(57)【要約】      （修正有）【課題】ピロリ菌のcagA遺伝子の有無の判別及び病原性を左右するcagA遺伝子の型の判別を特異的かつ高感度に行うことを可能とするピロリ菌型判別用オリゴヌクレオチドを提供。【解決手段】特定なる配列で示される、オリゴヌクレオチドからなる欧州型ピロリ菌検出用のフォワードプライマー、リバースプライマー、及び東アジア型ピロリ菌検出用のフォワードプライマー、リバースプライマーとピロリ菌ｃａｇＡ遺伝子検出用プローブを用いての、ＰＣＲ法による検出法及びキットを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし２８塩基を有するオリゴヌクレオチドからなる欧州型ピロリ菌検出用フォワードプライマー。
【請求項２】
配列表の配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる請求項１記載のプライマー。
【請求項３】
５’末端が蛍光標識された 請求項１または２記載のプライマー
【請求項４】
蛍光標識がFITC、FAM、TxR或いは Cy5でなされている請求項３記載のプライマー。
【請求項５】
５’末端がビオチン標識された請求項１または２記載のプライマー
【請求項６】
配列表の配列番号３で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし１９塩基を有するオリゴヌクレオチドからなる欧州型ピロリ菌検出用リバースプライマー。
【請求項７】
配列表の配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる請求項６記載のプライマー。
【請求項８】
５’末端が蛍光標識された 請求項６または７記載のプライマー。
【請求項９】
蛍光標識がFITC、FAM、TxR或いは Cy5でなされている請求項８記載のプライマー。
【請求項１０】
５’末端がビオチン標識された請求項６または７記載のプライマー
【請求項１１】
配列表の配列番号４で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし３０塩基を有するオリゴヌクレオチドからなる東アジア型ピロリ菌検出用フォワードプライマー。
【請求項１２】
配列表の配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる請求項１１記載のプライマー。
【請求項１３】
５’末端が蛍光標識された 請求項１１または１２記載のプライマー
【請求項１４】
蛍光標識がFITC、FAM、TxR或いは Cy5でなされている請求項１３記載のプライマー。
【請求項１５】
５’末端がビオチン標識された請求項１１または１２記載のプライマー
【請求項１６】
配列表の配列番号６で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし２４塩基を有するオリゴヌクレオチドからなる東アジア型ピロリ菌検出用リバースプライマー。
【請求項１７】
配列表の配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる請求項１６記載のプライマー。
【請求項１８】
５’末端が蛍光標識された 請求項１６または１７記載のプライマー
【請求項１９】
蛍光標識がFITC、FAM、TxR或いは Cy5でなされている請求項１８記載のプライマー。
【請求項２０】
５’末端がビオチン標識された請求項１６または１７記載のプライマー
【請求項２１】
配列表の配列番号８で示される塩基配列の連続する２２塩基ないし２９塩基を有するオリゴヌクレオチドからなる5’端にFAM,3’端にTAMRAを有するピロリ菌cagA遺伝子検出用プローブ。
【請求項２２】
配列表の配列番号８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる請求項１７記載の5’端にFAM,3’端にTAMRAを有するピロリ菌cagA遺伝子検出用プローブ。
【請求項２３】
請求項１ないし請求項２のいずれか１項記載のフォワードプライマーと、請求項６ないし請求項７のいずれか１項記載のリバースプライマーと、請求項２１ないし請求項２２のいずれか１項記載のcagA遺伝子検出用標識プローブを用いて試料中のピロリ菌の核酸を増幅させ 該ピロリ菌が欧州型か否かを判別する方法。
【請求項２４】
請求項１１ないし請求項１２のいずれか１項記載のフォワードプライマーと、請求項１６ないし請求項１７のいずれか１項記載のリバースプライマーと、請求項２１ないし請求項２２のいずれか１項記載のcagA遺伝子検出用標識プローブを用いて試料中のピロリ菌の核酸を増幅させ 該ピロリ菌が東アジア型か否かを判別する方法。
