(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃ．グルタミカムにおける新規核酸分子を提供する。【解決手段】細胞膜の合成に必要な化合物の代謝に関与することが可能なタンパク質であるＭＣＴタンパク質をコードする特定の配列からなる群より選択された核酸配列またはその相補配列を含む、単離されたコリネバクテリウム−グルタミカムの核酸分子。また、当該核酸分子にもとづく宿主細胞、宿主細胞を用いたＭＣＴタンパク質の製造方法、コリネバクテリウム−ジフテリアの存在又は活性を診断する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子が表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれも含まない、配列表の奇数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO)：３及び７〜６７５に示された配列からなる群より選択された核酸配列又はその相補配列を含む、単離されたコリネバクテリウム−グルタミカムの核酸分子。
【請求項２】
核酸分子が表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれも含まない、配列表の偶数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO)：４及び８〜６７６に示された配列からなる群より選択されたアミノ酸配列又はその相補配列を含む、ポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項３】
核酸分子が表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれも含まない、配列表の偶数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO)：４及び８〜６７６に示された配列からなる群から選択されたアミノ酸配列又はその相補配列を含む、ポリペプチドの自然に発生する対立性変異体をコードする単離された核酸分子。
【請求項４】
核酸分子が表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれも含まない、配列表の奇数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO)：３及び７〜６７５に示された配列からなる群より選択されたいずれかのヌクレオチド配列全体又はその相補配列に対し、少なくとも５０％の相同性を持つヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項５】
核酸分子が表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれも含まない、配列表の奇数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO) ：３及び７〜６７５に示された配列からなる群より選択されたヌクレオチド配列又はその相補配列の、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの核酸フラグメントを含む、単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の核酸分子、および異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項８】
発現ベクターである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターによりトランスフェクションされた単離された宿主細胞。
【請求項１０】
前記細胞が微生物に由来する請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記核酸分子の発現の結果、前記細胞からのファインケミカルの製造が調節される請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
ファインケミカルが、有機酸、タンパク質原アミノ酸および非タンパク質原アミノ酸、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質、飽和および不飽和の脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミン、補助因子、ポリケチド、および酵素からなる群より選択される請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
適当な培地中で請求項９に記載の宿主細胞を培養し、これによりポリペプチドを製造することを含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１５】
アミノ酸配列が、表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれによってもコードされていない、配列表の偶数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO)：４、及び８〜６７６に示された配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
アミノ酸配列が、表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれによってもコードされていない、配列表の偶数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO) ：４、及び８〜６７６に示された配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの、自然に発生する対立性変異体を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
核酸分子が表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれも含まない、配列表の奇数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO）：３及び７〜６７５に示された配列からなる群より選択された核酸配列全体に対し、少なくとも５０％の相同性を持つヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
アミノ酸配列が、表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれによってもコードされていない、配列表の偶数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO) ：４及び８〜６７６に示された配列からなる群より選択されたいずれかのアミノ酸配列全体に対し、少なくとも５０％の相同性を持つアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸配列が、表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれによってもコードされていない、配列表の偶数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO) ：４、及び８〜６７６に示された配列のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、ポリペプチドフラグメントが前記アミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性を維持している単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
核酸分子が、表１に記載されたＦ表示核酸分子のいずれも含まない、配列表の奇数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO) ：３及び７〜６７５に示されたいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされている単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
異種アミノ酸配列を更に含む請求項１５〜２０のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。  
【請求項２２】
請求項９に記載の細胞を培養する工程を含み、ファインケミカルが製造されるファインケミカルの製造方法。
【請求項２３】
培養により得られた産物からファインケミカルを回収する工程を含む、請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２４】
前記細胞が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記細胞が、コリネバクテリウム−グルタミカム, コリネバクテリウム−ヘルキュリス、コリネバクテリウム−リリウム、コリネバクテリウム−アセトアシドフィリウム、コリネバクテリウム−アセトグルタミカム、コリネバクテリウム−アセトフィリウム、コリネバクテリウム−アンモニアゲン、 コリネバクテリウム−フジオケンス、コリネバクテリウム−ニトリロフィリウス、 ブレビバクテリウム−アンモニアゲン、ブレビバクテリウム−ブタニカム、 ブレビバクテリウム−ジバリカツム、ブレビバクテリウム−フラビン、ブレビバクテリウム−ヘアリ、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、ブレビバクテリウム−ケトソレダクタム、ブレビバクテリウム−ラクトフェルメンツム、ブレビバクテリウム−リネンス、ブレビバクテリウム−パラフィノリティカム、および表３に記載の株からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ベクターによる核酸分子の発現の結果、前記ファインケミカルの製造の調節される請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ファインケミカルが、有機酸、タンパク質原アミノ酸および非タンパク質原アミノ酸、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質、飽和および不飽和の脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミン、補助因子、ポリケチド、および酵素からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
ファインケミカルがアミノ酸である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
アミノ酸が、リジン、グルタマート、グルタミン、アラニン、アスパルタート、グリシン、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、およびトリプトファンから成る群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１から６のいずれかに記載の核酸分子の導入によってゲノムＤＮＡが変異した細胞を培養する工程を含むファインケミカルの製造方法。
【請求項３１】
請求項１〜５に記載の核酸分子の少なくとも1つ又は請求項１５〜２０に記載のポリペプチド分子の少なくとも1つの存在を検知する工程を含み、これにより患者のコリネバクテリウム−ジフテリアの存在または活性を診断する、患者のコリネバクテリウム−ジフテリアの存在または活性を診断する方法。
【請求項３２】
配列表の奇数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO)：３及び７〜６７５に示された群から選択された核酸分子を含み、核酸分子が混乱している宿主細胞。
【請求項３３】
配列表の奇数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO)：３及び７〜６７５に示された群から選択された核酸分子を含み、前記核酸分子が配列表の奇数の番号付けがされた配列番号（SEQ ID NO)：３及び７〜６７５を有するいずれかの配列に対して1個以上の核酸の修飾を含む宿主細胞。
【請求項３４】
配列表の奇数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO)：３及び７〜６７５に示された群から選択された核酸分子を含み、前記核酸分子の調節領域が、分子の野生型の調節領域に対して修飾されている宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本願は、１９９９年６月２５日出願米国仮出願第60/141031号明細書を優先権の基礎とするものである。更に本願は１９９９年７月８日出願ドイツ特許出願第19931454.3号明細書、 １９９９年７月８日出願ドイツ特許出願第 19931478.0号明細書、１９９９年７月８日出願ドイツ特許出願第19931563.9号明細書、１９９９年７月９日出願ドイツ特許出願第19932122.1号明細書、１９９９年７月９日出願ドイツ特許出願第19932124.8号明細書、１９９９年７月９日出願ドイツ特許出願第19932125.6号明細書、１９９９年７月９日出願ドイツ特許出願第.19932128.0号明細書、１９９９年７月９日出願ドイツ特許出願第 19932180.9号明細書、１９９９年７月９日出願ドイツ特許出願第19932182.5号明細書、１９９９年７月９日出願ドイツ特許出願第19932190.6号明細書、１９９９年７月９日出願ドイツ特許出願第19932191.4号明細書、１９９９年７月９日出願ドイツ特許出願第19932209.0号明細書、１９９９年７月９日出願ドイツ特許出願第19932212.0号明細書、１９９９年７月９日出願ドイツ特許出願第19932227.9号明細書、１９９９年７月９日出願ドイツ特許出願第19932228.7号明細書、１９９９年７月９日出願ドイツ特許出願第19932229.5号、１９９９年７月９日出願ドイツ特許出願第19932230.9号明細書、１９９９年７月１４日出願ドイツ特許出願第19932927.3号明細書、１９９９年７月１４日出願ドイツ特許出願第19933005.0号明細書、１９９９年７月１４日出願ドイツ特許出願第19933006.9号明細書、１９９９年８月２７日出願ドイツ特許出願第19940764.9号明細書、１９９９年８月２７日出願ドイツ特許出願第19940765.7号明細書、１９９９年８月２７日出願ドイツ特許出願第19940766.5号明細書、１９９９年８月２７日出願ドイツ特許出願第19940830.0号明細書、１９９９年８月２７日出願ドイツ特許出願第19940831.9号明細書、１９９９年８月２７日出願ドイツ特許出願第19940832.7号明細書、１９９９年８月２７日出願ドイツ特許出願第19940833.5号明細書、１９９９年８月３１日出願ドイツ特許出願第19941378.9号明細書、１９９９年８月３１日出願ドイツ特許出願第19941379.7号明細書、１９９９年８月３１日出願ドイツ特許出願19941395.9号明細書、１９９９年９月３日出願ドイツ特許出願第19942077.7号明細書、１９９９年９月３日出願ドイツ特許出願第19942078.5号明細書、１９９９年９月３日出願ドイツ特許出願第19942079.3号明細書および１９９９年９月３日出願ドイツ特許出願第19942088.2号明細書を優先権の基礎とする。上記出願の全内容は、参考のため本明細書に全て組み込まれているものとする。
【０００２】
本発明によると、新規バクテリア核酸分子が提供され、種々の用途に用いられる。用途の例としては、ファインケミカルを生産するために使用される微生物の識別、Ｃ．グルタミカムまたは関連するバクテリアにおけるファインケミカル生産調整、Ｃ．グルタミカムまたは関連するバクテリアの分類または識別、Ｃ．グルタミカムゲノムマップ作成のための参照点としての使用、および形質転換の標識としての使用が挙げられる。これらの新規核酸分子は、本明細書で膜構成（合成）および膜輸送（ＭＣＴ）タンパク質と呼ぶタンパク質をコードするものである。
【背景技術】
【０００３】
細胞内の天然の代謝工程による産物および副産物は食品、飼料、化粧品および医薬業を含む多種産業で用いられる。集合的に「ファインケミカル」と呼ばれるこれらの分子には、有機酸、タンパク質源および非タンパク質源のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド、脂質および脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミン類、補助因子（コファクター）および酵素が含まれる。これらの生産は、所望の分子を大量に生産および分泌させるために開発されたバクテリアの大規模な培養により最も簡便に行われる。この目的における特に有用な生物の一種に、グラム陽性、非病原性のバクテリアであるコリネバクテリウム−グルタミカム（コリネバクテリウム−グルタミカム)がある。株（菌種）を選択することにより、多数の変異株が開発されており、これらにより一連の所望の化合物が産生する。しかしながら、特定分子生産のための改良された株の選択は時間のかかる困難な作業である。
【０００４】
Ｃ．グルタミカムは、グラム陽性の好気性バクテリアであり、種々のファインケミカルの大量生産を行う産業分野において、および炭化水素（例えば石油中）の分解およびテルペイドの酸化に一般的に使用されている。本発明のＭＣＴ核酸分子の発現の調節または同ＭＣＴ核酸分子の配列の修飾は、微生物から得られる１種類以上のファインケミカルの生産を調節するため（例えばコリネバクテリウム（Corynebacterium）またはブレビバクテリウム（Brefibacterium)種からの１種類以上のファインケミカルの終了または生産を向上させるため）に行われる。
【０００５】
本発明のＭＣＴ核酸はコリネバクテリウム−グルタミカムまたはこれに密接に関連する微生物を識別するため、または微生物の混合集団におけるＣ．グルタミカムまたはこれに密接に関連する微生物の存在を認識するために用いられる。本発明は、多数のＣ．グルタミカム遺伝子の核酸の配列を提供するものであり、この配列は、緊縮（ストリンジェント）条件下で、微生物の単独培養体または微生物の混合集団培養体から抽出されたゲノムＤＮＡを、Ｃ．グルタミカムに特有のプローブ領域のスパニングにより検出し、目的の生物が存在するか否かを評価するものである。コリネバクテリウム−グルタミカム自体は非病原性であるが、ヒトにおける病原体種、例えばコリネバクテリウム−ジフテリア（ジフテリアの原因物質）に関連する。従って、このような微生物の検出は重要な臨床関連性を有する。
【０００６】
本発明のＭＣＴ核酸分子は、Ｃ．グルタミカムのゲノムまたは関連する微生物のゲノムの染色体地図作製の参照点としての作用も有する。
【０００７】
同様に、これらの分子、これらの変異体または一部は、遺伝子工学的に得られたコリネバクテリウムまたはブレビバクテリウム種の標識としての作用も有する。
【０００８】
本発明の新規核酸分子によりコードされるＭＣＴタンパク質は、例えば膜（膜）の生合成に必要な化合物の代謝（例えば生合成または分解）に関して機能し、細胞内外への１種類以上の化合物の膜輸送を助けることが可能である。
コリネバクテリウム−グルタミカムに用いられるクローニングベクターの有効性は、例えばSinskey等、米国特許第4,649,119号、Ｃ．グルタミカムおよび関連のブレビバクテリウム種（例えばlactofermentum）の遺伝的複製技術(例えばlactofermentum)(Yoshihama等著、J. Bacteriol. 162: 591-597(1985); Katsumata等著、J. Bacteriol. 159: 306-311 (1984); and Santamaria等著、 J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246 (1984))に記載されている。本発明の核酸分子は、この生物の遺伝子操作に用いられてもよく、これにより１種類以上のファインケミカルの生産が改良されるか、または更に効率的な製造が行われる。ファインケミカルの製造および製造効率の改善は本発明の遺伝子の操作による直接的効果であることも、間接的効果であることもある。
【０００９】
改変されたタンパク質を導入され、本発明のＭＣＴタンパク質が改変（変化）したことにより、Ｃ．グルタミカム株から得られるファインケミカルの収率、生産および／または製造効率に直接的な影響が与えられることがある。この様な細胞からファインケミカルを放出するＭＣＴタンパク質は数または活性の面で改善されており、大量の化合物を細胞外媒体に分泌することが可能であると共に、これを培地から回収することも以前より容易とされる。同様に、１種類以上のファインケミカル（例えばリン酸化合物、硫酸化合物、窒素化合物等）の生合成に必要な栄養の取り込みに関与するこれらのＭＣＴタンパク質は、数および活性において改善されており、これらの前駆体、補助因子または中間産物の細胞内濃度を上昇させることも可能であるである。更に、脂肪酸および脂質は重要なファインケミカルであるが、これらの化合物の生合成に関与する本発明の１種類以上のＭＣＴタンパク質の活性を最適化させ、数を増大させることにより、または上述の化合物の分解に関連する１種類以上のＭＣＲタンパク質の作用を低下させることにより、Ｃ．グルタミカム由来の脂肪酸および脂質分子の収率、生産および／または製造効率を向上させることも可能である。
【００１０】
本発明の１種類以上のＭＣＴ遺伝子を変異させることにより、Ｃ．グルタミカム由来の１種類以上の所望のファインケミカルの生産に間接的な影響を与える活性に変化を有するＭＣＴタンパク質を製造することも可能である。例えば、細胞における正常な代謝排出物（所望のファインケミカルの過剰生産により数量が増加する可能性がある）を、これらが細胞内のヌクレオチドおよびタンパク質に悪影響を与えたり（細胞の生存力を低下させることがある）、ファインケミカル生合成経路を妨害する（所望のファインケミカルの収率、生産または製造効率を低下させることがある）以前に効率的に細胞から放出させるように、排出物の放出に関与する本発明のＭＣＴタンパク質の数または活性を増加させてもよい。更に、所望のファインケミカルの細胞内質量が比較的大きい場合には、これが細胞に対して毒性に作用することがあるため、これらの化合物を細胞から放出することが可能な輸送体（トランスポータ）の活性または数量を増大させることにより、培養体中の細胞の生存力を増大させ、培養体中に所望のファインケミカルの製造を行う大量の細胞を得ることが可能である。本発明のＭＣＴタンパク質を、相対的な量の種々の脂質および脂肪酸分子が得られるように操作することも可能である。脂質は種類ごとに異なる物理特性を有しているため、膜における脂質組成を変化させると膜の流動性が著しく変化する。膜の流動性の変化は、膜を通過する分子の輸送と細胞の完全性とに影響を与え、この双方が大規模発酵培養におけるＣ．グルタミカム由来のファインケミカル製造に重大な影響を与える。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、Ｃ．グルタミカムにおける細胞膜の合成に必要な化合物の代謝等に関与することが可能なタンパク質、すなわちＭＣＴタンパク質をコードする新規核酸分子を提供することをその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明者等により、核酸分子が表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれも含まない、配列表の奇数の番号付けがされた配列番号のうち、配列番号（SEQ ID NO)：３及び７〜６７５に示された配列からなる群より選択された核酸配列又はその相補配列を含む、単離されたコリネバクテリウム−グルタミカムの核酸分子が見出された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本明細書では、ＭＣＴタンパク質をコードしている核酸分子をＭＣＴ核酸分子という。好ましい実施の形態において、ＭＣＴタンパク質は、Ｃ．グルタミカムにおける細胞膜の合成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を通過して行われる分子の輸送に関与する。この様なタンパク質の例は、表１に記載の遺伝子によりコードされるものを含む。
【００１４】
本発明は更に、ＭＣＴタンパク質をまたはこのうちの生物学的に活性なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子（例えばｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、およびＭＣＴをコードする核酸（例えばＤＮＡまたはｍＲＮＡ）の検出または増幅のためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして適する核酸フラグメントを含む。特に好ましい実施の形態において、単離された核酸分子は、配列表中の奇数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの配列（例えばSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7．．．）により示されるヌクレオチド配列のいずれか、配列表中の奇数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの配列（例えばSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7．．．）により示されるヌクレオチド配列のいずれか、またはこの様なヌクレオチド配列におけるコード領域または相補性領域を含むものである。他の特に好ましい実施の形態では、本発明の単離された核酸分子が、配列表中の奇数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ（例えばSEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7．．．）として示されているヌクレオチド配列にハイブリダイズするか、もしくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、更に好ましくは少なくとも約７０％、８０％または９０％、および更に好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上相同なヌクレオチド配列またはその一部を含む。好ましい実施の形態では、単離された核酸分子が、偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ（例えばSEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8...）に示されたアミノ酸配列のいずれかをコードする。この好ましいＭＣＴタンパク質は、本明細書に記載のＭＣＴ活性の少なくとも１種類を有することが好ましい。
【００１５】
