(57)【要約】      （修正有）【課題】骨粗鬆症発症傾向を測定する方法を提供する。【解決手段】ペルオキシソーム増殖因子−活性化受容体γ（PPARγ）における遺伝子多型を利用する。ホモ接合体PPARγPro12アレル又はホモ接合体PPARγVN102「G」アレルの存在を検出する。血液サンプルを用い、ＰＣＲの実施とプライマーセットを用いて行う。更に骨密度試験を併用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の骨粗鬆症発症傾向を測定する方法であって、当該方法が以下のステップ：
個体試料中のホモ接合体PPARγPro12アレル又はホモ接合体PPARγVN102「G」アレルの存在を検出し；及び
ホモ接合体PPARγPro12アレル又はホモ接合体PPARγVN102「G」アレルが存在する場合に、骨粗鬆症の高い危険性の分析を記録する、
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
COL1A1イントロン1 Sp1サイトである「T」アレルが個体試料中に存在するか否かを評価するステップを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記分析がコンピュータで読み取り可能な形式上に記録される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記Pro12アレルが、個体由来のゲノムDNA試料におけるPPARγ2のPro12をコードするコドンの位置１のCヌクレオチドの存在を測定することによって検出される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ゲノムDNA試料が、血液から入手される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
Cヌクレオチドの存在を測定する前記ステップが、増幅反応を含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記増幅反応が、Proアレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチド及びAlaアレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて実施される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記アレル-特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号１及び２で示されるプライマー配列を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅反応が、Proアレル又はAlaアレルに特異的に結合する標識プローブで増幅産物をハイブリダイズするステップを含む、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記VN102アレルが、個体由来のゲノムDNA試料中に検出される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記ゲノムDNA試料が血液から入手される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
VN102アレルの存在を測定する前記ステップが、増幅反応を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記増幅反応が、「G」アレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチド及び「A」アレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて実施される、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記アレル-特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号４及び５で示されるプライマーセットを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅反応が、Gアレル又はAアレルに特異的に結合する標識プローブで増幅産物をハイブリダイズするステップを含む、請求項６記載の方法。
【請求項１８】
前記個体が女性である、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記個体が白人である、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
個体の骨密度試験を実施するステップを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
a)Pro12Ala多型又はVN102多型に関する個体の遺伝子型を表示するデータコード；
b)当該遺伝子型を表示するデータを用いて、当該遺伝子型が、骨粗鬆症の高い危険性と関連付けられるか否かを評価するためのコード、
を含む、コンピュータ読み取り可能媒体。
【請求項２２】
個体の骨粗鬆症発症傾向を測定する方法であって、当該方法が、
ホモ接合体PPARγアレルがPPARγPro12アレル又はPPARγVN102「G」であるホモ接合体PPARγアレルの個体試料の存在を検出すること；及び
COL1A1「T」アレルの存在又は非存在を検出すること；
ここで、ホモ接合体PPARγアレルの存在及びCOL1A1「T」アレルの存在は、ホモ接合体PPARγアレル又はCOL1A1「T」アレルのみの検出に比べて骨粗鬆症の高い危険性の指標であることを示す、
を含む、前記方法。
【請求項２３】
a)Pro12Ala多型又はVN102多型に関する個体の遺伝子型を表示するデータコード；
b)COL1A1イントロン1 Sp1部位多型に関する個体の遺伝子型を表示するデータコード；及び
c)遺伝子型を表示する当該データを使って、当該遺伝子型が骨粗鬆症の高い危険性と関連付けられるか否かを決定するコード、
を含むコンピュータ読み取り可能媒体。
【請求項２４】
個体の骨粗鬆症発症傾向を測定するキットであって、当該キットが、
−Pro12アレルのためのアレル特異的オリゴヌクレオチド及びPPARγ2のAlaアレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチドを含む増幅プライマーセット、
−増幅用緩衝液
を含む、前記キット。
【請求項２５】
前記プライマーセットが配列番号１及び２で示されるプライマーセットを含む、請求項２４記載のキット。
【請求項２６】
個体の骨粗鬆症発症傾向を測定するキットであって、当該キットが、
−PPARγ2 VN102「G」アレルのためのアレル特異的オリゴヌクレオチド及びPPARγ VN102「G」アレルのためのアレル特異的オリゴヌクレオチドを含む増幅プライマーセット、
−増幅用緩衝液
を含む、前記キット。
【請求項２７】
前記プライマーセットが、配列番号４及び５で示されるプライマーセットを含む、請求項２６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨密度の減少を含む疾患又は症状、例えば骨粗鬆症の危険性の増加と関連するPPARγ2における一塩基多型の発見に基く。
【背景技術】
【０００２】
ペルオキシソーム増殖因子-活性化受容体γ（PPARγ）は、転写因子の核内ホルモン受容体ファミリーの構成員である。PPARγは、含脂肪細胞の分化、及びグルコース及び脂肪酸の代謝をレギュレーションする役割を有する。マウスのモデルでは骨成長に役立つことも明らかとなっている（Czernikら, Endocrinology 143: 2376-2384, 2002: Akuneら, J. Clin. Invest 113:846-855, 2004）。
【０００３】
PPARγ遺伝子おいては、多数の一塩基多型（SNPs）が報告されている。これらは、Pro12Ala多型、すなわちコード領域のヌクレオチド34でのCからGへの置換を含む。これは、PPARγ2の位置12でプロリン(Pro)をアラニン（Ala）で置換したことになる（Yenら, Biochem. Biophys. Res. Comm. 241: 270-274(1997)。Ala多型は、比較的稀である。最も高い頻度を有する民族である白人では、キャリア罹患率は25％である。Pro12Ala多型は、糖尿病と関連する（例えばAlshulerら, Nat. Gen. 26:76-80, 2000; Moriら, Diabetes 50: 891-894, 2000; Douglasら, Diabetes 50:886-890, 2001）。当初、糖尿病の75％の危険性の減少は、Alaアレルによってもたらされたことが報告されたが（Deebら, Nat. Gen. 20: 284-287, 1998）、以降の研究では当該関連性を再度見出してはいない。多くの研究により、より一般的なプロリンアレルと関連して糖尿病危険性が顕著に増加していることが判明した（頻度85％）。危険アレルはこのような高頻度で生じるため、そのささやかな効果により大多数の集団に危険を与える−一般群の2型糖尿病の25％に影響を与える（Alshulerら, supra）。
【０００４】
別のSNPであるVN102多型は、Pro12Ala多型と強い連鎖不均衡にある。当該多型に関する多型「A」アレルの頻度は、Pro12Ala多型に関するAlaアレル頻度の頻度と同等である。
【０００５】
別のPPARγ2多型であるPPARγ2のエキソン6でのCからTへの置換が閉経後の女性の日本人群における骨塩密度と関連することが報告されている（Ogawaら, Biochem. Biophys. Res. Comm. 260: 122-126, 1999）が、Pro12Ala及びVN102多型と、骨蜜度を含む疾患、例えば骨粗鬆症の危険との関連性は従来観察されていなかった。
【発明の開示】
【０００６】