【請求項２５】
請求項４記載のフォワードプライマーと請求項１０のリバースプライマー あるいは請求項５記載のフォワードプライマーと請求項９記載のリバースプライマーのいずれかのプライマーセットと、請求項１４記載のフォワードプライマーと請求項２０のリバースプライマー あるいは 請求項１５のフォワードプライマーと請求項１９記載のリバースプライマーのいずれかのプライマーセットを用いて試料中のピロリ菌の核酸を増幅させ 該ピロリ菌が欧州型か東アジア型かを判別する方法。
【請求項２６】
請求項１ないし請求項２のいずれか１項記載のフォワードプライマーと、請求項６ないし請求項７のいずれか１項記載のリバースプライマーと、請求項２１ないし請求項２２のいずれか１項記載のcagA遺伝子検出用標識プローブを含む、試料中のピロリ菌が欧州型か否かを判別するためのキット。
【請求項２７】
請求項１１ないし請求項１２のいずれか１項記載のフォワードプライマーと、請求項１６ないし請求項１７のいずれか１項記載のリバースプライマーと、請求項２１ないし請求項２２のいずれか１項記載のcagA遺伝子検出用標識プローブを含む、試料中のピロリ菌が東アジア方か否かを判別するためのキット。
【請求項２８】
請求項１ないし請求項２のいずれか１項記載のフォワードプライマーと、請求項６ないし請求項７のいずれか１項記載のリバースプライマーと、請求項１１ないし請求項１２のいずれか１項記載のフォワードプライマーと、請求項１６ないし請求項１７のいずれか１項記載のリバースプライマーと、請求項２１ないし請求項２２のいずれか１項記載のcagA遺伝子検出用標識プローブを含む、試料中のピロリ菌が欧州型か東アジア型かを判別するキット。
【請求項２９】
請求項４記載のフォワードプライマーと請求項１０のリバースプライマー あるいは請求項５記載のフォワードプライマーと請求項９記載のリバースプライマーのいずれかのプライマーセットと、請求項１４記載のフォワードプライマーと請求項２０のリバースプライマー あるいは 請求項１５のフォワードプライマーと請求項１９記載のリバースプライマーのいずれかのプライマーセットを含む、資料中のピロリ菌が欧州型か東アジア型かを判別するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリ菌の病原性を左右する型判別に用いることができる cagA遺伝子の判別用オリゴヌクレオチド、それらを用いた型判別方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
病原性を有するグラム陰性菌の多くは 外来性遺伝子群を有することで病原性を発揮することが認められており、この外来性遺伝子群はPathogenicity island（PAI）と呼ばれている。ヘリコバクター・ピロリ(ピロリ菌)では 病原因子の一つである細胞空胞化毒素関連タンパク質(CagA)の遺伝子 cagAがこのPAI内に位置し、このcagAを有する株の感染が十二指腸潰瘍、胃癌と関連することが報告されてきた。このcagAを有する株は 病原性が弱いタイプ(欧州型)と病原性が強いタイプ(東アジア型)に分類される。両者の違いは、生体内に注入されたCagAタンパク質が酸化を受けた後に結合する 細胞質内で分化や増殖に重要な役割を担っているsrc homology phosphatase-2(SPH-2)との結合機作に起因することが知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリ(ピロリ菌)のcagA遺伝子の有無を調べるためには、試料中のピロリ菌のDNAからcagA遺伝子の一部または全部を含む断片を核酸増幅方法により特異的に増幅し調べることが考えられる。 またその際に、cagA遺伝子の有無のみならず病原性を左右するcagAの型を増幅の有無により判別することが考えられる。しかしながらcagA遺伝子の型を精度高く判別できる核酸増幅用のプライマーは知られていない。
【０００４】
従って、本発明の目的は、ピロリ菌のcagA遺伝子の有無の判別及び病原性を左右するcagA遺伝子の型の判別を可能とするピロリ菌型判別用オリゴヌクレオチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ねた結果、ピロリ菌のcagA遺伝子の断片を増幅せしめ 且つ cagA遺伝子の型特異的に増幅せしめるプライマーを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は配列番号１で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし２８塩基を含むオリゴヌクレオチド