他の実施の形態において、単離された核酸分子はタンパク質またはタンパク質の一部をコードするが、この場合のタンパク質またはその一部には本発明のアミノ酸配列（例えば配列表中の、偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの配列）に十分に相同な、例えばタンパク質またはその一部がＭＣＴ活性を維持するに十分な程度に相同なアミノ酸配列を含む。上述の核酸によりコードされたタンパク質またはその一部は、Ｃ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与する能力を維持していることが好ましい。好ましい実施の形態において、核酸分子にコードされたタンパク質は、本発明のアミノ酸配列（例えば配列表中の偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの配列から選択されるアミン酸配列全体）に対して少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、更に好ましくは少なくとも約７０％、８０％または９０％、および更に好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上相同である。他の好ましい実施の形態においては、このタンパク質は本発明のアミノ酸配全体に対して実質的に相同なＣ．グルタミカムタンパク質全体である（配列表中の奇数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯに対応するオープンリーディングフレームによりコードされたもの（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７．．．）。
【００１６】
他の好ましい実施の形態において、単離された核酸分子はＣ．グルタミカム由来のものであり、本発明のアミノ酸配列（例えば配列表中の偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのいずれかの配列）のいずれかに少なくとも約５０％以上相同な生物学的に活性なドメインを含むタンパク質（例えばＭＣＴ融合タンパク質）をコードし、かつＣ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与する能力を有するか、または表１に記載の１種類以上の活性を有するものである。この場合の核酸分子は、非相同のポリペプチドまたは調節領域をコードする非相同核酸配列も含まれる。
【００１７】
他の実施形態において、単離された核酸分子の長さは少なくとも１５ヌクレオチドであり、この核酸分子は本発明のヌクレオチド配列を含む核酸分子と緊縮条件下でハイブリダイズする（例えば配列表中の奇数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの配列）。単離された核酸分子は、天然に発生する核酸分子に対応するものであることが好ましい。単離された核酸が、天然に発生するＣ．グルタミカムＭＣＴタンパク質またはその生物学的に活性な部分をコードしていると更に好ましい。
【００１８】
更に、本発明はベクター、例えば本発明の核酸分子を含む組換え発現ベクター、およびこの様なベクターが組み込まれた宿主細胞を含む。一実施の形態においては、宿主細胞は、この様な宿主細胞を適当な培地で培養することによりＭＣＴタンパク質を製造するため用いられる。このように製造されたＭＣＴタンパク質は培地または宿主細胞から単離される。
【００１９】
更に、本発明はＭＣＴ遺伝子が導入されているか、または変化している遺伝的に変化した微生物を含むものである。一実施の形態では、この微生物のゲノムを、野生型または変異型ＭＣＴ配列をコードする本発明の核酸分子をトランス遺伝子として導入することにより変化させておく。他の実施の形態では微生物のゲノム中の内因性ＭＣＴ遺伝子に対して、改変されたＭＣＴ遺伝子のとの相同組換えにより例えば機能的に混乱させる等の変性が行なわれる。他の実施の形態では、微生物中の内因性または誘導されたＭＣＴ遺伝子が、１カ所以上の点変異、欠失、逆位により変化しているにもかかわらず機能性ＭＣＴタンパク質をコードしている。更に他の実施の形態では、微生物のＭＣＴ遺伝子の１種類以上の領域（例えばプロモーター、リプレッサー、インデューサー）がＭＣＴ遺伝子の発現が調節されるように変化している（例えば欠失、切断、逆位、点変異による）。この微生物がコリネバクテリウムまたはブレビバクテリウム属に属していると好ましく、コリネバクテリウム−グルタミカムに属していると更に好ましい。好ましい実施の形態では、この微生物を、所望の化合物、例えばアミノ酸、特にリジンの製造に使用することが好ましい。
【００２０】
更に、本発明は、コリネバクテリウム−ジフテリア(Corynebacterium diphteriae)の存在または活性を認識する方法を提供するものである。この方法は、被検体中の本発明の核酸またはアミノ酸分配列（例えば配列表中ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１〜６７６に示された配列）の１種類以上の検体（被験者／患者）から検出を含み、これにより、被検体中のコリネバクテリウム−ジフテリアの存在または活性が検出される。
【００２１】
また、本発明は単離されたＭＣＴタンパク質またはその一部、例えば生物学的に活性な部分を含む。好ましい実施の形態においては単離されたＭＣＴタンパク質またはその一部は化学的または環境的に有害な条件に対するＣ．グルタミカムの耐性を向上させる能力を有する。他の好ましい実施の形態では、単離されたＭＣＴタンパク質またはその一部が、Ｃ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与する。他の好ましい実施の形態では、単離されたＭＣＴタンパク質またはその一部が本発明のアミノ酸配列（例えば配列表の偶数のSEQ ID NO)に対して、Ｃ．グルタミカムにおける細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与する能力を維持する程度に相同であることが好ましい。
【００２２】
更に、本発明によると単離されたＭＣＴタンパク質の製造法が提供される。好ましい実施の形態では、ＭＣＴタンパク質が本発明のアミノ酸配列（例えば配列表中の偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの配列）を含む。他の好ましい実施の形態において、本発明は、本発明の全アミノ酸配列（例えば配列表中の偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの配列）（配列表中の奇数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯに示されたオープンリーディングフレームによりコードされている）に実質的に相同な、単離されたタンパク質全体を含む。更に他の実施の形態では、タンパク質は、本発明のアミノ酸配列（例えば配列表中の偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの配列）に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、更に好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％、および更に好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上相同である。他の好ましい実施の形態において、単離されたＭＣＴタンパク質は、本発明のアミノ酸配列（例えば配列表中の偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのいずれかの配列）のいずれかに少なくとも約５０％以上相同アミノ酸配列であり、Ｃ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与することができるか、または表１に記載の１種類以上の活性を有するものである。
【００２３】
更に、単離されたＭＣＴタンパク質は、例えば緊縮条件下で配列表に記載された偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのいずれかのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされているか、または少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、更に好ましくは約７０％、８０％、９０％、更に好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上相同なヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を含んでもよい。ＭＣＴタンパク質は本明細書に記載の１種類以上のＭＣＴ生物学的活性を有するモノであることが好ましい。
【００２４】
ＭＣＴポリペプチド、またはこのペプチドの生物学的に活性な部分は、非ＭＣＴポリペプチドと協同的に結合して、融合タンパク質を形成する。好ましい実施の形態では、融合タンパク質はＭＣＴタンパク質単独の場合と異なる活性を有する。他の好ましい実施の形態では、この融合タンパク質がＣ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与する。特に好ましい実施の形態では、この融合タンパク質を宿主細胞に導入することにより、細胞からの所望の化合物の生産が調節される。
【００２５】
更に、本発明は、タンパク質自体、基質もしくはＭＣＴタンパク質の結合対象との相互作用により、または本発明のＭＣＴ核酸分子の転写または翻訳を調節することにより、ＭＣＴタンパク質の活性を調節する分子をスクリーニングする方法を提供する。
【００２６】
更に本発明は、ファインケミカルの製造法を含む。この方法では、本発明のＭＣＴ核酸分子の発現を支配するベクターを含む細胞を培養し、これによりファインケミカルを製造するものである。好ましい実施の形態によると、同製造法にはこの様なベクターを含む細胞を得る工程が含まれ、この工程でＭＣＴ核酸の発現を支配するベクターを細胞に移入する。他の好ましい実施の形態においては、この方法は、培養体から得られたファインケミカルを回収する工程を更に含む。好ましい実施の形態では、細胞がコリネバクテリウムまたはブレビバクテリウム種由来であるか、表３に記載された株から選択されたものである。
【００２７】
更に、本発明の方法は、微生物由来の分子の製造を調節する方法を含む。この方法では、細胞をＭＣＴタンパク質活性またはＭＣＴ核酸発現を調節する薬剤と接触させて、細胞に関連する活性を、この薬剤を用いない場合の活性に対して変化させる。この場合、細胞が細胞膜成分についての１種類以上のＣ．グルタミカム耐性経路の調節を行うか、この膜を通過する化合物の輸送を調節し、これにより微生物による所望のファインケミカルの収率または製造速度が向上することが好ましい。ＭＣＴタンパク質活性を調節する薬剤としては、ＭＣＴタンパク質の活性またはＭＣＴ核酸の発現を刺激する薬剤が使用可能である。ＭＣＴタンパク質の活性またはＭＣＴ核酸の発現を刺激する薬剤の例には小さい分子、活性ＭＣＴタンパク質、およびＭＣＴタンパク質をコードする細胞中に導入された核酸がある。ＭＣＴ活性または発現を阻害する薬剤の例には、小さい分子、アンチセンスＭＣＴ核酸分子がある。
【００２８】
更に本発明は、別のプラスミドに存在するか、または宿主細胞のゲノムに組み込まれた、野生型もしくは変異型ＭＣＴ遺伝子を導入して得られた細胞からの所望の化合物の収率を調整する方法を含む。ゲノムに組み込まれる場合の導入はランダムであってもよい。また、天然の遺伝子が導入されたコピーにより代替されるように相同な組換えを行うことも可能である。これにより、調節されるべき細胞から所望の化合物が製造される。好ましい実施の形態においては、収率が上昇する。特に好ましい実施の形態において得られるファインケミカルはアミノ酸である。アミノ酸がＬ−リジンであると特に好ましい。
【００２９】
［発明の詳細な説明］
本発明は、Ｃ．グルタミカムの細胞膜成分の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与するＭＣＴ核酸およびタンパク質分子を提供する。本発明の分子は、Ｃ．グルタミカム等の微生物からのファインケミカルの製造調節に使用可能である。ファインケミカルの製造調節は直接的行われるか（例えば脂肪酸の生合成が過剰発現または最適化されると、タンパク質が、変性されたＣ．グルタミカム由来の脂肪酸の収率、製造および／または製造効率に直接的な影響を与える）、または所望の化合物の収量、生産および／または製造効率を結果的に上昇させる間接的な影響を与えるか（例えば細胞膜成分の代謝が調節されると、細胞膜成分の収率、製造および／または製造効率が変化し、これにより１種類以上のファインケミカルの製造に影響が与えられる）。本発明について、以下に更に詳細に説明する。
【００３０】
［１．ファインケミカル］
「ファインケミカル」という用語は従来の認識どおり、生物から生産され、種々の産業、例えば医薬、農業、化粧品産業（これらに限定されるものではない）に用いられる分子を意味する。この様な化合物の例には、有機酸、例えば酒石酸、イタコン酸、ジアミノピメリン酸、タンパク質原またはタンパク質原以外のアミノ酸、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド（Kuninaka, A.著、(1996) Nucleotides and related compounds, p. 561-612、（Biotechnology第６巻における論考、Rehm等著、VCH編、Weinheim、および同文献中に記載された参考文献）、脂質、飽和および不飽和脂肪酸（例えばアラキドン酸）、ジオール（例えばプロパンジオールおよびブタンジオール）、炭水化物（例えばヒアルロン酸およびトレハロース）、芳香族化合物（例えば芳香族アミン、バニリンおよびインジゴ）、ビタミン類および補助因子（Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 第A27巻、“Vitamins”, p.443-613 (1996) VCH: Weinheimおよび同文献中に記載された参考文献、Ong, A.S., Niki, E. & Packer, L. 著、(1995) “Nutrition, Lipids, Health, and Disease ”Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research-Asia（マレーシア、ペナンにおいて１９９４年９月１〜３日に開催）、(1995)）、 酵素、ポリケタイド(Cane等 (1998) Science 282: 63-68)、およびGutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086および同文献中に挙げられた参考文献中に記載されている他の全ての化学物質がある。これらのファインケミカルの代謝および所定の使用法について以下に詳細に説明する。
【００３１】
Ａ．アミノ酸代謝および使用法
アミノ酸はあらゆるタンパク質の塩基性構造単位であるため、全生物の正常な細胞機能に重要である。「アミノ酸」の用語は従来より公知である。タンパク質源となるアミノ酸は２０種類存在し、タンパク質の構造単位としての役割を有し、ペプチド結合により結合する。一方、タンパク質原以外のアミノ酸（１００種類が公知である）がタンパク質内に一般的に見出される（Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 第A2巻、p. 57-97 VCH: Weinheim (1985)参照）。
【００３２】
アミノ酸−は、Ｄ−またはＬ−光学的立体配置を有し、天然に発生するタンパク質には通常Ｌ−アミノ酸のみが存在する。２０種類のタンパク質原アミノ酸の各生合成および分解経路は、原核細胞および真核細胞（例えばStryer, L. Biochemistry第３版、578-590頁、(1988)参照）の双方において顕著な特徴を有する。必須アミノ酸（ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリン）は、これらが通常、複雑な生合成における栄養的必須成分であるためにこのように呼ばれるものであり、簡単な生合成経路により残りの１１種類の「非必須」アミノ酸（ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリン）に変換される。高等動物は、これらのアミノ酸の幾つかを合成する能力を保持するが、必須アミノ酸は食事から供給されなければならず、これにより、正常なタンパク質合成が起こる。
【００３３】
タンパク質合成における機能は別に、これらのアミノ酸は、本来重要な化学物質であり、多くは食品、飼料、化学、化粧品、農業、医薬の各業界で様々に使用されている。リジンはヒトのみならず、単胃動物、例えば飼鳥類および豚においても栄養的に重要である。グルタミン酸塩は最も一般的に使用される香味添加物であり（グルタミン酸ソーダ、ＭＳＧ）、アスパラギン酸塩、フェニルアラニン、グリシンおよびシステインと同様に食品業界全体で広く使用されている。グリシン、Ｌ−メチオニンおよびトリプトファンは、化粧品業界で全て使用されている。グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、アルギニン、プロリン、セリンおよびアラニンは医薬品および化粧品業界の双方で使用されている。スレオニン、トリプトファンおよびＤ／Ｌメチオニンは一般的な飼料添加剤である（Leuchtenberger, W.著、(1996) Amino aids-technical production and use, p. 466-502 （Rehm等著 (編) Biotechnology第6巻、第14a章, VCH: Weinheim）。更に、これらのアミノ酸は合成アミノ酸およびタンパク質合成の前駆体、として使用されることがわかっている。この例にはＮ−アセチルシステイン、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン、（Ｓ）−５−ヒドロキシトリプトファンおよび（Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 第A2巻、p. 57-97, VCH: Weinheim 1985）に記載の他の物質がある。
【００３４】
生物、例えばバクテリアにより製造される天然のアミノ酸は顕著な特徴を有する（bacterial amion biosynthesis and regulation thereof, Umbarger, H. E.著、(1978) Ann. Rev. Biochem. 47:533-606参照）。グルタミン酸塩は、クエン酸回路の中間体であるα−ケトグルタル酸の還元的アミン化により合成される。次いで、グルタミンからグルタミン、プロリン、アルギニンがそれぞれ製造される。セリンの生合成は、３−ホスホグリセレート（解糖の中間体）を出発物質として３工程から成り、酸化、アミノ基転移、および加水分解工程を経てこのアミノ酸が得られる。システインおよびグリセリンの双方はセリンから生産され、前者はホモシステインとセリンの縮合により、後者は側鎖β−炭素原子が、トランスヒドロキシメチラーゼにより触媒される反応において、テトラヒドロ葉酸塩に伝達されることにより製造される。
【００３５】
フェニルアラニンおよびチロシンは、プレフェネート合成後の最後の２工程のみが異なる９工程の生合成経路において、解糖経路およびペントースリン酸経路の前駆体、エリトロース４−リン酸およびホスホエノールピルビン酸から合成される。トリプトファンもこれらの２つの主要な分子から製造されるが、合成は１１工程の経路によるものである。チロシンは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼにより触媒される反応においてフェニルアラニンから合成可能である。アラニン、バリンおよびロイシンは、全て、解糖の最終生成物であるピルビン酸の生合成産物である。アスパラギン酸塩は、クエン酸回路の中間体であるオキサロ酢酸から製造される。イソロイシンはスレオニンから生成する。複雑な９工程の経路により、活性化された糖の５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸からヒスチジンが製造される。
【００３６】
細胞のタンパク質合成に必要な分を上回るアミノ酸は貯蔵されずに劣化し、細胞の主要な代謝経路における中間体を提供する（Stryer, L. Biochemistry、第３版、 21章、“Amino Acid Degradation and the Urea Cycle” p. 495-516 (1988)参照）。細胞は不必要なアミノ酸を有用な代謝中間体に変換することができるが、合成によるアミノ酸合成ではエネルギー、前駆物質分子および必要な酵素において高コストとなる。すなわち、アミノ酸生合成がフィードバック阻害により調節されていることは驚くべきことではなく、特別なアミノ酸の存在により、製造速度が低下したり、完全に停止する（アミノ酸生合成経路におけるフィードバックメカニズムについてはUllman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, “Vitamins” 、第A27巻、p. 443-613, VCH: Weinheim, 1996を参照のこと）。従って、特定のアミノ酸の放出は、そのアミノ酸の細胞内における存在量により制御されている。
【００３７】
Ｂ．ビタミン、補助因子、および機能性食品の代謝および使用法
ビタミン、補助因子、および機能性食品には他の種類の分子が含まれ、バクテリア等の生物はこれらを簡単に合成することができるが、高等動物はその合成能力を失い、摂取する必要がある。これらの分子は、生物学的に活性な物質そのものであるか、または種々の代謝経路における電子の担体および中間体として作用する。これらの化合物は栄養的な価値とは別に、着色剤、酸化防止剤、触媒または他の加工助剤としての重要な工業的価値を有する（これらの化合物の構造、活性および工業的用途についは例えばUllmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry、第A27巻、“Vitamins”, p.443-613 (1996) を参照のこと）。「ビタミン」という用語は従来より認識されているとおりであり、この物質は生物が通常の機能を得るために必要であるが、生物自身は合成不能な栄養分を含む。ビタミンは補助因子および機能性食品化合物を含む。補助因子（コファクター）という用語は、通常必要な酵素活性を得るための非タンパク質原化合物を含む。このような化合物は、有機物でも、無機物でもよいが、本発明のコファクター分子は有機物であると好ましい。「機能性食品化合物」という用語には動植物、特に動物の健康に利益を与える補助食品が含まれる。この様な分子の例はビタミン、酸化防止剤、および所定の脂質（例えば多価不飽和脂肪酸）である。
【００３８】
これらの物質を製造することが可能な生物、例えばバクテリアにおけるこれらの物質の生合成は、顕著な特徴を有する(Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, “Vitamins” 第A27巻, p. 443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E. & Packer, L.著、(1995) “Nutrition, Lipids, Health, and Disease” Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, およびthe Society for Free Radical Research  Asia（マレーシア、ペナンにおいて１９９４年９月１〜３日に開催 ）、AOCS Press: AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S)。
【００３９】
チアミン（ビタミンＢ1）は、ピリミジンとチアゾール部分の化学的結合により製造される。リボフラビン（ビタミンＢ2）は、グアノシン−５’−三リン酸（ＧＴＰ）およびリボース−５’−リン酸から合成される。リボフラビンはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の合成に使用される。集合的に「ビタミンＢ6」と呼ばれる化合物のファミリー（例えばピリドキシン、ピリドキシアミン、ピリドオキサ−５’−リン酸、および慣用の塩酸ピリドキシン）の全ては、一般的な構造単位である５−ヒドロキシ−６−メチルピリジンの誘導体である。パントテネート（パントテン酸、（Ｒ）−（＋）−Ｎ−（２，４−ジヒドロキシ−３，３−ジメチル−１−オキソブチル）−β−アラニン）は、化学合成または発酵のいずれかにより製造される。パントテン酸生合成の最終工程は、β−アラニンとパントイン酸のＡＴＰにより稼働する縮合である。パントイン酸またはアラニンへの変換、およびパントテン酸への縮合における生合成工程にかかわる酵素は公知である。パントテン酸の代謝活性形は補酵素Ａであり、これを得るために、酵素による５工程の生合成が起こる。パントテン酸、ピリドキサル−５’−リン酸、システインおよびＡＴＰは補酵素Ａの前駆体である。これらの酵素はパントタン酸の生成を触媒するのみではなく、（Ｒ）−パントン酸、（Ｒ）−パントラクトン、（Ｒ）−パンテノール（プロビタミンＢ５）、パンテテイン（およびその誘導体）および補酵素Ａも製造する。
【００４０】
微生物中の前駆体物分子、ピメロイル−ＣｏＡからのビオチン生合成は、詳細に研究されており、関与する数種類の遺伝子が認識されている。対応のタンパク質の多くが、Ｆｅクラスター合成に関与することわかっており、ｎｉｆＳタンパク質のメンバーである。リポ酸は、オクタン酸から誘導され、エネルギー代謝の補酵素として作用し、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体およびα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体の一部を構成している。葉酸塩（folate）は葉酸から誘導された全ての誘導体から構成される物質であり、葉酸はＬ−グルタル酸、ｐ−アミノ安息香酸および６−メチルプテリンから誘導される。葉酸およびこの誘導体の生合成は代謝中間産物であるグアノシン−５’−酸リン酸（ＧＴＰ）、Ｌ−グルタル酸およびｐ−アミノ安息香酸については特定の微生物において詳細に研究されている。
【００４１】
コリノイド（例えばコバラミンおよび特にビタミンＢ12）およびポルフィリンは、テトラピロール環系により特徴づけられた化学物質の種類に属する。ビタミンＢ12の生合成は、非常に未だ完全に特徴が把握されていない程複雑であるが、これに関連する酵素および物質が公知である。ニコチン酸（ニコチン酸塩）およびニコチンアミドは、「ナイアシン」とも呼ばれるピリジン誘導体である。ナイアシンは、重要な補酵素ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）およびその還元形態の前駆物質である。
【００４２】
これらの化合物の大量生産は細胞を含まない化学合成に大きく依存している。しかしながら、これらの化学物質の一部、例えばリボフラビン、ビタミンＢ6、パントテン酸およびビオチン等は微生物の大規模培養によっても製造される。ビタミンＢ12は、合成が複雑なことから発酵によってのみ製造される。In vitroの方法では、相当な材料と時間が必要であり、費用が嵩む場合も多い。
【００４３】
Ｃ．プリン、ピリミジン、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの代謝および使用法
プリンおよびピリミジン代謝遺伝子およびこれに対応するタンパク質は腫瘍による疾病およびウイルス感染の治療法に用いられる重要な標的である。「プリン」または「ピリミジン」という用語には、核酸、補酵素およびヌクレオチドの構成単位である窒素含有塩基が含まれる。「ヌクレオチド」とは核酸分子の塩基性構造単位であり、窒素含有塩基、五炭糖（ＲＮＡの場合の糖はリボースであり、ＤＮＡの場合のＤ−デオキシリボースである）およびリン酸から構成される。「ヌクレオシド」はヌクレオチドの前駆体として作用し、ヌクレオチドが有するリン酸部分を有さない分子である。これらの分子の生合成または核酸分子の代謝を阻害することにより、ＲＮＡおよびＤＮＡの合成を阻害することが可能である。例えばガン細胞におけるこの様な活性が阻害されれば、ガン細胞の分裂と複製の能力を阻害することが可能であると考えられている。更に、核酸分子を形成しないが、エネルギー源（例えばＡＭＰ）または補酵素（例えばＦＡＤおよびＮＡＤ）として作用するヌクレオチドが存在する。
