(57)【要約】【課題】  酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質を利用して、酢酸存在下での生育能が改善された酢酸菌、及び酢酸菌の酢酸存在下での生育能を改善させることのできる新規な育種方法を提供すること、さらに前記酢酸菌を用いることにより、食酢や高濃度の酢酸を製造することができる手段を提供すること。【解決手段】  １３種類の中央代謝系酵素群から選ばれる１又は２以上の酵素活性が増強されてなることを特徴とする酢酸存在下での生育能の向上した酢酸菌、該酢酸菌の育種方法、及び、該酢酸菌を用いた食酢の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、フマレートヒドラターゼ、マレートキノンオキシドレダクターゼ、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）、ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素、ＮＡＤＨ脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、エノラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコネート脱水素酵素、及びホスホグルコネートデヒドラターゼからなる中央代謝系酵素群から選ばれる１又は２以上の酵素活性が増強されてなることを特徴とする酢酸存在下での生育能の向上した酢酸菌。
【請求項２】
ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、フマレートヒドラターゼ、マレートキノンオキシドレダクターゼ、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）、ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素、ＮＡＤＨ脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、エノラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコネート脱水素酵素、及びホスホグルコネートデヒドラターゼからなる中央代謝系酵素群から選ばれる１又は２以上の酵素活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入して発現させることによって酵素活性を増強することを特徴とする請求項１記載の酢酸存在下での生育能の向上した酢酸菌の育種方法。
【請求項３】
ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号８４〜１１１２からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号８４〜１１１２からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
スクシニルＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１３０〜２２１８からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１３０〜２２１８からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、スクシニルＣｏＡ合成酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
フマレートヒドラターゼをコードする遺伝子が、下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列のうち、塩基番号２３〜１８１９からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列のうち、塩基番号２３〜１８１９からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、フマレートヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号８に記載の塩基配列のうち、塩基番号８５〜１４５８からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列表の配列番号８に記載の塩基配列のうち、塩基番号８５〜１４５８からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、フマレートヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
マレートキノンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８２〜１６７８からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８２〜１６７８からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、マレートキノンオキシドレダクターゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、塩基番号８９〜１８９１からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、塩基番号８９〜１８９１からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６〜１７７９からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６〜１７７９からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
ＮＡＤＨ脱水素酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＮＡＤＨ脱水素酵素複合体のサブユニットｎｕｏＭをコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８６〜１７２７からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８６〜１７２７からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ＮＡＤＨ脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１８記載の塩基配列のうち、塩基番号９１〜１１１３からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１８に記載の塩基配列のうち、塩基番号９１〜１１１３からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
エノラーゼをコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列のうち、塩基番号６８〜１３９３からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列のうち、塩基番号６８〜１３９３からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、エノラーゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
グルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列のうち、塩基番号７１〜１６００からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列のうち、塩基番号７１〜１６００からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１３】
６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１〜８７３からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１〜８７３からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
６−ホスホグルコネート脱水素酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列のうち、塩基番号７２〜１０７０からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列のうち、塩基番号７２〜１０７０からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ホスホグルコネート脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
ホスホグルコネートデヒドラターゼをコードする遺伝子が、下記の(a)又は(b)に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列のうち、塩基番号７８〜１９１６からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列のうち、塩基番号７８〜１９１６からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ホスホグルコネートデヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
酢酸菌が、グルコンアセトバクター属、又はアセトバクター属に属することを特徴とする請求項１に記載の酢酸存在下での生育能の向上した酢酸菌。
【請求項１７】
請求項１に記載の酢酸存在下での生育能の向上した酢酸菌を、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物に由来する中央代謝系の酵素および関連する酵素タンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させた微生物、特にグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）及びアセトバクター属（Acetobacter）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて食酢を効率良く製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
【０００３】
そのため、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しない、酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、酢酸耐性に関与する遺伝子（酢酸耐性遺伝子）をクローニングし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられている。
【０００４】
これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関する知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）がクローニングされていた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
このうち、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、また、ａａｒＣ遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であった（例えば、非特許文献２参照）。
【０００６】
これらの３つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片をマルチコピープラスミドにクローニングし、グルコンアセトバクター・キシリヌスＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性の向上レベルが僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵での能力の向上の有無については不明であった（例えば、特許文献３参照）。
【０００７】
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵において最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が開示されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、ＡＬＤＨはアセトアルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
【０００８】
上記以外に酢酸耐性を向上させる遺伝子として、アコニターゼ遺伝子（特許文献３参照）が知られている。この遺伝子を過剰発現させることにより酢酸菌の酢酸耐性が向上することが見出されているが、十分な酢酸耐性を付与することには成功していない。
このような実情から、酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な遺伝子を取得し、また取得した遺伝子を用いて、より高い発酵能を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
【０００９】
【特許文献１】特開昭６０−９４８８号公報
【特許文献２】特開平２−２３６４号公報
【特許文献３】特開２００３−２８９８６７号公報
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，１７２巻，ｐ．２０９６−２１０４，１９９０年
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」，７６巻，ｐ．２７０−２７５，１９９３年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のように、酢酸耐性を遺伝子レベルで解明し、高い酢酸耐性を有する実用酢酸菌の開発に成功した例は報告されていない。
従って、本発明は、酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質を利用して、酢酸存在下での生育能が改善された酢酸菌、及び酢酸菌の酢酸存在下での生育能を改善させることのできる新規な育種方法を提供すること、さらに酢酸存在下での生育の向上した酢酸菌を用いることにより、食酢を効率良く製造できると共に、高濃度の酢酸を製造することができる手段を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記目的を達成すべく、従来とは別の観点で、酢酸菌の酢酸耐性を向上させる手段を検討することとした。その過程で、本発明者は、これまでほとんど検討されていなかったＡＴＰ生成およびそれに関係する代謝系に着目した。
