(57)【要約】【課題】  検出用核酸（プローブ核酸）が存在する領域に強制的に標的核酸を移動させてハイブリダイゼーションの発生確率を高める。【解決手段】  ハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域Ｒと、該反応領域Ｒ内に配列された複数の検出用核酸固定部位（例えば、電極Ｅの表面部位）と、前記反応領域Ｒ内に導入された標的核酸Ｔを、前記検出用核酸固定部位の配列順番に従って、誘電泳動により順次移動させていく手段と、を備えるハイブリダイゼーション検出部１ａ等、並びにセンサーチップを提供する。【選択図】  図１
2006084301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域と、
前記反応領域内に配列された複数の検出用核酸固定部位と、
前記反応領域内に導入された標的核酸を、前記検出用核酸固定部位の配列順番に従って、誘電泳動により順次移動させていく手段と、
を備えるハイブリダイゼーション検出部。
【請求項２】
前記検出用核酸固定部位が、電極表面部位であることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項３】
前記電極表面部位は、絶縁膜で覆われていることを特徴とする請求項２記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項４】
前記電極表面部位が、前記反応領域を挟んで向かい合う対向電極の一方側又は両側の電極の表面部位であることを特徴とする請求項２記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項５】
前記対向電極の一方側の電極が、単一又は複数の共通電極から構成されていることを特徴とする請求項４記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項６】
前記対向電極が、複数対並設されていることを特徴とする請求項４記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項７】
それぞれの前記対向電極が対称な位置で向かい合う配置構成を備えることを特徴とする請求項６記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項８】
所定方向へ対向電極を順番に選択して電界を印加していくことを特徴とする請求項６記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項９】
複数設けられた前記検出用核酸固定部位のすべてに、同一種の検出用核酸が固定されていることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項１０】
複数設けられた前記検出用核酸固定部位毎に、異なる種類の検出用核酸が固定されていることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項１１】
前記誘電泳動は、反応領域に貯留又は保持された媒質に対する交流電界の印加によって得られることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項１２】
請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部が設けられたことを特徴とするセンサーチップ。
【請求項１３】
ハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域の複数箇所に設けられた固定部位に予め一種又は複数種の検出用核酸を固定化する手順と、
前記反応領域内に標的核酸を導入する手順と、
前記標的核酸を選択された前記固定部位へ向けて誘電泳動によって順次移動させながらハイブリダイゼーションを進行させる手段と
を少なくとも行うことを特徴とするハイブリダイゼーション検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーションを検出する技術に関する。より詳しくは、検出用核酸が固定された部位へ標的核酸を誘電泳動によって移動させるように工夫したハイブリダイゼーション検出技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００３】
この「ＤＮＡチップ」は、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。以下、本願発明の背景技術と想定される先行技術を説明する。
【０００４】
まず、特許文献１には、核酸等の荷電分子を移動又は分離するための微少電気泳動チップが開示されており、より具体的には、基体に形成されたチャネル内に微少電極が配置されており、該微少電極によって形成された電界により、前記荷電分子がチャネル内を移動し、分離される構成となっている。この先行技術に代表されるように、核酸等の荷電分子を移動又は分離させるために、電気泳動を用いるのが一般的である。
【０００５】
特許文献２には、荷電極性を有する荷電物質を移動させる装置が開示されている。より具体的には、基板上に所定の配列方向に沿って配列された複数の電極を有し、この複数の電極のうちの一部の電極に、前記荷電物質と逆極性の電圧を印加し、極性を切換えながら前記配列方向に前記荷電物質を移動させる装置が開示されている。また、使用する電極の表面を絶縁性薄膜で覆うという構成が開示されている。
【０００６】
特許文献３には、反応領域内に走査電極群を配列しておき、隣り合う電極間に電界を印加して電極エッジに核酸分子を引き寄せ、該核酸分子を両電極エッジに橋架けするように固定配列することができるように工夫された技術が開示されている。
