(57)【要約】【課題】  卵細胞または卵母細胞の輸送過程における接着や活性低下を防止して、当該細胞を最適な状態で実験に供するための方法を提供すること。【解決手段】  1細胞／1分画で培養液とともに輸送容器内に収容された卵細胞または卵母細胞を4〜30℃で輸送し、前記輸送後の細胞を、死細胞を除去した後、1つの培養容器内に複数細胞が存在する条件下で18〜22℃にて3時間以上静置培養してから使用する。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
1細胞／1分画で培養液とともに輸送容器内に収容された卵細胞または卵母細胞を4〜30℃で輸送し、前記輸送後の細胞を、死細胞を除去した後、1つの培養容器内に複数細胞が存在する条件下で18〜22℃にて3時間以上静置培養してから使用することを特徴とする、卵細胞または卵母細胞の輸送および輸送後の使用方法。
【請求項２】
前記輸送後の細胞を4細胞／cm2以下または20細胞/ｍL以下で培養容器に入れて、静置培養することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記卵細胞または卵母細胞が遺伝子導入された卵細胞または卵母細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記卵細胞または卵母細胞がアフリカツメガエルの卵細胞または卵母細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記輸送容器および培養容器が細胞付着用の表面処理が施されていない容器である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記輸送容器および培養容器が細胞付着防止用の表面処理が施された容器である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記輸送容器が多穴プレートである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
1細胞／1分画で培養液とともに輸送容器内に収容された卵細胞または卵母細胞と、ピペット、培地、およびシャーレから選ばれるいずれか１つ以上とを含み、前記卵細胞または卵母細胞は4〜30℃で輸送され、輸送後の細胞は、死細胞を除去した後、１つの培養容器内に複数細胞が存在する条件下で18〜22℃にて3時間以上静置培養してから使用する旨の表示がされていることを特徴とする、卵細胞または卵母細胞を含むキット。
【請求項９】
前記卵細胞または卵母細胞が遺伝子導入された卵細胞または卵母細胞である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記卵細胞または卵母細胞がアフリカツメガエルの卵細胞または卵母細胞である、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵細胞または卵母細胞の輸送と輸送後の処理方法、ならびに当該方法を利用した卵細胞または卵母細胞を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子、色素、蛋白質、ぺプチド、薬物等の試料を導入したアフリカツメガエル等のカエルの卵母細胞は、サイズが比較的大きく、また低コストで多量に得られるため、薬物の作用確認、遺伝子機能の解析、蛋白質の組換え発現などに広く使用されている。最近では、研究用として遺伝子導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞（特許文献１参照）も提供されているが、こうした卵母細胞ではその取扱いにあたって注意しなければならない問題がある。
【０００３】
まず、研究用の卵母細胞は通常コラゲナーゼ処理等により濾胞細胞が取り除かれた状態で提供されるため、細胞同士や細胞と器壁とが接着しやすいという特質がある。殊に、不可避的に振動を受ける輸送過程や、浮遊細胞用ではない容器を用いた場合にはこうした接着が特に生じやすくなる。細胞同士や細胞と器壁との接着は、輸送後の卵母細胞を実験に供する際の、死細胞の除去や計数などの作業において不都合となる。しかしながら、接着した細胞を単離するには熟練が必要であり、未熟練者では単離の際に細胞を破壊してしまうこともあり、これは高価な遺伝子導入卵母細胞や他研究機関から供与された数に限りがある細胞の場合に大きな問題となる。
【０００４】
