(57)【要約】【課題】  遺伝子を担持した担体を、パーティクルガンによって標的細胞に発射して、標的細胞のオルガネラＤＮＡに効率良く遺伝子を導入する方法を提供すること。【解決手段】  遺伝子を担持した担体をパーティクルガンによって標的細胞に発射して、該標的細胞のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法であって、前記担体が、平均粒径が異なる２種類以上の微粒子の混合物であることを特徴とするオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子を担持した担体をパーティクルガンによって標的細胞に発射して、該標的細胞のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法であって、
前記担体が、平均粒径が異なる２種類以上の微粒子の混合物であることを特徴とするオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法。
【請求項２】
前記担体に担持された遺伝子が、標的細胞中のオルガネラＤＮＡと相同配列を有することを特徴とする請求項１に記載のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法。
【請求項３】
前記担体に担持された遺伝子が、ベクターに組込まれていることを特徴とする請求項１又は２に記載のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法。
【請求項４】
前記担体に担持された遺伝子が、環状であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法。
【請求項５】
前記標的細胞中のオルガネラＤＮＡが欠損していることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法。
【請求項６】
前記標的細胞が、酵母又はクラミドモナス属（Chlamydomonas）に属する緑藻であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法。
【請求項７】
前記オルガネラが、葉緑体又はミトコンドリアであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオルガネラＤＮＡへの遺伝子の導入方法に関する。より詳しくは、遺伝子を担持した担体を、パーティクルガンによって標的細胞に発射して、標的細胞のオルガネラＤＮＡに効率良く遺伝子を導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアや葉緑体などのオルガネラは真核生物の細胞内に存在する。二重膜で厳重に隔離された構造を持ち、独自のＤＮＡゲノムを有している。
【０００３】
ミトコンドリアは、ほとんどすべての真核細胞の細胞質中に存在するオルガネラであり、呼吸の電子伝達系に関与している。ミトコンドリアの形態は様々であり、高等植物や動物では球型や円柱型が一般的である。ミトコンドリアは、内膜と外膜とからなる２枚のリン脂質二重膜に囲まれている。
葉緑体は光合成細菌とラン藻以外の光合成を行う全ての生物に存在するオルガネラであり、光合成の電子伝達系に関与している。葉緑体の形態は直径３〜１０μｍ程度の両凸レンズのような形態であり、二重の外膜に囲まれている。
【０００４】
ミトコンドリアや葉緑体などのオルガネラは、独自の環状ＤＮＡゲノムを有しており、オルガネラ内に存在する独自の転写系、翻訳系により、オルガネラＤＮＡにコードされる遺伝情報が発現する。また、オルガネラＤＮＡは独自のＤＮＡ合成系によって複製され自己増殖することが可能であり、このオルガネラの自己増殖によって、オルガネラは細胞分裂により希釈又は消失することなく、一定のオルガネラ数が維持される。
【０００５】
ミトコンドリアや葉緑体などのオルガネラに存在するＤＮＡに外来遺伝子を導入することが、従来、試みられており、例えば、酵母のミトコンドリアゲノムを形質転換する方法（非特許文献１参照）や、クラミドモナスのミトコンドリアを形質転換する方法（非特許文献２及び３参照）が提案されている。
【０００６】
【非特許文献１】Johnston SA, “Mitochondrial transformation in yeast by bombardment with microprojectiles.”, Science, 1989, 240, 1538-1541
【非特許文献２】Boynton JE, “Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles.” Science, 1988, 240, 1534-1535