【特許文献１】特表２００１−５０７４４１号公報。
【特許文献２】特開２００３−７５３０２号公報（特に、請求項１、段落００２７参照）。
【特許文献３】特開２００４−１３５５１２号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在提案されている様々なＤＮＡチップ技術は、端的に言えば、物質間の相互作用の場、即ちハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域を基板上に予め設定しておき、この反応領域中にプローブＤＮＡ等の検出用核酸を固定しておくことによって、この検出用核酸と相補的な標的核酸との間の相互作用であるハイブリダイゼーションを解析する技術であると言えるだろう。
【０００８】
このＤＮＡチップ技術では、所定の反応領域へ滴下等されるサンプル溶液中に存在する前記標的核酸が極めて微量であるときには、自然のブラウン運動の条件に委ねると、該標的核酸が相補的な検出用核酸と出会う確率は非常に低くなるため、標的核酸を検出することが難しくなり、また、仮に検出できたとしてもその標的核酸の量を高精度に検出することが困難であるという技術的課題がある。
【０００９】
そこで、本発明は、検出用核酸（プローブ核酸）が存在する領域に強制的に標的核酸を移動させることによって、ハイブリダイゼーションの発生確率を高めることが可能な技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明では、ハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域と、前記反応領域内に配列された複数の検出用核酸固定部位と、前記反応領域内に導入された標的核酸を、前記検出用核酸固定部位の配列順番に従って、誘電泳動により順次移動させていく手段と、を備えるハイブリダイゼーション検出部、並びに該ハイブリダイゼーション検出部を備えるセンサーチップを提供する。
【００１１】
このハイブリダイゼーション検出部（以下「検出部」と略称。）では、反応領域内に、導入（導入手段は問わない）された標的核酸の駆動力として誘電泳動という電気力学的作用を用いることを第一の特徴としている。この「誘電泳動」は、印加した電界とそれにより誘起される分極ベクトル（電気双極子）との相互作用により物質（本発明では、核酸分子）に力が働く現象であって、反応領域内に電極を配置して不均一電界を形成すると、電気力線が集中する部位（例えば、微小電極部位）に向かって物質が移動するという現象である。なお、核酸分子に対する誘電泳動の作用については、非特許文献１である「Seiichi Suzuki，Takeshi Yamanashi,Shin-ichiTazawa,Osamu Kurosawa and Masao Washizu:“Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy”,IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.1,P75-83(1998)」、あるいは、非特許文献２である「鷲津正夫、「見ながら行うＤＮＡハンドリング」、可視化情報  Ｖｏｌ．２０  Ｎｏ．７６（２０００年１月）」に述べられているので、これらの文献を参照すれば、本発明の理解に役立てることができる。
【００１２】
次に、本発明に係る上記検出部では、反応領域内に複数の検出用核酸固定部（例えば、電極表面部位）を配列しておいて、固定部の配列順番に従って、前記誘電移動による駆動力により、各固定部の近傍領域に向けて標的核酸を順次移動させていき、各固定部における検出用核酸と標的核酸の会合確率を高めて、各固定部におけるハイブリダイゼーションを順番に進行させていくという手段を採用していることが第二の特徴である。なお、検出用核酸固定部として、電極表面部位を用いる場合では、この電極表面部位を絶縁膜で覆うことが望ましい。反応領域中に貯留又は保持される場合があるイオン溶液による電気化学的な反応を防止することができるからである。
【００１３】
また、検出用核酸固定部として電極表面部位を採用する場合、反応領域を挟んで向かい合うに配置された対向電極の一方側又は両側の電極の表面部位を検出用核酸固定部として利用することができる。
【００１４】
なお、対向電極は、その一方側の電極を単一又は複数の共通電極で構成してもよく、あるいは、複数対の対向電極を並べて設けてもよい。例えば、それぞれの前記対向電極が対称な位置で向かい合う配置構成である複数対の対向電極を並べて設けてもよい。いずれの電極構成であっても、対向電極の配列方向に従って、対向電極を順番に選択して電界を印加していくようにする。
【００１５】
本発明では、（Ａ）複数設けられた検出用核酸固定部位のすべてに、同一種の検出用核酸を固定する構成、あるいは（Ｂ）複数設けられた前記検出用核酸固定部位毎に、異なる種類の検出用核酸を固定する構成、さらには（Ｃ）所定数の検出用核酸固定部毎にグループ分けして、異なる種類の検出用核酸を固定する構成、のいずれを採用してもよい。特に、（Ｂ）、（Ｃ）の構成を採用すると、反応領域に複数種の標的核酸が混在して含まれる系では、導入側の近傍に位置する固定部あるいは固定部グループに固定化された検出用核酸（プローブ核酸）から順番に、ハイブリダイゼーションを進行させていくアッセイ系を構築できる。
【００１６】
ここで、本発明における「誘電泳動」は、反応領域に貯留又は保持された媒質に対する交流電界、特に好適には高周波交流電界の印加によって得られる電気力学的効果であることが望ましい。交流電界では、直流電界のような電気分解の影響を排除できるからである。
【００１７】
