(57)【要約】      （修正有）【課題】生分解性プラスチックを分解する好熱性酵素をコードする遺伝子の取得方法、それにより得られた新規遺伝子、およびその遺伝子によりコードされる酵素を提供する。また、該酵素または該酵素を発現している微生物を利用した生分解性プラスチックの分解方法を提供する。【解決手段】高温条件のコンポストに一定期間埋設した生分解性プラスチック表面からDNAを直接抽出することにより、効率よくプラスチック分解酵素遺伝子を取得することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性プラスチック分解酵素遺伝子の取得方法であって、
コンポスト中に生分解性プラスチックを埋設する工程、
前記生分解性プラスチックをコンポストから取り出す工程、
前記生分解性プラスチック表面からＤＮＡを抽出する工程、および
生分解性プラスチック分解酵素遺伝子を選抜する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
生分解性プラスチックがエステル結合を含有するプラスチックである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記生分解性プラスチックがポリ乳酸、ポリブチレンサクシネートまたはポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートである、請求項２に記載の酵素。
【請求項４】
コンポストの温度が３０〜８０℃である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法により得られる遺伝子であって、生分解性プラスチック分解活性を有するタンパク質をコードする、前記遺伝子。
【請求項６】
請求項５記載の遺伝子であって、
（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のＮ末端アミノ酸から２７アミノ酸が欠失したアミノ酸配列をコードする遺伝子、またはそれらの相補配列からなる遺伝子、
（ｂ）生分解性プラスチック分解活性を有するタンパク質をコードし（ａ）の核酸配列の一部が欠失、置換、挿入若しくは付加された配列、またはその相補配列からなる遺伝子、または
（ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）の核酸配列にハイブリダイズする遺伝子から選択される、前記遺伝子。
【請求項７】
配列番号１または２の核酸配列を有する遺伝子である、請求項５記載の遺伝子。
【請求項８】
請求項５記載の遺伝子であって、
（ａ）配列番号５に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のＮ末端アミノ酸から２７アミノ酸が欠失したアミノ酸配列をコードする遺伝子、またはそれらの相補配列からなる遺伝子、
（ｂ）生分解性プラスチック分解活性を有するタンパク質をコードし（ａ）の核酸配列の一部が欠失、置換、挿入若しくは付加された配列、またはその相補配列からなる遺伝子、または
（ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）の核酸配列にハイブリダイズする遺伝子から選択される、前記遺伝子。
【請求項９】
配列番号４の核酸配列を有する遺伝子である、請求項５記載の遺伝子。
【請求項１０】
生分解性プラスチック分解酵素であって、配列番号３または配列番号５に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸の、欠失、置換、挿入または付加を有するアミノ酸配列であって、前記生分解性プラスチック分解酵素活性を維持したアミノ酸配列からなる、前記生分解性プラスチック分解酵素。
【請求項１１】
請求項１０記載の生分解性プラスチック分解酵素であって、配列番号３または配列番号５に示すアミノ酸配列のＮ末端側から２７アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸の、欠失、置換、挿入または付加を有するアミノ酸配列であって、生分解性プラスチック分解酵素活性を維持したものである、生分解性プラスチック分解酵素。
【請求項１２】
高温条件下で生分解性プラスチック分解活性を有する、請求項１０または１１記載の酵素。
【請求項１３】
前記生分解性プラスチックが分子構造中にエステル結合を有するものである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項１４】
