(57)【要約】【課題】  核酸混合物から、検体中の核酸を核酸吸着性の多孔性膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させてＲＮＡを選択的に分離精製するより安価な方法を提供する。分離性能に優れ、洗浄効率がよく、簡便で、迅速で、自動化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である多孔性膜を使用して、ＤＮＡとＲＮＡの混合試料から、ＲＮＡを選択的に回収する、より安価で、純度のよい方法を提供する。【解決手段】  核酸混合物溶液を、二個以上の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを用いて、（ａ）核酸を吸着させる工程、（ｂ）洗浄する工程、（ｃ）ＤＮａｓｅを作用させる工程、（ｄ）洗浄する工程、（ｅ）回収液によりＲＮＡを脱着させ、上記カートリッジ外に排出する工程、を含み、ＤＮａｓｅを作用させる工程におけるＤＮａｓｅ溶液の全液量が核酸吸着性多孔性膜１ｃｍ2あたり１３０μｌ以下で行うことを特徴とするＲＮＡの選択的分離精製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液を、
少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを用いて、
(a)核酸吸着性多孔性膜に核酸を吸着させる工程、
(b)洗浄液により核酸が吸着した状態で核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、
(c)核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程、
(d)洗浄液により核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、
(e)回収液により核酸吸着性多孔性膜内からＲＮＡを脱着させ、上記カートリッジ外に排出する工程
を含み、核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程におけるＤＮａｓｅ溶液の全液量が核酸吸着性多孔性膜１ｃｍ2あたり１３０μｌ以下で行うことを特徴とするＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項２】
ＤＮａｓｅ溶液におけるＤＮａｓｅ濃度が１０Ｋｕｎｉｔｚ  Ｕ／ｍＬ以上１００００Ｋｕｎｉｔｚ  Ｕ／ｍＬ以下である請求項１に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項３】
核酸吸着性多孔性膜が、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する有機高分子からなる請求項１又は２に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項４】
核酸吸着性多孔性膜が、水酸基を有する請求項３に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項５】
核酸吸着性多孔性膜が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる請求項１〜４の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項６】
核酸吸着性多孔性膜が、表裏非対称性の膜である請求項１〜５の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項７】
核酸混合物溶液が、検体に核酸可溶化試薬を添加し混合して得られた混合液に、さらに水溶性有機溶媒を添加して得られた液である請求項１〜６の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項８】
検体が、培養細胞である請求項７に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項９】
培養細胞が、浮遊系細胞である請求項８に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項１０】
培養細胞が、接着系細胞である請求項８に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項１１】
検体が、動物組織である請求項７に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項１２】
検体を核酸可溶化試薬添加前または添加後にホモジナイズ処理する請求項７〜１１の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項１３】
核酸可溶化試薬が、カオトロピック塩、核酸安定化剤、界面活性剤、緩衝剤及び消泡剤から選ばれる少なくとも一つを含む請求項７〜１２の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項１４】
カオトロピック塩が、塩酸グアニジンまたはグアニジンチオシアン酸塩から選ばれる少
なくとも一つである請求項１３に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項１５】
水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノールから選ばれる少なくとも一つを含む請求項７〜１４の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項１６】
洗浄液が、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノールから選ばれる少なくとも一つのアルコールを含む溶液であり、該洗浄液が該アルコールを１〜１００質量％含む請求項１〜１５の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項１７】
回収液が、その塩濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以下の溶液である請求項１〜１６の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項１８】
圧力差発生装置が、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されるポンプである請求項１〜１７の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法を行うための、核酸分離精製カートリッジと試薬のキット。
【請求項２０】
請求項１〜１８に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法を、自動で行う装置。
【請求項２１】
請求項１９に記載のキットの使用を、自動で行う装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡを選択的分離精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形態で用いることが要求される。
【０００３】
診断分野においても、核酸は種々の形態で種々の目的に用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現におよぶ種々の目的により、興味ある核酸の位置確認、同定および単離において日常的に用いられている。
【０００４】
多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。
血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料から核酸を精製する場合には、コンタミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険性も加わる。
【０００５】
広く知られた分離精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、これに引き続いて洗浄、脱着等の操作を行い、分離精製する方法がある（例えば、特許文献１）。この方法は、分離性能として優れているが、簡便性、迅速性、自動化適性において充分といえず、またこの方法に用いられる器具および装置は小型化に不向きであり、さらに器具および装置、特に吸着媒体を同一性能で工業的に大量生産することが困難であり、かつ取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。さらに、素材自体が脆いために機械的強度を得るには一定以上の厚みが必要となるため、特にＤＮＡとＲＮＡの混合試料からＲＮＡを選択的に回収するために、ＤＮａｓｅでＤＮＡを分解する際に、ＤＮａｓｅを固相に均一に作用させるには一定量以上の液量が必要となる等の問題がある。ＤＮａｓｅは比較的高価なものであり、今後ますます必要性が増加すると予測されるＲＮＡの選択的回収の際に問題となる。
【０００６】
また、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、固相に核酸を吸着させる溶液及び固相から核酸を脱着させる溶液をそれぞれ用いて、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相に核酸を吸着及び脱着させることによって、核酸を分離精製する方法が提案されている（特許文献２）が、更なる改良が望まれる。
【０００７】
その他に、従来から知られている核酸分離精製法としては、遠心法によるもの、磁気ビーズを用いるもの、フィルターを用いるものなどがある。また、これらを利用した核酸分離精製装置が提案されている。例えば、フィルターを用いた核酸分離精製装置としては、フィルターを収容したフィルターチューブをラックに多数セットし、これに核酸を含む試料溶液を分注し、前記ラックの底部の周囲をシール材を介してエアチャンバーで密閉して内部を減圧し、全フィルターチューブを同時に排出側より吸引し試料液を通過させて核酸をフィルターに吸着し、その後、洗浄液および回収液を分注して、再び減圧吸引して洗浄・脱着するようにした自動装置が提案されている（例えば、特許文献３参照）。
【特許文献１】特公平７−５１０６５号公報
【特許文献２】特開２００３−１２８６９１号公報
【特許文献３】特許第２８３２５８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ＲＮＡとＤＮＡを含む核酸混合物から、検体中の核酸を核酸吸着性の多孔性膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させてＲＮＡを選択的に分離精製する、より安価な方法を提供することである。さらに詳しくは、分離性能に優れ、洗浄効率がよく、簡便で、迅速で、自動化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である多孔性膜を使用して、ＤＮＡとＲＮＡの混合試料から、ＲＮＡを選択的に回収する、より安価で、純度のよい方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、二個の開口を有する容器内に多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを使用し、ＲＮＡとＤＮＡを含む核酸混合物を多孔性膜に吸着及び脱着させる工程を含むＲＮＡの選択的分離精製方法において、該方法が多孔性膜でＤＮＡをＤＮａｓｅで分解する工程を含み、特に該工程におけるＤＮａｓｅの液量を核酸吸着性多孔性膜１ｃｍ2当たり１３０μｌ以下で行うことで、上記課題を達成できることを見出し、本発明を完成したものである。即ち、本発明は、下記の構成よりなるものである。
【００１０】
１．  ＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを用いて、
（ａ）核酸吸着性多孔性膜に核酸を吸着させる工程、
（ｂ）洗浄液により核酸が吸着した状態で核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、
（ｃ）核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程、
（ｄ）洗浄液により核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、
（ｅ）回収液により核酸吸着性多孔性膜内からＲＮＡを脱着させ、上記カートリッジ外に排出する工程、
を含み、核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程におけるＤＮａｓｅ溶液の全液量が核酸吸着性多孔性膜１ｃｍ2あたり１３０μｌ以下で行うことを特徴とするＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００１１】
２．  ＤＮａｓｅ溶液におけるＤＮａｓｅ濃度が１０Ｋｕｎｉｔｚ  Ｕ／ｍＬ以上１００００Ｋｕｎｉｔｚ  Ｕ／ｍＬ以下であることを特徴とする第１項に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００１２】
３．  核酸吸着性多孔性膜が、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する有機高分子からなる第1項又は第２項に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００１３】
