(57)【要約】 【課題】培地液量を少なく抑えたうえで、擬似生体環境下で培養した生体細胞の遺伝子の発現状態を解析し得る生体細胞の遺伝子発現状態解析方法及び解析システムを提供する。【解決手段】静置培養させたＨＵＶＥＣを配した隔膜３１の第１室４１側に溶存酸素濃度の高い培養液４７を流すと共に隔膜３１の第２室４３側に溶存酸素濃度の低い培養液４７ａを流して、培養液の流れ，酸素勾配を加えた培養液の流れ，低比重リポタンパクを加えた培養液の流れ及び酸素勾配と低比重リポタンパクを加えた培養液の流れのうちのいずれかの刺激にＨＵＶＥＣを曝露可能なフロー培養機１と、フロー培養後のＨＵＶＥＣから培地を除去すると共にｉｓｏ−ｇｅｎｅを添加して細胞を溶解して成る溶出液を回収するＲＮＡ回収手段１１０と、回収した溶出液内のＲＮＡの発現状態をＤＮＡマイクロアレイ又はリアルタイムＰＣＲ法を用いて解析する解析手段１２０を備えている。【選択図】  図１
2006014710.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
擬似生体環境下でフロー培養した生体細胞の遺伝子の発現状態を解析する方法であって、透過膜の一方側に生体細胞を配して静置培養した後、この生体細胞を配した透過膜の一方側に溶存酸素濃度の高い培養液を流すと共に透過膜の他方側に溶存酸素濃度の低い培養液を流して、この培養液の流れ，酸素勾配を加えた培養液の流れ，低比重リポタンパクを加えた培養液の流れ及び酸素勾配と低比重リポタンパクを加えた培養液の流れのうちのいずれかの刺激に上記生体細胞を曝してフロー培養を行い、次いで、培養後の生体細胞から培地を除去するのに続いて、ｉｓｏ−ｇｅｎｅを添加して細胞を溶解して成る溶出液を回収し、この回収した溶出液内のＲＮＡの発現状態をＤＮＡマイクロアレイ又はリアルタイムＰＣＲ法を用いて解析することを特徴とする生体細胞の遺伝子発現状態解析方法。
【請求項２】
擬似生体環境下でフロー培養した生体細胞の遺伝子の発現状態を解析するシステムであって、静置培養させた生体細胞を配した透過膜の一方側に溶存酸素濃度の高い培養液を流すと共に透過膜の他方側に溶存酸素濃度の低い培養液を流して、この培養液の流れ，酸素勾配を加えた培養液の流れ，低比重リポタンパクを加えた培養液の流れ及び酸素勾配と低比重リポタンパクを加えた培養液の流れのうちのいずれかの刺激に上記生体細胞を曝露可能なフロー培養機と、このフロー培養機によるフロー培養後の生体細胞から培地を除去すると共にｉｓｏ−ｇｅｎｅを添加して細胞を溶解して成る溶出液を回収するＲＮＡ回収手段と、このＲＮＡ回収手段で回収した溶出液内のＲＮＡの発現状態をＤＮＡマイクロアレイ又はリアルタイムＰＣＲ法を用いて解析する解析手段を備えていることを特徴とする生体細胞の遺伝子発現状態解析システム。
【請求項３】
フロー培養機は、透過膜によって仕切った第１室及び第２室を有し且つ透過膜の第１室側に生体細胞をセット可能とした生体細胞セット部と、所定の溶存酸素濃度に維持した培養液を貯留する第１の培養液貯留部と、この第１の培養液貯留部に貯留した培養液よりも溶存酸素濃度を低く維持した培養液を貯留する第２の培養液貯留部と、第１の培養液貯留部に貯留した培養液を生体細胞セット部の第１室を通して循環させる第１循環ポンプと、第２の培養液貯留部に貯留した培養液を生体細胞セット部の第２室を通して循環させる第２循環ポンプを具備している請求項２記載の生体細胞の遺伝子発現状態解析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、疾病に関連する遺伝子群から発現因子を探るのに用いられる生体細胞の遺伝子発現状態解析方法及び解析システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えば、疾病に関連する遺伝子群から発現因子を探る場合、静置培養では生体環境に近い刺激を負荷することができないので、生体細胞に対して生体環境に近い刺激を負荷可能なフロー培養装置が広く用いられている。