【非特許文献３】Randolph-Anderson BL, “Further characterization of the respiratory deficient dum-1 mutation of Chlamydomonas reinhardtii and its use as a recipient for mitochondrial transformation.”, Mol. Gen. Genet., 1993, 236, 235-244
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
オルガネラは強固な二重膜を有するために、核膜に孔を有する核の場合と比較してオルガネラＤＮＡを形質転換することは困難である。
上述した非特許文献１〜３に記載の形質転換方法において、オルガネラＤＮＡの形質転換の可能性が示されているものの、形質転換効率は低く、実用的な方法とはいえなかった。
【０００８】
本発明は、強固な二重膜を有するオルガネラに存在するＤＮＡに効率良く遺伝子を導入する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は上記課題を解決するためになされた発明であって、請求項１に係る発明は、遺伝子を担持した担体をパーティクルガンによって標的細胞に発射して、該標的細胞のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法であって、前記担体が、平均粒径が異なる２種類以上の微粒子の混合物であることを特徴とするオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法に関する。
請求項２に係る発明は、前記担体に担持された遺伝子が、標的細胞中のオルガネラＤＮＡと相同配列を有することを特徴とする請求項１に記載のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法に関する。
請求項３に係る発明は、前記担体に担持された遺伝子が、ベクターに組込まれていることを特徴とする請求項１又は２に記載のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法に関する。
請求項４に係る発明は、前記担体に担持された遺伝子が、環状であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法に関する。
請求項５に係る発明は、前記標的細胞中のオルガネラＤＮＡが欠損していることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法に関する。
請求項６に係る発明は、前記標的細胞が、酵母又はクラミドモナス属（Chlamydomonas）に属する緑藻であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法に関する。
請求項７に係る発明は、前記オルガネラが、葉緑体又はミトコンドリアであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ミトコンドリアや葉緑体などに存在するオルガネラＤＮＡに効率良く遺伝子を導入することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明に係るオルガネラＤＮＡへの遺伝子導入方法（以下、単に遺伝子導入方法という場合がある。）について詳細に説明する。
本発明に係る遺伝子導入方法は、パーティクルガンを使用してオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入する方法である。
パーティクルガンによる遺伝子導入方法では、オルガネラＤＮＡに導入する遺伝子を担持させた担体を、パーティクルガンによって標的細胞に直接撃ち込み、撃ち込まれた微粒子が標的細胞を通過途中に担持ＤＮＡを細胞内に放出することによって、標的細胞に遺伝子を導入することができる。
【００１２】
担体は、通常のパーティクルガンで使用されている担体を用いることができ、具体的には、金粒子又はタングステン粒子などを例示することができ、特に本発明では金粒子を使用することが好ましい。
また、担体の形態は特に限定されないが、略球状であることが好ましい。
【００１３】
本発明では、担体としては平均粒径が異なる２種類以上の微粒子の混合物が用いられる。担体として平均粒径が異なる２種類以上の微粒子の混合物を使用することによって、オルガネラＤＮＡへの遺伝子の導入効率を向上させることができる。
平均粒径が異なる二種類以上の微粒子のそれぞれの平均粒径や配合比率は特に限定されず、標的細胞の大きさや標的細胞のオルガネラの大きさに応じて適宜任意に設定される。
