(57)【要約】      （修正有）【課題】塩基配列の検査、とりわけプロモーター領域の特定塩基の繰り返し配列の挿入、欠失の検査を簡便にしかも精度よく、多数検体を効率よく検査できる方法を提供する。【解決手段】プロモーター領域の特定塩基の繰り返し配列の挿入、欠失の検査を簡便にしかも精度良く、多数検体を効率良く検査できる方法を鋭意研究した。被検試料に少なくとも２塩基の非相補配列を生じるプライマーと全配列が相補または１塩基の非相補配列を有するプライマーをそれぞれ組み合わせて用いることにより、特定の塩基配列の繰り返し数に対応したプライマー伸長反応が進行することから、それに対応したシグナルを検出することで簡便にしかも精度良く、多数検体を効率良く検査できる検査方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料中に含まれる特定塩基配列の繰り返し数を検査する方法であって、ストリンジェントな条件でハイブリダイズさせるプライマーの特定塩基配列の繰り返し数が被検試料の特定塩基配列の繰り返し数と一致している場合には該プライマーの全配列又は１塩基を除く配列が試料と相補であり、特定塩基配列の繰り返し数が一致していない場合には該プライマーの３´末端側に少なくとも２塩基の非相補配列及び／又は５´末端側に少なくとも４塩基の非相補配列を生じるプライマーを被検試料にハイブリダイズさせる工程、該プライマーを伸長させる工程、及びプライマー伸長反応に対応するシグナルを検出する工程を組み合わせることを特徴とする検査方法。
【請求項２】
特定塩基配列の繰り返し数がチミン−アデニン配列の繰り返し数（ＴＡリピート数）
である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＡリピート数の検査がグルクロン酸転移酵素遺伝子（ＵＧＴ１）のプロモーター領域である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＴＡリピート数が４〜８のいずれかであることを検査する請求項１〜３のいずれか１に記載の方法。
【請求項５】
配列表の配列番号１〜３のいずれかに記載のプライマー。
【請求項６】
配列表の配列番号１に記載のプライマーと配列番号２又は３に記載のプライマーを組み合わせて検査する請求項１〜４のいずれか１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜３または６のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査試薬、検査装置、又は検査キット。
【請求項８】
請求項５に記載のプライマーを含む検査試薬又は検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸試料中に含まれる特定の塩基配列の検査方法および試薬に関するものであり、とりわけ及びプロモーター領域に見られる特定塩基の繰り返し配列の検査方法及び検査試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子変異には、特定塩基の繰り返し配列の反復数の増減による変異、数塩基の挿入や欠失による変異、１塩基変異（ＳＮＰ）等があることはよく知られている。これらの変異を検査するには、直接塩基配列をシーケンスする方法が主に行われている。しかし、直接シーケンス法は結果が得られるのに長時間必要な上、データーの解析も複雑である等の問題があり、汎用されるものではない。
【０００３】
遺伝子変異のなかで最も一般的なＳＮＰでは、種々の検査方法が提案されている。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法(特許文献1及び２)は遺伝子増幅法を利用した変異の検出方法としてよく知られている。この方法では、プライマーの末端塩基がＳＮＰの塩基になるように設計された正常型プライマーと変異型プライマーを用意し、検体と２つのプライマーをそれぞれ別々にＰＣＲし、どちらが増幅するかにより判定する。その他、下記の文献に示した方法が報告されている。
【非特許文献１】検査と技術、増刊号、（２００２）、３０，９９１−９９５
【特許文献１】特公平４−６７９６０号
【特許文献２】特公平４−６７９５７号
【特許文献３】特開平１１−１０３８９４号
【特許文献４】特開２００２−１０１８９９号
【特許文献５】ＷＯ０１／４２４９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題はプロモーター領域の特定塩基の繰り返し配列の挿入、欠失の検査を簡便にしかも精度よく、多数検体を効率よく検査できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、プロモーター領域の特定塩基の繰り返し配列の挿入、欠失の検査を簡便にしかも精度良く、多数検体を効率良く検査できる方法を鋭意研究した。被検試料に少なくとも２塩基の非相補配列を生じるプライマーと全配列が相補または１塩基の非相補配列を有するプライマーをそれぞれ組み合わせて用いることにより、特定の塩基配列の繰り返し数に対応したプライマー伸長反応が進行することを見出し、それに対応したシグナルを検出することで簡便にしかも精度良く、多数検体を効率良く検査できる検査方法を提供することが可能なった。