酢酸発酵時におけるＡＴＰの生成は、エタノール酸化を主反応とするものであるため、酢酸耐性に関与する酵素として、従来はアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）やアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）などの膜に局在するピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性の脱水素酵素やＰＱＱの酸化還元系が重要とされ、それ以外については、ほとんど着目されていなかった。
本発明者は、酢酸発酵の進行につれてエタノール酸化が十分に進行している場合でも、酢酸濃度が上昇すると生育や発酵が抑制されることに着目して、エタノール酸化以外によるＡＴＰ生成系が重要であると考えた。
【００１２】
酢酸菌において、ＡＴＰ生成は、ユビキノール・オキシダーゼによる補酵素の酸化還元反応にともなって生成するプロトン勾配の発生とリンクしてＡＴＰａｓｅの作用による反応によるものとされている。ユビキノール・オキシダーゼへの還元力の供給は、ＰＱＱ以外にも、ＮＡＤ関与およびＦＡＤ関与の反応が知られているが、これらの重要性については、従来知られていなかった。
そこで、本発明者は、酢酸菌の代謝経路の中で、ＮＡＤの還元反応に関わる酵素として、解糖系、ペントースリン酸経路、エントナードードルフ経路、ＴＣＡ回路などの中央代謝系に着目した。
【００１３】
この解糖系やペントースリン酸経路、エントナードードルフ経路、ＴＣＡ回路などの中央代謝系によって生成したＮＡＤＨをＮＡＤに再生し、電子をユビキノール・オキシダーゼに伝達するＮＡＤＨ脱水素酵素、特に電子伝達と同時に自身がプロトン勾配を生成する能力を有しているＩ型のＮＡＤＨ脱水素酵素複合体に着目した。
さらに、上記中央代謝系のうちＦＡＤの還元反応に関わる酵素として、コハク酸脱水素酵素や乳酸脱水素酵素、マレートキノン脱水素酵素などのＦＡＤを補酵素とする脱水素酵素にも着目した。
そして、酢酸菌のＡＴＰ生成に関わるこれらの中央代謝系関連の酵素活性を測定し、酢酸発酵時と非発酵時とで比較すると共に、酢酸発酵の進行に伴う変化を観察したところ、特定の酵素活性が酢酸発酵時、特に酢酸発酵の進行に伴って顕著に低下することをはじめて見出した。
【００１４】
これらの知見に基づき、酢酸菌の酢酸耐性、すなわち、酢酸存在下での増殖や酢酸発酵能を改善するためには、酢酸発酵時に低下する酵素の活性を強化することが重要であるとの結論に達した。
そして、酢酸発酵時に活性の低下が観察された各酵素の活性を示すタンパク質をコードする新規な遺伝子を、酢酸菌からのクローニングにより見出した。そして、該遺伝子を、プラスミドベクターに連結して酢酸菌に形質転換してコピー数を増幅させ、酢酸を含有する培地での生育を元株との間で比較した。その結果、コピー数を増幅させた形質転換株においては、酵素活性が上昇し、これに伴い、高濃度の酢酸を含む培地での生育が改善されることを見出した。さらに、該形質転換株を使用してアルコールを含有する培地で培養することにより、酢酸の生成速度や蓄積できる酢酸濃度が高まったことから、酢酸耐性が向上し、食酢の効率よい生産能を有しかつ高濃度の酢酸を生産することができる新規な酢酸菌を育種できたことを見出した。
本発明は、係る知見に基くものである。
【００１５】
すなわち、本発明は、下記の（１）〜（１７）を提供するものである。
（１）ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、フマレートヒドラターゼ、マレートキノンオキシドレダクターゼ、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）、ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素、ＮＡＤＨ脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、エノラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコネート脱水素酵素、及びホスホグルコネートデヒドラターゼからなる中央代謝系酵素群から選ばれる１又は２以上の酵素活性が増強されてなることを特徴とする酢酸存在下での生育能の向上した酢酸菌。
【００１６】
（２）ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、フマレートヒドラターゼ、マレートキノンオキシドレダクターゼ、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）、ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素、ＮＡＤＨ脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、エノラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコネート脱水素酵素、及びホスホグルコネートデヒドラターゼからなる中央代謝系酵素群から選ばれる１又は２以上の酵素活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入して発現させることによって酵素活性を増強することを特徴とする（１）記載の酢酸存在下での生育能の向上した酢酸菌の育種方法。
【００１７】
（３）ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする（２）に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号８４〜１１１２からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号８４〜１１１２からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１８】
（４）スクシニルＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする（２）に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１３０〜２２１８からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１３０〜２２１８からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、スクシニルＣｏＡ合成酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１９】
（５）フマレートヒドラターゼをコードする遺伝子が、下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡであることを特徴とする（２）に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列のうち、塩基番号２３〜１８１９からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列のうち、塩基番号２３〜１８１９からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、フマレートヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号８に記載の塩基配列のうち、塩基番号８５〜１４５８からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列表の配列番号８に記載の塩基配列のうち、塩基番号８５〜１４５８からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、フマレートヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２０】
（６）マレートキノンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする（２）に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８２〜１６７８からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８２〜１６７８からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、マレートキノンオキシドレダクターゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２１】
（７）ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする（２）に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、塩基番号８９〜１８９１からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、塩基番号８９〜１８９１からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２２】
（８）ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする（２）に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６〜１７７９からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６〜１７７９からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２３】
（９）ＮＡＤＨ脱水素酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＮＡＤＨ脱水素酵素複合体のサブユニットｎｕｏＭをコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項２に記載の酢酸菌の育種方法。
ＤＮＡであることを特徴とする（２）に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８６〜１７２７からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８６〜１７２７からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ＮＡＤＨ脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２４】
（１０）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする（２）に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１８記載の塩基配列のうち、塩基番号９１〜１１１３からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１８に記載の塩基配列のうち、塩基番号９１〜１１１３からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２５】
（１１）エノラーゼをコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする（２）に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列のうち、塩基番号６８〜１３９３からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列のうち、塩基番号６８〜１３９３からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、エノラーゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２６】
（１２）グルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする（２）に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列のうち、塩基番号７１〜１６００からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列のうち、塩基番号７１〜１６００からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２７】
（１３）６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする（２）に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１〜８７３からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１〜８７３からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２８】
（１４）６−ホスホグルコネート脱水素酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする（２）に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列のうち、塩基番号７２〜１０７０からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列のうち、塩基番号７２〜１０７０からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ホスホグルコネート脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２９】
（１５）ホスホグルコネートデヒドラターゼをコードする遺伝子が、下記の(a)又は(b)に示すＤＮＡであることを特徴とする（２）に記載の酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列のうち、塩基番号７８〜１９１６からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列のうち、塩基番号７８〜１９１６からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ホスホグルコネートデヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００３０】
（１６）酢酸菌が、グルコンアセトバクター属、又はアセトバクター属に属することを特徴とする（１）に記載の酢酸存在下での生育能の向上した酢酸菌。
（１７）（１）に記載の酢酸存在下での生育能の向上した酢酸菌を、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、酢酸菌に対して、酢酸存在下での生育能を高めることができる。そして、酢酸に対する耐性が顕著に向上する。その結果、培地中での酢酸発酵速度の向上や高濃度の酢酸を効率良く食酢を製造することができる。