次に、輸送されてきた卵母細胞を実験に供する際に、しばしば細胞応答性の低下など、細胞の活性低下が問題となることがある。これは実験結果や判断に大きな影響を与え、ラボ間でデータ再現性がとれない理由のひとつとなっている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−６５２４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、卵細胞または卵母細胞の輸送過程における接着や活性低下を防止して、当該細胞を最適な状態で実験に供するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、細胞同士および細胞と器壁との接着を防ぐため、細胞を1細胞／1分画となるように輸送容器に収容した。さらに、細胞応答性が低下する原因は輸送時の温度設定にあると考え、アフリカツメガエル卵母細胞の培養至適温度である4〜30℃で輸送を行った。さらに、輸送後の細胞に対し、直ちに死細胞を除去した後、直径6センチ以上のシャーレに100個以下となるように移して18〜22℃で一定時間静置培養してから使用すれば、卵母細胞は高い細胞応答性を維持していることが確認された。
【０００８】
すなわち本発明は、1細胞／1分画で培養液とともに輸送容器内に収容された卵細胞または卵母細胞を4〜30℃で輸送し、前記輸送後の細胞を、死細胞を除去した後、1つの培養容器内に複数細胞が存在する条件下で18〜22℃にて3時間以上静置培養してから使用することを特徴とする、卵細胞または卵母細胞の輸送および輸送後の使用方法に関する。
【０００９】
前記方法において、輸送後の細胞は、4細胞／cm2以下または20細胞/ｍL以下となるように培養容器に入れて静置培養することが好ましい。
【００１０】
本発明で用いられる卵細胞または卵母細胞は、遺伝子導入された卵細胞または卵母細胞であってもよい。例えば、アフリカツメガエルの卵細胞または卵母細胞、あるいは遺伝子導入されたこれらの細胞を挙げることができる。
【００１１】
本発明で用いられる輸送容器および培養容器としては、細胞付着用の表面処理が施されていない容器が好ましく、細胞付着防止用の表面処理（例えば、ナルジェンヌンクインターナショナル社製のローセルバインディング処理等）が施された容器がより好ましい。輸送容器の好適な一例として、96穴等の多穴プレートを挙げることができる。
【００１２】
本発明は、前記方法を利用した卵細胞または卵母細胞を含むキットを提供する。前記キットは、1細胞／1分画で培養液とともに輸送容器内に収容された卵細胞または卵母細胞と、ピペット、培地、およびシャーレから選ばれるいずれか１つ以上とを含み、前記卵細胞または卵母細胞は4〜30℃で輸送され、輸送後の細胞は、死細胞を除去した後、１つの培養容器内に複数細胞が存在する条件下で18〜22℃にて3時間以上静置培養してから使用する旨の表示がされていることを特徴とする。前記表示は、その内容や趣旨を変更しない限りにおいて、その表現や使用語句を適宜変更しうる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、卵細胞または卵母細胞を細胞同士や細胞と器壁との接着を防いで輸送し、正常な活性（細胞応答性）を維持した状態で使用に供することができる。したがって、従来の研究用卵細胞または卵母細胞よりも取扱いが容易で、正確かつ再現性の高い実験結果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、図面を参照しながら本発明について詳細に説明する。
【００１５】
図1は、卵母細胞輸送用の容器および、容器内での卵母細胞の状態を示す。ここでは96穴マルチウエルプレートを用いた例を示すが、1細胞／1分画で細胞を収容できる限り、容器は96穴マルチウエルプレートに限定されるものではない。例えば、6穴、12穴、24穴、384穴等の他の多穴プレートを用いてもよいし、独立した小容器を多数用いてもよい。
【００１６】
容器はプラスチック製でもガラス製でもよいが、細胞の器壁への接着を防止するため、前記容器は浮遊細胞用の容器（細胞付着用の表面処理が施されていない容器）を用いることが必要である。できれば、容器は細胞付着防止用の表面処理、例えばナルジェンヌンクインターナショナル社製のローセルバインディング処理、あるいは通常の浮遊細胞培養用処理等が施されたものであることが好ましい。
【００１７】
こうして1細胞／1分画となるように細胞を培養液とともに充填した容器は、培養液がもれないように容器表面をシーリングして輸送に供される。
【００１８】
図6は、本発明の卵母細胞輸送方法および到着後の処理方法に関する望ましいフローの一例を示す。卵細胞または卵母細胞（遺伝子導入する場合は、遺伝子導入後1〜2日後の細胞が好ましい）は、培養液とともに96穴マルチウエルなどの多穴プレートにいれ、プレート表面をシーリングした後、4〜30℃で輸送する。輸送後の細胞は速やかに死細胞を取り除き、シャーレ等に移して18〜22℃で3時間以上培養してから実験に供する。
【００１９】
ここで重要なのは、輸送温度と輸送後の細胞の培養条件・培養時間である。輸送温度は、細胞の活性低下を防ぐため4〜30℃の温度帯に保たれることが必要である。また、輸送後の細胞は、１つの培養容器内に複数細胞が一定の密度を持って存在する条件下において、18〜22℃で3時間以上培養することが必要である。