【０００６】
本発明は以下の構成からなる。
１、核酸試料中に含まれる特定塩基配列の繰り返し数を検査する方法であって、ストリンジェントな条件でハイブリダイズさせるプライマーの特定塩基配列の繰り返し数が被検試料の特定塩基配列の繰り返し数と一致している場合には該プライマーの全配列又は１塩基を除く配列が試料と相補であり、特定塩基配列の繰り返し数が一致していない場合には該プライマーの３´末端側に少なくとも２塩基の非相補配列及び／又は５´末端側に少なくとも４塩基の非相補配列を生じるプライマーを被検試料にハイブリダイズさせる工程、該プライマーを伸長させる工程、及びプライマー伸長反応に対応するシグナルを検出する工程を組み合わせることを特徴とする検査方法。
２、特定塩基配列の繰り返し数がチミン−アデニン配列の繰り返し数（ＴＡリピート数）である前記１に記載の方法。
３、ＴＡリピート数の検査がグルクロン酸転移酵素遺伝子（ＵＧＴ１）のプロモーター領域である前記１又は２に記載の方法。
４、ＴＡリピート数が４〜８のいずれかであることを検査する前記１〜３のいずれか１に記載の方法。
５、配列表の配列番号１〜３のいずれかに記載のプライマー。
６、配列表の配列番号１に記載のプライマーと配列番号２又は３に記載のプライマーを組み合わせて検査する前記１〜４のいずれか１に記載の方法。
７、前記１〜３または６のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査試薬、検査装置、又は検査キット。
８、前記５に記載のプライマーを含む検査試薬又は検査キット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、プロモーター領域の特定塩基の繰り返し配列の挿入、欠失の検査をできる方法を提供し、測定に際して特殊な機器、設備を必要とせずに安価で簡便に、しかも精度よく多数検体を効率よく検査できるといった、格段の効果を有する検査方法、検査試薬及びキットを提供することを可能にした。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において用いられている用語の定義は以下のとおりである。
１、核酸とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）の両方又はどちらか一方を表し、ＤＮＡにおいては特に限定しない限り、１本鎖又は２本鎖のいずれも含まれる。また、ある特定の領域の全長を核酸とし、その一部を核酸断片という。
２、オリゴヌクレオチドとはとりわけ、数塩基〜数十塩基からなる核酸断片をいう。
３、プライマーとは１本鎖の核酸又は核酸断片とハイブリダイズし、ポリメラーゼによる塩基伸長反応を誘導し得るオリゴヌクレオチドである。このプライマーはビオチン、蛍光色素などの標識物質で標識されているものも含まれる。
４、プローブとは１本鎖の核酸又は核酸断片とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。
【０００９】
本発明の特徴は、プロモーター領域の繰り返し配列、ＴＡリピート、部位に特異的にハイブリダイズして伸長反応を進行させるプライマーとリピート数の変化により伸長反応を進行させないプライマーを選択し、それらを組み合わせて用いることにより、リピート数の変化を簡便に検査できる方法を提供することである。
【００１０】
本発明を実施するために設計されるプライマーは、正常型試料に正常型検出プライマーを作用させると伸長反応が進行し、変異型検出プライマーでは反応が進行しないようなプライマーを、逆に変異型試料に正常型検出プライマーでは反応が進行せずに、変異型検出プライマーを作用させると伸長反応が進行するプライマーを設計する必要がある。ＴＡリピート数が正常型で６、変異型で７である試料を検査するときに、プライマーの３´末端が正常型のＴＡリピートの５´末端に相補となり、ＡＴの繰り返し数が正常型の６であるプライマーを用いた場合、正常型試料でプライマー伸長反応が進行する一方、変異型試料でもプライマーが完全に相補配列を有することになるため、伸長反応は進行する。従って、このようなプライマーでは全く検査できないことになる。これを解決するためには、図１の上段及び中段に示したように、プライマーの３´末端をＴＡリピートの開始点よりも上流側の塩基配列と相補となるようにすることにより解決できる可能性が考えられる。しかしながら、単純にプライマーの３´末端をＴＡリピートの開始点よりも上流側の塩基配列と相補としただけでは、図１の最下段に示すようにプライマーの３´末端側の相補部分が試料にハイブリダイズするためプライマー伸長反応が進行する。それを解決するために、プライマーの５´末端側に少なくとも４塩基の非相補配列ができるように、正常型のＴＡリピートの終末点よりも下流域に相補配列を有する必要がある。このように、プライマーの５´末端側に多くの非相補領域を持たせることで、プライマー全体の相補性が低下するため、ストリンジェントな条件下で被検試料にハイブリダイズさせると、ハイブリダイズが完全でないため、プライマー伸長反応が進行しないことを見出した。図１から図３に示したように、目的のリピート数と一致しない場合には、プライマーの３´末端側に少なくとも2塩基の非相補配列となり、５´末端側に少なくとも４塩基の非相補配列となるプライマーを設計することにより、リピート数が目的のリピート数と一致していないことを検査できる。各リピート数を検出するプライマーを組み合わせて用いることにより、試料のＴＡリピート数を検査できる。また検査できるリピート数は上記の例では正常型６と変異型７を示したが、変異型５、４、８及び９のいずれも同じコンセプトでプライマーを設計し、作製することで検査できる。