前記生分解性プラスチックがポリ乳酸、ポリブチレンサクシネートまたはポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートである、請求項１３に記載の酵素。
【請求項１５】
生分解性プラスチック分解酵素の生産方法であって、
（ｄ）請求項５〜９のいずれか一項記載の遺伝子を含むベクターを含有する宿主細胞を、該宿主細胞の生育に適した条件下で培養する工程；
（ｅ）該酵素を該宿主細胞から分離・精製する工程；
を含む、前記酵素の生産方法。
【請求項１６】
宿主細胞が大腸菌である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項１０〜１４のいずれか一項記載の酵素を生分解性プラスチックと接触させる工程を含む、生分解性プラスチックの分解方法。
【請求項１８】
請求項１０〜１４のいずれか一項記載の酵素を含有する宿主細胞を生分解性プラスチックと接触させる工程を含む、生分解性プラスチックの分解方法。
【請求項１９】
４０℃以上の温度で前記生分解性プラスチックと接触させる、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
生分解性プラスチックが分子構造中にエステル結合を有するものである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記生分解性プラスチックがポリ乳酸、ポリブチレンサクシネートまたはポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野 
本発明は、生分解性プラスチックを分解する好熱性酵素をコードする遺伝子の取得方法、それにより得られた新規遺伝子、およびその遺伝子によりコードされる酵素に関する。本発明はまた、該酵素または該酵素を発現している微生物を利用した生分解性プラスチックの分解方法に関する。
【０００２】
従来の技術 
プラスチック廃棄物の再資源化技術のうち、モノマーリサイクルは、一次生産品と全く同等のプラスチック製品を再生することができる利点がある。特に生分解性プラスチックは、そのほとんどがポリエステル系であり、モノマーリサイクルが容易である。しかし廃棄物は「混合物」であり、一般的な化学分解ではモノマーも混合物で得られてしまう。これに対し、分解に酵素を用い、その高い基質特異性を利用することにより混合物からであっても高純度のモノマーを効率よく取り出すことができると考えられる。特に、生分解性プラスチックは土壌細菌によって分解を受けてモノマー化するので、強力な分解酵素を自然界から得やすいというメリットがある。
【０００３】
しかし、従来の分解酵素は至適温度が常温であり、高温下では反応性に乏しい（特許文献１および２参照）。また、自然界からプラスチック分解菌を分離する場合に、プラスチック分解菌は培養不可能なものが多いとされているため、培養を介する方法では分解酵素、遺伝子の取得が困難であった。
【０００４】
近年、メタゲノムスクリーニングと呼ばれる新たな概念と手法が広まりつつある。古典的なスクリーニングでは微生物を探すが、この方法では自然界の99%を占める培養不可能な微生物は対象とできない。そこで土壌より直接ＤＮＡを抽出し、これ（メタゲノム）を大腸菌に組み込んで発現させ、スクリーニングを行う。これまでの発明者らの知見から、自然界で実際に生分解性プラスチックの分解に関わる菌の多くは培養不可能なことが明らかとなっているので有効な手段と考えられる（非特許文献１参照）。
【０００５】
しかし、メタゲノムスクリーニングの概念についてはすでに多くの研究者らによって示され培養不可能な微生物由来の遺伝子を検索対象とできるが、対象遺伝子の絞込みが極めて困難であるという問題があり、自然界からの効率的なプラスチック分解酵素の分離法の確立が強く望まれている。
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−２２５７５５：生分解性ポリマー分解酵素及びその製造方法
【特許文献２】特開平１０−２７１９９４：ポリウレタンエステラーゼをコードする遺伝子
【非特許文献１】日本農芸化学会2003年度大会講演要旨集
【０００７】
発明が解決しようとする課題 
本発明は、生分解性プラスチックを分解する好熱性酵素をコードする遺伝子の効率のよい取得方法を提供することを目的とする。本発明はまた、前記方法により得られる新規遺伝子、その遺伝子によりコードされる酵素を提供することを目的とする。本発明はまた、該酵素または該酵素を発現している微生物を利用した生分解性プラスチックの分解方法およびモノマーの回収方法を提供することを目的とする。
【０００８】
課題を解決するための手段 