【００４４】
複数の文献に、プリンおよび／またはピリミジン代謝に影響を与えることによりこれらの医薬用化学物質を使用する方法が記載されている（例えば、Christopherson, R.I.およびLyons, S.D. 著、(1990) “Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents.” Med. Res. Reviews 10: 505-548）。プリンおよびピリミジン代謝に関与する酵素の研究では、例えば免疫抑制剤または抗増殖剤として使用される新しい薬剤の開発が主に取り上げられている(Smith, J.L., (1995) “Enzymes in nucleotide synthesis.” Curr. Opin. Struct. Biol. 5:752-757; (1995) Biochem Soc. Transact. 23: 877-902)。しかしながら、プリン、ピリミジン塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、数種類のファインケミカルの生合成の中間体として（例えば、チアミン、Ｓ−アデノシルメチオニン、葉酸またはリボフラビン）、または細胞へのエネルギー担体（例えばＡＴＰまたはＧＴＰ）として、または調味料として一般に使用される薬剤そのもの（例えばＩＭＰまたはＧＭＰ）として、または複数の医学的用途に（例えば、Kuninaka, A.著(1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology 第6巻, Rehm等編 VCH: Weinheim, p. 561-612）としての用途がある。更に、プリン、ピリミジン、ヌクレオシドおよびヌクレオチド代謝に関与する酵素も標的として、これに対する農作物保護用の化学物質、例えば殺菌剤、除草剤および殺虫剤の開発が進んでいる。
【００４５】
バクテリアにおけるこれらの化合物の代謝は、顕著な特徴を有する（例えば、 Zalkin, H. およびDixon, J.E.著、 (1992) “de novo purine nucleotide biosynthesis”（Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology、第42巻、Academic Pressにおける論考、p. 259-287;、Michal, G.著、(1999) “Nucleotides and Nucleosides”, 第８章（Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley: New Yorkにおける論考）参照）。プリン代謝は集中的な研究対象であり、細胞の正常な機能にとって重要なものである。高等生物のプリン代謝が悪影響を受けると、痛風などの深刻な疾患が生ずる。プリンヌクレオチドはリボース−５−リン酸から、中間体化合物イノシン−５’−リン酸（ＩＭＰ）から複数工程を経て、グアノシン−５’−一リン酸（ＧＭＰ）またはアデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）が製造され、これらからヌクレオチドとして使用される三リン酸が迅速に生成する。これらの化合物はエネルギー源としても利用される。三リン酸は分解されて細胞内の種々の生合成経路にエネルギーをもたらすものである。
【００４６】
ピリミジン生合成は、リボース−５−リン酸からのウリジン−５’−モノリン酸（ＵＭＰ）の生成により行われる。このＵＭＰは、次いでシチジン−５’−三リン酸（ＣＴＰ）に変換される。これらの全てのヌクレオチドのデオキシ形態は、ヌクレオチドの二リン酸リボースからヌクレオチドの二リン酸デオキシリボースへの一工程の還元反応により行われる。これらの分子は加リン酸反応においてＤＮＡ合成に関与することがある。
【００４７】
Ｄ．トレハロースの代謝および使用法
トレハロースはα，α−１，１結合により結合する２個のグルコース分子から構成される。トレハロースは食品産業において、甘味料、乾燥または冷凍食品における添加剤、および飲料用に使用される。しかしながら、トレハロースには医薬品、化粧品およびバイオテクノロジー業界での用途もある（例えばNishimoto等、(1998) 米国特許第5,759,610号明細書、Singer, M.A. およびLindquist, S.著、 (1998) Trends Biotech. 16: 460-467、Paiva, C.L.A. およびPanek, A.D.著、(1996) Biotech. Ann. Rev. 2: 293-314、およびShiosaka, M.著、 (1997) J. Japan 172: 97-102参照）。トレハロースは多種微生物から酵素により産生し、周辺の媒体に自然に放出されるものであり、これを公知方法により回収する。
【００４８】
［ＩＩ．膜の生合成および膜内外輸送］
細胞膜は、細胞の種々の機能を担う。第一に、膜は周辺環境により細胞成分に変化を与え、これにより細胞の完全性が得られる。膜は有害なまたは不適当な化合物の流入と、所望の化合物の流出に対する障壁として作用する。細胞膜は、その構造により、元来は、タンパク質、水分子およびイオン等の親水性化合物が促進拡散していない場合にはこれを通過させない。すなわち細胞膜は脂質分子の二重膜から成り、この二重膜において頭部を構成する極性基は外側を向き（それぞれ細胞の外部および内部方向に向いている）、尾部を構成する非極性基は二重膜中心内側を向いて疎水性の核を形成している（膜構造と機能については、Gennis R. B. 著、(1989), Biomembrans, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelbergを参照のこと)。この障壁により、細胞は、これを取り巻く媒体中に含まれているよりも比較的高濃度の所望の化合物と、比較的低濃度の不適当な化合物を維持することが可能となっている。これは、細胞膜により各化合物の拡散が効率的にブロックされているためである。しかしながら、この膜は、所望の化合物を取り込み、排出物分子を放出する効率的な障壁としても作用する。この困難な操作を行うため、細胞膜は多種化合物の膜内外の輸送を効率的に行うことのできる多種の輸送体タンパク質を取り込む。この様な輸送体タンパク質は２種類に大別される。すなわち細孔もしくはチャンネルタンパク質および輸送体（トランスポーター）タンパク質である。前者は膜に調節された孔を形成する膜内在性タンパク質、例えばタンパク質複合体である。この調節または「ゲーティング」は、一般に孔またはチャネルにより輸送される分子に特異的であり、これらの膜内外構成が、特異的な物質群に選択的に透過性とされる。例えば、カリウムチャンネルは、カリウムと同様な電荷とサイズを有するイオンのみを通過可能とするように構成されている。チャンネルおよび孔タンパク質は不連続に疎水性ドメインと親水性ドメインを有し、タンパク質の疎水性部分が膜の内部と結合し、親水性部分がチャンネルの内部内側を覆うため、選択された親水性分子のみが通過可能な遮蔽された親水性環境が得られる。多くの孔／チャンネルは従来より公知であり、その例にはカリウム、カルシウム、ナトリウムおよび塩化物イオンのための孔／チャンネルがある。
【００４９】
促進拡散の孔およびチャンネル−調節システムは、非常に小さい分子、例えばイオンのみに適応する。これは、タンパク質分子全体を促進核酸により通過可能とするような大きな孔またはチャンネルが存在すれば、小さな親水性分子の通過を妨害することも不可能となるからである。この方法による分子の輸送は、輸送を行うためには濃度勾配による促進力が必要であることから、「促進拡散（facilitated diffusion）」と呼ばれることもある。透過酵素（パーミアーゼ）は、膜の一方側の分子濃度が、他方側の分子濃度よりも大きい場合に、グルコースまたは他の糖類等の大きな分子の細胞内への促進拡散を可能とする（ユニポートとも呼ばれる）。孔またはチャンネルとは異なり、これらの膜内在性タンパク質（６〜１４の膜結合αへリックスを有することも多い）は膜を貫通するオープンチャンネルを形成せず、膜表面で標的分子と結合し、これにより標的分子が膜の反対側に放出されるような構造変化（コンフォメーショナル・シフト）を行う。
【００５０】
しかしながら、細胞は既存の濃度勾配に対する分子の導入または放出（「能動輸送」）を行う必要があり、この場合には促進拡散は起こらない。この様な膜輸送について細胞が用いる２種類の一般的な機構は、シンポート（等方輸送）またはアンチポート（対向輸送）、およびＡＢＣトランスポーターに調節されるエネルギー連結輸送である。シンポートおよびアンチポートシステムは２つの異なる分子の動きを膜を通過して連結させるが（この２つの異なる分子用の２つの別々の結合部位を有するパーミアーゼ）、シンポートでは両分子が同方向に輸送され、アンチポートでは一方の分子が取り込まれ、他方の分子が放出される。このことは、２種類の分子の一方が濃度勾配に従って移動するため、エネルギー的に可能である。周囲の濃度勾配に逆らって所望の化合物が随伴して移動する場合のみにこのエネルギー的に好ましい現象が可能となる。エネルギー稼働工程において、一方の種類の分子が濃度勾配に逆らって膜を通過して輸送され、ＡＢＣトランスポーターによって利用される。この系では、膜に存在する輸送タンパク質がＡＴＰ結合カセットを有し、標的分子が結合すると、ＡＴＰがＡＤＰ＋Ｐｉに変換され、この結果生じるエネルギーの放出により、トランスポーターに補助されて標的分子の膜の反対側への移動が起こされる。この様な輸送システムの更なる詳細については、Bamberg等著、(1993)  “Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes” 、Q. Rev. Biophys. 26: 1-25; Findlay、J.B.C. (1991)、“Structure and function in membrane transport systems”, Curr. Opin. Struct. Biol. 1:804-810; Higgins, C. F. (1992), “ABC transporters from microorganisms to man”, Ann. Rev. Cell boil. 8: 67-113; Gennis, R. B. (1989) “Pores, Channels and Transporters”, （Biomembrans, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelbergにおける論考、p.270-322）、およびNakano, H. およｂSaier, H. (1992) “Transport proteins in bacteria: common themes in their design”, Science 258:936-942、および上記各文献中に挙げられた参考文献に記載されている。
【００５１】
膜の合成は、多数の成分が関与する特徴的な工程であり、このうちの最も重要な成分は脂質分子である。脂質の合成は２部分に分けられる。すなわち、脂質の合成とｓｎ−グリセロール−３−リン酸への付加、および頭部極性基の付加または変性である。バクテリアの膜に用いられている一般的な脂質の例は、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質およびホスホグリセリドである。脂肪酸の生合成はアセチルＣｏＡの、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼによるマロニルＣｏＡへの変換か、またはアセチルトランスアシラーゼによるアセチルＡＣＰへの変換のいずれかにより開始する。縮合反応の後、このように生成した分子は、一連の縮合、還元および脱水反応により、共同でアセトアセチルＡＣＰを生成し、所望の長さの鎖を有する飽和脂肪酸分子となる。この様な分子からの不飽和脂肪酸の産生は、分子状の酸素の存在下に、特異的なデサチュラーゼにより好気的に、または嫌気的に触媒されて行われる（脂肪酸の合成については、F.C. Neidhardt等著、(1996)、E. coli and Salmonella. ASM Press: Washington, D.C.、p.612-636、および同文献中に記載の参考文献、Lengeler等編、(1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, および同文献中に記載の参考文献、およびMagnuson,K.等著、(1996) Microbiological Reviews 57:522-542,および同文献中に記載の参考文献を参照のこと）。シクロプロパン脂肪酸（ＣＦＡ）は、補基質としてのＳＡＭの使用により特異的ＥＦＡシンセターゼにより合成される。分岐状脂肪酸は、分岐アミノ酸の脱アミン化により分岐状２−オキソ酸が生成することにより合成される（例えばLangeler等編、(1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New Yorkおよびこの文献中に記載された参考文献参照）。脂質合成における他の重要な工程は、脂肪酸をグリセロール−リン酸−アシルトランスフェラーゼ等により頭部極性基上へ輸送する工程である。多種の前駆体分子と生合成酵素を結合することにより様々な脂肪酸分子の製造が行われ、これが膜組成に重大な影響を与える。
【００５２】
［ＩＩＩ．本発明の要素および方法］
本発明は新規分子（ＭＣＴ核酸およびタンパク質分子という）に基づくものであり、これによりＣ．グルタミカムにおける細胞膜の製造が制御され、この膜を経る分子の移動が支配される。一実施の形態において、ＭＣＴ分子はＣ．グルタミカムにおける細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与する。好ましい実施の形態では、膜成分製造および膜輸送を調節する本発明のＭＣＴ分子の活性はこの生物による所望のファインケミカルの製造に影響をあたえる。特に好ましい実施の形態において、本発明のＭＣＴタンパク質が調節するＣ．グルタミカム代謝経路の収率、生産および／または製造効率が調節され、および／または膜を通過する化合物の製造効率および輸送効率が変化し、これがＣ．グルタミカムによる所望のファインケミカルの収率、製造および生産および／または製造効率を直接的または間接的に調節するように、本発明のＭＣＴ分子の活性が調節される。
【００５３】
「ＭＣＴタンパク質」または「ＭＣＴポリペプチド」という表現は、Ｃ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与するタンパク質を意味する。ＭＣＴタンパク質の例には、表１に記載されているか、または奇数のSEQ ID NOにより示されているＭＣＴ遺伝子にコードされるタンパク質を含む。「ＭＣＴ遺伝子」または「ＭＣＴ核酸配列」とは、ＭＣＴタンパク質をコードする核酸配列と、対応の未翻訳５’および３’配列領域とから成る。ＭＣＴ遺伝子の例は表１に記載のものを含む。「製造」および「生産性」とは従来より理解されているとおりであり、所定時間内に所定発酵量（例えば生成物（ｋｇ）／時間／リットル）得られた発酵産物（例えば所望のファインケミカル）の濃度を含む。「製造効率」とは、所定量の生産が行われるために必要な時間を意味する（例えば細胞がファインケミカルを所定の割合で産生するに至るまでの所用時間）。「収率（収量）」または「生成物（産物）／炭素収率」とは、従来より理解されているとおりであり、炭素源が生成物（すなわちファインケミカル）に変換される効率を意味する。これは通常、例えば生成物（ｋｇ）／炭素源（ｋｇ）と表記される。化合物の収量または製造を増加させることにより、所定時間に所定量の培養体から回収された分子または回収された分子のうちの有用なものの量が増加する。「生合成」または「生合成経路」という表現は従来より理解されているとおりであり、細胞による、中間体化合物からの、多工程（等）の高度な制御（等）による、化合物、特に有機化合物の合成を意味する。「分解」および「分解経路」とは従来より理解されているとおりであり、細胞による、化合物、特に有機化合物の、多工程（等）の高度な制御（等）による、分解生成物（一般には小さいまたは複雑さの低下した分子）への分解を意味する。「代謝」とは、従来より理解されているとおりであり、生物中で起こる生体反応の全体を意味する。所定化合物の代謝（例えばグリシン等のアミノ酸の代謝）とは、この化合物に関連する細胞内での総合的な生合成、修飾、および分解経路を意味する。
【００５４】
他の実施の形態において、本発明のＭＣＴ分子は、所望の分子、例えばファインケミカルのＣ．グルタミカム等の微生物中での産生を調節することが可能である。本発明のＭＣＴタンパク質を変化させることにより、この様な変化したタンパク質をＣ．グルタミカムに導入することにより、このＣ．グルタミカムによるファインケミカルの収率、生産および／または製造効率に直接的な影響を与える多数のメカニズムが存在する。細胞からのファインケミカル分子の放出に関与するＭＣＴタンパク質の数および活性を増大させ、この様な化合物が細胞外媒体に対して従来よりも大量に分泌され、媒体からの化合物の回収が従来よりも容易に行われるようにすることも可能である。同様に、これらのＭＣＴタンパク質は、１種類以上のファインケミカル（例えばリン酸化合物、硫酸化合物、窒素化合物等）の生合成に必要な栄養の取り込みに関与しており、数および活性において改善されており、これらの前駆体、補助因子または中間産物の細胞内濃度を上昇させることも可能であるである。更に、脂肪酸および脂質は重要なファインケミカルであるが、これらの生合成に関与する本発明の１種類以上のＭＣＴタンパク質の活性を最適化させ、数を増大させることにより、または上述の化合物の分解に関連する１種類以上のＭＣＲタンパク質の作用を低下させることにより、Ｃ．グルタミカム由来の脂肪酸および脂質分子の収率、生産および／または製造効率を向上させることも可能である。
【００５５】
本発明の１種類以上のＭＣＴ遺伝子を操作することにより、Ｃ．グルタミカム由来の１種類以上の所望のファインケミカルの生産に直接的な影響を与える活性に変化を有するＭＣＴタンパク質を製造することも可能である。例えば、細胞（所望のファインケミカルの過剰生産により数量が増加する可能性がある）における正常な代謝排出物を、これらが細胞内のヌクレオチドおよびタンパク質に悪影響を与えたり（細胞の生存力を低下させることがある）、ファインケミカル生合成経路を妨害する（ファインケミカルの収率、生産または製造効率を低下させることがある）以前に効率的に細胞から放出させるように、排出物の放出に関与する本発明のＭＣＴタンパク質の数または活性を増加させてもよい。更に、所望のファインケミカルの細胞内質量が比較的大きい場合には、これが細胞に対して毒性に作用することがあるため、これらの化合物を細胞から放出することが可能な輸送体（トランスポータ）の活性または数量を増大させることにより、培養体中の細胞の生存力を増大させ、培養体中に所望のファインケミカルの製造を行う大量の細胞を得ることが可能である。本発明のＭＣＴタンパク質を、相対的な量の種々の脂質および脂肪酸分子が得られるように操作することも可能である。脂質は種類ごとに異なる物理特性を有しているため、膜における脂質組成を変化させると膜の流動性が著しく変化する。膜の流動性の変化は、膜を通過する分子の輸送と細胞の完全性とに影響を与え、この双方が大規模発酵培養におけるＣ．グルタミカム由来のファインケミカル製造に重大な影響を与える。
【００５６】
本発明の単離された核酸配列は、ATCC 13032として認識される、American Type Culture Collectionにより市販されているコリネバクテリウム−グルタミカムのゲノム内に含まれている。単離されたＣ．グルタミカムＭＣＴ ＤＮＡのヌクレオチド配列が奇数のSEQ ID NOとして、Ｃ．グルタミカムＭＣＴタンパク質において予想された（predicted）アミノ酸配列が偶数のSEQ ID NOとしてそれぞれ示されている。コンピュータ分析を行い、上記ヌクレオチド配列を、細胞膜成分の代謝に関与するタンパク質、またはこの膜を通過する化合物の輸送に関与するタンパク質をコードする配列として分類および／または同定した。
【００５７】
本発明は、本発明のアミノ酸配列に実質的に相同なアミノ酸配列（例えば配列表中の偶数のSEQ ID NOによる配列）を有するタンパク質を含む。本明細書では、選択されたアミノ酸配列に対して実質的に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質は、選択されたアミノ酸配列、例えば全体が選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％相同である。選択されたアミノ酸配列に対して実質的に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質は、選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも約５０〜６０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、更に好ましくは少なくとも約７０％〜８０＆、８０％〜９０％、または９０％〜９５％、および更に好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％以上相同である。上記各値の中間値により示される値の範囲（例えば７５％〜８０％同一、８５〜８７％同一、９１〜９２％同一）も本発明に含まれる。
【００５８】
本発明のＭＣＴタンパク質または生物学的に活性なタンパク質またはそのフラグメントは、Ｃ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与するか、または表１に記載の１種類以上の活性を有する。
本発明の詳細を更に以下に説明する。
【００５９】
Ａ．単離された核酸分子
本発明はＭＣＴポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子、ＭＣＴをコードする核酸（SRT DNA）の認識（同定）または増幅のために用いられるハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用可能な核酸分子フラグメントを含む。本明細書では、「核酸分子」とはＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）およびヌクレオチドの類似体を用いて生成したＤＮＡおよびＲＮＡの類似体を含むものとする。この用語は、遺伝子のコード領域の３’および５’末端双方に存在する未翻訳の配列、すなわち遺伝子のコード領域の５’末端から上流の少なくとも約１００ヌクレオチドの配列、および遺伝子のコード領域の３’末端から下流の少なくとも約２０ヌクレオチドの配列も含む。ヌクレオチド分子は１本鎖または２本鎖であるが、２本鎖のＤＮＡであることが好ましい。「単離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。「単離された」核酸分子は、生物のゲノムＤＮＡに由来し、天然にはこのゲノムＤＮＡの核酸の側方に位置する配列（すなわち５’末端および３’末端に配置された配列）を有さないことが好ましい。例えば、種々の実施の形態において、単離されたＭＣＴ核酸分子は、天然の状態では、この核酸が得られた細胞（例えばＣ．グルタミカム細胞）のゲノムＤＮＡの側方に位置し、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満の長さのヌクレオチド配列から成る。更に、「単離された」核酸分子、例えばＤＮＡ分子は、他の細胞材料、組換え技術により製造された場合に用いられた培地を含まず、また化学的に合成された場合も化学的前駆体や他の化学物質を含まない。
【００６０】
本発明の核酸分子、例えば配列表の奇数のSEQ ID NOのヌクレオチド配列を有する核酸分子またはその一部は、標準的な分子生物学による技術により単離され、その情報は本明細書に記載する。例えばＣ．グルタミカムSRT DNAは、配列表の奇数のSEQ ID NO配列のいずれかの全体または一部と標準的なハイブリダイゼーション技術を用いてＣ．グルタミカムライブラリから単離可能である(例えば、Sambrook, J., Fritsh, E.F., 、Maniatis, T. 共著、Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第２版., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。更に、本発明の核酸配列のいずれか（例えば奇数のSEQ ID NO）の、全体または一部を含む核酸分子を、この配列に基づき設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により単離する（例えば本発明の核酸配列のいずれか（例えば奇数のSEQ ID NO）の、全体または一部を含む核酸分子は、同様の配列に基づき設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により単離可能である）。例えば、ｍＲＮＡは、通常の内皮細胞から単離され（例えばChirgwin 等著、 (1979) Biochemistry 18: 5294-5299に記載のグアニジニウム−チオシアン酸抽出操作による）、ＤＮＡは逆転写酵素を用いて製造される（例えばGibco/BRL、Bethesda, MD製、Moloney MLV 逆転写酵素、または Seikagaku America, Inc、AMV, St. Petersburg, FL製ＡＭＶ、逆転写酵素）。ポリメラーゼ連鎖反応による増幅に用いられる合成オリゴヌクレオチドは配列表に記載のいずれかのヌクレオチド配列に基づき設計される。本発明の核酸は、テンプレートとしてのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡと、標準的なＰＣＲ増幅技術において適当とされるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅される。このように増幅された核酸は、適当なベクターにクローンされ、ＤＮＡ配列分析により特徴付けが行われる。更に、ＭＣＴ核酸配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的合成技術により、例えば自動ＤＮＡ合成機器を用いて製造される。
【００６１】
好ましい実施の形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列表に記載されたヌクレオチド配列のいずれかを含む。配列表に記載された本発明の核酸配列は本発明のコリネバクテリウム−グルタミカムＭＣＴ ＤＮＡに相当する。このＤＮＡにはＭＣＴタンパク質をコードする配列（すなわち配列表における奇数のSEQ ID NOの配列に示されている「コード領域」）、並びに配列表の奇数のSEQ ID NOの配列に示されている５’未翻訳配列および３’未翻訳配列を含む。また、この核酸分子は、配列表の核酸配列のいずれかのコード領域のみを含むものであってもよい。
【００６２】