次に、本発明では、（１）ハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域の複数箇所に設けられた固定部位に予め一種又は複数種の検出用核酸を固定化する手順と、（２）前記反応領域内に標的核酸を導入する手順と、（３）前記標的核酸を選択された前記固定部位へ向けて誘電泳動によって順次移動させながらハイブリダイゼーションを進行させる手順と、を少なくとも行うハイブリダイゼーション検出方法を提供する。
【００１８】
（１）の手順は、プローブである検出用核酸の末端を所定の固定部位へ化学的に結合する手順である。固定化に係わる化学的結合は、特に限定されず、また、必要に応じてリンカー分子を介して固定してもよい。なお、この固定化に係わる手順では、固定部位として電極表面部位を活用し、電界印加による誘電泳動によって検出用核酸を電極エッジに引き寄せて、固定化を促進させるようにしてもよい。
【００１９】
（２）の手順は、反応領域内に標的核酸（を含む媒質）を導入する手順であり、この導入の具体的手順や手段は、特に限定されず、反応領域の構成や媒質の物理的性状等に応じて適宜決定すればよい。
【００２０】
（３）の手順は、反応領域に配列された各固定部位でのハイブリダイゼーションを順次進行させる手順である。即ち、所定の固定部位の近傍領域へ標的核酸を移動させて、ハイブリダイゼーションを効率的に進行させるというステップを繰り返して行う手順である。なお、標的核酸の移動は、誘電泳動を駆動力とする。
【００２１】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。
【００２２】
まず、「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２３】
「検出用核酸」とは、反応領域に貯留又は保持された媒質中に固定又は遊離の状態で存在し、当該核酸分子と特異的に相互作用する相補的塩基配列を有する核酸分子を検出するための探り針（検出子）として機能する核酸分子であり、プローブと呼ばれることが多い。代表例は、ＤＮＡプローブなどのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。
【００２４】
「標的核酸」とは、前記検出用核酸と相補的な塩基配列を有する核酸分子である。
【００２５】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。なお、「ミスハイブリダイゼーション」は、正規ではない前記相補鎖形成反応を意味する。
【００２６】
「反応領域」は、ハイブリダイゼーションの場を提供できる領域であり、一例を挙げるなら、液相やゲルなどを貯留できるウエル形状を有する反応場を挙げることができる。
【００２７】
「標的核酸固定部位」は、検出用核酸の末端部を、直接又は間接的に化学的に結合可能な表面構成を有する部位である。
【００２８】
「対向電極」は、電極面が向かい合った状態で配置される少なくとも一対の電極を意味する。本発明では、対向電極の一方が共通電極とされる場合がある。なお、「共通電極」とは、複数の電極との関係において、対向電極を構成する電極を意味する。
【００２９】
「インターカレーター」は、二本鎖核酸に挿入結合可能な蛍光物質であり、ハイブリダイゼーション検出に用いられる物質である。例えば、ＰＯＰＯ−１やＴＯＴＯ−３、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩなどを用いることができる。
【００３０】
「立体障害（steric hindrance）」は、分子内の反応中心等の近傍に嵩高い置換基の存在や反応分子の姿勢や立体構造（高次構造）によって、反応相手の分子の接近が困難になることによって、所望の反応（本願では、ハイブリダイゼーション）が起こり難くなる現象を意味する。
【００３１】
「誘電泳動」は、電界が一様でない場において、分子が電界の強い方へ駆動する現象であり、交流電圧をかけた場合も、かけた電圧の極性の反転につれて分極の極性も反転するので、直流の場合と同様に駆動効果が得られる（監修・林  輝、「マイクロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、Ｐ３７〜Ｐ４６・第５章・細胞およびＤＮＡのマニピュレーション参照）。
【００３２】
「センサーチップ」は、ＤＮＡプローブなどの標的核酸が固定化されて微細配列された状態とされたハイブリダイゼーション検出用基板を広く意味し、ＤＮＡマイクロアレイの概念も含む。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、検出用核酸が固定化された状態で存在する領域へ、誘電泳動によって強制的に標的核酸を移動させることによって、ハイブリダイゼーションの発生確率を高めることができる。加えて、誘電泳動による核酸分子の伸長（伸張）によって、立体障害によるハイブリダイゼーションの阻害やミスハイブリダイゼーションの発生を低減できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００３５】
図１から図１２は、本発明に係る検出部の好適な実施形態を示す図である。まず、図１に示す第一実施形態である検出部の垂直方向の縦断面図を用いることにより、全ての実施形態に共通する基板構成から説明する。
【００３６】
本発明で採用できる基板は、ＣＤ（Compact Disc）、ＤＶＤ（Degital Versatile Disc）、ＭＤ(Mini Disc)等の光情報記録媒体と同様の基材から形成することができる。また、本発明に係る基板は、特に限定されず、目的に応じて、矩形状、円盤状などの様々な形状を採用できる。
【００３７】
