(57)【要約】【課題】分子マーカーの存在または非存在により、患者がＦＴＩに応答する可能性が高いか否かを決定する治療方法を提供すること。【解決手段】癌患者、好ましくは悪性血液疾患の患者を治療する方法であって、患者の遺伝子発現プロファイル及び／または分子マーカーを分析して、患者がファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩｓ）及び、場合によっては他の薬物での治療に応答する可能性が高いか否かを決定するステップを含む。この方法は、患者の治療の監視及び治療方法の選択に有用である。ＦＴＩ治療に応答して調節された遺伝子を提供し、これを用いて遺伝子発現プロファイルを作成する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）の存在または発現を分析して、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）での治療に患者が応答するか否かを決定することを特徴とする方法。
【請求項２】
ＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）の存在または発現を分析してファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）で治療する患者の治療を監視することを特徴とする方法。
【請求項３】
患者を治療する方法であって、
（ａ）前記患者におけるＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）の存在またはその遺伝子発現プロファイル分析して、前記患者がファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）での治療に応答するか否かを決定するステップと、
（ｂ）前記分析により前記患者が応答すると決定された場合に、前記患者を前記ＦＴＩで治療するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）の治療に対する応答を決定するための試薬を含むことを特徴とするキット。
【請求項５】
前記試薬がＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）の存在または発現の検出に用いられることを特徴とする請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記試薬が、配列番号１、３‐１８、及び２９及びそれらの変異配列から成る群から選択される配列を有する遺伝子の発現の検出に用いられることを特徴とする請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記遺伝子の配列が配列番号１及び／または３であることを特徴とする請求項６に記載のキット。
【請求項８】
更に、ＣＤ３３及びＣＤ３４から成る群から選択される細胞表面抗原の検出に用いる試薬を含むことを特徴とする請求項４に記載のキット。
【請求項９】
更に、芽細胞の検出に用いる試薬を含むことを特徴とする請求項４に記載のキット。
【請求項１０】
前記試薬がＰＣＲプライマーを含むことを特徴とする請求項４に記載のキット。
【請求項１１】
更にプローブを含むことを特徴とする請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
ＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）が存在しないまたは発現していないと決定された患者、または後にＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）が存在しないまたは発現していないと決定された患者を治療するための薬剤の調製にファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）を使用すること。
【請求項１３】
ＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）が存在しないまたは発現していないと後に確認された患者を治療するための薬剤の調製にファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）を使用すること。
【請求項１４】
患者からのサンプルを分析してＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）の存在または発現を決定するための診断キット。
【請求項１５】
患者を治療するための組合せであって、
前記患者におけるＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）の存在または遺伝子発現プロファイルを決定して、前記患者がファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）での治療に応答するか否かを決定するための手段と、
分析により前記患者が応答すると示された場合に、前記患者の治療用の医薬品組成物の調製にＦＴＩを用いることを含むことを特徴とする組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００３年７月１日出願の米国特許出願第１０／６１１，４４６号の一部係属出願であり、この優先権を主張するものである。
【０００２】
配列表
添付の配列表及びＣＤに保存したコンピュータプログラムは言及することを以って本明細書の一部とする。
【０００３】
本願は、分子マーカーの検出及び／または遺伝子発現解析に基づいた癌の診断、予後、及び治療に関連する。
【背景技術】
【０００４】
癌に関連するＲａｓなどのある種の分子は、ファルネシルトランスフェラーゼ酵素によってファルネシル化され、細胞膜の内側のリーフレットと相互作用して様々なシグナル伝達に関与するようになる。しかしながら、このような癌に関連するタンパク質はＲａｓだけではない。ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩｓ）は、炭素ファルネシル部分のタンパク質のＣ末端ＣＡＡＸモチーフへの共有結合を阻害する治療薬である。このような阻害剤は、悪性血液疾患などの増殖異常及び癌の治療に有用である。特に、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫（例えば、急性骨髄性白血病：ＡＭＬ）などの悪性血液疾患は、ＥＴＩｓで最も効果的に治療できる疾患である。乳癌及びグリア芽細胞腫などの固形癌もＦＴＩｓで治療することができる。
【０００５】
多くの治療計画に当てはまることだが、ＦＴＩｓでの治療に応答する患者もいるし、応答しない患者もいる。患者がある治療方法に応答する可能性が低いのに、その患者にその治療方法を処方するのは望ましくない。従って、非応答者が不必要な治療を受けないようにすると共に、ある薬物によって恩恵を受ける可能性が最も高い患者を適切に治療及び監視できるように、薬物を投与する前に患者が治療に対してどの程度応答するかを知ることが大事である。更に、治療に応答する患者の中でも、治療に対する応答は様々である。ＦＴＩｓ以外の薬剤での治療またはＦＴＩｓと別の薬剤とを組み合わせた治療は、ＦＴＩｓに応答しない患者またはＦＴＩｓだけの治療では応答が不十分な患者にとって有用であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
分子マーカーの存在または非存在により、患者がＦＴＩに応答する可能性が高いか否かを決定する治療方法を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＦＴＩで癌患者を治療する方法である。このようなある治療法では、分子マーカーの存在または非存在により、患者がＦＴＩに応答する可能性が高いか否かを決定することができる。患者がＦＴＩに応答する可能性が高い場合は、その患者をＦＴＩで治療する。患者がＦＴＩに応答する可能性が低い場合は、ＦＴＩでの治療は行わない。本発明の一態様では、ＦＴＩ応答を予測する遺伝子群についての遺伝子発現プロファイルを作成する。本発明の別の態様では、分子マーカーの存在及び遺伝子発現プロファイルを組み合わせて、ＦＴＩ応答の可能性を決定することができる。本発明の更に別の態様では、遺伝子発現プロファイルを白血病芽球数及び／または白血病細胞の抗原の発現を組み合わせてＦＴＩ治療に対する応答の可能性を決定することができる。本発明の別の態様では、骨髄からアッセイ用のサンプルを採取する。
【０００８】
本発明の別の態様では、ＦＴＩでの治療について癌患者を監視する。具体的には、患者の遺伝子発現プロファイル及び／または分子マーカーの存在を分析して患者がＦＴＩに応答するかを決定し、患者が所望の形で応答する可能性が高い場合はその患者をＦＴＩで治療する。
【０００９】
本発明の別の態様では、遺伝子発現プロファイルが、ＦＴＩ応答者を示唆する１または複数の特定の遺伝子の調節を示す場合はその患者を治療する。
【００１０】
本発明の別の態様では、遺伝子発現プロファイルが、ＦＴＩ応答者を示唆する１または複数の特定の遺伝子の調節を示し、かつ骨髄芽細胞数が０％〜６０％またはＣＤ３３細胞表面抗原を発現する細胞の割合が６０％未満及び／またはＣＤ３４細胞表面抗原を発現する細胞の割合が１０％未満の場合はその患者を治療する。
【００１１】
本発明の更に別の態様では、分子マーカーは、ＬＢＣ癌遺伝子、ＡＨＲ、ＭＩＮＡ５３、ＩＤＳ、ＧＰＲ１０５、ＴＥＭ６、ＴＮＦＳＦ１３、ＳＶＩＬ、Ｃ６ｏｒｆ５６、ＦＲＡＧ１、ＧＯＳＲ１、ＫＩＡＡ１０３６、ＢＴＧ３、ＭＡＰＫ８ＩＰ３、ＬＩＬＲＢ３、ＡＲＨＨ、及びＮＰＴＸ２の１つ以上である。分子マーカーは、１または複数の上記とＯＰＮ３及び／またはＩＬ３ＲＡとの組合せにすることもできる。
【００１２】
本発明の別の態様では、ＦＴＩは、キニロン（quinilone）またはキニロン誘導体である。本発明の更に別の態様では、ＦＴＩは、（Ｒ）‐６‐［アミノ（４‐クロロフェニル）（１‐メチル‐１Ｈ‐イミダゾール‐５‐イル）メチル］‐４‐（３‐クロロフェニル）‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐キノリノンである。
【００１３】
本方法の実施に用いる物品も本発明の一態様である。このような物品には、遺伝子発現プロファイルやその表現が含まれる。このような表現は、コンピュータ可読メディアに保存することができる。本発明に従った他の物品には、本発明の遺伝子発現プロファイルを決定するために用いる核酸アレイや、他の核酸決定法の実施に用いる装置及び構成要素が含まれる。
【００１４】
キットも本発明の一態様である。このようなキットには、ＦＴＩ治療に対する応答者と非応答者を区別する分子マーカーの存在及び／または遺伝子発現を検出するための試薬が含まれる。
【００１５】
本発明の別の態様では、癌患者を治療する方法は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路、ＴＧＦβ、ＷＮＴ、Ｒｈｏ、またはアポトーシス経路を調節する薬剤及びＦＴＩを投与するステップを含む。
【００１６】
本発明の別の態様では、チロシンキナーゼ阻害剤、ＭＥＫキナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、アポトーシス修飾物質、及びこれらの組合せからなる群から選択される薬剤及びＦＴＩで患者を治療する。
【００１７】
本発明の更に別の態様では、遺伝子発現プロファイル及び／または患者の分子マーカーの存在または非存在を分析して、ＦＴＩと他の薬物との組合せが患者に有効であるか否かを決定する。次いで、患者をこのような組合せで治療するか、或いは患者がＦＴＩに応答する可能性が低い場合は、チロシンキナーゼ阻害剤、ＭＥＫキナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、アポトーシス修飾物質、及びこれらの組合せからなる群から選択される別の薬物で治療する。
【００１８】
本発明の別の態様では、遺伝子発現プロファイル及び／または患者の分子マーカーの存在を分析して、ＦＴＩと別の治療形態との組合せが患者に有効であるか否かを決定する。次いで、このような組合せで患者を治療するか、或いは患者がＦＴＩに応答する可能性が低い場合は、ＦＴＩを含まない他の治療法で患者を治療する。
【発明の効果】
【００１９】
分子マーカーの存在または非存在により、患者がＦＴＩに応答する可能性が高いか否かを決定する治療方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本明細書における治療薬はＦＴＩｓである。ＦＴＩｓは様々な形態をとるが、癌及び増殖性疾患に関係するタンパク質のファルネシル化を阻害または抑制する必須阻害機能を有する。ＦＴＩｓは、グリア芽細胞種及び乳癌などの固形癌の治療に用いられるものが好ましい。より好ましくは、ＦＴＩｓは、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫などの悪性血液疾患の治療に用いられるものである。最も好ましくは、ＦＴＩｓは、ＡＭＬ、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、及び多発性骨髄腫に用いられるものである。悪性血液疾患の場合、ＦＴＩに応答する患者とは、ＦＴＩでの治療後に骨髄で５０％以上の芽細胞の減少が見られる患者である。固形癌では、ＦＴＩに応答すると患者は、癌の成長が停止する患者である。別法として、固形癌患者における応答を、腫瘍学では一般的な用語であるＲＥＣＩＳＴ基準（固形癌における効果判定基準）に従って測定することもできる。
【００２１】
様々なＦＴＩｓが本発明に包含され、次に示す米国特許に開示されている。それぞれ言及することを以って本明細書の一部とする、ブラウン（Brown）らによる米国特許第５，９７６，８５１号、アンソニー（Anthony）らによる同第５，９７２，９８４号、デ・ソルムス（de Solms）による同第５，９７２，９６６号、ディンスモアー（Dinsmore）らによる同第５，９６８，９６５号、ベネット（Venet）らによる同第５，９６８，９５２号、ベネット（Venet）らによる同第６，１８７，７８６号、ベネット（Venet）らによる同第６，１６９，０９６号、ベネット（Venet）らによる同第６，０３７，３５０号、アンギバウド（Angibaud）らによる同第６，１７７，４３２号、グラハム（Graham）らによる同第５，９６５，５７８号、セブティ（Sebti）らによる同第５，９６５，５３９号、アフォンソ（Afonso）らによる同第５，９５８，９３９号、アンソニー（Anthony）らによる同第５，９３９，５５７号、コマーコン（Commercon）らによる同第５，９３６，０９７号、アンソニー（Anthony）らによる同第５，８９１，８８９号、バウディン（Baudin）らによる同第５，８８９，０５３号、アンソニー（Anthony）らによる同第５，８８０，１４０号、デ・ソルムス（de Solms）による同第５，８７２，１３５号、デ・ソルムス（de Solms）による同第５，８６９，６８２号、バウデゥィン（Baudoin）による同第５，８６１，５２９号、グラハム（Graham）らによる同第５，８５９，０１５号、クラーク（Clerc）による同第５，８５６，４３９号、アンソニー（Anthony）らによる同第５，８５６，３２６号、グラハム（Graham）らによる同第５，８５２，０１０号、マースターズ（Marsters）らによる同第５，８４３，９４１号、ドル（Doll）による同第５，８０７，８５２号、ディンスモアー（Dinsmore）らによる同第５，７８０，４９２号、ドン（Dong）らによる同第５，７７３，４５５号、キム（Kim）らによる同第５，７６７，２７４号、アンソニー（Anthony）らによる同第５，７５６，５２８号、バウドイン（Baudoin）らによる同第５，７５０，５６７号、ビショップ（Bishop）らによる同第５，７２１，２３６号、ドル（Doll）らによる同第５，７００，８０６号、アンソニー（Anthony）らによる同第５，６６１，１６１号、セブティ（Sebti）らによる同第５，６０２，０９８号、ブレスリン（Breslin）らによる同第５，５８５，３５９号、シッカローネ（Ciccarone）らによる同第５，５７８，６２９号、シッカローネ（Ciccarone）らによる同第５，５３４，５３７号、マースターズ（Marsters）らによる同第５，５３２，３５９号、パテル（Patel）らによる同第５，５２３，４３０号、デ・ソルムス（de Solms）らによる同第              ５，５０４，２１２号、デ・ソルムス（de Solms）らによる同第５，４９１，１６４号、ブラウン（Brown）らによる同第５，４２０，２４５号、及びグラハム（Graham）らによる同第５，２３８，９２２号。
