(57)【要約】【課題】ナノフロー流量(ｎｌ／min）でのグラジエント溶出による分離分析を、安定で、効率よく連続して行えるようにする。【解決手段】複数の溶液を混合比を変更しながら送液する分離分析装置において、第１のポンプからの流路、第２のポンプからの流路、試料導入部への流路が接続され、且つ溶液を一時的に保留する第１及び第２のサンプリングループを備えた流路切り替え手段を有し、前記流路切り替え手段は、前記第１のポンプからの溶液を前記第１のサンプリングループに送液しながら、前記第２のポンプによって前記第２のサンプリングループ内の溶液を前記試料導入部側へ押出す第１の状態と、前記第１のポンプからの溶液を前記第２のサンプリングループに送液しながら、前記第２のポンプによって前記第１のサンプリングループ内の溶液を前記試料導入部側へ押出す第２の状態とを交互に繰り返すことを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の溶液を混合比を変更しながら送液する第１のポンプと、送液用の溶液を送液する第２のポンプと、試料を導入する試料導入部と、試料を分離する分離カラムと、分離カラムから溶出される溶液を検出する検出器を備えた分離分析装置において、
前記第１のポンプからの流路、前記第２のポンプからの流路、及び前記試料導入部への流路が接続され、且つ溶液を一時的に保留する第１及び第２のサンプリングループを備えた流路切り替え手段を有し、
前記流路切り替え手段は、前記第１のポンプからの溶液を前記第１のサンプリングループに送液しながら、前記第２のポンプによって前記第２のサンプリングループ内の溶液を前記試料導入部側へ押出す第１の状態と、前記第１のポンプからの溶液を前記第２のサンプリングループに送液しながら、前記第２のポンプによって前記第１のサンプリングループ内の溶液を前記試料導入部側へ押出す第２の状態とを交互に繰り返すことを特徴とする分離分析装置。
【請求項２】
請求項１において、
前記流路切り替え手段は、溶液を機外へ排出し、且つ前記分離カラムと同等の流路抵抗を有する排出流路を備え、
前記第１の状態では、前記第１のサンプリングループが当該排出流路へ接続され、前記第２の状態では、前記第２のサンプリングループが当該排出流路へ接続されることを特徴とする分離分析装置。
【請求項３】
請求項１において、
前記第１のポンプは、マイクロリットル／分(μｌ／min）の流量で送液を行い、前記第２のポンプは、ナノリットル／分(ｎｌ／min）の流量で送液を行うことを特徴とする分離分析装置。
【請求項４】
請求項１において、
前記第１及び第２のサンプリングループの容積は、略１マイクロリットル（μｌ）であることを特徴とする分離分析装置。
【請求項５】
請求項２において、
前記流路切り替え手段は、前記第１のポンプからの流路が接続される接続口（１）、前記第２のポンプからの流路が接続される接続口（２）、前記試料導入部への流路が接続される接続口（３）、前記排出流路が接続される接続口（４）を備えた第１の部材と、前記第１の状態と第２の状態を切り替える切り替え流路が形成された第２の部材を有し、
前記第１の部材内に、前記第１及び第２のサンプリングループが形成されることを特徴とする分離分析装置。
【請求項６】
請求項１において、
マイクロリットル／分(μｌ／min）の流量を送液する第３のポンプと、前記分離カラムからの溶出液と前記第３のポンプから送液される溶液を混合するミキサーと、当該ミキサーによって混合された後の溶液の分取を行う分取部とを備えたことを特徴とする分離分析装置。
【請求項７】
請求項１において、装置全体を一定温度に保つ恒温器を備えたことを特徴とする分離分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離分析技術に係り、特に、ナノフロー流量(ｎｌ／min）レベルでの分離分析の実現をするためのグラジエントを行う分離分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフ等の分離分析装置において、ナノフロー流量(ｎｌ／min) でグラジエント溶出を行いながら分析を行うには、マイクロフロー(μｌ／min) の低圧（または高圧）グラジエント機能付きポンプで送られてくる溶液をスプリッターで分割（例えば、１：
１００のスプリット比）し、ナノフロー流量(ｎｌ／min) を得る方式や、１分析に要するグラジエント溶液を、あらかじめ１個または多数のチューブやホールに充満させてから、送液ポンプ（またはガスボンベ）とバルブを利用して、これらの溶液を順次分離カラムに導入する方式（例えば、下記特許文献１，２及び非特許文献１に記載されている）がある。