【０００３】
このフロー培養装置を用いて疾病に関連する遺伝子群から発現因子を探る場合、生体細胞を添加した培養カップを装置にセットしてフロー培養を行い、培養後において、生体細胞から培地を除去するのに続いて、ｉｓｏ−ｇｅｎｅを添加して細胞を溶解して成る溶出液を回収し、この回収した溶出液内のＲＮＡの発現状態を解析するようにしていた。
【非特許文献１】アルバート  ジェイ  バーンズ（Ａｌｂｅｒｔ  Ｊ．Ｂａｎｅｓ）、外２名、「ストリーマー（Ｓｔｒｅａｍｅｒ）」、テクニカル  レポート（Ｔｅｃｈ  Ｒｅｐｏｒｔ）、フレクセル  インターナショナル  コーポレーション（ＦＬＥＸＣＥＬＬ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）、２００３年１０月９日、第１０１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところが、従来において、生体細胞に対して生体環境に近い刺激を負荷可能なフロー培養装置を用いて疾病に関連する遺伝子群から発現因子を探る場合には、、多量（２００〜５００ｍｌ）の培地液を必要とするといった問題があり、この問題を解決することが従来の課題となっていた。
【０００５】
本発明は、上記した従来の課題に着目してなされたものであり、例えば、疾病に関連する遺伝子群から発現因子を探る場合、培地液量を少なく抑えたうえで、擬似生体環境下で培養した生体細胞の遺伝子の発現状態を解析することが可能である生体細胞の遺伝子発現状態解析方法及び解析システムを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、擬似生体環境下でフロー培養した生体細胞の遺伝子の発現状態を解析する方法であって、透過膜の一方側に生体細胞を配して静置培養した後、この生体細胞を配した透過膜の一方側に溶存酸素濃度の高い培養液を流すと共に透過膜の他方側に溶存酸素濃度の低い培養液を流して、この培養液の流れ，酸素勾配を加えた培養液の流れ，低比重リポタンパクを加えた培養液の流れ及び酸素勾配と低比重リポタンパクを加えた培養液の流れのうちのいずれかの刺激に上記生体細胞を曝してフロー培養を行い、次いで、培養後の生体細胞から培地を除去するのに続いて、ｉｓｏ−ｇｅｎｅを添加して細胞を溶解して成る溶出液を回収し、この回収した溶出液内のＲＮＡの発現状態をＤＮＡマイクロアレイ又はリアルタイムＰＣＲ法を用いて解析する構成としたことを特徴としており、この生体細胞の遺伝子発現状態解析方法の構成を前述した従来の課題を解決するための手段としている。
【０００７】
一方、本発明の遺伝子発現状態解析システムは、静置培養させた生体細胞を配した透過膜の一方側に溶存酸素濃度の高い培養液を流すと共に透過膜の他方側に溶存酸素濃度の低い培養液を流して、この培養液の流れ，酸素勾配を加えた培養液の流れ，低比重リポタンパクを加えた培養液の流れ及び酸素勾配と低比重リポタンパクを加えた培養液の流れのうちのいずれかの刺激に上記生体細胞を曝露可能なフロー培養機と、このフロー培養機によるフロー培養後の生体細胞から培地を除去すると共にｉｓｏ−ｇｅｎｅを添加して細胞を溶解して成る溶出液を回収するＲＮＡ回収手段と、このＲＮＡ回収手段で回収した溶出液内のＲＮＡの発現状態をＤＮＡマイクロアレイ又はリアルタイムＰＣＲ法を用いて解析する解析手段を備えている構成としたことを特徴としており、この生体細胞の遺伝子発現状態解析システムの構成を前述した従来の課題を解決するための手段としている。