または配列番号２で示される塩基配列の連続する２８塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる欧州型ピロリ菌検出用フォワードプライマー、配列番号３で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし１９塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる欧州型ピロリ菌検出用リバースプライマー、配列番号４で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし３０塩基を含むオリゴヌクレオチドまたは配列番号５で示される塩基配列の連続する１９塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる東アジア型ピロリ菌検出用フォワードプライマー、配列番号６で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし２４塩基を含むオリゴヌクレオチドまたは配列番号７で示される塩基配列の連続する２１塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる東アジア型ピロリ菌検出用リバースプライマー、及びより精度を高めTaqMan法に用いるための配列番号８で示される塩基配列の連続する２２塩基ないし２９塩基を含むオリゴヌクレオチドからなり5’端にFAM,3’端にTAMRAを有する共通プローブ、を提供し、これらを用いてのTaqMan法によるピロリ菌の型判別方法及びキットを提供する。
【０００７】
更に、本発明はフォワードプライマー或いはリバースプライマーの一方が検出のために蛍光標識されもう一方が分離のためにビオチン標識された配列番号１で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし２８塩基を含むオリゴヌクレオチドまたは配列番号２で示される塩基配列の連続する２８塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる欧州型ピロリ菌検出用フォワードプライマー、配列番号３で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし１９塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる欧州型ピロリ菌検出用リバースプライマー、配列番号４で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし３０塩基を含むオリゴヌクレオチドまたは配列番号５で示される塩基配列の連続する１９塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる東アジア型ピロリ菌検出用フォワードプライマー、配列番号６で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし２４塩基を含むオリゴヌクレオチドまたは配列番号７で示される塩基配列の連続する２１塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる東アジア型ピロリ菌検出用リバースプライマーセットを提供し、これらを用いてのPCR法によるピロリ菌の型判別方法及びキットを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により ピロリ菌の病原性 及び 毒性の強弱を決定するcagA遺伝子の型判別を簡便に、特異的かつ高感度におこなうことができるプライマー、方法 およびキットが提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
ピロリ菌の病原性或いはその毒性の強弱を判別するためには cagA遺伝子を増幅し その有無およびcagA遺伝子の型判別を行うが、欧州型ピロリ菌のcagA遺伝子を増幅するために用いられるフォワードプライマーは 上述のように、配列表の配列番号１で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし２８塩基を有するオリゴヌクレオチドからなる。さらには 配列番号２で示される塩基配列の連続する２１塩基からなるプライマーが好ましい。
【００１０】
欧州型ピロリ菌のcagA遺伝子を増幅するために用いられるリバースプライマーは 上述のように、配列表の配列番号３で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし１９塩基を有するオリゴヌクレオチドからなる。さらには 配列番号３で示される塩基配列の連続する１９塩基からなるプライマーが好ましい。