図１等に示された最下層に位置する下層基板１１は、光透過性の石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の合成樹脂、好ましくは、射出成形可能な合成樹脂によって、目的の所定形状に成形する。なお、基板１を安価な合成樹脂を用いて基板を成形することで、従来使用されていたガラスチップに比して、低ランニングコストを実現できる。
【００３８】
図１等で示された下層基板１１は、所定波長域の光を透過する光透過層として示されている。下層基板１１を光透過性とすることにより、下層基板１１の下方側（裏面側）からの光照射によって、反応領域Ｒ内の蛍光検出作業等を実施できる。下層基板１１の光透過性は、蛍光励起光と励起された蛍光を少なくとも透過する性質を意味し、さらには、反応領域の位置を検出するための光や焦点を合せるための光を透過する性質までを有するものを含む。
【００３９】
なお、光透過性の下層基板１１は、二層構造としてもよい（図示せず）。上層側の光透過層を、媒質の屈折率及び下層側の光透過層の屈折率よりも高い屈折率を有するようにすれば、フォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御を採用する場合、これらの制御を正確かつ高速に行うことができる。
【００４０】
また、下層基板１１の下方側（裏面側）からの光照射により、反応領域Ｒ内の蛍光検出作業を実施する構成を採用すると、検出部の周辺に、必要な装置群の配置設計を行う場合、基板の上方側には、試料溶液などの滴下又は注入に係わる装置を配置し、基板の下方側には、検出（読み取り）用の光学的装置群をまとめて配置することができるという利点がある。
【００４１】
次に、下層基板１１の上層には、合成樹脂（例えば、感光性ポリイミド樹脂層）などから形成された反応領域形成層１２が設けられている。この反応領域形成層１２は、公知の光ディスクマスタリング技術によって、ハイブリダイゼーションの場を提供する役割を果たす反応領域Ｒ、例えば、ウエル状の反応領域Ｒを形成する。なお、反応領域Ｒの形状は、「ウエル」の概念に狭く限定されない。
【００４２】
次に、反応領域形成層１２の上側の上層１３には、少なくとも光反射層（図示せず。）を設けるようにする。この光反射層は、例えば、数ｎｍから数十ｎｍ程度の範囲の膜厚に形成する。
【００４３】
なお、本発明で用いる基板の表面（反応領域Ｒ内の表面を含む。）は、予め、親媒性加工に基づく表面処理を施すようにしておくのが望ましい。表面上において、疎水性である表面部分と親水性である表面部分を目的に応じて区別して形成しておくことにより、親媒性原理を有効に利用し、スムーズに所望の生体物質を反応領域Ｒ内へ導入することができる等の効果を得ることができる。以上説明した基板の層構成は、以下に説明するすべての実施形態に適合する。
【００４４】
続いて、本発明に係る検出部の具体的な構成を、図面に示された実施形態に基づいて説明する。まず、図１に示した第１実施形態の構成から説明する。
【００４５】
この図１は、本発明に係る検出部の第１実施形態（符号１ａ）の垂直方向断面図である。検出部１ａは、所定形状の基板上に単独で、あるいは多数配列された微小な検出領域である（この点、他の検出部も同様）。検出部１ａには、試料が含有された水溶液（例えば、緩衝液など）を貯留したり、ゲル（例えば、アガロースゲル）を保持したりして、ハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域Ｒが設けられている。
【００４６】
この検出部１ａは、アッセイの目的に応じて、グループ分けし易いように、基板１上に配列してもよく、例えば、使用する試料物質の種類や遺伝子の違いによって、検出部１ａ群を、グループ分けしておくことは自由である。
【００４７】
検出部１ａに設けられた反応領域Ｒの形状やサイズは特に限定されないが、その長さ、幅、深さは、それぞれ数μｍから数百μｍであって、このサイズ値は、励起光のスポット径やサンプル溶液（検出用核酸含有溶液、標的核酸含有溶液）の最小滴下可能量に基づいて決定することができる（他の検出部でも同様）。また、複数の反応領域が連通して形成されたような構成を採用してもよい（図示せず）。
【００４８】
なお、図１やその他の図面に示された符号２１，２２のいずれか一方は、媒質（例えば、標的核酸Ｔを含む媒質やインターカレーターを含む媒質など）を導入するための開口部であり、他方は、空気抜き口である。媒質の導入の際に毛細管現象を利用することを自由である。
【００４９】
ここで、検出部１ａを構成する反応領域Ｒ内には、ＤＮＡプローブ等の検出用核酸Ｄの末端を固定化するための検出用核酸固定部位（以下「固定部位」と略称。）を配設しておくようにする。固定部位の数や面積を増やせば、ハイブリダイゼーションの量を増やすことができる。
【００５０】
この固定部位は、検出用核酸Ｄの末端を固定化に適する表面構成を備える部位であればよいが、図１中に符号Ｅ１〜Ｅｎで示されたような電極表面部位を用いる構成が、より望ましい。検出用核酸Ｄの固定化作業において、電界、特に誘電泳動を利用できるからである。図１には、反応領域Ｒ内の下面領域に所定間隔を置いて配設された固定部位Ｅ１〜Ｅｎに対して、所定量の検出用核酸Ｄが固定化されている様子が模式的に示されている。
【００５１】
なお、検出用核酸Ｄの末端を固定化に適する固定部位Ｅ１〜Ｅｎの表面処理法については、例えば、アミノ基含有のシランカップリング剤溶液やポリリシン溶液で予め表面処理しておく方法を採用できる。合成樹脂製基板に対する表面処理加工の場合は、その表面をプラズマ処理及びＤＵＶ（ＤｅｅｐＵＶ、遠赤外）照射処理後、アミノ基含有シランカップリング剤溶液で処理することもできる。例えば、アミノ基含有のシランカップリング剤溶液やポリリシン溶液で表面処理される。合成樹脂製基板であれば、その表面をプラズマ処理及びＤＵＶ（ＤｅｅｐＵＶ、遠赤外）照射処理後、アミノ基含有シランカップリング剤溶液で処理する。
