(57)【要約】【課題】本発明はＤ−アラニンを発酵法によって工業的に製造する。【解決手段】ＤＬ−アラニンを実質的に単一炭素源および単一窒素源を含有する培地中で、キャンディダ（Candida）属、サッカロマイコプシス（Saccharomycopsis）属、ピキア（Pichia）属、トルロプシス（Torulopsis）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、ハンゼヌラ（Hansenura）属またはトルコスポロン（Torycosporon）属などのＬ−アラニンを資化しＤ−アラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、培養物からＤ−アラニンを採取する際に、ＤＬ−アラニンを含有する無機酸水溶液を添加することで培地のｐＨを調整する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＬ−アラニンを実質的に単一炭素源および単一窒素源を含有する培地中で、Ｌ−アラニンを資化しＤ−アラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、培養物からＤ−アラニンを採取する際に、ＤＬ−アラニンを含有する無機酸水溶液を添加することで培地のｐＨを調整することを特徴とするＤ−アラニンの製造法。
【請求項２】
Ｌ−アラニンを資化しＤ−アラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母が、キャンディダ（Candida）属、サッカロマイコプシス（Saccharomycopsis）属、ピキア（Pichia）属、トルロプシス（Torulopsis）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、ハンゼヌラ（Hansenura）属またはトルコスポロン（Torycosporon）属のいずれかに属する酵母であることを特徴とする請求項１記載のＤ−アラニンの製造法。
【請求項３】
無機酸が硫酸または塩酸またはリン酸である請求項１または２記載のＤ−アラニンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤ−アラニンを発酵法によって工業的に製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グルコースとＤＬ−アラニンを含有する培地中で酵母を培養することによりＤ−アラニンを製造する方法はすでに知られている（非特許文献１）。
【０００３】
また、グルコースを炭素源とするコリネバクテリウム・ファスシアンスによる直接Ｄ−アラニン発酵法も知られている（特許文献１）。
【０００４】
１回の培養で得られるＤ−アラニンの生産量を増やすためには培養槽に大量の培養液を仕込む方法と培養液中のＤＬ−アラニン濃度を増加させる方法がある。
【特許文献１】特公昭５１−２１０７６号公報
【非特許文献１】「発酵と代謝」、１５、８９（１９８７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前項について、非特許文献１に記載の方法は安価なDL−アラニンから、高価なＤ−アラニンを高純度で得る方法として優れている。
【０００６】
しかしながらＤＬ−アラニン濃度を２０ｇ／ｌ以上にすると菌の生育が阻止されるばかりでなく、Ｌ−アラニンの資化能も低下すること、また、Ｄ−アラニンも資化されてしまうために、残存Ｄ−アラニン回収率も低いことなどのために工業的に有利な方法とはいえない。
【０００７】
また、特許文献１に記載の方法はＤ−アラニンの蓄積濃度が６ｇ／ｌと低いこと、培養時間が５日間と長いことなどのために、同様に工業的に有利な方法とはいえない。
【０００８】
しかも、従来技術はグルコース、グリセロールなどを炭素源とする培地で微生物を培養し、その微生物の保有する酵素によってＬ−アラニンを他の物質に変換せしめることにより、ＤＬ−アラニンからＤ−アラニンを製造する方法である。
【０００９】
また、Ｄ−アラニンの生産量を増やすために培養槽に大量の培養液を仕込む方法では、通気撹拌により起こる液面の上昇や発泡が原因で培養槽から培養液がオーバーフローする危険性がある。さらに、培養液中のＤＬ−アラニン濃度を増加させる方法では、ＤＬ−アラニン濃度が高いため、微生物の成育が阻害され、培養時間が長くなるという問題点があった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで、本発明者らはｐＨを酸性側にコントロールするための無機酸にＤＬ−アラニンを溶かし込み、ＤＬ−アラニンを単一炭素源および単一窒素源として含有する培地に追添加することにより、Ｌ−アラニンを資化せしめＤ−アラニンを製造する方法を検討した。
【００１１】
