(57)【要約】      （修正有）【課題】α−グルクロニダーゼ活性に基づいた酵素製品の分離方法、それによって得られる酵素、及びその酵素による植物細胞壁及び／又は樹液由来多糖の分解組成物を提供する。【解決手段】ヘミセルラーゼ活性とα−グルクロニダーゼ活性を有する酵素製品を限外濾過処理によってα−グルクロニダーゼ活性を有する酵素とα−グルクロニダーゼ活性を有さない酵素に分離することを特徴とする。植物細胞壁及び／又はは樹液多糖を、前記α−グルクロニダーゼ活性を有する酵素又は前記α−グルクロニダーゼ活性を有さない酵素によって分解することによって得られる分解組成物である。前記α−グルクロニダーゼ活性を有さない酵素による分解組成物の一例はキシロトリオースにグルクロン酸又は４−Ｏ−メチルグルクロン酸が１個結合した４量体を最小単位とし、平均重合度が４〜１０である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘミセルラーゼ活性とα−グルクロニダーゼ活性を有する酵素製品を、限外濾過処理によってα−グルクロニダーゼ活性を有する酵素とα−グルクロニダーゼ活性を有さない酵素に分離することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によって得られることを特徴とするα−グルクロニダーゼ活性を有する酵素。
【請求項３】
請求項１に記載の方法によって得られることを特徴とするα−グルクロニダーゼ活性を有さない酵素。
【請求項４】
植物細胞壁及び／又は樹液由来多糖を、請求項２に記載のα−グルクロニダーゼ活性を有する酵素によって分解することによって得られることを特徴とする分解組成物。
【請求項５】
植物細胞壁及び／又は樹液由来多糖を、請求項３に記載のα−グルクロニダーゼ活性を有さない酵素によって分解することによって得られることを特徴とする分解組成物。
【請求項６】
キシロトリオースにグルクロン酸又は４−Ｏ−メチルグルクロン酸が１個結合した４量体を最小単位とすることを特徴とする請求項５に記載の分解組成物。
【請求項７】
平均重合度が４〜１０であることを特徴とする請求項６に記載の分解組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−グルクロニダーゼ活性に基づいた酵素製品の分離方法、それによって得られる酵素、及びその酵素による植物細胞壁及び／又は樹液由来多糖の分解組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活習慣病の予防や美容のための健康機能食品の需要が年々高まっている。その素材の多くは、自然界に存在しているものを抽出、精製したもの、あるいは分解や酵素合成などのごく簡単な加工をしたものである。
【０００３】
例えば、体内の消化液の分解を免れて大腸に到達し、大腸中の腸内細菌叢に資化されて、お腹の調子を整える働きを持つ、難消化性オリゴ糖は、元々、消化液で分解されにくい成分の抽出物か（特許文献１参照）、消化液で分解されにくい細胞壁多糖や樹液由来多糖（特許文献２、特許文献３参照）、あるいは澱粉や乳糖、砂糖等消化吸収されるものを、酵素合成を用いて消化されにくい構造に変えたもの（特許文献４、特許文献５、特許文献６参照）である。
【０００４】
抽出物には大豆オリゴ糖やラクチュロース、分解物にはセロオリゴ糖、キシロオリゴ糖、アラビノキシロオリゴ糖、アラビノガラクトオリゴ糖、アラビノオリゴ糖、ガラクトマンノオリゴ糖、グルコマンノオリゴ糖、マンノオリゴ糖、キチン・キトサンオリゴ糖などであり、酵素合成物にはイソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖等がある。
【０００５】
難消化物の分解処理には、酸処理や酵素処理が用いられる。分解する酵素としては、分解する原料によって、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、キチナーゼ等が用いられる。市販酵素の多くは複合酵素であり、例えばセルラーゼとして販売されているものでも、多少のヘミセルラーゼ活性を有するのが普通である。また、果汁など濁り防止目的で用いられるペクチナーゼ中にもアラビノシダーゼが含まれることも多い。
【０００６】
