(57)【要約】【課題】キャンディダ・ユティリスの形質転換において、薬剤の耐性マーカーとして用いることができ、効率よく目的遺伝子を選択できる、キャンディダ・ユティリス由来の遺伝子を提供する。【解決手段】キャンディダ・ユティリス染色体遺伝子由来の、約１．３ｋｂｐのＡＰ−１様転写活性化タンパク質をコードする遺伝子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャンディダ・ユティリス（Candida  utilis）由来のＡＰ−１様転写活性化タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
配列表配列番号１で表される、キャンディダ・ユティリス（Candida  utilis）由来のＡＰ−１様転写活性化タンパク質をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャンディダ・ユティリス（Candida  utilis）に外来遺伝子を導入して形質転換する際に利用される、キャンディダ・ユティリス由来のＡＰ−１様転写活性化タンパク質（以下、「ＹＡＰ１」とも略称する。）をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
キャンディダ・ユティリスは、炭素資化域が広く、好気的条件下での培養でエタノールを生成せず、その増殖阻害も受けないことから、高濃度での連続培養による菌体製造が可能であり、食飼料用のタンパク質源等として広く使用されているのみならず、グルタチオン等の生産株として広く工業的に利用されてきた。
【０００３】
組み換えＤＮＡ技術の発展によって、遺伝子を自在に改変しあるいは加工し、これを細胞に導入して遺伝子を組み換え、例えばその発酵特性の改良、工業的有用性の増大、などが行われており、種々の酵母で可能となってきた。
酵母の遺伝子操作、特に形質転換には、目的の遺伝子が挿入された酵母を選択するための選択マーカーが必要である。選択マーカーの一つとして、栄養要求性変異を付加しその相捕を基本にした栄養要求性マーカーがある。倍数性が低く栄養要求性変異株を取得しやすい実験室酵母サッカロミセス・セレビシェでは、主としてこのマーカーが使用されている。キャンディダ・ユティリスにおいても、二倍体細胞を用いてウラシル要求性を基にした形質転換系が報告されている（FEMS  Microbiol  Lett  1998  165  335）。しかし、実用酵母はそれ以上の高次倍数体の場合もあり、これら酵母に遺伝的変異により栄養要求性を付与することは困難である。また、変異の導入によって優良形質が失われる危険性も否定できない。従って、実用酵母の選択マーカーとしては、ドミナントで、かつ宿主細胞を選ばない薬剤耐性マーカーが望ましい。
【０００４】
酵母の形質転換に用いられる薬剤耐性マーカーとしては、バクテリア由来のＧ４１８耐性遺伝子（ｋａｎＭＸ）（Yeast  1994  10  1793）やハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）（Gene  1983  25  179）を始め、酵母由来のＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ（ＡＵＲ−１）（Mol  Gene  Genet  1996  251  236）、亜硫酸耐性遺伝子（ＦＺＦ１−４）（Curr  Genet  1999  36  339）、シクロヘキシミド耐性遺伝子（ｃｙｈ２）（Curr  Genet  1991  19  353）、ホルムアルデヒド耐性遺伝子（ＳＦＡ１）（Yeast  1997  13  551）など諸種の遺伝子が知られている。
安全性の高いセルフクローニングのベクターを構築する上では、宿主となる酵母細胞由来のマーカーが望まれているが、キャンディダ・ユティリスでは、リボゾームタンパク質であるＬ４１タンパク質を部分特異的変異法によりシクロヘキシミド耐性型に変換した薬剤耐性マーカーが知られているのみである（特許文献１）。
【０００５】