従って、本発明は、PPARγ2の位置12の多型(Pro12Ala)及びVN102 SNPが骨密度の減少を含む疾患、例えば骨粗鬆症の危険性と関連することの発見に基くものである。更に、発明者は、当該PPARγ多型が、コラーゲン1型アルファ遺伝子のイントロン1のSp1結合部位においてCOL1A1多型と相互作用することを発見した。
【０００７】
本発明は、個体が骨粗鬆症を発症する傾向を検出する方法であって、個体におけるホモ接合体PPARγPro12アレル又はホモ接合体PPARγVN102「G」アレルの存在を検出し、及び骨粗鬆症の高い危険性の分析を読み取る方法を提供する。分析は、コンピュータで読み取り可能な形式上で読み取られることが多い。一つの実施態様では、当該個体は女性である。別の実施態様では、当該個体は白人である。
【０００８】
Pro12アレルは典型的には、個体のゲノムDNA試料中のPPARγ2の残基12をコードするコドン「CCA」の第一の位置における「C」ヌクレオチドの存在を測定することによって検出される。ゲノムDNA試料は、血液から入手されることが多いが、他の組織から入手してもよい。多型を検出する方法は、一般的に増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む。
【０００９】
一つの実施態様では、増幅反応は、Proアレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチド及びAlaアレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて実施される。具体的なアレル-特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号1及び2で示されるプライマー配列を含む。
【００１０】
別の実施態様では、増幅反応は、Proアレル又はAlaアレルに特異的に結合する標識プローブと増幅産物とをハイブリダイズするステップを含む。
【００１１】
別の実施態様では、本発明は、位置12にProを含むポリペプチドの存在を検出することによる、Pro12Ala多型の「Pro」アレルの存在を測定する方法を提供する。当該アレル変異体は、例えばProアレルに特異的に結合するモノクローナル抗体等の抗体を用いて検出することができる。
【００１２】
VN102「G」の存在は、ゲノムDNAを含む個体由来の核酸試料中でも検出される。典型的な実施態様では、検出ステップは、増幅反応、通常は、「G」アレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチドプライマー及び「A」アレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーセットを用いるPCRを含む。具体的なアレル-特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号4及び5で示されるプライマー配列を含む。別の実施態様では、増幅反応はGアレル又はAアレルに特異的に結合する標識プローブと増幅産物をハイブリダイズするステップを含む。
【００１３】
実施態様によっては、当該方法は、個体の骨密度試験を実施するステップを更に含むことができる。
【００１４】
本発明はまた、a)対象における、Pro12Ala多型のホモ接合体「G」アレルの存在又は非存在、及び／又はホモ接合体PPARγVN102「G」アレルの存在又は非存在を検出すること；並びにb)COL1A1多型のための「T」アレルの存在又は非存在を検出すること、ここで、Pro12Ala多型のホモ接合体PPAR「G」アレルの存在及び／又はホモ接合体VN102「G」アレルの存在は、COL1A1「T」アレルの存在と関連して、骨粗鬆症の危険性を増加させる、によって個体の骨粗鬆症発症傾向を測定する方法を提供する。典型的な実施態様では、多型アレルの存在又は非存在はゲノムDNA試料を用いる遺伝子型を評価することによって測定される。本発明は、Pro12Ala多型のホモ接合体PPAR「G」アレル及び／又はホモ接合体VN102「G」アレルが、個体中のCOL1A1「T」アレルと関連して存在する場合に、骨粗鬆症の高い危険性を記録するステップを更に含むことができる。
【００１５】
別の態様では、本発明は、以下を含むコンピュータ読み取り可能な媒体を提供する：a)生物試料中のPro12Ala多型のホモ接合体Proアレル又はVN102多型のホモ接合体「G」アレルの存在を測定するためのアッセイの結果を示すデータを取得するためのコード；及びb)当該生物試料がアッセイの結果を示すデータを用いて骨粗鬆症の高い危険性と関連付けられるか否かを測定するためのコード。実施態様によっては、当該コンピュータで読み取り可能な媒体は、COL1A1多型中の「T」アレルの存在を測定するためのアッセイの結果を示すデータを取得するためのコード、及び当該試料が骨粗鬆症に関して高い危険性にあるか否かを当該アッセイの結果を示すデータを用いて測定するためのコードを更に含む。
【００１６】
定義
用語「アレル」は、対象の遺伝子のヌクレオチド配列変異体を意味する。
【００１７】
用語「Pro12Ala多型」及び「ProAla SNP」は、PPARγ2の残基12をコードするコドンのエキソン1に生じるPPARγ2多型(CCA/GCA)を意味するために交換して使用される。一般名はNT＿005718.5＿52893である。当該名称は、contig配列名及び国立生物工学情報センター(NCBI)から得られたcontig配列中のSNP配置に基くものである、SNP起源はNCBI OMIM 601487.0002; db SNP rs1801282である。
【００１８】
本明細書で用いる、Pro12Alaアレル変異体に関する「Cアレル」は、PPARγ2のコード領域のヌクレオチド34にシトシンすなわち「Cヌクレオチド」を有する配列変異体を意味する。これは、PPARγ2蛋白質の位置12にプロリンが存在することとなる。
【００１９】
Pro12Alaアレル変異体に関する「Gアレル」は、多型位置にグアニンすなわち「Gヌクレオチド」を含む配列変異体を意味する。これは、PPARγ2の位置12にアラニンが存在することになる。
【００２０】
用語「VN102多型」は、PPARγ2のイントロン1に生じるSNPを意味する。多型位置は「A」残基に対して「G」残基である。SNP源は、dbSNP rs1899951である。
【００２１】
VN102多型に関する「Gアレル」は、PPARγ2のイントロン1の多型位置にグアニンすなわち「G」ヌクレオチドを有するアレル変異体を意味する。
【００２２】
VN102多型に関する「Aアレル」は、PPARγ2のイントロン1の多型位置にアデニンすなわち「Aヌクレオチド」が存在することを意味する。
【００２３】
本明細書で用いる「COL1A1」多型は、1型コラーゲンアルファ1(COL1A1)遺伝子において「G」から「T」への変化として明らかとなった多型を意味する。この多型は、COL1A1のイントロン1のSp1結合部位に局在化し、骨塩密度の減少と関連する（Mannら, J. Clin. Invest. 107: 899-907, 2001; Mann & Ralston, Bone 32:711-717, 2003）。多型は、Sp1のその認識配列への結合を変更する。「T」アレルの存在は、骨粗鬆症の危険性を増加させる。
【００２４】
用語「遺伝子型」は、個体又は試料中に含まれる遺伝子のアレルの表記を意味する。本発明の文脈において、個体の遺伝子型と個体から得られる試料の遺伝子型とは区別しない。典型的には、遺伝子型は2倍体細胞の試料から測定されるが、遺伝子型は半数体細胞、例えば精子細胞の試料から測定することもできる。
【００２５】
「多型」は、群中の2個又はそれ以上の遺伝的に決定された代わりの遺伝子配列の存在を意味する。典型的には、最初に特定されたアレル体は標準型として任意に表され、他のアレル体は代替又は変異アレルとして表される。選択された群中に最も頻繁に生じるアレル体は、野生型と言われることがある。
【００２６】
「一塩基多型」又は「SNP」は、アレル間で変化する一つのヌクレオチドの部位を意味する。一塩基多型は、遺伝子の任意の領域で生じることが可能である。ある例では、多型は蛋白質配列での変化、例えばPro12Ala多型を生じ得る。蛋白質配列での変化は蛋白質機能に影響を与える場合もあるし、与えない場合もある。
【００２７】
本明細書で用いる用語「連鎖不均衡」は、無作為に関連しないすなわちそれらの頻度と比例して関連しない、異なった遺伝子座のアレルを意味する。アレルが正の連鎖不平衡にある場合には、統計的に独立と仮定すると当該アレルは予測を超えて頻繁に生じる。逆に、アレルが負の連鎖不平衡にある場合には、統計的に独立と仮定すると当該アレルは予測を下回った頻度で生じる。本明細書で用いる「強連鎖不平衡」は、約1のD’値を意味する。
【００２８】
用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的塩基対に起因する、2個の単一標準核酸によるデュプレックス構造の形成を意味する。ハイブリダイゼーションは、厳密に相補的な核酸鎖間又はミスマッチの少ない領域を含む核酸鎖間で起こり得る。本明細書で用いる用語「実質的に相補的な」は、ミスマッチの少ない領域を除いて相補的である配列を意味する。典型的には、ハイブリダイズ領域上のミスマッチヌクレオチドの総数は、約15ヌクレオチド長の配列に関して3ヌクレオチド以下である。厳密に相補的核酸鎖のみがハイブリダイズする条件は、「緊縮」又は「配列-特異的」ハイブリダイゼーション条件と言われる。実質的に相補的な核酸の安定なデュプレックスは、ほとんど緊縮性でないハイブリダイゼーション条件下で得られる。核酸工学の当業者は、例えばオリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対濃度、イオン強度及びミスマッチ塩基対の存在を含む多数の変動を考慮して、デュプレックス安定性を経験的に決定することができる。デュプレックス安定性を計算するコンピュータソフトウエアは、National Biosciences, Inc. (Plymouth, Minn)から商業的に入手可能である；OLIGOバージョン5参照マニュアルは本明細書に参考として援用されている。