本発明者らは、生分解性プラスチックの効率的分解またはコンポスト内での分解に適した好熱性酵素をコードする遺伝子の取得方法を提供すべく、鋭意検討した結果、極めて効率よく好熱性酵素をコードする遺伝子を取得することができる方法を発見し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、生分解性プラスチックを分解する好熱性酵素をコードする遺伝子の効率のよい取得方法である。
本発明はまた、生分解性プラスチックを高温条件下にて分解することができる新規プラスチック分解酵素をコードする遺伝子である。
【００１０】
さらに本発明は、生分解性プラスチックを高温条件下にて分解することができる好熱性新規プラスチック分解酵素である。
本発明はまた、前記酵素もしくは該酵素を発現する宿主細胞を用いる、生分解性プラスチックの分解方法またはそのモノマーの回収方法である。
【００１１】
発明の実施の形態  
遺伝子取得方法
本発明の遺伝子取得方法は、コンポスト中にプラスチックを埋設する工程、前記プラスチックをコンポストから取り出す工程、前記プラスチック表面から全ＤＮＡを抽出する工程、およびプラスチック分解酵素遺伝子を選抜する工程を含む。
【００１２】
コンポストとは、家庭から排出される生ごみや下水及び浄化槽汚泥、家畜の糞尿などの有機物を、微生物の働きによって醗酵分解させ、堆肥にしたものという。コンポストを入れる容器および装置の形態や規模は、大がかりなコンポスト化プラントから家庭用の小型生ごみ処理機まで多種多様であるが、いずれであってもよい。
【００１３】
コンポスト内の温度は、処理中は通常３０〜８０℃程度の比較的高温となる。４０℃以上の高温条件下で処理したプラスチックからは、より効率的に好熱性酵素をコードする遺伝子を分離することができる。
【００１４】
埋設するプラスチックは、生分解性ブラスチックであればよく、好ましくはエステル結合を含有するプラスチックである。制限的でない例としては、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）およびポリ乳酸（ＰＬＡ）が挙げられる。
【００１５】
ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートとは、ポリブチレンサクシネート合成において原料にアジピン酸を加えることにより調製される高分子をいう。融点は90℃ぐらいにまで下がるが、柔軟性が向上する。包装材や苗のポット、ゴミ袋などに利用されている。本発明の酵素により分解されるポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートの数平均分子量は、特に制限はない。
【００１６】
ポリブチレンサクシネートとは、１，４−ブタンジオールとコハク酸のホモポリマーである。例えば、１，４―ブタンジオールとコハク酸の重縮合により調製される。本発明の酵素により分解されるポリブチレンサクシネートの数平均分子量は、特に制限はない。
ポリ乳酸とは、乳酸を主要成分とする重合体をさし、ポリＬ−乳酸や、ポリＤ−乳酸等のポリ乳酸ホモポリマー、ポリＬ/Ｄ−乳酸共重合体、およびこれらにε−カプロラクトン、グリコリド、デプシペプチド等の他の成分を共重合させたポリ乳酸共重合体、そして上記ポリマー間、および他の成分ポリマーとのブレンド体を含む。その重合方法としては、乳酸からの直接重合法、ラクタイド（乳酸の環状二量体）を介する開環重合法等が知られている。また、本発明の酵素により分解されるポリ乳酸の数平均分子量は、特に制限はない。
【００１７】
コンポスト中に埋設する期間は、１〜２日くらいの短期間であってもよいが、効率よく目的遺伝子を取得するためには３日〜数週間埋設するのが好ましい。但し、プラスチックが完全に分解する前に取り出さなければならない。
【００１８】
プラスチックのコンポストからの取り出しは、プラスチックを取り出せる方法であればいずれの方法であってもよい。取り出したプラスチックは必要により水で洗浄する。
プラスチック表面からのＤＮＡの抽出は、取り出したプラスチックから全ＤＮＡ抽出キット、例えばFast DNA Kitを使用して抽出することができる。
【００１９】
抽出した全ＤＮＡからのプラスチック分解酵素遺伝子の選抜は、例えば以下のように実施することができる。まず、全ＤＮＡをある制限酵素にて限定分解し、数Kbの断片を回収して、ベクターに連結し、大腸菌等を形質転換する。これを適当な抗生物質を含んだLB寒天培地に各種生分解性プラスチックのエマルジョンを重層した平板に塗布し、コロニー周辺に生分解性プラスチックの分解により生じるクリアーゾーンを形成するものをピックアップすることにより、プラスチック分解酵素遺伝子を含んだ大腸菌を選抜することができる。
【００２０】