【００２２】
非ペプチド性治療薬、いわゆる「小分子」治療薬が好ましい。より好ましいＦＴＩｓは、キノリンまたはキノリン誘導体である。キノリン誘導体の例として、７‐（３‐クロロフェニル）‐９‐［（４‐クロロフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾール‐１‐イル）メチル］‐２,３‐ジヒドロ‐１Ｈ,５Ｈ‐ベンゾ［ｉｊ］キノリジン‐５‐オン、７‐（３‐クロロフェニル）‐９‐［（４‐クロロフェニル）（１Ｈ‐イミダゾール‐１‐イル）メチル］‐１,２‐ジヒドロ‐４Ｈ‐ピロロ［３,２,１‐ｉｊ］キノリン‐４‐オン、８‐［アミノ（４‐クロロフェニル）（１‐メチル‐１Ｈ‐イミダゾール‐５‐イル）,メチル］‐６‐（３‐クロロフェニル）‐１,２‐ジヒドロ‐４Ｈ‐ピロロ［３,２,１‐ｉｊ］キノリン‐４‐オン、及び８‐［アミノ（４‐クロロフェニル）（１‐メチル‐１Ｈ‐イミダゾール‐５‐イル）メチル］‐６‐（３‐クロロフェニル）‐２,３‐ジヒドロ‐１Ｈ,５Ｈ‐ベンゾ［ｉｊ］キノリジン‐５‐オンを挙げることができる。
【００２３】
最も好ましいＦＴＩは、鏡像異性体（＋）としてベネット（Venet）らによる米国特許第６，４２０，３８７号に開示されている（Ｒ）‐６‐［アミノ（４‐クロロフェニル）（１‐メチル‐１Ｈ‐イミダゾール‐５‐イル）メチル］‐４‐（３‐クロロフェニル）‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐キノリノンである。
【００２４】
別の好適なＦＴＩは、ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ ０１／９８３０２号に開示されている（‐）‐５‐（３‐クロロフェニル）‐α‐（４‐クロロフェニル）‐α‐（１‐メチル‐１Ｈ‐イミダゾール‐５‐イル）テトラゾロ［１,５‐ａ］キナゾリン‐７‐メタンアミン及び薬学的に許容される酸付加塩である。
【００２５】
他の有用なＦＴＩｓには、Ａｒｇｌａｂｉｎすなわち１（Ｒ）‐１０‐エポキシ‐５（Ｓ）,７（Ｓ）‐グアヤ‐３（４）,１１（１３）‐ジエン‐６,１２‐オリド（ＷＯ ９８／２８３０３）、ペリリルアルコール（perrilyl alcohol）（ＷＯ ９９／４５９１２）、ＳＣＨ‐６６３３６すなわち（＋）‐（Ｒ）‐４‐［２‐［４‐（３,１０‐ジブロモ‐８‐クロロ‐５,６‐ジヒドロ‐１１Ｈ‐ベンゾ［５,６］シクロヘプタ［１,２‐ｂ］ピリジン‐１１‐イル）ピペリジン‐１イル］‐２‐オキソエチル］ピペリジン‐１‐カルボキシアミド（米国特許第５，８７４，４４２号）、Ｌ７７８１２３すなわち１‐（３‐クロロフェニル）‐４‐［１‐（４‐シアノベンジル）‐５‐イミダゾリルメチル］‐２‐ピペラジノン（ＷＯ ００／０１６９１）、化合物２（Ｓ）‐［２（Ｓ）‐［２（Ｒ）‐アミノ‐３‐メルカプト］プロピルアミノ‐３（Ｓ）‐メチル］‐ペンチルオキシ‐３‐フェニルプロピオニル‐メチオニンスルホン（ＷＯ ９４／１０１３８）、ＢＭＳ ２１４６６２すなわち（Ｒ）‐２,３,４,５‐テトラヒドロ‐１‐（ＩＨ‐イミダゾール‐４‐イルメチル）‐３‐（フェニルメチル）‐４‐（２‐チエニルスルホニル）‐１Ｈ‐１,４‐ベンゾジアザピン（benzodiazapine）‐７‐カルボニトリル（ＷＯ ９７／３０９９２）、ＣＰ ６０９７５４すなわちＮ‐（３‐エチニルフェニル）‐６,７‐ビス（２‐メトキシエトキシ）‐４‐キナゾリンアミン（米国特許第５，７４７，４９８号）、及び６‐［アミノ‐（４‐クロロフェニル）‐（３‐メチル‐３Ｈ‐イミダゾール‐４‐イル）‐メチル］‐４‐（３‐エチニル‐フェニル）‐１‐メチル‐１Ｈ‐キノリン‐２‐オン（ＷＯ ００／１２４９９）が含まれる。
【化１】
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【００２６】
タンパク質またはペプチドを発現する可能性のあるゲノム内の核酸配列（「遺伝子」）の単なる存在では、タンパク質またはペプチドが所定の細胞で発現しているか否かを決定できない。所定の遺伝子が、タンパク質またはペプチドを発現するか、ＲＮＡを転写できるか、そして可能な場合にそのような発現または転写がどの程度であるかは、様々な複合因子によって決まる。それにもかかわらず、遺伝子発現の分析により、薬物や他の治療物質の導入などの所定の刺激に対する細胞応答についての有用な情報が得られる。遺伝子の活性または不活性がどの程度であるかの相対的評価をこのような遺伝子発現プロファイルで確認することができる。場合によっては、分子マーカーの存在自体または遺伝子発現情報との組合せによっても、治療効果についての有用な情報が得られる。本発明の分子マーカー及び遺伝子発現プロファイルを用いて、ＦＴＩ治療で効果が得られる可能性の高い患者を特定して治療する、或いはＦＴＩ治療で効果が得られる可能性が殆どない患者を排除する。
【００２７】
悪性血液疾患を含む癌は、通常は様々な遺伝子の突然変異から起こる。同じ種類の癌は、同じ種類の癌をもつ別の患者の突然変異とは異なるまたは一致する１または複数の突然変異から起こり得る。同じ癌に多数の分子的な基礎が存在する場合が多いという事実は、ある患者には効果がある治療が、同じ種類の癌をもつ別の患者には必ずしも同じ効果があるとは限らないという所見に一致する。更に、診断の観点から、転座、欠失、ＳＮＰｓなどの特定の突然変異の存在が重要な意味を持つであろう。場合によっては、このような分子マーカーは、これら自体が診断、予後、治療効果の決定に有用な指標である。これは、特に分子の突然変異が特定の治療に対する応答に関連する場合に当てはまる。本発明では、ＬＢＣ（リンパ性急性転換（lymphoid blast crisis））癌遺伝子（ＡＫＡＰ１３（配列番号２）としても知られている）が存在しない癌はＦＴＩ治療に応答する。従って、この遺伝子の発現、発現の不足、及び存在または非存在が、このような治療を実際に処方する前にＦＴＩ治療に対する抵抗性を予測するのに有用である。
【００２８】
ＬＢＣ癌遺伝子は、染色体７ｑを起源とする関連のない配列と染色体１５ｑのＬＢＣプロトオンコジーン（配列番号２３−２７）との融合によって得られたキメラである。配列のＣ末端におけるプロトオンコジーンの切断により、この遺伝子が形質転換能力を得る。この切断は、転座以外のメカニズムからも起こり得る。例えば、異常スプライシングにより、Ｃ末端が切断されたＲＮＡ転写物が生じる。この遺伝子は、ｍＲＮＡ及びタンパク質（配列番号２８、ヒトＬＢＣタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション：ＧＩ２９７９１８９７）を含む多数の発現産物を有する。ＬＢＣ癌遺伝子が機能する正確な仕組みは完全には理解されていないが、骨格筋、心臓、肺、前立腺、卵巣、小腸、及び造血細胞を含む様々な組織に存在することが確認されている。癌遺伝子が存在する（存在しなくても良い）組織を起源とする癌の治療は本発明の範囲内である。
【００２９】
この遺伝子が切断によって得られ、確認できる発現産物を産生するため、本発明のアッセイを様々に作成することができる。この遺伝子またはその産物の非存在を利用できるだけでなく、この遺伝子の発現の変化の検出も利用することができる。従って、遺伝子発現プロファイルはこの遺伝子を含むことができる。この遺伝子の発現の変化または非存在を、好ましくは悪性血液疾患、より好ましくは白血病、最も好ましくはＡＭＬにおけるＦＴＩ治療効果の指標として用いる。
【００３０】
任意の好適な検出方法を用いて、分子マーカーとしてのＬＢＣ癌遺伝子を確認することができる。この分子マーカーの存在は、ＦＴＩでの治療の予後が悪いことを示唆し、その非存在は、ＦＴＩ治療に応答する可能性が極めて高いことを示唆する。ＬＢＣ癌遺伝子の存在を検出するのに有用な方法には、限定するものではないが、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型法、化学及び熱変性勾配法、化学及び酵素切断法、質量分析法、ＲＦＬＰ及び対立遺伝子特異的増幅法、レシオメトリックＰＣＲ法、ビーズ及びマイクロアレイを用いたシステム、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ヘテロデュプレックス分析、マイクロアレイ解析、ＥＬＩＳＡ、ウェスタン法、蛍光活性化選別装置（ＦＡＣＳ）、抗体を用いる方法、メチル化を用いるＰＣＲ法、及びＳＮＰの検出を含む既知の突然変異遺伝子または配列を検出するための任意の方法が含まれる。
【００３１】
ＬＢＣ癌遺伝子の存在または非存在を検出するための最も好適な方法はＰＣＲ法である。この方法では、通常のサンプル調製法に従って、まず患者から細胞を採取する。悪性血液疾患の場合、単なる末梢血サンプルまたは骨髄サンプルが好ましい。次いで、一般に受け入れられている方法でＲＮＡを抽出し、次のように増幅する。例えば２５０ｎＭ プライマー及び２５０ｎＭ ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのＡＢＩ ＴａｑＭａｎ（登録商標）バッファーを用いて増幅する。５０℃で２分間、９５℃で１０分間のサーマルサイクルを行い、次いで、９５℃で１５分間と６２℃で１分間のサイクルを５０回繰り返した。プライマー及びプローブの例が表１に示されている。
【００３２】
この方法では、サンプル中のＬＢＣ転写物を定量する。測定した値を、同じサンプルを用いてＨＰＲＴなどの外来コントロール遺伝子を増幅する同様のＲＴ‐ＰＣＲ実験で標準化することができる。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
ＬＢＣ癌遺伝子の存在または非存在を決定する別の方法では、ＲＮＡ転写物の長さを測定する。ＬＢＣ癌遺伝子は３’転座を有するため、その転写物の長さはＬＢＣプロトオンコジーン転写物の長さよりも短い。この指標は、診断に好ましい。転写物の大きさを診断するために、プロト及びオンコＬＢＣプライマーの両方に相同な順方向プライマー（例えば、表１のＬＢＣ順方向プライマー）を、ＲＮＡ転写物のユニバーサルポリＡ尾部に相同な逆方向プライマーと共に用いる。初めのｃＤＮＡ合成でポリＡ配列の別のユニークな配列タグ３’を含めて、ＰＣＲ反応に更なる特性を付与するのが好ましい。
【００３５】
ゲノムの転座が確認されたら、ＬＢＣ癌遺伝子に特異的なＰＣＲプライマー及び標準的な方法を用いてゲノムＤＮＡを単離する。例えば、プロト及びオンコＬＢＣ遺伝子の両方に相同な順方向プライマーを上記したポリＡ配列と共に用いることができる。別法では、３’転座配列に相同な逆方向プライマーを用いることもできる。リードアウトは、癌遺伝子の存在がプロトオンコジーンよりも短い産物に一致するアンプリコンの大きさであり、オンコＬＢＣ特異的アンプリコンが存在するまたは存在しない。
【００３６】
細胞のＬＢＣ癌遺伝子状態についてのアッセイで、免疫組織化学法（ＩＨＣ）などの方法を用いて診断目的で正常／異常組織の分布を決定することができる。例えば、ＬＢＣタンパク質の抗体を、ＩＨＣでの検査のために調製した新鮮凍結した及びホルマリン固定したパラフィン包埋組織ブロックの両方と共に用いることができる。各組織ブロックは、５０ｍｇの残留「粉状」腫瘍から成る。
【００３７】
要約すると、凍結切片の作成方法では、凍結粉状腫瘍５０ｍｇを室温で、小さなプラスチックカプセルのリン酸バッファー（ＰＢＳ）で再水和し、遠心分離で粒子をペレット化し、これらのペレットを粘性包埋培地（ＯＣＴ）に再懸濁し、カプセルを反転させて遠心分離で再びペレット化し、−７０℃のイソペンタンで瞬間凍結させ、プラスチックカプセルを切断して凍結柱状組織を取り出し、クリオスタット・ミクロトーム・チャックに柱状組織を固定し、無傷の腫瘍細胞を含む２５〜５０の連続切片に切断する。
【００３８】
永久切片も同様の方法で作成することができる。具体的には、５０ｍｇのサンプルをプラスチック遠心分離チューブ内で再水和し、ペレット化し、１０％ ホルマリンで４時間固定して再懸濁し、洗浄及びペレット化し、温かい２．５％ 寒天で再懸濁し、ペレット化し、氷水で冷却して寒天を固め、チューブから組織／寒天ブロックを取り出し、パラフィンの中にブロックを浸潤させて包埋させ、最大５０個の連続した永久切片に切断する。
【００３９】
ＩＨＣアッセイの場合、３％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳまたは他の遮断試薬を含む遮断液を切片に塗る。遮断試薬は、非特異的血清または粉乳を含む。室温で１時間、ブロッキングする。抗ＬＢＣタンパク質抗体を、３％ ＢＳＡ、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ（商標）‐１００、及びｔ‐オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含むＰＢＳバッファーで希釈する（１：１００）。サンプルの切片を、抗体を含む溶液で塗って４℃で１６時間放置する。時間と温度の条件は、選択する抗体及び検査する物質によって異なる。最適な条件は経験的に決定される。次いで、抗体で処理した切片をＰＢＳ中でそれぞれ１５分間３回洗浄して結合しなかった抗体を除去し、次いで、３％ ＢＳＡ及び二次抗体を含むＰＢＳ（１：２０００の希釈）を切片に塗る。二次抗体は、カラシペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、フルオレッセインイソチオシアネート、または他の好適な酵素などの発色酵素に結合することができる。別法では、二次抗体をビオチンに結合させて、発色団標識アビジンと共に使用することができる。
【００４０】