植物細胞壁多糖や樹液由来多糖、例えばコーンファイバーやビートファイバー、アラビアガム等はその構成成分中にグルクロン酸やフェノール酸等のような弱酸性の成分を有する。従って、酸や酵素でこうした多糖を分解しオリゴ糖を製造した場合、その中には、弱酸性成分を構成成分中に含む画分（酸性オリゴ糖）と含まない画分（中性オリゴ糖）が混合して存在することになる。中性オリゴ糖にはセロオリゴ糖、キシロオリゴ糖、アラビノキシロオリゴ糖、アラビノガラクトオリゴ糖、アラビノオリゴ糖、ガラクトマンノオリゴ糖、グルコマンノオリゴ糖、マンノオリゴ糖等があり、酸性オリゴ糖にはα−グルクロノキシロオリゴ糖、α−グルクロノガラクトオリゴ糖、α−グルクロノアラビノオリゴ糖、フェラリックアラビノオリゴ糖等がある。植物細胞壁多糖や樹液由来多糖に酸性成分を遊離する活性を持っている酵素例えばグルクロニダーゼやエステラーゼなどを作用させると、酸性成分であるグルクロン酸やフェルラ酸のみが単体で遊離し、オリゴ糖は中性化することになる。従って、中性オリゴ糖を多く生産したい場合には、酸性成分を遊離する活性を多く有する酵素を作用させることが望ましく、また、酸性オリゴ糖を多く生産したいときには酸性成分を遊離する活性をできるだけ含まない酵素を作用させるのが望ましい。
【０００７】
しかし、市販されている酵素には、中性成分をオリゴ糖化する活性と酸性成分を遊離する活性の両方を持つことが多く、その使い分けが極めて困難であった。特にα−グルクロニダーゼについては、報告も少なく（特許文献７参照）、α−グルクロニダーゼとして市販されているものもなかった。
【特許文献１】特開平３−２８７５９４号公報
【特許文献２】特開平２−１００６９４号公報
【特許文献３】特開平４−３０９５０１号公報
【特許文献４】特開昭６１−２１９３４５公報
【特許文献５】特開平３−２９０１９７号公報
【特許文献６】特開昭６２−１４７９２号公報
【特許文献７】特表２００２−５１０４８５公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は市販の酵素製品を簡易な方法で精製分離してα−グルクロニダーゼを有する酵素と有さない酵素を提供すること、及びかかる各酵素によって得られる植物細胞壁及び樹液由来多糖の分解組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、市販のヘミセルラーゼ分解酵素中に酸性成分を遊離する活性（α−グルクロニダーゼ活性）があり、それら酵素の分子量が大きく異なることを見出した。更にこの酵素を限外濾過処理することにより、酸性成分を遊離する活性（α−グルクロニダーゼ活性）を多く持つ酵素と、酸性成分を遊離する活性（α−グルクロニダーゼ活性）を全く持たない酵素に分離することが容易にできることを見出し、本発明を完成させるに到った。
【００１０】
即ち、本発明は、ヘミセルラーゼ活性とα−グルクロニダーゼ活性を有する酵素製品を、限外濾過処理によってα−グルクロニダーゼ活性を有する酵素とα−グルクロニダーゼ活性を有さない酵素に分離することを特徴とする方法である。
【００１１】
また、本発明は、前記方法によって得られることを特徴とするα−グルクロニダーゼ活性を有する酵素及びα−グルクロニダーゼ活性を有さない酵素である。
【００１２】
さらに、本発明は、植物細胞壁及び／又はは樹液多糖を、前記α−グルクロニダーゼ活性を有する酵素又は前記α−グルクロニダーゼ活性を有さない酵素によって分解することによって得られる分解組成物である。本発明の前記α−グルクロニダーゼ活性を有さない酵素による分解組成物の一例はキシロトリオースにグルクロン酸又は４−Ｏ−メチルグルクロン酸が１個結合した４量体を最小単位とし、平均重合度が４〜１０である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、極めて簡易な方法で市販の複合活性を有する酵素製品を原料として、α−グルクロニダーゼ活性の高い酵素とα−グルクロニダーゼ活性を全く持たない二つの酵素を生産し、更に、それぞれの酵素を有効に用いることで酸性オリゴ糖、中性オリゴ糖のいずれでも効率的に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において使用する酵素製品は、基本となる酵素の種類や品名は特に限定されるものではないが、ヘミセルラーゼ活性とα−グルクロニダーゼ活性の二つの活性を少なくとも有するものである。こうした市販酵素としては、セルラーゼＡ−アマノ、セルラーゼＴ−アマノ（以上、天野エンザイム）、セルラーゼＸＰ−４１５、セルラーゼＸＰ−４２５（以上、ナガセ生化学工業）、ビスコザイムＬ、ペクチネックス  ウルトラＳＰ−Ｌ、ウルトラフロＬ、セルクラスト（以上、ノボノルディスクインダストリー）、セルロシンＨＣ−１００、セルロシンＰＥ６０、セルロシンＰＥＬ（以上、阪急バイオインダストリー）、スミチームＸ、スミチームＣ、スミチームＡＣ４０、スミチームＡＲＳ、スミチームＸ、スミチームＰＸ（以上、新日本化学）、ドリセラーゼＫＳＭ（協和エンザイム）、ＧＯＤＯ−ＴＣＬ、ＧＯＤＯ  ＴＣＤ−Ｈ（以上、合同酒精）、セルラーゼＹ−ＮＣ、セルラーゼ  オノズカ（ヤクルト）等がある。これらの中では、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ  ｓｐ由来のヘミセルラーゼであるスミチームＸ（新日本化学）が好ましく使用できる。