【００２９】
オリゴヌクレオチドが厳密に相補的な標的配列にのみハイブリダイズする緊縮性の配列-特異的ハイブリダイゼーション条件は、当該分野では周知である（例えば、核酸配列の多型の検出に関する項に提供されている一般的な文献を参照されたい）。緊縮条件は、配列依存的であり、条件が異なれば異なるだろう。一般的に緊縮条件は、特定のイオン強度及びpHで特定の配列に関して、融解点より約5℃低い温度が選ばれる。Tmは、（特定のイオン強度及びpHで）塩基対の50％が解離する温度である。ハイブリダイズ条件の緊縮性を緩和するとミスマッチ配列を容認することとなる；容認されるミスマッチ度は、ハイブリダイゼーション条件の好適な調整によって制御するこことができる。
【００３０】
用語「プライマー」は、核酸鎖に相補的なプライマー伸張産物の合成が誘導される条件下、すなわち好適な緩衝液中及び好適な温度での、4種の異なったヌクレオチド三リン酸及び高分子化試薬（すなわち、DNAポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下に、DNA合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、好ましくは一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、標的配列に厳密に又は実質的に相補的な「ハイブリダイズ領域」、好ましくは約15〜約35ヌクレオチド長を含む。プライマーオリゴヌクレオチドは、完全なハイブリダイゼーション領域から成るか、又は増幅産物の検出、固定化もしくは取り扱いを可能にするが、DNA合成の出発試薬として働くプライマーの能力を変化させない、追加の特徴を含むことができる。例えば、核酸配列尾部は、捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーの5’末端に含まれる。
【００３１】
本明細書で用いる「アレル-特異的」プライマーは、プライマーの3’末端、通常3’ヌクレオチドが対象の多型部位と並ぶような標的配列にハイブリダイズするプライマーであり、多型位置でアレルの一つと厳密に相補的である。本明細書で用いるプライマーは、3’末端で厳密に相補的であるアレルに対して「特異的」である。一般的に、プライマーの伸張は、ミスマッチがプライマーの3’末端に存在する場合に阻害される。アレル-特異的プライマーは、厳密に相補的アレルにハイブリダイズする場合に、かなりの効率性で伸張可能である。同一のプライマーは、他のアレルにハイブリダイズする場合には、ハイブリダイゼーションデップレックス中のプラマーの3’末端のミスマッチのため、容易に伸張することができない。従って、アレル-特異的プライマーの使用により、感知可能な伸張産物が形成された否かに基いたアレル識別が可能となる。
【００３２】
用語「プローブ」は、好適な条件下で標的核酸に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３３】
「アレル-特異的」プローブは、標的核酸に厳密に又は実質的に相補的な「ハイブリダイズ領域」を含み、対象の多型部位で標的配列に厳密に相補的である。十分に緊縮したハイブリダイゼーション条件下でプローブを用いて行うハイブリダイゼーションアッセイにより、特定の標的配列の検出が可能になる。プローブのハイブリダイズ領域は、好ましくは約10〜約35ヌクレオチド長であり、より好ましくは約15〜約35ヌクレオチド長である。ハイブリダイゼーションの安定性に影響を与える修飾塩基又は塩基類似体の使用は、当該分野では周知であり、当該使用により、短鎖プローブ又は長鎖プローブの使用が相当の安定性で可能になる。プローブオリゴヌクレオチドは完全なハイブリダイズ領域から成るか、又はプローブの検出もしくは固定化を可能にするが、ハイブリダイズ領域のハイブリダイゼーション特性を変化させない、追加の特徴を含むことができる。
【００３４】
用語「標的配列」又は「標的領域」は、解析される核酸の領域を意味し、対象の多型部位を含む。
【００３５】
本明細書で用いる用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、プライマー、プローブ及びオリゴマー断片を意味する。当該用語は長さによっては限定されず、一般的には、（2-デオキシ-D-リボースを含む）ポリデオキシリボヌクレオチド、(D-リボースを含む)ポリリボヌクレオチド、及びプリンもしくはピリミジン塩基又は修飾プリンもしくはピリミジン塩基の任意の他のN-グリコシドの直鎖ポリマーである。当該用語は、二本鎖-及び一本鎖-DNA、並びに二本鎖-及び二本鎖-RNAを含む。本発明のオリゴヌクレオチドはプライマー及び／又はプローブとして使用することができる。従って、本明細書において「プライマー」と言われるオリゴヌクレオチドはプローブとして働くことができ、ある実施態様では、「プローブ」と言われるオリゴヌクレオチドはプライマーとして働くことができる。
【００３６】
核酸、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエステル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエート又はスルホン結合及びこれらの結合の組み合わせに限定されないホスホジエステル結合又は修飾結合を含むことができる。
【００３７】
核酸、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、5種の生物学的に存在する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）及び／又は当該5腫の生物学的に存在する塩基以外の塩基を含むことができる。これらの塩基は、多数の目的、例えばハイブリダイゼーションを安定化させるか又は不安定化させる；プローブ分解を促進するか又は阻害する；あるいは検出可能部分又は停止部分のための接合点として働く。例えば、本発明のポリヌクレオチ  ドは、N6-メチル-アデニン、N6-tert-ブチル-ベンジル-アデニン、イミダゾール、置換イミダゾール、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、3-(3-アミド-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、2,6-ジアミノプリン及び5-プロピニルピリミジンを含むがこれらに限定されない、1個又はそれ以上の修飾された、非-標準的な又は誘導された塩基部分を含むことができる。
【００３８】
更に、核酸、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシロース及びヘキソースを含むがこれらに限定されない、1個又はそれ以上の修飾糖部分を含むことができる。
【００３９】
＜導入＞
PPARγ2における多数の遺伝的変異体が同定されている。これらのうちの一つは、アミノ酸をプロリンからAla(CCG(Pro)からGCG(Ala))に変化させる、PPARγのコドン12におけるCからGへの置換である。この多型は、2型糖尿病及び肥満症と関連する。低頻度のAla12変異体は、2型糖尿病を発症する危険性を20％減じると推定される。本発明では、ホモ接合体「C」アレル（本明細書では「Pro」アレルとも言われる）の存在は骨粗鬆症の高い危険性と関連する。
【００４０】
典型的には、Pro12Ala多型は、個体から得られた生物学的試料から取得したゲノムDNA中の「C」アレル又は「G」アレルの存在を測定することにより検出される。しかしながら、多型は他の核酸試料、例えばPPARγ2が発現している組織、例えば含脂肪細胞から単離されたmRNA中でも検出される。更に、多型は、個体に存在するPPARγ2アレルの蛋白質産物（類）を解析することによっても検出することができる。多型変異体の存在を測定する具体的な方法は、下に詳細が記載されている。
【００４１】
別の多型、VN1012はPro12Alaと強い連鎖不平衡にある。VN102多型はイントロン1におけるGからAへの置換である。VN102に関するホモ接合体「G」アレルの存在はまた、骨粗鬆症等の骨密度の減少に関連する疾患又は症状の高い危険性と関連する。VN102多型変異体は、当該部位での個体の遺伝子型を測定することによって検出される。
【００４２】
本発明はまた、本明細書に記載したPPARγ多型とイントロン1のSp1部位のCOL1A1多型とが相互作用するために、下記：1)COL1A1「T」アレル、及び2)ホモ接合体PPARγPro12Ala「G」アレル及びホモ接合体VN102「G」アレルの双方を保持している個体は危険性が高い、すなわちCOL1A1多型又はPPARγ多型（複数）のみを有する場合に比べて骨粗鬆症に関して統計的に重要な高い危険性を有する、という発見に基いている。
【００４３】
＜核酸配列多型の検出＞
SNPの存在のための核酸の評価する検出技術は、分子遺伝学の分野で周知の方法を含む。更に、方法の多くは、核酸の増幅を含む。実施するための十分な指針が当該分野で提供されている。具体的文献は以下のPCR技術等を含む取り扱い説明書である：Principles and Applications for DNA Amplication (H. A. Erlich編, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Aplications (Innisら編, Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, 1994-1999, 2004年4月までに補足的に更新されたものを含む; Sambrook及び& Russel, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第3版, 2001)。
【００４４】