【００１１】
東アジア型ピロリ菌のcagA遺伝子を増幅するために用いられるフォワードプライマーは 上述のように、配列表の配列番号４で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし３０塩基を有するオリゴヌクレオチドからなる。さらには 配列番号５で示される塩基配列の連続する１９塩基からなるプライマーが好ましい。
【００１２】
東アジア型ピロリ菌のcagA遺伝子を増幅するために用いられるリバースプライマーは 上述のように、配列表の配列番号６で示される塩基配列の連続する１５塩基ないし２４塩基を有するオリゴヌクレオチドからなる。さらには 配列番号７で示される塩基配列の連続する２１塩基からなるプライマーが好ましい。
【００１３】
ピロリ菌のcagA遺伝子を検出のために増幅する際 より精度を高める為に用いるTaqMANプローブは 配列番号８で示される塩基配列の連続する２２塩基ないし２９塩基を有する５’端にFAM、３’端にTAMRAを有するオリゴヌクレオチドからなる。さらには 配列番号８で示される塩基配列の連続する２９塩基からなるプローブが好ましい。
【００１４】
ピロリ菌のcagA遺伝子の増幅領域近傍の塩基配列 ならびに上記の欧州型判別用フォワードプライマー、リバースプライマー、東アジア型判別用フォワードプライマー、リバースプライマー 及び 精度高めるためのTaqManプローブの配列する領域を図１に示す。
【００１５】
上述のように、本発明はまた上記本発明のフォワードプライマー及びリバースプライマー、さらには精度向上のための標識プローブを用いて ピロリ菌の病原性の有無或いは毒性の強弱について検査する方法およびキットを提供する。
以下にこれらの方法について説明する。
【００１６】
本発明の方法に提供される検体としては ピロリ菌の病原性 あるいは その毒性の強弱を検査することが望まれる検体であって、胃液や胃の生体材料が挙げられるがこれに限定されるものではない。検体からのDNAの抽出については、市販のDNA抽出キットあるいは既知の方法に基づいて容易に実施することができる。
【００１７】
本発明の方法では、まず欧州型検出用あるいは東アジア型検出用のフォワードプライマーとリバースプライマーをセットとして用いて検体から抽出されたピロリ菌のcagA遺伝子を鋳型として該核酸をPCR(Polymerase Chain Reaction)法により増幅反応を行う。
【００１８】
欧州型検出用プライマーセットでは cagA遺伝子の塩基配列が欧州型の場合にのみ増幅される。また、東アジア型検出用プライマーセットでは cagA遺伝子の塩基配列が東アジア型の場合にのみ増幅される。
【００１９】
これらの増幅の有無を簡便にかつ精度を高く検出する方法として、フォワードプライマーとリバースプライマーで増幅される領域にハイブリダイズし得るTaqManプローブを用いることが出来る。
【００２０】
また、欧州型検出用フォワードプライマーあるいはリバースプライマーのいずれかの５’端を蛍光標識し、もう一方をビオチン標識したプライマーセットと東アジア検出用フォワードプライマーあるいはリバースプライマーのいずれかの５’端を欧州型の標識に用いた蛍光物質と波長の異なる別の物質で蛍光標識し、もう一方をビオチン標識したプライマーセットを用いることで、１反応で 検体中のピロリ菌の型判別を同時に行う事ができる。
【実施例】
【００２１】
以下に 本発明の実施例に基づきより具体的に説明する。 もっとも本発明は下記の実施例に限定されるものではい。
実施例１
欧州型と東アジア型が混在する地域の胃潰瘍、胃癌、十二指腸潰瘍患者から採取した４１検体から市販のDNA抽出キットを用いてDNAを調製した。このDNAサンプルを用いてピロリ菌の検出および型判別を実施した。欧州型を検出するために、このDNAを鋳型に 配列番号２のフォワードプライマーと配列番号３のリバースプライマーと配列番号８の５’端にFAM、３’端にTAMRA標識されたTaqManプローブを用いて実施した。 ２５μLのTaqMan Universal PCR Master Mix(ABI社製)にフォワードプライマー、リバースプライマー各々４００nM、TaqManプローブは５００nMとなる様に添加し更に 抽出した検体のDNAを５μL添加し、滅菌水にて全量を５０μLに調整し２００μL容 MicroAmp optical tube（ABI社製）にて 次の条件下でリアルタイムPCRをABI PRISM ７７００ Sequence Detection System（ABI社製）を用いて行った。PCR条件は、最初の変性工程が９５℃、１０分、更に変性工程が ９５℃、１５秒、アニーリング及び伸長工程が６０℃、６０秒のサイクルを５０回繰り返した。