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−３６５２７２号公報
【特許文献２】特開２００２−７１６５７号公報
【非特許文献１】BUNSEKI KAGAKU, 51, 825(2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記に示すスプリッターで分割を行う場合では、流路の詰まりが流量変動につながり、安定した流量を得ることが困難であり、また、１分析に要するグラジエント溶液を、あらかじめ１個または多数のチューブやホールに充満する場合では、１分析ごとに１個または多数のチューブやホールに溶液の充填が必要であり、連続分析を効率良く行うことができない。
【０００５】
本発明の目的は、上記問題を解決し、ナノフロー流量(ｎｌ／min）でのグラジエント溶出による分離分析を、安定で、効率よく連続して行えるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するための本発明の特徴は、複数の溶液を混合比を変更しながら送液する第１のポンプと、送液用の溶液を送液する第２のポンプと、試料を導入する試料導入部と、試料を分離する分離カラムと、分離カラムから溶出される溶液を検出する検出器を備えた分離分析装置において、前記第１のポンプからの流路、前記第２のポンプからの流路、及び前記試料導入部への流路が接続され、且つ溶液を一時的に保留する第１及び第２のサンプリングループを備えた流路切り替え手段を有し、前記流路切り替え手段は、前記第１のポンプからの溶液を前記第１のサンプリングループに送液しながら、前記第２のポンプによって前記第２のサンプリングループ内の溶液を前記試料導入部側へ押出す第１の状態と、前記第１のポンプからの溶液を前記第２のサンプリングループに送液しながら、前記第２のポンプによって前記第１のサンプリングループ内の溶液を前記試料導入部側へ押出す第２の状態とを交互に繰り返すことである。
【０００７】
これにより、第１のポンプからマイクロフローレベル(μｌ／min）の流量でグラジエント溶液を送液しても、流路切り替え手段により第２のポンプからの送液量に容易に変更することが出来、且つグラジエントカーブも第１のポンプから送液されたグラジエントカーブに再現性良く追従することが出来る。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、１分析に要するグラジエント溶液を予め作製しておく必要は無く、ナノフロー(ｎｌ／min) 流量においても再現性の良いグラジエント溶出による分離分析を行うことが出来る。したがって、本発明を用いたナノフロー(ｎｌ／min) 流量レベルのグラジエントを行う分析を効率よく連続して行うことが出来る液体クロマトグラフを実現することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００１０】
図１に、本発明の概略構成図を示す。ポンプ１は、マイクロフローレベル(μｌ／min）の流量で二つの溶液６，７を低圧グラジエント方式、即ち、電磁弁（ソレノイドバルブ）９，１０のオン／オフで溶液６，７の組成比を決めて混合し送液を行う（高圧グラジエント方式の場合は、それぞれの溶液に送液ポンプが備えられる）。ポンプ１から送られる溶液は、ミキサー１１で混合した後、１０方バルブ３へ送液される。
【００１１】
１０方バルブ３は、サンプリングループ１００，１０１を備え、ポンプ１から送液された溶液は、バルブ内の流路を切り替えることで、サンプリングループ１００，１０１の何れか一つに連通する。サンプリングループ１００，１０１の容積は、それぞれ１マイクロリットル（μｌ）位である。また、切り替えられる流路は、各穴を結ぶ流路である（流路２１を除く）。図１の状態では、ポンプ１からの溶液は、サンプリングループ１００を経由した後、流路２１を介して、抵抗コイル（または、抵抗カラムや圧量調整バルブ）５を経てドレインに流れる流路を形成している。バルブが切り替えられると、ポンプ１からの溶液は、流路２１を介して、サンプリングループ１０１を経由した後、抵抗コイル５を経てドレインに流れる流路を形成する。
【００１２】
また、１０方バルブ３へは、溶液８をナノフローレベル(ｎｌ／min) の流量で送液するポンプ２（例えば、シリンジ型やレシプロ型のポンプ）がダンパー１２を介して接続されている。図１の状態では、ポンプ２からサンプリングループ１０１を介して溶液に試料を導入するサンプルインジェクタ１３に通じる流路が形成されている。バルブが切り替えられると、ポンプ２からサンプリングループ１００を介してサンプルインジェクタ１３に通じる流路が形成される。