本発明によれば、酢酸存在下での生育能が顕著に改善された酢酸菌が提供され、また、該酢酸菌を効率良く育種するための方法が提供される。この酢酸存在下での生育の向上した酢酸菌は、食酢の効率的な製造や高濃度の酢酸の製造に利用することができ、有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）酢酸存在下での生育能の向上した酢酸菌
本発明の酢酸存在下での生育能の向上した酢酸菌は、中央代謝系酵素群から選ばれる１又は２以上の酵素活性が増強されてなることを特徴とする。
本発明において、中央代謝系酵素群は、解糖系、ペントースリン酸経路、エントナー・ドードルフ経路、ＴＣＡ回路などを意味し、具体的には、ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、フマレートヒドラターゼ、マレートキノンオキシドレダクターゼ、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）、ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素、ＮＡＤＨ脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、エノラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコネート脱水素酵素、及びホスホグルコネートデヒドラターゼからなるものである。
ここで、酵素活性が増強されるとは、中央代謝系酵素群から選ばれる１又は２以上の酵素活性が、親株（元株）の酢酸菌の同じ酵素の活性を超えることを意味し、１．２倍以上を示すことを意味する。酵素活性を増強するための具体的な手段については、下記の（２）にて詳述する。
【００３３】
酢酸菌におけるこれらの中央代謝系酵素群の酵素活性は、例えば以下の方法で測定することができる。
まず、酢酸菌（元株）を、ＹＰＧ培地（グルコース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．２％、ｐＨ６．５）あるいはＹＰＧＥ培地（グルコース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．２％、エタノール２％、ｐＨ６．５。エタノール濃度は、培養中２％になるように制御）に植菌する。対数増殖後期の菌体あるいは定常期の菌体を使用して、調製した粗酵素液を測定対象とする。
ここで、酢酸菌としては、グルコンアセトバクター属又はアセトバクター属に属する酢酸菌を挙げることができ、具体例については、（２）において後述する通りである。中でも、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８株を用いることが好ましい。
【００３４】
粗酵素液としては、培養液を遠心分離して集菌し、得られた沈殿物を５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にけん濁・洗浄し、フレンチプレス（２０，０００ｐｓｉ）で２回処理した後、未破砕細胞を遠心分離で除去して調製した上澄を使用することができる。ただし、マレートキノンオキシドレダクターゼ及びＮＡＤＨ脱水素酵素については、上記細胞破砕液を超遠心分離（７００００ｒｐｍ、１時間）して得られた沈殿画分を粗酵素液として使用する。
酵素活性の測定方法は、各酵素ごとに、例えば以下のような条件で行うことができる。
【００３５】
ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素は、ＥＣ：１．１．１．４１として分類されている酵素を指し、その酵素活性は、ＮＡＤＰのかわりにＮＡＤを使用した以外は、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１３巻、ｐ．３０−ｐ．３３、１９６９年」に記載の方法に準じて測定できる。
【００３６】
スクシニルＣｏＡ合成酵素は、ＥＣ：６．２．１．５として分類されている酵素を指し、その酵素活性は、ＧＴＰをＡＴＰに変更し、ＮＡＤＨ溶液の濃度を１．６ｍＭに変更する以外は「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１３巻、ｐ．６２−ｐ．６９、１９６９年」に記載の方法に準じて測定できる。
【００３７】
フマレートヒドラターゼは、ＥＣ：４．２．１．２として分類されている酵素を指し、その酵素活性は、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）  １３巻、ｐ．９１−ｐ．９９、１９６９年」に記載の方法に準じて測定できる。
【００３８】
マレートキノンオキシドレダクターゼ（マレートキノン脱水素酵素）は、ＥＣ：１．１．９９．１６として分類されている酵素を指し、その酵素活性は、「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２５４巻、ｐ．３９５−ｐ．４０３、１９９８年」に記載の方法に準じて測定できる。
【００３９】
ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）は、ＥＣ：１．１．１．３８として分類されている酵素を指し、その酵素活性は、「バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ）９７巻、ｐ．２８４−ｐ．２９７、１９６５年」に記載の方法に準じて測定できる。
【００４０】
ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素は、ＥＣ：１．１．１．２８として分類されている酵素を指し、その酵素活性は、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）６８巻、ｐ．５１６−ｐ．５２２、２００４年」に記載の方法に準じて測定できる。
【００４１】
ＮＡＤＨ脱水素酵素は、ＥＣ：１．６．５．３として分類されている酵素を指し、ＮＡＤＨ脱水素酵素複合体としてサブユニットｎｕｏＭなどを含んでいる。その酵素活性は、「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２６巻、ｐ．７７３２−ｐ．７７３７、１９８７年」に記載の方法に準じて測定できる。
【００４２】
グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素は、ＥＣ：１．２．１．１２として分類されている酵素を指し、その酵素活性は、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）４１巻、ｐ．２６４−ｐ．２７３、１９７５年」に記載の方法に準じて測定できる。
【００４３】
エノラーゼは、ＥＣ：４．２．１．１１として分類されている酵素を指し、その酵素活性は、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）９巻、ｐ．６７０−ｐ．６７９、１９６６年」に記載の方法に準じて測定できる。
【００４４】
グルコース−６−リン酸脱水素酵素は、ＥＣ：１．１．１．４９として分類されている酵素を指し、その酵素活性は、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，６７巻，１２号，ｐ．２６４８−２６５１，２００３年」に記載の方法に準じて測定できる。
【００４５】
６−ホスホグルコノラクトナーゼは、ＥＣ：３．１．１．３１として分類されている酵素を指し、その酵素活性は、「プロシーディングス・ナチュラル・アカデミー・サイエンス  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，８２巻，１１号，ｐ．３８７６−３８７８，１９８５年」に記載の方法に準じて測定できる。
【００４６】
６−ホスホグルコネート脱水素酵素は、ＥＣ：１．１．１．４４として分類されている酵素を指し、その酵素活性は、「バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，６７巻，１２号，ｐ．２６４８−２６５１，２００３年」に記載の方法に準じて測定できる。
【００４７】
ホスホグルコネートデヒドラターゼは、ＥＣ：４．２．１．１２として分類されている酵素を指し、その酵素活性は、エントナー・ドードルフ経路全体の活性として「ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ），１０５巻，ｐ．１１−３１，２００３年」に記載の方法に準じて測定できる。
【００４８】
本発明の酢酸菌は、上述したような中央代謝系酵素群から選ばれる１又は２以上の酵素活性が増強されてなることにより、酢酸存在下での生育能が向上したものとなっている。すなわち、元株の場合は酢酸存在下では生育が阻害され増殖が伸び悩むが、本発明の酢酸菌は、酢酸存在下でも生育が阻害されず、増殖を続けることができる。
ここで、酢酸存在下での生育能が向上したことについては、例えば、元株の酢酸菌と酵素活性が増強されてなる酢酸菌とを、酢酸、エタノール、及び耐性遺伝子に対応する抗生物質（アンピシリンなど）を含むＹＰＧ培地にて２５〜３５℃で培養を行い、培地における生育（増殖度合い）を６６０ｎｍにおける吸光度を測定して比較することにより確認することができる。酢酸存在下での生育向上とは元株より短時間で吸光度が０．１以上となることを意味する。
【００４９】
このような本発明の酢酸菌としては、以下の１４種類の酢酸菌を挙げることができる。ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素の酵素活性が増強されてなるである。
これらの本発明の酢酸菌は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００５年２月２日又は２月２２日付けで寄託されており、その寄託番号は、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８／ｐＩＣＤがＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２５４、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８／ｐＳＵＣがＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２５７、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８／ｐＦＵＭＡがＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２５１、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８／ｐＦＵＭＣがＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２５２、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８／ｐＭＱＯがＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２１９、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８／ｐＭＡＬがＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２１８、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８／ｐＬＤＨがＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２１７、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８／ｐＮＤＨがＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２５５、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８／ｐＧＬＤがＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２５３、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８／ｐＥＮＯがＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２１１、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８／ｐＧ６ＰがＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２１５、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８／ｐＰＧＬがＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２２３、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８／ｐＰＧＤがＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２２１、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８／ｐＰＧＨがＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２５６である。
【００５０】
（２）本発明の育種方法
本発明の育種方法は、上記（１）で説明した酢酸存在下での生育能の向上した酢酸菌の育種方法であり、上記（１）で挙げた特定の中央代謝系酵素群から選ばれる１又は２以上の酵素活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入して発現させることによって酵素活性を増強することを特徴とする。
中央代謝系酵素群から選ばれる１又は２以上の酵素活性を示すタンパク質をコードする遺伝子とは、具体的には、以下の（Ａ）〜（Ｍ）に示す１３種類の遺伝子を意味する。
【００５１】
（Ａ）ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素をコードする遺伝子
ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素をコードする遺伝子としては、ＮＡＤ依存性イソクエン脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であれば、酢酸菌やシュワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）由来の遺伝子を用いることができる。尚、シュワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）のＳ０１５３８遺伝子は、ＮＣＢIデータベースにＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  ２４３４７３００として遺伝子の塩基配列及びコードするタンパク質のアミノ酸配列が公開されている。