方法は典型的にはPCR法を採用するが、他の増幅プロトコールも使用できる。好適な増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（例えばWu及びWallace, Genomics 4:560-560, 1988）；鎖置換アッセイ（例えばWalkerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, 1992; 米国特許第 5,455,166号明細書）；及び米国特許第 5,437,990号明細書, 同 5,409,818号明細書及び同 5,399,491号明細書に記載の方法を含む、様々な転写-系増幅装置；転写増幅装置(TAS)（Kwohら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177, 1989）及び自律配列複製(3SR) (Guatelliら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878, 1990; WO 92/08800号)を含む。あるいは、プローブを検出可能なレベルまで増幅する方法は、Qβ-レプリカーゼ増幅(Kramer及びlizardi, Nature 339: 401-402, 1989; Lomeliら, Clin. Chem. 35: 1826-1831, 1989)等を使用することができる。公知の増幅反応の概説は、例えばAnderson及びMeyersのCurrent Opinion in Biotechnology 4: 41-47, 1993に提供されている。
【００４５】
典型的には、個体のPro12Ala及び／又はVN102遺伝子型の検出は、オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブを用いて実施される。同様に、COL1A1多型の検出は、COL1A1遺伝子座の当該部位での個体の遺伝子型を評価することによっても実施することができる。オリゴヌクレオチドは、任意の好適な方法、通常、化学的合成によって調製することができる。オリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能な試薬及び機器を用いて合成することができる。あるいは、商業的起源から購入することもできる。オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該分野で周知である（例えば、Narangら, Meth. Enzymol. 68: 90-99, 1979; Brownら, Meth. Enzymol. 68: 109-151, 1979; Beaucageら, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862, 1981; 及び米国特許第 4,458,066号明細書の固体支持体法）。更に、上記合成方法の修飾も、合成されたオリゴヌクレオチドに関して酵素作用の影響を与えるために望ましく使用することができる。例えば、修飾ホスホジエステル結合（例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート又はボラノホスフェート）又はリン酸誘導体以外の結合のオリゴヌクレオチドへの取り込みは、特定の部位での開裂を避けるために使用することができる。更に、新規核酸鎖の合成の鋳型でもある核酸にハイブリダイズする場合に、2’-アミノ修飾糖を使用すると、オリゴヌクレオチドの消化を超えて置換を助ける傾向になる。
【００４６】
Pro12Ala及び／又はVN102多型に関する個体の遺伝子型は、当該分野で周知の多くの検出方法を用いて測定することができる。アッセイのほとんどは、種々の一般的プロトコールの一つを必要とする：アレル-特異的オリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーション、プライマー伸張、アレル-特異的ライゲーション、塩基配列決定又は電気泳動的分離技術、例えば一本鎖高次構造多型(SSCP)及びヘテロデュプレックス解析。具体的アッセイは、5’ヌクレアーゼアッセイ、鋳型-指向型色素-ターミネーターの取り込み、分子標識アレル-特異的オリゴヌクレオチドアッセイ、一塩基伸張アッセイ及びリアルタイムのピロリン酸塩配列によるSNP計数を含む。増幅配列の解析は、マイクロチップ、蛍光偏光アッセイ及びマトリックス支援レーザ脱離イオン化(MALDI)質量分析等の様々な技術を用いて実施することができる。更に使用できる2種の方法は、Flapヌクレアーゼによる浸潤的開裂及びパドロックプローブを用いる方法に基くアッセイである。
【００４７】
特定のPPARγ2アレルの存在又は非存在の測定は、一般的に解析する個体から得られた核酸試料を解析することによって実施することができる。通常、核酸試料はゲノムDNAを含む。ゲノムDNAは典型的には血液試料から取得され、他の細胞又は組織から取得することもできる。
【００４８】
多型アレルの存在には、RNA試料を解析することもできる。例えば、mRNAはPro12Ala多型部位の個体の遺伝子型を測定するために使用することもできる。このような場合には、核酸試料は標的核酸が発現している細胞例えば含脂肪細胞から取得される。かかるアッセイは、最初に例えばウイルス逆転写酵素を用いて標的RNAを逆-転写させ、次いで得られたcDNAを増幅し；又は米国特許第 5,310,652号明細書；同 5,322,770号明細書；同 5,561,058号明細書；同 5,641,864号明細書；及び同 5,693,517号明細書に記載の高温を組み合わせた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いて実施することができる。
【００４９】
SNPsを検出するための核酸試料の解析のために頻繁に用いられる方法を簡単に記載する。しかしながら、当該分野で公知の任意の方法が一塩基置換の存在を検出するために本発明では使用することができる。
【００５０】
アレル-特異的ハイブリダイゼーション
一般的にはアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(ASO)（例えばStonekingら, Am. J. Hum. Genet. 48: 70-382, 1991; Saikiら , Nature 324, 163-166, 1986; 欧州特許 235,726号明細書; WO 89/11548号）とも言われるこの技術は、変異体の一つについて特異的なオリゴヌクレオチドを、核酸試料を増幅することから得られる増幅産物にハイブリダイズすることによって一塩基が異なる2個のDNA分子を識別することができる。当該方法は、典型的には、短鎖オリゴヌクレオチド、例えば15〜20塩基長を採用する。プローブは一つの変異体と他の変異体を区別してハイブリダイズするように設計されている。かかるプローブを設計するための原理及び指針は、当該分野例えば本明細書に引用した参考文献で利用できる。ハイブリダイゼーションの条件は、アレル間のハイブリダイゼーション強度、好ましくは基本的な二成分反応において顕著な相違が存在することにより、プローブがアレルの一方とのみハイブリダイズするという、十分に緊縮性である必要がある。プローブの中には、多型部位がプローブの中央の位置で（例えば、位置7の15-塩基オリゴヌクレオチドで；位置8又は9のいずれかの16-塩基オリゴヌクレオチドで）並ぶように標的DNAの分画にハイブリダイズするように設計されているものもあるが、このような設計は必ずしも必要ではない。
【００５１】
アレルの量及び／又は存在は、試料にハイブリダイズするアレル-特異的オリゴヌクレオチドの量を測定することによって決定される。典型的には、オリゴヌクレオチドは蛍光標識等の標識で標識化することができる。例えば、アレル-特異的オリゴヌクレオチドはPPARγ2SNP配列を表す固定化オリゴヌクレオチドに適用される。緊縮ハイブリダイゼーション及び洗浄条件後、蛍光強度を各SNPオリゴヌクレオチドについて測定する。
【００５２】
一つの実施態様では、多型部位に存在するヌクレオチドは、多型部位を含む領域中の多型アレルの一つに厳密に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを用いる配列-特異的ハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションによって同定される。ハイブリダイズするプローブ配列及び配列-特異的条件は、多型位置の一ミスマッチがハイブリダイゼーションデュプレックスを十分に不安定化するために、デュプレックスが効果的に形成されないように選択される。従って、配列-特異的ハイブリダイゼーション条件下では、安定なデュプレックスがプローブ及び厳密に相補的なアレル配列間に形成される。従って、多型部位を含む領域中のアレル配列に厳密に相補的な約10〜約35ヌクレオチド長、好ましくは約15〜約35ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内である。
【００５３】
別の実施態様では、多型部位に存在するヌクレオチドは、多型部位を含む領域中のSNPアレルの一つに実質的に相補的であって、多型部位のアレルに厳密に相補的なオリゴヌクレオチドを用いる、十分に緊縮ハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションによって同定される。非-多型部位で生じるミスマッチは2つのアレル配列を有するミスマッチであるため、標的アレルで形成されるデュプレックス中のミスマッチの数の相違及び対応する非-標的アレル配列で形成されるデュプレックスの相違は、標的アレル配列に厳密に相補的なオリゴヌクレオチドが使用される場合と同一である。この実施態様において、ハイブリダイゼーション条件は非常に緩く、標的配列を有する安定なデュプレックス形成を可能にするものであるが、同時に、十分な緊縮性を維持して非-標的配列を有する安定なデュプレックスの形成を除外する。かかる十分な緊縮ハイブリダイゼーション条件下では、安定なデュプレックスがプローブ及び標的アレル間でのみ形成する。従って、多型部位を含む領域中のアレル配列に厳密に相補的であって、多型部位のアレル配列に厳密に相補的な約10〜約25ヌクレオチド長、好ましくは約15〜約35ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内である。