【００１３】
サンプルインジェクタ１３で試料が注入された後は、分離カラム１４で試料が分離され、検出器１５によって検出が行われる。検出器１５には、例えば、ＵＶ−ＶＩＳ吸光度検出器，蛍光検出器，電気化学検出器、及び質量分析装置等を使用することが出来る。
【００１４】
コントローラ４は、ポンプ１，２の流量，グラジエントプログラム及び１０方バルブ３の定期的な切り替えを制御する。もし、ポンプ１自身が定期的にイベント信号を出す機能を持っている場合は、１０方バルブ３はポンプ１から制御可能なので、コントローラ４は必ずしも必要ではない。
【００１５】
抵抗コイル５は、分離カラム１４が連通している時にかかる圧力と同等レベルの圧力がかかるような流路抵抗を有するものである。これにより、１０方バルブ３の切り替えに伴う圧力変動を最小限にする効果がある。さらに、ポンプ２のあとのダンパー１２も同様の効果を果たす。また、ダンパー１２はレシプロ型やシリンジ型のポンプ２が発生するパルスモータ由来の脈流を軽減する効果もある。
【００１６】
上記ポンプ２が送り出す溶液８は、ポンプ１からの流量に比べて桁違いに小さいために、実際に分離カラム１４に到達するわけではない。したがって、ポンプ２には、電気浸透流を起こすのに最適な溶液を用いた電気浸透流ポンプを用いても良い。また同様の理由により、一定圧で送液する場合はガスボンベを用いても良い。
【００１７】
図２は、図１の構成で得られるグラジエントカーブを説明するための図である。実線のグラジエントカーブ（実線）はポンプ１から送液される溶液を示し、点線のグラジエントカーブは１０方バルブ３を経た後の溶液を示す。
【００１８】
１０方バルブ３からの送液は、ポンプ２側に連通しているサンプリングループに充填されている溶液が、ポンプ２がナノフローレベル(ｎｌ／min）の流量で送液する溶液８によって押出されることで行われる。サンプリングループの容積は前述のように１μｌ程度であるのに対して、ポンプ２側からの送液はナノフローレベル(ｎｌ／min）の流量であるため、数分間送液しても溶液８がサンプリングループを超えてサンプルインジェクタ１３側へ送液されることは無い。サンプルループ内に進入した溶液８は、１０方バルブ３が切り替えられた際に、ポンプ１からの新たな組成の溶液によってドレインへ押出され、機外へ排出される。
【００１９】
図１の構成において、１０方バルブ３が２分ごとに切り替え制御された場合には、１０方バルブ３を経た後の溶液のナノフローグラジエントカーブ（点線）は、図２に示すように、２分間隔で階段状に、ポンプ１のグラジエントカーブ（実線）を追随する。１０方バルブ３の切り替えを１分毎に早めれば、ナノフローグラジエントカーブ（点線）は１分間隔で階段状となり、元のグラジエントカーブ（実線）との追随性は更に改善される。最小のバルブ切り替え時間間隔は、ポンプ１の流量とサンプリングループの容積で決まる。即ち、次式で計算される：
最小のバルブ切り替え時間間隔＝サンプリングループの容積／ポンプ１の流量
【００２０】
図３は、ポンプ２の流量５００ｎｌ／min，ポンプ１の流量５０μｌ／min，サンプリングループの容積１μｌ，１０方バルブ３は１分毎に流路が切り替えられるという条件の基に得られたナノフローグラジエントカーブを示している。溶液６，７，８はそれぞれ、水，０.１％ アセトンを含んだアセトニトリル８０％液水を使用した。
【００２１】
（Ａ）は、ＵＶ吸光度検出器をポンプ１と１０方バルブ３の間に接続して、ポンプ１が作製して１０方バルブ３に送液する溶液の吸光度（２５０ｎｍ）変化を測定したグラジエントカーブであり、（Ｂ）は、ＵＶ吸光度検出器を１０方バルブ３の後に接続して、実際に分離カラム１４に送液される溶液の吸光度（２５０ｎｍ）変化を測定したグラジエントカーブである。（Ａ）と（Ｂ）の比較から、この条件下でも追随性の良いグラジエントカーブが得られることが分かる。（Ｂ）のカーブの立ち上がりの遅れは、５００ｎｌといった低流量であるために、１０方バルブ３の下流に接続したＵＶ吸光度検出器に到達する時間が遅れたことによる。
【００２２】
本発明においては、サンプルインジェクタ１３におけるサンプル導入と同期して、上記ポンプ１のグラジエントカーブ作製のタイムプログラムをスタートさせることにより、サンプルの連続分離分析が可能になる。ポンプ２のシリンジ容積と１分析に必要な溶液量があらかじめ計算されるので、分析中にポンプ２が吸引過程に入る場合は、コントローラ４が、サンプルインジェクタ１３にスタート信号を出さないように制御することも可能である。また、１分析終了後のカラム洗浄および平衡化の時間中に、消費した液量を吸引補充できる機能を持つポンプを使用し、吸引過程による流量変動を、分析中に起らないようにすることも可能である。