このうち、特に、酢酸菌（アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株）由来のＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素をコードする遺伝子、つまり、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号８４〜１１１２からなるＤＮＡが好ましい。
【００５２】
また、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の本来のＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号８４〜１１１２からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。
ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００５３】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列は、Ｓ０１５３８遺伝子のコードするタンパク質とアミノ酸配列で５２％の相同性を示す。
【００５４】
（Ｂ）スクシニルＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子
スクシニルＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子としては、スクシニルＣｏＡ合成酵素活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であれば、酢酸菌や大腸菌由来の遺伝子を用いることができる。尚、大腸菌のｓｕｃＣｓｕｃＤオペロンを構成するｓｕｃＣ遺伝子及びｓｕｃＤ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに公開されており、各遺伝子のＧＩ  ｎｕｍｂｅｒは、ｓｕｃＣ遺伝子がＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２８７０３であり、ｓｕｃＤ遺伝子がＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２８７０４である。
このうち特に、酢酸菌（アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株）由来のスクシニルＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子、つまり、配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号５記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１３０〜２２１８からなるＤＮＡが好ましい。また、配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列及び配列番号６記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の本来のスクシニルＣｏＡ合成酵素活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１３０〜２２１８からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、スクシニルＣｏＡ合成酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。ストリンジェントな条件については、（Ａ）において述べたのと同様である。
【００５５】
上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡは、ＳｕｃＣ遺伝子とＳｕｃＤ遺伝子とのオペロンをなすものであり、ＳｕｃＣ部分は配列番号３記載の塩基配列のうち塩基番号１３０〜１３４１部分に対応し、ＳｕｃＤ部分は、同塩基配列のうち塩基番号１３４６〜２２１８部分に対応する。
配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列は、上記ｓｕｃＣｓｕｃＤオペロンのｓｕｃＣ遺伝子のコードするたんぱく質とアミノ酸配列で５３％の相同性を示す。
また、配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列は、上記オペロンのｓｕｃＤ遺伝子のコードするたんぱく質とアミノ酸配列で６４％の相同性を示す。
【００５６】
（Ｃ）フマレートヒドラターゼをコードする遺伝子
フマレートヒドラターゼをコードする遺伝子としては、フマレートヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であれば遺伝子であれば、酢酸菌や大腸菌由来の遺伝子を用いることができる。尚、大腸菌のｆｕｍＡ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２９５７０として公開されており、大腸菌のｆｕｍＣ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２９５６９として公開されている。
このうち特に、酢酸菌（アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株）由来のフマレートヒドラターゼをコードする遺伝子、つまり、配列表の配列番号７記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ａ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列のうち、塩基番号２３〜１８１９からなるＤＮＡが好ましい。また、配列表の配列番号７記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の本来のフマレートヒドラターゼ活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｂ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列のうち、塩基番号２３〜１８１９からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、フマレートヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。ストリンジェントな条件については、（Ａ）において述べたのと同様である。
【００５７】
同様に、配列番号９記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｃ）配列表の配列番号８に記載の塩基配列のうち、塩基番号８５〜１４５８からなるＤＮＡが好ましい。また、配列表の配列番号９記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の本来のフマレートヒドラターゼ活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｄ）配列表の配列番号８に記載の塩基配列のうち、塩基番号８５〜１４５８からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、フマレートヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。ストリンジェントな条件については、（Ａ）において述べたのと同様である。
【００５８】
配列表の配列番号７記載のアミノ酸配列は、ｆｕｍＡ遺伝子のコードするたんぱく質とアミノ酸配列で６３％の相同性を示す。また、配列表の配列番号９記載のアミノ酸配列は、酢酸菌由来のｆｕｍＣ遺伝子のコードするたんぱく質とアミノ酸配列で５５％の相同性を示す。
【００５９】
（Ｄ）マレートキノンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子
マレートキノンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子としては、マレートキノンオキシドレダクターゼ活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であれば、酢酸菌や大腸菌由来の遺伝子を用いることができる。尚、大腸菌のｙｏｊＨ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１３０１４７として公開されている。
このうち特に、酢酸菌（アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株）由来のマレートキノンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子、つまり、配列表の配列番号１１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ａ）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８２〜１６７８からなるＤＮＡが好ましい。
【００６０】
また、配列表の配列番号１１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の本来のマレートキノンオキシドレダクターゼ活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｂ）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８２〜１６７８からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、マレートキノンオキシドレダクターゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。ストリンジェントな条件については、（Ａ）において述べたのと同様である。
【００６１】
配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列は、ｙｏｊＨ遺伝子とコードするタンパク質とアミノ酸配列で５９％の相同性を示す。
【００６２】
（Ｅ）ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）をコードする遺伝子
ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）をコードする遺伝子としては、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であれば、酢酸菌や大腸菌由来の遺伝子を用いることができる。尚、大腸菌のｓｆｃＡ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２９４３８として公開されている。
このうち特に、酢酸菌（アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株）由来のＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）をコードする遺伝子、つまり、配列表の配列番号１３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ａ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、塩基番号８９〜１８９１からなるＤＮＡが好ましい。
【００６３】
また、配列表の配列番号１３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の本来のＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｂ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、塩基番号８９〜１８９１からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。ストリンジェントな条件については、（Ａ）において述べたのと同様である。
【００６４】
配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配列は、ｓｆｃＡ遺伝子とコードするタンパク質とアミノ酸配列で４４％の相同性を示すと共に、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）において共通に保存されているモチーフＰｆａｍ００３９０ともｓｃｏｒｅ７２８．２の高い相同性を有している。
【００６５】
（Ｆ）ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子
ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子としては、ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であれば、酢酸菌や大腸菌由来の遺伝子を用いることができる。尚、大腸菌のｄｌｄ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１３００７１として公開されている。
このうち特に、酢酸菌（アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株）由来のＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子、つまり、配列表の配列番号１５記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ａ）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６〜１７７９からなるＤＮＡが好ましい。
【００６６】
また、配列表の配列番号１５記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の本来のＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｂ）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列のうち、塩基番号４６〜１７７９からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。ストリンジェントな条件については、（Ａ）において述べたのと同様である。
【００６７】
配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列は、ｄｌｄ遺伝子とコードするタンパク質とアミノ酸配列で５８％の相同性を示す。
【００６８】
（Ｇ）ＮＡＤＨ脱水素酵素をコードする遺伝子