ＬＢＣ癌遺伝子の存在を検出するための別の例示的な方法では、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを用いる。一般に、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションでは、（１）分析する組織または生物学的構造を固定する、（２）標的ＤＮＡへの到達性を良くし、非特異的結合を減少させるために生物学的構造のプレハイブリダイゼーション処理を行う、（３）核酸混合物と生物学的構造または組織の核酸とのハイブリダイゼーションを行う、（４）ハイブリダイゼーションで結合しなかった核酸断片を除去するためのハイブリダイゼーション後の洗浄を行う、そして（５）ハイブリダイズした核酸断片を検出する。これらの各ステップで用いる試薬及び用いる条件は適用例によって異なる。
【００４１】
この場合、ＬＢＣ癌遺伝子にハイブリダイズできる（その染色体座で）少なくとも１つの検出可能な核酸プローブを含むハイブリダイゼーション溶液を、ハイブリダイゼーション条件下で細胞に接触させる。次いで、全てのハイブリダイゼーションを検出して、正常つまりコントロール細胞の所定のハイブリダイゼーションパターンと比較する。プローブは、α‐動原体プローブであるのが好ましい。このようなプローブは、多数の販売者（例えば、イリノイ州、ダウナーズ・グロウブ（Downers Grove）のバイシス社（Visys Inc））から購入することができる。好適な実施形態では、ハイブリダイゼーション溶液は、キメラを構成する配列の転座に一致する染色体上の領域（例えば、１５ｑ２４‐２５）に特異的な複数のプローブを含む。
【００４２】
本発明の方法に使用するのに適したハイブリダイゼーションプロトコルは、例えば、アルバートソン（Albertson）著、「ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J）」、１９８４年、３：１２２７‐１２３４、ピンケル（Pinkel）著、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）」、８５：９１３８‐９１４２、欧州特許第４３０，４０２号、「メソッヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Methods in Molecular Biology）」、第３３巻、チュー（Choo）編集、「イン・シツ・ハイブリダイゼーション・プロトコルズ（In Situ Hybridization protocols）」、１９９４年、ヒューマナ・プレス（Humana Press）、ニュージャージー州トトワに記載されている。好適な一実施形態では、ピンケル（Pinkel）ら著、「ネイチャー・ジェネチクス（Nature Genetics）」、１９９８年、２０：２０７‐２１１またはカリオニエミ（Kallioniemi）著、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ウナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Natl. Acad. Sci. USA）」、１９９２年、８９：５３２１‐５３２５のハイブリダイゼーション・プロトコルを用いる。ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は周知である（例えば、チジェッセン（Tijssen）著、「ラボラトリー・テクニークス・イン・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology）」、第２４巻、１９９３年、「ハイブリダイゼーション・ウイズ・ニュークリーク・アシッド・プローブス（Hybridization With Nucleic Acid Probes）」、ニューヨークウ、エルスビアー）。
【００４３】
好適な実施形態では、ハイブリダイゼーションの際に界面活性剤（例えば、Ｃ‐ＴＡＢ）または遮断薬（例えば、精子ＤＮＡ、ｃｏｔ‐１ ＤＮＡなど）を用いてバックグランドシグナルを減少させて非特異的な結合を減少させる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ（例えば、ｃｏｔ‐１ ＤＮＡ）の存在下で行う。
【００４４】
プローブは、合成や生物宿主での成長を含む当分野で周知の任意の方法で作製することができる。合成方法には、オリゴヌクレオチド合成、リボプローブ、及びＰＣＲが含まれる。
【００４５】
プローブは、当分野で周知の任意の方法で検出可能なマーカーを標識することができる。プローブを標識する方法には、ランダムプライミング、末端標識、ＰＣＲ、及びニックトランスレーション法が含まれる。酵素標識は、核酸ポリメラーゼ、３種の未標識ヌクレオチド、及び第４のヌクレオチドの存在下で実施する。この第４のヌクレオチドは、標識に付着するためのリンカーアームを含み、直接標識される、或いは標識された結合分子が結合できるハプテンや他の分子に付着する。好適な直接標識には、32Ｐ、3Ｈ、及び35Ｓなどの放射性標識、フルオレセイン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー、ルシファーイエロー、及びローダミンなどの蛍光マーカー、可視光で検出可能なシアニン、及び酵素などの非放射性標識が含まれる。標識は、オリゴヌクレオチド合成の際に直接的に、または亜硫酸水素塩仲介性アミノ基転移によってＤＮＡプローブの中に化学的に組み込むことができる。
【００４６】
蛍光マーカーは、プローブ内に組み込まれた活性化したリンカーアームでヌクレオチドに容易に付着させることができる。プローブは上記した方法で間接的に標識することができる。つまり、ビオチンまたはジゴキシゲニンなどの分子やハプテンに共有結合したヌクレオチドを組み込み、ハプテンまたは他の分子に対して標識した抗体を用いて直接サンドイッチハイブリダイゼーションを行う。ビオチンの場合には、検出可能な標識に結合したアビジンを用いてサンドイッチハイブリダイゼーションを行う。抗体とアビジンは、蛍光マーカーを用いて、またはアルカリホスファターゼまたはカラシペルオキシダーゼなどの酵素マーカーを用いて結合させて検出可能にすることができる。結合したアビジンと抗体は、ベクター・ラボラトリーズ（Vector Laboratories（カリフォルニア州バーリンガム））及びベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim（インディアナ州インディアナポリス））などの会社から入手できる。
【００４７】
このような酵素は、基質を添加して非色反応により検出することができる。様々な基質の存在下では、反応により様々な色が生成され、これらの色から複数のプローブを別々に検出することができる。当分野で周知の基質を用いることができる。アルカリホスファターゼの好適な基質には、５‐ブロモ‐４‐クロロ‐３‐インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）が含まれる。カラシペルオキシダーゼの好適な基質はジアミノ安息香酸エステル（ＤＡＢ）である。
【００４８】
本発明のｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法に用いるのに適した蛍光標識プローブは、１５０〜５００ヌクレオチド長さの範囲が好ましい。プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡとすることができ、好ましくはＤＮＡである。
【００４９】
検出可能なプローブの細胞に対するハイブリダイゼーションは、０．１ｎｇ／μＬ〜５００ｎｇ／μＬの濃度、好ましくは５ｎｇ／μＬ〜２５０ｎｇ／μＬの濃度のプローブを用いて行う。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアミドなどの変性剤を含むのが好ましい。一般に、ハイブリダイゼーションは、２５℃〜４５℃、より好ましくは３２℃〜４０℃、最も好ましくは３７℃〜３８℃の温度で行う。ハイブリダイゼーションに必要な時間は、約０．２５時間〜９６時間、より好ましくは１時間〜７２時間、最も好ましくは４時間〜２４時間である。ハイブリダイゼーション時間は、プローブの濃度及びハイブリダイゼーション溶液の内容物によって異なる。ハイブリダイゼーション溶液は、ｈｎＲＮＰ結合タンパク質、トリアルキルアンモニウム塩、及びラクタムなどの促進物質を含み得る。次いで、スライドをホルムアミドなどの変性剤を含む溶液で洗浄して塩化ナトリウムの濃度を下げる、または結合しなかった不一致のプローブを除去できる任意の溶液で洗浄する。
【００５０】
塩の温度及び濃度は、所望のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによって異なる。例えば、高ストリンジェンシーの洗浄は４２℃〜６８℃の範囲、中程度のストリンジェンシーの洗浄は３７℃〜５５℃の範囲、低ストリンジェンシーの洗浄は３０℃〜３７℃の範囲で行うことができる。高ストリンジェンシーの塩濃度は、０．５〜１．０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）、中程度のストリンジェンシーは１〜４×ＳＳＣ、低ストリンジェンシーは２〜６×ＳＳＣとすることができる。
【００５１】
必要に応じて、検出インキュベーションステップを、２３℃〜４２℃、より好ましくは２５℃〜３８℃、最も好ましくは３７℃〜３８℃の湿室で行うのが好ましい。標識した試薬は、ＢＳＡや脱脂粉乳などの遮断試薬を含む溶液で希釈するのが好ましい。希釈液は、１：１０〜１：１０，０００、より好ましくは１：５０〜１：５，０００、最も好ましくは１：１００〜１：１，０００の範囲とすることができる。スライドまたは他の固体支持構造をインキュベーションステップの間に洗浄して過剰な試薬を除去すべきである。
【００５２】
次いで、スライドを取り付けて、可視検出マーカーの場合は顕微鏡で分析し、放射線マーカーの場合はオートラジオグラフフィルムに曝露させて分析する。蛍光マーカーの場合は、蛍光減衰防止剤（antifade）を含む溶液中に固定し、蛍光顕微鏡で分析するのが好ましい。検出精度を上げるために複数の核を検査する。
【００５３】
加えて、ＬＢＣ癌遺伝子の発現産物のアッセイは、ＬＢＣ癌遺伝子の突然変異が起こっているか否かを決定するために用いることができる。最も好ましくは、このようなアッセイは免疫測定法である。免疫測定法は、最も単純で直観的な結合アッセイである。ある種の好適な免疫測定法は、当分野で周知の様々な酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡｓ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。組織切片に用いるＩＨＣ検出は特に有用である。
【００５４】
ある例示的なＥＬＩＳＡでは、抗‐オンコＬＢＣタンパク質に特異的な抗体を、ポリスチレン・マイクロタイター・プレートの穴などのタンパク質親和性を有する選択された表面に固定する。次いで、臨床サンプルなどの所望の抗原を含む検査組成物を穴に添加する。結合させた後に洗浄して非特異的に結合した免疫複合体を除去し、結合した抗原を検出することができる。検出は、検出可能な標識に結合する所望の抗原に特異的な別の抗体を添加して行われるのが普通である。このタイプのＥＬＩＳＡは、単純な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出は、所望の抗原に特異的な二次抗体を添加し、二次抗体に対して結合親和性を有する、検出可能な標識に結合する三次抗体を添加して行うことができる。
【００５５】
様々なＥＬＩＳＡ法が良く知られている。このような一形態では、所望の抗原を含むサンプルを穴の表面に固定し、次いで本発明の抗体に接触させる。結合の後に適切に洗浄し、結合した免疫複合体を検出する。初めの抗原特異的抗体が検出可能な標識に結合したら、その免疫複合体を直接検出することができる。再び、免疫複合体は、第１の抗原特異的抗体に対して結合親和性を有する、検出可能な標識に結合する、二次抗体を用いて検出することができる。
【００５６】
競合ＥＬＩＳＡも用いることができる。競合ＥＬＩＳＡでは、検査サンプルが、既知の量の標識された抗原または抗体と結合を争う。未知のサンプルの反応種の量は、コーティングした穴でのインキュベーションの前または最中に、既知の標識した化学種とそのサンプルを混合して決定する。サンプル中に反応種が存在すると、穴に結合できる標識した化学種の量が減少し、最終的な信号が減少する。
【００５７】
抗原または抗体は、プレート、ビーズ、ディップスティック、メンブラン、またはカラムマトリックスなどの固体支持構造にも結合することができ、固定された抗原または抗体に分析するサンプルを接触させることができる。プレートを抗原または抗体でコーティングする場合、通常は抗原または抗体を含む溶液でプレートの穴を一晩または所定時間インキュベートする。次いで、プレートの穴を洗浄して不完全に吸着された物質を除去する。次いで、使用できる残った穴の表面を、検査する抗血清に対して抗原的に中性な非特異的なタンパク質でコーティングする。これらには、ＢＳＡ、カゼイン、及び粉乳溶液が含まれる。このコーティングにより、固定する表面上の非特異的吸着部位がブロックされ、その表面への抗血清の非特異的な結合によって起こるバックグランドが減少する。
【００５８】
ＥＬＩＳＡでは、直接法ではなく、二次的または三次的な検出を用いるのが一般的である。従って、抗原または抗体が穴に結合した後、バックグランドを小さくするために非反応物質でコーティングし、次いで洗浄し、結合しなかった物質を除去し、次いで免疫複合体（抗原／抗体）が許容される効果的な条件下で、固定する表面を検査する臨床サンプルすなわち生体サンプルと接触させる。これには、ＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）、及びＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎなどの溶液で抗原または抗体を希釈することが含まれる。このような希釈剤は、非特異的なバックグランドを軽減するのに役立つ。免疫複合体の検出には、標識した二次的に結合するリガンドまたは抗体、或いは二次的に結合するリガンドまたは抗体と標識した三次抗体または三次的に結合するリガンドが必要である。
【００５９】
ＥＬＩＳＡでの全てのインキュベーションステップの後、接触した表面を洗浄して複合体を形成しなかった物質を除去する。洗浄には、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液やホウ酸バッファーでの洗浄が含まれることが多い。初めに結合していた物質と検査サンプルとの特異的な免疫複合体の形成の後に洗浄を行い、微量の免疫複合体の発生も検出することができる。
【００６０】
二次または三次抗体は、検出手段として結合した標識を有する。このような標識は、好ましくは、好適な発色基質でのインキュベーションで色を生成する酵素である。従って、例えば、一次または二次免疫複合体を、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、または過酸化水素酵素結合抗体に所定時間、更なる免疫複合体の形成に適した条件下で接触及びインキュベートする（例えば、ＰＢＳ／ＴｗｅｅｎなどのＰＢＳを含む溶液中で、室温で２時間インキュベーション）。
【００６１】