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、上記した構成としているので、例えば、疾病に関連する遺伝子群から発現因子を探る場合、短時間で且つ多くの培地液を必要とすることなく、擬似生体環境下で培養した生体細胞の遺伝子の発現状態を解析することが可能であるという非常に優れた効果がもたらされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の遺伝子発現状態解析システムにおいて、透過膜によって仕切った第１室及び第２室を有し且つ透過膜の第１室側に生体細胞をセット可能とした生体細胞セット部と、所定の溶存酸素濃度に維持した培養液を貯留する第１の培養液貯留部と、この第１の培養液貯留部に貯留した培養液よりも溶存酸素濃度を低く維持した培養液を貯留する第２の培養液貯留部と、第１の培養液貯留部に貯留した培養液を生体細胞セット部の第１室を通して循環させる第１循環ポンプと、第２の培養液貯留部に貯留した培養液を生体細胞セット部の第２室を通して循環させる第２循環ポンプを具備している構成のフロー培養機を採用することが望ましい。
【実施例】
【００１０】
以下、図面に基づいて本発明の遺伝子発現状態解析システムの実施例を説明する。
【００１１】
図１〜図４は、本発明の遺伝子発現状態解析システムの一実施例を示しており、図１及び図３に示すように、この遺伝子発現状態解析システムは、フロー培養機１と、ＲＮＡ回収手段１１０と、解析手段１２０を備えている。
【００１２】
フロー培養機１は、ベース３上に載置された生体細胞セット部５と、第１の培養液貯留部７と、第２の培養液貯留部９と、第１循環ポンプ１１と、第２循環ポンプ１３とから主として構成されており、ベース３はステンレスの材質で帯板状に作られていて、ベース３を持ち上げることで培養機全体の持ち運びが可能となっている。
【００１３】
生体細胞セット部５は、上部ケース１５と下部ケース１７と観察室を兼ねるチャンバケース１９とを有している。下部ケース１７は、底部が透明版によって閉塞された開口窓２１と成っていて、ベース３に設けられた生体細胞観察窓２３の窓枠２５に固定支持され、第２取入口２７と第２取出口２９とを有している。
【００１４】
チャンバケース１９は、フランジ部１９ａを有する上方が開放された円筒状に作られていて、底面は薄いフィルム状の透過膜で作られた隔膜３１となっている。
【００１５】
上部ケース１５は、下部ケース１７とともにチャンバケース１９を固定支持する支持部材として機能し、第１取入口３３と第１取出口３５を有している。上部ケース１５には下部ケース１７の上端縁に支持されたチャンバケース１９のフランジ部１９ａを上から押えつける押えフランジ３７を有している。押えフランジ３７は、下部ケース１７のケース周面に設けられたねじ部１７ａと螺合し合う締結キャップ３９によって上部ケース１５，下部ケース１７及びチャンバケース１９の三者が一体に固定支持されることで、隔膜３１を介して第１室４１及び第２室４３が作られるようになっている。
【００１６】
第１、第２室４１、４３は、Ｏリング等のシール部材４５によって水密状態に仕切られており、隔膜３１で仕切られた上位側となるチャンバケース１９の内側が第１室４１となり、隔膜３１で仕切られた下位側となるチャンバケース１９の外側が第２室４３となっている。
【００１７】