ＹＡＰ１は、酵母におけるＡＰ−１様タンパク質で、細胞毒性のある各種薬剤や酸化ストレスに応答して、細胞の保護や耐性獲得に関連する遺伝子をはじめ各種遺伝子群の発現を活性化する働きを有する。ＹＡＰ１を酵母細胞内で高発現させると、シクロヘキシミドやｓｕｌｆｏｍｅｔｕｒｏｎ、４−ｎｉｔｒｏｓｏ−２−ｎａｐｈｔｏｌ、４−ｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ、ｃｅｒｕｌｅｎｉｎなどさまざまな薬剤に耐性となることが知られている（Curr  Opinion  Genet  Dev  1999  9  55）。この性質を利用して、出芽酵母サッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces  cerevisiae）ではＹＡＰ１をマーカーとした形質転換系が報告されている（非特許文献１）。
ＹＡＰ１のホモログは、他の酵母、例えばスキゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）（非特許文献２）、クロペロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces  lactis）（非特許文献３）、キャンディダ・アルビカンス（Candida  albicans）（非特許文献４）などで既に取得されているが、キャンディダ・ユティリス（Candida  utilis）では未だ報告がない。
ＹＡＰ１をマーカーとした場合、シクロヘキシミドの他にもさまざまな薬剤で選択することも可能となるばかりでなく、野生型の遺伝子を用いている為、変異を導入した遺伝子の場合と異なり、相同組み換えにより変異遺伝子が野生型遺伝子へ変換する可能性もなくなることが期待される。
【特許文献１】ＷＯ９５／３２２８９号公報
【非特許文献１】Yeast  2002  19  17
【非特許文献２】Genes  Dev  1991  5  60
【非特許文献３】Mol  Gen  Genet  1997  257  62
【非特許文献４】J  Boil  Chem  1997  272  19304
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、かかる従来の問題点を解決することにあり、効率よく目的遺伝子を選択できる、キャンディダ・ユティリス由来のＡＰ−１様転写活性化タンパク質をコードする遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、キャンディダ・ユティリス由来のＡＰ−１様転写活性化タンパク質をコードした遺伝子をクローニングするため鋭意研究の結果、キャンディダ・ユティリスのゲノムから該タンパク質をコードする遺伝子断片のクローニングに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
（１）キャンディダ・ユティリス（Candida  utilis）由来のＡＰ−１様転写活性化タンパク質をコードする遺伝子、
（２）配列表配列番号１で表される、キャンディダ・ユティリス（Candida  utilis）由来のＡＰ−１様転写活性化タンパク質をコードする遺伝子、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明が提供するキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子は、キャンディダ・ユティリス細胞内において機能を持つＡＰ−１様転写活性化タンパク質に翻訳され、該タンパク質の発現の増強による酸化ストレスや薬剤耐性能力向上を指標とすることにより、特に、キャンディダ・ユティリスを宿主とする形質転換において、効率よく目的遺伝子を選択できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の、ＡＰ−１様転写活性化タンパク質とは、通常は細胞質に散在しているが、酸化ストレスや細胞毒性を示す薬剤等のストレス要因が加わることによって、核内に局在し、これによって酵母の細胞保護のための酵素やタンパク質をコードする遺伝子群の発現を誘導することにより、酵母の生存率を向上させるものをいう。
本発明の、ＡＰ−１様転写活性化タンパク質をコードする遺伝子とは、キャンディダ・ユティリス染色体遺伝子からクローニングされた、該タンパク質をするコードするＤＮＡ断片、具体的には、配列番号１に示す塩基配列で示されるものである。
【００１０】
染色体遺伝子から目的のＤＮＡ断片をクローニングする手順について、以下、説明する。
１．ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ−ＰＣＲによるＹＡＰ１部分ＤＮＡ断片の取得
ＹＡＰ１クローニングのプローブとして用いるため、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ−ＰＣＲによるＹＡＰ１部分ＤＮＡ断片を取得した。
ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ−ＰＣＲとはアミノ酸配列で保存されている領域を基にして縮重した配列をもつプライマーを作製し、これらを用いてＰＣＲを行うもので、ファミリー遺伝子の ＤＮＡ 断片を取得する際によく使われる技術である。
ＹＡＰ１には、ＡＰ−１ファミリーの特徴であるｂ−ＺＩＰ領域に加えてシステイン残基に富むシステインリッチ領域（ＣＲＤ）が存在し、アミノ酸レベルで良く保存されていることが知られている（Oncogene  2001  20  2336）。それらの高い相同性を示すアミノ酸配列を基に縮重したプライマーを設計し、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲに用いることで、ＹＡＰ１類似のＤＮＡ断片を増幅した。
さらに、続けて一回目で用いたプライマーの数塩基内側に設計したｎｅｓｔｅｄプライマーでＰＣＲを行い、ＹＡＰ１特異的な部分ＤＮＡ断片を取得した。
【００１１】
２．ＹＡＰ１遺伝子のクローニング
キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、上記ＰＣＲで得たＹＡＰ１特異的な部分ＤＮＡ断片をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションに供した。プローブとハイブリダイズするサイズのＤＮＡを回収し、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。得られたアンピシリン耐性を示す形質転換体について、同様のプローブ、すなわちＹＡＰ１特異的な部分ＤＮＡ断片、を用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、ＹＡＰ１の部分塩基配列を含むＤＮＡ断片をクローニングした。
【００１２】
３．ＤＮＡ塩基配列の決定
ＤＮＡ塩基配列の決定は、適当な制限酵素を用いたＤＮＡ断片の細分化とプライマーウォーキング法を組み合わせて行った。
配列番号１に示される塩基配列から予測されるアミノ酸配列を解析した結果、ＹＡＰ１に特徴的なｂ−ＺＩＰ領域と２つのＣＲＤと高い相同性を有する配列が認められ、取得したＤＮＡ断片がＹＡＰ１を含んでいることを確認した。
【００１３】
４．機能の確認
配列から予測されるＹＡＰ１構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を、キャンディダ・ユティリスで機能する自律複製型の強発現ベクターに挿入して、キャンディダ・ユティリスＡＨＵ３０５３に形質転換し、シクロヘキシミド耐性のコロニーを多数得た。
ランダムに単離したシクロヘキシミド耐性コロニーについて、高いシクロヘキシミド耐性能を示すこと、およびサザン解析によりＹＡＰ１高発現ベクターを保持していることを各々確認し、耐性コロニーが薬剤耐性をマーカーにした形質転換でまれに生じる自然耐性株ではなく、ＹＡＰ１高発現プラスミドによる形質転換体であることを確認した。
【００１４】
本発明において提供されるキャンディダ・ユティリス由来のＡＰ−１様転写活性化タンパク質をコードする遺伝子は、キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株から得られたものであるが、当該キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株から誘導される種々の変異株のみならず、キャンディダ・ユティリスに属する他の菌株においても、機能を持つタンパク質に翻訳される。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例１
１．ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ− ＰＣＲによるＹＡＰ１部分ＤＮＡ断片の取得
既に遺伝子配列が明らかとなっている、Saccharomyces  cerevisiae、Candida  albicans、 Kluyveromyces  lactis、Schizosaccharomyces  pombe由来の各ＹＡＰ１のアミノ酸配列について相同性検索を行い、特に保存性の高いｂＺＩＰ領域とＣ末側のＣＲＤ領域を基に縮重したプライマーを作成した。
【００１６】
基にしたアミノ酸配列は以下に示す通りである。
ｂＺＩＰ−１：Ala  Gln  Asn  Arg  Ala  Ala  Gln