標識した抗体でインキュベーションした後、洗浄で結合しなかった物質を除去し、標識を定量する。この定量では、ペルオキシダーゼが酵素標識の場合は、例えば尿素やブロムクレゾールパープルなどの発色基質及びＨ2Ｏ2でインキュベートする。次いで、生成された色の程度を、例えば可視スペクトル分光光度計で測定する。別法では、標識を化学発光標識とすることができる。このような標識の使用については、米国特許第５，３１０，６８７号、同第５，２３８，８０８号、及び同第５，２２１，６０５号を参照されたい。
【００６２】
ＦＴＩに対する応答を決定するために遺伝子発現を検出する本発明の実施形態では、遺伝子発現ポートフォリオを使用するのが最も好ましい。遺伝子のポートフォリオは、分類された遺伝子群であって、これらの遺伝子の発現情報が、診断、予後、または治療の選択などの臨床的な適切な判断を行う際の基礎となる。この場合、遺伝子発現ポートフォリオは、癌患者へのＦＴＩｓ使用についての治療の判断に役立つように作成される。
【００６３】
発現の差がＦＴＩ治療に対する応答の可能性を示す１または複数の他の遺伝子を用いて、遺伝子発現プロファイルの一部としてＬＢＣ癌遺伝子の発現を検出するのが最も好ましい。次に示す１または複数の遺伝子を使用することができ、ＬＢＣ癌遺伝子と共に使用するのが最も好ましい。このような遺伝子には、ＡＨＲ、ＭＩＮＡ５３、ＩＤＳ、ＯＰＮ３、ＧＰＲ１０５、ＴＥＭ６、ＴＮＦＳＦ１３、ＳＶＩＬ、ＩＬ３ＲＡ、Ｃ６ｏｒｆ５６、ＦＲＡＧ１、ＧＯＳＲ１、ＫＩＡＡ１０３６、ＢＴＧ３、ＭＡＰＫ８ＩＰ３、ＬＩＬＲＢ３、ＡＲＨＨ、及びＮＰＴＸ２（配列番号１、３‐１８、及び２９）が含まれる。ＯＰＮ３及びＩＬ３ＲＡは、１または複数の他の遺伝子、好ましくは２つ以上の任意の遺伝子を含むプロファイルと組み合わせて用いる。最も好適な遺伝子発現プロファイルは、ＬＢＣ癌遺伝子及びＡＨＲの発現の変化を検出する。好適な３つの遺伝子セットは、ＬＢＣ、ＡＨＲ、及びＭＩＮＡ５３である。上記した遺伝子のスプライスバリアントなどの変異体も本明細書で有用である。
【００６４】
遺伝子発現プロファイル（適切な生物学的経路の説明となるものを含む）を作成する好適な方法では、タンパク質またはペプチドをコードできるまたはＲＮＡを転写できる遺伝子よって産生されるＲＮＡの量を決定する。これは、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ‐ＰＣＲ）、競合ＲＴ‐ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲ、ディファレンシャル・ディスプレイＲＴ‐ＰＣＲ、ノーザンブロット解析、及び他の関連した方法で達成するのが最良である。個別のＰＣＲ反応を用いてこれらの方法を行うことができるが、ｍＲＮＡから作製したコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはコピーＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を増幅し、これをマイクロアレイで解析するのが好ましい。多数の異なったアレイ構造及び製造方法が当業者には周知であり、言及することを以ってその開示内容の全てを本明細書の一部とする米国特許第５，４４５，９３４号、同第５，５３２，１２８号、同第５，５５６，７５２号、同第５，２４２，９７４号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４２９，８０７号、同第５，４３６，３２７号、同第５，４７２，６７２号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５２９，７５６号、同第５，５４５，５３１号、同第５，５５４，５０１号、同第５，５６１，０７１号、同第５，５７１，６３９号、同第５，５９３，８３９号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，５６８，７３４号、及び同第５，７００，６３７号に開示されている。
【００６５】
マイクロアレイ技術は、数千の遺伝子の安定状態のｍＲＮＡのレベルを測定可能であり、細胞生物学におけるＦＴＩｓの効果及びそのような効果の分析に基づいて治療効果の可能性を決定する強力なツールとなる。現在、２つのマイクロアレイ技術が広く用いられている。その１つはｃＤＮＡアレイであり、もう１つはオリゴヌクレオチド・アレイである。これらのチップの製造方法には違いがあるが、本質的に全てのダウンストリームデータ解析及びアウトプットは同じである。このような解析により、通常は、マイクロアレイの既知の位置の核酸配列にハイブリダイズするサンプルのｃＤＮＡ配列の検出に用いられる標識プローブから受け取った信号の強度の測定値が得られる。一般に、この信号強度は、ｃＤＮＡの量、従ってサンプルの細胞で発現するｍＲＮＡに比例する。様々なこのような技術を利用でき、便利である。好適な方法は、言及することを以ってその開示を本明細書の一部とする、リンスレイ（Linsley）らによる米国特許第６，２７１，００２号、フレンド（Friend）らによる同第６，２１８，１２２号、ペック（Peck）らによる同第６，２１８，１１４号、及びワン（Wang）らによる同第６，００４，７５５号に開示されている
【００６６】
発現レベルの解析は、このような強度を比較して行う。これは、検査サンプルの遺伝子発現強度とコントロールサンプルの遺伝子発現強度の比率マトリックスを作成して行うのが最良である。例えば、薬物で処理した組織からの遺伝子発現強度を、薬物で処理していない同じ組織からの遺伝子発現強度と比較することができる。これらの発現強度の比率が、検査サンプルとコントロールサンプルとの遺伝子発現の倍数比を示唆する。
【００６７】
遺伝子発現プロファイルはまた、様々な方法で表示することができる。一般的な方法は、比率マトリックスを、各列が検査サンプルを示し、各行が遺伝子を示すグラフィック・デンドログラムに配列することである。データは、類似の発現プロファイルを有する遺伝子が互いに近接するように配置される。各遺伝子の発現比率は色で確認することができる。例えば、１未満の比率（下方制御を示す）はスペクトルの青色成分で現れ、１を超える比率（上方制御を示す）はスペクトルの赤色成分で現れる。市販のコンピュータ・ソフトウエア・プログラムを利用して、このようなデータを表示することができる。このようなプログラムの例として、シリコン・ジェネティックス社（Silicon Genetics, Inc.）が販売する「ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＴ」及びパーテック社（Partek, Inc.）が販売する「ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ」及び「ＩＮＦＥＲ」ソフトウエアを挙げることができる。
【００６８】
異なって発現した遺伝子は、上記した遺伝子発現の評価から推定される、ＦＴＩでの治療後の病変細胞で、或いは治療前の非応答者に対して応答者で上方制御または下方制御されている。上方制御及び下方制御は相対語であって、検出可能な差（遺伝子発現の測定に用いるシステムにおけるノイズの影響以上の差）があるベースラインに対して遺伝子の発現量に見られることを意味する。この場合、ベースラインは、未処置の病変細胞で測定された遺伝子発現である。処置した病変細胞における目的の遺伝子の発現が、同じ測定法を用いたベースラインレベルに対して上方制御または下方制御される。上方制御及び下方制御のレベルは、ハイブリダイズさせたマイクロアレイプローブの強度測定の倍数比に基づいて決定するのが好ましい。１．５倍の変化がこのような区別に好ましい。すなわち、未処置の病変細胞に対して処置した病変細胞で遺伝子が異なって発現する前に、処置した細胞が未処置の細胞よりも少なくとも１．５倍以上、または１．５分の１未満の測定強度を有することが分かった。遺伝子発現測定値における１．７倍の変化がより好ましく、２倍またはそれ以上の変化が最も好ましい。
【００６９】
本発明のある方法では、患者が治療薬の使用に応答するか否かを決定するために様々な遺伝子について遺伝子発現プロファイルを比較する。応答者と非応答者を区別する遺伝子発現プロファイルを確立して、後述するようなコンピュータ可読メディアなどのメディアにそれぞれの遺伝子発現プロファイルを保存する。次いで、病変細胞（ＡＭＬの場合は造血芽細胞など）を含む患者のサンプルを採取する。サンプルは、骨髄細胞であって、患者を薬物で治療する前に通常の方法で患者の血清または腸骨稜から抽出するのが最も好ましい。骨髄吸引液を通常の方法で処理して、白血病芽細胞を濃縮するのが好ましい。次いで、患者の病変細胞からサンプルＲＮＡを採取して増幅し、好ましくはマイクロアレイを用いて（大きい遺伝子ポートフォリオの場合）、適切なポートフォリオの遺伝子について遺伝子発現プロファイルを作成する。次いで、サンプルの発現プロファイルを、応答者及び非応答者として既に決定した発現プロファイルと比較する。サンプルの発現パターンがＦＴＩ応答者の発現パターンに一致する場合は、ＦＴＩを用いた治療が示される（反対する医学的所見がない場合）。サンプルの発現パターンがＦＴＩ非応答者の発現パターンに一致する場合は、ＦＴＩを用いた治療が示されない。ＬＢＣ癌遺伝子の１つの遺伝子が用いられる場合などのように少数の遺伝子がポートフォリオに用いられる場合は、単純な核酸の増幅及び検出法が遺伝子調節の測定の最も好ましい方法である。このような場合、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ローリングサークル、ＬＣＲ、及び当業者に周知の他の増幅法をＰＣＲ法と共に用いるのが最も好ましい。ポートフォリオが多数の遺伝子を含む場合または多数の他の遺伝子の発現を測定するのが望ましい場合は、上記したようなマイクロアレイの強度測定に基づいて発現パターンを評価するのが好ましい。
【００７０】
同様の要領で、遺伝子発現プロファイル解析を行って治療反応を監視する。この方法の一態様では、上記したような遺伝子発現解析は、治療計画に亘って様々な期間でＦＴＩで治療した患者に対して行う。この遺伝子発現パターンが応答者に一致する場合は、患者の治療を継続する。一致しない場合は、患者の治療を、チロシンキナーゼ阻害剤などの別の治療薬を用いる、用量を変更する、またはＦＴＩ治療を止めるなどして変更する。このような解析により、検出可能な臨床的な徴候の前すなわち解析を行わない場合は曖昧な臨床的徴候に対して介入及び治療の変更が可能となる。
【００７１】
本発明の分子マーカーに多数の他の形態及び手法を診断目的で利用することができる。ゲノム領域のメチル化は、遺伝子発現レベルに影響を与え得る。例えば、遺伝子プロモーター領域の過剰メチル化は遺伝子発現を恒常的に下方制御し、過少メチル化は安定状態のｍＲＮＡレベルの増大につながり得る。従って、薬物応答を予測する遺伝子に関連したメチル化領域の検出を、遺伝子発現レベルを診断するための代替の方法として用いることができる。このような方法は当業者には周知である。また、プロモーター領域に存在する一塩基多型（ＳＮＰｓ）も遺伝子の転写活性に影響を与える。従って、当業者に周知の方法によるこのようなＳＮＰｓの検出を、応答者と非応答者で異なって発現する遺伝子の検出についての診断として用いることができる。
【００７２】
応答者と非応答者の区別は、治療前に存在する骨髄性白血病芽球及び／またはＣＤ３３及び／またはＣＤ３４などの細胞表面抗原の存在の割合を調べる別のアッセイで有利に行うことができる。ＣＤ３３及びＣＤ３４表面抗原の低発現は、ＦＴＩ治療に対する応答の可能性が高いことを示す。これは、このような抗原を発現するサンプル中の細胞の割合として単純に測定できる。応答者は、このようなＣＤ３３を発現する細胞を約６０％以下、ＣＤ３４を発現する細胞を約１５％以下有する。ＣＤ３３を発現する細胞の割合が６０％を超える、またはＣＤ３４抗原を発現する細胞の割合が１５％を超えると、患者がＦＴＩ治療に対して非応答者である可能性が高い。更に、上記したように採取された芽細胞の割合が約６０％未満であるサンプルは、ＦＴＩ治療に対して応答者である可能性が高く、芽細胞数がこの割合を超える場合は応答者である可能性が低い。ＣＤ３３＋、ＣＤ３４＋、及び芽細胞の数の割合の決定は、当分野で周知の任意の方法に従って行うことができ、標準的な病理学検査及び殆どの臨床検査室で行われる方法で最も効率的に行うことができる。
【００７３】
本発明の製品は、疾患の治療、診断、予知、進度、及び他の評価に有用な遺伝子発現プロファイルの表現である。これらの表現は、コンピュータ可読メディア（磁気メディアや光学メディアなど）などの自動読み取り可能なメディアに圧縮するのが好ましい。本発明の製品には、このようなメディアの遺伝子発現プロファイルの評価の取扱説明書も含まれる。例えば、本発明の製品には、上記した遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現プロファイルを比較するためのコンピュータ取扱説明書を含むＣＤ ＲＯＭが含まれ得る。製品には、患者のサンプルからの遺伝子発現データと比較できるように内部にデジタル記録された遺伝子発現プロファイルも含まれ得る。別法では、プロファイルは異なった表現形式で記録することができる。上記したパーテック社（Partek, Inc.）が販売する「ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ」及び「ＩＮＦＥＲ」ソフトウエアに含まれるようなクラスタリング・アルゴリズムが、このようなデータの視覚化に最も役立つであろう。
【００７４】
本発明に従った別の製品は、上記したアッセイを行うためのキットである。このようなキットはそれぞれ、人間または機械が読むことができる取扱説明書や上記したタイプのアッセイに一般的な試薬を含むのが好ましい。このようなキットには、例えば、本発明の遺伝子発現プロファイルを識別できるように構成された、上記したような核酸アレイ（例えば、ｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチド・アレイ）が含まれ得る。また、このようなキットには、例えば、逆転写酵素、逆転写酵素プライマー、一致するＰＣＲプライマーセット、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼや、限定するものではないが、スコーピオンプローブ（scorpion probe）、蛍光プローブアッセイ用のプローブ、分子指標プローブ、単一染色プライマー、またはエチジウムブロマイドなどの二本鎖ＤＮＡに特異的な蛍光染料などの好適な検出用試薬を含め、核酸の増幅及び検出を行うために用いる試薬も含まれ得る。表面抗原を検出するためのキットは、染色物質を含むか、或いはバッファー、抗‐抗原抗体、検出用酵素、及びカラシペルオキシダーゼのような基質などの成分を含む抗体系試薬、またはビオチン‐アビジン系試薬である。芽細胞を検出するためのキットの構成要素には、通常はフローサイトメトリー、芽細胞接着アッセイ、及び一般的に行われている他の芽細胞アッセイに用いる試薬が含まれる。
【００７５】