第１室４１は、第１取入口３３及び第１取出口３５と接続連通していると共に、第２室４３は、第２取入口２７及び第２取出口２９と接続連通しており、第１室４１には、第１取入口３３からの培養液４７を隔膜３１へ向けて送り出して隔膜３１へ当てることで乱流を作り出す供給間４９と、隔膜３１に当たった培養液４７を隔膜３１に沿って外周へ向け誘導案内する誘導案内板５１とが設けてあって、この場合、隔膜３１と対向し合う誘導案内板５１の案内面５１ａを中心から外周へ向かって上昇するテーパ面とすることが可能である。
【００１８】
第１培養液貯留部７及び第２培養液貯留部９は、図３に示すように、ベース３の上面に並列に配置されていて、第１培養液貯留部７は生体細胞セット部５の第１室４１用としてあると共に、第２培養液貯留部９は生体細胞セット部５の第２室４３用としてある。
【００１９】
第１培養液貯留部７は、図１に示すように、循環用入口５３及び循環用出口５５を有する貯留タンク５７内に培養液４７を充填していると共に溶存酸素検出センサ５９及び撹拌子６１を具備して成り、その外には、フィルタ６３を介して大気中から酸素を取入れる大気取入れ口６５を有している。培養液４７は、溶存酸素濃度が約２０％で、主成分はおもに低比重リポタンパク（ＬＤＬ）と白血球とでできている。
【００２０】
溶存酸素検出センサ５９は、培養液４７の酸素濃度が約２０％となるよう監視するものである。具体的には、溶存酸素検出センサ５９の検出値に基づき図外の吸引装置を作動して吸引口６７から吸引を行ない、大気取り入れ口６５から空気を取り入れることで、培養液４７内の溶存酸素濃度が約２０％となるよう制御管理すようになっている。一方、撹拌子６１は、駆動モータ６９によって回転する磁石７１の磁力により回転が与えられて、貯留タンク５７内の培養液４７を撹拌するよう機能する。
【００２１】
第１循環ポンプ１１は、培養液４７を吐出する吐出ポンプ部７３と、この吐出ポンプ部７３で吐出された同一吐出量の培養液４７を吸込む吸込ポンプ部７９とで構成され、この実施例では、吐出ポンプ部７３及び吸込ポンプ部７９が交互に切換わるダイヤフラムポンプとなっている。
【００２２】
即ち、左右一対のダイヤフラム８１，８１によって独立した第１ポンプ室８３と第２ポンプ室８４とが形成され、第１ポンプ室８３及び第２ポンプ室８４の各ポンプ取入口８５，８５と各ポンプ取出口８７，８７には、ポンプ取入口８５からポンプ取出口８７へのみ流れを許す一方向弁８９，８９がそれぞれ設けられている。
【００２３】
つまり、ダイヤフラム８１に対して駆動モータ９１からの回転動力を偏心カム軸９３及び駆動リンク９５を介して図１矢印方向の往復運動として付与することで、第１ポンプ室８３を吐出ポンプ部７３として機能させ、これと同時に、第２ポンプ室８４内を拡大させることで、第２ポンプ室８４を吸込ポンプ部７９として機能させる。
【００２４】
一方、第２培養液貯留部９は、図２に示すように、循環用入口５３ａ及び循環用出口５５ａを有する貯留タンク５７ａ内に培養液４７ａを充填していると共に溶存酸素検出センサ５９ａ及び撹拌子６１ａを具備して成り、その外には、フィルタ６３ａを介して大気中から酸素を取入れる大気取入れ口６５ａを有している。培養液４７ａは、溶存酸素濃度が約５％で、主成分はおもに低比重リポタンパク（ＬＤＬ）でできている。
【００２５】
溶存酸素検出センサ５９ａは、培養液４７ａの酸素濃度が約５％となるよう監視するものである。具体的には、溶存酸素検出センサ５９ａの検出値に基づき図外の吸引装置を作動して吸引口６７ａから吸引を行ない、大気取入れ口６５ａから空気を取入れることで、培養液４７ａ内の溶存酸素濃度が約５％となるよう制御管理すようになっている。一方、