本発明においては、高温条件のコンポストに一定期間埋設した生分解性プラスチック表面からDNAを直接抽出し、好熱性プラスチック分解酵素遺伝子を含有する菌を選抜することにより、極めて効率的にプラスチック分解酵素遺伝子を取得することができる。
【００２１】
遺伝子
次に本発明は、上記方法により分離される生分解性プラスチック分解酵素をコードする遺伝子である。
【００２２】
例を挙げれば、配列番号１または配列番号４の配列を有する遺伝子のオープンリーディングフレームがコードするアミノ酸配列をコードする遺伝子である。例えば配列表の配列番号２に示す核酸番号１−１１８２で示される核酸配列を含む遺伝子、または配列表の配列番号４に示す核酸番号１−１２９３で示される核酸配列を含む遺伝子である。
【００２３】
本発明の遺伝子は、上述の方法で分離された遺伝子において、その縮重を含むことができる。縮重とは、異なるヌクレオチドコドンによって１つのアミノ酸がコードされ得る現象をいう。かくして、本発明の遺伝子は縮重により変化することができる。
【００２４】
本発明には、配列番号２または配列番号４に示した核酸配列、配列番号２または配列番号４に示した核酸配列の相補配列に高度にストリンジェントな条件下で［たとえば０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃でフィルター結合ＤＮＡにハイブリダイゼーション、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中、６８℃で洗浄（Ausubel,F.M. et al.編,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.I,Green Publishing Associates社,およびJohn Wily & Sons社,ニューヨーク，p.2.10.3）］ハイブリダイズする核酸配列によりコードされるタンパク質も同様の酵素活性を示すことがありうる。従って、同様の酵素活性を有する限り、それらの核酸配列も、本発明の範囲に含まれる。さらに、配列番号２に示したヌクレオチド配列の相補配列に中程度にストリンジェントな条件下で［たとえば０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中、４２℃で洗浄（Ausubel,et al.,1989,前掲）］ハイブリダイズする核酸配列によりコードされるタンパク質も同様の酵素活性を示すことがありうる。従って、同様の酵素活性を有する限り、それらの核酸配列も、本発明の範囲に含まれる。
【００２５】
遺伝子組み換え技術によれば、基本となる遺伝子の特定の部位に、当該遺伝子の基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の核酸配列を有する遺伝子、あるいは天然のものとは異なる核酸配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換、付加を行うことにより、天然のポリヌクレオチドと同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含むものである。即ち、配列表の配列番号２または配列番号４に示す遺伝子の一部が挿入、欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号２または配列番号４に示す核酸配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号２または配列番号４に示す核酸配列とは、７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する（相同性の計算は、例えばＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）検索を用いることにより行うことができる。）。その様な遺伝子も、生分解性プラスチックを分解する能力を有するという特徴を有するタンパク質をコードしている限り、本発明の範囲に含まれる。
【００２６】
酵素
次に本発明は、上記遺伝子によりコードされるタンパク質、すなわち生分解性プラスチック分解酵素である。本発明の酵素は、４０℃以上、好ましくは５０℃以上において高い活性を有する好熱性酵素である。
【００２７】