４．  核酸吸着性多孔性膜が、水酸基を有する第３項に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００１４】
５．  核酸吸着性多孔性膜が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる第１項〜第４項の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００１５】
６．  核酸吸着性多孔性膜が、表裏非対称性の膜である第１項〜第５項の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００１６】
７．  核酸混合物溶液が、検体に核酸可溶化試薬を添加し混合して得られた混合液に、さらに水溶性有機溶媒を添加して得られた液である第１項〜第６項の何れかに記載のＲＮＡ
の選択的分離精製方法。
【００１７】
８．  検体が、培養細胞である、第７項に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００１８】
９．  培養細胞が、浮遊系細胞である第８項に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００１９】
１０．  培養細胞が、接着系細胞である第８項に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００２０】
１１．  検体が、動物組織である第７項に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００２１】
１２．  検体を核酸可溶化試薬添加前または添加後にホモジナイズ処理する第７項〜第１１項の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００２２】
１３．  核酸可溶化試薬が、カオトロピック塩、核酸安定化剤、界面活性剤、緩衝剤及び消泡剤から選ばれる少なくとも一つを含む第７項〜第１２項の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００２３】
１４．  カオトロピック塩が、塩酸グアニジンまたはグアニジンチオシアン酸塩から選ばれる少なくとも一つである第１３項に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００２４】
１５．  水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノールから選ばれる少なくとも一つを含む第７項〜第１４項の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００２５】
１６．  洗浄液が、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノールから選ばれる少なくとも一つのアルコールを含む溶液であり、該洗浄液が該アルコールを１〜１００質量％含む第１項〜第１５項の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００２６】
１７．  回収液が、その塩濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以下の溶液である第１項〜第１６項の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００２７】
１８．  圧力差発生装置が、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されるポンプである第１項〜第１７項の何れかに記載のＲＮＡの選択的分離精製方法。
【００２８】
１９．  第１項〜第１８項に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法を行うための、核酸分離精製カートリッジと試薬のキット。
【００２９】
２０．  第１項〜第１８項に記載のＲＮＡの選択的分離精製方法を、自動で行う装置。
２１．  第１９項に記載のキットの使用を、自動で行う装置。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、分離性能に優れ、洗浄効率がよく、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である多孔性膜を使用して、ＤＮＡとＲＮＡの混合試料から、より安価に、純度よくＲＮＡを選択的に精製できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の核酸分離精製方法は、ＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを用いて、
（ａ）核酸吸着性多孔性膜に核酸を吸着させる工程（以下、「吸着工程」とも言う。）、（ｂ）洗浄液により核酸が吸着した状態で核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程（以下、「洗浄工程１」とも言う。）、
（ｃ）核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程、
（ｄ）洗浄液により核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程（以下、「洗浄工程２」とも言う。）、
（ｅ）回収液により核酸吸着性多孔性膜内からＲＮＡを脱着させ、上記カートリッジ外に排出する工程（以下、「回収工程」とも言う。）、
を少なくとも含むものである。
【００３２】
好ましくは、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の各工程において、ＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液、洗浄液、ＤＮａｓｅ溶液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させるものであり、より好ましくは、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸混合物溶液、洗浄液、ＤＮａｓｅ溶液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。ＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液、洗浄液、ＤＮａｓｅ溶液又は回収液を加圧状態で上記多孔性膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。ポンプの加圧は、好ましくは１０〜３００ｋＰａ、より好ましくは４０〜２００ｋＰａの程度で行われる。
【００３３】
さらに好ましくは、上記核酸吸着性多孔性膜を収容する核酸分離精製カートリッジを用いて、以下の工程でＲＮＡを分離精製することができる。
すなわち、（１）ＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、（２）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を加圧状態にし、注入したＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（３）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、（４）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、（５）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口にＤＮａｓｅ液を注入し核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程、（６）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入したＤＮａｓｅ液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出する工程、（７）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、（８）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、ＲＮＡが吸着した状態で、洗浄する工程、（９）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、（１０）核酸分離精製カートリッジの一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内からＲＮＡを脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程を、挙げることができる。
【００３４】
上記のＲＮＡ分離精製の工程では、最初の核酸混合物溶液を注入から核酸分離精製カー
トリッジ外にＲＮＡを得るまでの工程を実質２０分以内、好適な状況では２分以内で終了することが可能である。
【００３５】
また、上記のＲＮＡ分離精製の工程では、紫外可視分光光度計での測定値（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）が、１．８〜２．２となる純度を持つＲＮＡを回収することができ、不純物混入量の少ない高純度のＲＮＡを定常的に得ることができる。好適な状況では、紫外可視分光光度計での測定値（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）が２．０付近となる純度を持つＲＮＡを回収することができる。
【００３６】
また、上記工程において、圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような加圧が可能なポンプ等、或いは、エバポレーター等の減圧可能なものが挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。
また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されている。
【００３７】
また、上記工程において、上記核酸分離精製カートリッジの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にしても好適に実施できる。また、核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させることによっても好適に実施することができる。
【００３８】
［検体、およびＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液］
本発明において使用できる検体は、核酸を含むものであれば特に制限はなく、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルス、培養細胞、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料が対象となる。培養細胞としては、浮遊系細胞、接着系細胞等が挙げられる。浮遊系細胞とは培養液中で容器壁に付着することなく漂いながら生育、増殖する細胞を指し、例えばＨＬ６０，Ｕ９３７，ＨｅＬａＳ３等が代表的な細胞株として挙げられる。接着系細胞とは培養液中で容器壁底面に付着し生育、増殖する細胞を指し、例えばＮＩＨ３Ｔ３，ＨＥＫ２９３，ＨｅＬａ，ＣＯＳ，ＣＨＯ細胞等が代表的な細胞株として挙げられる。検体として用いられる動物（またはその一部）としては、動物組織が挙げられる。例えば、動物を解剖したとき或いは生検により採取可能な、肝臓、腎臓、脾臓、脳、心臓、肺や胸腺など個体を構成する組織全てを使用することができる。
【００３９】
これらの検体は、細胞膜・核膜を溶解して核酸を溶出する試薬を含む水溶液、いわゆる核酸可溶化試薬で処理することが好ましい。これにより細胞膜・核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散した核酸混合物溶液を得ることができる。
【００４０】
以下の工程で核酸混合物溶液を得ることが好ましい。
（Ｉ）  検体を容器に注入する工程
（II）  前記容器に、核酸可溶化試薬を添加し、検体と核酸可溶化試薬を混合して混合液を得る工程
（III)  前記で得られた混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程
【００４１】
核酸可溶化試薬としては、カオトロピック塩、核酸安定化剤、界面活性剤、緩衝剤及び消泡剤から選ばれる少なくとも一つを含む溶液が挙げられる。
【００４２】
カオトロピック塩としては、特に限定は無く公知のカオトロピック塩を使用することができる。カオトロピック塩としては、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム等を使用することができる。中でもグアニジン塩が好ましい。
グアニジン塩としては、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩（チオシアン酸グアニジン）が挙げられ、中でも塩酸グアニジンまたはグアニジンチオシアン酸塩が好ましい。これらの塩は単独でも、複数組み合わせて用いてもよい。