２００２年１０月３０日出願の本発明者による係属中の米国特許出願第１０／２８３，９７５号（名称：「白血病の評価及び治療方法（METHODS FOR ASSESSING AND TREATING LEUKEMIA）」）に記載されているように、好適なＦＴＩｓに加えて、本発明の好適な薬物は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路、ＴＧＦβ、ＷＮＴ、またはアポトーシス経路を調節する薬物である。このような薬物には、限定するものではないが、チロシンキナーゼ阻害剤、ＭＥＫキナーゼ阻害剤、Ｐ１３Ｋキナーゼ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、アポトーシス調節剤、及びこれらの組合せが含まれる。最も好適な代表的な薬物の例として、特に、Ｎｏｖａｒｔｉｓの「ＧＬＥＥＶＥＣ」チロシンキナーゼ阻害剤、Ｕ‐０１２６ ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＰＤ‐０９８０５９ ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＳＢ‐２０３５８０ ＭＡＰキナーゼ阻害剤、及びアンチセンス、リボザイム、及びＤＮＡ分解酵素、Ｂｃｌ‐ＸＬ、及び抗‐アポトーシスを挙げることができる。他の有用な薬物には、限定するものではないが、米国特許第６，３０６，８９７号のカラノリド（calanolides）、同第６，２８４，７６４号の置換二環式化合物、同第６，１３３，３０５号のインドリン（indolines）、及び同第６，２７１，２１０号のアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００７６】
ＦＴＩは、他の従来の抗癌剤と組み合わせて使用することもできる。このような抗癌剤は、例えばシスプラチンやカルボプラチンなどのプラチナ配位化合物（platinum coordination compound）、パクリタキセルやドセタキセルなどのタキサン化合物、イリノテカンやトポテカンなどのカンプトテシン化合物、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビノレルビンなどの抗腫瘍ビンカアルカロイド、５‐フルオロウラシル、ゲムシタビン、またはカペシタビンなどの抗腫瘍ヌクレオシド誘導体、シクロフォスファミド、クロランブシル、カルムスチン、またはロムスチンなどのナイトロジェンマスタードまたはニトロソウレア・アルキル化剤、ダウノルビシン、ドキソルビシン、またはイダルビシンなどの抗腫瘍アントラサイクリン誘導体、トラストズマブ（trastzumab）などのＨＥＲ２抗体、エトポシドやテニポシドなどの抗腫瘍ポドフィロトキシン誘導体、エストロゲン受容体拮抗薬または好ましくはタモキシフェン（或いは、トレミフェン、ドロロキシフェン（droloxifene）、ファスロデックス（faslodex）、及びラロキシフェン、またはエキセメスタン、アナストロゾール、レトラゾール（letrazole）、及びボロゾール（vorozole）などのアロマターゼ阻害剤）である選択的エストロゲン受容体調節物質を含む抗エストロゲン剤が含まれる。
【００７７】
ＦＴＩは、照射と組み合わせて上記したように患者に投与することができる。このような治療は、国際特許出願第ＷＯ ００／０１４１１号に開示されているようにＦＴＩが放射線増感剤として機能するため特に有利であり、このような照射の治療効果を促進する。現在、特に線形加速装置または放射性核種によって放射される電離放射線、特にγ放射線の照射手段は一般に使用されている。放射線核種による腫瘍の照射は外部または内部から行うことができる。
【００７８】
ＦＴＩ投与は、腫瘍の照射の１ヶ月前、特に１０日前、または１週間前に開始するのが好ましい。加えて、腫瘍の照射を複数回に分け、最初の照射と最後の照射の間にＦＴＩ投与を行うのが有利である。ＦＴＩの用量、照射の線量、及び照射の間隔は、腫瘍の種類、その位置、化学療法または放射線治療に対する患者の反応によって異なり、最終的には医師及び放射線科医の個別のケースに合わせた判断による。従って、本発明の方法に従った癌治療には、腫瘍を覆う宿主に対して、その腫瘍の近傍の宿主に対して照射を行う前、最中、または後で本発明に従った放射線増感効果のある量のＦＴＩを投与することが含まれる。
【００７９】
上記したように、本発明の薬物には、遺伝子治療、アンチセンス治療、またはＲＮＡ干渉に用いられる治療薬も含まれ得る。ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを細胞内に導入して、ｍＲＮＡの翻訳を阻害し、これによりｍＲＮＡをコードする遺伝子の機能を阻害することができる。オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子発現の阻害は、例えば、言及することを以って本明細書の一部とするストラチャン（Strachan）及びリード（Read）著、「ヒューマン・モレキュラー・ジェネティックス（Human Molecular Genetics）」、１９９６年に記載されている。
【００８０】
このようなアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートなどのＤＮＡの安定した誘導体、ＲＮＡ、２’‐Ｏ‐アルキルＲＮＡなどのＲＮＡの安定した誘導体、または他のアンチセンスオリゴヌクレオチド模倣物質とすることができる。アンチセンス分子は、微量注入、リポソーム封入、またはアンチセンス配列を含むベクターからの発現によって細胞内に導入することができる。
【００８１】
遺伝子治療の場合、目的の遺伝子を、レシピエント宿主細胞の感染によって治療用ＤＮＡの導入を仲介するウイルスベクターに結合することができる。好適なウイルスベクターの例として、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、及びポリオウイルスなどを挙げることができる。別法では、リガンドとＤＮＡの複合体またはアデノウイルスとリガンドとＤＮＡの複合体を用いた受容体仲介標的ＤＮＡの導入、リポフェクション膜融合、または直接微量注入を含む非ウイルス法によって治療ＤＮＡを遺伝子治療のために細胞内に導入する。このような方法及びその変更した方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子治療に適している。本遺伝子と共に用いるのに適した遺伝子治療の分子方法論のプロトコルが、ポール・Ｄ．ロビンス（Paul D. Robbins）編集、「遺伝子治療プロトコル（Gene Therapy Protocols）」、ヒューマン・プレス（Human press）、１９９６年、ニュージャージー州トトワに記載されている。
【００８２】
ＦＴＩは様々な種類の癌の治療に用いることができる。このような癌には、肺癌（例えば、腺癌及び非小細胞肺癌）、膵臓癌（例えば、外分泌膵癌などの膵癌）、結腸癌（例えば、結腸腺癌や結腸腺腫などの結腸直腸癌）、進行癌を含む前立腺癌、リンパ系の造血器腫瘍（例えば、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫）、骨髄性白血病（例えば、ＡＭＬ）、甲状腺濾胞癌、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉が起源の腫瘍（例えば、線維肉腫及び横紋筋肉腫）、黒色腫、奇形癌、神経芽細胞、神経膠腫、皮膚の良性腫瘍（例えば、角化棘細胞腫）、乳癌（例えば、進行乳癌）、腎癌、卵巣癌、膀胱癌、及び表皮癌が含まれる。
【００８３】
本発明の薬物を含む医薬的に有用な組成物は、薬学的に許容される担体の混合などによる既知の方法で配合することができる。このような担体及び配合方法は、レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）に記載されている。効果のある投与に適した薬学的に許容される組成物の調合では、このような組成物が有効量の薬物を含むようにする。薬物の有効量は、個人の状態、体重、性別、及び年齢などの様々な因子によって決まる。他の因子として、投与形態も含まれる。薬学的組成物は、皮下、局所、経口、及び筋肉内などの様々な経路から患者に与えることができる。
【００８４】
本発明の薬物には、この薬物の基の分子の化学誘導体が含まれる。すなわち、通常は基の分子の一部ではない別の化学部分を含み得る。このような化学部分は、基の分子の可溶性、半減期、及び吸収などを改善することができる。別法では、化学部分は、基の分子の不所望の副作用を減少させる、または基の分子の毒性を軽減することができる。このような化学部分の例は、レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）などの様々な文献に記載されている。
【００８５】
ここに開示した方法に従って得た化合物は、潜在的な毒性を最小限にすると共に阻害作用または活性作用を最大限にするために、通常の検査で決定される好適な用量で単独で使用することができる。加えて、他の物質との同時投与または連続投与も望ましい。
【００８６】
本発明の薬物は、投与用の従来の担体に様々な薬剤投与形態で投与することができる。例えば、薬物は、タブレット、カプセル（持続放出カプセル製剤及び徐放カプセル製剤の両方を含む）、ピル、粉末、顆粒、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロップ、及び乳剤などの経口製剤として、または注射で投与することができる。同様に、本発明の薬物は、薬学分野の技術者に周知の方法で、静脈投与（瞬時大量投与及び注入の両方）、腹膜内投与、皮下投与、密閉するまたは密閉しない局所適用、筋内投与の形態で投与することができる。毒性のない効果のある量の所望の化合物を修飾物質として用いることができる。
【００８７】
薬物の１日の用量は、１日に０．０１ｍｇ〜１，０００ｍｇと非常に広範囲にすることができる。経口投与の場合、本組成物は、治療する患者に対する症状改善の用量として、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、及び５０．０ｍｇの活性成分を含む分割錠または非分割錠の形態で提供するのが好ましい。有効量の薬物は、通常は１日に体重１ｋｇに付き約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量レベルで提供される。より具体的には、１日に体重１ｋｇに付き約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。所望の効果を得るために組み合わせる場合は用量を調節する。一方、様々な物質の用量は、個別に最適化し、単独で用いる場合よりも症状が改善される場合は組み合わせて相乗効果を得ることができる。
【００８８】
本発明に使用する化合物または修飾物質は、１日に１回の投与とすることもできるし、１日の合計投与量を１日に２回、３回、または４回に分けて投与することもできるという利点がある。更に、本発明に使用する化合物または修飾物質は、好適な鼻腔用担体を用いて鼻腔内に局所適用したり、当業者に周知の経皮パッチの形態で経皮的に投与することができる。経皮送達系の形態で投与する場合、投与計画に亘って断続的に投与するよりも連続的に投与する方が望ましい。
【００８９】
２種以上の活性成分の組合せ治療では、活性成分が異なる製剤の場合、これらの活性成分は同時に投与するか或いは別々にそれぞれの時間に投与することができる。
【００９０】
本発明の化合物または修飾物質を用いる投与計画は、患者の体型、人種、年齢、体重、性別、症状、治療する症状の程度、投与経路、患者の腎機能及び肝機能、及び使用する薬物を含め、様々な因子によって選択される。一般的な技術を有する医師または獣医師であれば、症状の進行を防止、抵抗、または停止するのに必要な有効量の薬物を容易に決定し処方することができる。毒性を与えずに効果が得られる範囲の薬物濃度を厳密に達成するには、標的部位に存在する薬物の動態学に基づいた計画が必要である。これについては、薬物の分布、平衡、及び排泄を考慮しなければならない。
【００９１】
本発明の薬物は、活性成分を構成することができ、従来の薬務に従って、所望の投与形態に適するように選択された好適な薬剤用希釈剤、添加物、または担体（本明細書では、これら全てを「担体」物質と呼ぶことにする）と混合して投与されるのが一般的である。このような投与形態には、経口タブレット、カプセル、エリキシル剤、及びシロップなどが含まれる。
【００９２】
例えば、タブレットまたはカプセルの経口投与形態の場合、薬物の活性成分を、エタノール、グリセロール、及び水などの経口投与した場合に無毒の薬学的に許容される不活性な賦形剤と組み合わせることができる。更に、所望または必要に応じて、好適な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、及び着色剤をこの混合物に含めることもできる。好適な結合剤には、限定するものではないが、デンプン、ゼラチン、グルコースやβ‐ラクトースなどの天然の糖、コーン甘味料、アカシア、トラガカント、またはアルギン酸ナトリウムなどの天然または合成のゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、及びワックスなどが含まれる。このような剤形に用いられる潤滑剤には、限定するものではないが、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び塩化ナトリウムなどが含まれる。崩壊剤には、限定するものではないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、及びザンサンガムなどが含まれる。
【００９３】
液体の形態の場合、薬物の活性成分は、例えばトラガカント、アカシア、及びメチルセルロースなどの合成及び天然のゴムなどの好適に香りが付けられた懸濁化剤または分散剤と組み合わせることができる。利用できる他の分散剤には、グリセリンなどが含まれる。非経口投与の場合、殺菌懸濁液や殺菌液が望ましい。通常は好適な防腐剤を含む等張製剤は、静脈内投与が望ましい場合に用いられる。
【００９４】
本発明の薬物は、小さな単層小胞、大きな単層小胞、及び多層小胞などのリポソーム送達系の形態で投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンなどの様々なリン脂質から形成することができる。
【００９５】
本発明の薬物は、化合物が結合する個々の担体としてモノクローナル抗体を用いて送達することもできる。薬物は、標的可能な薬物担体として可溶性ポリマーに結合させることもできる。このようなポリマーには、ポリビニル‐ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル‐アミドフェノール、ポリヒドロキシ‐エチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチル‐エネオキシドポリリシンが含まれる。更に、本発明の薬物は、例えば、ポリ乳酸、ポリ（ε‐カプロラクトン）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ‐ピラン、ポリシアノアクリレート、及びヒドロゲルの架橋結合または両親媒性ブロックコポリマー等の薬物の制御された徐放を達成するのに有用な生体分解性ポリマーのクラスに結合することができる。
【００９６】