撹拌子６１ａは、駆動モータ６９ａによって回転する磁石７１ａの磁力により回転が与えられて、貯留タンク５７内の培養液４７ａを撹拌するよう機能する。
【００２６】
第２循環ポンプ１３も、培養液４７ａを吐出する吐出ポンプ部７３ａと、吐出ポンプ部７３ａで吐出された同一吐出量の培養液４７ａを吸込む吸込ポンプ部７９ａとで構成され、この実施例では、吐出ポンプ部７３ａ及び吸込ポンプ部７９ａが交互に切換わるダイヤフラムポンプとなっている。
【００２７】
即ち、左右一対のダイヤフラム８１ａ，８１ａによって独立した第１ポンプ室８３ａと第２ポンプ室８４ａとが形成され、第１ポンプ室８３ａ及び第２ポンプ室８４ａの各ポンプ取入口８５ａ，８５ａと各ポンプ取出口８７ａ，８７ａには、ポンプ取入口８５ａからポンプ取出口８７ａへのみ流れを許す一方向弁８９ａ，８９ａがそれぞれ設けられている。
【００２８】
つまり、ダイヤフラム８１ａに対して駆動モータ９１ａからの回転動力を偏心カム軸９３ａ及び駆動リンク９５ａを介して図２矢印方向の往復運動として付与することで、例えば、第１ポンプ室８３ａ内を圧縮することで、第１ポンプ室８３を吐出ポンプ部７３として機能させ、これと同時に、第２ポンプ室８４ａ内を拡大させることで、第２ポンプ室８４ａを吸込ポンプ部７９ａとして機能させる。
【００２９】
第１ポンプ室８３ａ及び第２ポンプ室８４ａの各ポンプ取入口８５ａ，８５ａは、第２培養液貯留部９の循環用出口５５ａ及び第２室４３の第２取出口２９とシリコン製のゴムチューブ９９を介してそれぞれ接続連通しており、第１ポンプ室８３ａ及び第２ポンプ室８４ａの各ポンプ取出口８７ａ，８７ａは、第２室４３の第２取入口２７及び第２培養貯留部９の循環用入口５３ａとシリコン製のゴムチューブ１０１を介してそれぞれ接続連通している。
【００３０】
シリコン製のゴムチューブ９９，１０１は、チャンバケース１９を交換する際に上部ケース１５を下部ケース１７から取外す際に、自由に屈曲することで、上部ケース１５の取外しに何等支障が起きないようになっている。なお、シリコン製のゴムチューブ９９，１０１には三方弁１０３が設けられており、この三方弁は、初期作動時に第１，第２循環ポンプ１１，１３を作動させながら弁体１０３ａを開とすることで、チューブ９９，１０１内及び第１，第２室４１，４３内の空気を外へ排出するように機能する。
【００３１】
上記したフロー培養機１では、予め静置培養させた生体細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ；人臍帯静脈上皮細胞）を配したチャンバケース１９の底面に位置する隔膜３１の第１室４１側に溶存酸素濃度の高い培養液４７を流すと共に隔膜３１の第２室４３側に溶存酸素濃度の低い培養液４７ａを流して、この培養液４７，４７ａの流れ，酸素勾配を加えた培養液４７，４７ａの流れ，低比重リポタンパクを加えた培養液４７，４７ａの流れ及び酸素勾配と低比重リポタンパクを加えた培養液４７，４７ａの流れのうちのいずれかの刺激に生体細胞を曝露させるようにしている。
【００３２】
ＲＮＡ回収手段１１０では、上記フロー培養機１によるフロー培養後の生体細胞から培地を除去すると共にｉｓｏ−ｇｅｎｅを添加して細胞を溶解して成る溶出液を回収するようになっている。また、解析手段１２０では、ＲＮＡ回収手段１１０で回収した溶出液内のＲＮＡの発現状態をＤＮＡマイクロアレイ又はリアルタイムＰＣＲ法を用いて解析するようになっている。
【００３３】
そこで、上記した遺伝子発現状態解析システムを使って、生体細胞の遺伝子の発現状態を解析する手順を説明する。
【００３４】
１）細胞の調整
