(57)【要約】      （修正有）【課題】  家畜胚由来細胞の培養方法を提供する。【解決手段】  家畜胚由来細胞の培養方法は、家畜胚の透明帯に切込みを入れて培養を行い、ヘルニアを形成させた後にヘルニア部分の栄養膜細胞を採取し、当該栄養膜細胞を血清の存在下、αＭＥＭ改変培地で培養することからなる。遺伝子診断やＤＮＡマーカー解析を行うために必要な十分量のＤＮＡサンプル量が得られ、遺伝子情報に基づく家畜の選別が容易となり、家畜の改良速度を速めることができる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
家畜胚の透明帯に切込みを入れて培養を行い、ヘルニアを形成させた後にヘルニア部分の栄養膜細胞を採取し、当該栄養膜細胞を血清の存在下、αＭＥＭ改変培地で培養することからなる家畜胚由来細胞の培養方法。
【請求項２】
αＭＥＭ改変培地が、αMEM培地に100μM MEM 非必須アミノ酸、100μM 2-メルカプトエタノール、5μg/ml インスリン、10ng/ml EGF、10ng/ml FGF-1、10μg/ml ヘパリン、5mg/mlBSAを添加した培地である請求項１記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は家畜胚由来細胞の培養方法に関する。より詳細には、ヘルニア法バイオプシーにより形成されたヘルニア部分（栄養膜細胞）を採取し、当該細胞を培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、家畜の品種改良が種々の方法で行われてきた。例えば、黒毛和種やホルスタイン種など、牛の改良における選抜・淘汰は、外貌や後代検定の成績などを基準に行われてきた。しかし、この方法では牛個体が生まれてから評価することになり、選抜・淘汰にかなりの時間と経費がかかるという欠点がある。一方、牛の繁殖技術の一つとして、受精卵（胚）移植が生産現場に普及し、数多くの受精卵が生産され、仮腹牛に移植が行われ、仔牛の生産に役立っている。
近年、ＰＣＲ法やＦＩＳＨ法の開発により、少数の細胞で遺伝子診断や染色体異常の解析が可能となってきた。これらの技術をウシ受精卵に応用することにより、性判別、遺伝病の解析、ミトコンドリアＤＮＡの解析、肉質や乳量に関連した遺伝子マーカー解析などが受精卵で可能となってきた（非特許文献１）。
【非特許文献１】Theriogenology, 55: 23-34 (2001)
【０００３】
受精卵の段階での遺伝子診断技術は、仔牛が生まれた後に判断する従来方法に比べて、牛の改良速度を飛躍的に早める選抜・淘汰技術として注目を集めている。
受精卵（胚）を死なせずに遺伝子解析などに用いるごくわずかの胚細胞を採取するために、胚のバイオプシー法が開発された。一般的には、微小メスを用いて透明帯も含めて胚の一部を切開して胚細胞を切除する方法（非特許文献２、非特許文献３）、また、透明帯に微小針を刺して穴を開け、細いピペットを胚内部に刺して、一部の胚細胞を吸引して採取する方法（非特許文献４、非特許文献５）などが行われている。
【非特許文献２】Theriogenology,31: 95-104 (1989)
【非特許文献３】Theriogenology,43: 71-80 (1995)
【非特許文献４】Theriogenology, 46:813-824 (1996)
【非特許文献５】Theriogenology, 47: 501-509 (1997)
【０００４】
採取した細胞の遺伝情報をより正確に読み取るためや胚から細胞を採取中にピペットなどに細胞が吸着して回収できないという問題を解消するためには、多くの細胞を採取することが望ましい。しかし、多くの細胞を採取することは、胚に対する傷害が大きくなり、バイオプシーした後の胚の発生が停止したり、また、胚そのものが死滅する確率が高くなるといった問題があった。また、傷害を受けた胚は十分修復できないと、凍結保存したバイオプシー胚の融解後の生存率が低下する現象も知られている（前掲非特許文献５、非特許文献６）。その結果、移植した後の受胎率が、バイオプシー胚では低い（非特許文献７）といった深刻な問題となっており、凍結保存可能で、しかも、移植しても受胎可能な高品質バイオプシー胚の効率的生産技術の確立が望まれている。