ｂＺＩＰ−２：Ala  Gln  Arg  Ala
ｃＣＲＤ：Lys  Ala  Lys  Cys  Ser
以上のアミノ酸配列に対応する塩基配列を持つように、以下のプライマーを作成した。ここでｂＺＩＰ−２は、ｂＺＩＰ−１の下流に存在するアミノ酸配列である。
(1)ｂＺＩＰ−１
5'-CCCTCGAGGCYCARAAYMGWGCIGCICA-3'
(2)ｂＺＩＰ−２
5'-CCCTCGAGGCICARMGIGC-3'
(3)ｃＣＲＤ
5'-CCCTCGAGISWACAYTTIGCYTT-3'
全てのプライマーの末端にＸｈｏＩを付加してある。
（なお、上記配列中、Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｉはイノシンを示し、ＹはＴとＣを、ＲはＡとＧ、ＭはＣとＡ、ＳはＧとＣ、およびＷはＴとＡをそれぞれ示す。）
【００１７】
ＰＣＲは、Ｅｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ製）を用い、９４℃、１ｍｉｎの後、９５℃、３０ｓｅｃ→５０℃、１ｍｉｎ→７２℃、２．５ｍｉｎを３０サイクル、最後に７２℃、１０ｍｉｎの条件で行った。
まず、キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマー(1)と(3)を用いてＰＣＲを行った結果、複数のバンドの増幅が認められた。次いで、このＰＣＲ後の反応液を鋳型として、プライマー(2)と(3)を用いて二回目のＰＣＲを行うことで、約１．２ｋｂｐの断片が強く増幅された。
このＤＮＡ断片をＸｈｏＩで消化した後、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＸｈｏＩサイトに挿入した。この断片の両端について部分塩基配列を解読したところｂＺＩＰとＣＲＤ領域とそれぞれ高い相同性を示し、この断片がＹＡＰ１の特異的な部分配列であることを確認した。
【００１８】
２．ＹＡＰ１遺伝子のクローニング
ＹＡＰ１の特異的な部分配列をプローブとして、キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株のゲノムＤＮＡからＹＡＰ１遺伝子全長のクローニングを行った。
キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株のゲノムＤＮＡをさまざまな制限酵素で消化し、上記ＰＣＲで得たＹＡＰ１特異的な部分ＤＮＡ断片をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションに供した。プローブの標識や検出にはジゴキシゲニンとその抗体を利用するＤＩＧシステム（Ｒｏｃｈｅ製）を用いた。その結果、ＰｓｔＩ消化したもので約５ｋｂｐに、ＳａｌＩ消化したもので約１０ｋｂｐと１．３ｋｂｐにポジティブなシグナルを検出した。ＳａｌＩ消化したものに関しては１．３ｋｂｐのみを、以下、使用した。シグナルが検出された箇所のアガロースゲルを切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮキット（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてＤＮＡを回収して、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに連結し、ＤＮＡライブラリーとした。
この濃縮されたＤＮＡライブラリーを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られたアンピシリン耐性を示す形質転換体について、同様のプローブ、すなわちＹＡＰＩ特異的な部分ＤＮＡ断片、を用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った。ＰｓｔＩ 断片を組み込んだ１３６８個の形質転換コロニーから７つ、ＳａｃＩ断片を組み込んだ１５７５ 個の形質転換コロニーからは１つのポジディブのシグナルを得た。
シグナルの得られたクローンについては、マスタープレートからシングルコロニーを分離した後、プラスミドを回収した。これらのプラスミドを組み込みに使用した制限酵素、ＰｓｔＩまたはＳａｃＩ、でそれぞれ消化し、再度前記プローブを用いたサザンハイブリダイゼーションに供した結果、ＰｓｔＩでは２つ、ＳａｃＩでは１つにポジディブのシグナルを得た。ＰｓｔＩ断片に関しては各種制限酵素で消化して得られるフラグメントパターンから同一のクローンであることを確認した。
