＡの分解が進行して、タグ配列と相補的な配列を含む一本鎖核酸が生ずる。タグ配列認識プローブは、ここで生じた一本鎖ＤＮＡ中のタグ配列と塩基対形成するため、二本鎖ＤＮＡが形成される。次に、この二本鎖ＤＮＡは二本鎖特異的５’→３’エキソヌクレアーゼにより認識されるため、タグ配列認識プローブはその５’末端から３’方向に分解される。タグ配列は検出すべきそれぞれの一塩基変異に対応する異なる配列を持っているため、一塩基変異を含む標的塩基配列に相補的な配列が伸長しない場合には、ＰＣＲ増幅産物が得られず、タグ配列認識プローブが塩基対形成しないため、タグ配列認識プローブの分解が起こらない。したがって、タグ配列認識プローブが分解されるか否かを検出することにより、標的塩基配列中の一塩基変異を検出することができる。
【００２３】
タグ配列認識プローブの分解の検出は、分解産物をゲル電気泳動で分析することにより容易に行うことができる。例えば、タグ配列認識プローブの５’末端の塩基を蛍光標識しておけば、ＰＣＲ増幅産物が存在する場合には１塩基の長さに対応する位置に蛍光が検出され、存在しない場合には元のタグ配列認識プローブの長さに対応する位置に蛍光が検出される。かかる検出方法の具体例は、下記の実施例３に示される。
【００２４】
あるいは、タグ配列認識プローブを蛍光分子および消光分子で標識することにより、ＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy transfer、蛍光共鳴エネルギー移動）の原理を利用して、分解反応の有無を蛍光強度の大きさで比較することが可能である。すなわち、ＰＣＲ増幅産物が存在しない場合には蛍光分子と消光分子が隣接して存在するため蛍光が検出されず、ＰＣＲ増幅産物が存在する場合にはタグ配列認識プローブが分解されるため、蛍光分子と消光分子との距離が大きくなり、蛍光信号が発生する。したがって、蛍光強度の変化を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物が存在したか否かを判定することができ、このことにより標的塩基配列中の一塩基変異を検出することができる。この方法は特にマイクロタイタープレート等のフォーマットを用いる一塩基変異の同定に適している。
【００２５】
蛍光強度の変化は、例えば、蛍光分光光度計やプレートリーダー等を用いて慣用の方法により測定することができる。蛍光分子としては、例えば、フルオレセイン、ダンシル、カスケードイエロー、フルオレスカミン、オレゴングリーン、ピレン、テキサスレッド、パシフィックブルー、マリンブルー、アレクサ、ルシファーイエロー、ボディパイ（BODIPY）、クーマリン、ピンポ（PyMPO）、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、ROX、FAM、VIC、HEX、TAMRA、SYBR Green、NBD等を用いることができる。消光分子としては、例えば、ダブシル、QSY-7、QSY-21、QSY-35、BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、Eclipse等の蛍光を発しない物質（ダーククエンチャーと言われる）を用いてもよいし、上記蛍光分子が発する波長領域に吸収帯を持つ蛍光物質を消光分子として利用してもよい。蛍光分子および消光分子をＤＮＡに結合させる方法、ならびに蛍光強度の変化を検出する方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００２６】
図８および９は、本発明の方法の第３の態様を示す。この方法は、ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲを行うことを特徴とする。この態様においては、アレル特異的プライマー（プライマー１（Ｇ））は、標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列およびタグ配列に加えて、さらにタグ配列の５’側に第１のユニバーサル配列を有しており、アレル共通プライマー（プライマー２）は、ポリメラーゼ伸長産物に相補的な配列に加えて、さらにその配列の５’側に第２のユニバーサル配列を有する。
【００２７】