【非特許文献６】Cryobiology, 32: 505-510 (1995)
【非特許文献７】Theriogenology, 50: 129-145 (1998)
【０００５】
このような問題から、非特許文献８には、バイオプシーした後の胚の細胞傷害を少なくする方法をヒツジ受精卵で報告している。この方法は、微小針で胚透明帯に小さな穴を開け、２４時間培養すると胚細胞の増殖が起こり、一部の細胞が胚外部に飛び出して風船様のヘルニアを形成する。ヘルニア部分の細胞を微小メスで切除して遺伝子診断に使用するというものである（一般にヘルニア法と称されており、本願明細書でもヘルニア法という）。この方法は胚本体に与える細胞傷害が少なく、バイオプシー胚の凍結融解後の生存能も高いことを報告している。また、この方法のもうひとつの長所として、培養することにより細胞増殖が誘導され、ヘルニア部分より胚細胞数が１胚当たり平均２０個程度採取できると報告しており、複数の遺伝子診断が可能なＤＮＡ量を回収できることである。
【非特許文献８】J Reprod Fertil, 119: 309-314 (2000)
【０００６】
本発明者らは、このバイオプシー法をウシ体外受精胚に応用できるかどうか検討した（非特許文献９）。
重要なポイントとしては、(1)透明帯を切開した胚を培養した後のヘルニア形成細胞（栄養膜細胞）の出現率の向上、(2)ヘルニア部分における活発な栄養膜細胞の増殖、(3)ヘルニア部分を切除した後の移植に用いられるバイオプシー胚の高い生存率の向上、(4)耐凍能の高いバイオプシー胚の生産が挙げられる。
より具体的には、ウシ体外受精胚（桑実胚）の透明帯を切開後、無血清培地（ＩＶＭＤ101）と血清培地（ＨＰＭ199 + 5% ＣＳ）で培養して胚盤胞の発生率を比較検討した。透明帯を切開した胚（桑実胚）を無血清培地（IVMD101）及び血清培地（HPM199 + 5％ CS）で72時間まで培養したところ、ヘルニア胚の形成率は、それぞれ75.6％と37.5％となり、無血清培地で高かった。透明帯を切開した胚を48時間培養してできたヘルニア部分の栄養膜細胞数は、無血清培地で46.7個、血清培地で33.8個であった。この時バイオプシーした胚をガラス化法により凍結保存し、融解後72時間培養した後の胚の生存率は、無血清培養胚では66.1％に対して、血清培地胚は12.5％であった。
以上の結果をまとめると、無血清培地（ＩＶＭＤ101）で培養することによりバイオプシー胚の高いヘルニア形成を得ることができた。ヘルニア部分から切除した栄養膜細胞の細胞数を測定したところ、無血清培地で培養した胚の方が平均細胞数が多かった。また、無血清培地で培養したバイオプシー胚の方が、凍結保存による耐凍能が高かった。
【非特許文献９】Tissue Cult. Res. Commun., 23: 139-147 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、ウシ胚のヘルニア法バイオプシーにおいては、上記の無血清培地を使用することにより、前記ポイント(1)〜(4)の課題を改善できることが判明した。
しかし、ヘルニア部分から切除した栄養膜細胞数が30-50個程度では、精度の高い多数項目（例えば１０項目以上）の遺伝子診断やＤＮＡマーカー解析を行うために必要な十分量のＤＮＡサンプル量は得られない。