まず、フロー培養機１のチャンバケース１９の隔膜３１の第１室４１側に生体細胞としてのＨＵＶＥＣを２×１０５  ｃｅｌｌ添加し、３７℃ＣＯ２  インキュベータ内において一晩培養する。
【００３５】
２）セット及び培養開始
次いで、図４に示すように、フロー培養機１の生体細胞セット部５にチャンバケース１９をセットするのに続いて、フロー培養機１の第１循環ポンプ１１及び第２循環ポンプ１３を作動させて第１培養液貯留部７及び第２培養液貯留部９をそれぞれ駆動し、生体細胞セット部５のＨＵＶＥＣを配した第１室４１側に溶存酸素濃度の高い培養液４７を流すと共に第２室４３側に溶存酸素濃度の低い培養液４７ａを流す。
【００３６】
この際、以下の４通りの刺激パターンａ〜ｄのうちのいずれかの刺激パターンに上記ＨＵＶＥＣを任意の時間曝してフロー培養を行う。
ａ．培養液４７，４７ａの流れ
ｂ．酸素勾配を加えた培養液４７，４７ａの流れ
ｃ．低比重リポタンパクを加えた培養液４７，４７ａの流れ
ｄ．酸素勾配と低比重リポタンパクを加えた培養液４７，４７ａの流れ
但し、流れの強さ及び曝露時間は、目的によって異なる。
３）ＲＮＡの回収
次に、ＲＮＡ回収手段１１０において、フロー培養機１の生体細胞セット部５のチャンバケース１９から培地が除去されるのに続いて、以下のア〜クの処理がなされる。
ア．ｉｓｏ−ｇｅｎｅを１ｍｌ添加
イ．クロロホルムを０．２ｍｌ添加
ウ．遠心分離器（１２０００Ｇ，１５分，４℃）による水相部回収
エ．イソプロパノールを０．５ｍｌ添加
オ．遠心分離器（１２０００Ｇ，１０分，４℃）による上澄除去及び沈殿物回収
カ．エタノール（７０％）を１ｍｌ添加
キ．遠心分離器（７５００Ｇ，５分，４℃）による上澄除去及び沈殿物回収
ク．乾燥（風乾又は５〜１０分間真空乾燥）
上記処理の後、ＲＮＡ回収手段１１０において、細胞を用途に応じた溶媒に溶解して成るＲＮＡ溶出液を回収する。
４）解析
そして、解析手段１２０において、回収した溶出液内におけるＲＮＡの発現状態のＤＮＡマイクロアレイ解析又は定量的リアルタイムＰＣＲ解析を行う。
【００３７】
そこで、上記ＨＵＶＥＣを上記した４通りの刺激パターンａ〜ｄのそれぞれに任意の時間曝してフロー培養を行い、その際の遺伝子発現状態をＤＮＡマイクロアレイにより解析した。この解析結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
2006014710.tif 000003
【００３９】
表１のＤＮＡマイクロアレイ解析結果で得た各刺激パターンａ〜ｄにおける変動遺伝子数を図５のグラフにまとめて示し、刺激パターンａにおいてｍＲＮＡ数が特に増加した遺伝子１９種類のリストを表２Ａに示す。また、刺激パターンｂにおいて流れの影響を差し引いた刺激条件（すなわち、酸素勾配のみ）でｍＲＮＡ数が特に増加した遺伝子１２種類のリストを表３Ａに示す。さらに、刺激パターンｃにおいて流れの影響を差し引いた刺激条件（すなわち、低比重リポタンパク添加のみ）でｍＲＮＡ数が特に増加した遺伝子２２種類（コレステロール低比重リポタンパク受容体などの代謝調整に働く遺伝子）のリストを表４Ａに示す。さらにまた、刺激パターンｄにおいて流れの影響を差し引いた刺激条件（すなわち、酸素勾配＋低比重リポタンパク添加）でｍＲＮＡ数が特に増加した遺伝子９種類のリストを表５Ａに示す。
【００４０】
この際、表２Ｂ〜５Ｂとして、ｍＲＮＡ数が減少した遺伝子のリストを併せて記載した。また、表２〜５において、比較のために静置におけるｍＲＮＡ数をそれぞれ記載した。
【００４１】
【表２】
2006014710.tif 000004
【００４２】
【表３】
2006014710.tif 000005
【００４３】
【表４】
2006014710.tif 000006