【００５４】
厳密にというよりむしろ実質的に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、最適なハイブリダイゼーション条件が限定されるアッセイ形式では望ましい。例えば、典型的な複数標的を固定化したプローブアッセイ形式では、各標的のプローブは単一の固相支持体上に固定化されている。ハイブリダイゼーションは、固相支持体を標的DNAを含む溶液と接触させることによって同時に実施することができる。ハイブリダイゼーションは全て同一の条件下で実施されるので、ハイブリダイゼーション条件は各プローブごとに別個に最適化することはできない。ミスマッチのプローブへの取り込みは、アッセイ様式がハイブリダイゼーション条件を調整することができない場合に、デュプレックス安定性を調整するために使用することができる。具体的な導入されたミスマッチのデュプレックス安定性に与える効果は周知であり、デュプレックス安定性は、上記のように日常的に推定することができ、また経験的に測定することができる。プローブの厳密なサイズ及び配列に依拠する好適なハイブリダイゼーション条件は、本明細書で提供された及び当該分野で周知な指針を用いて経験的に選択することができる。配列中の一塩基対の相違を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブの使用は、例えば本明細書に参考として各々援用されているConnerら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 278-282、及び米国特許第 5,468,623号明細書及び同 5,604,099号明細書に記載されている。
【００５５】
完全なマッチと一塩基ミスマッチのハイブリダイゼーションデュプレックスの安定性に比例する変化は、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの長さに依拠する。短いプローブ配列で形成されるデュプレックスほど、ミスマッチの存在によってより比例的に不安定になる。実際に、約15及び約35ヌクレオチド長間のオリゴヌクレオチドは、配列-特異的検出のため好ましい。更に、ハイブリッドオリゴヌクレオチドの末端は、連続した無作為解離と熱エネルギーによる再アニーリングを受けるため、いずれかの末端のミスマッチは、内部に生じるミスマッチほど、ハイブリダイゼーションデュプレックスを不安定化しない。好ましくは、標的核酸中の一塩基対の変化の識別のため、多型部位がプローブの内部領域で生じるような、標的配列にハイブリダイズするプローブ配列が選択される。
【００５６】
PPARγ2にハイブリダイズするプローブ配列を選択する上記基準は、プローブのハイブリダイズ領域、すなわち標的配列とのハイブリダイゼーションに含まれるプローブ部分に適用される。プローブは、プローブのハイブリダイゼーション特性を著しく変化させることなく、プローブの固定化に用いられるポリTテイル等の追加の核酸配列に結合される。当業者であるならば理解できることであるが、本方法における使用のためには、標的配列に相補的でなく、そのためハイブリダイゼーションに含まれない追加の核酸配列に結合されたプローブは、基本的に非結合プローブと等価である。
【００５７】
プローブ及び試料中の標的核酸配列間で形成されたハイブリッドを検出するための好適なアッセイ形式は、当該分野で公知であり、固定化標的（ドットブロット）形式及び固定化プローブ（逆ドットブロット又はラインブロット）アッセイ形式を含む。ドットブロット及び逆ドットブロットアッセイ形式は、本明細書に参考として各々援用されている米国特許第 5,310,893号明細書;同 5,451,512号明細書;同 5,468,613号明細書;及び同 5,604,099号明細書に記載されている。
【００５８】
ドットブロット形式では、増幅標的DNAはナイロン膜等の固相支持体上に固定化される。膜-標的複合体は、好適なハイブリダイゼーション条件、すなわちハイブリダイズしていないプローブを好適な緊縮条件下で洗浄することによって除去し、及び結合されたプローブの存在を当該膜によって観察する条件下で、標識プローブとインキュベートされる。好ましいドットブロット検出アッセイは実施例に記載されている。
【００５９】
逆ドットブロット（又はラインブロット）形式では、プローブはナイロン膜又はマイクロタイタープレート等の固相支持体上に固定化される。標識DNAは、典型的には標識プライマーの取り込みによる増幅中に標識化される。プライマーの一方又は両方を標識化することができる。膜-プローブ複合体は、好適なハイブリダイゼーション条件、すなわちハイブリダイズしていない標的DNAを好適な緊縮条件下で洗浄することによって除去し、及び結合された標的DNAの存在を当該膜によって観察する条件下で、標識化された増幅標識DNAとインキュベートされる。好ましい逆ラインブロット検出アッセイは実施例に記載されている。
【００６０】
多型変異体の一つに特異的なアレル-特異的プローブは、他の多型変異体のためのアレル-特異的プローブとよく併用される。実施態様によっては、プローブは固相支持体上に固定され、個体の標的配列は両プローブを同時に使用して解析される。核酸アレイの実施例は、WO 95/11995号に記載されている。同一の又は異なったアレイを特徴的な多型の解析に用いることができる。WO 95/11995号は、特性を示す前の多型の変異体の検出に最大限利用できるサブアレイについても記載している。かかるサブアレイは、本明細書で記載したPro12Ala及び／又はVN102多型の存在の検出に用いることができる。
【００６１】
アレル-特異的プライマー
多型はまた、一般的に、アレル-特異的増幅法又はプライマー伸張法を用いて検出される。これらの反応は典型的には、プライマーの3’末端のミスマッチを介して多型を特異的に標的するように設計されているプライマーの使用を含む。ポリメラーゼがエラー修正作用を減少している場合に、ミスマッチの存在は、プライマーを伸張するポリメラーゼの能力に影響を与える。例えば、アレル-特異的増幅-又は伸張-系の方法を用いてアレル配列を検出するためには、3’末端ヌクレオチドが多型位置でハイブリダイズするように、Pro12Ala多型のCアレル（又はGアレル）に相補的なプライマーが設計される。具体的アレルの存在は、プライマーの伸張開始能力によって決定することができる。3’末端がミスマッチである場合、伸張は妨げられる。従って、例えばプライマーが3’末端のヌクレオチドにマッチするならば、当該プライマーは効率よく伸張される。
【００６２】
典型的には、プライマーは増幅反応において第二のプライマーと併用することができる。第二のプライマーは、多型位置に関連しない部位でハイブリダイズする。増幅は、2種のプライマーから進行し、特定のアレル体の存在を示す検出可能な産物を与える。アレル-特異的増幅-又は伸張-系の方法は、例えばWO 93/22456号；米国特許第 5,137,806号明細書；同 5,595,890号明細書；同 5,639,611；及び同 4,851,331号明細書に記載されている。
【００６３】
アレル-特異的増幅-系ゲノタイピングを用いる場合、アレルの同定は増幅された標的配列の存在又は非存在を検出すればよい。増幅された標的配列の検出のための方法は、当該分野で周知である。例えば、記載したゲル電気泳動及びプローブハイブリダイゼーションアッセイは、核酸の存在を検出するために頻繁に用いられる。
【００６４】
別のプローブをほとんど使用しない方法、すなわち増幅された核酸を反応混合物中の二本鎖DNAの総量の増加を追跡することによって検出する方法は、例えば米国特許第 5,994,056号；欧州特許出願公開第 487,218号及び同 512,334号に記載されている。二本鎖標的DNAの検出は、二本鎖DNAに結合されている場合に様々なDNA-結合色素、例えばSYBR Greenが示す蛍光増加量に基づく。
【００６５】
当業者であれば当然のことであるが、アレル-特異的増幅法は、特定のアレルを標的とする多アレル-特異的プライマーを採用する反応で実施することができる。かかるマルチプレックス適用のためのプライマーは、アレルから産生された増幅産物がサイズによって識別できるように、一般的に識別可能な標識で標識化されるか又は選択される。従って、例えば単一試料中の2種のアレルは、増幅産物のゲル解析による一本鎖増幅法を用いて同定することができる。
【００６６】
アレル-特異的プローブの場合には、アレル-特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、ハイブリダイズ領域中の多型アレルの一つに厳密に相補的であるか、又はオリゴヌクレオチドの3’末端以外の位置にミスマッチ、このミスマッチは2種のアレル配列の非-多型部位に生じる、をいくつか有していてもよい。
【００６７】
5’-ヌクレアーゼ アッセイ
ゲノタイピングは、米国特許第 5,210,015号明細書；同 5,487,972号明細書；及び同 5,804,375号明細書；及びHollandら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280記載されているように、「TaqMan（登録商標）」又は「5’-ヌクレアーゼアッセイ」を用いて実施することができる。TaqMan（登録商標）アッセイでは、増幅された領域内でハイブリダイズする標識検出プローブは、増幅反応中に添加される。プローブは、当該プローブがDNA合成のためのプライマーとして働かないように修飾される。増幅は、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて実施される。増幅の各合成ステップでは、伸張されるプライマーから下流の標的核酸にハイブリダイズする任意のプローブは、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。従って、新しい標的鎖の合成は、結果としてプローブの分解にもなり、分解産物の蓄積は標的配列の合成の指標となる。