核酸可溶化試薬中のカオトロピック塩濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ〜８ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは、１ｍｏｌ／Ｌ〜６ｍｏｌ／Ｌである。
カオトロピック塩の代わりに、カオトロピック物質として尿素を用いることもできる。
【００４３】
核酸可溶化試薬は、核酸安定化剤を含むことが好ましい。核酸安定化剤は、検体中の核酸を安定に存在させることができ、好ましい。より好ましくは、カオトロピック塩、界面活性剤、緩衝剤および消泡剤の中から選ばれるいずれか１つ以上と共存させる。これにより、最終的に得られるＲＮＡの回収量及び回収効率が向上し、検体の微量化及び迅速化が可能となり、好ましい。
核酸安定化剤としては、ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有するものが挙げられる。検体によっては、核酸を分解するヌクレアーゼ等が含まれていることがあり、核酸をホモジナイズすると、このヌクレアーゼが核酸に作用し、収量が激減することがある。
ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤としては、一般的に還元剤として使用される化合物を用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物等が挙げられる。中でもメルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物としては、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が挙げられる。メルカプト化合物は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
核酸安定化剤は、核酸可溶化試薬における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．３〜１５質量％で用いることができる。メルカプト化合物は、核酸可溶化試薬における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．５〜１５質量％で用いることができる。
【００４４】
界面活性剤としては、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。
本発明においてはノニオン界面活性剤およびカチオン界面活性剤を好ましく用いることができる。
ノニオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドが挙げられ、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）アルキルエーテル系界面活性剤の中でも、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールがさらに好ましい。
カチオン界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドが挙げられる。
これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。界面活性剤の核酸可溶化試薬における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。
【００４５】
前記核酸可溶化試薬は、好ましくはｐＨ３〜８、より好ましくはｐＨ４〜７、さらに好
ましくはｐＨ５〜７のものが用いられる。
【００４６】
緩衝剤としては、通常用いられるｐＨ緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒ）を挙げることができる。好ましくは、生化学用のｐＨ緩衝剤が挙げられる。このような緩衝剤としては、クエン酸塩、リン酸塩または酢酸塩を含む緩衝剤、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＥＤＴＡ）、ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ／ＥＤＴＡ）、ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ／ＥＤＴＡ）、グッド緩衝剤が挙げられる。グッド緩衝剤としては、ＭＥＳ(２‐Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ)、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ(Ｂｉｓ（２‐ｈｙｄｏｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ）、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｘｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｎｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＣＡＰＳ（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）が挙げられる。
これらの緩衝剤は、前記核酸可溶化試薬中の濃度は１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
【００４７】
消泡剤としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、リン燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。これらの消泡剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。特に好ましくは、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することである。
消泡剤の核酸可溶化試薬における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましい。
【００４８】
また、前記の核酸可溶化試薬は水溶性有機溶媒を含んでいても良い。水溶性有機溶媒としては、アセトン、アルコール類、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。核酸可溶化試薬に含まれる各種試薬の溶解性を上げることができ、好ましい。中でも、アルコール類が好ましい。アルコール類は、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。とりわけメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体をより好ましく用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独でも複数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸可溶化試薬における濃度は１〜２０質量％であることが好ましい。
【００４９】
検体が培養細胞や酵母などの場合は、１０個〜１×１０8個の細胞数に対して、核酸可溶化試薬５０〜１０００μｌで処理することが望ましい。検体が動物や植物などの組織の場合は、組織量０．１ｍｇ〜２００ｍｇに対して、核酸可溶化試薬５０〜１０００μｌで処理することが望ましい。検体が細菌の場合は、１×１０8個〜１×１０10個の細菌に対して、核酸可溶化試薬５０〜１０００μｌで処理することが望ましい。検体が溶解し、か
つ、カートリッジの容量を超えない範囲で核酸可溶化試薬の液量を変えることができる。
【００５０】
検体は、核酸可溶化試薬を添加する前または添加後にホモジナイズ処理することが好ましい。また、核酸可溶化試薬を添加して得られた溶液をホモジナイズ処理することも好ましい。ホモジナイズ処理することで自動化処理適正が向上し、好ましい。ホモジナイズ処理は、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる処理、高速攪拌処理を用いる処理、微細空隙から押し出す処理、ガラス、ステンレス、ジルコニアなどのビーズを用いる処理等で行うことができる。これらの処理を行なうには、特に限定はなく、例えば、ボルテックスなどのミキサーや、Ｒｏｔｏｒ−Ｓｔａｔｏｒ型、ポッター型、ダウンス型などのホモジナイザーや、ビーズミル、ペッスル、フレンチプレス、グラインダー、ブレードホモジナイザーなどの市販のホモジナイザー等、いずれも使用することができる。核酸可溶化試薬を添加する前にホモジナイズ処理する場合は、検体を液体窒素で凍らせた後、ビーズミルやクラッシャーミル、すり鉢、粉砕機などを使用して処理することもできる。
【００５１】
ホモジナイズした検体と核酸可溶化試薬とを混合する方法は、特に限定されない。例えば、混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、最終的に分離精製されるＲＮＡ収量を好適に増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができ、この場合、簡便な操作で最終的に分離精製されるＲＮＡ収量を増加させることができ、好ましい。
【００５２】
核酸可溶化試薬を添加し、混合して得られた混合液に、さらに水溶性有機溶媒を添加することが好ましい。水溶性有機溶媒としては、特に限定は無いが、アルコール類を好ましく用いることができる。アルコール類としては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでもよく、メタノール、エタノール、プロパノール又はその異性体、ブタノール又はその異性体を好ましく用いることができる。これら水溶性有機溶媒は、単独でも複数組み合わせて用いてもよい。水溶性有機溶媒の核酸混合物溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。水溶性有機溶媒を添加後に混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製されるＲＮＡ収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる。
【００５３】
また、得られた核酸混合物溶液は、表面張力は０．０５Ｊ／ｍ2以下であることが好ましく、また、粘度は、１〜１００００ｍＰａであることが好ましく、比重は、０．８〜１．２の範囲であることが好ましい。この範囲の溶液にすることで、次の工程において、核酸混合物溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸を吸着させた後に、核酸混合物溶液残渣を除去しやすくする。
【００５４】
（ａ）核酸吸着性多孔性膜に核酸を吸着させる工程（吸着工程）
以下に、本発明で用いる核酸吸着性多孔性膜および(a)核酸吸着性多孔性膜に核酸を吸着させる工程について説明する。
本発明の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が内部を通過可能」とは、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。または、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。
【００５５】
また、本発明の核酸吸着性多孔性膜は、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることが好ましい。これは、多孔性膜側の使用条件で「イオン
化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができ、好ましい。さらに好ましくは、核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有する多孔性膜であり、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜の親水基同士が引きあうようになると推定される。
【００５６】
ここで親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。
【００５７】
ここで親水基を有する多孔性膜とは、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する多孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入した多孔性膜を意味する。多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜などを使用することができるが、加工の容易性から、多孔性膜を形成する材料は有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。
【００５８】
親水基を有する材料の多孔性膜としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などで、形成された多孔性膜を挙げることができるが、特に水酸基を有する有機材料の多孔性膜、とりわけ水酸基を有する有機高分子からなる多孔性膜を好ましく使用することができる。
【００５９】