本発明は培養槽内の培養液量を制限でき、また、培地中のＤＬ−アラニン濃度を微生物が正常に成育できる濃度のままで高効率にＤ−アラニンを蓄積させることができる培養方法に関する。
【００１２】
本発明者らは単一炭素源および単一窒素源として安価なＤＬ−アラニンを使用しこの特定の培地を使用してＬ−アラニンのみを資化する選択的資化能を有する微生物を用いて、ｐＨ調整用硫酸に溶かしたＤＬ−アラニン追添加後のＤ−アラニンの蓄積量および光学純度について探究した。また、Ｌ−アラニンを他の物質に変換する酵素としては、例えば、アラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アラニン−オキソ酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼなどが知られており、さらに、アラニンラセマーゼが知られている。
【００１３】
これらの酵素は例えば、スタフィロコッカス属、キャンディダ属、サッカロマイコプシス属、ラクトバチルス属、バシリス属、トルロプシス属、ピキア属、デバリオマイセス属、アスペルギルス属、ミクロコッカス属、サッカロマイセス属、アエロバクター属、ハンゼヌラ属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属などに属する微生物に存在する。
【００１４】
しかし、これらの微生物がＬ−アラニンを他の物質に変換する能力を有していても、Ｄ−アラニンをも変換する酵素が共に存在している場合やアラニン・ラセマーゼが存在している場合には、残留アラニン中にＬ−アラニンが混入するため、Ｄ−アラニンのみを蓄積することはできない。そこで、本発明は実質的にＤＬ−アラニンを単一炭素源および単一窒素源として含有する培地中で、キャンディダ属、サッカロマイコプシス属、ピキア属、トルロプシス属、クリプトコッカス属、ハンゼヌラ属またはトリコスポロン属に属しかつＬ−アラニンを資化しＤ−アラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、培養物からＤ−アラニンを採取する際に、ＤＬ−アラニンを無機酸水溶液に溶かして追加添加することを特徴とするＤ−アラニンの製造法に関するものである。
【００１５】
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１６】
（１）ＤＬ−アラニンを実質的に単一炭素源および単一窒素源を含有する培地中で、Ｌ−アラニンを資化しＤ−アラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、培養物からＤ−アラニンを採取する際に、ＤＬ−アラニンを含有する無機酸水溶液を添加することで培地のｐＨを調整することを特徴とするＤ−アラニンの製造法。
【００１７】
（２）Ｌ−アラニンを資化しＤ−アラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母が、キャンディダ（Candida）属、サッカロマイコプシス（Saccharomycopsis）属、ピキア（Pichia）属、トルロプシス（Torulopsis）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、ハンゼヌラ（Hansenura）属またはトルコスポロン（Torycosporon）属のいずれかに属する酵母であることを特徴とする（１）記載のＤ−アラニンの製造法。
【００１８】
（３）無機酸が硫酸または塩酸またはリン酸である（１）または（２）記載のＤ−アラニンの製造法。
【発明の効果】
【００１９】
ＤＬ−アラニンを単一炭素源および単一窒素源として酵母を培養することにより、Ｌ−アラニンを高選択的に資化することができる。さらに蓄積濃度も高く、短時間でＤ−アラニンが得られる。
【００２０】
加えて、消費されたＬ−アラニンはほとんど炭酸ガスと水にまで変換されて、培養  液中にはＤ−アラニン以外の副生物は実質的には存在しない。このためにＤ−アラニンの単離精製が容易である。
【００２１】
培養槽に仕込む培養液の液量を増やすことなく一回の培養で得られるD−アラニンの生産量を増やすことができる。さらに初期ＤＬ−アラニン濃度を高くすることなく一回の培養で得られるD−アラニンの生産量を増やすことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の構成を詳述する。
【００２３】
本発明で使用する酵母としては、Ｌ−アラニン資化能を有し、Ｄ−アラニンを実質的に資化しない酵母であれば、どのようなものでもよいが、キャンディダ属、サッカロマイコプシス属、ピキア属、トルロプシス属、クリプトコッカス属、ハンゼヌラ属またはトリコスポロン属に属する酵母が好ましく使用できる。これらの酵母のうち実質的にＤＬ−アラニンを単一炭素源および単一窒素源として含有する培地中で生育可能であって、かつＬ−アラニン資化能を有し、Ｄ−アラニンを実質的に資化しない酵母が本発明では用いられる。