その例を挙げれば、配列番号３のアミノ酸配列を有する酵素である。その酵素は３９４のアミノ酸から構成され、分子量４４，４３６のポリペプチドであり、配列番号３のアミノ酸番号１−３９４で示されるアミノ酸配列により特定される。このアミノ酸配列は、配列番号１に記載されている核酸配列の、オープンリーディングフレーム（読み枠）部分によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号１のオープンリーディングフレームにコードされるタンパク質はシグナルペプチド部分を有しており、その切断点は配列番号３のＮ末端から２７番目のアミノ酸と２８番目のアミノ酸の間である。従って、成熟型の酵素は、分子量４１，３９３で３６７アミノ酸からなる。
【００２８】
他の例は、配列番号５のアミノ酸配列を有する酵素である。その酵素は４３１のアミノ酸から構成され、分子量約４．９万のポリペプチドであり、配列番号５のアミノ酸番号１−４３１で示されるアミノ酸配列により特定される。このアミノ酸配列は、配列番号４に記載されている核酸配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号４で示されるオープンリーディングフレームにコードされるタンパク質はシグナルペプチド部分を有しており、その切断点は配列番号５のＮ末端から２７番目のアミノ酸と２８番目のアミノ酸の間である。従って、成熟型の酵素は、４０４アミノ酸からなる。
【００２９】
本発明のアミノ酸配列には、配列番号３または配列番号５に示したアミノ酸配列、ならびにその類似体および誘導体が含まれる。さらに、配列番号３または配列番号５に示すアミノ酸配列のアミノ酸の一部が欠失、置換、挿入若しくは付加されたタンパク質、例えば配列番号３に示すアミノ酸配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換されたタンパク質も、同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同様の酵素活性を有する限り、それらのタンパク質も本発明の酵素に含まれる。また、その様なタンパク質と配列番号３または配列番号５に示すアミノ酸配列とは、７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する（相同性の計算は、例えばＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）検索を用いることにより行うことができる。）。その様なタンパク質も、生分解性プラスチック分解反応を触媒するという特徴を有する限り、本発明の範囲に含まれる。  
【００３０】
本発明酵素が分解できるプラスチックは、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものである。制限的でない例としては、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、ポリブチレンサクシネートおよびポリ乳酸が挙げられる。
【００３１】
酵素の生産方法
本発明の酵素は、本発明の遺伝子を組み込んだ宿主を培養し、該宿主から酵素を分離・精製することにより、生産することができる。
【００３２】
本発明の酵素を、遺伝子組換え細胞により生産する方法は以下の通りである。まず、核酸分子を、宿主細胞に導入して組換え体を形成することができる何れかのベクターに挿入する。ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡ何れか、原核生物または真核生物何れかであり得るが、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。ベクターは染色体外エレメント（例えば、プラスミド）として発現させることができるか、あるいはそれを染色体に組込むことができる。組込まれた核酸分子は、染色体プロモーター制御した、天然もしくはプラスミドプロモーター制御下、または幾つかのプロモーター制御の組合せ下とすることができる。ポリヌクレオチド分子の単一または複数コピーを染色体に組み込むことができる。次に、該ベクターを宿主細胞にトランスフェクトして組換え細胞を形成させる。トランスフェクトするための適当な宿主細胞にはトランスフェクトできる何れかの細菌、菌類（例えば酵母）、昆虫、植物または動物細胞が含まれる。本発明で使用される好ましい宿主細胞には、限定されるものではないが、例えば大腸菌、枯草菌、酵母等を含めた、本発明の酵素の発現に適した何れの微生物細胞も含まれる。更に、該宿主を、該宿主に適した培養条件にて培養することにより、本発明の酵素を含有した遺伝子組換え細胞を得ることができる。該宿主に適した培養条件は、当業者に周知である。
【００３３】