例えば、１〜３μｍ程度の大きさのオルガネラに存在するＤＮＡに遺伝子を導入する場合、担体としては、平均粒径が４００〜６００ｎｍの微粒子と、平均粒径が５０〜１００ｎｍの微粒子の混合物を用いることが好ましい。また配合比率も特に限定されず、４００〜６００ｎｍの微粒子と、平均粒径が５０〜１００ｎｍの微粒子とを、粒子の個数比で、１：１０〜３０００の比率で、好ましくは１：１００〜５００の比率で混合する。
【００１４】
担体はオルガネラに導入される遺伝子を担持している。具体的には、担体の表面にオルガネラに導入される遺伝子がコーティングされている。
担体の表面に遺伝子を付着させる方法は、通常のパーティクルガン法において担体の表面に遺伝子をコーティングする方法が採用される。
例えば、遺伝子は酸性であることから、スペルミジン、スペルミン又はポリリジン等の塩基性の物質とともに担体表面に遺伝子をコーティングする方法を例示することができる。担体表面に前述の塩基性物質をコーティングするには、担体と前述の塩基性物質とを接触させればよい。
【００１５】
担体の表面に担持される遺伝子は、オルガネラＤＮＡに導入して標的細胞（標的生物）を形質転換するための標的細胞由来の遺伝子や、標的細胞以外の生物由来の外来遺伝子を有するが、さらに、オルガネラＤＮＡと相同配列を含有することが好ましい。担体の表面に担持される遺伝子がオルガネラＤＮＡと相同配列を含有することで、オルガネラＤＮＡと担体に担持された遺伝子との間で、相同組換えが起こり、担体に担持された所要の遺伝子をオルガネラＤＮＡに導入することができる。
担体に担持される遺伝子が、オルガネラＤＮＡと相同配列を有する場合、その大きさは特に限定されないが、最低３０〜５０塩基対、好ましくは２００〜１０００塩基対の長さであることが好ましい。
【００１６】
担体の表面に担持される遺伝子は、ベクターに組み込まれていても構わない。用いられるベクターは特に限定されず、pBR322、pUC118、pUC119、pBluescript II KS、pBluescript II SK、pGEM(R)-13Zf(＋)などのプラスミドベクターを例示することができる。
【００１７】
本発明では、担体に担持される遺伝子の形態は直鎖状又は環状のいずれの形態でも構わないが、環状であることが好ましい。担体に担持される遺伝子の形態が環状であることで、直鎖状である場合に比べて、より高い効率でオルガネラＤＮＡに遺伝子を導入することができる。
【００１８】
遺伝子を担持した担体が撃ち込まれる標的細胞は、葉緑体やミトコンドリアなどのオルガネラを有する生物であればよく、動物、植物、藻類、菌類などを例示することができ、好ましくは、酵母やクラミドモナス属（Chlamydomonas）に属する生物を例示することができる。
【００１９】
酵母は単細胞性の微生物であり、その多くは菌界（菌類）の子嚢菌門に属している。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などを例示することができる。
クラミドモナス属に属する生物は、緑藻網、オオヒゲマワリ目に属する淡水産の単細胞の緑藻である。体長は６〜１０μｍであり、１個の核、１個の葉緑体、３〜１００個のミトコンドリア、眼点、収縮胞、ピレノイドと２本の等長の鞭毛を有する。細胞生物学、植物生理学、遺伝学、分子生物学などの研究の材料として利用されている。
クラミドモナスは、Chlamydomonas angulosa、Chlamydomonas moewusii、Chlamydomonas reinhardtiiなどを例示することができ、Chlamydomonas reinhardtiiを使用することが好ましい。
【００２０】
本発明ではオルガネラＤＮＡに遺伝子が導入されるが、遺伝子が導入されるオルガネラとしては、ミトコンドリアや葉緑体を例示することができる。
また、本発明ではオルガネラＤＮＡに遺伝子が導入されるが、特にミトコンドリアＤＮＡに遺伝子を導入する場合、ミトコンドリアＤＮＡの左末端が欠損していることが好ましい。ミトコンドリアＤＮＡの左末端が欠損していることによって、遺伝子導入効率を高めることができる。
ミトコンドリアＤＮＡの左末端が欠損している変異株としては、C. reinhardtii mt- dum-14、C. reinhardtii mt- dum-15、C. reinhardtii mt- dum-16などを例示することができ、これらの変異株を使用した場合、遺伝子導入効率を高めることができる。
【００２１】
本発明では、遺伝子を担持した担体がパーティクルガンによって、標的細胞に撃ち込まれる。標的細胞に担体を撃ち込む際の圧力は特に限定されないが、９００〜１４００psi程度に設定することが好ましく、１０００〜１２００psi程度に設定することがより好ましい。
【００２２】
以下、実施例を示して本発明について詳細に説明するが、本発明は以下の実施例より何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
［クラミドモナス］