【００５２】
また、表面に銅、銀、アルミニウム又は金をスパッタして成膜して、その表層にアミノ基、チオール基、カルボキシル基等の官能基（活性基）を有する物質やシステアミン、ストレプトアビジン等をコートしてもよい。ストレプトアビジンによって表面処理された検出表面の場合には、ビオチン化されたＤＮＡプローブ末端の固定に適している。あるいは、チオール（ＳＨ）基によって表面処理された検出表面の場合には、チオール基が末端に修飾されたプローブＤＮＡ等の検出用物質Ｄをジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）により固定することに適している。
【００５３】
また、ｎ個の固定部位Ｅ１〜Ｅｎには、必要に応じて、検出用核酸Ｄを固定化するためのリンカーやスペーサーなどを含む介挿分子を結合することによって、固定部位Ｅ１〜Ｅｎと検出用核酸Ｄとの距離を確保し、互いの干渉を防ぐように工夫してもよい。即ち、検出用核酸Ｄの固定化部位以外が検出表面Ｕに付着してしまうのを防止するようにしてもよい。なお、介挿分子の分子長を選択することによって、例えば、分子長の異なるリンカーを、所定間隔で固定部位Ｅ１〜Ｅｎに交互に結合しておくことで、固定部位Ｅ１〜Ｅｎに固定化された検出用核酸Ｄ同士が互いに干渉し合わないように工夫してもよい。使用する介挿分子の分子長は、検出用核酸Ｄや標的核酸Ｔの長さ（塩基数）、検出用核酸Ｄ同士の距離等に応じて適宜決定できる。
【００５４】
検出部１ａにおける電極Ｅ１〜Ｅｎの表面は、既述したように検出用核酸Ｄの固定部位として機能する。電極Ｅ１〜Ｅｎのそれぞれは、反応領域Ｒの上方に設けられた共通電極Ｅａとの間で、反応領域Ｒを挟むような配置関係で、対向電極を構成している（図１参照）。具体的には、電極Ｅ１−Ｅａ、電極Ｅ２−Ｅａ、電極Ｅ３−Ｅａ・・・・電極Ｅｎ−Ｅａは、それぞれ対向電極として機能する。
【００５５】
電極Ｅ１〜Ｅｎは、アルミニウムや金などの金属、あるいはＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）等の透明な導体で形成するのが望ましい。透明な導体であれば、下層基板１１の裏面側からの光照射による検出等を実施できる。
【００５６】
各電極Ｅ１〜Ｅｎは、ＳｉＯ２、ＳｉＣ、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＯＦ、ＴｉＯ２などから形成された絶縁膜１４で覆うことが望ましい。同様に、共通電極Ｅａも前記絶縁膜１５で覆うことが望ましい。反応領域Ｒ中に貯留される場合があるイオン溶液による電気化学的な反応を防止することができるからである。
【００５７】
この対向電極Ｅ１−Ｅａ、Ｅ２−Ｅａ、Ｅ３−Ｅａ・・・・Ｅｎ−Ｅａは、スイッチＳ１〜Ｓｎのオン／オフ操作を適宜行うことによって、連続的又は断続的に、反応領域Ｒ（の媒質）へ電界を印加することができる。なお、図１他に示された符号Ｖ１は、電源を示している。
【００５８】
対向電極Ｅ１−Ｅａ、Ｅ２−Ｅａ、Ｅ３−Ｅａ・・・・Ｅｎ−Ｅａは、これらを順番に選択して電界印加を行うことで、それぞれの対向電極間に形成される電界場、特に共通電極Ｅａよりも面積狭小に形成された電極Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３・・・・Ｅｎの近傍に形成される不均一電界場（電界が一様でない場、あるいは電界強度の傾きが大きい場）に向けて、開口部２１から導入された標的核酸Ｔを、誘電泳動の作用により、連続的又は断続的に矢印Ｘ方向へ移動させることができる。なお、図１では、スイッチＳ２のみがオンとされて対向電極Ｅ２−Ｅａ間に電界が形成された様子を、電気力線Ｚを模式的に示すことによって示している。
【００５９】
この結果、標的核酸Ｔは、電極Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３・・・・Ｅｎのそれぞれの近傍領域を順番に移動していき、その過程で、各電極Ｅ１〜Ｅｎにそれぞれ固定された検出用核酸Ｄとの間でのハイブリダイゼーションが同時並行的に進行させることができる。このハイブリダイゼーションが不充分である場合は、必要に応じて、標的核酸Ｔの移動に係わる電界印加操作を繰り返し行えばよい。
【００６０】
なお、交流電界、特に所定条件の高周波交流電界等の電界印加により得られる誘電泳動の電気力学的効果によって、反応領域Ｒに存在する核酸分子（検出用核酸Ｄ、標的核酸Ｔなど）を直鎖状に伸長（伸張）させたり、伸長（伸張）させながら移動させたりすることもできる。
【００６１】
ハイブリダイゼーションは、通常、ランダムコイル状に丸まったり、絡まったりしている状態の一本鎖核酸分子同士間で進行するので、立体障害の影響などを受けて、相補結合の効率が低下し、ミスハイブリダイゼーションも起き易くなる。しかし、電界印加を行うことよって、核酸分子の高次構造を伸長状態に調整し、あるいは、核酸分子の会合の確率（即ち、濃度）が高まるように、所定領域へ移動させることができる。
【００６２】
電界印加された状態で、それぞれの固定部位においてハイブリダイゼーションを行うと、誘電泳動の作用により核酸分子が伸長（伸張）するため、これにより立体障害の影響を低減できるので、該ハイブリダイゼーションの効率と精度を飛躍的に高めることができる。この結果、高速のハイブリダイゼーション検出を実現できる。なお、ハイブリダイゼーションの際に、電界オンの状態を継続してもよいが、一旦電界オフの状態（時間帯）を形成しておいて、自然なブラウン運動に委ねてハイブリダイゼーションを進行させるのは、自由である。
【００６３】