【００６８】
ハイブリダイゼーションプローブは、SNPアレル類を識別するアレル-特異的プローブでもよい。あるいは、当該方法は、アレル-特異的プライマー及び増幅産物に結合する標識プローブを用いて実施することができる。
【００６９】
分解産物を検出するための好適な任意の方法は、5’ヌクレアーゼアッセイで使用することができる。検出プローブは、一般的には、2種の蛍光色素で標識化され、そのうちの一つは他の色素の蛍光を抑えることができる。色素は当該プローブに結合され、好ましくは一つが5’末端に、他方が内側部位に結合される。その結果、当該プローブはハイブリダイズしていない状態にあり、かつDNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によってプローブの開裂が当該2種の色素間で起こる。増幅は、色素間でブローブの開裂を招き、同時に停止の消去が起こり、最初の停止色素から蛍光の増加が観察できる。分解産物の蓄積は、反応中の蛍光の増加量を測定することによって追跡できる。いずれも本明細書に参考として援用されている米国特許第 5,491,063号明細書及び同 5,571,673号明細書は、増幅と同時に生じるプローブの分解の代替的検出方法を記載している。
【００７０】
DNA塩基配列決定及び一塩基伸張
PPARγ2SNPsは直接塩基配列決法によっても検出することができる。方法は、例えばジデオキシ塩基配列系方法及びマキサム・ギルバート塩基配列決定法等のその他の方法を含む（例えばSambrook及びRussel, supraを参照）。
【００７１】
他の検出方法は、オリゴヌクレオチド-長産物のピロシークエンシング(Pyrosequencing)（登録商標）を含む。かかる方法は、PCR等の増幅方法を頻繁に採用する。例えば、ピロシークエンシングにおいては、塩基配列決定するプライマーは、一本鎖鎖、PCR-増幅産物、DNA鋳型にハイブリダイズし；酵素すなわちDNAポリメラーゼ、ATPスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ及びアピラーゼ、及び基質すなわちアデノシン5’ホスホサルフェート(APS)及びルシフェリンでインキュベートされる。まず、4種のデオキシヌクレオチド トリホスフェート(dNTP)が反応に添加される。DNA鎖が鋳型鎖中の塩基に相補的である場合には、DNAポリメラーゼは、デオキシヌクレオチド トリホスフェートのDNA鎖への取り込みを触媒する。各取り込み事象は、取り込まれたヌクレオチドに等モルの量でのピロホスフェート(PPi)の放出を伴う。ATPスルフリラーゼは、アデノシン5’ホスホサルフェートの存在下でPPiをATPに定量的に変換する。このATPは、ATPの量に比例した量で可視光線を生じるルシフェリンからオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ-介在変換を駆動する。ルシフェラーゼ-触媒化反応で生成する光は、電荷結合素子(CCD)カメラによって検出され、ピログラム(program)（登録商標）のピークとして見られる。各光シグナルは、取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。アピラーゼはヌクレオチド分解酵素であるが、取り込まれなかったdNTPs及び過剰のATPを継続的に分解する。分解が完全である場合には別のdNTPが添加される。
【００７２】
SNPsを特徴付ける別の類似の方法は、完全なPCRの使用を必要としないが、典型的には、検索されるヌクレオチドに相補的な一本鎖の蛍光-標識ジデオキシリボ核酸分子(ddNTP)によるプライマーの伸張のみを用いる。多型部位のヌクレオチドは、一塩基だけ伸張されたものであって、蛍光標識されたプライマーの検出によって同定することができる(例えば、Kobayashiら, Mol. Cell. Probes, 9: 175-182, 1995)。
【００７３】
変性勾配ゲル電気泳動
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成した増幅産物は、変性勾配ゲル電気泳動を用いて解析することができる。異なったアレルは異なった配列に依拠した融解性及び溶液中のDNAの電気泳動に基いて同定することができる(例えば、Erlich編, PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, W. H. Freemanら, New York, 1992, 第7章を参照されたい)。
【００７４】
一本鎖-高次構造多型解析
標的配列のアレルは、例えばOritaら, Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2770 (1989)に記載されているように、一本鎖PCR産物の電気泳動の変化によって塩基の相違を同定する、一本鎖-高次構造多型解析を用いて識別することができる。増幅PCR産物は、上記のようにして得ることができるが、加熱又は分解して一本鎖の増幅産物を形成することができる。一本鎖核酸は、その塩基配列に部分的に依拠した二次構造を再び折り重ねるか又は形成する。一本鎖増幅産物の異なった電気泳動の挙動は、標的のアレル間の塩基配列の相違に関連する。
【００７５】
SNP検出法は、標識オリゴヌクレオチドを採用することが多い。オリゴヌクレオチドは、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的又は化学的な手段によって検出可能な標識を取り込むことによって標識化することができる。有用な標識は蛍光色素、放射活性標識、例えば32P、電子密度試薬、ペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ等の酵素、ビオチン、又はハプテン及び抗血清又はモノクローナル抗体が利用できる蛋白質を含む。標識技術は当該分野で周知である(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, supra; Sambrook及びRussell, supraを参照されたい)。
【００７６】
＜蛋白質変異体の検出＞
ProAla多型は、位置12にPro又は位置12にAlaを有するPPARγ2ポリペプチド変異体を生じる。従って、当該変異体アレルは、2種の変異体蛋白質を識別する方法によって検出することもできる。これらの方法は、一般的に、変異体アレルによってコードされる蛋白質に特異的な抗体を使用する。
【００７７】
適用可能な技術の一般的な概要は、Harlowo及びLane, Abtibodies: A Laboratory Manual (1988)、及びHarlow及びLane, Using Antibodies (1999)に見られる。アレル変異体と特異的に反応するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者に周知である(例えば、Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow及びLane, supra; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (第2版, 1996);及びKohler及びMilstein, Nature 256: 495-497 (1975)参照)。かかる技術は、ファージ又は類似のベクターの組み換え抗体のライブラリーから抗体を選択することによる抗体の調製、及びウサギ又はマウスを免疫することによるポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製を含む(例えば、Huseら, Science 246: 1275-1281 (1989); Wardら, Nature 341: 544-546 (1989)を参照されたい)。
【００７８】
変異体アレルは、様々な免疫アッセイ法によって検出することができる。免疫学的方法及び免疫アッセイ法の概要についてはBasic and Clinical Immunology (Sites及びTerr編, 第7版, 1991)を参照されたい。更に、本発明の免疫アッセイは、Enzyme Immunoassay (Maggio編, 1980);及びHalow及びLane, supraに専ら記載されている任意の様々な構成で実施することができる。一般的な免疫アッセイの概要に関しては、Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, 第37巻 (Asai編, 1993); Basic and Clinical Immunology (Sites及びTerr編, 第7版, 1991)を参照されたい。
【００７９】
＜分析の記録＞
女性又は男性ついて多型の存在を解析することができる。解析は任意の年齢で行うことができる。アレル頻度は特定の群で変動する。典型的には、白人群は最も高いAlaアレル頻度(約12％)を有する。
【００８０】
当業者であれば理解できることがあるが、本発明の方法は、骨粗鬆症等の骨密度疾患の傾向を検出するためのその他の解析法と組み合わせて用いることができる。実施態様によっては、例えば患者が骨粗鬆症の付加的な危険因子を呈する場合には、当該方法は骨密度を評価する追加のステップを含むことができる。
【００８１】
本発明の方法は、典型的には、骨密度の疾患の傾向に関連するSNPsの存在を記録することを含む。この情報は、コンピュータ読み取り可能な形式に記憶させることができる。かかるコンピュータ装置は、典型的には、中央処理装置、システムメモリ(典型的にはRAM)、インプット/アウトプット(I/O)コントローラ等の主なサブシステム、表示アダプターを介する表示画面、シリアルポート、キーボード、貯蔵インターフェースを介する固定ディスクドライブ及びフロッピー（登録商標）ディスクを受け取るために有効なフロッピー（登録商標）ディスクドライブ、及びCD-ROMを受け取るために有効なCD-ROM(又はDVD-ROM)装置を含む。シリアルポートに接続されたネットワークインターフェース等の多くの他の装置を接続することができる。