従って、ヘルニア部分から切除した少数の栄養膜細胞をさらに培養し、効率よく生存させ、しかも良好に細胞増殖させる培養法の確立が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は上記の課題を解決するためになされたもので、家畜胚の透明帯に切込みを入れて培養を行い、ヘルニアを形成させた後にヘルニア部分の栄養膜細胞を採取し、当該栄養膜細胞を血清の存在下、αＭＥＭ改変培地で培養することからなる家畜胚由来細胞の培養方法であり、上記のαＭＥＭ改変培地としては、αMEM培地に100μM MEM 非必須アミノ酸、100μM 2-メルカプトエタノール、5μg/ml インスリン、10ng/ml EGF、10ng/ml FGF-1、10μg/ml ヘパリン、5mg/mlBSAを添加した培地が好適に使用される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明においては、ヘルニア法で形成された栄養膜細胞を血清の存在下、新規な培地で培養しており、後記実施例に示されるように、当該栄養膜細胞の生存率及び増殖率を著しく改良することができる。従って、本発明によれば、精度の高い多数項目の遺伝子診断やＤＮＡマーカー解析を行うために必要な十分量のＤＮＡサンプル量が得られ、優良な遺伝子や合目的的な遺伝子を有する家畜の選別（例えば、性別、遺伝病の有無、高肉質、多乳量等）が容易となるので、家畜の改良速度を速めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
上述のように、本発明の家畜胚由来細胞の培養方法は、家畜胚の透明帯に切込みを入れて培養を行い、ヘルニアを形成させた後にヘルニア部分の栄養膜細胞を採取し、当該栄養膜細胞を血清の存在下、αＭＥＭ改変培地で培養することからなる。即ち、所謂ヘルニア法バイオプシーで形成されたヘルニア（栄養膜細胞）を採取し、それを血清の存在下、αＭＥＭ改変培地で培養する方法である。
本発明で使用される家畜胚は、常法に準じて、体外受精卵の培養や生体胚の採取により得ることができる。家畜としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどが例示されるが、これらに限定されるものではない。経済的な意義や需要からすると、ウシ及びブタ胚に適用するのが好ましい。
【００１１】
ヘルニア法は、前述のように、既に文献記載の公知の方法であり、従来法に準じて行うことができる（前掲非特許文献８及び９参照）。その一例を具体的に説明すると、受精後６〜７日目の家畜胚の透明帯にガラスナイフなどで微小の切込みを入れ、適当な培地（前記のように、ウシ胚においては、ＩＶＭＤ101培地）で１〜３日間培養する。係る培養により、胚には切込みから飛び出たヘルニア部分が形成される。このヘルニア部分（栄養膜細胞）を金属ナイフなどで切断し、採取する。
なお、ヘルニア部分を切除された本体側の胚（バイオプシー胚）は修復培養した後、移植に用いられるまで凍結保存される。
【００１２】
本発明においては、上記で採取されたヘルニア部分の栄養膜細胞を、血清の存在下、αＭＥＭ改変培地で培養する。
αＭＥＭ改変培地としては、上記の栄養膜細胞の増殖及び生存を改善できるαＭＥＭ培地であればいずれの培地も使用することができるが、例えば、αＭＥＭ培地に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、インスリン、ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ヘパリン、２-メルカプトエタノール、ＭＥＭ 非必須アミノ酸溶液などを適宜添加した培地を挙げることができる。上記の非必須アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリンなどのアミノ酸を挙げることができる。
本発明で使用されるαＭＥＭ改変培地の好ましい例としては、αMEM培地に100μM MEM非必須アミノ酸（8.9μg/ml Ｌ−アラニン、13.2μg/ml Ｌ−アスパラギン、13.3μg/ml Ｌ−アスパラギン酸、14.7μg/ml Ｌ−グルタミン酸、7.5μg/ml グリシン、11.5μg/ml Ｌ−プロリン、10.5μg/ml Ｌ−セリン）、100μM 2-メルカプトエタノール、5μg/ml インスリン、10ng/ml EGF、10ng/ml FGF-1、10μg/ml ヘパリン、5mg/mlBSAを添加した培地（以下、ESM-2培地という）が挙げられる。