本発明において、配列表に記載された全ての核酸およびアミノ酸配列には、「ＲＸＡ」、「ＲＸＮ」、「ＲＸＳ」または「ＲＸＣ」の表示と、その後の５桁の数値とを含む識別用のＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、ＲＸＣ番号が付けられている(例えば、RXA02099、RXN03097、RXS00148またはRXC01748)。各核酸配列は、３個までの部分、すなわち５’上流領域、コード領域、下流領域を含む。これらの３領域は、混乱を防ぐため、それぞれ共通のＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、RXC表示により識別される。「配列表の奇数の配列のいずれか」という表現は、異なるＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、RXC表示により認識可能な、配列表中の核酸配列のいずれかであることを示している。各配列のコード領域は、配列表に偶数のSEQ ID NOとして、対応する核酸配列のすぐ下に記載されている対応のアミノ酸配列に翻訳される。例えば、RXA03097のコード領域はSEQ ID NO: 1に示され、これがコードするアミノ酸配列はSEQ ID NO: 2に記載されている。本発明の核酸配列は、これらがコードするアミノ酸分子と同じRXA、RXN、RXS、RXCの表示により示されており、相関性が容易に読みとれる。例えば、RXA02099と表示したアミノ酸配列は、核酸分子RXA02099のヌクレオチド配列のコード領域を翻訳したものであり、RXN03097と表示したアミノ酸配列は、核酸分子RXN03097のヌクレオチド配列におけるコード領域を翻訳したものであり、更にRXS00148と表示したアミノ酸配列は、核酸分子RXS00148のヌクレオチド配列におけるコード領域を翻訳したものであり、RXC01748と表示したアミノ酸配列は、核酸分子RXC01748のヌクレオチド配列におけるコード領域を翻訳して得られたものである。本発明のRXA、RXN、RXSまたはRXCによるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、並びにこれらの割り当てられたSEQ ID NOとの対応関係は表１に示されている。
【００６３】
本発明における数種類の遺伝子は「Ｆ表示遺伝子（F-designated genes）」である。Ｆ表示遺伝子は、ＲＸＡ、ＲＸＮまたはＲＸＳの表示の前に「Ｆ」を有し、表１に記載の遺伝子を含む。例えば表１に記載されているようにSEQ ID NO: 7 は、「F RXA00498」というＦ表示遺伝子であり、SEQ ID NO:25、33、37もＦ表示遺伝子である（表１にそれぞれF RXA01345、F RXA02543、F RXA02282と記載されている）。
【００６４】
一実施の形態において、本発明の核酸分子は、表２に記載されたものは含まなくてもよい。dapD遺伝子の配列はWehrmann, A.等著、(1998) J. Bacteriol. 180(12): 3159-3165により発表された。しかしながら、本発明者により得られた配列は、上記文献により発表されたものよりもかなり長い。また上記文献に発表された配列では、開始コドンが不正確であるために、実際のコード領域のみのフラグメントが示されているものと考えられる。
【００６５】
他の好ましい実施の形態では、本発明の単離された核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列（例えば配列表の奇数のSEQ ID NOの配列またはその一部）に相補性を有する核酸分子を含む。本発明のヌクレオチド配列のいずれかに相補性な核酸分子は、配列表に示されたヌクレオチド配列のいずれか（例えば配列表中奇数のSEQ ID NOの配列）に対し十分な相補性を有し、これにハイブリダイズし、安定な二本鎖を形成する。
【００６６】
更に他の実施の形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも約５０％、５１％、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、５9%、または60%、好ましくは少なくとも61%、62%、63%、64%、６5%、66%、67%、68%、69%、または７0%、更に好ましくは少なくとも約71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、または80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、または 90%、または91%、92%、93%、94%、 更に好ましくは少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%以上、本発明のヌクレオチド分子（配列表の奇数のSEQ ID NOの配列）またはその一部に相同である。上記各値の中間値により示される値の範囲（例えば７５％〜８０％同一、８５〜８７％同一、９１〜９２％同一）も本発明に含まれる。例えば、上限値および／または下限値として記載された上述の値のいずれを組み合わせて値の範囲としてもよい。更に他の好ましい実施の形態では、本発明の単離された核酸分子がハイブリダイズする、例えば緊縮条件下で、本発明の核酸分子またはその一部のいずれかとハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含む。
【００６７】
更に、本発明の核酸分子は、配列表の奇数のSEQ ID NOのいずれかの配列におけるコード領域の一部のみ、例えばプローブもしくはプライマー用フラグメント、またはＭＣＴタンパク質の生物学的に活性な部分をコードするフラグメントのみから成ってもよい。Ｃ．グルタミカム由来のＭＣＴ遺伝子のクローニングにより決定されたヌクレオチド配列により、他種の細胞および生物に相同なＭＣＴおよび他のコリネバクテリアまたは関連種からのＭＣＴ類似体を認識および／またはクローニングするための、プローブまたはプライマーの生成が行われる。プローブ／プライマーは通常、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、一般に、緊縮条件下で少なくとも約１２、好ましくは約２５、更に好ましくは４０、５０または７５の連続した、本発明のヌクレオチド配列のいずれか（例えば配列表の奇数のSEQ ID NＯのいずれかの配列）におけるセンス鎖ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列部分、配列表のいずれかにおけるアンチセンス配列または天然に発生するこれらの変異体を含む。本発明のヌクレオチド配列に基づくプライマーは、PCR反応に使用可能であり、ＭＣＴ相同体のクローンが行われる。ＭＣＴヌクレオチド配列に基づくプローブは、転写により得られた配列、または同配列または相同なタンパク質をコードするゲノム配列を検出する。好ましい実施の形態において、プローブは、更にラベルグループ（標識用官能基）を有している。ラジオグループの例は放射性同位体、紫外線化合物、酵素、酵素補助因子である。この様なプローブは、例えば細胞サンプル中のＭＣＴコード核酸のレベルを、例えばＭＣＴｍＲＮＡレベルの検出またはゲノムＭＣＴ遺伝子の変異または欠失を確認して測定することにより、ＭＣＴタンパク質の誤発現を行う細胞を調べるための医療用テストキットの一部として使用される。
【００６８】
一実施の形態において、本発明の核酸分子は本発明のアミノ酸配列（例えば配列表の偶数のSEQ ID NOの配列）に、タンパク質またはその一部がＣ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与する能力を維持するために十分な程度に相同なアミノ酸配列によるタンパク質またはタンパク質部分をコードする。本明細書における「十分に相同」という表現は、本発明のアミノ酸配列と同一または等価（例えば配列表の偶数のSEQ ID NOのいずれかの配列におけるアミノ酸残基と類似する側鎖を有するアミノ残基）な最小数のアミノ酸残基を有するタンパク質またはタンパク質部分を有し、このタンパク質またはタンパク質部分がＣ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与することが可能であることを意味する。上述のように、膜成分代謝経路または膜輸送システムのタンパク質メンバーは、１種類以上の化学物質の製造または分泌において所定の役割を果たすことができる。この様な活性の例は本明細書に記載されている。「ＭＣＴタンパク質の機能」は１種類以上の化学物質の収率、製造および／または製造効率に直接的または間接的に関与するものである。ＭＣＴタンパク質活性の例を表１に記載する。
【００６９】
他の実施の形態において、タンパク質は、本発明のアミノ酸の配列全体（例えば配列表の偶数のSEQ ID NOによる配列）に対して少なくとも約50-60%、好ましくは約60-70%、更に好ましくは少なくとも約70-80%、80-90%、90-95%、および特に好ましくは少なくとも約96%、97%、98%、99%以上相同である。
【００７０】
本発明のＭＣＴ核酸分子によりコードされたタンパク質部分は、ＭＣＴタンパク質のいずれかにおける生物学的に活性な部分であることが好ましい。本明細書中、「ＭＣＴタンパク質の生物学的に活性な部分」という表現は、Ｃ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与するか、または表１に記載の活性を有する部分、例えばＭＣＴタンパク質のドメイン／モチーフを含むものである。ＭＣＴタンパク質またはその生物学的に活性な部分がＣ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与するかどうかを判断するために、酵素活性の評価を行う。この様な評価方法は、当業者に公知であり、その具体例は実施例８に詳細に記載されている。
【００７１】
ＭＣＴタンパク質の生物学的に活性な部分をコードしている他の核酸フラグメントは、本発明のアミノ酸配列（例えば配列表の偶数のSEQ ID NO）のいずれかの一部を単離することにより製造され、ＭＣＴタンパク質またはペプチドのコードされた部分を発現し（例えばin vitroでの組換え発現による）、ＭＣＴタンパク質またはペプチドのコードされた部分の活性を評価する。
【００７２】
遺伝子コードの変化（ディジェネラシー）により本発明の核酸配列（例えば配列表の奇数のSEQ ID NOの配列）（およびその一部）とは異なる配列を有し、本発明の核酸配位列によりコードされていると同じＭＣＴタンパク質をコードしている核酸分子を含む。他の実施の形態では、本発明の単離された核酸分子が配列表に記載のアミノ酸配列（例えば偶数のSEQ ID NO)を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であると好ましい。更に他の実施の形態では、本発明の単離された核酸分子は、本発明のアミノ酸配列に実質的に相同なＣ．グルタミカムタンパク質の全体をコードする（例えば配列表中の奇数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯに示されたオープンリーディングフレームによりコードされている）。
【００７３】
一実施の形態において、本発明の配列は、本発明より以前に得られた表２または４に記載のBenbank配列等は含まないことは当業者には明白である。一実施の形態において、本発明は、従来技術による配列（例えば表２または４に記載のGenbank配列（またはこの配列によりコードされるタンパク質））よりも本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に同一な部分の割合が大きいヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含む。例えば、本発明は、RXA01420という表示によるヌクレオチド配列（SEQ ID NO:7）に３８％以上、RXA00104という表示によるヌクレオチド配列(SEQ ID NO:５)に４３％以上、およびRXA02173という表示によるヌクレオチド配列（SEQ ID NO: ２５）に４５％以上同一なヌクレオチド配列を含む。当業者は、本発明の所定の配列に対する同一性の割合の下限は、この所定配列についてヒットした表４に記載の上位３データからＧＡＰにより計算された同一性スコアを検討し、ＧＡＰにより計算された最高の同一割合の値（％）を１００％から差し引くことにより、計算により求めることができる。このように計算された下限値よりも同一な割合の高い核酸およびアミノ酸配列（例えば少なくとも５０％、５１％、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、または60%、好ましくは少なくとも約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、または70%、更に好ましくは少なくとも約71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、または80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、または 90%、または91%、92%、93%、94%、更に好ましくは少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%以上同一）が本発明に含まれることは、当業者には明白に理解される。
【００７４】
奇数のSEQ ID NOとして配列表に記載されているＣ．グルタミカムＭＣＴ核酸配列の他に、個体群（Ｃ．グルタミカム個体群）中にＭＣＴタンパク質のアミノ酸配列の変化を起こすＤＮＡ配列多形性（polymorphism)が存在し得ることも当業者には理解される。ＭＣＴ遺伝子におけるこの様な遺伝的多形性は、天然の変異により存在することもある。本明細書で用いられる「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語はＭＣＴタンパク質、好ましくはＣ．グルタミカムＭＣＴタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を意味する。この様な天然の変異はＭＣＴ遺伝子のヌクレオチド配列において、通常は１〜５％変動する。ＭＣＴにおける、上述のような、または他の全てのヌクレオチドの変動およびこれにより得られるアミノ酸の多形性は天然の変異の結果であり、ＭＣＴタンパク質の機能的活性を変化させるものではなく、本発明に含まれるものである。
【００７５】
本発明のＣ．グルタミカムＭＣＴ ＤＮＡの天然の変異体および非−Ｃ．グルタミカム相同体に対応する核酸分子は、Ｃ．グルタミカム、またはこれらの一部に関して上述したＣ．グルタミカムＭＣＴ核酸に対する相同性に基づいて、緊縮ハイブリダイゼーション条件下の標準的ハイブリダイゼーション技術によりハイブリダイゼーションプローブとして単離される。従って、他の実施の形態では、本発明の単離された核酸分子は１５以上のヌクレオチドから成り、配列表の奇数のSEQ ID NOのヌクレオチド配列を含む核酸分子に対し、緊縮条件下でハイブリダイズする。他の実施の形態では、核酸分子は、少なくとも３０、５０、１００、または２５０以上のヌクレオチドを有する。「緊縮条件下でハイブリダイズする」とは、相互に６０％以上相同なヌクレオチドが相互にハイブリッドした状態を保つ、ハイブリダイゼーションとウォッシングの条件を示している。この条件は、少なくとも約６５％、更に好ましくは少なくとも約７０％、および更に好ましくは少なくとも約７５％以上相互に相同な配列が相互にハイブリッドした状態を保つ条件であることが好ましい。この様な緊縮条件は、当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に記載されている。緊縮ハイブリダイゼーション条件の好ましい例（これに限定されない）は、６X塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）にて約４５℃でハイブリダイズした後、0.2 X SSC、0.1% SDS で、50〜65℃にて１回以上洗浄したことによるハイブリダイゼーションである。緊縮条件下で本発明の核酸配列にハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に発生する核酸分子に対応していることが好ましい。本明細書で、「天然に発生する」核酸とは、天然に起こるヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子（例えば天然のタンパク質をコードしている）を意味する。一実施の形態において、本発明の核酸は天然のＣ．グルタミカムＭＣＴタンパク質をコードするものである。
【００７６】
個体群中に存在する可能性のあるＭＣＴ配列の天然に発生する変異体の他に、本発明のヌクレオチド配列に変異による変化が生じ、これからコードされたＭＣＴタンパク質アミノ酸配列に変化が生じ、ＭＣＴタンパク質の機能上の能力には変化が起こらないことも、当業者には理解される。例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸の置換を引き起こすヌクレオチドの置換は、本発明のヌクレオチド配列中で起こり得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＭＣＴタンパク質のいずれかの野生型の配列（例えば配列表の偶数のSEQ ID NO）から変化が生じた残基であり、ＭＣＴタンパク質の活性には変化のないものである。一方、「必須」アミノ酸残基は、ＭＣＴタンパク質活性に必要なアミノ酸残基である。しかしながら、他のアミノ酸残基（例えばＭＣＴ活性を有するドメインで保存されていないか、または半保存状態であるアミノ酸）は活性に必須でないこともあるため、ＭＣＴ活性に変化のない状態で変化を受けやすい。
【００７７】
従って、更に本発明は、ＭＣＴ活性に必須ではないアミノ酸残基中に変化を含むＭＣＴタンパク質を含む核酸分子を含むものである。この様なＭＣＴタンパク質のアミノ酸配列は、配列表の偶数のSEQ ID NOの配列とは異なるが、本明細書中に記載した１種類以上のＭＣＴ活性を含むものである。一実施の形態において、単離された核酸分子とは、本発明のアミノ酸配列に少なくとも５０％相同なアミノ酸配列を含み、かつＣ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与可能であるか、または表１に記載の１種類以上の活性を向上させるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。核酸分子にコードされるタンパク質は、配列表の奇数のSEQ ID NOのいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約５０〜６０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、更に好ましくは約７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、特に好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％相同なアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００７８】
２種類のアミノ酸配列（例えば、本発明のアミノ酸配列のいずれかと、この変異形）または２種類の核酸の相同な割合を測定するため、最適な比較が可能なように配列が決定される（一方のタンパク質または核酸と他方のタンパク質または核酸との最適な位置（アライメント）を得るためにギャップを設けることができる）。アミノ酸残基または核酸との、対応するアミノ酸位置または核酸位置同士を比較する。一方の配列の位置（例えば本発明のアミノ酸配列の一つ）に、他方の配列（例えばアミノ酸配列の変異形）の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドが存在する場合、この位置で分子は相同である（すなわち、本発明ではアミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。２つの配列の間の相同性の割合は、これらの配列間で同一な位置の数の関数である（すなわち相同性（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）。
【００７９】
本発明のタンパク質配列（例えば配列表の偶数のSEQ ID NOの配列）に相同なＭＣＴタンパク質をコードしている単離された核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列に１個以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失が起こり、これによりコードされたタンパク質の１個以上のアミノ酸の置換、付加、欠失が生ずることにより生成する。標準的方法、例えば特定部位の突然変異誘発およびPCR仲介突然変異等により、本発明のいずれかのヌクレオチド配列の変異が生ずる。保存的アミノ酸置換が１種類以上の予測された非必須アミノ酸残基上で起こる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基により置換されることを意味する。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーはこの分野で定義されている。これらのファミリーには塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香性側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。ＭＣＴタンパク質中の予測された非必須アミノ酸が同じ側鎖ファミリーに属する他のアミノ酸残基により代替されることが好ましい。他の好ましい実施の形態においては、ＭＣＴコード配列の全てまたは一部に対して、飽和変異生成(saturation mutagenesis)等によりランダムに変異を導入することができる。得られた変異体の上記ＭＣＴ活性をスクリーニングし、変異体がＭＣＴ活性を保持していることを確認する。配列表の奇数のSEQ ID NOのいずれかのヌクレオチド配列の変異生成により、これによりコードされたタンパク質は組換えによる発現を行うため、このタンパク質の活性を、例えば本明細書に記載の（具体例として実施例８を参照）評価法により評価する。
【００８０】
上述のＭＣＴタンパク質をコードする核酸分子の他に、本発明は、これに対してアンチセンスな、単離された核酸分子を含む。「アンチセンス」な核酸とは、所定のタンパク質をコードする「センス」核酸に相補性を有するヌクレオチド配列、例えばｃＤＮＡ分子のコードストランドまたはｍＲＮＡ配列に相補性を有するヌクレオチド配列を意味する。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は全ＭＣＴコードストランドに相補性を有することも、その一部に相補性を有することも可能である。一実施の形態において、アンチセンスヌクレオチド分子はＭＣＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコードストランドの「コード領域に」アンチセンスである。「コード領域」とはアミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を意味する（例えばSEQ ID NO.: ５(RXA00104)のコード領域はヌクレオチド１〜756を含む）。他の実施の形態において、アンチセンス核酸分子はＭＣＴをコードするヌクレオチド配列のコード鎖（コードストランド）の「非コード領域」にアンチセンスである。「非コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されない、コード領域の側方に存在する５’および３’配列を意味する（５’および３’未翻訳領域ともいう）。
【００８１】
本発明におけるＭＣＴをコードするコード鎖（例えば配列表の奇数のSEQ ID NOに示された配列）として、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンとクリックによる塩基対のルールにより設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＭＣＴｍＲＮＡの全コード領域に相補性を有してもよいが、ＭＣＴｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみにアンチセンスなオリゴヌクレオチドでると好ましい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＣＴｍＲＮＡの翻訳開始サイトを取り巻く領域に相補性を有することもある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約5、10、15、20、25、30、35、40、45または５０ヌクレオチド長とされる。本発明のアンチセンスヌクレオチドは、この分野で公知の手法により化学合成および酵素的結紮反応により構成される。例えばアンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に発生するヌクレオチドを用いて化学的に合成することができるが、分子の生物学的安定性を向上させるため、もしくはアンチセンスとセンス核酸、例えばホスホロチオエート誘導体とアクリジン置換ヌクレオチドとの間の２本鎖の物理的安定性を向上させるために設計された種々の修飾を有するヌクレオチドを使用してもよい。アンチセンス核酸の生成に使用される修飾されたヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキノシン、５´−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、プソイドウラシル、キノシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリンである。この他、アンチセンス核酸は、所定の核酸を発現ベクターにアンチセンス方向にサブクローニングしたものを用いて生物学的に製造することもできる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的の核酸に対してアンチセンスな方向に配置される。これについては以下に更に詳細に説明する。）。
【００８２】
本発明のアンチセンスな核酸分子は、ＭＣＴタンパク質をコードする細胞のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリッドまたは結合するように、一般的には細胞に投入されるか、または現場で生成され、転写および／または翻訳を阻害する等によりタンパク質の発現が阻害される。このハイブリダイゼーションは、安定な２本鎖を形成する本来のヌクレオチドの相補性により行うことができるが、ＤＮＡ２本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合等には二重らせんに結合する主溝での特異的相互作用により行ってもよい。アンチセンス分子は、所定の細胞表面の受容体または同細胞表面で発現する抗原に特異的に結合するように、細胞表面上の受容体または抗原と結合するペプチドまたは抗体と予め結合するなどして修飾される。抗原核酸分子を、例えばベクターを用いて細胞に導入することも可能である。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を得るために、原核細胞、ウイルスまたは真核細胞プロモータの強力な制御下にアンチセンス核酸分子が配置されたベクター構成体が好ましく用いられる。
【００８３】
他の実施の形態において、本発明のアンチセンス核酸分子として、α−アノマー核酸分子が用いられる。α−アノマー核酸分子は、相補性ＲＮＡと特異的な２本鎖ハイブリッドを形成する。この場合は通常のβユニットとは異なり、核ストランドが互いに平行に伸長する（Gaultier等著、(1987) Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641）。アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue等著、(1987)  Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148)、またはキメラRNA-DNA類似体(Inoue等著、(1987) FEBS Lett. 215: 327-330）を含んでもよい。