この方法においては、まず、アレル特異的プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ鎖伸長反応を行う。標的塩基配列の一塩基部位とアレル特異的プライマーの３’末端の塩基がマッチして塩基対形成されるときのみ伸長反応が起こる。次にアレル共通プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いて第２鎖の伸長反応を行う。この二本鎖伸長産物をテンプレートして、第１のユニバーサルプライマー（プライマー３）、第２のユニバーサルプライマー（プライマー４）およびＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。第１のユニバーサルプライマーは上記第１のユニバーサル配列を含んでおり、第２のユニバーサルプライマーは上記第２のユニバーサル配列を含んでいる。上記第１および第２のユニバーサルプライマーは、好ましくは被検試料に含まれるゲノムDNAとの相同性が極めて低い配列を有している。生成したＰＣＲ増幅産物は、上述の第１の態様と同様に電気泳動により検出してもよく、第２の態様と同様にタグ配列認識プローブおよび二本鎖特異的５’→３’エキソヌクレアーゼを用いて検出してもよい。
【００２８】
この方法では、第１のユニバーサルプライマーはタグ配列を含まないため、複数箇所の一塩基変異についてマルチプレックスＰＣＲを行う際に、第１のユニバーサルプライマーとして１種類だけのプライマーを用いることができるため、検出のコストが低くなるという利点を有する。好ましくは、ユニバーサルプライマーがユニバーサル配列と塩基対形成するときのＴｍ値が、アレル特異的プライマーまたはアレル共通プライマーが標的塩基配列と塩基対形成するときのＴｍ値よりも高くなるように設計する。このことにより、１サイクル目と２サイクル目は低いアニーリング温度で反応を行い、３サイクル目以降は高いアニーリング温度でＰＣＲを行うことができ、マルチプレックスＰＣＲにおいて均一な増幅が期待できる。
【００２９】
さらに別の観点においては、本発明は、上述の本発明の方法により被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出するためのキットを提供する。該キットは、
ａ）  標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異に対応する塩基を有し、かつその相補的な配列の５’側にそれぞれ第１および第２のタグ配列を有する第１および第２のアレル特異的プライマー、ただし、前記第１および第２のアレル特異的プライマーの３’末端の塩基は互いに異なっており；
ｂ）  前記第１および第２のアレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有するアレル共通プライマー；
ｃ）  前記第１のアレル特異的プライマー中の前記第１のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有する第１のタグ配列認識プローブ；および
ｄ）  前記第２のアレル特異的プライマー中の前記第２のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有する第２のタグ配列認識プローブ
を含む。
【００３０】
さらに別の観点においては、本発明は、上述の本発明の方法により被検試料中の標的塩基配列中の一塩基変異を検出するためのキットを提供する。該キットは、
ａ）  標的塩基配列中の一塩基変異部位から３’側の配列に相補的な配列を有し、その３’末端は一塩基変異に対応する塩基を有し、かつその相補的な配列の５’側にそれぞれ第１および第２のタグ配列を有し、さらにタグ配列の５’側に第１のユニバーサル配列を有する第１および第２のアレル特異的プライマー、ただし、前記第１および第２のアレル特異的プライマーの３’末端の塩基は互いに異なっており；
ｂ）  前記第１および第２のアレル特異的プライマーからポリメラーゼにより伸長される配列に相補的な配列を有し、かつその配列の５’側に第２のユニバーサル配列を有するアレル共通プライマー；
ｃ）  前記第１のユニバーサル配列を含む第１のユニバーサルプライマー；
ｄ）  前記第２のユニバーサル配列を含む第２のユニバーサルプライマー；
ｅ）  前記第１のアレル特異的プライマー中の前記第１のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有する第１のタグ配列認識プローブ；および
ｆ）  前記第第２のアレル特異的プライマー中の前記第第２のタグ配列の全部または一部の配列と同一の配列を有する第２のタグ配列認識プローブ
を含む。
【００３１】
本発明の方法を用いることにより、標的塩基配列中の一塩基変異を高い特性および高い感度をもって検出することができる。このような一塩基変異の検出は、癌や遺伝病、薬剤応答性の診断に利用することができる。
【００３２】
なお、２種類の一塩基変異を区別して検出する方法を例として、本発明の特徴および利点を詳細に説明してきたが、同様にして３種類または４種類の一塩基変異を検出しうることが明らかであろう。
【００３３】
以下の実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