【００４４】
【表５】
2006014710.tif 000007
【００４５】
また、表１に示すように、リアルタイムＰＣＲ解析によりＨＯ−１のＲＮＡ発現量を正確に定量化し、流れの強度及び経時的時間に対するＨＯ−１の発現量の関係を図６のグラフに示し、これと同様にして、ＨＯ−１以外のｓｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅ−１，ＳＬＣ７Ａ１１及びＮＱＯ−１の各発現量と流れの経時的時間との関係を図７のグラフに示す。ここで、ＨＯ−１，ｓｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅ−１，ＳＬＣ７Ａ１１及びＮＱＯ−１は、細胞防御的に働く遺伝子である。
【００４６】
さらに、表１に示すように、リアルタイムＰＣＲ解析により各刺激パターンａ〜ｄにおけるＴＸＮＩＰ（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現量を正確に定量化し、各刺激パターンａ〜ｄのＴＸＮＩＰの各発現量及び静置のＴＸＮＩＰの発現量を図８のグラフにまとめて示して比較した。なお、ＴＸＮＩＰは、動脈硬化病変の促進を抑制する方向に働く遺伝子である。
【００４７】
上記した解析結果から判るように、本実施例の遺伝子発現状態解析システムでは、疾病に関連する遺伝子群から発現因子を探る場合、短時間で且つ多くの培地液を必要とすることなく、擬似生体環境下で培養した生体細胞の遺伝子の発現状態を解析することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の生体細胞の遺伝子発現状態解析システムの一実施例を示すフロー培養機の正面説明図である。（実施例１）
【図２】図１におけるフロー培養機の第２培養液貯留部側の正面方向からの説明図。（実施例１）
【図３】図１におけるフロー培養機の平面説明図である。（実施例１）
【図４】図１におけるフロー培養機の生体細胞セット部の拡大断面説明図である。（実施例１）
【図５】ＤＮＡマイクロアレイ解析結果で得た各刺激パターンａ〜ｄにおける変動遺伝子数をまとめて示したグラフである。
【図６】流れの強度及び経時的時間に対するＨＯ−１の発現量の関係を示したグラフである。
【図７】ＨＯ−１以外のｓｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅ−１，ＳＬＣ７Ａ１１及びＮＱＯ−１の各発現量と流れの経時的時間との関係を示したグラフである。
【図８】刺激パターンａ〜ｄのＴＸＮＩＰの各発現量及び静置のＴＸＮＩＰの発現量を示したグラフである。
【符号の説明】
【００４９】
１      フロー培養機
５      生体細胞セット部
７      第１培養液貯留部  
９      第２培養液貯留部
１１    第１循環ポンプ
１３    第２循環ポンプ
３１    隔膜（透過膜）
４１    第１室（透過膜の一方側）
４３    第２室（透過膜の他方側）
４７    溶存酸素濃度の高い培養液
４７ａ  溶存酸素濃度の低い培養液
１１０  ＲＮＡ回収手段
１２０  解析手段
【図１】
2006014710.tif 000008
【図２】
2006014710.tif 000009
【図３】
2006014710.tif 000010
【図４】
2006014710.tif 000011
【図５】
2006014710.tif 000012
【図６】
2006014710.tif 000013
【図７】
2006014710.tif 000014
【図８】
2006014710.tif 000015