本実施例では、以下のクラミドモナスを使用した。
Chlamydomonas reinhardtii mt- dum-1 CC-2255のサブクローンであるC. reinhardtii mt- CC-2654は、Chlamydomonas Genetic Center（c/o Dr. Elizabeth Harris, Department of Botany, Duke University, Durham, NC 27706, USA）から入手した。
C. reinhardtii mt-の呼吸能欠損株である、dum-14、dum-15、dum-16及びdum-19は、R.F.Matagne博士（University of Liege, Belgium）から分与された。
図１に、各呼吸能欠損株の呼吸能欠損に関連する突然変異の部位を示した。
【００２４】
［培養条件］
上記呼吸能欠損株を、明所、２５℃の温度条件下で、TAP（Tris-Acetate-Phosphate）培地で振とう培養した。
対数増殖期に達した約7mlの培地（2〜5×106細胞／ml）を濾過によって回収し、細菌混入の防止のためにアンピシリン50μg／mlを加えたTAP寒天培地（寒天1％含有）に移植した。
【００２５】
［パーティクルガン］
ミトコンドリア及び葉緑体の形質転換には、PDS-1000/He パーティクル・デリバリー・システム（Bio-Rad社製）を使用し、Smith FD, “Biolistic transformation of prokaryotes: factors that affect biolistic transformation of very small cells.” J. Gen. Microbiol, 1992, 138, 239-248及びBio-Rad technical bulletin 1688に記載の方法に従った。
【００２６】
［形質転換方法］
担体として、40nmの金粒子（G-40、E-Yラボラトリーズ社製）、100nmの金粒子（EM.GC 100、ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル社製）、200nmの金粒子（EM.GC 200、ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル社製）、600nmの金粒子（Bio-Rad社、カタログNo.♯165−2262）、及び100nmと600nmの金粒子の混合物を使用した。
100nmと600nmの金粒子の混合物は、3mgの600nm金粒子と、100nmの金粒子の沈殿物（1mlのコロイド状懸濁液から調製）とを、50μlの50％グリセロールで懸濁することにより調製した。
金粒子の懸濁液に、5μlのドナーＤＮＡ（１μｇ／μｌ）と、50mlの2.5M ＣａＣｌ２と、20mlの0.1Mのスペルミジン溶液とを加えて、金粒子の表面にDNAを担持させた。
25mmHgに減圧されたパーテュクルガン内で、DNAを担持させた金粒子を、1100psi（１psi＝6895kPa）に加圧されたヘリウムガスを使用して、プレートに発射した。
発射した後、2時間の明条件、22時間の暗条件下、25℃で4週間、TAP１％寒天プレート内で培養して、呼吸能が回復した形質転換体の成長を促進した。呼吸能回復株のコロニーを分離して、２５℃で５日間の明条件で、5mlのＴＡＰ液体培地で振とう培養して呼吸能回復株を選抜した。
【００２７】
［ミトコンドリアゲノムの分析］
DNeasy plant mini-DNA extraction kit（QIAGEN社製）を使用して、全DNAを抽出して、ミトコンドリアのゲノム構造の解析にはPCRを使用した。
【００２８】
［ＤＮＡ構成物］
(1) 5.0kbのDNA構成物
この構成物は３つのPCR断片から構成される。これらの全ては、野生株C.reinhardtii（CC-277,cw-15 mt+）の全DNAから増幅した。
第一の要素は、C.reinhardtiiのミトコンドリアゲノムの1〜1780塩基対に相当する。これは、左逆位反復配列、cob遺伝子、C-末端６７塩基対のNADH−シトクロームｃ還元酵素サブユニット4(nd4)遺伝子（以下、C(nd4)という。）を含む。
第二要素は、C.reinhardtiiのミトコンドリアゲノムの4780〜6620塩基対に相当する。これは、nd5遺伝子のＮ末端180塩基対（以下、N(nd5)という。）、プロモーター及びcox1遺伝子の全体を保有している。
最後の要素は、C.reinhardtiiのミトコンドリアゲノムの14400〜15758塩基対に相当する。これは、染色体の右逆位反復配列を含む。
これらの要素は、一つの連続的なＤＮＡフラグメント（全体で約5.0kb）とされている。この遺伝子構成は、図２ａに示すように、左端−cob−C(nd4）−N(nd5)−プロモーター−cox1−右端であり、Escherichia coli pT7Blue-2 T−ベクターのEco RVサイトに結合させた。以下、このプラスミドをp5.0kbとする。