プライマー１(G)、プライマー１(A)、プライマー２、テンプレート１、テンプレート２（配列を図１０に示す）を表１に示す最終濃度（１チューブ／１００μL）となるように調製し、９５℃×５分で変性後、９４℃×３０秒→６４℃×５秒→７２℃×３０秒の反応を３０回繰り返した。この反応液の組成は、dNTPが0.2mM、１０ mM Tris-HCl(ｐH８.３)、５０mM KCl、1.5mM MgCl2となるように調製した。反応液を４％アガロースゲルにアプライし、電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを染色し、PCR産物のバンドを確認した（図１１）。プライマー１（G）が伸長した場合のみ得られるPCR産物は７４塩基、プライマー１（A）が伸長したPCR産物は８８塩基に相当する。図１１の試料２、３、４、５の結果から、テンプレートとプライマー１の3’末端が相補鎖を形成する場合に、特異的にプライマー伸長反応が進み、一塩基変異部位の塩基に対応したPCR産物が得られることが示された。
【００３５】
【表１】
2006075126.tif 000003
【実施例２】
【００３６】
本実施例では、テンプレートとしてヒトゲノムＤＮＡを用いて実施例１と同様の実験を行った。プライマー１(G)、プライマー１(A)、プライマー２、ヒトゲノムＤＮＡを表２に示す最終濃度（１チューブ／１００μL）となるように調製し、９５℃×５分で変性後、９４℃×３０秒→６４℃×５秒→７２℃×３０秒の反応を４０回繰り返した。この反応液の組成は、dNTPが0.2mM、１０ mM Tris-HCl(ｐH８.３)、５０mM KCl、1.5mM MgCl2となるように調製した。プライマーと相補鎖を形成する部分のヒトゲノムの配列は、図１０に示す。反応物を４％アガロースゲルにアプライし、電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを染色し、PCR産物のバンドを確認した（図１２）。図１２の左端のレーンは２０bpラダーのマーカーである。図１２の試料２の74塩基に相当するバンドが得られることから、プライマー１（G）がヒトゲノムと特異的に相補鎖を形成し伸長反応が進んだことが示された。
【００３７】
【表２】
2006075126.tif 000004
【実施例３】
【００３８】
実験１の試料3で得られたPCR産物と実験２の試料2で得られたPCR産物、蛍光プローブ１、T7エキソヌクレアーゼを表３に示す最終濃度（１チューブ／４０μL）となるように調製した。すなわち、ここで表３に記載されている「実施例2の試料2の反応液」とは、実施例２の試料２で得られた１００μLの反応液から２０μL取り出した溶液であり、一方、表３の「実施例１の試料３の反応液」とは、実施例１の試料３で得られた１００μLの反応液から２０μLを取り出した溶液である。この20μLに、蛍光プローブ１、T7エキソヌクレアーゼを表３に示す組成(１チューブ／４０μL)になるように加え、試料全体を調製した。
【００３９】
「実施例2の試料2の反応液」とは、具体的には、プライマー1(G)を０.５μMとプライマー1(A) を０.５μM、プライマー２を０.５μM、ヒトゲノムを１０ng、Taqポリメラーゼを２.５U含む１００μLの溶液である。試料にはその他の成分としてdNTPが０.２mM、１０ mM Tris-HCl(ｐH＝８.３)、５０mM KCl、０.１５ mM MgCl2が含まれる。この試料を９５℃×５分で変性後、９４℃×３０秒→６４℃×５秒→７２℃×３０秒のPCRを４０回行い、表３に示す実施例２の試料２の反応液として用いた。
【００４０】
一方、「実施例１の試料３の反応液」とは、プライマー1(G)を０.５μMとプライマー1(A) を０.５μM、プライマー２を０.５μM、テンプレート１を１pM、Taqポリメラーゼを２.５U含む１００μLの溶液である。試料にはその他の成分としてdNTPが０.２mM、１０ mM Tris-HCl(ｐH＝８.３)、５０mM KCl、０.１５ mM MgCl2が含まれる。この試料を９５℃×５分で変性後、９４℃×３０秒→６４℃×５秒→７２℃×３０秒のPCRを３０回行い、表３に示す実施例１の試料３の反応液として用いた。
【００４１】
表３に示す試料のバッファー組成は、２５ mM
Tris-HCl、２５mM KCl、２５ｍM NaCl、１０ mM MgCl2となるように調製した。それぞれの試料を４０℃でインキュベーション後、T７エキソヌクレアーゼを失活させるため９５℃で１０分間加熱し、反応を停止させた。
【００４２】