また、血清としては、細胞培養で慣用の血清を使用することができ、好ましくはウシ胎児血清（ＦＢＳ）が使用される。αＭＥＭ改変培地に対する血清の添加量は、栄養膜細胞の増殖及び生存を改善できる量であれば特に限定はされないが、αＭＥＭ改変培地に対して、１〜２０％（ｗ／ｖ、以下同様）、好ましくは２．５〜１５％、より好ましくは１０％程度に調整される。
【００１３】
上記の血清添加αＭＥＭ改変培地を用いた栄養膜細胞の培養は、常法に準じて行うことができ、例えば、5％CO2/95％空気、38.5℃飽和湿度条件下、浮遊培養法で、適宜培地交換を行うことで培養することができる。
かくして培養された栄養膜細胞は、常法に準じて、当該細胞から遺伝子を採取し、遺伝子診断やＤＮＡマーカー解析に供される。
【実施例】
【００１４】
以下、実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る実施例に限定されるものではない。なお、実施例で使用した材料及び実験方法の概要は以下のとおりである。
【００１５】
材料及び実験方法
(1)卵子の回収と体外成熟培養
屠畜した雌牛より卵巣を採取し、250μg/ml硫酸カナマイシン添加した生理食塩水に入れて実験室に持ち帰った。卵巣内に存在する直径2-5mmの卵胞より、吸引法により卵丘-卵子複合体（COCs）を回収した。実体顕微鏡下で観察し、3-5層の卵丘細胞がしっかりと付着している卵子のみを実験に用いた。選択したCOCsは、細胞培養用シャーレ（MS1160-R；住友ベークライト社製）上に作製した300μlの無血清培地（IVMD101；機能性ペプチド研究所社製）のドロップ中に30-35個ずつ移し、流動パラフィン（Nakarai Tesque社製）で覆い、5％ CO２/95％空気、38.5℃、飽和湿度条件下で20-22時間培養して卵子の体外成熟を行った。
【００１６】
(2)体外受精胚の作製方法
牛凍結精液を37℃で速やかに融解し、IVF100培地（機能性ペプチド研究所社製）で希釈して、2000回転、5分間の遠心操作を2回行い、精子洗浄を行った。体外受精操作は、卵子の体外成熟と同じ培養気相条件で、IVF100培地中で体外成熟培養後の成熟卵子と5.0×106精子/mlの精子液を一緒にし、6時間培養した。体外受精操作後、200μlのIVMD101培地の入ったリプロC-1プレート（機能性ペプチド研究所社製）の1穴に25-30個ずつ卵子を入れ、5％ CO２/95％空気、38.5℃、飽和湿度条件下で20-22時間培養して体外培養を行った。その後卵丘細胞を卵子から剥離し、200μlの胚発生用無血清培地（IVD101；機能性ペプチド研究所社製）の入ったリプロプレート1穴に25-30個ずつ体外受精処理卵子を入れ、5％ CO２ /5％O2/90％Ｎ2、38.5℃、飽和湿度条件下で5-6日間培養して、材料胚（後期桑実胚又は胚盤胞期胚）を作製した。以後の実験には、胚の形態評価でA〜Bランクのものを用いた。
【００１７】
(3)生体胚の作製方法
供胚牛には県内農家で飼養されている黒毛和種経産繁殖牛を用いて採胚を実施した。過剰排卵処理は常法により行った。すなわち、供胚牛の自然発情を確認後、7〜10日目よりFSH製剤（アントリンR；デンカ製薬社製）を総量20アーマー単位（AU）の3日間漸減投与（5・5・3・3・2・2AU）を行った。併せて、FSH投与3日目の午前中にPGF2α類縁体（エストラメイト；住友製薬社製）をクロプロステノール量として750μg投与して発情誘起を行った。その後、発情が確認されたものに人工授精を行った。
胚の回収は、発情日を0日として6日目に、エンブリオテック（日本全薬工業社製）を灌流液としてバルーンカテーテルを用いて非外科的に実施した。
試験には、回収した胚のうち発育ステージが後期桑実胚から胚盤胞期胚で胚の形態評価でA〜Bランクのものを用いた。
【００１８】
(4)胚のバイオプシー方法とヘルニア化した栄養膜細胞の切除方法