即ち、スイッチＳ１〜Ｓｎのオン／オフ操作のタイミングは、目的やその効果に照らして、自由に選択可能である。例えば、前段階のスイッチ（例えば、Ｓ１）をオンしたままで、次のスイッチ（例えば、Ｓ２）をオンしていくと、標的核酸Ｔを、連続的に電極間を移動させることができるし、前段階のスイッチ（例えば、Ｓ１）をオフしてから、次のスイッチ（例えば、Ｓ２）をオンする手順を順次繰り返すと、標的核酸Ｔを、断続的に電極間を移動させることができる。
【００６４】
なお、反応領域Ｒに設けられる対向電極Ｅ１−Ｅａ、Ｅ２−Ｅａ、Ｅ３−Ｅａ・・・・Ｅｎ−Ｅａのいずれにおいても、電界強度の選択に加え、交流と直流の選択、あるいは高周波電界や低周波電界の選択を自在に行うことができるように電界制御できる構成が好適である（他の実施形態でも同様）。様々なハイブリダイゼーション条件や電界条件を必要に応じて設定できるからである。
【００６５】
次に、図２に基づいて、本発明に係る検出部の第２実施形態（符号１ｂ）の構成について説明する。
【００６６】
図２に示された検出部１ｂは、符号Ｆ１〜Ｆｎで示された固定部位が電極ではない構成である点、並びに反応領域Ｒの左右に対向電極Ｅｘ−Ｅｙが設けられている点において、上記第１実施形態の検出部１ａと相違する（図１と図２を比較参照）。
【００６７】
検出部１ｂでは、対向電極Ｅｘ−Ｅｙに電界を印加することによって、固定部位Ｆ１〜Ｆｎを横断するような電界を形成する（図２参照）。このとき、対向電極Ｅｘ−Ｅｙのいずれか一方の電極表面面積を他方よりも狭小にしておくことによって、狭小な電極（ここでは、Ｅｙ）の近傍領域に、不均一な電界場を形成することができる（図２参照）。なお、図２中の符号Ｚは、電界形成の様子を示す電気力線を模式的に示している。
【００６８】
反応領域Ｒに遊離状態で存在する標的核酸Ｔは、誘電泳動の作用に基づいて、不均一な電界場に向けて移動する。その過程で、固定部位Ｆ１〜Ｆｎのそれぞれに固定された検出用核酸Ｄとの間で、ハイブリダイゼーションが進行する。なお、図２示すスイッチＳｍのオン操作は、所定時間継続してもよいし、断続的に行ってもよい。
【００６９】
ここで、図３は、本発明に係る検出部の第３実施形態（符号１ｃ）の構成を示す垂直断面図である。
【００７０】
図３の検出部１ｃの構成の特徴は、反応領域Ｒを挟むように上下に配置された対向電極群Ｅ１−Ｅａ、Ｅ２−Ｅａ・・・・Ｅｎ−Ｅａと反応領域Ｒを挟むように左右に配置された対向電Ｅｘ−Ｅｙの両方を備えることである。言わば、検出部１ｃは、図１の検出部１ａと図２の検出部１ｂを合体した如きの構成を備える。
【００７１】
この検出部１ｃでは、対向電Ｅｘ−Ｅｙによる電界印加により、標的核酸Ｔを概ね目的の領域にまで移動させておき、続く対向電極群Ｅ１−Ｅａ、Ｅ２−Ｅａ、Ｅ３−Ｅａ・・・・Ｅｎ−Ｅａの電界印加操作によって、検出用核酸Ｄが固定された電極Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３・・・・Ｅｎの近傍領域に向けて標的核酸Ｔを引き寄せるという電界アッセイを実施できるという利点がある。また、検出部１ｃでは、対向電Ｅｘ−Ｅｙをハイブリダイゼーションの障害になるような余剰物質やミスハイブリダイゼーションした核酸分子を、ハイブリダイゼーションの場から除去する手段（洗浄手段）として用いることもできるだろう。
【００７２】
次に、図４は、本発明に係る検出部の第４実施形態（符号１ｄ）の構成を示す垂直断面図である。
【００７３】
この検出部１ｄの特徴は、上方側の共通電極が複数設けられており（この場合二つ、ＥａとＥｂ）、そして、共通電極Ｅａが係わる対向電極群（Ｅ１−Ｅａ、Ｅ２−Ｅａ、Ｅ３−Ｅａ）と、共通電極Ｅｂが係わる対向電極群（Ｅ４−Ｅｂ、Ｅ５−Ｅｂ、Ｅ6−Ｅｂ）が設けられ、それぞれの対向電極群が別個独立の電源Ｖ１、Ｖ２を用いて電界印加の操作が可能とされている点である。
【００７４】
なお、本実施形態では、下方側の電極が計６個形成されているものとして示されているが（図４参照）、電極個数や対向電極群のセット数は、適宜設計可能である。
【００７５】
電極Ｅ１−Ｅ６のすべてに同一種の検出用核酸Ｄを固定してもよいが、例えば、図４に示すように、対向電極群（Ｅ１−Ｅａ、Ｅ２−Ｅａ、Ｅ３−Ｅａ）と対向電極群（Ｅ４−Ｅｂ、Ｅ５−Ｅｂ、Ｅ6−Ｅｂ）に分けて、それぞれ異なる検出用核酸Ｄ１、Ｄ２を固定するようにしてもよい。
【００７６】
図５は、本発明に係る検出部の第５実施形態（符号１ｅ）の構成を示す垂直断面図である。
【００７７】
図５に示された検出部１ｅの特徴は、固定部位として機能するｎ個の電極Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３・・・・Ｅｎに、それぞれ塩基配列が異なる検出用核酸Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３・・・・Ｄｎを固定したことである。
【００７８】
このような構成の検出部１ｅでは、スイッチＳ１〜Ｓｎのオン／オフ操作に基づく電界印加操作により、順番に、開口部２１から導入された媒質Ｍに含まれている複数種の標的核酸Ｔ群を、開口部２１に近い位置から遠い方に向けた電極Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３・・・・Ｅｎに移動させていき、ハイブリダイゼーションを進行させることができる。図５では、検出用核酸Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３・・・・Ｄｎとそれぞれ相補性のある標的核酸Ｔが、図面左から右へ向けて、順番にトラップ（ハイブリダイゼーション）されていく様子が模式的に示されている。
【００７９】
図６は、本発明に係る検出部の第６実施形態（符号１ｆ）の構成を示す垂直断面図である。