経口投与の場合、薬物は、カプセル、タブレット、またはボーラスの形態で投与する、または食物に混合することもできる。カプセル、タブレット、及びボーラスは、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、またはリン酸２カルシウムなどの好適な担体と組み合わせた活性成分から構成される。このような単位剤形は、均一な混合物が得られるように希釈剤、充填剤、崩壊剤、及び／または結合剤を含む好適な微細粉末不活性成分と活性成分と良く混合して調製される。不活性成分は、薬物と反応しない、治療を受ける動物に対して無毒な物質である。好適な不活性成分には、デンプン、乳糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物ガム、及び植物油などが含まれる。このような製剤は、治療する動物種の大きさ及び体格、感染の種類及び程度などの多数の因子によって様々な量の活性成分及び不活性成分を含むことができる。活性成分はまた、この化合物を飼料に単純に混合したり、この化合物を飼料の表面に塗ったりして投与することができる。
【００９７】
化合物または修飾物質は、不活性な液体担体に溶解した活性成分からなる製剤を注射により非経口投与することができる。このような注射は、筋内注射、腔内注射、気管内注射、または皮下注射とすることができる。注射用の製剤は、不活性な好適な液体担体に混合した活性成分からなる。許容される液体担体には、落花生油、綿実油、及びゴマ油などの植物油、並びにソルケタル（solketal）及びグリセロールホルマールなどの有機溶媒が含まれる。別法として、水溶性非経口製剤も用いることができる。植物油が好適な液体担体である。このような製剤は、最終製剤が活性成分を０．００５ｗｔ％〜１０ｗｔ％含むように液体賦形剤に活性成分を溶解または懸濁して調整する。
【００９８】
本発明は更に、以下に示す限定目的ではない例によって説明する。
【００９９】
例
非予測的な例では、ＡＭＬ患者に、ＡＭＬのそれぞれの２８日サイクルの最初の２１日間は１日２回、開始経口投与量６００ｍｇで、６００ｍｇの（Ｒ）‐６‐［アミノ（４‐クロロフェニル）（１‐メチル‐１Ｈ‐イミダゾール‐５‐イル）メチル］‐４‐（３‐クロロフェニル）‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐キノリノン（Ｚａｒｎｅｓｔｒａ（商標）と呼ぶ）を投与した。患者を、再発性ＡＭＬ患者群と難治性ＡＭＬ患者群の２つの群に分けた。合計で２５７人の患者（再発性１３５人、難治性１１７人）を治療した。
【０１００】
Ｚａｒｎｅｓｔｒａ（商標）の治療に対する応答者を、表２に示されているように客観的応答（ＣＲ、ＣＲｐ、ＰＲ）のある患者、または病理や臨床部位によって決定される疾患が安定した抗白血病活性（白血病芽細胞の５０％を超える減少）を示す患者と定義する。抗白血病活性は、あらゆる骨髄芽球数が５％未満、または骨髄芽球の少なくとも半分への減少と定義する。
【０１０１】
【表２】
2006014739.tif 000005
【０１０２】
例１：マクロアレイ解析
Ｚａｒｎｅｓｔｒａ（商標）ＦＴＩ（活性成分：（Ｒ）‐６‐［アミノ（４‐クロロフェニル）（１‐メチル‐１Ｈ‐イミダゾール‐５‐イル）メチル］‐４‐（３‐クロロフェニル）‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐キノリノン）で治療する前及び治療した後に同意した患者から骨髄サンプルを採取し、ＰＢＳで希釈し、フィコール‐ダイアトリゾエート（１．０７７ｇ／ｍＬ）を用いて遠心分離した。白血球をＰＢＳで２回洗浄し、１０％ＤＭＳＯを含むＦＢＳに再懸濁し、−８０℃で瞬間凍結した。サンプルを３７℃で解凍し、２０％ ＦＢＳを含む１０倍量のＲＰＭＩを５分間滴下させて添加した。細胞は、５００ｇで１０分間遠心分離し、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５％ ＢＳＡを含む１０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、サンプルを７０μＭ フィルター（ニュージャージー州フランクリン・レイクスのベクトン・ディッキンソン・ラブウエア（Becton Dickinson Labware））に通して細胞屑を除去した。細胞の生存をトリパンブルー色素排除アッセイで測定した。解凍時の骨髄サンプルの平均生存率は３５％（０〜９６％の範囲）であった。生細胞数が比較的少ないため、サンプルの骨髄細胞の濃縮を行わなかった。約２×１０5の細胞をＣＤ３３‐ＦＩＴＣ及びＣＤ３４‐ＰＥ抗体（カリフォルニア州サンディエゴのベクトン・ディッキンソン・バイオサイエンシーズ・ファーミンゲン（Becton Dickinson Biosciences Pharmingen））の両方で二重標識し、ＦＡＣＳ分析を行った。
【０１０３】
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（カリフォルニア州サンタクラリタのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて細胞サンプルから抽出した。ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡの合成は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（カリフォルニア州サンタクララ）プロトコルに従って行った。複数のサンプルのＲＮＡ収量が１μｇ未満であるため、２回の線形増幅を行った。ハイブリダイゼーションの準備として、１１μｇのｃＲＮＡを、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ８．１、１００ｍＭ 酢酸カリウム、及び３０ｍＭ 酢酸マグネシウムの溶液中で、９４℃３５分間インキュベートしてランダムに断片化した。断片化ｃＲＮＡを、６０ｒｐｍにセットしたロティサリーオーブンで４５℃で１６時間、Ｕ１３３Ａアレイにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、アレイを洗浄し（６×ＳＳＰＥ及びＴｒｉｔｏｎ‐Ｘ１００（０．００５％）を含む０．５×ＳＳＰＥ）、ストレプトアビジン‐フィコエリトリン（ＳＡＰＥ：分子プローブ、オレゴン州のユージーン（Eugene））で染色した。結合した標識プローブの定量は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５００Ａ ＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナー（カリフォルニア州パロ・アルトのアジレント・テクノロジーズ（Agilent Technologies））を用いて行った。
【０１０４】
各アレイの全ての蛍光強度を等分目盛り（６００）に合わせた。チップの性能を、Ｓ／Ｎ比（生の平均Ｓ／Ｎ比）を計算して定量化した。Ｓ／Ｎ比が５未満の場合は、更なる解析のためにチップを取り外した。チップの少なくとも１０％に存在している遺伝子のみを更なる解析に含めた。このカットオフの後、約１２，０００のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットが残った。遺伝子発現データの品質は、主成分分析に基づいたアウトライヤーの決定及び遺伝子強度の正規分布分析によって更に管理することができる。
【０１０５】
カイ二乗検定及びスチューデントｔ‐検定を用いて、患者の応答と、患者の共変量、突然変異状態、ＣＤ３３及びＣＤ３４抗原の発現、白血病芽球数、及び遺伝子発現との間の相関性を調べる。高感度の応答を予想できる遺伝子を同定するためにパーセンタイル分析を用いた。例えば、少なくとも４０％の非応答者に比べて全ての応答者で上方制御または下方制御された遺伝子を同定した。両側スチューデントｔ‐検定（不等分散）に基づいて有意なｐ値（Ｐ＜０．０５）を示さなかった遺伝子は排除した。上位遺伝子の予測値を、Ｌｅａｖｅ‐ｏｎｅ‐ｏｕｔ‐ｃｒｏｓｓ‐ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ（ＬＯＯＣＶ）法で分析した。ここで、１つのサンプルをデータセットから取り出して、マーカーを１２，０００の遺伝子から再び選択した。次いで、この遺伝子の予測値を、線形判別分析を用いて残りのサンプルに対して調べる。感度は、真陽性の数を真陽性と擬陰性の合計数で除して求めた。特異度は、真陰性の数を真陰性と偽陽性の合計数で除して求めた。陽性予測値は、真陽性の数を真陽性と偽陽性の合計数で除して求めた。陰性予測値は、真陰性の数を偽陰性と真陰性の合計数で除して求めた。
【０１０６】
単変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて、患者の生存結果と各パラメータ（遺伝子数または芽球数）との関連を評価した。Ｃｏｘモデルの各パラメータの係数の推定値で、このような関連の強さを評価する。２つ以上の遺伝子を用いた場合は多変量ハザードモデルを用いた。応答者と非応答者を区別するクラシファイアを以下に示すように定義した。
ｂ１*ｘ１＋ｂ２*ｘ２＋ｂ３*ｘ３＋
このｂ１、ｂ２、ｂ３は、Ｃｏｘモデルからの係数の推定値であり、ｘ１、ｘ２、ｘ３は、標準化されたパラメータ値（芽球数、または遺伝子発現値のＬｏｇ10である）である。
【０１０７】
受信者動作曲線（ＲＯＣ）を用いて、各クラシファイアについて好適な閾値を選択する。これには少なくとも９０％の感度が必要である。ＲＯＣ診断により、各パラメータについての感度及び特異度を求める。加えて、まず遺伝子マーカーを、ランダムに選択した２９のサンプルの訓練セットを用いて良好な結果と不良な結果とを分ける能力で分類した。次いで、各遺伝子の予測値を残りの２９のサンプルに対して調べた。これにより、最も強い予測値を有する遺伝子を特定することができる。
【０１０８】
例２：白血病細胞の抗原の発現
白血病芽細胞は、表面抗原ＣＤ３３及びＣＤ３４を発現することが知られている。患者の骨髄性白血病細胞の９５％がＣＤ３３に対して陽性であり、５５％がＣＤ３４に対して陽性である。各サンプルにおける抗原を発現する細胞の平均パーセンテージは、ＣＤ３４が１３％、ＣＤ３３が４３％である。カイ二乗検定を行って、抗原の発現レベルと患者の結果との相関性を調べた。ＣＤ３４に対しては１５％、ＣＤ３３に対しては６０％のカットオフレベルを選択した。ＣＤ３３及びＣＤ３４の低発現（ＣＤ３４に対しては細胞集団の約１５％未満が陽性であり、ＣＤ３３に対しては細胞集団の約６０％未満が陽性である）は患者のＺａｒｎｅｓｔｒａ（商標）に対する応答に相関性を有する（それぞれｐ＝０．１３７、ｐ＝０．０５２）。両方の抗原の高発現（ＣＤ３４に対しては細胞集団の約１５％超が陽性であり、ＣＤ３３に対しては細胞集団の約６０％超が陽性である）は高い芽球数と強い相関性を有する。カプラン‐マイヤー分析（Kaplan-Meier analysis）も、ＣＤ３３の高発現が低い全生存率に相関性を有することを示している（図１）。
【０１０９】
例３：白血病芽球数の分析
ＣＤ３３及びＣＤ３４抗原の発現の分析は、白血病芽細胞のレベルが患者の応答に相関することを示した。部位の平均値及びＤＣＬの芽球数の測定値を求め、スチューデントｔ‐検定を行って、芽球数がＡＭＬ患者における患者応答に相関するかについて調べた。合計１９９人（その内２４人がＣＲ、ＣＲｐ、ＰＲ、またはＳＤである）の評価可能な患者から、芽球のパーセンテージが患者の結果に著しく相関することが分かった（ｐ＝０．０００６）。応答者は、進行疾患の芽球数（平均５１％）よりも低い芽球数（平均３４％）を有していた。合計２４人の応答者（ＳＤであると定義する）の内、唯一人が６０％よりも高い芽球数を有していた。全ての評価可能な患者に対するカイ二乗検定により、高芽球数と治療に対する抵抗性との間に有意な相関性があることが分かった（χ2＝９．５３）。
【０１１０】
カプラン‐マイヤー分析（Kaplan-Meier analysis）により、芽球数のレベルが低い（＜６０％）患者の方が芽球数のレベルが高い患者よりも全体の生存率が有意に高いことが分かった（図２）。これらの分析は、芽球数が約６０％よりも高い患者がＺａｒｎｅｓｔｒａ（商標）に応答しないであろうことを示している。
【０１１１】
例４：応答者と非応答者で異なって発現する遺伝子の同定
遺伝子発現解析のために、薬物で治療する前に８０人の患者から骨髄サンプルを採取した。８０の基準サンプルの内、１４のサンプルが評価できない患者からのものであったため、この１４のサンプルを排除した。サンプルの骨髄細胞を濃縮し、ｍＲＮＡ（遺伝子特異的タンパク質をコードする分子）を抽出し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａ遺伝子チップにハイブリダイズさせた。６６のサンプルの内、５８のサンプルが、このＵ１３３Ａチップに対するハイブリダイゼーション後の品質管理基準をパスした。遺伝子発現データを臨床情報と組み合わせ、レトロスペクティブ分析を行って応答者と非応答者を高感度で区別できる遺伝子を同定した。Ｚａｒｎｅｓｔｒａ（商標）に対する応答の予測に有用な複数の遺伝子マーカーを同定した（表３）。ＬＢＣ癌遺伝子（オンコＬＢＣ）の場合は、この遺伝子の予測値を、Ｌｅａｖｅ‐ｏｎｅ‐ｏｕｔ‐ｃｒｏｓｓ‐ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ法（表３）を用いてデータセットについて計算した。オンコＬＢＣ遺伝子の発現レベルは、臨床的に確認された全ての応答者を捕捉し、非応答者の半数以上を排除した。
【０１１２】
【表３】
2006014739.tif 000006
【０１１３】
【表４】
2006014739.tif 000007
【０１１４】
生存の分析により、オンコＬＢＣ発現に基づいて応答者として分類された患者（図３Ａ、ｐ＝０．００８４１）の方が臨床データから分類された患者（図３Ｂ、ｐ＝０．０８２７）よりも有意に優れていることが分かった。これは、オンコＬＢＣマーカーが全体的な生存率の高い非応答者のサブセットを同定したためである。Ｃｏｘハザードモデルに基づいてオンコＬＢＣと第２の遺伝子マーカーであるアリル炭水化物受容体（ＡＨＲ）を組み合わせると、特異度及び陽性予測値がそれぞれ７５％及び５６％に上昇した（図３Ｃ）。これらの結果は、オンコＬＢＣを単独で用いた場合及びＡＨＲ遺伝子と組み合わせて用いた場合に、Ｚａｒｎｅｓｔｒａ（商標）に対する応答の予測に有効なアレイが得られることを示している。
【０１１５】
分子マーカーとしてオンコＬＢＣ及びＡＨＲを用いたＬＯＯＣＶも良く機能した。カットオフを用いて最高の感度及び特異度を決定しても、陽性予測値（ＰＰＶ）及び感度は同じままであった。他の遺伝子の組合せを用いたＬＯＯＣＶの結果が表５に示されている。これは、マーカーの組合せによりこの方法の予測値を改善できることを例示している。
【０１１６】
【表５】
2006014739.tif 000008
【０１１７】
更に、ＬＢＣ及びＡＨＲクラシファイアを用いた患者の分類は、オンコＬＢＣ遺伝子または臨床応答による定義を用いた場合に比べると２つの患者群間の平均生存期間において類似の差を示した（図４Ｃ）。これらの結果は、オンコＬＢＣ単独またはＡＨＲ遺伝子との組合せが、現在のデータセットにおいてＺａｒｎｅｓｔｒａ（商標）に対する応答を予測するための有効な生体マーカーとして用いることができることを示している。
【０１１８】
Ｃｏｘハザードモデルを用いて、生存率の悪い患者と生存率の良い患者とを区別する他のマーカーの組合せを分析した（表６）。ここで、測定により５１の患者サンプルだけがＣＤ３３及びＣＤ３４抗原レベルを有していたため５１のデータを用いた。９０％を超える感度を、マーカーの適切なカットオフの決定に用いた。複数のマーカーを用いることにより、２つの患者群の平均生存期間の差を改善することができる。