体外受精胚及び生体胚のバイオプシー方法は、Saitoら(前掲非特許文献９)の方法に従った。透明帯に切込みを入れて培養を行い、ヘルニアを形成させた後にヘルニア部分の増殖した栄養膜細胞を切断する方法（以下、ヘルニア法）で胚の栄養膜細胞塊を切除した。具体的には、倒立顕微鏡下で発生培養6-7日目の胚をホールディングピペットで固定し、微小ガラス管（Drummond社製）を加工したガラスナイフで胚透明帯に切込みを入れた。その後IVMD101培地にバイオプシー胚を移し、1-3日間培養し、胚の外部に形成したヘルニア部分（栄養膜細胞塊）を倒立顕微鏡下で金属刃を用いて切断した。
【００１９】
(5)バイオプシー胚より回収した栄養膜細胞の体外培養法
バイオプシー胚のヘルニア部分を切除して採取した栄養膜細胞塊は、10％胎仔牛血清（Gibco；FBS）を添加したHPM199培地又は種々の濃度のFBS(0, 2.5, 5, 10%)を添加したESM-2培地を200μl入れたリプロプレートの各穴で浮遊培養し、5％CO2/95％空気、38.5℃飽和湿度条件下で最長14日間まで培養した。培地交換は、それぞれの培地で培養7日目に1回行った。同時に倒立顕微鏡下で細胞の形態観察を行い、培養中の栄養膜細胞の生死判別を行った。生存胚の定義として、培養により胞胚腔の形成や培養プレートに接着して増殖した細胞数の増加をもって判断した。
HPM199（機能性ペプチド研究所社製）培地は市販のTCM199培地からTween-80とp-アミノ安息香酸を除いた処方となっている。
ESM-2培地は、本来ウシ胚由来未分化細胞の培養に適した無血清培地（ESM-1；αMEM培地に100μM MEM非必須アミノ酸、100μM 2-メルカプトエタノール、50IU/mlアプロチニン、5μg/mlインスリン、10ng/ml TGFα、10ng/ml FGF-1、10μg/mlヘパリン、3mg/ml BSAを添加した培地；特開２００３−２１０１６２公報参照）を改良し、胚由来細胞である栄養膜細胞の増殖に適した無血清培地として改良した培地である。ESM-2培地は、前述のように、αMEM培地に100μM MEM非必須アミノ酸、100μM 2-メルカプトエタノール、5μg/ml インスリン、10ng/ml EGF、10ng/ml FGF-1、10μg/ml ヘパリン、5mg/mlBSAを添加した培地である。
【００２０】
(6)栄養膜細胞数の計測方法
栄養膜細胞は、体細胞と異なりトリプシン等で処理しても単一細胞になりにくいことから、細胞数の計測は、以下の方法で行った。栄養膜細胞は10μg/mlヘキスト33342（Wako）を含むESM-2培地で20-30分侵漬した後、スライド標本を作成し、蛍光顕微鏡下で染色した細胞核を数えて行った。栄養膜細胞シートの表面積の単位面積あたりの細胞核数を計測し、推定細胞数を算出した。
【００２１】
実施例１
ヘルニア化した体外受精胚の栄養膜細胞の切除と培養後の細胞形態
バイオプシーした体外受精胚（胚盤胞）をIVMD101培地で1〜3日間培養し、栄養膜細胞をヘルニア形成させた（図1、a）。ヘルニア部分を切除してESM-2+10％FBS培地で1日培養すると胞胚腔（生存胚）が観察された（図1、b）。7日間培養すると、生存栄養膜細胞は培養器に接着してシート状に増殖が観察され（図1、C）、死滅、退行した栄養膜細胞は増殖が起こらず半浮遊状の細胞がわずかに観察された（図1、d）。
【００２２】
実施例２
異なる培地で培養したバイオプシー体外受精胚由来栄養膜細胞の生存率
ヘルニア法によりバイオプシーした体外受精胚から採取した栄養膜細胞塊を10％胎仔牛血清（FBS）を含むHPM199培地又は新規に改良したESM-2培地で1、7、14日間培養し、栄養膜細胞の生存率を調べた。その結果を図2に示す。
図２に示されるように、従来のHPM199培地では、培養1、7、14日目の生存率は、55.6％、16.7％、5.6％と培養日数の経過に従い著しい生存率の低下が観察された。一方、ESM-2培地で培養したところ、培養1、7、14日目の生存率は100％、91.2％、85.3％とほとんど死滅細胞は認められず、高い値となった。ESM-2培地は栄養膜細胞の長期保存に効果を示すことが判明した。
【００２３】
実施例３