【００１５】
本発明の方法では、酵素製品を分画分子量１〜１０万、望ましくは５万の膜で限外濾過することにより、α−グルクロニダーゼ活性を有する画分（酵素）を濃縮液として、α‐グルクロニダーゼ活性を有しない画分（酵素）を透過液として回収することができる。使用する限外濾過膜の素材や種類は特に限定されるものではないが、例えば素材としてはメンブランやセラミック等が挙げられ、種類としては平膜タイプ、中空紙タイプ等が挙げられる。
【００１６】
α−グルクロニダーゼ活性を有する画分（濃縮液）を作用させる基質は、その由来や状態に限定されるものではないが、側鎖にα−グルクロン酸を保持しているものである。望ましくは、植物細胞壁由来多糖や樹液由来多糖である。その由来として、例えば木質ヘミセルロース、小麦ふすま、コメ糠、コーンファイバー、ビートファイバー、アラビアガム等が挙げられ、また多糖として、例えばキシラン、アラビノキシラン、アラビノグルカン、アラビナン、アラビノガラクタン等が挙げられる。基質は酵素分解前に、先に挙げたものそのままでも良いが、酸、アルカリ、爆砕、蒸煮、超臨界処理等で前処理したものでも良い。また、基質原料中にセルロースを有する場合は、事前にセルロースを除去してもしなくても良い。除去方法としては、例えばアルカリ抽出処理、限定酸分解処理等がある。
【００１７】
α−グルクロニダーゼ活性を有する画分（濃縮液）を前述の基質に作用させた場合、グルクロン酸が遊離し、グルクロンを含まない中性オリゴ糖が効率的に製造される。
【００１８】
α−グルクロニダーゼ活性を有しない画分（透過液）を作用させる基質は、その由来や状態に限定されるものではないが、例えば主鎖にキシロースがβ（１，４）結合した構造を有するものである。この場合、側鎖にα−グルクロン酸を保持していてもしていなくても良い。望ましくは、植物細胞壁由来多糖であり、その由来として木質ヘミセルロース、小麦ふすま、コメ糠、コーンファイバー、また、多糖としてキシランやアラビノキシラン等が挙げられる。基質は酵素分解前に、先に挙げたものそのままでも良いが、酸、アルカリ、爆砕、蒸煮、超臨界処理等で前処理したものでも良い。また、基質原料中にセルロースを有する場合は、事前にセルロースを除去してもしなくても良い。除去方法としては、例えばアルカリ抽出処理、限定酸分解処理等がある。
【００１９】
α−グルクロニダーゼ活性を有しない画分（透過液）を、側鎖にα−グルクロン酸を保持していない基質に作用させた場合は、精製前よりも少量の酵素で、同様の収率の製品を得ることができる。
【００２０】
α−グルクロニダーゼ活性を有しない画分（透過液）を、側鎖にα−グルクロン酸を保持している基質に作用させた場合は、酸性オリゴ糖がグルクロン酸を１個以上有し、キシロースを３個以上有している。最小単位はキシロトリオースにグルクロン酸がα（１，２）結合した構造を持つ４量体である（図１参照）。なお、同酵素は、分離精製前（α−グルクロニダーゼ活性を有した状態）のものを用いても同じ組成のものを産生するが、側鎖のグルクロン酸を遊離するため、その製品収率は低くなる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２２】
（酵素の分離精製例）
市販ヘミセルラーゼであるスミチームＸ（新日本化学工業株式会社）を限外濾過装置ＵＦ−ＰＳのＵＦ−３０ＵＦ膜（分画分子量３０，０００）（東ソー株式会社）を用いて限外濾過処理を行った。原液の酵素と限外濾過処理後の各画分（濃縮液および透過液）を電気泳動分析したところ、原液で複数本見られていたバンドが限外濾過処理により、濃縮液は５万〜１０万にかけての幅広いバンドに変わった。また、透過液は３万弱のほぼ単一バンドを示す成分に精製されていた（図２参照）。
【００２３】
限外濾過処理後の各画分（濃縮後透過液）のタンパク回収率と酵素活性（ヘミセルラーゼ活性及びα−グルクロニダーゼ活性）の変化を表１に示す。表１から明らかなように、限外濾過による濃縮液のタンパク回収率は６３％であり、α−グルクロニダーゼ活性は原液の１．５倍であった。また、限外濾過による透過液のタンパク回収率は３７％であり、ヘミセルラーゼ活性は原液の２．０倍であり、かつα−グルクロニダーゼ活性は認められなかった。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
（酵素の作用例１）