ＮＡＤＨ脱水素酵素をコードする遺伝子としては、ＮＡＤＨ脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、酢酸菌や大腸菌由来の遺伝子を用いることができる。また、ＮＡＤＨ脱水素酵素複合体をコードする全ての遺伝子を用いてもよいが、サブユニットの１つ又は２つ以上の遺伝子を用いることもできる。尚、大腸菌のｎｕｏオペロン中のｎｕｏＭ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１３０２１２として公開されている。
このうち特に、酢酸菌（グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８株）由来のＮＡＤＨ脱水素酵素複合体のサブユニットｎｕｏＭをコードする遺伝子（ｎｕｏＭ遺伝子）、つまり、配列表の配列番号１７記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ａ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８６〜１７２７からなるＤＮＡが好ましい。
【００６９】
また、配列表の配列番号１７記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の本来のＮＡＤＨ脱水素酵素活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｂ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８６〜１７２７からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ＮＡＤＨ脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。ストリンジェントな条件については、（Ａ）において述べたのと同様である。
【００７０】
配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列は、ｎｕｏＭ遺伝子をコードするタンパク質とアミノ酸配列で３６％の相同性を示す。
【００７１】
（Ｈ）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子
グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子としては、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であれば、酢酸菌や大腸菌由来の遺伝子を用いることができる。尚、大腸菌のｇａｐＡ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２９７３３として公開されている。
このうち特に、酢酸菌（アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株）由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子、つまり、配列表の配列番号１９記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ａ）配列表の配列番号１８記載の塩基配列のうち、塩基番号９１〜１１１３からなるＤＮＡが好ましい。
【００７２】
また、配列表の配列番号１９記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の本来のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｂ）配列表の配列番号１８に記載の塩基配列のうち、塩基番号９１〜１１１３からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。ストリンジェントな条件については、（Ａ）において述べたのと同様である。
【００７３】
配列表の配列番号１９に記載のアミノ酸配列は、ｇａｐＡ遺伝子をコードするタンパク質とアミノ酸配列で４８％の相同性を示すと共に、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素において共通に保存されているモチーフＰｆａｍ０００４４ともｓｃｏｒｅ６３０．２の高い相同性を有している。
【００７４】
（Ｉ）エノラーゼをコードする遺伝子
エノラーゼをコードする遺伝子としては、エノラーゼ活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であれば、酢酸菌や大腸菌由来の遺伝子を用いることができる。尚、大腸菌のｅｎｏ遺伝子の塩基配列及びコードするタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１３０６８６として公開されている。
このうち特に、酢酸菌（アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株）由来のエノラーゼをコードする遺伝子、つまり、配列表の配列番号２１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ａ）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列のうち、塩基番号６８〜１３９３からなるＤＮＡが好ましい。
【００７５】
また、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の本来のエノラーゼ活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｂ）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列のうち、塩基番号６８〜１３９３からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、エノラーゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。ストリンジェントな条件については、（Ａ）において述べたのと同様である。
【００７６】
配列表の配列番号２１に記載のアミノ酸配列は、ｅｎｏ遺伝子をコードするタンパク質とアミノ酸配列で５２％の相同性を示すと共に、エノラーゼにおいて共通に保存されているモチーフＰｆａｍ００１１３ともｓｃｏｒｅ６７８．２の高い相同性を有している。
【００７７】
（Ｊ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子
グルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子としては、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であれば、酢酸菌や大腸菌由来の遺伝子を用いることができる。尚、大腸菌のｚｗｆ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子のコードするタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２９８０５として公開されている。
このうち特に、酢酸菌（アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株）由来のグルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子、つまり、配列表の配列番号２３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ａ）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列のうち、塩基番号７１〜１６００からなるＤＮＡが好ましい。
【００７８】
また、配列表の配列番号２３記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の本来のグルコース−６−リン酸脱水素酵素活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｂ）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列のうち、塩基番号７１〜１６００からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。ストリンジェントな条件については、（Ａ）において述べたのと同様である。
【００７９】
配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列は、ｚｗｆ遺伝子をコードするタンパク質とアミノ酸配列で３９％の相同性を示す。
【００８０】
（Ｋ）６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子
６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子としては、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であれば、酢酸菌やメソリゾビウム・ロチ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）由来の遺伝子を用いることができる。尚、メソリゾビウム・ロチ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）のｍｌ１６５１４遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １３４７５４４４として公開されている。
このうち特に、酢酸菌（アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株）由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子、つまり、配列表の配列番号２５記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ａ）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１〜８７３からなるＤＮＡが好ましい。
【００８１】
また、配列表の配列番号２５記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の本来の６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｂ）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１〜８７３からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。ストリンジェントな条件については、（Ａ）において述べたのと同様である。
【００８２】
配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列は、ｍｌ１６５１４遺伝子をコードするタンパク質とアミノ酸配列で３２％の相同性を示す。
【００８３】
（Ｌ）６−ホスホグルコネート脱水素酵素をコードする遺伝子
６−ホスホグルコネート脱水素酵素をコードする遺伝子としては、６−ホスホグルコネート脱水素酵素を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば、酢酸菌や大腸菌由来の遺伝子を用いることができる。尚、大腸菌のｇｎｄ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２９９７０として公開されている。
このうち特に、酢酸菌（アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株）由来の６−ホスホグルコネート脱水素酵素をコードする遺伝子、つまり、配列表の配列番号２７記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ａ）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列のうち、塩基番号７２〜１０７０からなるＤＮＡが好ましい。
【００８４】
また、配列表の配列番号２７記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の本来の６−ホスホグルコネート脱水素酵素活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｂ）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列のうち、塩基番号７２〜１０７０からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ホスホグルコネート脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。ストリンジェントな条件については、（Ａ）において述べたのと同様である。
【００８５】
配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列は、ｇｎｄ遺伝子をコードするタンパク質とアミノ酸配列で３５％の相同性を示す。
【００８６】
（Ｍ）ホスホグルコネートデヒドラターゼをコードする遺伝子
ホスホグルコネートデヒドラターゼをコードする遺伝子としては、ホスホグルネートヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であれば、酢酸菌や大腸菌由来の遺伝子を用いることができる。尚、大腸菌のｅｄｄ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２９８０４として公開されている。
このうち特に、酢酸菌（アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株）由来のホスホグルコネートデヒドラターゼをコードする遺伝子、つまり、配列表の配列番号２９記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ａ）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列のうち、塩基番号７８〜１９１６からなるＤＮＡが好ましい。
【００８７】
また、配列表の配列番号２９記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の本来のホスホグルコネートデヒドラターゼ活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、具体的には、（ｂ）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列のうち、塩基番号７８〜１９１６からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ホスホグルコネートデヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。ストリンジェントな条件については、（Ａ）において述べたのと同様である。
【００８８】
配列表の配列番号２９に記載のアミノ酸配列は、ｅｄｄ遺伝子をコードするタンパク質とアミノ酸配列で５８％の相同性を示す。