陽性のシグナルを得た５ｋｂｐのＰｓｔＩ断片を適当な制限酵素で消化し、得られる細分化されたＤＮＡ断片について、同様のサザン解析を行い、ＰｓｔＩとＥｃｏＲＶで切り出される約０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片にポジディブのシグナルが得られ、この断片を中心にＹＡＰＩ遺伝子が含まれると推察された。
【００１９】
３．ＤＮＡ塩基配列の決定
得られたＰｓｔＩの５ｋｂｐ、ＳａｃＩの１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片について塩基配列の決定を行った。ＰｓｔＩに関してはＰｓｔＩとＥｃｏＲＶで切り出される約０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片をメインに解析を進めた。
ＤＮＡ塩基配列の決定は、ジデオキシ法によりキャピラリーシーケンサーＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ３１０を用いて行った。ＹＡＰＩ全長の塩基配列は、適当な制限酵素を用いたＤＮＡ断片の細分化とプライマーウォーキング法を組み合わせて解読した。
その結果、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ断片単独ではＹＡＰＩ遺伝子全長をカバーできておらず、ＳａｃＩ 断片にはＹＡＰ１遺伝子の５’側が、ＰｓｔＩ断片には同３’側が含まれることが明らかとなった(図１)。
このＳａｃＩ断片とＰｓｔＩ断片より得られるＹＡＰ１を含むＤＮＡ断片の塩基配列中には４３９アミノ酸をコードする配列番号１で示される１３１７ｂｐのＤＮＡより構成されるオープンリーディングフレームが存在していた。このオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列を、既に配列が分かっているSaccharomyces  cerevisiae、Candida  albicans、 Kluyveromyces  lactis、Schizosaccharomyces  pombe由来の 各ＹＡＰ１のアミノ酸配列と比較した結果、ＹＡＰ１の保存領域である、ｂ−ＺＩＰ領域と２つのＣＲＤ領域に極めて高い相同性が認められた。全長では、Candida  albicansのＹＡＰ１と最も高い相同性を示し、２２．３％であった（図２）。
【００２０】
以上から、キャンディダ・ユティリスのＹＡＰ１は、４３９アミノ酸をコードする配列番号１で示される１３１７ｂｐのＤＮＡで構成されることが明らかとなり、ＳａｃＩ断片とＰｓｔＩ断片より得られるＤＮＡ断片中にＹＡＰ１遺伝子の全長が含まれることを確認した。
【００２１】
４．機能の確認
ＹＡＰ１遺伝子をキャンディダ・ユティリス細胞内で高発現させることでシクロヘキシミド耐性を付与できるか、また、その耐性がＹＡＰ１遺伝子に依存するかを確認した。
（１）発現ベクターの構築
ＹＡＰ１構造遺伝子は、アミノ酸配列から推定された開始コドンＡＴＧの上流３ｂｐから、終止コドンＴＧＡの６ｂｐ下流までをＰＣＲにより増幅して用いた。
強発現のための遺伝子調節領域には、解糖系を構成する酵素で強い発現が知られているキャンディダ・ユティリス由来のグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）のプロモーター、ターミネーターを用いた（特許文献１）。これらの遺伝子領域は以下のプライマーを用いてキャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得した。
自律複製起点には、本発明者らが取得しているキャンディダ・ユティリス由来の２．７ｋｂｐのＡＲＳ４−２を用いた（特許出願中）。
【００２２】
プライマー
(1)ＹＡＰ−Ｆ
5'-GGCCCGGGAGATCTGAGATGACTGAATACGCA-3'
(2)ＹＡＰ−Ｒ
5'-GGTCTAGAAATAGATCATTTCCTAAT-3'
(3)Ｐｇａｐ−Ｆ
5'-GGGAATTCAAGCTTACAGCGAGCACTCAA-3'
(4)Ｐｇａｐ−Ｒ
5'-CCCTGCAGTATGTTGTTTGTAAGTGTGTT-3'
(5)Ｔｇａｐ−Ｆ
5'-GGTCTAGAATTGTATGACTTTTATTTATG-3'
(6)Ｔｇａｐ−Ｒ
5'-GGGCGGCCGCACGTGTAATACCTCAGGAGTC-3'