【０１１９】
【表６】
2006014739.tif 000009
【０１２０】
例５：応答者と非応答者で異なって発現する遺伝子の同定（反復測定法）
全ての応答者と少なくとも４０％の非応答者との間で異なって発現する別の遺伝子を同定するために遺伝子発現データを用いて管理分析を行った。この基準は、可能な最大レベルの感度でティピファニブ（Tipifarnib）に対する応答を予測できる遺伝子を同定するために選択した。応答者と非応答者とを分類でき（表７及び表８）、ｔ‐検定で有意なｐ値（ｐ＜０．０５）が得られる合計１９の遺伝子が同定された。興味深いことに、このような遺伝子には、シグナル伝達、アポトーシス、細胞増殖、発癌、及び潜在的なＦＴＩ生物学に関与する遺伝子が含まれている（ＡＲＨＨ、ＬＢＣ、及びＩＬ３ＲＡ）。
【０１２１】
【表７】
2006014739.tif 000010
【０１２２】
【表８】
2006014739.tif 000011
【０１２３】
例６：最小セットの３遺伝子マーカーの同定
ＬＢＣ単独の場合よりも高い精度でティピファニブ（Tipifarnib）に対する応答を予測できる遺伝子マーカーの候補セットを同定するべく、ＬＯＯＣＶを用いて最適な遺伝子数を決定した。ｔ‐検定のｐ値に基づいて多数の遺伝子で複数のクラシファイアを作成し、ＬＯＯＣＶを用いてこれらのクラシファイアの誤差率を計算し、予測する応答の感度を１００％に維持した（図４Ａ）。３‐遺伝子クラシファイア（ＬＢＣ、ＡＨＲ、及びＭＩＮＡ５３を含む）が低い誤差率で応答を予測できることが分かった（図４Ａ）。これは、Ｌｅａｖｅ‐ｆｉｖｅ‐ｏｕｔ‐ｃｒｏｓｓ‐ｖａｌｉｄａｔｉｏｎを行った場合にも見られた。遺伝子を追加した場合の誤差率の上昇は、追加された遺伝子がクラシファイアに誤差を招いたことを示唆する。３‐遺伝子クラシファイアの場合、ＬＯＯＣＶにより、感度が８６％、特異度が７０％、全体の診断精度が７４％であることが示された（図４Ｂ）。各患者における３遺伝子の総発現値が図４Ｃに示されている。
【０１２４】
カプラン‐マイヤー分析（Kaplan-Meier analysis）により、予測された応答者群と非応答者群との間で生存率に有意差が再び示された（図４Ｄ）。更に、誤って分類された非応答者と正確に分類された非応答者を比較すると、誤って分類された非応答者の方が全体的に良好な生存率を示した（図５）。これは、臨床の基準では観察できない治療に対する応答レベルを遺伝子シグネチャが予測できることを示唆している。別法では、遺伝子シグネチャにより、ＦＴＩ治療に対する応答を予測して予後値を提供できるであろう。更に、未治療の患者に行った分析を用いて、遺伝子発現シグネチャと予後との関係を決定することができる。
【０１２５】
例７：抗体（予測）
ポリクローナル抗体の作製のために、ＬＢＣ癌遺伝子由来ペプチドを合成し、キーホールリンペットヘモシニアンに結合し、これを用いてウサギを免疫化した。この血清が対応するペプチドに対して反応するかをＥＬＩＳＡで検査し、陽性のバッチを親和精製した。精製した抗体は、組織部分にエピトープを有するペプチドを特異的に検出する。これは、抗体と対応するペプチドが同時に添加された場合に信号が完全に消滅することで確認できる。ＩＨＣで良く機能するこのポリクローナル抗体に加えて、自然の折りたたみ状態のタンパク質を検出できるモノクローナル抗体も作製した。モノクローナル抗体を作製するために、自然の折りたたみ及び翻訳後修飾が確実となるように哺乳動物細胞で産生された抗原を精製した。この抗原、すなわちＬＢＣオンコプロテイン‐ＩｇＧ定常部分融合タンパク質をマウス骨髄腫細胞で発現させ、このタンパク質をおとり（bait）としてＦｃ部分を用いて精製した。この精製された抗原を、Ｃ末端ポリクローナル抗体によりウエスタンブロットで確認した。この抗原を用いて、ＩｇＧ定常部分ではなくＬＢＣペプチドに対して作用する抗体を産生する陽性クローンから選択してＬＢＣペプチドに対するマウスモノクローナル抗体を得た。
【０１２６】
ＬＢＣ癌遺伝子を臨床で同定するためのキットを、これらの抗体または類似の抗体を用いて容易に作製することができる。このようなキットは、ＬＢＣペプチド（従ってＬＢＣ癌遺伝子）同定用の抗体、適切な標識試薬（例えば、酵素及びラベルなど）、並びにこのようなキットの臨床用途に有用な、希釈用バッファー、安定剤、及びこのようなアッセイに一般的に用いられる他の物質などの他の試薬（オプション）を含むことができる。
【０１２７】
例８：ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（予測）
ホルマリン固定したパラフィン包埋組織サンプルを５μｍ〜７μｍの厚みの切片に切断してシランがコーティングされたガラススライドに取り付け、３７℃で一晩そして６５℃で３０分間インキュベートしてから、キシレン中で１０分間２回脱パラフィン化する。次いで、サンプルを段階的な一連のエタノール液（１００％〜７０％）で再水和し、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中で５分間のリンスを２回行い、０．１Ｍ／Ｌのグリシンで５分間２回処理し、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含むＰＢＳで１５分間浸透させる。切片を、プロティナーゼＫ（フィンランドのヘルシンキのフィンジムス（Finnzymes））（μｇ／ｍＬ、ＴＥバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣＬ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０））で、３７℃で３０分処理し、３％ パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで、４℃で５分後置し、ＰＢＳ中で２回リンスする。正の電荷を、スライドを０．２５％（ｖ／ｖ）無水酢酸／１００ｍＭ／Ｌ トリエタノールアミン、ｐＨ８．０に５分間、２回浸してブロックする。スライドを、４×ＳＳＣ／５０％（ｖ／ｖ）脱イオンホルムアミドで、３７℃で１０分間、平衡させる。
【０１２８】
プローブは、ＴＡクローニングキット（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン（Invitrogen））を用いてＰＣＲ増幅した０．４ｋｂのＬＢＣ癌遺伝子ｃＤＮＡインサートをｐＣＲ‐ＩＩベクターに結合させて作製する。ＬＢＣ癌遺伝子のアンチセンスまたはセンスＲＮＡプローブのテンプレートを、好適なベクター構造を３’から５’方向または５’から３’方向に線形にして作製する。ＲＮＡ標識キット（ベーリンガー‐マンハイム（Boehringer-Mannheim））を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写でジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを作製する。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション溶液を用いて、４５℃で一晩行う。ハイブリダイゼーション溶液は、１×デンハート液（０．２ｇ／Ｌ Ｆｉｃｏｌｌ Ｔｙｐｅ４００、ファーマシア（Pharmacia））、０．２ｇ／Ｌ ポリビニルピロリドン、０．２ｇ／Ｌ ＢＳＡ（ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ、シグマ（Sigma））、４０％ ホルムアミド、１０％ デキストラン硫酸、４×ＳＣＣ、１０ｍＭ／Ｌ ジチオスレイトール、１ｍｇ／ｍＬ イーストｔＲＮＡ、１ｍｇ／ｍＬ ニシン精子ＤＮＡ、及び３００ｎｇ／ｍＬ ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを含む。ハイブリダイゼーション後、組織切片を、２×ＳＳＣで２回５分間、そして６０％ ホルムアミド／０．２×ＳＳＣで１回１５分間、３７℃で洗浄し、次いで、２×ＳＣＣで、室温で５分間２回リンスし、１００ｍＭ／Ｌ Ｔｒｉｓ‐ＨＣＬ（ｐＨ８．０）／１５０ｍＭ／Ｌ ＮａＣｌで１０分間２回洗浄する。信号の検出を、１：２５０のアルカリホスファターゼ‐共役ヒツジ抗ジゴキシゲニンＦａｂ断片（ベーリンガー‐マンハイム）を用いて行う。この信号を、切片をＮＢＴ／ＢＣＩＰ ＳＴＯＣＫ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ベーリンガー‐マンハイム）で１時間３０分間インキュベートして視覚化する。
【０１２９】
癌患者の腫瘍化細胞に見られるＬＢＣ癌遺伝子‐陽性細胞がＦＴＩに対する応答可能性が低いことを示唆している。
【０１３０】
例９：免疫組織化学（予測）
ＬＢＣ癌遺伝子のＣ末端ペプチドに対する親和精製ポリクローナル抗体をＩＨＣの検出及びＬＢＣ癌遺伝子の位置特定に用いる。ホルマリンに固定しパラフィンに包埋した正常組織及び腫瘍組織から得た４μｍの切片を、３‐アミノプロピル‐トリエトキシ‐シラン（ＡＰＥＳ、ミズーリ州セントルイスのシグマ（Sigma））がコーティングされたスライドに載せる。これらの切片を、段階的濃度のエタノールで脱パラフィン化して再水和し、室温で３０分間、メタノールペルオキシド（methanolic peroxide）（０．５％過酸化水素を含む絶対メタノール）で処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害する。抗原の回収は、電子レンジで５分間（６５０Ｗ）２回行う。
【０１３１】
Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ、カリフォルニア州バーリンガムのベクター・ラボラトリーズ（Vector Laboratories））を用いて免疫ペルオキシダーゼ染色を行う。ＬＢＣペプチド抗体は、１：２０００の最適な希釈濃度で使用する。ビオチン標識二次抗体及びペルオキシダーゼ標識アビジン‐ビオチン複合体の両方を切片上で３０分間インキュベートする。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈液を作成し、全てのインキュベーションを室温の湿室で行う。ある染色ステップと別の染色ステップの合間にスライドをＰＢＳで３回洗浄する。ペルオキシダーゼ染色は、室温で１５分間、３‐アミノ‐９‐エチルカルバゾール（3-amino-9-etylcarbazole）（シグマ（Sigma））溶液（０．０３％ 過酸化水素を含む０．０５Ｍ酢酸バッファー中に０．２ｍｇ／ｍＬの濃度、ｐＨ５．０）で視覚化する。最後に、切片を、マイヤーのヘマトキシリンで軽く後染色し、水溶性封入剤（Ａｑｕａｍｏｕｎｔ、ＢＤＨ）で封入する。コントロール実験では、一次抗体を正常なウサギの血清のＩｇＧ断片で置換する、或いは一次抗体をＬＢＣペプチドで予め吸収する。このような染色は、細胞のサブセットにＬＢＣ癌遺伝子が存在することを示唆する。
【０１３２】
例１０：酵素免疫測定法（予測）
ＬＢＣタンパク質またはＬＢＣ癌遺伝子に関連した特長的なペプチドに適するように免疫測定法を変更する。結腸腫瘍標本の消化物（免疫ペルオキシダーゼ染色した抗原を含む）を含む標準的な抗原を用いる。ヒト白血球は、ＡＭＬ患者から採取する。これらの標本をプールし、０．２％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウムを含む１０倍量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）で、４℃でホモジナイズする。このホモジネートを３７℃まで急速に加熱し、撹拌しながら試薬（最終濃度）を添加する。この試薬は、１ｍＭ システイン（シグマ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（シグマ）、及びパパイン（０．８単位／ｍＬ）（インディアナ州インディアナポリスのベーリンガー‐マンハイム）を含む。５分後、５ｍＭ ヨードアセトアミド（シグマ）を添加して消化を止める。このホモジネートを、４℃で１時間、１００，０００Ｘｇで遠心分離し、次いで、１０ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオリド及び１０ｍＭ アミノカプロン酸を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．９％食塩水‐バッファー（ｐＨ７．４）で透析する。次いで、ホモジネートを０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で小さなアリコットに凍結させる。
【０１３３】
ＬＢＣタンパク質またはペプチドの免疫測定法のために作成した用量反応曲線が、１００ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの抗原の範囲で線形を示す。血清の分析の場合は、アッセイの前に既に１０倍に希釈されているため、その範囲は１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬである。
【０１３４】
上記した例で説明した抗体の固相調製はＣＮＢｒ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファーマシア（Pharmacia））を用いて行う。マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｉ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ：ニューヨーク州グランドアイランドのグランド・アイランド・バイオロジカル社（Grand Island Biological Co.））を、抗体（２００μＬ／穴）５０ｍＭ 炭酸‐重炭酸バッファー（ｐＨ９．６）でコーティングし、４℃で１８時間インキュベートする。抗体液を除去した後、プラスチック上の部位に結合している残ったタンパク質を、２００μＬのアッセイ用バッファー（１％（ｖ／ｖ）ウサギ血清及び１％（ｗ／ｖ）ウシアルブミンを含むＰＢＳ）を添加してブロックする。室温で１時間インキュベートしてから、コーティングしたプレートをすぐにアッセイに用いる。
【０１３５】
アッセイを行うために、アッセイ用のバッファーで希釈した２００μＬのサンプルを３７℃で１時間〜５時間放置する。アッセイ用のバッファーで３回洗浄してから、カラシペルオキシダーゼに共有結合した２００μＬの抗体（Ｔｙｐｅ ＶＩ、シグマ）を各穴の中に分注し、３７℃で１時間半放置する。この結合体を、１０％（ｖ／ｖ）マウス血清を含むＰＢＳ １ｍＬ当たり免疫グロブリン ０．５μｇの濃度に希釈する。上記した洗浄の後、１穴に付き２００μＬの基質液を分注し、室温で３０分間放置する。この基質液は、１ｍＬの０．００３％ 過酸化水素／クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に付き０．４ｍｇのｏ‐フェニレンジアミンを含む。５０μＬの２Ｎ 硫酸を添加して反応を停止させ、酵素アッセイ・プレート・リーダー（ペンシルバニア州ピッツバーグのフィッシャー・サイエンティフィック社（Fisher Scientific Co.））を用いて４８８ｎＭでの吸光度を監視する。