【００８９】
上記（Ａ）〜（Ｍ）に挙げた各中央代謝系酵素群から選ばれた各酵素活性を示すタンパク質をコードする遺伝子の入手方法については、特に限定されないが、上記したように、大腸菌、シュワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）、メソリゾビウム・ロチ（Mesorhizobium loti）、酢酸菌などの微生物においては、各酵素遺伝子の塩基配列が明らかであることから、該配列から設計したプライマーやプローブを利用してこれらの微生物のゲノムＤＮＡから入手することができる。
例えば、各遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、酢酸菌（例えば、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株やグルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288））、大腸菌（例えば、大腸菌Ｋ−１２株）、シュワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）（例えば、ＭＲ−１株（ＡＴＣＣ７００５５０））、メソリゾビウム・ロチ（Mesorhizobium loti）（例えば、ＭＡＦＦ３０３０９９（独立行政法人農業生物資源研究所から分譲可能））などのゲノムＤＮＡ、好ましくは酢酸菌（特にアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株やグルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288））のＤＮＡを鋳型として用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）（トレンズ・オブ・ジェネティックス（Trends Genet．）５巻，１８５頁，１９８９年）によって得ることができる。ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ２４００などを用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用して、定法に従って行なうことができる。
【００９０】
また、上記塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ゲノムＤＮＡライブラリーを用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。
一方、上述のような天然の微生物に由来するものではなく、各遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列を自動合成機などで化学的に合成したものを用いることもできる。
【００９１】
また、各酵素活性を示すタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードする遺伝子は、コードされるタンパク質の本来の酵素活性が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするＤＮＡ、すなわち、本来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ本来の酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡであっても良いとしたが、このような実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換又は付加されるように塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
【００９２】
更に、タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、一般的に、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られている。従って、各酵素活性を示すタンパク質を酢酸菌全般、中でもグルコンアセトバクター属やアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることができる場合は、上記のような各酵素活性を示すタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、グルコンアセトバクター属やアセトバクター属に属する酢酸菌、又は変異処理したグルコンアセトバクター属やアセトバクター属に属する酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から単離され得る。
【００９３】
酵素活性の増強株の取得は、例えば、上記遺伝子を酢酸菌の細胞に導入してアナログ耐性変異株を取得する方法、上記遺伝子の酢酸菌細胞内のコピー数を増幅する方法によることができる。また、上記遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を酢酸菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて、酢酸菌を形質転換する方法によって、酵素活性を増強することもできる。
【００９４】
上記遺伝子の細胞内コピー数増幅は、上記遺伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター属細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、上記遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等の組換えベクターを、酢酸菌、すなわち、グルコンアセトバクター属やアセトバクター属に属する酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
プラスミドとしては、ｐＵＦ１０６（例えば、「セルロース（Cellulose）、ｐ．１５３−１５８（１９８９年）参照」、ｐＭＶ２４（例えば、「アプライド・アンド・エンバイロマンタル・マイクロバイオロジー（Appl．Environ．Microbiol．）」、５５巻、ｐ．１７１−１７６（１９８９年）参照）、ｐＧＩ１８（例えば、本願明細書参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特開昭６０−９４８８号公報参照）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric．Biol．Chem．）」、５２巻、ｐ．３１２５−３１２９（１９８８年）参照）も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
尚、細胞内で増幅させる遺伝子は、上記したような中央代謝系酵素群から選ばれる１又は２以上の酵素活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であれば、特に起源は問わないが、酢酸菌由来の遺伝子の方が酢酸菌での発現が容易であり、特に好ましい。
【００９５】
グルコンアセトバクター属やアセトバクター属の酢酸菌への遺伝子の導入は、塩化カルシュウム法（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric．Biol．Chem．）４９巻，p.２０９１，１９８５年）やエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．）、５８巻、９７４頁、１９９４年）等によって行なうことができる。
【００９６】
マルチコピーベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
ここで、マルチコピーベクターに遺伝子を挿入する場合には、その遺伝子の機能が発揮されるような条件を選択することが必要である。そこで、マルチコピーベクターに遺伝子を挿入して組換えベクターを得る際には、プロモーター及び遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。
なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００９７】
また、染色体ＤＮＡ上の酵素遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列に置き換えるには、相同組換え用のベクターを構築し、該ベクターを用いて微生物の染色体に相同組換えを起こすようにすればよい。そのようなプロモーター配列としては、例えば、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなど、酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列が挙げられる。相同組換えを行うためのベクターの構築に関しては当業者に周知である。このようにして微生物における内因性の酵素遺伝子を強力なプロモーターの制御下に配置することによって、該酵素遺伝子からのコピー数が増幅され、発現が増強される。
【００９８】
ここで、遺伝子の導入対象となる酢酸菌としては、グルコンアセトバクター属又はアセトバクター属に属する酢酸菌を挙げることができる。
グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）に属する酢酸菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、具体的には、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウスＤＳＭ６１６０（Gluconacetobacter europaeus DSM6160）株、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカスＡＴＣＣ４９０３７（Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037）株、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）としてはアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８４年２月２３日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）を用いることができる。
【００９９】
アセトバクター属（Acetobacter）に属する酢酸菌として、具体的にはアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、具体的には、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８３年６月２７日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）、グルコンアセトバクター・キシリヌスＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（Acetobacter aceti IFO3283）株などを用いることができる。
【０１００】
上記のようにして、該遺伝子のコピー数が増幅されたことにより酢酸耐性が選択的に増強された酢酸菌を効率良く育種することができる。酢酸耐性が増強されたことの確認については、前記（１）において述べたとおりである。
【０１０１】
（３）本発明の食酢の製造方法
本発明の食酢の製造方法は、前記（１）で述べたような本発明の酢酸存在下での生育能の向上した酢酸菌を、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする。
【０１０２】
本発明の製造方法における酢酸菌のアルコールを含有する培地における培養は、いわゆる酢酸発酵が可能な条件で行なえば良く、具体的には、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行なえば良い。
アルコールを含有する培地としては、酢酸発酵に使用する培地であれば良く、エタノールなどのアルコール成分の他、炭素源、窒素源、無機物等を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものを用いることができる。培地は、合成培地でも天然培地でも良い。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【０１０３】
また、培養条件は、静置培養法、振盪培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は２５〜３５℃、通常３０℃とする。培地のｐＨは、通常は２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することができる。通常１〜２１日間培養することによって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。
このような本発明の食酢の製造方法により、高酸度の食酢を効率よく製造することができる。
【実施例】
【０１０４】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
（製造例１）大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の作成
酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８は、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来の約３．１ｋｂのプラスミドｐＧＩ１とｐＵＣ１８とから作製した。
すなわち、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の培養液より、菌体を集菌し、水酸化ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウムを用いて溶菌後、フェノール処理し、更にエタノールによりプラスミドＤＮＡを精製した。
【０１０５】
得られたプラスミドは、ＨｉｎｃＩＩで３ヶ所、また、ＳｆｉＩで１ヶ所の認識部位を有する環状二本鎖ＤＮＡプラスミドであり、プラスミド全体の長さは約３１０００塩基対（ｂｐ）であった。また、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位は有していなかった。
このプラスミドをｐＧＩ１と命名し、ベクターｐＧＩ１８の作製に用いた。
上記で得られたプラスミドｐＧＩ１を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法によって増幅し、ＡａｔＩＩで切断した。この断片をｐＵＣ１８の制限酵素ＡａｔＩＩ切断部位に挿入し、プラスミドｐＧＩ１８を作製した（図１）。