【００２３】
一般に、有機溶媒の組成を時間と共に変えるグラジエント溶出においては、溶液の粘性の変化により、１分析中にカラム圧力が変化する。この時、抵抗コイル５にかかる圧力を分離カラムにかかる圧力と同等レベルにしておくことにより、１０方バルブ３の切り替えに伴う圧力変動を最小限にすることが出来る。その結果、１分析中に起る分離カラムの圧力の変動による流量変動を最小限にする効果がある。
【００２４】
また、装置全体を恒温器等の内部に配置するようにし、装置全体を一定温度に保温するようにすると、ナノフロー流量のより安定した送液を図ることができる。
【００２５】
図４は、本発明の他の実施例を示す概略構成図である。図１の実施例との違いは、分取を行う手段を追加した点にある。分離カラム１４から溶出する流量は、ナノフロー流量
(ｎｌ／min) であり、このレベルの流量になると排出後は液滴とならず、分取は非常に困難になる。そこで本実施例では、分離カラム１４からの溶液に対して、メイクアップ溶媒１６をメイクアップポンプ１７によりミキサー１８で合流させるようにする。メイクアップポンプ１７の流量は、マイクロフロー流量(μｌ／min) である。合流後の溶液は、分取プレート１９上に分取（分画）される。この時、分取プレート１９は、各分画毎に、前後左右に移動可能に構成される。本実施例では、排出後の溶液をマイクロフロー流量 (μｌ／min) とするため、排出後も液滴とすることができ、分取が可能となる。
【００２６】
尚、メイクアップ溶媒１６として、マトリックスレーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析計に適した一種または複数の化合物（マトリクス）を溶解した溶液を用いることも可能である。
【００２７】
図５，図６は、本発明で用いる改良された１０方バルブ３の構成図である。１０方バルブ３は、図６に示されるように、ローターシール２２，ステーターリング２５，ステーターシール２４，ステーター２３から構成される。
【００２８】
図５の円内の細い実線は、ステーターシール２４上に刻まれた溝であり、バルブ内の流路の切り替えはこの部分が回転することで行われる。一方、太い実線は、本実施例特有のものであり、ステーター２３上に刻まれた溝である。通常の１０方バルブでは、サンプリングループ１００，１０１および流路２１には、ＰＥＥＫやＳＵＳチューブが使用されている。しかし、ナノフロー流量を扱う装置に必要なサンプリングループ容積は、前述のように１マイクロリットル位なので、バルブ内のステーター２３上の溝（１００，１０１）でこれらの構成を代用することができる。また、流路２１も同様である。この結果、６個のチューブ接続用の押しネジ穴が節約でき、チューブ接続が簡単になる。また、目詰まりの原因となるゴミがチューブ接続時に混入する可能性を軽減するといった効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の実施例の概略構成図である。
【図２】ポンプ１で送液されるグラジエントカーブ（実線）と１０方バルブ３から送液されるグラジエントカーブ（点線）を示す図である。
【図３】ポンプ１で送液されるグラジエントカーブ（実線）と１０方バルブ３から送液されるグラジエントカーブ（点線）を実際に測定して得られた結果を示す図である。
【図４】本発明の他の実施例の概略構成図である。
【図５】本発明で用いる改良された１０方バルブの流路図である。
【図６】本発明で用いる改良された１０方バルブの構成図である。
【符号の説明】
【００３０】
１，２…ポンプ、３…１０方バルブ、４…コントローラ、５…抵抗コイル、６，７，８…溶液、９，１０…電磁弁（ソレノイドバルブ）、１１，１８…ミキサー、１２…ダンパー、１３…サンプルインジェクタ、１４…分離カラム、１５…検出器、１６…メイクアップ溶媒、１７…メイクアップポンプ、１９…分取プレート、２１…流路、２２…ローターシール、２３…ステーター、２４…ステーターシール、２５…ステーターリング、１００，１０１…サンプリングループ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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