水酸基を有する有機材料の多孔性膜として、多糖構造を有する材料が好ましく、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る有機高分子の多孔性膜をより好ましく使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物を好ましく使用する事ができる。特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましく、９０：１０〜５０：５０である事がより好ましい。
【００６０】
更に好ましい水酸基を有する有機材料としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載のアセチルセルロースの鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースの鹸化物とは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理したものであり、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物も好ましく使用することができる。より好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物を使用することである。トリアセチルセルロー
スとジアセチルセルロース混合物の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましい。更に好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比は、９０：１０〜５０：５０であることである。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で多孔性膜表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。
核酸の分離効率をあげるためには、水酸基の量（密度）が多いことが好ましい。鹸化処理により得られる有機材料の鹸化率（表面鹸化率）が５％以上１００％以下であることが好ましく、１０％以上１００％以下であることが更に好ましい。
また、水酸基を有する有機材料の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理することが好ましい。
多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜であってもよいが、表裏非対称性の多孔性膜を好ましく使用することができる。
【００６１】
ここで、鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したセルロースのエステル誘導体のエステル基が加水分解され、水酸基が導入され再生セルロースとなる。こうして作成された再生セルロースは、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。また、鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度や処理時間を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。
【００６２】
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有するグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することができる。有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。
【００６３】
まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。
【００６４】
多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖とする方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で多孔性膜表面上に活性種を与え、多孔性膜と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合させる方法を指す。多孔性膜に結合するグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物を
も用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。
【００６５】
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。
【００６６】
また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が１０％以上１００％以下であることが好ましい。
【００６７】
親水基を有する無機材料である多孔性膜としては、シリカ化合物を含有する多孔性膜を挙げることができる。シリカ化合物を含有する多孔性膜としては、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。
【００６８】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜と親水基をもつグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
多孔性膜と親水基をもつグラフトポリマー鎖とを化学結合させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
【００６９】
親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、上記親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法において記載した、親水基を有するグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
【００７０】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロ
キシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる。
【００７１】
また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上１００％以下であることが好ましい。
【００７２】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を加工して作製した多孔性膜を挙げることができる。
【００７３】
上記の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能であり、厚さが１０μｍ〜５００μｍであることが好ましい。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである。洗浄がし易い点で、厚さが薄いほど好ましい。
【００７４】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、最小孔径が０．２２μｍ以上であることが好ましい。さらに好ましくは、最小孔径が０．５μｍ以上である。また、最大孔径と最小孔径の比が２以上である多孔性膜を用いる事が好ましい。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が５以上である。
【００７５】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、空隙率が５０〜９５％であることがこのましい。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である。また、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2である事が好ましい。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ2である。
【００７６】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである事が好ましい。これにより、過圧時に均一な圧力が得られる。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。
【００７７】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で１〜５０００ｍＬであることが好ましい。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり1分間で５〜１０００ｍＬである。
【００７８】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、多孔性膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である事が好ましい。さらに好ましくは、多孔性膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である。
【００７９】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、一辺が５ｍｍの正方形の多孔性膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに、１時間以内では溶解しないが４８時間以内に溶解するセルロース誘導体が、好ましい。また、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体も好ましい。中でも、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以
内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体がより好ましい。
【００８０】
核酸吸着性多孔性膜中を、核酸混合物溶液を通過させる場合、核酸混合物溶液を一方の面から他方の面へと通過させることが、液を多孔性膜へ均一に接触させることができる点で、好ましい。核酸吸着性多孔性膜中を、核酸混合物溶液を通過させる場合、核酸混合物溶液を核酸吸着性多孔性膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で好ましい。
【００８１】
核酸混合物溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させる場合の流速は、液の多孔性膜への適切な接触時間を得るために、膜の面積ｃｍ2あたり、２〜１５００μＬ／ｓｅｃである事が好ましい。液の多孔性膜への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、上記流速は、膜の面積ｃｍ2あたり、５〜７００μＬ／ｓｅｃである事が好ましい。
【００８２】
また、使用する溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、１枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。
【００８３】
複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸吸着性多孔性膜との組合せであっても良い。例えば、ガラスフィルターと再生セルロースの多孔性膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚の核酸吸着性多孔性膜、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸非吸着性多孔性膜との組合せであってもよい、例えば、ガラスフィルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔性膜との組合せを挙げることができる。
【００８４】
少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。また、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を複数枚収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。この場合、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容される複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであっても良い。
【００８５】
核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。上記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、上記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。
【００８６】
核酸分離精製カートリッジとして、個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段を備えている核酸分離精製カートリッジを使用する事ができる。個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段としては、バーコード、二次元バーコード、磁気テープ、ＩＣカードなどが挙げられる。
【００８７】