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。即ち、鋳型としてプラスミドｐＧＩ１を用い、プライマーとして制限酵素ＡａｔＩＩ認識部位を有するプライマーＡ（配列番号３０）及びプライマーＢ（配列番号３１）を用い、下記のＰＣＲ条件にて、ＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ３分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【０１０６】
図１に示すように、得られたプラスミドｐＧＩ１８はｐＵＣ１８及びｐＧＩ１のいずれも含有していて、全体の長さは約５８００塩基対（５．８ｋｂｐ）であった。
このプラスミドｐＧＩ１８の塩基配列を配列表の配列番号３２に示した。
【０１０７】
（実施例１）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸存在下での生育の向上
（１）ＮＡＤ依存性イソクエン脱水素酵素遺伝子のクローニング
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）を、６％酢酸と４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン含有）中で、３０℃にて２４０〜３３６時間振盪培養を行なった。
培養終了後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。
【０１０８】
得られた菌体より、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により、染色体ＤＮＡを調製した。
すなわち、該菌体をＴＥ緩衝液で洗浄後、ＴＥＳ緩衝液を加えて菌体を懸濁し、リゾチーム液を加えて静置し、ＥＤＴＡ液を加えて３７℃で２０分間反応させた。反応後、ラウリル硫酸ナトリウムを加え、３７℃で２０分間静置したのち、食塩水を加え、０℃で一夜静置した。次いで、遠心分離を行ない、上清を得た。この上清にポリエチレングリコール６０００を加え、４℃で一夜静置した後、遠心分離を行ない、ＤＮＡを含む沈殿物を得た。
【０１０９】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、また、プライマーとして、プライマー１（配列表の配列番号３３記載の塩基配列参照）およびプライマー２（配列表の配列番号３４記載の塩基配列参照）を用いて、ＰＣＲ法により、ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ法は、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ２分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
その結果、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。この配列番号１記載の塩基配列は、塩基番号８４〜１１１２部分にＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素遺伝子のＯＲＦ（配列番号２記載のアミノ酸配列に対応）を含む。
このＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【０１１０】
このようにして調製したＤＮＡを大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株にエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．），５８巻，９７４頁，１９９４年参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。上記選択培地で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、ｐＵＣ１８由来のｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターと同じ転写方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＩＣＤを保持しているクローンを選択し、配列表１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保持していることを確認した。得られた形質転換株から、定法により、プラスミドＤＮＡを調製してｐＩＣＤを得た。
【０１１１】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＩＣＤを用いて、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８をエレクトロポレーション法（「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４（１９９０年）参照）」によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、ｐＩＣＤを保有していることが確認された。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８／ｐＩＣＤ株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月２２日付けで寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２５４である。
【０１１２】
ｐＩＣＤの形質転換株とベクターｐＧＩ１８のみを保有する元株をＹＰＧ培地で２日間培養し、得られた菌体の細胞破砕液のＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素の活性を、ＮＡＤＰの代わりにＮＡＤを使用した以外は「メソッズ・イン・エンザイモロジー（（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１３巻，ｐ．３０−ｐ．３３、１９６９年）」に記載の方法に準じて測定した。その結果を表1に示した。
【０１１３】
【表１】
2006246701.tif 000002
【０１１４】
表１に示すように、形質転換株のＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素の活性は、元株のそれに比べて高かったことから、酢酸菌のＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素遺伝子を酢酸菌に導入して発現させることによって該酵素活性が増強されることが明らかとなった。
また、上記のようにして得られたプラスミドｐＩＣＤを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
具体的には、酢酸３％、エタノール３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
各菌株の結果を表２に示す。
【０１１５】
【表２】
2006246701.tif 000003
【０１１６】
表２から明らかなように、３％酢酸を添加した培地において、形質転換株は旺盛に増殖したのに対し、元株はほとんど増殖しなかった。
このことから、ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素活性を増強させた酢酸菌は、酢酸存在下で高い生育能を示し、生育促進機能が発揮されていることが確認できた。
【０１１７】
（実施例２）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のスクシニルＣｏＡ合成酵素遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸存在下での生育の向上
（１）スクシニルＣｏＡ合成酵素遺伝子のクローニング
実施例１に記載したのと同様な方法で調製したグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の染色体ＤＮＡを鋳型として、また、プライマーとして、プライマー３（配列表の配列番号３５記載の塩基配列参照）およびプライマー４（配列表の配列番号３６記載の塩基配列参照）を用いて、実施例１と同様な条件でＰＣＲ法を実施して、スクシニルＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
その結果、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。この配列番号３記載の塩基配列は、塩基番号１３０〜１３４１部分及び塩基番号１３４６〜２２１８部分にスクシニルＣｏＡ合成酵素遺伝子の２つのＯＲＦ（それぞれｓｕｃＣ部分（配列番号４記載のアミノ酸配列に対応）及びｓｕｃＤ部分（配列番号５記載のアミノ酸配列に対応））を含む。
このＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【０１１８】
このようにして調製したＤＮＡを実施例１と同様な方法で大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＵＣ１８由来のｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターと同じ転写方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＳＵＣを保有する形質転換株を得、得られた形質転換株から、定法により、プラスミドＤＮＡを調製してｐＳＵＣを得た。
【０１１９】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＳＵＣを用いて、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８を実施例１と同様な方法で形質転換し、形質転換株を取得した。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８／ｐＳＵＣ株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月２２日付けで寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２５７である。
【０１２０】
ｐＳＵＣの形質転換株とベクターｐＧＩ１８のみを保有する元株をＹＰＧ培地で２日間培養し、得られた菌体の細胞破砕液のスクシニルＣｏＡ合成酵素活性を、ＧＴＰをＡＴＰに変更すると共にＮＡＤＨ溶液の濃度を１．６ｍＭに変更した以外は「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１３巻、ｐ．６２−ｐ．６９、１９６９年」に記載の方法に準じて測定した。その結果を表３に示した。
【０１２１】
【表３】
2006246701.tif 000004
【０１２２】
表３に示すように、形質転換株のスクシニルＣｏＡ合成酵素の活性は、元株のそれに比べて高かったことから、酢酸菌のスクシニルＣｏＡ合成酵素遺伝子を酢酸菌に導入して発現させることによって該酵素活性が増強されることが明らかとなった。
また、上記のようにして得られたプラスミドｐＳＵＣを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、実施例１と同様な方法で酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育をＯＤ６６０ｎｍで測定して、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
各菌株の結果を表４に示す。
【０１２３】
【表４】
2006246701.tif 000005
【０１２４】
その結果、表４に示すように、３％酢酸を添加した培地において、形質転換株は旺盛に増殖したのに対し、元株はほとんど増殖しなかった。
このことから、スクシニルＣｏＡ合成酵素活性を増強させた酢酸菌は、酢酸存在下で高い生育能を示し、生育促進機能が発揮されていることが確認できた。
【０１２５】
（実施例３）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のフマレートヒドラターゼ遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸存在下での生育の向上
（１）フマレートヒドラターゼ遺伝子のクローニング
実施例１に記載したのと同様な方法で調製したグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の染色体ＤＮＡを鋳型として、また、プライマーとして、プライマー５（配列表の配列番号３７記載の塩基配列参照）およびプライマー６（配列表の配列番号３８記載の塩基配列参照）を用いて、実施例１と同様な条件でＰＣＲ法を実施して、フマレートヒドラターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
その結果、配列表の配列番号６記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。この配列番号６記載の塩基配列は、塩基番号２３〜１８１９部分にフマレートヒドラターゼＡ遺伝子のＯＲＦ（配列番号７記載のアミノ酸配列に対応）を含む。
このＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入してＤＮＡを調製した。
【０１２６】
このようにして調製したＤＮＡを実施例１と同様な方法で大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＵＣ１８由来のｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターと同じ転写方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＦＵＭＡを保有する形質転換株を得、得られた形質転換株から定法によりプラスミドＤＮＡを調製してｐＦＵＭＡを得た。
【０１２７】
一方、アセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４の染色体ＤＮＡを鋳型として、また、プライマーとして、プライマー７（配列表の配列番号３９記載の塩基配列参照）およびプライマー８（配列表の配列番号４０記載の塩基配列参照）を用いて、実施例１と同様な条件でＰＣＲ法を実施して、フマレートヒドラターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
その結果、配列表の配列番号８記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。この配列番号８記載の塩基配列は、塩基番号８５〜１４５８部分にフマレートヒドラターゼＣ遺伝子のＯＲＦ（配列番号９記載のアミノ酸配列に対応）を含む。
得られたＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【０１２８】
このようにして調製したＤＮＡを実施例１と同様な方法で大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＵＣ１８由来のｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターと同じ転写方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＦＵＭＣを保有する形質転換株を得、得られた形質転換株から定法によりプラスミドＤＮＡを調製してｐＦＵＭＣを得た。