【００８４】
他の実施の形態では、本発明のアンチセンス核酸がリボザイムであってもよい。リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡ分子であり、相補性領域を有する１本鎖核酸、例えばｍＲＮＡを切断することが可能なリボヌクレアーゼ活性を有する。リボザイム（例えばハンマーヘッドリボザイム（HaselhoffおよびGerlach著、 (1988) Nature 334: 585-591に記載））を用いてＭＣＴｍＲＮＡの転写体を触媒的に切断し、ＭＣＴｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＭＣＴコード核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書に記載のＭＣＴＤＮＡ（例えばSEQ ID NO: 5(RXA00104)のヌクレオチド配列に基づき設計可能である。例えばテトラヒメナL-19 IVS RNAは、活性部分のヌクレオチド配列がＭＣＴコードｍＲＮＡにおいて切断可能なヌクレオチド配列に対して相補性を有する構成とされる。これについては例えばCech等、米国特許第4,987,071号、およびCech等、米国特許第5,116,742号各明細書に記載されている。更に、ＭＣＴｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプール中の特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒活性ＲＮＡを選択することもできる。これについてはBartel, D.およびSzostak, J.W. 共著、(1993) Science 261: 1411-1418が参考となる。
【００８５】
また、ＭＣＴヌクレオチド配列の調節領域（例えばＭＣＴプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補性を有するヌクレオチド配列を標的とすることによりＭＣＴ遺伝子の発現を阻害することができる。これについては、Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene, C. 等著、(1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36、および Maher, L.J.等著(1992) Bioassays 14(12): 807-15を参照されたい。
【００８６】
Ｂ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明は、更にＭＣＴタンパク質（またはその一部）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターを含む。ここで、「ベクター」とは、核酸分子であって、この核酸分子が結合している他の核酸を運搬する能力のある分子を意味する。ベクターの一例には「プラスミド」があるが、これは、他のＤＮＡ部分を結紮することが可能な環状の２本鎖ＤＮＡループである。ベクターの他の例はウイルスベクターであり、このウイルスゲノムに他のＤＮＡセグメントを結紮することが可能である。所定のベクターを宿主細胞に導入すると、この宿主細胞において自律的な複製が可能とされる（例えば複製によるバクテリア由来のバクテリアベクターおよびエピソーム上の哺乳類ベクター）。他のベクター（例えばエピソーム以外の哺乳類ベクター）を、宿主細胞に導入することにより宿主細胞のゲノムに導入し、宿主ゲノムと共に複製する。更に、ある種のベクターは、これが協同的に結合している遺伝子の発現を支配することが可能である。これらのベクターを、ここでは「発現ベクター」という。一般に、ＤＮＡ組換え技術において使用される発現技術はプラスミドの形態をとることが多い。本明細書においては、「プラスミド」と「ベクター」は相互変換可能に用いられ、プラスミドがベクターの最も頻繁に使用される形態とされる。しかしながら、本発明は、同様の機能を有する他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含む。
【００８７】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での発現に適する形態で核酸を含む。組換え発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞を基準に選択された１種類以上の調節配列を含み、発現すべき核酸配列に協同的に結合されている。組換え発現ベクターにおいて、「協同的に結合された」とは、ヌクレオチド配列の発現が可能なように調節配列に（例えばin vitro転写／翻訳系で、または宿主細胞にベクターが導入される場合は宿主細胞中で）結合されていることを意味する。この「調節配列」とはプロモーター、エンハンサー、および他の発現調節要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むものである。この様な調節配列については、例えばGoeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。好ましい調節配列は、例えばcos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SPO2, λ-PR- または λ-PL等のプロモーターであり、これらはバクテリアにおいて好ましく使用される。他の調節配列の例は、ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH等の酵母および菌類由来のプロモーター、CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp, STLS1, B33等の植物由来のプロモーター、nosまたはユビキチン−およびファセオリン−プロモーターである。人工のプロモーターを使用することも可能である。発現ベクターの設計は、形質転換すべき宿主細胞の選択等の要因、所望のタンパク質の発現程度等により変化することは、当業者に理解されることである。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入可能であり、これにより、核酸によりコードされた融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド（例えばSRT タンパク質、ＭＣＴタンパク質の変異形、融合タンパク質等）が製造される。
【００８８】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物の各細胞におけるＭＣＴタンパク質の発現を行うために設計される。例えばＭＣＴ遺伝子は、Ｃ．グルタミカム等のバクテリア細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクター使用による）、酵母および他の菌類の細胞（Romanos, M.A. 等著、(1992) “Foreign gene expression in yeast: a review”, Yeast 8: 423-488; van den Hondel、 C.A.M.J.J. 等著、(1991) “Heterologous gene expression in filamentous fungi”  （More Gene Manipulations in Fungiにおける論考、J.W. Bennet & L.L. Lasure編、p. 396-428: Academic Press: San Diego, およびvan den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) “Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi（Applied Molecular Genetics of Fungiにおける論考）Peberdy J.F. 等編、p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge参照)、藻類および多細胞植物(Schmidt, R. 、Ｗillmitzer, L.共著 (1988) High efficiency Agrobacterium tumefaciens  mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants” Plant Cell ReP.: 583-586参照）、または哺乳類細胞において発現可能である。適する宿主細胞についてはGoeddel, Gene Expression Technology: Method in Enzymology185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に詳細な説明がある。更に、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモータ調節配列およびＴ７ポリメラーゼ等を用いることにより、in vitroで転写、翻訳することもできる。
【００８９】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を支配する構成性または誘導性プロモーターを含むベクターにより行われるのが最も一般的である。融合ベクターは、コードされるタンパク質に対して、組換えタンパク質の通常はアミノ末端、更にＣ末端に、多数のアミノ酸数を付加するか、このタンパク質の適当な領域内で融合する。この様な結合ベクターは３つの役割を果たす。すなわち、１）組換えタンパク質の発現を増大させる、２）組換えタンパク質の溶解性を向上させる、および３）親和精製におけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助する。融合発現ベクターにおいて、融合部分と組換えタンパク質の結合部分に蛋白分解切断部位を導入し、融合タンパク質の精製を行うことにより融合部分を組換え部分から分離することを可能とすることも頻繁に行われている。この様な酵素およびそのコグネイト認識部位の例には、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼがある。
【００９０】
典型的な融合発現ベクターの例は、pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B.、Johnson, K.S.共著、(1988) Gene 67: 31-40)、pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) およびpRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)であり、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトーゼＥ結合タンパク質、タンパク質Ａを組換えタンパク質に融合させる。一実施の形態において、ＭＣＴタンパク質のコード配列はｐＧＥＸ発現ベクターにクローンされ、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＧＳＴ−トロンビン切断部位−Ｘタンパク質を順に含む、融合タンパク質をコードするベクターが製造される。融合タンパク質は、グルタチオン−アガロース樹脂を用いたアフィニティー・クロマトグラフィーにより精製される。ＧＳＴとの融合から除去された組換えＭＣＴタンパク質は、融合タンパク質の、トロンビンによる切断により回収される。
【００９１】
適する誘導性非融合E.coli発現ベクターの例には、pTrc (Amann 等著、(1988) Gene 69: 301-315) pLG338、 pACYC184、 pBR322、 pUC18、 pUC19、 pKC30、 pRep4、 pHS1、 pHS2、 pPLc236、 pMBL24、 pLG200、 pUR290、 pIN-III 113-B1、λgt11、 pBdC1、およびpET11d (Studier等著、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89、およびPouwels等編、 (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018)がある。pTrcベクターによる標的遺伝子の発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写により行われる。pET11dベクターによる標的の遺伝子の発現は、協同発現するウイルスＲＮＡポリメラーゼ(T7 gnl)により仲介されたT7 gn10-lac融合プロモータによる転写により行われる。このウイルスポリメラーゼは、lacUV5プロモータの転写支配下にT7gn1遺伝子を含む定住λファージによる宿主株 BL21(DE3) またはHMS174(DE3) から供給される。他の多種のバクテリアの形質転換には、適するベクターを選択することが可能である。例えばプラスミドpIJ101、 pIJ364、 pIJ702 および pIJ361はストレプトマイセスの形質転換に有効であることが公知であり、プラスミドpUB110、 pC194またはpBD214はバキュラス種の形質転換に適している。遺伝情報をコリネバクテリウムに移送するために使用される数種類のプラスミドの例はpHM1519、 pBL1、 pSA77 またはpAJ667 (Pouwels等編、(1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018)である。
【００９２】
組換えタンパク質の発現を最大限に行う１つの方法は、組換えタンパク質の蛋白分解的切断を行う能力に欠陥を有する宿主バクテリア中でタンパク質を発現させることである(Gottesman, S.著、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego、California (1990) 119-128）。他の方法は、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を変化させ、各アミノ酸に対応するコドンの発現に用いられる所定のバクテリア、Ｃ．グルタミカムで優先的に使用することである（Wada等、(1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118)。この様な核酸配列の変更は、標準的なＤＮＡ合成技術により行われる。
【００９３】
他の実施の形態においては、ＭＣＴタンパク質発現ベクターとして酵母発現ベクターが用いられる。酵母S. cerevisiaeにおける発現を行うベクターの例としては、pYepSec1 (Baldari等、(1987) Embo J. 6: 229-234)、2μ、pAG-1、Yep6、 Yep13、pEMBLYe23、pMFa(Kurjan、Herskowitz共著、(1982) Cell 30: 933-943)、pJRY88 (Schultz等著、(1987) Gene 54: 113-123),およびpYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)が挙げられる。繊維状細菌等の他の菌類に好ましく使用されるベクターを構成するために用いるベクターおよび方法については、van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) “Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi、（Applied Molecular Genetics of Fungi）Ｊ.F. Peberdy等編、p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge、およびPouwels等編、(1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York (IBSN 0 444 904018）に詳細に記載されている。
【００９４】
更に、本発明のＭＣＴタンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞において発現する。培養された昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）におけるタンパク質の発現が可能なバキュロウイルスベクターの例は、pAc系（Smith等著、(1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165）およびpVL系（Lucklow およびSummers著、(1989) Virology 170: 31-39)である。
【００９５】
他の実施の形態において、本発明のＭＣＴタンパク質は、単細胞植物細胞（例えば藻類）または高等植物由来の植物細胞（例えば農作物等の種子植物）において発現可能である。植物発現ベクターの例については、Becker, D., Kemper, E., Schell, J. およびMasterson, R.著、(1992) “New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197、Bevan, M.W.著、(1984) “Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721に詳細に記載されており、更にpLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、およびpDH51 (Pouwels等編、(1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018)が、例として挙げられる。
【００９６】
他の実施の形態では、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞において発現される。哺乳類発現ベクターの例は、pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) およびpMT2PC (Kaufman 等著、(EMBO J. 6: 187-195)である。哺乳動物の細胞中で使用される場合の発現ベクターの制御機能は、ウイルスの調節要素により提供されることが多い。例えば、通常使用されるプロモーターはポリオーマウイルス属、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０由来のものである。原核細胞および真核細胞の双方における他の適する発現システムについては、Sambrook, J., Fritsh, E.F.およびManiatis, T.著、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第二版、第16 、17章、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照されたい。
【００９７】
他の実施の形態では、組換えによる哺乳類発現ベクターは、所定細胞種に選択的な核酸の発現を支配することが可能である（例えば、この様な核酸の発現には組織特異的調節要素が用いられる）。組織特異的調節要素はこの分野で公知である。組織特異的プロモータの例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的： Pinkert等著、(1987) Genes Dev. 1: 268-277）、リンパ系特異的プロモーター(Calame、Eaton共著、(1988) Adv. Immunol. 43: 235-275)、特にＴ細胞受容体の特異的プロモーター(Winoto、Baltimore共著、(1989) EMBO J. 8: 729-733)、免疫グロブリン(Banerji等著、(1983) Cell 33: 729-740、Queen、Baltimore著、(1983) Cell 33: 741-748)、ニュウロン特異的プロモータ（例えばニュウロフィラメントプロモーター、ByrneおよびRuddle 著、(1989) PNAS 86: 5473-5477)、膵臓特異的プロモーター（Edlund 等著、(1985) Science 230: 912- 916)、乳腺特異的プロモータ（例えば乳漿プロモーター、米国特許第4,873,316号明細書およびヨーロッパ特許出願公開第264,166号公報)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。発育中に調節されるプロモーターの例としては、ネズミ（マウス）のホックスプロモーター(Kessel、Gruss著、(1990) Science 249: 374-379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campes、Tilghman 著、(1989) Genes Dev. 3: 537-546)が挙げられる。
【００９８】
本発明は、更に、発現ベクターにアンチセンス方向にクローニングされた本発明のＤＮＡベクターを含む組換え発現ベクターを提供するものである。すなわち、ＤＮＡ分子は、ＭＣＴｍＲＮＡにアンチセンスなＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現が可能なように、調節配列に協同的に結合している。例えばアンチセンス方向にクローンされた核酸に協同的に結合する調節配列が選択され、これが種々の細胞種におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を支配する。調節配列の例には、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーがある。或いは、アンチセンスＲＮＡの構成性の組織特異的または細胞種類に特異的な発現を支配する調節配列を選択してもよい。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸を高効率の調節領域の支配下に産生する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であってもよい。この場合の活性はベクターが導入された細胞の種類によって決定する。アンチセンス遺伝子の発現の調節に関してはWeintraub, H.等、Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews  Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986に詳述されている。
【００９９】
更に、本発明は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を含む。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」の双方の表現は、本明細書では相互変換可能である。これらの表現は、特定の細胞のみならず、次世代細胞および後世代の細胞に発達する可能性のあるものに対しても用いる。変異または環境的な影響のいずれかにより後の世代に修飾が起こる可能性があるため、この様な後の世代は実際には親細胞とは同一ではないこともあるが、この場合も上述の表現に含まれるものとする。
【０１００】
宿主細胞はいかなる原核細胞または真核細胞であってもよい。例えばＭＣＴタンパク質はＣ．グルタミカム等のバクテリア細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現される。他の適当な宿主細胞は、当業者に公知のものである。従来の宿主細胞として使用可能とされた、本発明の核酸およびタンパク質分子に用いられる、従来の宿主細胞として用いられていたコリネバクテリウム−グルタミカムに関連する微生物を表３に記載する。
【０１０１】
慣用の形質転換または形質移入技術によりベクターＤＮＡが原核細胞または真核細胞に導入可能である。本明細書で、形質転換（トランスフォーメーション）、形質移入（トランスフェクション）、対合（コンジュゲーション）および形質導入（トランスダクション）とは、外来核酸（例えば鎖状ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば直鎖化ベクターまたはベクターを有さない遺伝子構成部分のみ）またはベクター状の核酸（例えばプラスミド、ファージ、ファスミド、ファージミド、トランスポロンまたは他のＤＮＡ））を宿主細胞に導入する種々の公知技術、例えばリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共同沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、天然受容能、化学物質仲介による導入、またはエレクトロポレーションを示す。宿主細胞の形質転換または形質移入についての適当な方法は、Sambrook等著、(Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)、および他の研究マニュアルに記載されている。
【０１０２】
哺乳類細胞の安定な形質移入では、使用する発現ベクターと形質移入技術により、細胞の小部分により外来ＤＮＡがゲノム中に統合されることもあることが公知である。これらの構成要素全体を認識し選択するため、選択可能なマーカーをコードする遺伝子（例えば抗生物質に対する耐性）を所望の遺伝子と共に宿主細胞に導入する。適するマーカーの例には、薬剤に対して耐性を付与するもの、例えばＧ４１８、ハイグロマイシン、メトトレキセートがある。選択可能なマーカーをコードする核酸は、宿主細胞中の、ＭＣＴタンパク質をコードするベクターと同一のベクターに導入可能であるが、他のベクターに導入することもできる。導入された核酸により安定に形質移入された細胞は薬物の選択等により認識される（例えば選択可能なマーカー遺伝子が導入された細胞は維持され、他の細胞は死滅する）。
【０１０３】
相同な組換え微生物を得るためには、欠失、付加、置換が導入されたＭＣＴ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを製造し、これによりＭＣＴ遺伝子を、例えば機能的な混乱等により変化させる。このＭＣＴ遺伝子はコリネバクテリウム−グルタミカムＭＣＴ遺伝子であることが好ましいが、関連するバクテリアまたは哺乳動物、酵母または昆虫に相同なものであってもよい。好ましい実施の形態において、ベクターは相同な組換えの上、内因性ＭＣＴ遺伝子が機能的に混乱するように設計されていることが好ましい（すなわち、機能的タンパク質をコードしないように設計される。これは「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）。あるいは、相同な組換えの後、内因性ＭＣＴ遺伝子が変異または変化しているが、機能性タンパク質をコードしている状態を保つ（例えば上流の調節領域が変化し、これにより内因性ＭＣＴタンパク質の発現を変化させる）ようにベクターを設計することも可能である。相同な組換えベクターにおいて、ＭＣＴ遺伝子の５’および３’末端側方に付加的な核酸が配置し、改変部分が得られる。このベクターによりもたらされた外因性ＭＣＴ遺伝子と微生物における内因性ＭＣＴの間で相同組換えが可能とされる。この付加的に側方に位置するＭＣＴ核酸は十分な長さを有し、外来遺伝子による十分に相同な組換えを可能としている。通常は、数ｋｂの側方配置ＤＮＡ（５’末端および３’末端の双方において）がベクターに含まれている（Thomas, K.R.およびCapecchi, M.R.共著、(1987) Cell 51: 503 for a description of homologous recombination vector)。ベクターが微生物に導入され（例えばエレクトロポレーション）、導入されたＭＣＴ遺伝子と内因性ＭＣＴ遺伝子との組み合わせを有する細胞が公知技術により選択される。