【００１１】
本発明に用いる具体的なプライマーの例をあげて説明する。ＴＡリピート数が６である正常型を検査するために、配列表の配列番号１に記載の正常型検出用プライマーを設計した。本プライマーは、ＴＡリピートの開始箇所より３塩基上流の塩基を３´末端になるように設計した。このプライマーを変異型であるＴＡリピート数が７の試料にハイブリダイズさせた場合、５´末端側からは相補であり３´末端側の２塩基が非相補となるケースと、３´末端側は相補で５´末端側の数塩基が非相補となるケースが生じる（図１）。３´末端側の２塩基が非相補となるケースでは伸長反応が進行しないことが容易に期待できる。一方３´末端側は相補で５´末端側の数塩基が非相補となるケースでは、プライマーの全配列に占める相補配列が少なくなるため、プライマーが試料ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、結果としてプライマー伸長反応が進行しないことが期待できる。実際に、本プライマーでは変異型試料では有意なプライマー伸長反応が進行しないこと、正常型試料では有意な伸長反応の進行が確認できた。
【００１２】
配列表の配列番号２記載のプライマーは変異型試料でプライマー伸長反応が進行するように設計されたものである。本プライマーを正常型試料にハイブリダイズさせると、５´末端側からは相補であり３´末端側の２塩基が非相補となるケースと、３´末端側は相補で５´末端側の数塩基が非相補となるケースが生じる（図２）。このケースも前記と同様の理由によりプライマー伸長反応の有無が期待でき、本プライマーでは正常型試料では有意なプライマー伸長反応が進行しないこと、変異型試料では有意な伸長反応の進行が確認できた。
【００１３】
配列表の配列番号３に記載のプライマーは変異型試料でプライマー伸長反応が進行するように設計された他の例である。本プライマーを変異型試料にハイブリダイズさせると、５´末端側からは相補であり、３´末端より４塩基目が非相補となるように人工ミスマッチ配列を導入している。本プライマーを変異型試料にハイブリダイズさせると、３´末端側の３塩基が相補であるため伸長反応が進行する。一方、正常型試料にハイブリダイズさせると、３´末端側の２塩基と４番目の塩基が非相補となるケースと、３´末端側は４番目の人工ミスマッチ導入塩基を除いて相補で、５´末端側の数塩基が非相補となるケースが生じる（図３）。このケースも前記と同様の理由で伸長反応の有無が期待でき、実際に本プライマーでは正常型試料では有意なプライマー伸長反応が進行しないこと、変異型試料では有意な伸長反応の進行が確認できた。
【００１４】
配列表の配列番号１〜３に記載のプライマーは以下のようにして用いられる。
予め増幅された被検核酸に前記検出用プライマーをハイブリダイズさせ、基質とポリメラーゼによりプライマー伸長反応を進行させる。ここで用いる検出用プライマーは、その５´末端をビオチン、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ジゴキシゲニン等の公知の標識物質で標識しておく。プライマー伸長反応により生成した部位を特異的に結合しうる結合対は、プライマー伸長反応により生成した塩基配列に相補的な配列を有する捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを用いて結合させる。すなわちプライマー伸長反応が進行すれば標識検出用プライマーを含む核酸断片が捕獲用オリゴヌクレオチドプローブと結合する。一方変異のためにプライマー伸長反応が進行しなければ、標識検出用プライマーを含む核酸断片が捕獲用オリゴヌクレオチドプローブと結合しないので、標識物質が捕獲用オリゴヌクレオチドプローブに結合しない。捕獲用オリゴヌクレオチドプローブ上に結合した標識物質を検出することにより、プライマー伸長の有無が検出でき、ひいては遺伝子の配列、変異が検査できる（図４）。ここで用いる捕獲用オリゴヌクレオチドプローブは適当な固相担体に結合させて用いることが好適である。固相担体への結合はアミノ化オリゴヌクレオチドを、サクシニイミド基を介して結合させるなどの公知の方法が適用される。固相担体は、磁性粒子、マイクロタイタープレートウエル、チューブ、ガラスビーズ、プラスチックビーズ等が用いられる。
【００１５】