【００８０】
図６に示された検出部１ｆは、反応領域Ｒを上下から挟むような形態で、複数対（本実施形態では計６対）の対向電極が対並設されている、即ち、Ｅ１−Ｅ７，Ｅ２−Ｅ８，Ｅ３−Ｅ９，Ｅ４−Ｅ１０，Ｅ５−Ｅ１１，Ｅ６−Ｅ１２からなる対向電極が所定間隔で並び設けられている。さらに、これらの対向電極のすべてが、対称な位置で向かい合う配置構成を備える。
【００８１】
この検出部１ｆでは、Ｓ１とＳ７，Ｓ２とＳ８，Ｓ３とＳ９，Ｓ４とＳ１０，Ｓ５とＳ１１，Ｓ６とＳ１２の組み合わせで、スイッチのオン／オフ操作を順番に行ってもよく、あるいは、その逆方向へ順番にスイッチのオン／オフ操作を行ってもよい。いずれにしても、電界印加操作により、各電極Ｅ１〜Ｅ１２におけるハイブリダイゼーションを効率よく進行させる。なお、斜め方向に位置する電極（例えば、Ｅ１とＥ８）間で電界印加を行ってもよい。
【００８２】
図７Ａ、図７Ｂは、本発明に係る検出部の第７実施形態（符号１ｇ）の構成を示す図であり、図７Ａは、開口状態の反応領域Ｒを上方から視たときの状態を示す図、図７Ｂは、図７ＡのＡ―Ａ方向から視た矢視断面図である。
【００８３】
図７Ａ、図７Ｂに示された検出部１ｇは、上述した第６実施形態である検出部１ｆの変形形態とも言えるものである。具体的には、検出部１ｇは、検出部１ｆと同様に、対称位置に配置された電極対が複数並設されているが、電極Ｅ１〜Ｅ１２は、反応領域Ｒの底面Ｒｂ（図７Ｂ参照）に敷設された如き状態で、並べ設けられている点が、検出部１ｆとは構成を異にする。
【００８４】
なお、図７Ｂの符号１７は、ＳｉＯ２、ＳｉＣ、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＯＦ、ＴｉＯ２などから形成された絶縁膜を示している。また、図７Ａあるいは図７Ｂには、対向する電極エッジ部分に検出用核酸Ｄの末端が固定された状態が模式的に表されている。
【００８５】
この検出部１ｇでも、Ｓ１とＳ７，Ｓ２とＳ８，Ｓ３とＳ９，Ｓ４とＳ１０，Ｓ５とＳ１１，Ｓ６とＳ１２の組み合わせで、スイッチのオン／オフ操作を順番に行ってもよく、あるいは、その逆方向へ順番にスイッチのオン／オフ操作を行ってもよい。いずれにしても、電界印加操作により、各電極Ｅ１〜Ｅ１２でハイブリダイゼーションを効率よく進行させる。なお、斜め方向に位置する電極（例えば、Ｅ１とＥ８）間で電界印加を行ってもよい。
【００８６】
図８は、本発明に係る検出部の第８実施形態（符号１ｈ）の構成を示す図であり、開口状態の反応領域Ｒを上方から視たときの状態を示す図である。
【００８７】
図８に検出部１ｈは、既述した第１実施形態である検出部１ａ（図１参照）の変形形態とも言えるものである。具体的には、検出部１ｈは、共通電極Ｅａを有するとともに、これに対向するように配置された電極Ｅ１〜Ｅ６が並設されている。これらの電極Ｅａ、Ｅ１〜Ｅ6は、反応領域Ｒの底面Ｒｂ（図７Ｂ参照）に敷設された如き状態で、並べ設けられている。
【００８８】
図８で示す検出部１ｈは、既述した図５の検出部１ｅと同様に、各電極Ｅ１〜Ｅ６に異なる検出用核酸Ｄが固定された例が示されている。スイッチＳ１からＳ６へ順番にオンする過程において、各電極Ｅ１〜Ｅ６では、それぞれの種類の異なる検出用核酸Ｄと相補性のある標的核酸Ｔとの間で、ハイブリダイゼーションが効率よく進行する。
【００８９】
図９は、本発明に係る検出部の第８実施形態（符号１ｉ）の構成を示す図であり、開口状態の反応領域Ｒを上方から視たときの状態を示す図である。
【００９０】
この図９に示された検出部１ｉは、計６対の対向電極Ｅ１−Ｅ７，Ｅ２−Ｅ８，Ｅ３−Ｅ９，Ｅ４−Ｅ１０，Ｅ５−Ｅ１１，Ｅ６−Ｅ１２が所定間隔で、反応領域Ｒの底面Ｒｂ（図７Ｂ参照）に敷設された状態で、並び設けられている。
【００９１】
そして、これらの電極とは別個に、電界印加の操作とは直接関係のない固定部位Ｆが設けられている。固定部位Ｆ１〜Ｆ６は、対向電極Ｅ１−Ｅ７，Ｅ２−Ｅ８，Ｅ３−Ｅ９，Ｅ４−Ｅ１０，Ｅ５−Ｅ１１，Ｅ６−Ｅ１２にそれぞれ挟まれるように配置されている（図８参照）。
【００９２】
この検出部１ｉでも、スイッチＳ１とＳ７，Ｓ２とＳ８，Ｓ３とＳ９，Ｓ４とＳ１０，Ｓ５とＳ１１，Ｓ６とＳ１２の組み合わせで、スイッチのオン／オフ操作を順番に行ってもよく、あるいは、その逆方向へ順番にスイッチのオン／オフ操作を行ってもよい。いずれにしても、各固定部位Ｆ１〜Ｆ６では、標的核酸Ｔが移動してくるので、ハイブリダイゼーションが効率よく進行する。なお、本検出部１ｉにおいても、斜め方向に位置する電極（例えば、Ｅ１とＥ８）間で電界印加を行ってもよい。
【００９３】
図１０は、本発明に係る検出部の第１０実施形態（符号１ｊ）の構成を示す図であり、開口状態の反応領域Ｒを上方から視たときの状態を示す図である。
【００９４】
この図１０に示された検出部1ｊは、共通電極Ｅａを有するとともに、この共通電極Ｅａに対向するように配置された電極Ｅ１〜Ｅ６が並設されている（数は、６個に限定されない）。そして、電極ではない固定部位Ｆ１〜Ｆ６が、対向電極Ｅ１−Ｅａ，Ｅ２−Ｅａ，Ｅ３−Ｅａ，Ｅ４−Ｅａ，Ｅ５−Ｅａ，Ｅ６−Ｅａにそれぞれ挟まれるように配置されている（図１０参照）。これらの電極Ｅａ、Ｅ１〜Ｅ6や固定部Ｆ１〜Ｆ６は、反応領域Ｒの底面Ｒｂ（図７Ｂ参照）に敷設された如き状態で、並べ設けられている。
【００９５】
以上で説明した検出部１ａ〜１ｊでは、反応領域Ｒ内に配列された複数の対向電極間に、所定の順番に電界を印加することで、誘電泳動の作用を利用して標的核酸Ｔを移動させながら、ハイブリダイゼーションを効率よく進行させるという構成を有する点で共通の作用・効果を有している。
【００９６】