本発明のアミノ酸配列を組み込んだ宿主細胞からの本発明の酵素の分離・精製は、通常細胞からの蛋白質の分離・精製に用いられる方法を用いることにより行うことができる。具体的には、細胞を破壊後、通常用いられる分離精製手段を用いることにより行うことができる。細胞の破壊には、制限的でない例として、超音波処理、高圧ホモジナイザー処理、浸透圧ショック法が挙げられる。分離精製手段は、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いればよい。更に、酵素のC末端にHis−tagを有するように生産させ、培養菌体を遠心集菌し、ペリプラズム画分を浸透圧ショック法にて抽出し、その酵素はC末端にHis−tagを有しているため、ニッケルをキレートしたカラムによって容易に精製できる。
【００３４】
生分解性プラスチック分解方法およびモノマーの回収方法
更に本発明は、本発明の酵素または該酵素を発現する微生物を利用した生分解性プラスチックの分解方法およびモノマーの回収方法である。
【００３５】
本発明の生分解性プラスチック分解方法の代表例では、本発明の酵素または本発明の酵素を発現する微生物群をコンポストの成分として利用する。
本発明の酵素をコンポストの成分として添加する場合、その酵素は上述の方法で生産することができる。酵素をコンポストの成分として添加する場合は、酵素を宿主細胞から分離・精製する必要があるが、高度に精製されている必要はない。
【００３６】
本発明の酵素を発現している微生物群の調製は、上述の酵素の生産方法において、最終段階の宿主細胞から酵素の分離・精製工程を除いた方法にて調製することができる。すなわち酵素の分離・精製前の微生物群を使用することができる。当該微生物群は、湿潤状態であっても、乾燥粉末などの乾燥状態であっても、コンポスト等に使用することができる。
【００３７】
本発明の酵素は好熱性であり、処理中のコンポスト内の温度である約３０℃〜約８０℃のおいてプラスチックを分解することができる。
プラスチック由来のモノマーの回収は、上記分解プロセスの後に分解により生じたモノマーを回収することにより実施することができる。
【００３８】
本発明のプラスチックを分解する方法により分解できるプラスチックは、前記した通り、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものである。制限的でない例としては、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、ポリブチレンサクシネートおよびポリ乳酸が挙げられる。
分解に共されるプラスチックは、容器、フィルム、ペレット等、いずれの形であってもよい。
【００３９】
プラスチックの分解に要する時間は、分解に供するプラスチックの種類、組成、形状及び量、使用した酵素または微生物の種類及び樹脂に対する相対量、その他種々の条件等に応じて変化しうる。
培地中のプラスチックの分解の確認は、例えば、分解に供したプラスチックの重量減少の測定より確認することができる。
【００４０】
実施例 
本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００４１】
実施例１  遺伝子の取得
＜方法＞
実験対象として、生分解性プラスチックであるポリ（ブチレンサクシネート）-ｃｏ-アジペート（ＰＢＳＡ）、およびポリ乳酸を用いた。ＰＢＳＡは昭和高分子社製のビオノーレ３０２０（平均分子量１４万）を、ポリ乳酸は和光純薬工業社製（分子量約２万）を用いた。土壌または未熟成コンポストを小型の容器に詰め、ディスク状に成型した各種生分解性プラスチックを埋設し、水分調整を行いながら60℃にて運転した。一定期間ごとにディスクを１〜２枚取り出し、抽出キットを用いて表面からの全DNA抽出を行った。これを制限酵素Sau3AIにて限定分解して、２〜５Kbの断片を回収してベクターpUC19に連結し大腸菌DH10Bを形質転換した。これをアンピシリンを含んだLB寒天培地に各種生分解性プラスチックのエマルジョンを重層した平板に塗布し、コロニー周辺にクリアーゾーン形成するものをピックアップした。図１にフローチャートを示す。
【００４２】
＜結果＞
約３万コロニーについて検討の結果、ＰＢＳＡを乳化して加えた平板培地上にクリアーゾーンを形成したコロニー１つを取得した。本コロニーは分子量約２万のポリ乳酸を乳化した培地上でも同様にクリアーゾーンを形成したことから、PBSAおよびポリ乳酸分解活性を持つことが明らかとなった。
【００４３】
得られたコロニーよりプラスミドを抽出し、解析したところ、本プラスミドには約2Kbの断片が挿入されていた。挿入断片の全DNA配列を図２に示した。本プラスミドをpBSX4と命名した。
【００４４】