【００８２】
コンピュータ装置は、イーサーネットケーブル(coax又は10BaseT)、電話線、ISDN線、無線ネットワーク、光ファイバ、又はその他の好適なシグナル送信媒体等のデータ連結を介して連結された多数のコンピュータ装置を含むネットワークに連結することができ、それによって、少なくとも一つのネットワーク装置(例えばコンピュータ、ディスク配列等)が磁気ドメインの形態(例えば磁気ディスク)及び／又は本発明のアレイから得られるビット・パターン コーディングデータから成る電荷ドメイン(例えばDRAMセルのアレイ)を含むことができる。
【００８３】
コンピュータ装置は、PPARγ2多型Pro12Ala及びVN102多型アレルを評価する遺伝子研究の結果を翻訳するためのコードを含むことができる。実施態様によっては、コンピュータ装置はまた、COL1A1イントロン1 Sp1結合部位多型を評価する遺伝子型研究の結果を翻訳するためのコードを含むことができる。従って、具体的実施態様では、遺伝子型の結果は、中央処理装置が、骨密度の減少を含む症状の高い危険性又は低い危険性の傾向を測定するためのコンピュータプログラムを実行するコンピュータに提供される。
【００８４】
本発明は、次のものを含む上記のようなコンピュータ装置の使用を提供する：(1)コンピュータ；(2)コンピュータに内蔵された、本発明の方法によって得られる遺伝子型特定結果をコードする貯蔵ビット・パターン；(3)及び場合により(4)骨密度の減少に関連する疾患の危険性を測定するプログラム。
【００８５】
＜方法＞
本発明の一実施態様は、個体の骨粗鬆症発症傾向を測定する方法であって、当該方法が以下のステップ：
a)個体試料中のホモ接合体PPARγPro12アレル又はホモ接合体PPARγVN102「G」アレルの存在を検出こと；及び
b)ホモ接合体PPARγPro12アレル又はホモ接合体PPARγVN102「G」アレルが存在する場合に、骨粗鬆症の高い危険性の分析を記録すること
を含む、前記方法である。
【００８６】
更なる実施態様は、骨粗鬆症を発症する個体の傾向を検出する方法であって、当該方法が以下のステップ：
a)個体中のホモ接合体PPARγPro12アレル又はホモ接合体PPARγVN102「G」アレルの存在を検出すること；及び
b)骨粗鬆症の高い危険性の分析を記録すること
を含む、前記方法である。
【００８７】
上記方法は、COL1A1イントロン1 Sp1部位「T」アレルが個体由来の試料中に存在するか否かを測定するためのステップを更に含むことができる。
【００８８】
好ましくは、上記方法では、分析はコンピュータ読み取り可能な形式上で記録される。
【００８９】
上記方法では、Pro12アレルは、個体由来のゲノムDNA試料中のPPARγ2のPro12をコードするコドンの位置1のCヌクレオチドの存在を測定することによって検出することができる。好ましくは、当該ゲノムDNA試料は血液から取得される。
【００９０】
更に好ましくは、Cヌクレオチドの存在を測定するステップは、増幅反応を含むことができる。最も好ましくは、当該増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応である。
【００９１】
増幅反応は、Proアレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチド及びAlaアレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて実施することができる。アレル-特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号1及び2で示されるプライマー配列を含むことができる。更に、増幅反応は、増幅産物と、Proアレル又はAlaアレルに特異的に結合する標識プローブとをハイブリダイズするステップを含む。
【００９２】
好ましくは、上記方法では、VN102アレルは個体からゲノムDNAを検出することができる。好ましくは、当該ゲノムDNA試料は血液から取得できる。
【００９３】
更に好ましくは、VN102アレルの存在を測定するステップは増幅反応を含む。最も好ましくは、増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応である。増幅反応は「G」アレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチド及び「A」アレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて実施することができる。アレル-特異的オリゴヌクレオチドは配列番号4及び5で示されるプライマー配列を含むことができる。
【００９４】
更に、増幅反応は、増幅産物と、Gアレル又はAアレルに特異的に結合する標識プローブとをハイブリダイズするステップを含むことができる。
【００９５】
好ましくは、上記方法のいずれにおいても個体は女性である。また好ましくは、上記方法のいずれにおいても個体は白人である。全てのこれらの方法は、個体上で骨密度試験を実施するステップを更に含むことができる。
【００９６】
＜キット＞
本発明はまた、本方法を実施するための有用な成分を含むキットを提供する。実施態様によっては、キットは、場合により好適な支持膜に固定され得るアレル-特異的検出プローブを含む。かかるキットは、多型部位を含むPPARγ2遺伝子座の領域を増幅するための増幅プライマーを含むこともできる。更に、キットは、本明細書に記載のSp1多型イントロン1を検出するために、COL1A1遺伝子領域を増幅するためのプライマーを含むことができる。あるいは、有用なキットは、多型アレルの特定の増幅のためのアレル-特異的プライマーを含むプライマーセットを含むことができる。かかるキットはまた、増幅産物の検出のためのプローブを含んでもよい。
【００９７】
キットのその他の任意の成分は、患者の遺伝子型を特定するために用いられる追加の試薬を含む。例えば、キットはポリメラーゼ、基質ヌクレオチド三リン酸、核酸を標識し及び／又は検出するための手段（例えば、標識がビオチンの場合には、アビジン-酵素複合体及び酵素基質、及びクロモーゲン）、増幅又はハイブリダイゼーション反応のための好適な緩衝液、及び本法を実施するための機器を含むことができる。
【実施例】
【００９８】
種々の公知のPPARγSNPs（図１）を、骨粗鬆症との関連のために選別した。２個のSNPsを股関節部骨折の危険性と関連すると評価した。更に、当該SNPsが、COL1A1 Sp1多型と相互作用して、PPARγ及びCOL1A1-骨粗鬆症-関連遺伝子型が存在する場合に、危険性がより高まると評価した。相互作用は、脊椎骨折及び低骨量密度（BMD）上のPPARγ遺伝子及びCOL1A1遺伝子型間で観察された。
【００９９】
実施例１.  骨粗鬆症の高い危険性とPro12Ala多型との関連の検出
Pro12Ala多型と骨粗鬆症の危険性との関連付けは、老年女性のアメリカ人患者群における多型の存在を評価することによって実行した。患者のゲノムDNA試料は、対照試料及び股関節部骨折、脊椎骨折及び／又は低骨量密度（BMD）の老年女性由来の試料を含む。PPARγ2における一塩基多型を任意の当該遺伝子型と関連付けて選別した。
【０１００】
「C」及び「G」アレルの存在の解析は、PCRにおけるアレル-特異的オリゴヌクレオチドを用いて実施した。第一アレルを検出するためのアレル-特異的プライマーは、5’-GAAGGAATCGCTTTCTGG-3’（配列番号：1）である。第二アレルを検出するためのアレル-特異的プライマーは、5’-GAAGGAATCGCTTTCTGC-3’（配列番号：2）である。プライマーの問い合わせ位置は、3’末端である。PPARγ2の標的領域を増幅するために使用した一般的プライマーは、5’-GGTGAAACTCTGGGAGATTCTCCTA-3’（配列番号：3）である。PCRは58℃のアニーリング温度で実施した。プライマーは0.2μMの濃度であった。反応は、10 mM Tris HCl pH 8.0; 3 mM MgCl2; 50 μMの各dATP, dCTP及びdGTP; 25 μM dTTP; 75 μM dUTP, 0.1U UNG, 4% DMSO, 2% グリセロール; 0.2X SYBR Green; 6U CEA2 Gold Polymerase;及び3.5-10 ngのヒトゲノムDNAを含む混合物中で、50μlの体積で行った。反応は、50℃で2分間、95℃で12分間の初期インキュベーションを用い；次いで、95℃で20秒間、58℃で20秒間を45サイクルによって実施した。
【０１０１】
股関節部骨折とアレルとの関連は、p-値0.06とオッズ比1.45を有するSNP Pro12Ala（本明細書ではSNP 2とも言われる）（OMIM 60147.0002）に関するPPARγ遺伝子中に見られた。年齢、体重及びエストロゲン使用を調整すると、Pro12Alaとの関連は、p-値0.02とオッズ比1.76であった。結果の概略を図２に示す。
【０１０２】
実施例２.  骨粗鬆症の高い危険性とVN102多型との関連の検出
VN102多型と骨粗鬆症の危険性との関連付けは、上で解析した老年女性のアメリカ人患者群における多型の存在を評価することによって実行した。
【０１０３】
「G」及び[A]アレルの存在の解析は、PCRにおいてアレル-特異的オリゴヌクレオチドを用いることによる実施することができる。第一のアレルを検出するためのアレル-特異的プライマーは、5’-GTCTTGGGCCTTTAGGAG-3’(配列番号:4)である。第二のアレルのためのアレル特異的プライマーは、5’-GTCTTGGGCCTTTAGGAA-3’（配列番号:5）である。プライマーの問い合わせ位置は、3’末端である。PPARγ2の標的領域を増幅するために用いる一般的プライマーは、5’-GGCACTGTTTCTCTGTTAAAAATGTG-3’（配列番号:6）である。PCRは58℃のアニーリング温度で実施した。プライマーは0.2 μMの濃度であった。反応は、10 mM tris HCl pH8.0; 3 mM MgCl2; 50μMの各dATP, dCTP及びdGTP;及び25 μM dTTP; 75 μM dUTP; 0.1U UNG, 4% DMSO, 2% グリセロール; 0.2 X SYBR Green; 6U CEA2 Gold（登録商標）ポリメラーゼ;及び3.5-10 ngのヒトゲノムDNAを含む混合物中で50 μlの体積で実施した。反応は50℃で2分間、95℃で12分間の初期インキュベーションの後、95℃で20秒間及び58℃で20秒間を45サイクル行うことによって実施した。