【００２２】
東アジア型を検出するために、このDNAを鋳型に 配列番号５のフォワードプライマーと配列番号７のリバースプライマーと配列番号８の５’端にFAM、３’端にTAMRA標識されたTaqManプローブを用いて実施した。 ２５μLのTaqMan Universal PCR Master Mix(ABI社製)にフォワードプライマー、リバースプライマー各々４００nM、TaqManプローブは５００nMとなる様に添加し更に 抽出した検体のDNAを５μL添加し 滅菌水にて全量を５０μLに調整し ２００μL容 MicroAmp optical tube（ABI社製）にて 次の条件下でリアルタイムPCRをABI PRISM ７７００ Sequence Detection System（ABI社製）を用いて行った。PCR条件は、最初の変性工程が ９５℃、１０分、更に変性工程が ９５℃、１５秒、アニーリング及び伸長工程が６０℃、６０秒のサイクルを５０回繰り返した。
【００２３】
その結果、欧州型１１検体、東アジア型２２検体、両タイプ３検体、分類/検出不可５検体（ピロリ菌に感染していない検体）に分類することができた。この結果は、公知の方法によるピロリ菌の検出結果と同様なものである。
実施例２
実施例１で欧州型、東アジア型と分類された１１検体 および ２２検体由来のDNAを鋳型として欧州型検出の為の５’端がＦＩＴＣ標識された配列番号２のフォワードプライマーと５’端がビオチン標識された配列番号３のリバースプライマー および 東アジア型検出の為の５’端がFAM標識された配列番号５のフォワードプライマーと５’端がビオチン標識された配列番号７のリバースプライマーを用いて 型判別を実施した。２５μLのTaqMan Universal PCR Master Mix(ABI社製)に各２種類のフォワードプライマー、リバースプライマー各々４００nM、抽出した検体のDNAを５μL添加し 滅菌水にて全量を５０μLに調整し ２００μL容 MicroAmp optical tube（ABI社製）にて 次の条件下でPCRをABI PRISM ７７００ Sequence Detection System（ABI社製）を用いて行った。PCR条件は、最初の変性工程が ９５℃、１０分、更に変性工程が ９５℃、１５秒、アニーリング及び伸長工程が６０℃、６０秒のサイクルを３５回繰り返した。反応終了後、未反応の蛍光標識プライマーを除去するために 市販のアビジンビーズ(GenoVision製)を用いてPCR産物を回収、精製しアルカリ変性後 蛍光リーダー(テカン製)にて３３検体の蛍光強度を測定した。
その結果 実施例１で得られた結果と同様な結果を １回のPCRにて得ることが出来た。
実施例３
実施例１で欧州型、東アジア型と分類された１１検体 および ２２検体由来のDNAを鋳型として欧州型検出の為の配列番号２のフォワードプライマーと配列番号３のリバースプライマー および 東アジア型検出の為の配列番号５のフォワードプライマーと配列番号７のリバースプライマーを用いて 型判別を実施した。２５μLのTaqMan Universal PCR Master Mix(ABI社製)に各２種類のフォワードプライマー、リバースプライマー各々４００nM、抽出した検体のDNAを５μL添加し 滅菌水にて全量を５０μLに調整し ２００μL容 MicroAmp optical tube（ABI社製）にて 次の条件下でPCRをABI PRISM ７７００ Sequence Detection System（ABI社製）を用いて行った。PCR条件は、最初の変性工程が ９５℃、１０分、更に変性工程が ９５℃、１５秒、アニーリング及び伸長工程が６０℃、６０秒のサイクルを３５回繰り返した。反応終了後、PCR溶液１０μLを３％アガロース電気泳動に供し エチジウムブロマイド染色後紫外線下で増幅産物のサイズを分子量マーカーおよび陽性コントロールとの比較により測定した。
【００２４】
その結果 実施例１で得られた結果と同様な結果を １回のPCRにて得ることが出来た。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ピロリ菌のcagA遺伝子の増幅領域近傍の塩基配列 ならびに上記の欧州型判別用フォワードプライマー、リバースプライマー、東アジア型判別用フォワードプライマー、リバースプライマー 及び 精度高めるためのTaqManプローブの配列する領域を示す。
【図１】
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【配列表】
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