塩基配列を調べたところ、本断片には開始コドンTTGから始まる1182bpからなるORFが認められた。本ＯＲＦは３９４アミノ酸からなる分子量44,436のポリペプチドをコードしていた。なお、本ポリペプチドのＮ末端側から27アミノ酸はシグナル配列であると推定され、成熟型のポリペプチドは分子量41,393で３６７アミノ酸からなると考えられた。ORF部分のＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を図３に示した。
【００４５】
実施例２．新規ＰＢＳＡ分解酵素の諸性質
＜方法＞
得られたpBSX4由来の遺伝子産物（ＰＢＳＡ分解酵素）の性質について検討した。pBSX4を大腸菌JW366株に導入してアンピシリンを含むＬＢ培地2mlにて、OD580=0.3となるまで培養した。集菌後、100mMのリン酸緩衝液(pH7.0) 300μl加え、超音波により菌体を破砕した。遠心分離後、上清を回収し、これを粗酵素液とした。
【００４６】
エステラーゼ活性の測定には、基質としてｐ−ニトロフェニルアセテートをもちいて、エステル結合の切断によって生じるｐ−ニトロフェノールを、４０５ｎｍの吸光度の増加量で測定する方法を用いた。１分間に１マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを生じさせるのに必要な酵素量を１ユニットとした。
【００４７】
＜結果＞
各温度における粗酵素液のエステラーゼ活性を測定した結果を表１に示す。本酵素は４５℃において最も高い活性を示した。また６０℃における活性も３０℃の場合と比較して約３倍高いことから、４５℃から６０℃にて高活性を示す好熱酵素である事が明らかとなった。
【００４８】
【表１】
2006271367.tif 000002
【００４９】
また、ＰＢＳＡフィルムに対する分解活性を検討した。ＰＢＳＡ分解活性の測定にはビオノーレ３０２０を用いた。ＰＢＳＡ０．２ｇをジクロロメタン５ｍｌに溶解し、ペトリ皿に展開しフィルムを作成した。ＰＢＳＡフィルム5.0ｍｇを粗酵素液０．６ｍｌに加え、４５℃にて１２時間インキュベートした後、重量を測定した。その結果、表２に示すように酵素非添加の対象では分解は全く見られなかったが、酵素を加えた系ではフィルムは完全に分解、消失していた。
【００５０】
【表２】
2006271367.tif 000003
【００５１】
実施例３  遺伝子の取得２
＜方法＞
実験対象として、生分解性プラスチックであるポリ（ブチレンサクシネート）-co-アジペート（ＰＢＳＡ）、およびポリ乳酸を用いた。ＰＢＳＡは昭和高分子社製のビオノーレ３０２０（平均分子量１４万）を、ポリ乳酸は和光純薬工業社製（分子量約２万）を用いた。土壌または未熟成コンポストを小型の容器に詰め、ディスク状に成型した各種生分解性プラスチックを埋設し、水分調整を行いながら60℃にて運転した。一定期間ごとにディスクを１〜２枚取り出し、表面からの全DNA抽出を行った。これを制限酵素Sau3AIにて限定分解して、２〜４Kbの断片を回収してベクターpUC18に連結し大腸菌JW366を形質転換した。これをアンピシリンを含んだLB寒天培地に各種生分解性プラスチックのエマルジョンを重層した平板に塗布し、コロニー周辺にクリアーゾーン形成するものをピックアップした。図４にフローチャートを示す。
【００５２】
＜結果＞
約３万コロニーについて検討の結果、ＰＢＳＡを乳化して加えた平板培地上にクリアーゾーンを形成したコロニー４つを取得した。本コロニーは分子量約２万のポリ乳酸を乳化した培地上でも同様にクリアーゾーンを形成したことから、PBSAおよびポリ乳酸分解活性を持つことが明らかとなった。
得られたコロニーの一つからプラスミドを抽出し、解析したところ、本プラスミドには約2Kbの断片が挿入されていた。本プラスミドをpLA-M4と命名した。
【００５３】
塩基配列を調べたところ、本断片には開始コドンTTGから始まる1293bpからなるORFが認められた。本ＯＲＦは４３１アミノ酸からなる分子量約4.9万のポリペプチドをコードしていた。本遺伝子をplaM4と命名した。なお、本ポリペプチドのＮ末端側から27アミノ酸はシグナル配列であると推定され、成熟型のポリペプチドは４０４アミノ酸からなると考えられた。ORF部分のＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を図５に示した。
【００５４】
実施例４．PlaM4の諸性質
＜方法＞
「plaM4の大量発現系の構築」
シグナルペプチドを除いたplaM4の全長を増幅でき、5’末端にNheIサイト、3’末端にHindIIIサイトを付加したプライマーを作製し、PCRにより発現ベクター用plaM4を調製した。これをNheI、HindIIIで切断した発現ベクターpET-21a(+)に連結し、E. coli BL21株に導入した。
【００５５】