反応停止後、各試料を２０％変性ポリアクリルアミドゲルにアプライして電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを蛍光光度計にて解析した。電気泳動のパターンを図１３に示す。図１３の左側のレーンは５９塩基と２５塩基のマーカーである。PCR産物が溶液中に共存する場合にのみ、５’にFAMで修飾された蛍光プローブが分解することが確認された。
【００４３】
また、電気泳動のバンドの強度を数値化したところ表４に示す結果となった。図１３の試料２、３、４より、溶液中にPCR産物が存在する場合には、５’端にFAMの標識された塩基が分解されるが、PCR産物が存在しない場合には、FAMで標識された塩基が分解されないことがわかる。このことから、本発明にしたがって、一塩基変異をポリメラーゼとT7エキソヌクレアーゼを用いて区別できることが示された。
【００４４】
【表３】
2006075126.tif 000005
【００４５】
【表４】
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【実施例４】
【００４６】
本実施例はヒトのトロンビン遺伝子における一塩基多型G20210Aを対象にした一塩基多型タイピングのモデル実験である。ヒトゲノムDNAの代わりに、G20210AのアレルGおよびアレルAのそれぞれについて、標的塩基の前後51bpのアンチセンス側配列に対して、上流と下流に４塩基のTをつなげた一本鎖DNAを合成してテンプレートとした（図１４）。この標的塩基配列を一塩基多型タイピングするためのプローブとしてプライマー1〜4の配列を設計し合成した（図１４）。これらを用いて表5に示す組成で20μlずつ反応液を調製し試料とした。ただし、反応液にはその他の成分として10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.3)、1.5mM塩化マグネシウム、50mM塩化カリウム、0.2mM
dNTPが含まれる。また使用したポリメラーゼはTaq
DNAポリメラーゼである。次にサーマルサイクラーを使用して、試料に次のような4段階からなる熱サイクルを加えて反応させた。1段階目は94℃5分間。2段階目は94℃30秒間、50℃30秒間、72℃30秒間を2サイクル。3段階目は94℃30秒間、66℃5秒間、72℃30秒間を33サイクル。4段階目は72℃5分間。反応終了後、試料を5μlずつ4%アガロースゲル(緩衝液はTBE)に電気泳動した。ゲルを染色した結果が図１５である。アレルGに対応するPCR産物の長さは100bp、アレルAに対応するPCR産物の長さは81bpである。図１５に示されるように、アレルGのホモ（試料3）、アレルGとアレルAのヘテロ(試料4)、アレルAのホモ(試料5)が明瞭に識別されており、本方法にて一塩基多型のタイピングが可能であることが示された。
【００４７】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】アレル特異的プライマーによる伸長反応の説明。
【図２】アレル特異的プライマーによる伸長反応の説明。
【図３】アレル共通プライマーによる伸長反応の説明。
【図４】アレル共通プライマーによる伸長反応の説明。
【図５】ＰＣＲの説明。
【図６】ＰＣＲの説明。
【図７】タグ配列認識プローブを用いたアレル特異的ＰＣＲ産物を検出する方法の説明。
【図８】２本のユニバーサルプライマーを用いた反応の説明。
【図９】２本のユニバーサルプライマーを用いた反応の説明。
【図１０】実施例１〜３において用いられたＤＮＡの塩基配列。
【図１１】実施例１において得られた電気泳動の結果。
【図１２】実施例２において得られた電気泳動の結果。
【図１３】実施例３において得られた電気泳動の結果。
【図１４】実施例４において用いられたＤＮＡの塩基配列。
【図１５】実施例４において得られた電気泳動の結果。
【図１】
2006075126.tif 000008
【図２】
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【図３】
2006075126.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006075126.tif 000014
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2006075126.tif 000017
【図１４】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2006075126.tif 000021
【図１５】
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【配列表】
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