【０１０４】
他の実施の形態においては、導入された遺伝子の調節された発現を可能とする選択された系を有する組換え微生物が製造される。ＭＣＴ遺伝子をベクター上に、lacオペロンの支配下に導入することにより、IPTGが存在する場合のみＭＣＴ遺伝子の発現を行うことが可能となる。この様な調節システムは従来技術より公知である。
【０１０５】
他の実施の形態では、宿主細胞における内因性ＭＣＴ遺伝子を、これから得られたタンパク質産物が発現しないように混乱させる（相同組換えまたは従来技術による他の遺伝子上の手段による）。他の実施の形態では、宿主細胞中の内因性または導入されたＭＣＴ遺伝子が１カ所以上の点変異、欠失または逆位により変化しているが、機能性ＭＣＴタンパク質をコードしている。更に他の実施の形態では、微生物におけるＭＣＴ遺伝子の１カ所以上の調節領域（例えばプロモーター、リプレッサー、またはインデューサー）が、ＭＣＴ遺伝子の発現が調節されるように変化させられている（例えば欠失、切断、逆位、点変異による）。当業者にいると、１種類以上の上述のＭＣＴ遺伝子とタンパク質の修飾を有する宿主細胞は、本発明の方法により簡単に製造され、これらも本発明に含まれるものであることが容易にわかる。
【０１０６】
本発明の宿細胞、例えば培養体における原核細胞または真核細胞を用い、ＭＣＴタンパク質を製造する（すなわち発現させる）ことができる。従って、本発明は、更に本発明の宿主細胞を使用してＭＣＴタンパク質を製造する方法を提供するものである。好ましい実施の形態において、この方法では、ＭＣＴタンパク質が得られるまで本発明の細胞（ＭＣＴタンパク質をコードしている組換え発現ベクターが導入されているか、ゲノムが導入され、野生型または改変型ＭＣＴタンパク質をコードしている細胞）を適する培地中で培養する。他の実施の形態において、本発明の方法では培地または宿主細胞からＭＣＴタンパク質を単離する工程を含んでいる。
【０１０７】
Ｃ．単離されたＭＣＴタンパク質
本発明は、更に単離されたＭＣＴタンパク質、およびその生物学的に活性な一部を含む。「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性は部分は、組換えＤＮＡ技術で製造された場合に細胞質材料を実質的に含まず、化学的に合成された場合には化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない」とは、天然または組換え技術により製造された、細胞における細胞成分から分離したＭＣＴタンパク質の調製を意味する。一実施の形態において、「細胞材料を実質的に含まない」とは、非ＭＣＴタンパク質（「汚染タンパク質」（contamining protein）ともいう）を約３０％未満（乾重量で）、好ましくは約２０％未満、更に好ましくは約１０％未満、特に好ましくは５％未満含むＭＣＴタンパク質の調製を意味する。ＭＣＴタンパク質またはこの生物学的に活性な部分が組換えにより製造可能である場合、培地を実質的に含まないことが好ましい。すなわち培地がタンパク質製造の容量の２０％未満、更に好ましくは約１０％未満、特に好ましくは約５％未満であることが好ましい。一実施の形態では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という表現は、「約３０％（乾重量）未満、好ましくは約２０％未満、更に好ましくは約１０％未満、特に好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＭＣＴ化学物質を含むＭＣＴタンパク質の調製を意味する。単離されたタンパク質またはこの生物学的に活性な部分は、このＭＣＴタンパク質が誘導されたと同じ生物からの汚染（源）タンパク質を含まないことが好ましい。一般に、この様なタンパク質は、Ｃ．グルタミカム等の微生物におけるＣ．グルタミカムＭＣＴタンパク質等の組換え発現により製造される。
【０１０８】
本発明の単離されたＭＣＴタンパク質またはその一部は、Ｃ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与するか、または表１に記載の活性を有する。タンパク質またはその一部は、本発明の配列（例えば配列表中の偶数のSEQ ID NOによる配列）に十分に相同なアミノ酸配列を含み、このタンパク質または上述の一部が、Ｃ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与する能力を維持していることが好ましい。タンパク質の一部が、上述の生物学的な活性を有する部分であると好ましい。他の好ましい実施の形態では、本発明のＭＣＴタンパク質は、配列表中の偶数のSEQ ID NOによるアミノ酸配列を有している。他の好ましい実施の形態では、ＭＣＴタンパク質は本発明のヌクレオチド配列（例えば配列表中の奇数のSEQ ID NOによる配列）とハイブリダイズする、例えば緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされている。更に他の好ましい実施の形態では、ＭＣＴタンパク質は、本発明の核酸配列またはその一部に対して、少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%または60%、好ましくは少なくとも約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、または70%、更に好ましくは少なくとも約71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、または80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%または90%、91%、92％、93%、94%、特に好ましくは少なくとも約95%、96%、97%、 98%、99%以上相同なヌクレオチド配列によりコードされているアミノ酸配列を有する。上記各値の中間値により示される値の範囲（例えば７０〜９０％同一または８０〜９５％同一）も本発明に含まれる。例えば、上限値および／または下限値として記載された上述の値のいずれを組み合わせて値の範囲としてもよい。本発明のＭＣＴタンパク質は、本明細書に記載された少なくとも１種類のＭＣＴ活性を有することが好ましい。例えば、本発明のＭＣＴタンパク質は、本発明の核酸配列に、ハイブリダイズする、例えば緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列と実質的に相同であり、Ｃ．グルタミカムの細胞膜の構成に必要な化合物の代謝、またはこの膜を横切って行われる分子の輸送に関与可能であるか、表１に記載の１種類以上の活性を有することが好ましい。
【０１０９】
好ましい実施の形態では、ＭＣＴタンパク質は、上述の第Ｉ欄で詳細に記載したように、本発明のアミノ酸配列（例えば配列表中の偶数のSEQ ID NOによる配列）と実質的に相同であり、天然の変化、変異生成によるアミノ酸配列が異なるものの、タンパク質の機能的活性を保持するものである。他の実施の形態では、
ＭＣＴタンパク質は、本発明のアミノ酸配列の全体に対して、少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%または60%、好ましくは少なくとも約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、または70%、更に好ましくは少なくとも約71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、または80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%または90%、91%、92％、93%、94%、特に好ましくは少なくとも約95%、96%、97%、 98%、99%以上相同なアミノ酸配列を含み、上述のＭＣＴ活性のいずれかを含むタンパク質である。上記各値の中間値により示される値の範囲（例えば７０〜９０％同一または８０〜９５％同一）も本発明に含まれる。例えば、上限値および／または下限値として記載された上述の値のいずれを組み合わせて値の範囲としてもよい。本発明は、本発明のアミノ酸配列の全体に対して実質的に相同なＣ．グルタミカムタンパク質の全体を含む。
【０１１０】
ＭＣＴタンパク質の生物学的に活性な部分は、ＭＣＴタンパク質のアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列（例えば配列表中の偶数のSEQ ID NOによるアミノ酸配列）、またはＭＣＴタンパク質に相同なタンパク質のアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列（ＭＣＴタンパク質に全体よりも少ないアミノ酸を含むか、ＭＣＴタンパク質に相同なタンパク質全体を含む）を含み、ＭＣＴタンパク質の少なくとも１種類の活性を示す。
【０１１１】
一般的に、生物学的に活性な部分（ペプチド、例えば5、10、15、20、30、35、 36、37、38、39、40、50、100以上のアミノ酸長のペプチド）は、ＭＣＴタンパク質の少なくとも１種類の活性を有するドメインまたはモチーフを含む。更に、タンパク質の他の部分が欠失している、生物学的に活性な他のタンパク質を組換え技術により製造し、本明細書に記載された１種類以上の活性についての評価を行うことも可能である。ＭＣＴタンパク質の生物学的に活性な部分は、生物学的活性を有する１種類以上の選択されたドメイン／モチーフまたはその一部である。
【０１１２】
ＭＣＴタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により製造されることが好ましい。例えばタンパク質をコードしている核酸分子を発現ベクターにクローンし（上記参照）、この発現ベクターを宿主細胞に導入し（上記参照）、このＭＣＴタンパク質を宿主細胞中で発現させる。ＭＣＴタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いた適当な精製方法により細胞から単離される。組換え発現以外の方法では、標準的なペプチド合成法を用い、ＭＣＴタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを化学的に合成する。更に、例えば本発明のＭＣＴタンパク質またはそのフラグメントを用いて標準的な技術により製造された抗ＭＣＴ抗体を使用して未変性ＭＣＴタンパク質を細胞（例えば内皮細胞）から単離することができる。
【０１１３】
本発明は、更に、ＭＣＴキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。ここで、ＭＣＴ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」とは、非ＭＣＴポリペプチドに協同的に結合するＭＣＴポリペプチドを含む。ＭＣＴ「ポリペプチド」とはＭＣＴに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、「非ＭＣＴポリペプチド」とはＭＣＴタンパク質に実質的な相同性を有さないタンパク質、例えばＭＣＴタンパク質と異なり、同一または異なる生物から誘導されたタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。融合タンパク質に関して、「協同的に結合した」とは、ＭＣＴポリペプチドと非ＭＣＴポリペプチドがインフレームで相互に融合していることを意味している。非ＭＣＴポリペプチドはＭＣＴポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に融合可能である。例えば、融合タンパク質の例には、ＭＣＴ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に結合したＧＳＴ−ＭＣＴ融合タンパク質がある。この様な融合タンパク質は、組換えＭＣＴタンパク質の精製に有効に用いられる。他の実施の形態では、融合タンパク質として、Ｎ末端に非相同のシグナル配列を含むＭＣＴが用いられる。所定の宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）では、ＭＣＴタンパク質の発現および／または分泌は、非相同シグナル配列を使用することにより改善される。
【０１１４】
本発明のＭＣＴキメラタンパク質または融合タンパク質は標準的組換えＤＮＡ技術により製造される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードしているＤＮＡフラグメントは、慣用の技術により相互に結紮される。例えば、結紮に平滑末端または付着末端を用いた処理、好ましい末端を得るための制限酵素による消化、適当な粘着末端を得るための充填、不適当な結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素による結紮により行われることが好ましい。他の実施の形態では、融合遺伝子は自動ＤＮＡ合成機の使用等による慣用の技術により合成される。この他の場合には、２本の平行する遺伝子フラグメントの間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いて遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行う。この場合の２本の遺伝子フラグメントは、後にアニーリングし、再増幅してキメラ遺伝子配列を生成する（例えば、Molecular Biology、Ausubel等編、John Wiley & Sons: 1992)。更に、予め融合部分をコードしている多種の発現ベクターが市販されている（例えばＧＳＴポリペプチド）。ＭＣＴをコードしている核酸は、上述のような発現ベクターに、融合部分がＭＣＴタンパク質に対してインフレームに結合するようにクローンされる。
【０１１５】
ＭＣＴタンパク質の相同体は変異生成、例えばＭＣＴタンパク質の散在点変異または切断により生成する。本明細書では、「相同体」という用語は、ＭＣＴタンパク質活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するＭＣＴタンパク質の変異形を意味する。ＭＣＴタンパク質のアゴニストは、ＭＣＴタンパク質と同等の生物学的活性またはサブセットを維持することができる。ＭＣＴタンパク質のアンタゴニストは、ＭＣＴタンパク質を含む細胞膜成分代謝カスケードの下流または上流メンバーに競争的に結合するか、膜を通過する化合物の輸送を仲介するＭＣＴタンパク質に結合することにより、転位の発生を防止することができる。
【０１１６】
他の実施の形態において、ＭＣＴタンパク質の相同体は、ＭＣＴタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性を得るための、ＭＣＴタンパク質の変異体、例えば切断による変異体の組合わせライブラリーをスクリーニングすることにより同定される。一実施の形態において、ＭＣＴ変異体の異形ライブラリは、核酸レベルでの組合わせ変異生成により得られ、異形遺伝子ライブラリによりコードされる。ＭＣＴ変異体の異形ライブラリは、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列中に、ＭＣＴ配列を構成する可能性のある一連の変性体が個々のポリペプチドとして、或いは一連のＭＣＴ配列を含む大きな融合タンパク質（例えばファージディスプレー）として発現可能であるように、酵素的結紮により製造される。分解されたオリゴヌクレオチド配列からＭＣＴ相同体を構成する可能性のあるライブラリーを形成するためは、種々の方法が使用される。分解した遺伝子配列の化学的合成は、自動ＤＮＡ合成機中で行われ、合成された遺伝子は適当な発現ベクターに結紮させられる。分解された遺伝子をセットとして使用することにより、ＭＣＴ配列を構成する可能性のある所望のセットをコードする全ての配列が混合物として提供される。分解されたオリゴヌクレオチドを合成する方法は従来技術により公知である（例えばNarang, S.A. 著、(1983) Tetrahedron 39: 3、Itakura等著、(1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323、Itakura 等著、(1984) Science 198: 1056、Ike等著、(1983) Nucleic Acid Res. 11: 477）。
【０１１７】
更に、ＭＣＴタンパク質コードのフラグメントライブラリを用いて、ＭＣＴタンパク質の相同体のスクリーニングと選択を行う、ＭＣＴフラグメントの異形個体群を製造することが可能である。他の実施の形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、以下の方法で得られる。すなわち、ＭＣＴコード配列の２本鎖ＰＣＲフラグメントを、分子ごとに約１回だけニッキングが起こる条件下で、ヌクレア―ゼで処理し、２本鎖ＤＮＡを変性させ、異なるニッキングを起こした産物からセンス／アンチセンス対を含むＤＮＡが２本鎖ＤＮＡを形成するように復元し、再形成された２本鎖から、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理により１本鎖タンパク質を除去し、得られたフラグメントライブラリを発現ベクターに結紮する。この方法により、発現ライブラリーは、種々の大きさＭＣＴタンパク質のＮ末端、Ｃ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが得られる。
【０１１８】
点変異または切断により得られた組合わせライブラリの遺伝子産物をスクリーニングし、所定の性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリのスクリーニングを行うための複数の技術が公知である。この様な技術はＭＣＴ相同体の組合わせ変異生成により得られた遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに用いられる。この最も広く用いられている方法は、大きな遺伝子ライブラリのスクリーニングを行うための高速処理分析に用いられる。この方法では、一般に、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクターにクローニングし、適当な細胞を形質転換してベクターのライブラリーを得、所望の機能の検出により遺伝子をコードするベクターが単離され、遺伝子からの産物が検出される条件下で、組換え遺伝子を発現させる。ライブラリにおける帰納的変異体の発生率を向上させる新しい技術、すなわち帰納的集合変異生成(REM: recursive ensemble mutagenesis)を、ＭＣＴ相同体を同定するためのスクリーニング法と組み合わせて用いることができる（Arkin、Yourvan共著 (1992) PNAS 89: 7811-7815、Delgrave等著、(1993) Protein Engineering 6(3): 327-331）。
【０１１９】
他の実施の形態では、細胞を基準とする分析が行われ、公知方法を用いて異形ＭＣＴライブラリを分析することができる。
Ｄ．本発明の方法および使用法
本明細書に記載されている核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、相同タンパク質、プライマー、ベクター、および宿主細胞は、以下温１種類以上の方法により用いられる。すなわち、Ｃ．グルタミカムおよび関連する生物の同定（認識）、Ｃ．グルタミカムに関連する生物のマップ作成、所望のＣ．グルタミカムの同定および存在位置の確認、進化の研究、機能を得るために必要なＭＣＴタンパク質領域の決定、ＭＣＴタンパク質活性の調節、１種類以上の細胞膜成分の代謝調節、１種類以上の化合物の膜内外輸送の調節、および所望の化合物、例えばファインケミカルの細胞による産生の調節において用いられる。
【０１２０】
本発明のＭＣＴ核酸分子は種々の用途を有する。まず、同分子はコリネバクテリウム−グルタミカムまたはこれに密接に関連する生物を同定するために使用される。更に、ＭＣＴ核酸分子は、微生物の混合個体群におけるＣ．グルタミカムまたはこれに密接に関連する生物の存在を認識するために使用される。更に、本発明は、微生物の単独種類の個体群または混合個体群の培養体中の抽出されたゲノムＤＮＡを、緊縮条件下で、Ｃ．グルタミカム遺伝子特有の領域をスパニングするプローブを用いて調べることにより、この生物の存在を確認する。
【０１２１】
コリネバクテリウム−グルタミカム自体には病原性はないが、コリネバクテリウム−ジフテリア等の病原性種に関連を有する。コリネバクテリウム−ジフテリアはジフテリアの原因物質であり、急速に成長し、局所的および全身性病状の双方に関連する急性かつ熱性の感染を起こす。この疾病では、局所的障害が上部気道におよび壊死性損傷を内皮細胞まで到達させ、桿菌がトキシンを分泌し、障害が体の遠位の敏感な組織まで広がる。これらの組織、例えば心臓、筋肉、末梢神経、副腎、腎臓、肝臓および脾臓におけるタンパク質合成の阻害により変形性変化が生じ、この結果、疾病の全身性病状が示されるようになる。世界の多くの地域、例えばアフリカ、アジア、東ヨーロッパおよび旧ソビエト連邦から独立した国々において、ジフテリアは高発生率を示している。最後に挙げた２つの地域で続くジフテリアの流行により、１９９０年以来５０００人の死亡者が出る結果となった。
【０１２２】
一実施の形態において、本発明によると、被検体（被検者／患者）におけるコリネバクテリウム−ジフテリアの活性の存在を認識（同定）する方法が提供される。この方法では、本発明の核酸またはアミノ酸配列（例えば配列表の奇数または偶数のSEQ ID NOのヌクレオチド配列）の１種類以上の活性の存在を被検体より検出し、これによりコリネバクテリウム−ジフテリアの存在または活性を検出する。Ｃ．グルタミカムとＣ．ジフテリアとは関連するバクテリアであり、Ｃ．グルタミカムの核酸およびタンパク質分子の多くがＣ．ジフテリアの核酸およびタンパク質分子と相同であるため、この方法は被検体におけるＣ．ジフテリアの検出にも使用可能である。
【０１２３】
本発明の核酸およびタンパク質分子は、ゲノムの特定領域のマーカーとしての役割も果たす。これはゲノム地図作製のみならず、Ｃ．グルタミカムタンパク質の機能に関する研究にも利用される。例えば、特定のＣ．グルタミカムＤＮＡ−結合タンパク質が結合するゲノムの領域を同定するために、Ｃ．グルタミカムゲノムを消化することが可能であるが、フラグメントはＤＮＡ−結合タンパク質とインキュベートされる。タンパク質と結合する領域を、本発明の核酸に好ましくは検出が容易なラベルを付けたものを用いて詳細に調べることも可能であり、この様な核酸の遺伝子フラグメントに対する結合により、Ｃ．グルタミカムのゲノム地図におけるフラグメントの位置特定が可能となり、更に種々の酵素により複数回試行すれば、タンパク質が結合している核酸配列が迅速に決定される。更に、本発明の核酸分子は、関連種の配列に十分な相同性を有するため、関連するバクテリア、例えばブレビバクテリウム−ラクトフェルメントムにおけるゲノムマップ構造のマーカーとして作用する。
【０１２４】
本発明のＭＣＴタンパク質分子は進化論的およびタンパク質構造学においても有用である。本発明の分子が関連する代謝および輸送の過程は、本発明の核酸分子の配列を他の生物から得られた同様の酵素をコードする分子の配列と比較し、この生物の進化上の関連性を評価することにより種々の原核および真核細胞で使用される。同様に、この様な比較により、配列のどの部分が変換され、どの部分が変換されないかの評価が可能となり、酵素の機能に重要なタンパク質領域の特定に利用される。この様な特定方法は、タンパク質工学において重要であり、機能を失なわずに変異を行うタンパク質の変異生成では、何に対する耐性が得られるかの指標となる。
【０１２５】
本発明のＭＣＴ核酸分子の加工により、野生型ＭＣＴタンパク質と異なる機能を有するＭＣＴタンパク質を製造することが可能となる。この様なタンパク質により、その効率または活性を改善すること、細胞中に通常より多数これを存在させること、効率または活性を低下させることも可能である。
【０１２６】
本発明は、ＭＣＴタンパク質の活性を、このタンパク質自体、基質またはＭＣＴタンパク質の結合対象との相互作用か、または本発明のＭＣＴ核酸分子の転写または翻訳の調節による分子のスクリーニング方法を提供する。この方法では、本発明の１種類以上のＭＣＴタンパク質を発現する微生物を１種類以上の被検化合物と接触させ、各被検化合物の、ＭＣＴタンパク質の活性または発現水準についての効果を評価する。
【０１２７】
本発明のＭＣＴタンパク質の改変が、この改変したタンパク質を組み込んだＣ．グルタミカム株から得られたファインケミカルの収率、生産および／または製造効率に直接的に関与する多数のメカニズムがある。Ｃ．グルタミカムの大規模な培養系からのファインケミカル化合物の回収は大幅に改善された。これは、Ｃ．グルタミカムが所望の化合物を生産する場合（Ｃ．グルタミカム細胞を大量生産する場合の抽出とは反対に）、この様な化合物が培地から容易に精製されるためである。細胞からファインケミカルを放出するトランスポーター分子の数または活性を増加させることにより、細胞外媒体中のファインケミカル量を増大させることが可能であり、これにより回収および精製が顕著に容易化される。反対に、１種類以上のファインケミカルを効率的に過剰生産するためには、好適な生合成経路には、補助因子、前駆体分子および中間体化合物を増量して用いることが必要である。従って、炭素源（例えば糖類）、窒素源（例えばアミノ酸、アンモニウム塩）、リン酸（塩）および硫黄糖の栄養分の導入に関与するトランスポータータンパク質の数および／または活性を増大させることにより、生合成工程の栄養分供給に関する制限がなくなり、ファインケミカル製造が改善されることになる。更に、脂肪酸および脂質自体が所望のファインケミカルであるため、これらの化合物の生合成に関与する本発明の１種類以上のＭＣＴタンパク質の活性を最適化させるか、もしくは数を増大させることにより、またはこれらの化合物の分解に関与するＭＣＴタンパク質の活性を低下させることにより、Ｃ．グルタミカム由来の脂肪酸および脂質分子の収率、生産および／または製造効率を向上させることが可能となる。
【０１２８】
本発明の１種類以上のＭＣＴ遺伝子を加工することにより、活性の変化したＭＣＴタンパク質を得ることが可能であり、これが、Ｃ．グルタミカムから１種類以上の所望のファインケミカルを製造する際に間接的に影響を与える。例えば、代謝の正常な生合成工程により、種々の排出物（例えば過酸化水素および他の活性酸素種）の生産に影響が与えられ、同様の代謝工程に積極的に影響を与えることがある（例えば、ペルオキシニトリルはニトレートチロシン側鎖として公知であり、活性部位にチロシンが存在することにより、数種類の酵素が不活性化する（Groves,J.T.(1999)  Cuur. Opin. Chem. Biol. 3(2):226-235）。大規模培養製造において、使用されるＣ．グルタミカム株が、１種類以上のファインケミカルを過剰生産するように調節されている場合、野生型Ｃ．グルタミカムに通常見られるよりも多くの排出物が分泌される。排出物分子の放出に関与する本発明の１種類以上のＭＣＴタンパク質の活性を調節することにより、細胞の生存力を向上させ、効率的な代謝活性を維持することが可能となる。更に、所望のファインケミカルが高細胞内濃度で存在することにより、事実上細胞に有害となることもあり、このため、これらの化合物を分泌する細胞の能力を向上させることにより、細胞の生存力の向上が可能となる。
【０１２９】