また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔性膜を容易に取り出す事が可能になっている構造を有した核酸分離精製カートリッジを使用することもできる。
【００８８】
（ｂ）洗浄液により核酸が吸着した状態で核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程（洗浄工程１）
以下、（ｂ）洗浄液により核酸が吸着した状態で核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程について説明する。
洗浄工程により、最終的に得られるＲＮＡの回収量及び純度が向上し、必要なＲＮＡを含む検体の量を微量とすることができる。また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作を簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返すことが好ましい。
【００８９】
洗浄工程において、洗浄液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸混合物溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸混合物溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。中でも、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることが、洗浄効率が優れてより好ましい。
洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ／ｍｍ2以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上する。しかし、２００μｌ／ｍｍ2以下とすることで、操作性を保ち、試料の流出を抑止することができ、好ましい。
【００９０】
洗浄工程において、洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させる場合の流速は、膜の単位面積（ｃｍ2）あたり、２〜１５００μＬ／ｓｅｃであることが好ましく、５〜７００μＬ／ｓｅｃであることがより好ましい。通常、通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになる。しかし、本発明では前記の範囲とすることで、洗浄効率を落とすことなく、ＲＮＡの分離精製操作を迅速化でき、好ましい。
【００９１】
洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。また洗浄工程において、洗浄工程と同時に核酸分離精製カートリッジに器械的な振動や超音波による攪拌を与えることもできる。または遠心分離を行うことにより洗浄することもできる。
【００９２】
洗浄工程において、洗浄液は、水溶性有機溶媒及び水溶性塩の少なくともいずれかを含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、核酸吸着性多孔性膜に核酸と共に吸着した核酸混合物溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸着性多孔性膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である。この目的には、核酸はアルコール等の水溶性有機溶媒に対し難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに水溶性有機溶媒が適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不純物および不要成分の選択的除去作用を向上することができる。
【００９３】
洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコールを用いることができる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノールが挙げられる。プロパノールとしては、イソプロパノール、ｎ−プロパノールのいずれでもよく、ブタノールも直鎖状でも分岐状でもいずれでもよい。これらアルコールは、複数種類を使用することもできる。中でもエタノールを用いることが好ましい。
洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、１〜１００質量％であることが好ましく、５〜４０質量％であることがより好ましい。この範囲で、ＤＮＡのコンタミネーションが
増大することなく、目的のＲＮＡが多孔性膜から脱着することがなく、したがって、ＲＮＡを純度よく、回収量を高くすることができ好ましい。
【００９４】
一方、洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩、カリウム塩及びリチウム塩が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。よりさらに好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、とりわけ、塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが好ましい。
【００９５】
洗浄液は、カオトロピック物質を含んでいないことが好ましい。これによって、（ｅ）回収工程においてカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＲＴ−ＰＣＲ反応等を行う場合の酵素反応を阻害するので、後に酵素反応等を行う場合を考慮すると洗浄液にカオトロピック物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性があり有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。
ここで、カオトロピック物質とは、前記した尿素、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。
【００９６】
従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカートリッジなどの容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、回収工程の際に洗浄液が混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カートリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次工程以降に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。
【００９７】
したがって、洗浄工程における洗浄液が回収工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカートリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ2未満にすることが好ましい。表面張力が低いと、洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。
【００９８】
しかし、洗浄効率を上げる為に、水の割合を増やすことができるが、この場合、洗浄液の表面張力は上昇し、残留する液量が増える。洗浄液の表面張力が０．０３５Ｊ／ｍ2以上の場合は、カートリッジの撥水性を高めることで、残留する液量を抑えることができる。カートリッジの撥水性を高めることで、液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量を抑制できる。撥水性を高める方法としては、カートリッジ表面にシリコン等の撥水剤をコートするか、カートリッジ成型時にシリコン等の撥水剤を練り込む等の手段があるが、これに限らない。
【００９９】
本発明に係る核酸吸着性多孔性膜を利用して洗浄工程を簡素化することができる。（１）洗浄液が核酸吸着性多孔性膜を通過する回数を１回としてもよい、（２）洗浄工程を室温でできる。（３）洗浄工程の後、直ちに次工程を行うことができる。（４）前記（１）、（２）、（３）のいずれか１つもしくは２つ以上組み合わせることも可能である。従来法においては、洗浄液中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くためには、しばしば乾燥工程を必要としたが、本発明に用いる核酸吸着性多孔性膜は薄膜であるために乾燥工程を省略できる。
【０１００】
従来、ＲＮＡの分離精製方法において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多性孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫することによって抑止することができる。
【０１０１】
（ｃ）核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程
以下、（ｃ）核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程について説明する。ＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液からＲＮＡのみを選択的に分離精製するには、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジに通過させ、核酸吸着性多孔性膜に核酸を吸着させた（吸着工程）後、洗浄を行い（洗浄工程１）、ＤＮａｓｅを作用させる工程を経ることにより行うことが出来る。
ＤＮａｓｅは特に限定無く、いずれのＤＮａｓｅも用いることが出来る。例えば、ウシなどの動物膵臓由来のＤＮａｓｅＩや、遺伝子組み換え技術により作成したリコンビナントＤＮａｓｅを用いることができる。
ＤＮａｓｅを作用させる際のＤＮａｓｅ溶液（以下、ＤＮａｓｅ反応液とも言う。）には、ＤＮａｓｅ活性の発現に好適なマグネシウム、カルシウム、マンガンなどの２価の金属イオンを添加してもよい。さらに、核酸吸着性多孔性膜に核酸を保持させるため、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩などを共存させることもできる。
ＤＮａｓｅ活性至適ｐＨに合わせるため、ＤＮａｓｅ反応液には緩衝剤も含まれる。緩衝剤としては、一般的に用いられる、ＴｒｉｓＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、リン酸バッファーなどを用いることができる。
本発明の方法は、核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程におけるＤＮａｓｅ溶液の全液量は、核酸吸着性多孔性膜１ｃｍ2当たり１３０μｌ以下で行うものである。現在市販されている、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔでは、ＤＮａｓｅ溶液８０μｌ（核酸吸着性多孔性膜１ｃｍ2当たり２０８μｌ）が必要である。したがって本発明ではより安価に精製することができることになる。また、核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程においてＤＮａｓｅ溶液におけるＤＮａｓｅ濃度（以下、単にＤＮａｓｅ濃度とも言う。）は１０Ｋｕｎｉｔｚ  Ｕ／ｍＬ以上１００００Ｋｕｎｉｔｚ  Ｕ／ｍＬ以下が好ましく、５０Ｋｕｎｉｔｚ  Ｕ／ｍＬ以上５０００Ｋｕｎｉｔｚ  Ｕ／ｍＬ以下がより好ましい。なお、ここで用いた活性Ｋｕｎｉｔｚ Ｕは、「ＤＮＡを基質として、２５℃、ｐＨ５．０において反応液１ｍｌのＡ260の吸光度を1分間に０．００１増加させるＤＮａｓｅ活性を１Ｋｕｎｉｔｚ  Ｕとする」と定義したものである。また、核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程における時間は、ＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液中のＤＮＡ量と作用させるＤＮａｓｅ濃度により異なるが５秒〜３６０分が好ましく、３０秒〜１８０分がより好ましい。また、核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程における温度は４℃以上であればよく、１０〜５０℃が好ましく、反応効率を高めるため高温、例えば５０〜７０℃で行うこともできる。尚、「核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる」とは、核酸吸着性多孔性膜における、核酸が吸着している部位とＤＮａｓｅを作用させることを意味し、「核酸吸着性多孔性膜で」とは、酸吸着性多孔性膜上に限らず、多孔性膜における孔中や、膜の裏側の孔の出口等も含む。
【０１０２】
（ｄ）洗浄液により核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程（洗浄工程２）
（ｄ）洗浄液により核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程は、上記（ｃ）の工程の後に行う。（ｄ）の工程は、前記（ｂ）の工程に準じて行う。（ｄ）の工程を行う回数は１回以上である。
【０１０３】
（ｅ）回収液により核酸吸着性多孔性膜内からＲＮＡを脱着させ、上記カートリッジ容器外に排出する工程（回収工程）