トウモロコシの種皮を、特開平１１−３１３７００号公報に例示されている方法に従って酸分解した。具体的には、トウモロコシの種皮にシュウ酸を添加してｐＨを２付近に調整し、１３０℃で３０分〜３時間加圧分解して分解糖液を得た。得られた分解糖液を、活性炭処理し、イオン交換樹脂に通液し、さらに強酸型イオン交換樹脂による連続的クロマト分離により単糖成分を除去し、オリゴ糖組成物を得た（図３参照）。このオリゴ糖組成物の糖組成分析をＥｎｇｌｙｓｔ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｓｔ，１０７；３０７（１９８２）に記載の方法に準じて調べ、また、ウロン酸種をカルボジイミドによる還元反応で調べてグルクロン酸であることを確認した。グルクロン酸の定量はｍ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｄｉｐｈｅｎｙｌ法で行った（表２参照）。グルクロン酸の結合様式の検査のため、市販のβ−グルクロニダーゼを作用させたが、グルクロン酸の遊離は認められなかった（図４参照）。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
このオリゴ糖組成物に、スミチームＸ（新日本化学工業株式会社）を作用させると、グルクロン酸の遊離が認められた。次いで、前述の酵素の分離精製例で得られた各酵素画分（濃縮液および透過液）を作用させると、濃縮液を作用させたときのみグルクロン酸が遊離し、透過液を作用させたときにはグルクロン酸は遊離しなかった。
【００２８】
（酵素の作用例２）
トウモロコシの種皮を特開平１１−３１３７００号公報に例示されている方法に従って酸分解した。具体的には、トウモロコシの種皮にシュウ酸を添加してｐＨを２付近に調整し、１３０℃で３０分〜３時間加圧分解して分解糖液を得た。得られた分解糖液を、活性炭処理し、イオン交換樹脂に通液し、さらにＣａ型カチオン交換樹脂によるクロマト分離で単糖成分を分離除去し粗精製液を得た。この粗精製液を弱塩基型イオン交換樹脂に吸着させ、４％ＮａＣｌで脱離させて、高純度グルクロノキシロオリゴ糖（純度９９％以上）を得た。得られたグルクロノキシロオリゴ糖には若干（０．３％程度）のフェノール酸も認められた。
【００２９】
主鎖となるキシロオリゴ糖の平均重合度は４．１であり、これにグルクロン酸が平均で１．４個結合した構造を持っていた。これを基質とし、前述の酵素の分離精製例で分離した透過液（α−グルクロニダーゼが認められなかった画分）を過剰添加し、完全分解を行った（図５参照）。反応後に、透過液を再度添加しても分解がこれ以上進まないことを確認した。
【００３０】
こうして得られた分解糖液中には、グルクロン酸が結合した酸性成分と、酵素分解によりグルクロン酸が結合したフラグメントから遊離した中性成分が混在している。中性成分はＮａ型カチオン交換樹脂に通液して分離し、高純度の酸性成分を得た。ここで得られた酸性成分は、市販ヘミセルラーゼ（スミチームＸ（新日本化学））によるヘミセルラーゼ限界デキストリンであり、その限界はグルクロン酸の結合に起因する。
【００３１】
この限界デキストリンを、陰イオン交換ＨＰＬＣ（糖分析ＤＸ５００システム、分離カラムＣａｒｂｏｐａｋ  ＰＡ−１、Ｄｉｏｎｅｘ社）で分析すると、数種類の成分が混在することが認められた（図６参照）。このうち、酸性成分（グルクロン酸が結合した成分）は、単糖であるグルクロン酸より遅い溶出を示す。従って、グルクロン酸より遅く溶出した成分が酸性オリゴ糖である。図６中の成分のうちＦ１とＦ３は酵素分解で増加したが、Ｆ２は増加しなかった。そこでＦ１とＦ３を集めて詳細分析をしたところ、いずれもキシロースとグルクロン酸の比率が３：１であることが分かった。また、成分Ｆ１のキシロースの平均重合度は３であった。つまり、スミチームＸで分解して得られる酸性オリゴ糖の最小単位はキシロース３個にグルクロン酸が１個結合した３量体であった。分析手法の性質から、成分Ｆ１は図１の構造を持つものと判断された。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】市販ヘミセルラーゼによって得られる酸性オリゴ糖の基本構造を示す。
【図２】精製酵素の電気泳動の結果を示す。
【図３】酸性オリゴ糖の精製結果を示す。
【図４】酸性オリゴ糖のβ−グルクロニダーゼ分解によるグルクロン酸の遊離を示す。
【図５】酸性オリゴ糖の精製ヘミセルラーゼ（透過液）による限界分解の結果を示す。
【図６】酸性オリゴ糖の精製ヘミセルラーゼ（透過液）による限界分解物を示す。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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