更に、本発明のＭＣＴタンパク質を加工して、製造される多種の脂質および脂肪酸分子の相対的な量を変化させることも可能である。これにより、細胞の膜の脂質組成に重大な影響を与えることがある。各種の脂質が異なる物理特性を有するため、膜における脂質組成を変化させると膜の流動性が著しく変化する。膜の流動性の変化は、膜を通過する分子の輸送に影響を与え、これが上述したように排出物もしくは製造されたファインケミカルの放出と、必要な栄養の導入に変化を与える。更に膜流動性の変化は細胞の完全性に重大な影響を与えることがあり、比較的弱い膜を有する細胞は、大規模発酵環境における機械的特性に敏感であり、これにより細胞の損傷または死がもたらされることがある。膜を構成する脂肪酸または脂質の産生に関与するＭＣＴタンパク質を、得られた膜の組成がファインケミカルの製造に使用される培養体中における環境条件に影響を受けやすくなるように操作することにより、Ｃ．グルタミカムがより多く生存し、増殖することになる。培養体中により多くのＣ．グルタミカムが存在すれば、培養体からのファインケミカルの収率、生産または製造効率につながる。
【０１３０】
Ｃ．グルタミカムから得られるファインケミカルの収率を増大させるＭＣＴタンパク質の変異生成は、上述の事項に限定されるものではなく、これらの操作を変形可能であることは当業者には明白である。これらの方法を用い、上記メカニズムを組み込むことにより、本発明の核酸およびタンパク質分子は、Ｃ．グルタミカムまたは変異ＭＣＴ核酸およびタンパク質分子を発現する関連バクテリア株が、所望の化合物の収率、製造および／または製造効率が向上した状態で得られる。この所望の化合物はＣ．グルタミカムの天然産物であってもよく、その例には生合成経路の最終産物、天然発生代謝経路の中間産物、またはＣ．グルタミカムの代謝において天然には発生しないが本発明のＣ．グルタミカム株により製造される分子が含まれる。
【０１３１】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書に記載の参考文献、特許出願、特許、特許公報、表および配列表は、参考のため本明細書に組みこまれているものである。
【０１３２】
【表１】
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【０１３３】
【表２】
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【０１３４】
【表３】
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【０１３５】
【表４】
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【０１３６】
【表５】
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【０１３７】
【表６】
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【０１３８】
【表７】
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【０１３９】
【表８】
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【０１４０】
【表９】
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【０１４１】
【表１０】
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【０１４２】
【表１１】
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【０１４３】
【表１２】
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【０１４４】
【表１３】
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【０１４５】
【表１４】
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【０１４６】
【表１５】
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【０１４７】
【表１６】
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【０１４８】
【表１７】
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【０１４９】
【表１８】
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【０１５０】
【表１９】
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【０１５１】
【表２０】
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【０１５２】
【表２１】
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【０１５３】
【表２２】
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【０１５４】
【表２３】
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【０１５５】
【表２４】
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【０１５６】
【表２５】
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【０１５７】
【表２６】
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【０１５８】
【表２７】
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【０１５９】
【表２８】
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【０１６０】
【表２９】
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【０１６１】
【表３０】
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【０１６２】
【表３１】
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【０１６３】
【表３２】
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【０１６４】
【表３３】
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【０１６５】
【表３４】
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【０１６６】
【表３５】
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【０１６７】
【表３６】
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【０１６８】
【表３７】
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【０１６９】
【表３８】
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【０１７０】
【表３９】
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【０１７１】
【表４０】
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【０１７２】
【表４１】
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【０１７３】
【表４２】
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【０１７４】
【表４３】
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【０１７５】
【表４４】
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【０１７６】
【表４５】
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【０１７７】
【表４６】
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【０１７８】
【表４７】
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【０１７９】
【表４８】
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【０１８０】
【表４９】
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【実施例】
【０１８１】
実施例１：コリネバクテリウム−グルタミカム ATCC13032の全ゲノムＤＮＡの製造
コリネバクテリウム−グルタミカム (ATCC13032）の培養は、激しく攪拌したＢＨＩ媒体（Ｄｉｆｃｏ）中で、３０℃で終夜行なわれた。細胞は遠心分離により回収され、上澄みを処分し、細胞は、５ｍｌの緩衝液Ｉ（最初の培養容積の５％、すべての示された容積は、１００ｍｌの培養容積のために計算されたものである。）中再懸濁された。緩衝液Ｉの組成は、１４０．３４ｇ／ｌのショ糖、２．４６ｇ／ｌのＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、１０ｍｌ／ｌのＫＨ2ＰＯ4溶液（１００ｇ／ｌ、ＫＯＨでｐＨ６．７に調整）、５０ｍｌ／ｌのＭ１２濃縮物（１０ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌのＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、０.２ｇ／ｌのＣａＣｌ2、０．５ｇ／ｌの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍｌ／ｌのトレース−エレメンツ−ミックス（２００ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ4ｘＨ2Ｏ、１０ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、３ｍｇ／ｌのＭｎＣｌ2ｘ４Ｈ2Ｏ、３０ｍｇ／ｌのＨ3ＢＯ3、２０ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ2ｘ６Ｈ2Ｏ、１ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ2ｘ６Ｈ2Ｏ、３ｍｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4ｘ２Ｈ2Ｏ、５００ｍｇ／ｌの錯化剤（ＥＤＴＡまたはクエン酸）、１００ｍｌ／ｌのビタミン−ミックス（０．２ｍｇ／ｌのビオチン、０．２ｍｇ／ｌの葉酸、２０ｍｇ／ｌのｐ−アミノ安息香酸、２０ｍｇ／ｌのリボフラビン、４０ｍｇ／ｌのパントテン酸カルシウム、１４０ｍｇ／ｌのニコチン酸、４０ｍｇ／ｌの塩酸ピリドキソール、２００ｍｇ／ｌのミオ−イノシトール）である。リゾチームを最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌになるまで懸濁液に加えた。約４時間、３７℃での培養の後、細胞壁を劣化させ得られたプロトプラストを遠心分離によって回収した。ペレットを５ｍｌの緩衝液Ｉで一度、５ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）で一度洗浄した。ペレットを４ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、０．５ｍｌのＳＤＳ溶液（１０％）と０．５ｍｌのＮａＣｌ溶液（５Ｍ）を加えた。プロテイナーゼＫを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるまで加えた後、懸濁液を約１８時間、３７℃で培養した。ＤＮＡを標準的な操作で、フェノール、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールおよびクロロホルム−イソアミルアルコールによる抽出により精製した。それから、ＤＮＡを１／５０容積の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容積のエタノールを加えて析出させ、次いで３０分間、−２０℃でインキュベートし、ＳＳ３４ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ）を使用した高速遠心分離機で１２０００ｒｐｍで遠心分離を３０分間行なった。ＤＮＡを２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡを含む１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解し、４℃で、少なくとも３時間１０００ｍｌのＴＥ緩衝液に対して透析した。この間、緩衝液を３度交換した。透析したＤＮＡ溶液の０．４ｍｌの部分に、０．４ｍｌの２ＭＬｉＣｌと０．８ｍｌのエタノールを加えた。３０分間、−２０℃でインキュベートした後、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、Ｂｉｏｆｕｇｅ  Ｆｒｅｓｃｏ，Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｈａｎａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＤＮＡを集めた。ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液に溶解した。この操作により製造されたＤＮＡは、すべての目的、サザンブロット法またはゲノムライブラリーの構築に使用することができた。
【０１８２】
実施例２：コリネバクテリウム−グルタミカム ATCC13032のEscherichia Coliにおけるゲノムライブラリーの構築
実施例１に記載したように製造されたＤＮＡを用いて、コスミッドおよびプラスミドライブラリーが、公知で、よく確立された方法に従って構築された(例えば、Sambrook,Jら、(1989)'Molecular Cloning:A Laboratory Manual', Cold Spring Harbor Laboratory PressまたはAusubel,F.Mら(1994) 'Current Protocols in Molecular Biology', John Wiley and Sons.を参照）。
【０１８３】
どんなプラスミドまたはコスミッドでも使用することができた。特別に、プラスミドpBR322（Sutcliffe, J.G.(1979) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:3737-3741);pACYC177 (Change とCohen(1978) J.Bacteriol 134:1141-1156),pBSの系列のプラスミド(pBSSK+,pBSSK-およびその他；Stratagene LaJolla,USA),またはSuperCos1（Stratagene LaJolla,USA)、Lorist6(Gibson,T.J.,Rosenthal A.およびWaterson,R.H.(1987) Gene 53:283-286)のコスミッドが使用された。特にC.glutamicumにおいて使用するためのジーンライブラリーは、プラスミドpSL109( Lee,H.S.およびA.J.Sinskey(1994) J.Microbiol.Biotechnol.4:256-263)を用いて構築することができる。
【０１８４】
実施例３：ＤＮＡシーケンスとコンピューターによる機能解析
実施例２に記載されたゲノムライブラリーを標準的な方法、特にＡＢＩ３７７シーケンスマシーンを用いた鎖成長停止反応法（例えばFleischman,R.D.ら(1995)'Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd.',Science, 269:496-512参照）に従ったＤＮＡシーケンスに使用した。以下のヌクレオチド配列のシーケンスプライマーが使用された：5'-GGAAACAGTATGACCATG-3'(SEQ ID NO:677)または5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'(SEQ ID NO:678)。
【０１８５】
実施例４：生体内突然変異誘発
コリネバクテリウム−グルタミカムの生体内突然変異誘発が、E.coliまたは他の微生物(例えばBacillus spp.またはSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母）であってその遺伝子情報の完全性を保つための能力が減じられているものを通して、プラスミド（または他のベクター）の通過により行なうことができる。典型的なミューテーター株は、ＤＮＡ修復システム（例えばmutHLS,mutD,mutTその他；Rupp,W.D.(1996) DNA repair mechanisms,Escherichia coli and Salmonella,p2277-2294,ASM:Washington参照）の遺伝子に変異を持っている。このような株は当業者によく知られている。このような株の使用は、例えばGreener,A.およびCallahan,M.(1994) Strategies 7:32-34に記載されている。
【０１８６】
実施例５：Escherichia coli および コリネバクテリウム−グルタミカムの間のＤＮＡ転換
いくつかのコリネバクテリウムとブレビバクテリウム種は自律的に複製する(例えば、Martin, J.F.ら(1987) Biotechnology, 5:137-146参照）内因性プラスミド（例えばpHM1519またはpBL1)を含む。Escherichia coliとCorynebacuterium glutamicumのシャトルベクターは、E.coliの標準ベクター（Sambrook,J.et al.(1989),'Molecular Cloning:A Laboratory Manual',Cold Spring Harbor Laboratory PressまたはAusubel,F.M.et al.(1994)'Current Protocols in Molecular Biology', John Wiley and Sons)を用いて、これに、開始または複製のおよび適当なコリネバクテリウム−グルタミカム由来のマーカーを加えることで容易に構築することができる。このような複製の開始点は、好ましくはコリネバクテリウムとブレビバクテリウム種から単離された内因性プラスミドからもたらされる。これらの種の形質転換マーカーとして、カナマイシン耐性の遺伝子（Ｔｎ５またはＴｎ９０３トランスポゾンから誘導されたもの）またはクロラムフェニコール耐性遺伝子（Winnacker,E.L.(1987)'From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology,VCH,Weinheim)が特に用いられる。E.coli とC.glutamicumの双方でおいて複製するシャトルベクターの広範囲の構築の文献は数多く例があり、遺伝子過剰発現を含むいくつかの目的に使用することができる（例えば、Yoshihama,M.et al.(1985) J.Bacteriol. 162:591-597, Martin,J.F.et al.(1987) Biotechnology,5:137-146 およびEikmanns,B.J.et al.(1991) Gene, 102:93-98参照）。
【０１８７】
標準的な方法を用いて、上述のように注目の遺伝子をシャトルベクターの一つヘクローンすることが可能であり、またこのようなハイブリッドベクターをコリネバクテリウム−グルタミカム株に導入することが可能である。C.glutamicumの形質転換を、プロトプラスト形質転換（Kastsumata,R.et al.(1984) J.Bacteriol. 159306-311),エレクトロポレーション（Liebl,E.et al.(1989)FEMS Microbiol.Letters,53:399-303)そして特別のベクターが用いられた場合には、接合（例えば Schaefer,A et al.(1990)J.Bacteriol.172:1663-1666に記載）によって達成することができる。C.glutamicumからのプラスミドＤＮＡの製造（周知の標準的な方法を用いて）およびそのE.Coliへの形質転換によるC.glutamicumからE.coliへのシャトルベクターの転換も可能である。この形質転換の段階は、標準的な方法を用いて行なうことができるが、ＭＣＴ−不足E.coli株、例えばＮＭ５２２(Gough and Murray(1983)J.Mol.Biol.166:1-19)を使用することが有利である。
【０１８８】
遺伝子は、ｐＣＧ１（U.S.patent No.4617267)またはその断片、任意でＴＮ９０３（Grindley,N.D.and Joyce,C.M.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(12):7176-7180)からのカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを用いたC.glutamicum 株中に過剰発現させることができる。加えて、遺伝子は、プラスミドｐＳＬ１０９（Lee,H.S and A.J.Sinskey(1994) J.Microbiol Biotechnol.4:256-263)を用いてC.Glutamicum株中に過剰発現することができる。
【０１８９】
複製プラスミドに加えて、遺伝子の過剰発現は、ゲノムへの組み込みによって達成することができる。C.glutamicum または他のコリネバクテリウムまたはブレビバクテリウム種における遺伝子組み込みは、周知の方法、例えばゲノム領域での相同性組換え、制限エンドヌクレアーゼ仲介の組み込み（ＲＥＭＩ）（例えばDE patent 19823834)またはトランスポゾンの使用などによって達成することができる。調節領域（例えば、プロモーター、レプレッサー、および／またはエンハンサー）を配列の修飾、挿入、サイト−ダイレクテド法（例えば相同性組換え）による削除、またはランダムイベントに基づく方法（例えばトランスポゾン突然変異誘発またはＲＥＭＩ）により変形することにより、注目遺伝子の活性を変化させることもできる。転写ターミネーターとして機能する核酸配列は、本発明の一以上の遺伝子のコード領域へ３’挿入されることもできる。このようなターミネーターは、周知であり、例えばWinnacker, E.L. (1987)From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology. VCH: Weinheim中に記載されている。
【０１９０】
実施例６：変異タンパク質の発現の評価
形質転換された宿主細胞中の変異タンパク質の活性の観察は、変異タンパク質が、野生種のタンパク質と類似した形態と類似した量で発現されるという事実に基づいている。変異遺伝子（遺伝子産物に対する転写に用いられるｍＲＮＡの量のインジケーター）の転写のレベルを確認するために有用な方法は、ノーザン・ブロット法（Ausubel et al.(1988) Current Protocols in Molecular Bioloｇy, Wiley: New York参照)であり、注目遺伝子に結合するように設計されたプライマーが、検出タグ（通常放射性または化学ルミネセンス）により、生物の培養の総ＲＮＡを抽出し、ゲルに流し、安定マトリックスに移動させ、このプローブでインキュベートする場合に、プローブの結合および結合の量が、この遺伝子のｍＲＮＡの存在と量を示すようにラベルされている。この情報は、変異遺伝子の転写の程度の証拠である。全部の細胞のＲＮＡは、いくつかの周知の方法、例えば、 Bormann, E.R. et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:317-326に記載された方法により、コリネバクテリウム−グルタミカムから製造することができる。
【０１９１】
このｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の存在と比較量の評価のために、ウェスタン・ブロッド法などの標準的な技術が使用され得る(例えばAusubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York参照)。この方法では、全部の細胞のタンパク質は、抽出され、ゲル電気泳動により分離され、ニトロセルロースのようなマトリックスに移され、設計されたタンパク質に特異的に結合する抗体などのプローブとともにインキュベートされる。このプローブは、一般に容易に検出可能な化学ルミネセンスまたは比色のラベルでタグがつけられている。観察されたラベルの存在と量は、細胞中の所望の変異タンパク質の存在と量を示す。
【０１９２】
実施例７：遺伝子的に修飾されたCorynebacteriaの成長−媒体および培養条件
遺伝子的に修飾されたコリネバクテリウム−グルタミカムは、合成または天然成長媒体中で培養される。Corynebacteriaの異なった成長媒体の多くはどちらも知られており、容易に入手可能である(Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32:205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11:11-16; Patent DE 4,120,867; Liebl (1992)'The Genus Corynebacterium, in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Spring-Verlag)。これらの媒体は、一種以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび痕跡の要素からなる。好ましい炭素源は、モノ−、ジ−またはポリサッカライドなどの砂糖である。例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースが非常によい炭素源として働く。糖蜜または他の砂糖精製の副生成物のような複合化合物によって媒体に砂糖を供給することも可能である。異なった炭素源の混合物を供給することも有利である。他の可能な炭素源は、メタノール、エタノール、酢酸、乳酸などのアルコールおよび有機酸である。窒素源は通常有機または無機の窒素化合物か、またはこれらの化合物を含む材料である。窒素源として例えば、アンモニアガス、アンモニウム塩（例えばＮＨ4Ｃｌまたは（ＮＨ4）2ＳＯ4）、ＮＨ4ＯＨ、硝酸塩、尿素、アミノ酸、コーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母抽出物、肉抽出物などの複合窒素源が含まれる。
【０１９３】
媒体に含まれる無機塩化合物は、クロリド−、リン酸、硫酸のカルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、コバルト塩、モリブデン塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、銅塩、鉄塩を含む。金属イオンを溶液中に保持するために