以下に（ｅ）回収液により核酸吸着性多孔性膜内からＲＮＡを脱着させ、上記カートリッジ容器外に排出する工程について説明する。
回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸混合物溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸混合物溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。中でも、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が、回収効率が優れてより好ましい。
【０１０４】
検体から調整した核酸混合物溶液の体積に対して、回収液の体積を調整してＲＮＡの脱着を行うことができる。分離精製されたＲＮＡを含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量のＲＮＡを分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変える事ができる。
【０１０５】
回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファー等が使用できる。また、工程後に回収したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）に供する場合、ＲＴ−ＰＣＲ反応において用いる緩衝溶液（例えば、ＫＣｌ  ７５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ2  ３．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＴＴ  １０ｍｍｏｌ／Ｌを最終濃度とする水溶液）を用いることもできる。
【０１０６】
回収液のｐＨは、ｐＨ１〜１０であることが好ましい。さらには、ｐＨ２〜７であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着ＲＮＡの溶出に効果を及ぼす。回収液は、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましい。塩濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、さらには、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましい。こうすることで、ＲＮＡの回収率が向上し、より多くのＲＮＡを回収できることができる。
【０１０７】
回収液の体積を当初の核酸混合物溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮されたＲＮＡを含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１００〜９９：１００、更に好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１０〜９：１０にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単にＲＮＡを濃縮できる。これらの方法により検体よりもＲＮＡが濃縮されているＲＮＡ溶液を得る方法を提供できる。
【０１０８】
また別の態様としては、回収液の体積を当初の核酸混合物溶液よりも多い条件でＲＮＡの脱着を行うことにより、希望の濃度のＲＮＡを含む回収液を得ることができ、次工程、例えばＲＴ−ＰＣＲなどを行う場合に適した濃度のＲＮＡを含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、多孔性膜からのＲＮＡ回収率の増加を図るこ
とができる。
【０１０９】
また、目的に応じて回収液の温度を変化させることで簡便にＲＮＡを回収することができる。例えば、回収液の温度を０〜１０℃にして多孔性膜からのＲＮＡの脱着を行うことで、酵素による分解を防止する何らかの試薬や特別な操作を加えることなくＲＮＡ分解酵素の働きを抑制して、ＲＮＡの分解を防ぎ、簡便に、効率よくＲＮＡ溶液を得ることができる。
【０１１０】
また、回収液の温度を１０〜３５℃とした場合、一般的な室温でＲＮＡの回収を実施することが出来、複雑な工程を必要とせずにＲＮＡを脱着させて分離精製することができる。
【０１１１】
また別の態様としては、回収液の温度を高温、例えば３５〜７０℃することで、多孔性膜からのＲＮＡの脱着を煩雑な操作を経ず簡便に高い回収率で実施することができる。
【０１１２】
回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便にＲＮＡを分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量のＲＮＡを回収する場合等複数回にわたり回収液を注入してもよい。
【０１１３】
回収工程においては、ＲＮＡの回収液をその後の工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製されたＲＮＡは、しばしばＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼチェインリアクション）法が適用される。この場合、分離精製されたＲＮＡ溶液はＲＴ−ＰＣＲ法に適したバッファー液で希釈する必要がある。本方法による回収工程において、回収液にＲＴ−ＰＣＲ法に適したバッファー液を用いることで、その後のＲＴ−ＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができる。
【０１１４】
また、回収工程において、ＲＮＡの回収液に回収したＲＮＡの分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解抑制剤としては、核酸分解酵素の阻害剤が挙げられ、具体的にはＥＤＴＡなどが挙げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。
【０１１５】
回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収したＲＮＡ溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。２６０ｎｍに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が挙げられるがこれに限定されるものではない。
【０１１６】
前記のＲＮＡの選択的分離精製方法に用いる、核酸分離精製カートリッジと、（ａ）〜（ｅ）の各工程に用いる試薬をキットとすることができる。
【０１１７】
上記の、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、核酸を含む検体からＲＮＡを分離精製する方法はその含まれる工程を自動で行う自動装置を用いて行うことができる。また、前記のキットの使用を自動で行う自動装置を用いて行うことができる。自動装置により、操作が簡便化および迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、ＲＮＡを得ることが可能になる。
【０１１８】
以下に、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、核酸を含む検体からＲＮＡを分離精製する工程を自動で行う自動装置の例を示すが、本発明の自動装置はこれに限定されるもので
はない。
【０１１９】
自動装置は、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを用い、該核酸分離精製カートリッジにＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液を注入し加圧して該核酸混合物溶液中の核酸を前記核酸吸着性多孔性膜に吸着させた後、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去し、前記核酸分離精製カートリッジにＤＮａｓｅを分注して核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させ、加圧してＤＮａｓｅが核酸吸着性多孔性膜内部を通過した後、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液を分注し、加圧して分解されたＤＮＡを除去した後、前記核酸分離精製カートリッジに、回収液を分注し核酸吸着性多孔性膜に吸着したＲＮＡを脱着して回収液とともに回収する、分離精製動作を自動的に行うＲＮＡの選択的分離精製装置であって、前記核酸分離精製カートリッジ、前記核酸混合物溶液残渣、ＤＮａｓｅおよび洗浄液の排出液を収容する廃液容器および前記ＲＮＡを含む回収液を収容する回収容器を保持する搭載機構と、前記核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液、ＤＮａｓｅおよび回収液を分注する分注機構とを備えてなることが好適である。
【０１２０】
前記搭載機構は、装置本体に搭載されるスタンドと、該スタンドに上下移動可能に支持され前記核酸分離精製カートリッジを保持するカートリッジホルダーと、該カートリッジホルダーの下方で前記核酸分離精製カートリッジに対する位置を交換可能に前記廃液容器および前記回収容器を保持する容器ホルダーとを備えてなるものが好適である。
【０１２１】
また、前記加圧エア供給機構は、下端部より加圧エアを噴出するエアノズルと、該エアノズルを支持して前記カートリッジホルダーに保持された前記核酸分離精製カートリッジに対し前記エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、該加圧ヘッドに設置され前記搭載機構のラックにおける核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えてなるものが好適である。
【０１２２】
また、前記分注機構は、前記洗浄液を分注する洗浄液分注ノズルと、前記ＤＮａｓｅを分注するＤＮａｓｅ分注ノズルと、前記回収液を分注する回収液分注ノズルと、前記洗浄液分注ノズル、前記ＤＮａｓｅ分注ノズルおよび前記回収液分注ノズルを保持し前記搭載機構に保持された核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液を収容した洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し前記洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、ＤＮａｓｅを収容したＤＮａｓｅボトルよりＤＮａｓｅを吸引し前記ＤＮａｓｅ分注ノズルに供給するＤＮａｓｅ供給ポンプと、回収液を収容した回収液ボトルより回収液を吸引し前記回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えてなるものが好適である。
【０１２３】
核酸分離精製カートリッジ、廃液容器および回収容器を保持する搭載機構と、核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、核酸分離精製カートリッジに洗浄液、ＤＮａｓｅおよび回収液を分注する分注機構とを備えた、例えば前記のような自動装置によれば、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジに核酸を含む試料液を注入加圧し核酸を核酸吸着性多孔性膜に吸着させ、洗浄液を分注して不純物を洗浄排出し、前記核酸分離精製カートリッジにＤＮａｓｅを分注し核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させ加圧してＤＮａｓｅが核酸吸着性多孔性膜内部を通過し、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液を分注し加圧して分解されたＤＮＡを除去し、回収液を分注して核酸吸着性多孔性膜に吸着したＲＮＡを脱着して回収するＲＮＡ分離精製工程を自動的に行って、短時間で効率よく核酸混合物溶液中のＲＮＡを自動的に分離精製できる機構をコンパクトに構成することができる。
【０１２４】
また、前記搭載機構を、スタンドと、核酸分離精製カートリッジを保持する上下移動可能なカートリッジホルダーと、廃液容器および回収容器を交換可能に保持する容器ホルダーとを備えて構成すると、核酸分離精製カートリッジおよび両容器のセット並びに廃液容器と回収容器の交換が簡易に行える。
【０１２５】
また、前記加圧エア供給機構を、エアノズルと、該エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えて構成すると、簡易な機構で確実な加圧エアの供給が行える。
【０１２６】
また、前記分注機構を、洗浄液分注ノズルと、ＤＮａｓｅ分注ノズルと、回収液分注ノズルと、核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液ボトルより回収液を吸引し回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えて構成すると、簡易な機構で順次洗浄液および回収液の分注が行える。
【実施例】
【０１２７】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１２８】
（１）核酸精製カートリッジの作製
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔性膜を収容する部分を持つ核酸精製カートリッジを作製した。