「PlaM4の大量発現」
E. coli BL21/pET-21a(+)-plaM4を、アンピシリンとグルコース（2％）を含むLB培地100mlに1白金耳を植菌し、30℃にて一晩培養を行った。この培養液50mlを同培地500ml 含む三角フラスコに植菌し、37℃で本培養を行った。菌体密度がOD550＝1.0となった時点でIPTGによる発現誘導を行い集菌後、菌体を20mM リン酸buffer(pH7.0)30mlに懸濁、超音波破砕を行いその上清を粗酵素液とした。
【００５６】
「PlaM4の精製および濃縮」
得られた粗酵素液を30%−60%飽和硫酸アンモニウムで分画し、得られた30〜60%飽和硫酸アンモニウム沈殿画分をニッケルを結合したHi-Trap Chelating columnに供した。移動相としては60mM イミダゾールでタンパク質を吸着後、150mM イミダゾールでplaM4を溶出した。得られた画分は、限外ろ過膜により脱塩・濃縮を行い、同時に50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH１２）に置換した。
【００５７】
＜結果＞
「PlaM4の性質」
精製PlaM4のSDS-PAGEを図６に、および各種プラスチックエマルジョンの分解性を表３に示した。プラスチックエマルジョンの分解性の検定には各種エマルジョンを1.5% の寒天で固化した平板にpaper diskを乗せ、酵素液50μlを添加後、37℃、1hr後分解によるクリアーゾーンの有無を観察した。
【００５８】
【表３】
2006271367.tif 000004
【００５９】
さらに、PlaM4のエステラーゼ活性を測定した。エステラーゼ活性の測定には、基質としてｐ−ニトロフェニルアセテートをもちいて、エステル結合の切断によって生じるｐ−ニトロフェノールを、４０５ｎｍの吸光度の増加量で測定する方法を用いた。１分間に１マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを生じさせるのに必要な酵素量を１ｕｎｉｔとした。  本酵素は４５℃において最も高い活性を示し、その比活性は8.56U/mgであった。また６０℃における活性も３０℃の場合と比較して約2倍高いことから、４５℃から６０℃にて高活性を示す好熱酵素である事が明らかとなった。
【００６０】
また、ＰＢＳＡフィルムに対する分解活性を検討した。ＰＢＳＡ分解活性の測定にはビオノーレ３０２０を用いた。ＰＢＳＡ０．２ｇをジクロロメタン５ｍｌに溶解し、ペトリ皿に展開しフィルムを作成した。ＰＢＳＡフィルム5.0ｍｇを粗酵素液5unitに加え、４５℃にて１２時間インキュベートした後、重量を測定した。その結果、表４に示すように酵素非添加の対象では分解は全く見られなかったが、酵素を加えた系ではフィルムは完全に分解、消失していた（図７）。
【００６１】
【表４】
2006271367.tif 000005
【００６２】
発明の効果
高温条件のコンポストに一定期間埋設した生分解性プラスチック表面からDNAを直接抽出して、好熱性プラスチック分解酵素遺伝子を取得することにより、効率よくプラスチック分解酵素遺伝子を取得することができる。
【００６３】
当該遺伝子を発現させた微生物をそのまま、または酵素を取り出して、コンポストなどの高温条件下で生分解性プラスチックを分解・モノマー化することができる。酵素を利用した方法では、酵素の基質特異性を利用した混合物からの純モノマーの取り出しが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、目的遺伝子の取得方法のフローチャートを示す。
【図２】図２は、挿入断片の全DNA配列を示す。
【図３】図３は、ORF部分のＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、目的遺伝子の取得方法のフローチャートを示す。
【図５】図５は、ORF部分のＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図６】図６は、粗酵素液および精製PlaM4のSDS-PAGEの結果を示す。
【図７】図７は、フィルムの分解試験の結果を示す。
【図１】
2006271367.tif 000006
【図２】
2006271367.tif 000007
【図３】
2006271367.tif 000008
【図４】
2006271367.tif 000009
【図５】
2006271367.tif 000010
【図６】
2006271367.tif 000011
【図７】
2006271367.tif 000012
【配列表】
2006271367000001.app