【００２４】
ここで、Ｄ−アラニンを実質的に資化しない酵母とは、本発明の効果を実質的に阻害しない範囲においてＤ−アラニンを少量のみ資化する酵母、あるいはＬ−アラニンの資化後、Ｌ−アラニンの不存在条件下ではＤ−アラニンを資化する酵母も含まれる。
【００２５】
例えば、キャンディダ・フミコーラ（Candida humicola）ATCC36992、キャンディダ・ルゴーザ（Candida rugosa）ATCC10571、サッカロマイコプシス・リポリティカ（Saccharomycopsis lipolytica）ATCC20306、サッカロマイコプシス・リポリティカ（Sacharomycopsis lipolytica）IFO 0717、クリプトコッカス・ラウレンティ（Cryptococcus laurentii）ATCC36832、トルロプシス・キャンディダ（Torulopsis candida）ATCC20284、トルロプシス・グラブラタ（Torulopsis glabrata）IFO 0005、ピキア・ブルトニー（Pichia burtonii）ATCC20279、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）IFO 0947、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）ATCC26012、ハンゼヌラ・カプスラータ（Hansenula capsulata）ATCC16753、トリコスポロン・ベイゲリー（Trichosporon beigelii）ATCC36993などが挙げられる。
【００２６】
本発明では、ＤＬ−アラニンを実質的に単一炭素源および単一窒素源として含有する培地中で培養を行う。すなわち、本発明では、培地中の炭素源および窒素源として実質的にＤＬ−アラニンを用いるが、本発明の効果を阻害しない範囲内で他の炭素源および／または窒素源を少量含有していてもよい。炭素源としては、グルコース、フルクトース、でんぷんの加水分解物、糖密等の糖類、酢酸等の有機酸類、エタノール、グリセロール等のアルコール類等が使用でき、グルコース、フルクトースが好ましく使用できる。また、窒素源としては、酢酸アンモニウム等の有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水等が使用でき、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウムが好ましく使用できる。ＤＬ−アラニン以外の炭素源および窒素源の濃度としては、培地中に０．０１〜１０ｇ／ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは０．０１ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌである。また、有機微量栄養素として粉末酵母エキスを適宜添加するのが好ましい。これらの他にリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム７水、硫酸亜鉛７水、硫酸第一鉄７水等の微量金属成分が添加される。
【００２７】
培地中のＤＬ−アラニン濃度は１ｌ中に１〜１５０ｇ、好ましくは、３０〜１２０ｇである。ＤＬ−アラニン濃度が低いと生産効率が悪く、逆に濃度が高いと培養時間が長くなり、また、微生物の生育が阻害される傾向となる。
【００２８】
ＤＬ−アラニンは始めから培養液に全量仕込んでもよいが、濃度が高くなると微生物の生育が遅くなり培養時間が長くなるので、初濃度を２０〜５０ｇ／ｌにし、残りのＤＬ−アラニンを分割添加する流加培養法が好ましい。
【００２９】
培養は酸性で実施するのが好ましい。培養液は通常培養開始時にｐＨ５に調整するが、培養が進むにつれてｐＨが上昇する。そのままで培養するとＤ−アラニンの回収率が低下するので通常は、ｐＨを酸性側にコントロールする。ｐＨがアルカリ側になるとＤ−アラニンの回収率が低下する原因として、アラニン・ラセマーゼが活性化されること、またはＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼが活性化されることなどにより、Ｄ−アラニンが資化されるものと考えられる。これらの理由から、培養時のｐＨは通常４〜７、好ましくは４．５〜６．５に調整する。調整用の酸としては、無機酸が好ましく、例えば、リン酸、硫酸、塩酸などの無機酸水溶液の状態で添加するのが好ましい。
【００３０】