【００２０】
１つの培養容器内に複数細胞が一定の密度を持って存在する条件としては、例えば、汎用されている直径6cmのシャーレ（容積約5〜10ｍL、容器内表面積約28.3 cm2）であれば、その中に細胞を100個以下（4 細胞／cm2以下または20細胞/ｍL以下の播種密度）となるように入れて培養を行う。培養容器は、上記と同様の条件下で培養可能なものであれば特に限定されず、フラスコでもビーカーでもよい。前記培養容器も、浮遊培養用あるいは細胞付着防止用の表面処理が施された容器であることが望ましい。
【００２１】
本発明の卵細胞または卵母細胞の輸送および輸送後の使用方法は、卵母細胞、特に遺伝子導入された卵母細胞を含む研究用キット（例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞発現系）に好適に利用できる。
【００２２】
前記キットは、1細胞／1分画で培養液とともに輸送容器内に収容された卵細胞または卵母細胞と、ピペット、培地、およびシャーレから選ばれるいずれか１つ以上を含み、前記卵細胞または卵母細胞は4〜30℃で輸送され、輸送後の細胞は、死細胞を除去した後、１つの培養容器内に複数細胞が存在する条件下、かつ（4 細胞／cm2以下または20細胞/ｍL以下の播種密度）となる条件下で18〜22℃にて3時間以上静置培養してから使用する旨の表示がされていることを特徴とする。前記表示は、説明書としてキットに添付されるほか、パッケージの表面に記載されていても、シールの形態でパッケージ表面に貼付されていてもよい。また、前記表示は１つの部位にすべて表示されている必要はなく、複数箇所に分けて表示されていてもよい。さらに、前記表示はその内容や趣旨を変更しない限りにおいて、その表現や使用語句を適宜変更しうる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
１．輸送後の培養時間と細胞活性
アフリカツメガエル卵母細胞を母体より摘出し、コラゲナーゼを用いて卵母細胞を単離した。特願2003-33171に記載の方法にしたがい、実験に適した細胞を選別した。選別した細胞を一晩培養した後、特願2000-256381に記載の装置を用いて、卵母細胞にGLAST（グルタミン酸アスパラギン酸トランスポーター）のRNAを導入した。
【００２５】
GLASTを導入した卵母細胞を18〜22℃で一晩培養した後、１細胞／１ウェルとなるように浮遊細胞用の96穴マルチウエルプレート（ナルジェンヌンク社製、ローセルバインディングプレート）に培養液と共に移し、培養液を満たした後、容器表面をシールした。図1に卵母細胞輸送用の容器と容器内の卵母細胞の状態を示す。シールした容器は緩衝材などでくるんだ後、発泡スチロール容器に入れ、宅配便業者に委託して常温で約半日の輸送に供した（輸送）。コントロールとして、同様にGLASTのRNAを導入した卵母細胞を、輸送せずに18〜22℃で同じ時間静置培養した（静置）。
【００２６】
約半日後、輸送されてきた細胞を到着後直ちに死細胞を除去し、培養液入りの直径6センチのシャーレに移して18〜22℃で培養した。着荷直後〜6.5時間の各タイムポイントにおいて、輸送細胞および静置細胞をサンプリング（N=6）し、二電極膜電位固定法にて100μMグルタミン酸反応を計測した。GLASTを発現した卵母細胞では、グルタミン酸刺激により電流変化が起こるが、この電流変化の大きさを細胞活性の指標とした。各タイムポイントにおける静置細胞の活性を1とし、輸送細胞の活性比をプロットした結果を図2に示す。図2に示されるよう、着荷直後における輸送細胞の活性は低下しているが、3時間以上の培養により輸送細胞の活性は回復し、6.5時間後までその効果が持続した。すなわち、輸送による細胞の活性低下は3時間以上の培養によって回復することが確認された。
【００２７】
２．容器と細胞活性
次に、培養および着荷後の培養に用いる容器と細胞活性の関連について検討した。図3-1のフローチャートに実験の概略を示す。GLASTのRNA導入後の細胞を一晩培養し、輸送群と静置群に分けた。輸送群は１細胞／１ウェルとなるように浮遊細胞用の96穴マルチウエルプレートに入れ、緩衝材などにくるんだ後、発泡スチロール容器に入れ、宅配便業者に委託して常温で約半日間輸送した。静置群は、直径6センチシャーレで培養するものと96穴マルチウエルプレートで培養するものの２つに分けた。なお直径6センチシャーレで培養したものをコントロールとして、この群に対する各群の活性比を算出した。
【００２８】
約半日後、輸送されてきた細胞を到着後直ちに死細胞を除去し、96穴プレートで培養する群（96→96）と直径6センチシャーレで培養する群（96→6）に分けた。同じタイミングで、静置群の細胞も死細胞除去後、96穴プレートで培養する群（96→96）と直径6センチシャーレで培養する群（96→6）に分けた。なお、コントロールの静置・直径6センチシャーレ培養の細胞は死細胞のみ除去し、そのまま培養した。