前記プライマーを用いる他の実施態様として、予め増幅された被検核酸に前記検出用プライマーをハイブリダイズさせ、連鎖終止基質とポリメラーゼによりプライマー伸長反応を進行させ、１塩基伸長させる方法や、プライマー伸長反応生成物を金属コロイド粒子、ラテックス粒子、リポソーム及び非金属コロイド等の不溶性粒状マーカー表面に特異的に結合しうる結合対を介して捕獲し、プライマー伸長反応が進行している場合には粒子の凝集が認められるが、進行していない場合には凝集は起きないことを、肉眼的或いは光学的手段を用いて検出することなども可能である。例えば、金コロイドを不溶性粒子に用いた場合には、色調の変化を肉眼的に観察すること、或いは吸光度の変化を計測することができる。ラテックス粒子など他の不溶性粒子の場合にも同様に、肉眼的、光学的検出の両方が適用できる。
【００１６】
本発明には、配列表の配列番号１〜３に記載のプライマー、該プライマーを含む検査試薬、検査キット、さらには本発明の方法を実施するための検査試薬及びキットも本発明に含まれる。正常型検出用プライマー、変異検出用プライマー、ポリメラーゼ、基質、及び捕獲用オリゴヌクレオチドプローブが必須の構成試薬となる。増幅工程を組み込む場合にはリバースプライマーを、捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを固相化する場合には、マイクロタイタープレート或いは磁性粒子等の適当な固相にプローブを固定化した固相を、標識物質がビオチンであれば、それを検出するための酵素標識アビジン或いは酵素標識ストレプトアビジンと酵素活性測定のための基質類を構成試薬にする。さらに、検体からの核酸抽出用試薬、核酸処理用のアルカリ液等の処理液類、緩衝液類及び洗浄液等も組み込むことができる。
【実施例１】
【００１７】
グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１）遺伝子のプロモーター領域の通常ＴＡボックスと呼ばれる領域を本発明の方法により調べた。まずプロモーター領域を配列番号４に示したフォワードプライマーと配列番号５に示したリバースプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。ＴＡリピート数の変異を検出するために、得られたＰＣＲ産物に配列番号１から３に示した５'末端をビオチンで標識した検出用プライマーと通常の基質（４種類のデオキシヌクレオシド３リン酸）を加えてプライマー伸長反応を行った。反応終了後、反応液に２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ、１０μＬを加え、２本鎖核酸を1本鎖にし、それを捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを固定化したマイクロタイタープレートのウエルに移し、ｐＨを約７．５に調製して室温で３０分間ハイブリダイズ反応させた。ハイブリダイズ反応後、反応液を除去しリン酸緩衝液でウエルを洗浄した。そのウエルに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン溶液１００μLを加え室温２０分間反応させ、未反応の標識アビジンを除去、洗浄した。ペルオキシダーゼの基質である過酸化水素を含むオルトフェニレンジアミン溶液を加えて発色反応を行った。３７℃で１０分問反応させた後、１ｍｏｌ／Ｌの硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させ、波長４９２nmの吸光度を測定した。その結果を表1に示した。変異型では正常型に比べて明らかに低い吸光度となり本発明の方法により簡便に変異が検出できることがわかった。
【００１８】
【表１】
2006246769.tif 000002
【実施例２】
【００１９】
実施例２と同様に操作して、インフォームドコンセントの得られた４０例の検体について、本発明の方法を用いてＴＡリピート数の変異を調べ、ダイレクトシーケンス法の結果と比較した。その結果、表２に示したように全例ダイレクトシーケンス法と一致し、本発明の有用性が明らかになった。
【００２０】
【表２】
2006246769.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明は特定の遺伝子配列、とりわけ遺伝子変異の簡便な検査方法を提供するものであり、遺伝子変異の検査試薬、検査装置及び検査キットとして、臨床検査の分野で用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】正常型検出用プライマー（配列番号１）のハイブリダイズパターンの図である。
【図２】変異型検出用プライマー（配列番号２）のハイブリダイズパターンの図である。
【図３】変異型検出用プライマー（配列番号３）のハイブリダイズパターンの図である。
【符号の説明】
【００２３】
１、    
正常型検出用プライマー（配列番号１）
２、    
正常型試料ＤＮＡ
３、    
プライマー伸長反応の進行を示す矢印
４、    
変異型試料ＤＮＡ
５、    
プライマーが非相補となる部分
６、    
プライマー伸長反応が進行しないことを示す印
７、    
変異型検出用プライマー（配列番号２）
８、    
変異型検出用プライマー（配列番号３）
【図１】
2006246769.tif 000004
【図２】
2006246769.tif 000005
【図３】
2006246769.tif 000006
【配列表】
2006246769000001.app