本発明では、このｐＨ調整を行う際に、ＤＬ−アラニンを含有する無機酸水溶液を培養液に添加するのがポイントである。無機酸水溶液にＤＬ−アラニンを１０〜１０００ｇ／ｌの濃度になるように含有させ、それを用いてｐＨの調整を行う。ＤＬ−アラニンを含有する無機酸水溶液添加の仕方は、ｐＨが４．５〜６．５の範囲に保たれるように適宜添加するのが好ましい。こうすることで、Ｄ−アラニンの生産量を増加させることができる。
【００３１】
培養温度は通常２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃である。
【００３２】
培養は通気しながら撹拌する。通気量は通常、０．５〜２．０ｖｖｍ、好ましくは０．６〜１．２ｖｖｍである。通気量が少なすぎるとＬ−アラニン資化速度が遅くなる傾向となり、また、多くても効果に変わりなく、むしろ培養液の蒸発を促進するために培養液濃度が高くなったり、発泡が激しくなり好ましくない。
【００３３】
Ｌ−アラニンがすべて資化された時点で通常、培養を終了する。Ｌ−アラニンの全量資化はＤ−０をモニターすることにより、また、アラニンのＤ、Ｌを分析するか、酸の添加量をモニターすることにより知ることができる。Ｌ−アラニンがすべて資化されたのち、さらに培養を続けるとＤ−アラニンも徐々に資化される場合もあるので、培養の終点を明確に知ることが好ましい。
【００３４】
かくして得られた培養液を遠心分離により菌体を除去したのち、通常の方法によってＤ−アラニンを単離すればよい。
【００３５】
例えば、イオ交換樹脂ＳＫ−１Ｂ（三菱化学製）に通液してアラニンを樹脂に吸着させた後よく洗浄する。次いでアンモニア水溶液で溶出させたのち、溶出液を濃縮すればよい。ここで得られた粗Ｄ−アラニンを水で再結晶すれば精製されたＤ−アラニンが得られる。
【実施例】
【００３６】
実施例においてアラニンのＤＬ分析は、遠心分離後のD−アラニン含有上清をトリエチルアミンとＧＩＴＣ(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-beta-D-glucopyranosyl Isothiocyanate)試薬により誘導体化し、ジエチルアミンを加えたのちこれを次の条件によりＨＰＬＣで分析する方法によって行った。
【００３７】
カラム：ＳＧ１２０    ４．６ｍｍφ×１５０（資生堂）
移動層：０．１Ｍリン酸：メタノール（５６：４４）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
温度：３５℃
（実施例１）
乾燥ブイヨン１．８ｇ、無水ブドウ糖１．０ｇに水１００ｍｌを加えた培地を５００ｍｌ三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅菌し、種培養培地とした。これにキャンディダ・フミコーラATCC36992を一白金耳植菌し、３０℃で一日振とう培養した。一方、ＤＬ−アラニン１２０ｇ、リン酸一カリウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム７水０．７５ｇ、硫酸亜鉛７水０．０３ｇ、硫酸第一鉄７水０．０３ｇ、粉末酵母エキス０．７５ｇに水１．５  ｌを加えた培地（ｐＨ５．０）を３  ｌのミニジャーファーメンターに仕込み滅菌して主培養培地とした。これに先の種培養培地を接種し、３０℃、０．５ｖｖｍ通気撹拌培養をした。約１５時間後、この培養液を上記培養組成のうち、ＤＬ−アラニン２２５ｇ、他は同じ組成とした新しい主培養培地に５％シードで接種し、先ほどと同条件で通気撹拌培養をした。培養中は１２Ｎ硫酸７０ｍｌにＤＬ−アラニン４５ｇを溶かし込んだ硫酸によりｐＨ５．０±０．１に調整して培養を行った。約３９時間で添加を終えたのちも、さらに培養を続けた。培養を始めてから約４５時間で培養は終結し、Ｄ−アラニン１３６ｇを含む培養液約１．７５  ｌを得た。
【００３８】
この培養液を１０，０００ｒｐｍ１０分間遠心分離して菌体を除いた上清をＨＰＬＣにより分析したところ、光学純度は９９％ｅｅ以上であった。
【００３９】
（実施例２）
実施例１に示した操作のうち、ｐＨ調整に用いる酸を１２Ｎ塩酸とし、他は実施例１と同条件で培養を行ったところ、収量、光学純度ともに実施例１と同様であった。
【００４０】
（実施例３）
実施例１に示した操作のうち、ｐＨ調整に用いる酸を１２Ｎリン酸とし、他は実施例１と同条件で培養を行ったところ、収量、光学純度ともに実施例１と同様であった。
【００４１】
（比較例１）
実施例１に示した操作のうち、ＤＬ−アラニン無添加の１２Ｎ硫酸によりｐＨ５．０±０．１に調整し他は同じ条件で培養を行った。培養は約４０時間で終了し、Ｄ−アラニン１１３ｇを含む培養液約１．７ｌを得た。培養液から実施例１に示した操作で得られたＤ−アラニンの光学純度は９９％ｅｅ以上であった。
【００４２】
（比較例２）
実施例１に示した操作のうち、ＤＬ−アラニンを１５０ｇ／ｌとした主培養培地を１．８ｌとして他は同じ条件で培養を行った。培養を始めてから３０時間を過ぎたところで排気口から培養液がオーバーフローした。