媒体中にキレート化合物を加えることができる。特に有用なキレート化合物は、カテコールやプロトカテチュエートなどのジヒドロキシフェノールまたはクエン酸などの有機酸を含む。ビタミンなどの成長因子または成長促進剤、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩、ピリドキシンなどを含む媒体が典型的である。成長因子および塩はしばしば酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合媒体成分に由来する。正確な媒体化合物の組成は、直接の実験に強く依存し、各々の特定の場合に個々に決定される。媒体の最適化の情報は、テキストブックApplied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (eds. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp.53-73, ISBN 019 963577 3) から入手可能である。成長媒体を市販品、例えば標準1(Merck)またはBHI(grain heart infusion, DIFCO)などから選定することも可能である。
【０１９４】
すべての媒体成分は、熱（１．５×１０5Ｐａ、１２１℃で２０分間）またはろ過殺菌法のいずれかにより殺菌される。成分は、一緒に、または所望により分割して殺菌することができる。すべての媒体成分は、成長の初期に存在させるか、または任意に連続的にまたは回分式に加えることができる。
【０１９５】
培養条件は各々の実験のために分けて定義される。温度は、１５℃から４５℃の範囲であるべきである。温度を一定に保つか、実験中に変えることができる。媒体のｐＨは、５から８．５、好ましくは７．０前後の範囲であるべきであり、媒体に緩衝液を添加することで一定に保つことができる。この目的のための緩衝液の例は、リン酸カリウム緩衝液である。MOPS, HEPES, ACESその他の合成緩衝液を代わりに、または同時に使用することができる。成長の間にＮａＯＨまたはＮＨ4ＯＨを添加することより一定の培養ｐＨを保つことも可能である。酵母抽出物などの複合媒体成分が使用される場合、多くの複合成分は高い緩衝能力があるという事実によって、追加の緩衝液が必要ないかもしれない。微生物の培養に発酵槽を使用する場合、ｐＨはアンモニアガスにより制御することもできる。
【０１９６】
インキュベート時間は通常数時間から数日の範囲である。この時間は、ブロスの中に蓄積される生成物を最大にするように選択される。開示された成長実験は、種々の容器、例えばミクロタイター板、ガラス管、ガラスフラスコ、または種々のサイズのガラスまたは金属発酵槽等の中で行なうことができる。多数のクローンのスクリーニングのために、微生物をミクロタイター板、ガラス管、振とうフラスコ中、バッフル付きで、またはなしで培養すべきである。好ましくは１００ｍｌの振とうフラスコを使用し、所望の成長媒体の１０容積％で満たす。フラスコを１００から３００ｒｐｍの速さの範囲を使用して、ロータリーシェーカー（ふり幅２５ｍｍ）で振とうすべきである。蒸発ロスは湿潤雰囲気中に保つことによって少なくすることができる。代わりに、蒸発ロスの数学的補正が行なわれるべきである。
【０１９７】
遺伝子的に修飾されたクローンを試験した場合、修飾されていないコントロールのクローンまたはいかなる挿入もなされていない基本的なプラスミドを含むコントロールのクローンも試験するべきである。媒体を寒天平板上、例えばＣＭプレート（10g/lのグルコース、2.5g/lのNaCl、2g/lの尿素、10g/lのポリペプトン、5g/lの酵母抽出物、5g/lの肉抽出物、22g/lの寒天、2M NaOHによるｐＨ６．８としたもの）を３０℃でインキュベートしたもので成長させた細胞を用いて０．５−１．５のＯＤ600まで接種する。媒体の接種は、ＣＭプレートからのC.glutamicum細胞のサリーン懸濁液の導入、またはこのバクテリアの前培養液の添加のいずれかによりなされる。
【０１９８】
実施例８：変異タンパク質の機能のインビトロ解析
酵素の活性と速度論的パラメーターの決定は、先行技術でよく確立されている。得られた改変された酵素の活性決定のための実験は、当業者の能力の範囲内で、野生種酵素の比活性に対して行なわれなければならない。一般に酵素についての概要は、構造、速度論的、原理、方法、適用および多数の酵素の活性の決定例に関する特定の詳細と同様に、例えば以下の参照に見出される：Dixon, M., and Webb, E.C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism.  Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press:Oxford; Boyer, P.D., ed(1983) The Enzymes, 3rd ed. Academic Press: New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetic, 2nd ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325), Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Grassl, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3rd ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; and Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, 'Enzymes'. VCH: Weinheim, p. 352-363.。
【０１９９】
ＤＮＡと結合するタンパク質の活性は、数種のよく確立された方法、例えばＤＮＡバンド−シフトアッセイ（ゲル遅延アッセイとも呼ばれる）により測定することができる。他の分子の発現におけるこのようなタンパク質の効果は、レポーター遺伝子アッセイ（例えばKolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895-3904および引用文献に記載されたような） を用いて測定される。レポーター遺伝子試験系は、周知であり、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑蛍光性タンパク質およびその他数種の酵素を用いて、原核および真核細胞のどちらにでも適用が確立されている。
【０２００】
膜輸送タンパク質の活性の決定は、例えばGennis, R.B. (1989) 'Pores, Channels and Transporters', in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer; Heidelberg, p. 85-137; 199-234; and 270-322に記載されたような技術に従って行なわれる。
【０２０１】
実施例９：所望の製造物の製造における変異タンパク質の感化の解析
所望の化合物（例えばアミノ酸）の製造におけるC.Glutamicumの遺伝子修飾の効果は、適当な条件（例えば上述の）下の改変された微生物成長および媒体及び／または細胞成分の増加した所望の製造物（即ちアミノ酸）の生成の解析によって評価することができる。このような解析法は当業者に周知であり分光法、薄層クロマトグラフィー、種々の染色法、酵素的および微生物学的方法、高速液体クロマトグラフィーのような解析クロマトグラフィー（例えばUllman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 89-90 and p. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A. et al., (1987) 'Applications of HPLC in Biochemistry 'in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, vol. 3, Chapter III: 'Product recovery and purification', page 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D.(1988) Biochemical separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, page 1-27, VCH: Weinheim; and Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications参照)を含む。
【０２０２】
最終発酵生成物の測定に加えて、所望の化合物の生産に使用された代謝経路の他の成分、例えば中間体、副産物を、化合物の製造の効率を決定するために解析することもできる。解析法は、媒体中の栄養剤（例えば砂糖、炭化水素、窒素源、ホスファートおよび他のイオン）のレベルの測定、バイオマス組成物と成長の測定、通常の生合成経路の代謝物の製造の解析、発酵の間に生成したガスの測定を含む。これらの測定のための標準的な方法は、Applied Micro Physiology, A Practical Approach, P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, eds., IRL Press, p. 103-129; 131-163; and 165-192 (ISBN: 0199635773) および引用文献に概説してある。
【０２０３】
実施例１０：C.glutamicum培養からの所望の製造物の精製
C.glutamicum細胞からまたは上述の培養物の上澄みからの所望の製造物の回収は、周知の種々の方法により行なうことができる。所望の製造物が細胞から隠されていない場合、細胞を培養物から低速遠心分離により回収することができ、細胞を機械的力または超音波のような標準的な方法で溶解することができる。細胞の破片を遠心分離で取り除き、可溶性タンパク質を含む上澄み画分を所望の化合物のさらなる精製のために保持する。製造物がC.glutamicum細胞から隠されている場合、細胞を培養物から低速遠心分離により取り除き、上澄み画分をさらなる精製のために保持する。
【０２０４】
双方の精製法からの上澄み画分を、適当なレジンであって、所望の分子がクロマトグラフィーレジンに保持され、サンプル中の多くの不純物が保持されないか、または不純物がレジンにより保持され、サンプルが保持されないようなレジンを用いたクロマトグラフィーで処理する。このようなクロマトグラフィーの工程は、必要に応じて、同じまたは異なるクロマトグラフィーレジンを用いて繰り返すことができる。当業者は、適当なクロマトグラフィーレジンの選択と、精製される特別の分子への最も効率的な適用に精通しているであろう。精製された製造物はろ過または限外ろ過により濃縮し、製造物の安定性が最も大きくなる温度で保存することができる。
【０２０５】
広い範囲の精製法が周知であり、前述した精製法は範囲の減縮を意味しない。このような精製法が、例えば Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986)に記載されている。
【０２０６】
単離した化合物の同定と純度が、先行技術で標準的な方法で評価される。これらは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、分光学的方法、染色法、薄層クロマトグラフィー、ＮＩＲＳ、酵素的または微生物学的アッセイを含む。このような解析方法は、Petek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al.(1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; and Schmidt et al. (1988) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p.540-547, p. 559-566, 575-581 and p. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17に記載されている。
【０２０７】
実施例１１：本発明の遺伝子配列の解析
配列の比較と、２個の配列の間の相同性の百分率の決定は、公知の技術であり、数学的アルゴリズム、例えばKarlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 2264-68のアルゴリズムで、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77に記載のように変形されたものなどを使用して行なうことができる。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２によって、本発明のＭＣＴ核酸分子に対するヌクレオチド配列の相同性を得るために行なうことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３によって、本発明のＭＣＴタンパク質分子に対するアミノ酸配列の相同性を得るために行なうことができる。比較の目的で、間隙のあけられたアライメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴをAltschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のように使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムの使用に際して、当業者はプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のパラメーターの、解析される特定の配列のための最適化の方法についてよく知っている。
【０２０８】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの他の例は、Meyers とMiller （(1988) Comput. Appln. Biosci. 4: 11-17）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧシーケンスアライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。ＡＬＩＧＮプログラムをアミノ酸配列の比較のために使用する場合、ＰＡＭ１２０重量残渣表、１２のギャップ長さペナルティー、４のギャップペナルティーを使用することができる。さらに配列解析に使用されるアルゴリズムが公知であり、ＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ（Torelli and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:3-5に記載）および FASTA（ Pearson and Lipman (1988) P.N.A.S. 85:2444-8に記載）を含む。
【０２０９】
２本のアミノ酸配列の間の相同性の百分率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（http:  //www.gcg.comで入手可能）を用い、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１２、１０、８、６、または４の間隙重さ、２、３または４の長さ重さを用いて行なうことができる。２本の核酸配列の間の相同性の百分率は、標準的なパラメーター、例えば間隙重さが５０、および長さ重さが３などを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。
【０２１０】
本発明の遺伝子配列と、遺伝子バンクに存在する配列の比較解析が先行技術において公知の技術を用いて行なわれた（例えばBexevanis and Ouellette, eds. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. John Wiley and Sons: New York参照)。本発明の遺伝子配列が、遺伝子バンクに存在する遺伝子と、３段階の工程で比較された。第一段階で、遺伝子バンクに存在するヌクレオチド配列に対する本発明の配列の各々について、ＢＬＡＳＴＮ解析（例えばローカルアライメント解析）が行なわれた。最初にヒットした５００個についてさらに解析が続けられた。次いでＦＡＳＴＡ探索（例えば、結合されたローカルおよびグローバルアライメント解析で、配列の限定された領域を整列させる）が、これらの５００個について行われた。各々の本発明の遺伝子配列は次いで全体的に、ＦＡＳＴＡの頭の３個のヒットの各々について、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて（標準的なパラメーターを使用して）整列させられる。正しい結果を得るために、遺伝子バンクから抽出された配列の長さは、周知の方法により質問の配列の長さに調整された。この解析の結果は、表４にまとめられている。得られた結果は、遺伝子バンクの参照の各々と比較した本発明の遺伝子の各々においてＧＡＰ（グローバル）解析を単独で行なったときに得られるであろう結果と一致したが、このようなデータベースを広げて行なったＧＡＰ（グローバル）解析と比較して明らかに計算時間が短縮された。切り捨て値を上回るアライメントが得られなかった本発明の配列を、アライメントの情報なく表４に示した。表４に、’％相同性（ＧＡＰ）’の見出しで記載されたＧＡＰアライメント相同性百分率は、’，’は小数点を表すヨーロッパの数の形式で、並べられているということは、当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、このカラム中の’４０，３４５’の値は、４０．３４５％を表す。
【０２１１】
実施例１２：ＤＮＡマイクロアレイの構築と操作
本発明の配列を追加で、ＤＮＡマイクロアレイ（デザイン、方法論、ＤＮＡアレイの使用は周知であり、例えばSchena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470; Wodicka, L. et al. (1997) Nature Biotechnology 15:1359-1367; DeSaizieu, A. et al. (1998) Nature Biotechnology 16: 45-48; and DeRisi, J.L. et al. (1997) Science 278: 680-686に記載されている。)の構築と適用に使用することができる。
【０２１２】
ＤＮＡマイクロアレイは、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、シリコーンまたは他の材料からなる固体または柔軟性のある支持体である。核酸分子を、注文された方法で表面に取り付けることができる。適当なラベリングのあと、他の核酸または核酸混合物を固定された核酸分子にハイブリダイズすることができ、限定された領域でハイブリダイズされた分子の個々の信号強度を検知し、測定するためにラベルを使用することができる。この方法論は、適用された核酸サンプルまたは混合物中のすべてあるいは選択された核酸の相対量または絶対量を同時に定量化することを可能にする。このためＤＮＡマイクロアレイは、並行して多数の（６８００以上）核酸の発現を解析することを可能とする（Schena, M. (1996) BioEssays 18(5): 427-431参照）。
【０２１３】
本発明の配列は、ポリメラーゼ連鎖反応のような核酸増幅反応によって、１種以上のC.glutamicum遺伝子の限定された領域を増幅することができるオリゴヌクレオチドプライマーの設計に使用することができる。５’または３’オリゴヌクレオチドプライマーあるいは適当なリンカーの選択と設計は、上述の支持媒体（例えばSchena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470にも記載されている。）の表面に対する、得られたＰＣＲ産物の共有結合を可能とする。
【０２１４】
核酸マイクロアレイは、Wodicka,L.et al.(1997) Nature Biotechnology 15:1359-1367に記載されたようにその場のオリゴヌクレオチド合成によっても構築することができる。写真平板法により、マトリックスの正確に限定された領域が露光される。光不安定な保護基はこれによって活性化され、ヌクレオチド付加が進行し、一方光からマスクされた領域はいかなる修飾も進行しない。続く保護と光活性化のサイクルは、限定された位置における異なったオリゴヌクレオチドの合成を可能とする。小さい、限定された本発明の遺伝子の領域は、マイクロアレイ上で、固相オリゴヌクレオチド合成により合成することができる。
【０２１５】
ヌクレオチドのサンプルまたは混合物の中に存在する本発明の核酸分子は、マイクロアレイに対してハイブリダイズすることができる。これらの核酸分子は標準的な方法でラベルすることができる。要するに、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子）は、例えば、逆転写またはＤＮＡ合成の間、放射性同位元素によりまたは蛍光によりラベルされたヌクレオチドの組み込みによりラベルされる。ラベルされた核酸のマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションは、例えば Schena, M. et al. (1995) supra; Wodicka, L. et al. (1997), supra; and DeSaizieu A. et al (1998), supraに記載されている。ハイブリダイズされた分子の検出と定量化は、特定の組み込まれたラベルにより行なわれる。放射性のラベルは例えばSchena, M. et al. (1995) supraに記載されたように検出することができ、蛍光ラベルは例えばShalon et al. (1996) Genome Research 6: 639-645の方法により検出することができる。
【０２１６】
本発明の配列のＤＮＡマイクロアレイ技術に対する適用は、上述したように、C.glutamicumまたは他のCorynebacteriaの異なった株の比較解析を可能とする。例えば、個々の転写の特徴に基づく内部株の変種の研究および特定するために重要な遺伝子の同定および／または所望の株の特性、例えば病原性、生産性、およびストレス寛容などの同定は、核酸アレイ方法論により促進される。発酵反応の進行の間の、本発明の遺伝子の発現の特徴の比較は、核酸アレイ技術を用いることで可能である。
実施例１３：細胞タンパク質ポピュレーションの動力学的解析（プロテオミクス）
本発明の遺伝子、組成、方法は、タンパク質のポピュレーションの相互作用および動力学（プロテオミクスと定義する）の研究に適用することができる。注目のタンパク質ポピュレーションは、C.glutamicum(例えば他の生物のタンパク質ポピュレーションと比較して）、特定の環境または代謝条件下（例えば高いまたは低い温度で、または高いまたは低いｐＨでの発酵の間）で活性なタンパク質または特定の成長および発達の相の間に活性なタンパク質の総タンパク質ポピュレーションを含むが、これに限定されない。
【０２１７】
タンパク質ポピュレーションは、種々の周知の技術、例えばゲル電気泳動などにより解析することができる。細胞タンパク質は、例えば細胞溶解または抽出により得られ、種々の電気泳動技術を用いて互いに分離することができる。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、タンパク質をその分子量に基づいて大部分分離する。等電点のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＩＥＦ−ＰＡＧＥ）は、タンパク質をその等電点（アミノ酸配列を反映するのみならずタンパク質の後翻訳修飾も反映する）により分離する。他の、さらに好ましいタンパク質解析の方法は、２−Ｄ−ゲル電気泳動（例えばHermann et al. (1998) Electrophoresis 19: 3217-3221; Fountoulakis et al. (1998) Electrophoresis 19: 1193-1202; Langen et al. (1997) Electrophoresis 18: 1184-1192; Antelmann et al. (1997) Electrophoresis 18: 1451-1463に記載されている)として知られるＩＥＦ−ＰＡＧＥとＳＤＳ−ＰＡＧＥの連続する組み合わせである。他の分離技術、例えばキャピラリーゲル電気泳動などもタンパク質の分離に利用することができ、このような技術は、周知である。
【０２１８】
これらの方法論により分離されたタンパク質は、標準的な技術、例えば染色またはラベリングにより可視化することができる。適当な染色は公知であり、Coomassie ブリリアントブルー、銀染色、蛍光染料、例えばＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含む。C.glutamicumの媒体中にある、放射性物質によりラベルされたアミノ酸またはその他のタンパク質前駆体（例えば35Ｓ−メチオニン、35Ｓ−システイン、14Ｃ−ラベルされたアミノ酸、15Ｎ−アミノ酸、15ＮＯ3または15ＮＨ4+またはＣ13ラベルされたアミノ酸）の含有物は、分離に先立ってこれらの細胞からタンパク質をラベルすることを可能とする。同様に、蛍光ラベルを使用することができる。これらのラベルされたタンパク質は、抽出され、単離され、前述した技術に従って分離される。
【０２１９】
これらの技術により可視化されたタンパク質はさらに、使用された染料またはラベルの量を測定することにより解析することができる。得られたタンパク質の量は、定量的に、例えば光学的方法を用いて決定することができ、同様のゲルまたは他のゲル中の他のタンパク質の量と比較することができる。ゲル上のタンパク質の比較は、例えば光学的比較、分光学的、ゲルのイメージスキャンおよび解析、または写真フィルムおよびスクリーンの使用を通じて行なうことができる。このような技術は周知である。
【０２２０】
得られたタンパク質を同定するために、直接シーケンスまたは他の標準的な技術を使用することができる。例えば、Ｎ−および／またはＣ末端アミノ酸シーケンス（例えばエドマン分解）を、マススペクトロメトリー（特にＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ技術（例えばLangen et al. (1997) Electrophoresis 18: 1184-1192参照））として使用することができる。ここで提供されたタンパク質配列を、これらの技術によりC.glutamicumタンパク質の同定のために使用することができる。
【０２２１】
これらの方法により得られた情報は、タンパク質の存在、活性、種々の生物学的条件（例えば、異なった生物、発酵の時点、媒体条件、または異なったビオトープ、その他）からの異なったサンプルの間の修飾の様式の比較に使用することができる。このような実験から単独で、または他の技術との組み合わせにより得られたデータは、様々な適用、例えば与えられた（例えば代謝的）状況にある種々の生物の挙動の比較、ファインケミカルを産出する株の生産性の上昇、またはファインケミカルの製造の効率の上昇などに使用することができる。
【０２２２】
同等物
当業者は、わずかの型にはまった実験を用いて、ここに記載された発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識するか、確認することができるであろう。このような同等物は、請求の範囲に含まれる。
【配列表】
2006271389000001.app