異なる培地で培養したバイオプシー体外受精胚由来栄養膜細胞の細胞増殖
異なる培地で培養したバイオプシー体外受精胚由来栄養膜細胞の増殖を調べた。その結果を表１に示す。
表１に示されるように、ヘルニア化したバイオプシー体外受精胚から切除した栄養膜細胞塊の平均細胞数（培養日数0）は、HPM199+10％FBS培地で54.9、ESM-2+10％FBS培地では47.7とほぼ同じであった。培養1日目の生死細胞塊の平均細胞数もHPM199+10％FBS、ESM-2+10％FBS培地それぞれ69.4、63.8とほぼ同じ数であった。一方7日間培養後の細胞数は、HPM199+10％FBS培地が629に対してESM-2+10％FBS培地は1682と多く、ESM-2培地の方が細胞分裂が活発に起こることがわかった。
【００２４】
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【００２５】
実施例４
バイオプシー体外受精胚由来栄養膜細胞の生存率に及ぼす血清の効果
ヘルニア化したバイオプシー体外受精胚から栄養膜細胞塊を切除し、ESM-2培地に血清（FBS）を0、2.5、5、10％となるよう添加した培地で最長14日間まで培養した時の栄養膜細胞塊の生存率を調べた。その結果を図３に示す。
図３に示されるように、培養1日目の生存率は血清濃度に関係なく80％以上の高い値を示した。しかし、培養7日目では無血清培地区（0％FBS）で26.5％と著しい低下を示し、培養14日目にはすべて死滅した。培養14日目を見ると、10％血清添加培地では85.3％と高い値を維持する一方で、5％血清（65.8％）、2.5％血清（51.3％）であった。この結果より、栄養膜細胞塊の生存は、血清濃度に依存することが明らかである。
【００２６】
実施例５
バイオプシー体外受精胚由来栄養膜細胞の細胞増殖に対する血清の効果
ヘルニア化したバイオプシー体外受精胚から栄養膜細胞を切除し、ESM-2培地に血清（FBS）を0、2.5、5、10％となるよう添加した培地で培養した時の栄養膜細胞の平均細胞数を調べた。その結果を表２に示す。
表２に示されるように、血清の濃度に関わらず、培養0日目と1日目ではそれぞれの間に大きな細胞数の違いは認められなかった。しかし、培養7日目では、無血清培地の平均細胞数172個であったのに対し、2.5％、5％、10％血清添加培地の細胞数はそれぞれ1,409、2,012、1,682個であり、無血清培地に比べて著しく高い値となった。栄養膜細胞の増殖にとって血清は必須の因子と考えられる。
【００２７】
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【００２８】
実施例６
バイオプシー生体胚由来栄養膜細胞の生存率及び細胞増殖
バイオプシーした体外受精胚由来栄養膜細胞の生存維持及び細胞増殖には、EMS-2+10％FBS培地が適していることがわかっている（図2、表1）。この培地が生体胚由来栄養膜細胞の生存維持及び細胞増殖促進活性を示すかどうか検討した。その結果を表３に示す。
表３に示されるように、培養7日目でも90.9％の高い生存率を示し、ヘルニア部分から切除した平均栄養膜細胞数43.6が培養7日目には1572となり、体外受精胚由来栄養膜細胞と同様の細胞増殖活性を示した。
【００２９】
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【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヘルニア化した体外受精胚の栄養膜細胞の切除と培養後の細胞形態を示す図である。
【図２】異なる培地で培養したバイオプシー体外受精胚由来栄養膜細胞の生存率を示す図である。
【図３】バイオプシー体外受精胚由来栄養膜細胞の生存率に及ぼす血清の効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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