【００２９】
着荷2時間後および4時間後の細胞をサンプリング（N=6）し、細胞の活性を測定した。結果を図3-2に示す。図3-2に示されるように、輸送群の細胞では96穴プレートから直径6センチシャーレに移したもののみ活性の回復が見られた。一方、静置群であっても96ウエルにいれたままの細胞群ではコントロールに対する活性比が低下していた。すなわち、輸送の有無にかかわらず、96ウエルプレートでの長時間の培養は、卵母細胞の活性を低下させる。言い換えれば、卵母細胞の長時間の培養には複数の細胞が同一溶液中に一定の密度を持って存在することが重要であることが示唆された。
【００３０】
３．RNA導入後の静置培養時間と輸送後の細胞活性
次に、RNA導入後の静置培養時間と輸送後の細胞活性の関係について検討した。実験の概略を図4-1に示す。RNA導入後の細胞は、（1）RNA導入後一晩培養し、輸送する群、（2）RNA導入後二晩培養し輸送する群、（3）静置群の3群に分けた。（1）および（2）では輸送に約半日以上かかるため、（1）を培養2日、（2）を培養3日と呼ぶ。（1）および（2）の輸送群について、それぞれ同じ時間だけ静置培養した（3）の静置群（コントロール）に対する活性比を求めた。結果を図4-2に示す。図4-2に示されるように、RNA導入〜輸送までの時間にかかわらず、着荷直後の細胞では活性が低下しているが、3時間の培養により活性が回復することが確認された。すなわちRNA導入から輸送までの培養時間は一晩でも二晩でもよいが、輸送により低下した活性を回復させるためには、使用前に最低3時間の培養が必要であることが確認された。
【００３１】
４．輸送温度と細胞活性
次に、輸送中の温度と細胞の活性について検討した。RNA導入後、一晩培養した卵母細胞を１細胞／１ウェルとなるように浮遊細胞用の96穴マルチウエルプレートに入れ、培養液を満たした後、容器表面をシールした。容器を緩衝材などにくるんだ後、発泡スチロール容器に入れ、宅配便業者（ヤマト運輸）に委託して通常および4℃クール便で約半日間輸送した（輸送）。発泡スチロール箱内には温度記録計を入れ、輸送中の温度変化をモニタリングした。一方、コントロールとして、輸送群と同時にRNAを導入し、同じ時間だけ18〜22℃で静置培養した細胞を用意した（静置）。
【００３２】
約半日後、輸送されてきた細胞を到着後直ちに死細胞を除去し、直径6センチのシャーレに移して18〜22℃で培養した。温度記録計からデータを回収したところ、通常輸送の場合、箱内の温度変化は8±4℃であり、4℃クール便では-3±4℃であった。着荷2時間後、4時間後の細胞をサンプリングし、細胞活性を測定した。結果を図5に示す。図5に示されるように、通常輸送、4℃クール便共に着荷2時間後の活性比は低下していた。一方、着荷4時間後では通常輸送の場合は活性の回復が見られたが、4℃クール便では活性の回復が見られなかった。さらに4℃クール便の場合、長時間培養後の計測では細胞が死滅しデータを得ることができなかった。この結果より、卵母細胞の輸送温度指定はその培養至適温度である4〜30℃の範囲内である「通常（8±4℃）」が望ましいことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明によれば、従来の卵細胞または卵母細胞よりも取扱いが容易で、再現性の高い実験結果を得ることが可能な、研究用卵細胞または卵母細胞が提供される。本発明の方法およびキットは、医薬開発、遺伝子機能解析等、卵細胞や卵母細胞発現系を利用する種々の研究分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図1は、卵母細胞輸送用の容器（96穴プレート）および、容器内での卵母細胞の状態を示す模式図である。
【図２】図2は、細胞到着後の経過時間と細胞応答性（輸送／静置の活性比）の関係を示す。
【図３−１】図3-1は、細胞培養容器と細胞応答性の関係を検討するための実験の概略を示す。
【図３−２】図3-2は、着荷2時間および4時間後における、細胞培養容器と細胞応答性（コントロールに対する活性比）の関係を示す。
【図４−１】図4-1は、遺伝子導入後の静置培養時間と輸送後の細胞活性の関係を検討するための実験の概略を示す。
【図４−２】図4-2は、着荷直後（到着直後）と3時間後における、遺伝子導入後の培養時間（培養2日および培養3日）と細胞応答性（輸送／静置の活性比）の関係を示す。
【図５】図5は、着荷2時間および4時間後における、細胞輸送温度と細胞応答性（コントロールに対する活性比）の関係を示す。
【図６】図6は本発明の概略を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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