【０１２９】
（２）核酸吸着性多孔性膜として、トリアセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理した多孔性膜を使用し、上記（１）で作成した核酸精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜収納部に収容した。
【０１３０】
［実施例１］
（３）核酸可溶化試薬、洗浄液および回収液の調製
下記に示す処方の核酸可溶化試薬溶液Ａ、洗浄液Ａおよび回収液Ａを調製した。
【０１３１】
（核酸可溶化試薬Ａ）
塩酸グアニジン（ライフテクノロジー社製）                      ３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー社製）                          １２．１ｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＩＣＮ製）                              １０g
蒸留水                                          １０００ｍｌになるよう添加
１．０容量％の２−メルカプトエタノールを核酸可溶化試薬Ａ使用直前に添加。
【０１３２】
（洗浄液Ａ）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ    Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ                  ３０容量％エタノール
【０１３３】
（回収液Ａ）
１ｍｍｏｌ／Ｌ    Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ６．５）
【０１３４】
（４）核酸混合物溶液調製
ヒト前骨髄性白血病細胞(ＨＬ６０)を培養液（ＲＰＭＩ１６４０−１０％胎児子牛血清）中５％ＣＯ2存在下３７℃で培養し調製した。細胞数が１×１０6個になるように調製し、Ｃａ2+、Ｍｇ2+フリーＰＢＳで細胞を洗浄した。４℃、３００ｇ、５分、スイングローターで遠心し、浮遊細胞をペレット状にした後、上清を除去し、タッピングによって細胞を再懸濁した。ここへ核酸可溶化試薬Ａ  ３５０μｌを加え、ボルテックスミキサーで１分間攪拌した。その後７０容量％エタノール３５０μｌを加え、ボルテックスミキサーで５秒間撹拌し、実施例１の核酸混合物溶液を得た。
【０１３５】
（５）ＲＮＡ分離精製操作
上記（４）で調製した核酸混合物溶液を、上記（１）及び（２）で作製した核酸吸着性多孔性膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置（シリンジポンプ）を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（２６０ｋＰａ）にし、注入した核酸混合物溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力差発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液Ａ５００μｌを注入し、上記一の開口に圧力差発生装置（シリンジポンプ）を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（２６０ｋＰａ）にし、注入した洗浄液Ａを核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した（洗浄工程１）。圧力差発生装置を外し、ＤＮａｓｅ溶液（ＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ  ３４１  Ｋｕｎｉｔｚ  Ｕ／ｍＬを使用。添付プロトコール通りにＤＮａｓｅ溶液を調製した）を膜上に１０μｌ（２６μｌ／ｃｍ2）アプライし、室温で１５分放置した。続いて、先と同様の洗浄を２回行った（洗浄工程２）。その後、圧力差発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液Ａ  １００μｌを注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置（シリンジポンプ）を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（２６０ｋＰａ）にし、注入した回収液Ａを核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
また、ＤＮａｓｅ溶液の量１０μｌを、２０μｌ、４０μｌに変えた以外は同様にしてＲＮＡ分離精製操作を行った。さらに、参考例として、ＤＮａｓｅ溶液の量１０μｌを、８０μｌに変えた以外は同様にしてＲＮＡ分離精製操作を行った。
【０１３６】
［比較例１］
ＤＮａｓｅ溶液をアプライしなかったこと以外は実施例１と同様にしてＲＮＡを抽出した。この際、洗浄工程については実施例１とは異なり、実施例１において洗浄工程１と洗浄工程２における合計洗浄回数３回を、連続で３回洗浄工程１のみで行った。
【０１３７】
［比較例２］
実施例１と同様に調製した培養細胞（１×１０6個）を用い、ＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて同キットのプロトコルに従い、ＲＮＡ抽出を行った。ＤＮａｓｅ溶液はプロトコル通りの８０μｌ（２０８μｌ／ｃｍ2）と、減量した２０μｌ（５２μｌ／ｃｍ2）、１０μｌ（２６μｌ／ｃｍ2）の３通りで実施した。
【０１３８】
［比較例３］
ＤＮａｓｅ溶液をアプライしなかったこと以外は比較例２と同様に、ＲＮＡを抽出した。このときＤＮａｓｅ処理を行わないＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔプロトコルに従った。
【０１３９】
（６）回収された核酸のアガロースゲル電気泳動
実施例１及び比較例１、２、３において回収された核酸を含む回収液を、１％アガロースゲルを用いて電気泳動した結果を図１〜図３に示す。
【０１４０】
比較例２ではＤＮａｓｅ溶液を８０μｌ（２０８μｌ／ｃｍ2）必要とするが、実施例１では、比較例２で用いたＤＮａｓｅ溶液量より少ない量でもＤＮＡが分解され、比較例１で検出されたＤＮＡ由来のバンドが実施例１では検出されなかった。本発明では驚くべきことにＤＮａｓｅ溶液が１０μｌ（２６μｌ／ｃｍ2）であってもＤＮＡを分解できた。
上記結果から、本発明では、少量のＤＮａｓｅ溶液でも、ＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液中のＤＮＡを分解し、ＲＮＡを選択的に回収できることが確認できた。
【０１４１】
［実施例２］
接着細胞としてＨｅＬａ細胞を用いて以下のとおりＯｎ−ｄｉｓｈ法によって、核酸混合物溶液を得た。
培養細胞用プレートにてＨｅＬａ細胞を培養液（ＭＥＭ−１０％胎児子牛血清）中５％ＣＯ2存在下３７℃で培養し調製した。この培養細胞用プレートから培養液を除いた後、核酸可溶化試薬ＡをＨｅＬａ細胞１.５×１０6個あたり３５０μl添加し、細胞溶解液を得た。この細胞溶解液をピペッテイングを行うことにより攪拌し別の容器に回収した。
この回収した液に７０容量％エタノールを３５０μl添加した後、約５秒間ボルテックスミキサーにより攪拌し、核酸混合物溶液を得た。得られた核酸混合物溶液を実施例１の（５）と同様にして、ＲＮＡ分離精製操作を行った。尚、ＤＮａｓｅ溶液の量は１０μｌでＲＮＡ分離精製操作を行った。
【０１４２】
［実施例３］
接着細胞としてＨｅＬａ細胞を用いて以下のとおり剥離法によって、核酸混合物溶液を得た。
接着細胞培養用容器にてＨｅＬａ細胞を培養液（ＭＥＭ−１０％胎児子牛血清）中５％ＣＯ2存在下３７℃で培養し調製した。この接着細胞培養用容器から培養液を除いた後、０.２５％のトリプシンを添加して処理することにより接着細胞を接着細胞培養用容器から剥離し、細胞数を測定した。細胞用遠心機で１０００回転３分間、遠心することにより上清を除去し、ＨｅＬａ細胞を回収した。遠心後の細胞の沈殿物に核酸可溶化試薬Ａを５×１０5個あたり３５０μｌ添加した。１分間激しくボルテックスミキサーにより攪拌して細胞を溶解した。７０容量％エタノールを３５０μｌ添加後約５秒間ボルテックスミキサーにより攪拌し、核酸混合物溶液を得た。得られた核酸混合物溶液を実施例１の（５）と同様にして、ＲＮＡ分離精製操作を行った。尚、ＤＮａｓｅ溶液の量は１０μｌでＲＮＡ分離精製操作を行った。
【０１４３】
［比較例４］
実施例２の核酸混合物溶液を市販の精製キットＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して、同キットのプロトコルに従いＲＮＡ分離精製操作を行った。尚、ＤＮａｓｅ溶液の量は８０μｌでＲＮＡ分離精製操作を行った。
［比較例５］
実施例３の核酸混合物溶液を比較例４と同様にしてＲＮＡ分離精製操作を行った。
【０１４４】
実施例２および実施例３並びに実施例４および実施例５で回収された核酸を含む回収液のＲＮＡ回収量を各々測定した。測定法は２６０ｎｍの吸光度を使用する方法を用いた。結果を表１に示す。
【０１４５】
【表１】
2006271201.tif 000002
【０１４６】
次に実施例３および比較例５で回収された核酸を含む回収液をＭＯＰＳ−ｆｏｒｍａｍｉｄｅ電気泳動法により電気泳動した。結果を図４に示す。
【０１４７】
図４において実施例３で回収された核酸を電気泳動して得られたバンド１は、市販の精製キットを使用した比較例５のバンド２に比べて、純度が同等の、分解のない高品質のＲＮＡが得られた。
【０１４８】
さらに表２から、本発明のＲＮＡの選択的分離精製方法を使用した本実施例は、市販の
精製キットを使用した比較例に比べ、得られたＲＮＡは、同等の品質で有りながら、回収量が多いことが分かった。
【０１４９】
［実施例４］
（７）核酸可溶化試薬Ｂ（Ｂ１およびＢ２）、洗浄液Ｂ並びに回収液Ｂの調製
下記に示す処方の核酸可溶化試薬、洗浄液及び回収液を調製した。
【０１５０】
（核酸可溶化試薬Ｂ１）
グアニジンチオシアン酸塩（和光純薬社製）              ３．５ｍｏｌ／Ｌ
ＢｉｓＴｒｉｓ（同仁化学社製）                        ０．２５ｍｏｌ／Ｌ
塩酸を用いて、ｐＨ６．５に調製
１．０容量％の２−メルカプトエタノールを核酸可溶化試薬Ｂ１使用直前に添加。
【０１５１】
（核酸可溶化試薬Ｂ２）
Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製）                        １５質量％
ＢｉｓＴｒｉｓ（同仁化学社製）                        ０．１ｍｏｌ／Ｌ
塩酸を用いて、ｐＨ６．０に調製
【０１５２】
（洗浄液Ｂ）
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）                        １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム                                        ０．５ｍｏｌ／Ｌ
エタノール                                            １０容量％
【０１５３】
（回収液Ｂ）
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ６．５）                        １ｍｍｏｌ／Ｌ
【０１５４】
（８）核酸混合物溶液調製
液体窒素で急速凍結したマウス肝臓をハサミで小破片とし、５ｍｇを１．５ｍｌチューブにはかりとった。核酸可溶化試薬Ｂ１を３５０μｌ加え、Ｒｏｔｏｒ−Ｓｔａｔｏｒホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ、ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）にて均一になるまでホモジナイズした。８０００×ｇにて３分間、室温にて遠心分離し、組織破片を取らないように新しい１．５ｍｌチューブに上清を移した。ここに核酸可溶化試薬Ｂ２を１７５μｌ加え、ボルテックスミキサーで１５秒間攪拌した。さらに、９９．５容量％以上特級エタノールを１７５μｌ加え、ボルテックスミキサーで１分間攪拌した。
【０１５５】
（９）ＲＮＡ分離精製操作
上記（８）の核酸混合物溶液を、上記（１）及び（２）で作成した核酸吸着性多孔性膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置（シリンジポンプ）を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１２０ｋＰａ）にし、注入した核酸混合物溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力差発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液Ｂを７５０μｌ注入し、上記一の開口に圧力差発生装置（シリンジポンプ）を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１２０ｋＰａ）にし、注入した洗浄液Ｂを核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した（洗浄工程１）。圧力差発生装置を外し、ＤＮａｓｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ＲＱ１  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ５００Ｋｕｎｉｔｚ  Ｕ／ｍＬを使用。その際の反応液組成は４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  硫酸マグネシウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム、６ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カルシウム、２５容量％グリセロールである。）を膜上に１０μｌ（２６μｌ／ｃｍ2）アプライし、室温で５分放置した