【０１０４】
アレルと股関節部骨折との関連は、p-値0.04及びオッズ比1.51を有するSNPVN102(rs1899951)に関するPPARγ遺伝子で発見された。年齢、体重及びエストロゲン使用を調整すると、VN102との関連性はp-値0.01及びオッズ比1.85であった。当該発見の概略を図2に示す。
【０１０５】
実施例３.  Pro12Ala又はVN102多型とCOL1A1多型との相乗効果-骨粗鬆症の高い危険性の検出
COL1A1遺伝子のイントロン1のSp1結合部位における「G」から「T」への変異は、ヒトの骨塩密度(BMD)の減少に関連すると報告されている。Pro12Ala又はVN102多型とCOL1A1の当該変異との組み合わせと、骨粗鬆症の危険性との関連付けは、上で解析された老年の女性のアメリカ人患者の同一群における当該多型の存在を評価することによって実行した。
【０１０６】
「G」及び／又は「T」アレルの存在の解析は、PCRにおいてアレル-特異的オリゴヌクレオチドを用いて実施した。第一のアレルを検出するためのアレル-特異的プライマーは、5’-CTGCCCAGGGAATGG-3’（配列番号:7）である。第二のアレルのためのアレル-特異的プライマーは、5’-CCTGCCCAGGGAATGT-3’（配列番号:8）である。プライマーの問い合わせ位置は3’末端である。COL1A1の標的領域を増幅するために用いる一般的プライマーは、5’-AAGGGAGGTCCAGCCCTCAT-3’（配列番号:9）である。PCRは58℃のアニーリング温度で実施した。プライマーは0.2 μMの濃度であった。反応は、10 mM tris HCl pH8.0; 3 mM MgCl2; 50μMの各dATP, dCTP及びdGTP;及び25 μM dTTP; 75 μM dUTP; 1U UNG, 4% DMSO, 2% グリセロール; 0.2 X SYBR Green; 6U CEA2 Gold（登録商標）ポリメラーゼ;及び3.5〜10 ngのヒトゲノムDNAを含む混合物中で50 μlの体積で実施した。反応は50℃で2分間、95℃で12分間の初期インキュベーションの後、95℃で20秒間及び58℃で20秒間を45サイクル行うことによって実施した。
【０１０７】
相乗効果は、脊椎骨折及び低BMDについて、PPARγ及びCOL1A1遺伝子型間で観察された(年齢、体重及びエストロゲン使用を調整すると、それぞれP=0.009及び0.002)。年齢、体重及びエストロゲン使用を調整したCOL1A1危険性アレルを有する女性では、Pro/Pro遺伝子型に関する脊椎骨折の危険性が3倍に増加した(OR=2.9, p=0.01)。高い危険性はまた他の2種の骨粗鬆症表現型についても観察された。同一の効果は、PPARG＿VN102についても観察された。当該データは、PPARγ及びCOL1A1間の新規な遺伝子座間関連と、老齢の白人女性の骨粗鬆症に対する遺伝的感受性を示唆するものである。この発見の概略を図2に示す。
【０１０８】
あたかも個々の刊行物又は特許出願がそれぞれ参考として援用されるように特定して指示されている又は個別に指示されているように、本明細書に引用された全ての刊行物、特許、受託番号及び特許出願は、参考として本明細書に援用されている。
【０１０９】
先述の発明は理解を明瞭にする目的で例証及び実施例として詳細に記載されているが、添付の特許請求の精神又は範囲から離れることなく、ある変更や修正が可能であることが当業者には本発明の教示から容易に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、骨粗鬆症との関連について選別された種々の公知のPPARγSNPsを示す。
【図２】図２は、エキソン1C-G多型(Pro12Ala)及び症状、例えば股関節部骨折とのその関連の解析；イントロン1、G-A多型(VN102)と症状、例えば股関節部骨折とのその関連の解析；並びに、PPARγとCOL1A1多型の解析のための、遺伝子型の結果を要約したものである。
【図１】
2006014738.tif 000002
【図２】
2006014738.tif 000003
【配列表】
2006014738000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月23日(2005.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の骨粗鬆症発症傾向を測定する方法であって、当該方法が以下のステップ：
個体試料中のホモ接合体PPARγPro12アレル又はホモ接合体PPARγVN102「G」アレルの存在を検出し；及び
ホモ接合体PPARγPro12アレル又はホモ接合体PPARγVN102「G」アレルが存在する場合に、骨粗鬆症の高い危険性の分析を記録する、
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
COL1A1イントロン1 Sp1サイトである「T」アレルが個体試料中に存在するか否かを評価するステップを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記Pro12アレルが、個体由来のゲノムDNA試料におけるPPARγ2のPro12をコードするコドンの位置１のCヌクレオチドの存在を測定することによって検出される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
Cヌクレオチドの存在を測定する前記ステップが、増幅反応を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記増幅反応が、Proアレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチド及びAlaアレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて実施される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記アレル-特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号１及び２で示されるプライマー配列を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記VN102アレルが、個体由来のゲノムDNA試料中に検出される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
VN102アレルの存在を測定する前記ステップが、増幅反応を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記増幅反応が、「G」アレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチド及び「A」アレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて実施される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記アレル-特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号４及び５で示されるプライマーセットを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
a)Pro12Ala多型又はVN102多型に関する個体の遺伝子型を表示するデータコード；
b)当該遺伝子型を表示するデータを用いて、当該遺伝子型が、高い危険性と骨粗鬆症とを関連付けられるか否かを評価するためのコード、
を含む、コンピュータ読み取り可能媒体。
【請求項１２】
個体の骨粗鬆症発症傾向を測定する方法であって、当該方法が、
ホモ接合体PPARγアレルがPPARγPro12アレル又はPPARγVN102「G」であるホモ接合体PPARγアレルの個体試料の存在を検出すること；及び
COL1A1「T」アレルの存在又は非存在を検出すること；
ここで、ホモ接合体PPARγアレルの存在及びCOL1A1「T」アレルの存在は、ホモ接合体PPARγアレル又はCOL1A1「T」アレルのみの検出に比べて骨粗鬆症の高い危険性の指標であることを示す、
を含む、前記方法。
【請求項１３】
a)Pro12Ala多型又はVN102多型に関する個体の遺伝子型を表示するデータコード；
b)COL1A1イントロン1 Sp1部位多型に関する個体の遺伝子型を表示するデータコード；及び
c)遺伝子型を表示する当該データを使って、当該遺伝子型が骨粗鬆症の危険性の増加と関連付けられるか否かを決定するコード、
を含むコンピュータ読み取り可能媒体。
【請求項１４】
個体の骨粗鬆症発症傾向を測定するキットであって、当該キットが、
−Pro12アレルのためのアレル特異的オリゴヌクレオチド及びPPARγ2のAlaアレルのためのアレル-特異的オリゴヌクレオチドを含む増幅プライマーセット、
−増幅用緩衝液
を含む、前記キット。
【請求項１５】
個体の骨粗鬆症発症傾向を測定するキットであって、当該キットが、
−PPARγ2 VN102「G」アレルのためのアレル特異的オリゴヌクレオチド及びPPARγ VN102「G」アレルのためのアレル特異的オリゴヌクレオチドを含む増幅プライマーセット、
−増幅用緩衝液
を含む、前記キット。
【外国語明細書】
2006014738000001.pdf