【００２９】
(2) 3.8kbのＤＮＡ構成物
この構成物は、5.0kbの構成物の第一と第三の要素を有する。第二の要素は、1.2kbより短く、C.reinhardtiiのミトコンドリアゲノムの4780〜5400塩基対（図１及び図２ｂ参照）を含む。nd5遺伝子のＮ末端領域と、cox1遺伝子（以下、N(cox1)という。）のＮ末端３５８塩基対を含む。これらの要素は、左末端−cob−C(nd4)−N(nd5)−プロモーター−N(coxl)−N(cox1)−右端（図２ｂ参照）のように構成されており、pT7Blue-2 T−ベクターのEcoRVサイトに結合させた。以下、このプラスミドをp3.8kbとする。
【００３０】
(3) 1.8kbのＤＮＡ構成物
この構成物はC.reinhardtiiのミトコンドリアゲノムの1〜1780塩基対を含む。つまり、図２ｃに示すように、5.0kbの構成物の第一の要素と同様である。この構成物はpT7Blue-2 T−ベクターのEcoRVサイトに結合させた。以下、このプラスミドをp1.8kbとする。
【００３１】
［結果］
(1) 呼吸能欠損株の形質転換
担体として100nmと600nmの金粒子の混合物を用い、C.reinhardtiiの５つの呼吸能欠損株（dum-1,-14,-15,-16,-19）の形質転換を行った。
その結果、ミトコンドリアゲノムの左末端に大きな欠損が存在するdum-1,-14,-16の株では、5.0kbのDNA構成物を含むプラスミドによって形質転換された（dum-1のデータを表１に示す。ミトコンドリアの形質転換の頻度の著しい差異は、dum-1,-14,-16の株の間では見られなかった。）。暗所における２〜４週間のインキュベーションの後に、コロニーが現れた。
【００３２】
一方、同様の方法でdum-15（cob遺伝子に２箇所の変異）及びdum-19（cox1遺伝子に１塩基の欠失）の形質転換を20回繰り返し試みたが、これらの変異株の欠損を補うための野生型のcob及びcox1遺伝子を含む環状のp5.0kbでは形質転換されなかった。
対照的に、スペクチノマイシン抵抗性を与える細菌性アミノグリコシド−３''−アデニン転位酵素（aadA）遺伝子を含むプラスミドであるpEX-50-AADを使用した葉緑体の形質転換では、C.reinhardtiiの５つの呼吸能欠損株（dum-1,-14,-15,-16,-19）全てで繰り返し成功した。葉緑体の形質転換の頻度は、プレート当たり300〜500コロニー（1〜4×10−5／cell）と、各株の間で略同様であった（表２参照）。
【００３３】
形質転換された株（dum-1,-14,-16）は、左末端からcob遺伝子の近隣までの任意の箇所の範囲のミトコンドリアゲノムが欠損していた。他方、形質転換されなかった株では、ゲノムにこの欠損は存在しなかった。従って、左末端における大きな欠損がミトコンドリアが形質転換能力を有するかどうかを決定すると考えられる。
【００３４】
(2) ミトコンドリアゲノムの解析
呼吸能が現れた形質転換体のミトコンドリアゲノムを解析した。
解析方法は、まず、環状p5.0kbによる形質転換体から14検体を選択し、全ＤＮＡを単離して、PCRで分析した。
全ての検体から5.5kbのPCR断片が得られた。配列決定をしたところ、図３ａに示すような野生型のミトコンドリアゲノムと同一の遺伝子構造を有していた。つまり、形質転換前には存在していなかったcob遺伝子領域を有していた。
また、環状p5.0kbによる形質転換体から選択した14検体のうちの5検体から、図３ｂに示す4.0kbの非野生型のPCR断片が確認された。さらに、2検体からは、図３ｃに示す非野生型のPCR断片も確認された。
【００３５】
上記と同様の方法で、環状p3.8kbによる形質転換体のミトコンドリアゲノムを解析したところ、解析した8検体全てから、野生型特有の遺伝子構成である「cob-nd4-nd5-cox1」を確認することができた。
さらに、8検体全てから、非野生型の遺伝子構成である「cob-C(nd4)/N(nd5)-cox1」を、4検体から図３ｄに示す「cob-C(nd4)/N(nd5)-N(cox1）」を検出した。
【００３６】
(3) ＤＮＡ構成物の形態による形質転換率
環状p5.0kbを使用したdum-1株の形質転換率は1.0〜10×10-7個／cellであり、高い形質転換率であった。
一方、環状p3.8kb及び環状p1.8kbを使用した場合の形質転換率は、それぞれ環状p5.0kbを使用した場合の50％及び5〜20％であった（表１参照）。dum-1株のミトコンドリアゲノムが左末端とcob遺伝子を欠損しているとすると、環状p5.0kbと、dum-1株のミトコンドリアゲノムとの間の相同性領域は、3288bpであり、環状p3.8kbの構成物と比較すると、2068bpであり、環状p1.8kbと比較すると90塩基対である。環状p5.0kbと環状p3.8kbの形質転換率の比は、表１に示されるように約２：１であり、これは、２つの構成物間の相同性領域の長さの比（3288bp：2068bp）と略一致する結果となった。