。続いて、先と同様の洗浄を２回行った（洗浄工程２）。その後、圧力差発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液Ｂを１００μｌ注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置（シリンジポンプ）を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１２０ｋＰａ）にし、注入した回収液Ｂを核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
【０１５６】
［比較例６］
上記（８）と同じマウス由来の肝臓を用いて、ＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて同キットのプロトコルに従い、ＲＮＡ抽出を行った。ＤＮａｓｅ溶液はプロトコル通りの８０μｌ（２０８μｌ／ｃｍ2）で実施した。
【０１５７】
実施例４および比較例６で回収された核酸を含む回収液のＲＮＡ回収量を各々測定した。測定法は２６０ｎｍの吸光度を使用する方法を用いた。結果を表２に示す。
【０１５８】
【表２】
2006271201.tif 000003
【０１５９】
実施例４及び比較例６で回収された核酸を含む回収液を１％アガロース電気泳動法により電気泳動した。結果を図５に示す。
【０１６０】
図５の電気泳動結果より、比較例６バンド４ではＤＮａｓｅ溶液を８０μｌ（２０８μｌ／ｃｍ2）必要とするが、実施例４バンド３では１０μｌ（２６μｌ／ｃｍ2）でもＤＮＡが分解された。実施例４では比較例６と比べて少ないＤＮａｓｅ溶液量で純度が同等の、分解のない高品質のＲＮＡが得られた。
【０１６１】
さらに表２から、本発明のＲＮＡの選択的分離精製方法を使用した本実施例は、市販の精製キットを使用した比較例に比べ、得られたＲＮＡは、同等の品質で有りながら、回収量が多いことが分かった。
【０１６２】
以上のことから、検体が動物組織の場合でも、少量のＤＮａｓｅ溶液でＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液中のＤＮＡを分解し、ＲＮＡを選択的に回収できることが確認できた。
【０１６３】
［実施例５］
（１０）核酸混合物溶液調製
液体窒素で急速凍結したマウス脾臓をハサミで小破片とし、１０ｍｇを２ｍｌセーフロックチューブ（エッペンドルフ社製）にはかりとった。核酸可溶化試薬Ｂ１を３５０μｌ加え、さらに５ｍｍ径ジルコニアボールを入れた。ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）の設定を２０Ｈｚとして、３分間にて２回ホモジナイズする。８０００×ｇにて３分間、室温にて遠心分離し、組織破片を取らないように新しい１．５ｍｌチューブに上清を移した。ここに核酸可溶化試薬Ｂ２を１７５μｌ加え、ボルテックスミキサーで１５秒間攪拌した。さらに、９９．５容量％以上特級エタノールを１７５μｌ加え、ボルテックスミキサーで1分間攪拌した。
【０１６４】
（１１）ＲＮＡ分離精製操作
上記（９）と同様にＲＮＡを回収した。ＤＮａｓｅ処理についても同様にＰｒｏｍｅｇａ社製ＲＱ１  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ５００Ｋｕｎｉｔｚ  Ｕ／ｍＬを膜上に１０μｌ（２６μｌ／ｃｍ2）アプライして行った。
【０１６５】
［比較例７］
上記（１０）と同じマウス由来の脾臓を用い、同じホモジナイズ方法にて、ＱＩＡＧＥ
Ｎ社製ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて同キットのプロトコルに従い、ＲＮＡ抽出を行った。ＤＮａｓｅ溶液はプロトコル通りの８０μｌ（２０８μｌ／ｃｍ2）で実施した。
【０１６６】
実施例５及び比較例７で回収された核酸を含む回収液を１％アガロース電気泳動法により電気泳動した。結果を図６に示す。
【０１６７】
図６の電気泳動結果より、比較例７バンド６ではＤＮａｓｅ溶液を８０μｌ（２０８μｌ／ｃｍ2）でもかすかにゲノムＤＮＡバンドが認められるのに対し、実施例５バンド５では１０μｌ（２６μｌ／ｃｍ2）でもＤＮＡが分解された。実施例５では比較例７と比べて少ないＤＮａｓｅ溶液量で純度がより良好なＲＮＡを回収できた。
【０１６８】
［実施例６］
（１２）核酸混合物溶液調製
液体窒素で急速凍結したマウス肝臓をハサミで小破片とし、５ｍｇを１．５ｍｌチューブにはかりとった。核酸可溶化試薬Ｂ１を３５０μｌを加え、ＰＥＬＬＥＴ  ＰＥＳＴＬＥＳ（Ｋｉｍｂｌｅ／Ｋｏｎｔｅｓ社製）を専用モーターに取り付け、均一になるまでホモジナイズした。８０００×ｇにて３分間、室温にて遠心分離し、組織破片を取らないように新しい１．５ｍｌチューブに上清を移した。ここに核酸可溶化試薬Ｂ２を１７５μｌ加え、ボルテックスミキサーで１５秒間攪拌した。さらに、９９．５％以上特級エタノールを１７５μｌ加え、ボルテックスミキサーで１分間攪拌した。
【０１６９】
（１３）ＲＮＡ分離精製操作
上記（９）と同様にＲＮＡを回収した。ＤＮａｓｅ処理についても同様にＰｒｏｍｅｇａ社製ＲＱ１  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ５００Ｋｕｎｉｔｚ  Ｕ／ｍＬを膜上に１０μｌ（２６μｌ／ｃｍ2）アプライした。
【０１７０】
［比較例８］
上記（１２）と同じマウス由来の肝臓を用い、同じホモジナイズ方法にて、ＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて同キットのプロトコルに従い、ＲＮＡ抽出を行った。ＤＮａｓｅ溶液はプロトコル通りの８０μｌ（２０８μｌ／ｃｍ2）で実施した。
【０１７１】
実施例６及び比較例８で回収された核酸を含む回収液を１％アガロース電気泳動法により電気泳動した。結果を図６に示す。
【０１７２】
図６の電気泳動結果より、比較例８バンド８ではＤＮａｓｅ溶液を８０μｌ（２０８μｌ／ｃｍ2）必要とするが、実施例６バンド７では１０μｌ（２６μｌ／ｃｍ2）でもＤＮＡが分解された。実施例６では比較例８と比べて少ないＤＮａｓｅ溶液量で純度が同等の、分解のない高品質のＲＮＡが得られた。
【０１７３】
［実施例７］
（１４）核酸混合物溶液調製
液体窒素で急速凍結したマウス肝臓をハサミで小破片とし、１０ｍｇを２ｍｌセーフロックチューブ（エッペンドルフ社製）にはかりとった。表３に示す核酸可溶化試薬−１を３５０μｌ加え、さらに５ｍｍ径ジルコニアボールを入れた。ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）の設定を２０Ｈｚとして、３分間にて２回ホモジナイズした。１０，０００×ｇにて３分間、室温にて遠心分離し、組織破片を取らないように新しい１．５ｍｌチューブに上清を移した。表３の通りに核酸可溶化試薬−２を添加し、ボルテックスミキサーで１５秒間攪拌し、続いて表３に示す所定濃度の特級エタノールを添加し、ボルテ
ックスミキサーで1分間攪拌した。
【０１７４】
【表３】
2006271201.tif 000004
【０１７５】
（１５）ＲＮＡ分離精製操作
上記（１４）の核酸混合物溶液を、上記（１）及び（２）で作成した核酸吸着性多孔性膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置（シリンジポンプ）を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１２０ｋＰａ）にし、注入した核酸混合物溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、圧力差発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液−１を表４の通りに７５０μｌ注入し、上記一の開口に圧力差発生装置（シリンジポンプ）を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１２０ｋＰａ）にし、注入した洗浄液−１を核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した（洗浄工程１）。圧力差発生装置を外し、ＤＮａｓｅ溶液（ＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ  ３４１  Ｋｕｎｉｔｚ  Ｕ／ｍＬを使用）を膜上に４０μｌ（１０４μｌ／ｃｍ2）アプライし、室温で１５分放置した。続いて、表４に示す洗浄液−２で洗浄を２回行った（洗浄工程２）。その後、圧力差発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に表３に示す回収液を１００μｌ注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置（シリンジポンプ）を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１２０ｋＰａ）にし、注入した回収液を核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
【０１７６】
【表４】
2006271201.tif 000005
【０１７７】
実施例７で回収された核酸の回収量を表５に示す。
【０１７８】
【表５】
2006271201.tif 000006
【０１７９】
実施例７の結果より、ＤＮａｓｅ溶液の量が４０μｌ（１０４μｌ／ｃｍ2）であっても、上記いずれの核酸可溶化試薬、洗浄液および回収液の組み合わせにおいても、トータルＲＮＡを効率よく回収可能であることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】実施例１及び比較例１、２、３において回収された核酸を含む回収液を、１％アガロースゲルを用いて電気泳動して得られた写真である。
【図２】比較例２において回収された核酸を含む回収液を、１％アガロースゲルを用いて電気泳動して得られた写真である。
【図３】実施例１及び比較例１において回収された核酸を含む回収液を、１％アガロースゲルを用いて電気泳動して得られた写真である。
【図４】実施例３および比較例５において回収された核酸を含む回収液を、ＭＯＰＳ−ｆｏｒｍａｍｉｄｅ電気泳動法により電気泳動して得られた写真である。
【図５】実施例４および比較例６において回収された核酸を含む回収液を、１％アガロースゲルを用いて電気泳動して得られた写真である。
【図６】実施例５および比較例７、実施例６および比較例８において回収された核酸を含む回収液を、１％アガロースゲルを用いて電気泳動して得られた写真である。
【符号の説明】
【０１８１】
Ｒ          ＲＮＡ由来のバンド
Ｄ          ＤＮＡ由来のバンド
Ｅ１０      実施例１  ＤＮａｓｅ液量１０μｌ（２６μｌ／ｃｍ2）
Ｅ２０      実施例１  ＤＮａｓｅ液量２０μｌ（５２μｌ／ｃｍ2）
Ｅ４０      実施例１  ＤＮａｓｅ液量４０μｌ（１０４μｌ／ｃｍ2）
Ｅ８０      参考例    ＤＮａｓｅ液量８０μｌ（２０８μｌ／ｃｍ2）
Ｃ１        比較例１  ＤＮａｓｅ液量０μｌ
Ｃ２−１０  比較例２  ＤＮａｓｅ液量１０μｌ（２６μｌ／ｃｍ2）
Ｃ２−２０  比較例２  ＤＮａｓｅ液量２０μｌ（５２μｌ／ｃｍ2）
Ｃ２−８０  比較例２  ＤＮａｓｅ液量８０μｌ（２０８μｌ／ｃｍ2）
Ｃ３        比較例３  ＤＮａｓｅ液量０μｌ
【０１８２】
Ｍ          ＲＮＡ分子量マーカー
１          実施例３
２          比較例５
【０１８３】
３          実施例４  ＤＮａｓｅ液量１０μｌ（２６μｌ／ｃｍ2）
４          比較例６  ＤＮａｓｅ液量８０μｌ（２０８μｌ／ｃｍ2）
Ｍ２        １ｋｂ  ＰＬＵＳ  Ｌａｄｄｅｒ
【０１８４】
５          実施例５  マウス脾臓  ＤＮａｓｅ液量１０μｌ（２６μｌ／ｃｍ2）
６          比較例７  マウス脾臓  ＤＮａｓｅ液量８０μｌ（２０８μｌ／ｃｍ2）
７          実施例６  マウス肝臓  ＤＮａｓｅ液量１０μｌ（２６μｌ／ｃｍ2）
８          比較例８  マウス肝臓  ＤＮａｓｅ液量８０μｌ（２０８μｌ／ｃｍ2）
Ｍ３        １ｋｂ  ＰＬＵＳ  Ｌａｄｄｅｒ
【図１】
2006271201.tif 000007
【図２】
2006271201.tif 000008
【図３】
2006271201.tif 000009
【図４】
2006271201.tif 000010
【図５】
2006271201.tif 000011
【図６】
2006271201.tif 000012