ＹＡＰ１構造遺伝子の増幅には上記プライマーの(1)と(2)を、同様にＧＡＰプロモーターには(3)と(4)を、さらにＧＡＰターミネーターには(5)と(6)を用いた。
【００２３】
ＰＣＲで合成したプロモーター０．９８ｋｂｐとターミネーター０．８ｋｂｐを、各断片の両端に付加した制限酵素サイト（ＥｃｏＲＩ と ＰｓｔＩ、ＸｂａＩとＮｏｔＩ）を利用してクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに連結した。次いで、このベクターのＥｃｏＲＶサイトにＡＲＳ４−２を、その両端のＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩを平滑化して連結し、強発現ベクターＹＲｐＧＡＰを作成した。
この強発現ベクターのＢａｍＨＩ、ＸｂａＩサイトに、ＰＣＲで取得したＢｇｌＩＩとＸｂａＩを付加したＹＡＰ１構造遺伝子を挿入して、ＹＡＰ１高発現ベクターＹＲｐＹＡＰを作成した（図３）。
【００２４】
（２）ＹＡＰ１高発現ベクターによるキャンディダ・ユティリスの形質転換
供試菌には酢酸リチウム法でＤＮＡ導入効率の良いＡＨＵ３０５３株を用いた。定法である酢酸リチウム法（J  Bacteriol  1983  153  163）により、０．２μｇのＹＲｐＹＡＰプラスミドＤＮＡをキャンディダ・ユティリスに形質転換した。形質転換処理した細胞をＹＰＤ液体培地を用いて一時間振とう培養し、シクロヘキシミドを最少阻止濃度である４μｇ／ｍｌになるように添加したＹＰＤ培地に塗沫して３０℃で培養した。
【００２５】
培養３日目において、コントロールとして用いた空のクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩでは全く生育が見られなかったのに対し、ＹＡＰＩ高発現ベクターを導入したものではで７５２個のコロニーを形成した（表１）。また、ＤＮＡ濃度依存的にシクロヘキシミド耐性コロニー数の増加が認められた。
シクロヘキシミド耐性コロニーのサイズに差が認められたが、ランダムに１２個シングルコロニーを分離してシクロヘキシミド耐性濃度を測定したところ、全てのコロニーで１０μｇ／ｍｌ以上の耐性能を獲得していた。
【００２６】
【表１】
2006075122.tif 000002
【００２７】
（３）シクロヘキシミド耐性株のサザンハイブリダイゼーションによる確認
ＹＡＰ１高発現ベクターの導入によりキャンディダ・ユティリスにシクロヘキシミド耐性が付与されていることを確認するため、シクロヘキシミド耐性株についてサザンハイブリダイゼーションを行った。
得られたキャンディダ・ユティリスのシクロヘキシミド耐性コロニーをランダムに７個分離し、ゲノムＤＮＡを抽出した。コントロールとして、ＡＨＵ３０５３株のゲノムＤＮＡと、形質転換に用いたプラスミドＹＲｐＹＡＰとを用いた。全てのＤＮＡサンプルは、プラスミドＹＲｐＹＡＰを１箇所切断するＸｂａＩで消化し、ＹＡＰ１構造遺伝子をプローブに用いたサザンハイブリダイゼーションに供した。
その結果、約１５ｋｂｐのゲノム上に存在するＹＡＰ１に加え、プラスミドに由来する８．７ｋｂｐのバンドを確認できた（図４）。以上から得られたシクロヘキシミド耐性コロニーは、自然耐性株ではなくＹＲｐＹＡＰによる形質転換体であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
以上、述べてきた通り、本発明によれば、キャンディダ・ユティリス由来の、ＤＮＡ結合性転写活性化タンパク質をコードする遺伝子が提供され、特にキャンディダ・ユティリスの形質転換において、薬剤を耐性マーカーとして用いることができ、効率よく目的遺伝子を選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】キャンディダ・ユティリスのＹＡＰ１を含むＤＮＡ断片の制限酵素地図である。
【図２】キャンディダ・ユティリスのＹＡＰ１アミノ酸配列のアライメントを表す図である。
【図３】ＹＡＰ１高発現プラスミドを示す図である。
【図４】シクロヘキシミド耐性株のサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図１】
2006075122.tif 000003
【図２】
2006075122.tif 000004
【図３】
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【図４】
2006075122.tif 000006
【配列表】
2006075122000001.app