【０１３６】
結合した酵素複合体のパーセンテージは次の式で求めることができる。
（Ｂ−Ｂ0）（Ｂt−Ｂ0）（１００）
この式において、Ｂはサンプルの吸光度、Ｂtは最大吸光度、そしてＢ0はブランクの吸光度である。各アッセイは、アッセイ用のバッファーで２６倍に希釈した血清サンプル及び標準的な消化物を用いて３回行う。免疫測定法の特異性を、関連のないタンパク質および非免疫ウサギ血清に対する抗体を含む様々な固相の抗体試薬に代えて検査する。固相抗体の中で、上記した例に従って作製した抗体のみが、高希釈度で抗原に結合する。
【０１３７】
血清ＬＢＣタンパク質のレベルを、正常なコントロール患者、良性血液疾患の患者、及び悪性血液疾患の患者に対して調べる。
【０１３８】
明らかな健常人から得た血清はＬＢＣタンパク質を有していない。サンプルの僅か５％が、検出限界またはそれ以上の値で、血清抗原を発現している。この値を、血清レベルの上昇に対するカットオフとする。カットオフ値よりも低い癌患者は、ＦＴＩでの治療に応答する可能性が高い。
【０１３９】
本発明の実施態様は以下の通りである。
（１）ＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）の存在または発現を分析して、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）での治療に患者が応答するか否かを決定することを特徴とする方法。
（２）更に、前記ＦＴＩの存在下で差次的に調節される遺伝子の発現を分析するステップを含むことを特徴とする実施態様（１）に記載の方法。
（３）前記分析ステップが、前記ＬＢＣ癌遺伝子に加えて２つ以上の遺伝子の発現を分析するステップを含むことを特徴とする実施態様（２）に記載の方法。
（４）前記遺伝子の配列が、配列番号１、３‐１８、及び２９から成る群から選択されることを特徴とする実施態様（２）に記載の方法。
（５）前記遺伝子の配列が配列番号１及び／または３であることを特徴とする実施態様（４）に記載の方法。
【０１４０】
（６）前記ＬＢＣ癌遺伝子が存在しないまたは発現していないと決定された患者を前記ＦＴＩで治療することを特徴とする実施態様（１）に記載の方法。
（７）前記ＬＢＣ癌遺伝子が存在しないまたは発現していないと決定された患者を前記ＦＴＩ以外の物質で治療することを特徴とする実施態様（１）に記載の方法。
（８）更に、前記ＦＴＩに対する応答を決定するために用いられる前記患者のサンプルがＣＤ３３及びＣＤ３４から成る群から選択される細胞表面抗原を含むか否かを決定するステップを含むことを特徴とする実施態様（１）に記載の方法。
（９）前記表面抗原を有する細胞の存在が前記ＦＴＩ治療に対する応答の予測になることを特徴とする実施態様（８）に記載の方法。
（１０）更に、前記ＦＴＩに対する応答を決定するために用いられる前記患者のサンプルにおける芽細胞のパーセンテージを決定するステップを含むことを特徴とする実施態様（１）に記載の方法。
【０１４１】
（１１）前記サンプルにおける芽細胞の存在が６０％未満であると、前記ＦＴＩに対する応答の予測になることを特徴とする実施態様（１０）に記載の方法。
（１２）ＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）の存在または発現を分析してファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）で治療する患者の治療を監視することを特徴とする方法。
（１３）更に、前記ＦＴＩの存在下で差次的に調節される遺伝子の発現を分析するステップを含むことを特徴とする実施態様（１２）に記載の方法。
（１４）前記分析ステップが、前記ＬＢＣ癌遺伝子に加えて２つ以上の遺伝子の発現を分析するステップを含むことを特徴とする実施態様（１２）に記載の方法。
（１５）前記遺伝子の配列が、配列番号１、３‐１８、及び２９から成る群から選択されることを特徴とする実施態様（１４）に記載の方法。
【０１４２】
（１６）前記遺伝子の配列が配列番号１及び／または３であることを特徴とする実施態様（１５）に記載の方法。
（１７）前記ＬＢＣ癌遺伝子が存在しないまたは発現されていないと決定された患者を前記ＦＴＩに応答する患者として治療することを特徴とする実施態様（１２）に記載の方法。
（１８）更に、前記ＦＴＩに対する応答を決定するために用いられる前記患者のサンプルがＣＤ３３及びＣＤ３４から成る群から選択される細胞表面抗原を含むか否かを決定するステップを含むことを特徴とする実施態様（１２）に記載の方法。
（１９）ＣＤ３４細胞表面抗原を有する細胞が１５％未満、またはＣＤ３３細胞表面抗原を有する細胞が６０％未満であると、前記ＦＴＩ治療に対する応答を示唆していることを特徴とする実施態様（１８）に記載の方法。
（２０）前記表面抗原を有する細胞の非存在が前記ＦＴＩ治療に対する応答を示唆していることを特徴とする実施態様（１８）に記載の方法。
【０１４３】
（２１）更に、前記ＦＴＩに対する応答を決定するために用いられる前記患者のサンプルにおける芽細胞のパーセンテージを決定するステップを含むことを特徴とする実施態様（１２）に記載の方法。
（２２）前記サンプルにおける芽細胞の存在が６０％以下であると、前記ＦＴＩに対する応答を示唆していることを特徴とする実施態様（２１）に記載の方法。
（２３）前記サンプルにおける芽細胞の存在が６０％を超えると、前記ＦＴＩに対する非応答を示唆していることを特徴とする実施態様（２２）に記載の方法。
（２４）量が減少しないで前記ＬＢＣ癌遺伝子が存在するまたは発現している患者を前記ＦＴＩに対する非応答者として治療することを特徴とする実施態様（１２）に記載の方法。
（２５）前記ＦＴＩが、（Ｒ）‐６‐［アミノ（４‐クロロフェニル）（１‐メチル‐１Ｈ‐イミダゾール‐５‐イル）メチル］‐４‐（３‐クロロフェニル）‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐キノリノンであることを特徴とする実施態様（１）に記載の方法。
【０１４４】
（２６）前記ＦＴＩが、（Ｒ）‐６‐［アミノ（４‐クロロフェニル）（１‐メチル‐１Ｈ‐イミダゾール‐５‐イル）メチル］‐４‐（３‐クロロフェニル）‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐キノリノンであることを特徴とする実施態様（１２）に記載の方法。
（２７）患者を治療する方法であって、
（ａ）前記患者におけるＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）の存在またはその遺伝子発現プロファイル分析して、前記患者がファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）での治療に応答するか否かを決定するステップと、
（ｂ）前記分析により前記患者が応答すると決定された場合に、前記患者を前記ＦＴＩで治療するステップとを含むことを特徴とする方法。
（２８）前記分析ステップが、２つ以上の遺伝子の発現を分析するステップを含むことを特徴とする実施態様（２７）に記載の方法。
（２９）前記ＦＴＩが、キノリノンまたはキノリン誘導体から成る群から選択されることを特徴とする実施態様（２７）に記載の方法。
（３０）前記ＦＴＩが、７‐（３‐クロロフェニル）‐９‐［（４‐クロロフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾール‐１‐イル）メチル］‐２,３‐ジヒドロ‐１Ｈ,５Ｈ‐ベンゾ［ｉｊ］キノリジン‐５‐オン、７‐（３‐クロロフェニル）‐９‐［（４‐クロロフェニル）（１Ｈ‐イミダゾール‐１‐イル）メチル］‐１,２‐ジヒドロ‐４Ｈ‐ピロロ［３,２,１‐ｉｊ］キノリン‐４‐オン、８‐［アミノ（４‐クロロフェニル）（１‐メチル‐１Ｈ‐イミダゾール‐５‐イル）,メチル］‐６‐（３‐クロロフェニル）‐１,２‐ジヒドロ‐４Ｈ‐ピロロ［３,２,１‐ｉｊ］キノリン‐４‐オン、８‐［アミノ（４‐クロロフェニル）（１‐メチル‐１Ｈ‐イミダゾール‐５‐イル）メチル］‐６‐（３‐クロロフェニル）‐２,３‐ジヒドロ‐１Ｈ,５Ｈ‐ベンゾ［ｉｊ］キノリジン‐５‐オン、及び（Ｒ）‐６‐［アミノ（４‐クロロフェニル）（１‐メチル‐１Ｈ‐イミダゾール‐５‐イル）メチル］‐４‐（３‐クロロフェニル）‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐キノリノンから成る群から選択されることを特徴とする実施態様（２９）に記載の方法。
【０１４５】
（３１）前記ＦＴＩが（Ｒ）‐６‐［アミノ（４‐クロロフェニル）（１‐メチル‐１Ｈ‐イミダゾール‐５‐イル）メチル］‐４‐（３‐クロロフェニル）‐１‐メチル‐２（１Ｈ）‐キノリノンであることを特徴とする実施態様（２７）に記載の方法。
（３２）前記遺伝子が、配列１‐１８及び２９を有する１または複数の核酸配列に相関性を有することを特徴とする実施態様（２８）に記載の方法。
（３３）前記遺伝子の配列が配列番号１及び／または３であることを特徴とする実施態様（３２）に記載の方法。
（３４）前記治療が、前記ＦＴＩ及び別の治療用組成物の投与を含むことを特徴とする実施態様（２７）に記載の方法。
（３５）前記別の治療用組成物が、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路、ＴＧＦβ、ＷＮＴ、Ｒｈｏ、またはアポトーシス経路を調節することを特徴とする実施態様（３４）に記載の方法。
【０１４６】
（３６）前記別の治療用組成物が、チロシンキナーゼ阻害剤、ＭＥＫキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、アポトーシス調節物質、及びこれらの組合せから成る群から選択されることを特徴とする実施態様（３４）に記載の方法。
（３７）ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）での患者の治療の効果を評価する物品であって、
ＦＴＩ応答を示唆する患者の遺伝子発現プロファイルを決定するメディアを含むことを特徴とする物品。
（３８）前記遺伝子発現プロファイルが、配列番号１‐１８及び２９の２つ以上の核酸配列に相関する遺伝子群から得られていることを特徴とする実施態様（３７）に記載の物品。
（３９）前記遺伝子の配列が配列番号１及び／または２及び／または３であることを特徴とする実施態様（３７）に記載の物品。
（４０）メディアに保存された遺伝子発現プロファイルの表現を含むことを特徴とする実施態様（３７）に記載の物品。
【０１４７】
（４１）ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）の治療に対する応答を決定するための試薬を含むことを特徴とするキット。
（４２）前記試薬がＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）の存在または発現の検出に用いられることを特徴とする実施態様（４１）に記載のキット。
（４３）前記試薬が、配列番号１、３‐１８、及び２９及びそれらの変異配列から成る群から選択される配列を有する遺伝子の発現の検出に用いられることを特徴とする実施態様（４２）に記載のキット。
（４４）前記遺伝子の配列が配列番号１及び／または３であることを特徴とする実施態様（４３）に記載のキット。
（４５）更に、ＣＤ３３及びＣＤ３４から成る群から選択される細胞表面抗原の検出に用いる試薬を含むことを特徴とする実施態様（４１）に記載のキット。
【０１４８】
（４６）更に、芽細胞の検出に用いる試薬を含むことを特徴とする実施態様（４１）に記載のキット。
（４７）前記試薬がＰＣＲプライマーを含むことを特徴とする実施態様（４１）に記載のキット。
（４８）更にプローブを含むことを特徴とする実施態様（４７）に記載のキット。
（４９）ＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）が存在しないまたは発現していないと決定された患者、または後にＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）が存在しないまたは発現していないと決定された患者を治療するための薬剤の調製にファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）を使用すること。
（５０）ＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）が存在しないまたは発現していないと後に確認された患者を治療するための薬剤の調製にファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）を使用すること。
【０１４９】
（５１）患者からのサンプルを分析してＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）の存在または発現を決定するための診断キット。
（５２）患者を治療するための組合せであって、
前記患者におけるＬＢＣ癌遺伝子（配列番号２）の存在または遺伝子発現プロファイルを決定して、前記患者がファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）での治療に応答するか否かを決定するための手段と、
分析により前記患者が応答すると示された場合に、前記患者の治療用の医薬品組成物の調製にＦＴＩを用いることを含むことを特徴とする組合せ。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】ＣＤ３３抗原の高発現及び低発現を示す患者のカプラン‐マイヤー分析（Kaplan-Meier analysis）のグラフ表示である。
【図２】高芽球数及び低芽球数を示す患者のカプラン‐マイヤー分析のグラフ表示である。
【図３Ａ】臨床応答クラシファイアを用いた患者のカプラン‐マイヤー生存分析のグラフ表示である。
【図３Ｂ】患者を分類するためにオンコＬＢＣ遺伝子の発現を用いた患者のカプラン‐マイヤー生存分析のグラフ表示である。
【図３Ｃ】患者を分類するためにオンコＬＢＣ遺伝子及びＡＨＲ遺伝子の発現を用いた患者のカプラン‐マイヤー生存分析のグラフ表示である。
【図４】Ａは最小セットの予測マーカーを同定するために１００％の感度でＬＯＯＣＶを行い、１〜１９の遺伝子を含むクラシファイアを個別に検査し、得られた誤差率をプロットした図であり、Ｂは応答者（Ｒ）及び非応答者（ＮＲ）に対してクラシファイアとして３‐遺伝子シグネチャを用いて行ったＬＯＯＣＶから作成した２×２の表であり、Ｃはｐ値が応答者群における遺伝子発現の有意な差を示す、３‐遺伝子クラシファイアから作成したスコアを示す表であり、Ｄは応答者及び非応答者として３‐遺伝子シグネチャによって分類された患者に対して行われたカプラン‐マイヤー曲線、並びに平均生存期間を示す表である。
【図５】応答者及び非応答者として３‐遺伝子シグネチャによって分類された患者に対して行われたカプラン‐マイヤー分析を示す表であって、臨床的には非応答者と定義されたが３‐遺伝子シグネチャでは応答者と分類された患者の生存曲線、並びに平均生存期間が示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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