本発明において、電界印加の操作は、反応領域Ｒ内の媒質に対して、高周波交流電界を印加するのが好適である。このときの印加電界の好適な条件として、高周波電界は、１ＭＶ／ｍ以上及び５００ｋＨｚ以上が望ましく、例えば、約１×１０６Ｖ／ｍ、約１ＭＨｚを好適に選択できる（Masao Washizu and Osamu Kurosawa：”Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures”，IEEE Transaction on Industrial Application Vol.26,No.26,p.1165-1172(1990)参照）。
【００９７】
なお、アッセイで用いる試料物質を含む媒質を、反応領域Ｒへ確実に送り込むために、毛細管現象を利用するようにしてもよい。このために、反応領域Ｒに連通する開口部２１と、空気抜き口２２を設けるように工夫し、さらには、前記開口部２１の上方開口部の周辺表面領域を、媒質と逆の親媒性である疎水性としてもよい。
【００９８】
以上説明した検出部１ａ〜１ｊを所定形状の基板に、単独又は複数配置することによって、本発明に係るセンサーチップを製造できる。
【００９９】
このセンサーチップの各反応領域Ｒに対する媒質の滴下又は注入に係わる具体的方法は、特に限定されないが、例を挙げると、インクジェットプリンティング技術を利用した圧電技術によって、ＸＹＺ作動制御システムによって位置制御された小さなジェットノズルを介して、反応領域Ｒに正確に噴射することができる。
【０１００】
あるいは、マイクロスポッティング技術を用いて、ＸＹＺ作動制御システムによって位置制御されたマイクロスポッティングペン、キャピラリー、あるいはピンセットを装着したプリントヘッドにより、反応領域Ｒにスポットすることができる。
【０１０１】
これらの滴下（スポッティング）方法は、基板１上の検出部３位置に正確に追従させながら、検出用核酸Ｄを含む微小滴並びに標的核酸Ｄを含む微小滴などを、正確に滴下することができる。
【０１０２】
なお、図１１のように、ハイブリダイゼーションの検出は、標的核酸Ｔに蛍光物質ｆを予め標識し、あるいは、図１２に示すように、二本鎖核酸Ｗの塩基対部分に特異的に結合する蛍光インターカレーターＩを用いて、これらの蛍光強度を読み取る公知の光学的手段（光ピックアップ手段）によって実施することが可能である。また、図示しないが、モレキュラービーコンを利用してハイブリダイゼーションを検出するのは自由である。
【０１０３】
ハイブリダイゼーションの検出は、反応領域Ｒの上方側、下方側のいずれの方向から行ってもよいが、本発明では、既述したように、下層側１１や電極Ｅ群を光透過性とすることによって、蛍光を読み取るための所定波長のレーザー光Ｐ（図１１、図１２参照）を、基板の下側から反応領域Ｒに向けて照射する構成を採用できる。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明は、ハイブリダイゼーション検出に係わる作業を短時間で効率よく実施でき、かつ検出精度の高いハイブリダイゼーション検出を実施できるセンサーチップ、装置、システム、並びに方法として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】本発明に係る検出部の第１実施形態（符号１ａ）の垂直方向断面図である。
【図２】同検出部の第２実施形態（符号１ｂ）の垂直方向断面図である。
【図３】同検出部の第３実施形態（符号１ｃ）の垂直方向断面図である。
【図４】同検出部の第４実施形態（符号１ｅ）の垂直方向断面図である。
【図５】同検出部の第５実施形態（符号１ｅ）の構成を示す垂直断面図である。
【図６】同検出部の第６実施形態（符号１ｆ）の構成を示す垂直断面図である。
【図７Ａ】本発明に係る検出部の第７実施形態（符号１ｇ）の構成を示す図であり、開口状態の反応領域Ｒを上方から視たときの状態を示す図である。
【図７Ｂ】図７ＡのＡ―Ａ方向から視た矢視断面図である。
【図８】同検出部の第８実施形態（符号１ｈ）の構成を示す図であり、開口状態の反応領域（Ｒ）を上方から視たときの状態を示す図である。
【図９】同検出部の第９実施形態（符号１ｉ）の構成を示す図であり、開口状態の反応領域（Ｒ）を上方から視たときの状態を示す図である。
【図１０】同検出部の第１０実施形態（符号１ｊ）の構成を示す図であり、開口状態の反応領域Ｒを上方から視たときの状態を示す図である。
【図１１】標的核酸（Ｔ）に蛍光物質（ｆ）を標識することにより、ハイブリダイゼーションの検出行うときの概念を示す図である。
【図１２】蛍光インターカレーター（Ｉ）を用いたハイブリダイゼーション検出の概念を示す図である。
【符号の説明】
【０１０６】
１ａ〜１ｊ  ハイブリダイゼーション検出部（略称、検出部）
Ｄ  検出用核酸（例、ＤＮＡプローブ）
Ｅ１〜Ｅｎ  電極（固定部位として利用する場合がある）
Ｅａ，Ｅｂ  共通電極
Ｆ  （電極以外の）固定部位
ｆ  蛍光物質
Ｉ  蛍光インターカレーター
Ｍ  溶液やゲルなどの媒質
Ｒ  反応領域
Ｔ  標的核酸
【図１】
2006084301.tif 000003
【図２】
2006084301.tif 000004
【図３】
2006084301.tif 000005
【図４】
2006084301.tif 000006
【図５】
2006084301.tif 000007
【図６】
2006084301.tif 000008
【図７Ａ】
2006084301.tif 000009
【図７Ｂ】
2006084301.tif 000010
【図８】
2006084301.tif 000011
【図９】
2006084301.tif 000012
【図１０】
2006084301.tif 000013
【図１１】
2006084301.tif 000014
【図１２】
2006084301.tif 000015