【００３７】
また、環状p5.0kbを制限酵素NotI及びBamHIで処理することによって直鎖状とした構成物を用いて、dum-1株の形質転換を行った。表１に示すように、環状p5.0kbの形質転換率は、直鎖p5.0kbの形質転換率の約４〜６倍であった。
【００３８】
また、cob遺伝子及びnd4遺伝子を含み、左末端を含まない、180〜3100塩基対に対応するPCR断片を使用してdum-1株の形質転換を行った。その結果、表２に示すように、形質転換に成功した。
【００３９】
(4) 金粒子の粒子径による形質転換率
クラミドモナスの葉緑体の形質転換では、600nmの金粒子を使用すると、高い形質転換効率を示すことが知られている。しかしながら、ミトコンドリアゲノムの形態を考慮すると、600nmの粒径は明らかに大きいと考えられるので、40nm、100nm、200nmの金粒子を使用して試験を行った。
pEX-50-AADを使用してdum-1株の葉緑体の形質転換を行う際に、40nm及び100nmの金粒子を使用した場合、形質転換体は確認されなかった（表３参照）。600nmの金粒子を使用した場合、形質転換体が確認され、さらに、600nmと100nmの金粒子の混合物を使用した場合、600nmの金粒子を単独で使用した場合に比べて約2倍の形質転換体が確認された（表３参照）。
一方、環状p5.0kbを使用してdum-1株のミトコンドリアの形質転換を行ったところ、40nm及び100nmの金粒子を使用した場合、形質転換体は確認されなかった（表４参照）。600nmの金粒子を使用した場合、形質転換体が確認され、さらに、100nmと600nmの金粒子の混合物を使用した場合、600nmの金粒子を単独で使用した場合に比べて約2倍の形質転換体が確認された（表４参照）。
【００４０】
【表１】
2006014612.tif 000002
【００４１】
【表２】
2006014612.tif 000003
【００４２】
【表３】
2006014612.tif 000004
【００４３】
【表４】
2006014612.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明に係るオルガネラＤＮＡの形質転換方法によれば、ミトコンドリアや葉緑体などのオルガネラＤＮＡを高い転換効率で形質転換することができるので、細胞工学、遺伝子工学、発生工学などの研究分野において、効率的にオルガネラを形質転換する方法として利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】形質転換に使用した５種類の呼吸能欠損株の変異や欠損の位置を示す図である。左右方向の太矢印は末端逆位反復配列を示し、矢印の方向は転写方向を示している。垂直方向の矢印は、変異の位置を示している。  図１の下端部には、試験例で使用したＤＮＡ構成物の対応する配列を示しており、（ａ）はp3.8kbとp5.0kbの第一の要素、（ｂ−１）はp3.8kbの第二の要素、（ｂ−２）はp5.0kbの第二の要素、（ｃ）はp3.8kbとp5.0kbの第三の要素である。  Ｃは遺伝子産物のＣ末端を示し、Ｎは遺伝子産物のＮ末端を示す。丸印は複製開始点を示す。
【図２】ＤＮＡ構成物の遺伝子構成を示す図である。左右方向の矢印はミトコンドリアゲノムの末端における逆位反復配列を示し、垂直方向の矢印は、各要素の境界を示す。数字は、C.reinhardtiiのミトコンドリアゲノム配列（NC_001638）のヌクレオチドの位置を示す。  （ａ）は5.0kbのＤＮＡ構成物であり、（ｂ）はp3.8kbのＤＮＡ構成物であり、（ｃ）はp1.8kbのＤＮＡ構成物である。丸印は複製開始点を示す。
【図３】パーティクルガン法によって形質転換されたミトコンドリアゲノムの構成を示す図である。（Ａ）はp5.0kb又はp3.8kbのＤＮＡ構成物の第一の要素との組み換えによる野生型ゲノムである。（Ｂ）はp5.0kb又はp3.8kbのＤＮＡ構成物の第二の要素との組み換えによる非野生型ゲノムである。（Ｃ）はp5.0kbのＤＮＡ構成物の第三の要素との組み換えによる非野生型ゲノムである。（Ｄ）はp3.8kbのＤＮＡ構成物の第三の要素との組み換えによる非野生型ゲノムである。
【図１】
2006014612.tif 000006
【図２】
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【図３】
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