【０１２９】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＦＵＭＡおよびｐＦＵＭＣを用いてグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８を実施例１と同様な方法で形質転換し、形質転換株を取得した。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８／ｐＦＵＭＡ株および形質転換株ＪＭ１０９／ｐＦＵＭＣ株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月２２日付けで寄託されており、それぞれの寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２５１およびＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２５２である。
【０１３０】
ｐＦＵＭＡの形質転換株およびｐＦＵＭＣの形質転換株と、ベクターｐＧＩ１８のみを保有する元株を、ＹＰＧ培地で２日間培養し、得られた菌体の細胞破砕液のフマレートヒドラターゼ活性を、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）  １３巻、ｐ．９１−ｐ．９９、１９６９年」に記載の方法に準じて測定した。その結果を表５に示した。
【０１３１】
【表５】
2006246701.tif 000006
【０１３２】
表５に示すように、各形質転換株のフマレートヒドラターゼ活性は、元株のそれに比べて高かったことから、酢酸菌のフマレートヒドラターゼ遺伝子を酢酸菌に導入して発現させることによって該酵素活性が増強されることが明らかとなった。
また、上記のようにして得られたプラスミドｐＦＵＭＡを保有するアンピシリン耐性の形質転換株およびプラスミドｐＦＵＭＣを保有するアンピシリン耐性の形質転換株のそれぞれについて、実施例１と同様な方法で酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育をＯＤ６６０ｎｍで測定して、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
各菌株の結果を表６に示す。
【０１３３】
【表６】
2006246701.tif 000007
【０１３４】
その結果、表６に示すように、３％酢酸を添加した培地において、形質転換株は旺盛に増殖したのに対し、元株はほとんど増殖しなかった。
このことから、フマレートヒドラターゼ遺伝子を増強させた酢酸菌は、酢酸存在下で高い生育能を示し、生育促進機能が発揮されていることが確認できた。
【０１３５】
（実施例４）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のマレートキノンオキシドレダクターゼ遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸存在下での生育の向上
（１）マレートキノンオキシドレダクターゼ（脱水素酵素）遺伝子のクローニング
実施例１に記載したのと同様な方法で調製したグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の染色体ＤＮＡを鋳型として、また、プライマーとして、プライマー９（配列表の配列番号４１記載の塩基配列参照）およびプライマー１０（配列表の配列番号４２記載の塩基配列参照）を用いて、実施例１と同様な条件でＰＣＲ法を実施して、マレートキノン脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
その結果、配列表の配列番号１０記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。この配列番号１０記載の塩基配列は、塩基番号１８２〜１６７８部分にマレートキノンオキシドレダクターゼ遺伝子のＯＲＦ（配列番号１１記載のアミノ酸配列に対応）を含む。
このＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【０１３６】
このようにして調製したＤＮＡを実施例１と同様な方法で大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＵＣ１８由来のｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターと同じ転写方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＭＱＯを保有する形質転換株を得、得られた形質転換株から定法によりプラスミドＤＮＡを調製してｐＭＱＯを得た。
【０１３７】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＭＱＯを用いてグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８を実施例１と同様な方法で形質転換し、形質転換株を取得した。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８／ｐＭＱＯ株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月２日付けで寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２１９である。
【０１３８】
ｐＭＱＯの形質転換株とベクターｐＧＩ１８のみを保有する元株を、ＹＰＧ培地で２日間培養し、得られた菌体の細胞破砕液のマレートキノンオキシドレダクターゼ活性を、「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２５４巻、ｐ．３９５−ｐ．４０３、１９９８年」に記載の方法に準じて測定した。その結果を表７に示した。
【０１３９】
【表７】
2006246701.tif 000008
【０１４０】
表７に示すように、各形質転換株のマレートキノンオキシドレダクターゼ活性は、元株のそれに比べて高かったことから、酢酸菌のマレートキノンオキシドレダクターゼ遺伝子を酢酸菌に導入して発現させることによって該酵素活性が増強されることが明らかとなった。
また、上記のようにして得られたプラスミドｐＭＱＯを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、実施例１と同様な方法で酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育をＯＤ６６０ｎｍで測定して、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
各菌株の結果を表８に示す。
【０１４１】
【表８】
2006246701.tif 000009
【０１４２】
その結果、表８に示すように、３％酢酸を添加した培地で、形質転換株は旺盛に増殖したのに対して、元株はほとんど増殖しなかった。
このことから、マレートキノンオキシドレダクターゼ遺伝子を増強させた酢酸菌は、酢酸存在下で高い生育能を示し、生育促進機能が発揮されていることが確認できた。
【０１４３】
（実施例５）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸存在下での生育の向上
（１）ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）遺伝子のクローニング
実施例１に記載したのと同様な方法で調製したグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の染色体ＤＮＡを鋳型として、また、プライマーとして、プライマー１１（配列表の配列番号４３記載の塩基配列参照）およびプライマー１２（配列表の配列番号４４記載の塩基配列参照）を用いて、実施例１と同様な条件でＰＣＲ法を実施して、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
その結果、配列表の配列番号１２記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。この配列番号１２記載の塩基配列は、塩基番号８９〜１８９１部分に大腸菌のＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）遺伝子をコードするｓｆｃＡと４４％の相同性を有すると共に、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）において共通に保存されているモチーフＰｆａｍ００３９０ともｓｃｏｒｅ７２８．２の高い相同性を有していた。このことから配列番号１２記載の塩基配列は、塩基番号８９〜１８９１部分にＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）遺伝子のＯＲＦ（配列番号１３記載のアミノ酸配列に対応）を含むことが確認できた。
このＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【０１４４】
このようにして調製したＤＮＡを実施例１と同様な方法で大腸菌（Escherichia  coli）ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＵＣ１８由来のｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターと同じ転写方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＭＡＬを保有する形質転換株を得、得られた形質転換株から定法によりプラスミドＤＮＡを調製してｐＭＡＬを得た。
【０１４５】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＭＡＬを用いてグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter  xylinus）ＩＦＯ３２８８を実施例１と同様な方法で形質転換し、形質転換株を取得した。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter  xylinus）ＩＦＯ３２８８／ｐＭＡＬ株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月２日付けで寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２１８である。
【０１４６】
また、上記のようにして得られたプラスミドｐＭＡＬを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、実施例１と同様な方法で酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育をＯＤ６６０ｎｍで測定して、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
各菌株の結果を表９に示す。
【０１４７】
【表９】
2006246701.tif 000010
【０１４８】
その結果、表９に示すように、３％酢酸を添加した培地で、形質転換株は旺盛に増殖したのに対して、元株はほとんど増殖しなかった。
このことから、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）遺伝子を増強させた酢酸菌は、酢酸存在下で高い生育能を示し、生育促進機能が発揮されていることが確認できた。
【０１４９】
（実施例６）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸存在下での生育の向上
（１）ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素遺伝子のクローニング
実施例１に記載したのと同様な方法で調製したグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の染色体ＤＮＡを鋳型として、また、プライマーとして、プライマー１３（配列表の配列番号４５記載の塩基配列参照）およびプライマー１４（配列表の配列番号４６記載の塩基配列参照）を用いて、実施例１と同様な条件でＰＣＲ法を実施して、ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
その結果、配列表の配列番号１４記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。この配列番号１４記載の塩基配列は、塩基番号４６〜１７７９部分にＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素遺伝子のＯＲＦ（配列番号１５記載のアミノ酸配列に対応）を含む。
得られたＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【０１５０】
このようにして調製したＤＮＡを実施例１と同様な方法で大腸菌（Escherichia  coli）ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＵＣ１８由来のｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターと同じ転写方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＬＤＨを保有する形質転換株を得、得られた形質転換株から定法によりプラスミドＤＮＡを調製してｐＬＤＨを得た。
【０１５１】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＬＤＨを用いて、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８を実施例１と同様な方法で形質転換し、形質転換株を取得した。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter  xylinus）ＩＦＯ３２８８／ｐＬＤＨ株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月２日付けで寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２１７である。
【０１５２】
ｐＬＤＨの形質転換株とベクターｐＧＩ１８のみを保有する元株をＹＰＧ培地で２日間培養し、得られた菌体の細胞破砕液のＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素活性は、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）６８巻、ｐ．５１６−ｐ．５２２、２００４年」に記載の方法に準じて測定した。その結果を表１０に示した。
【０１５３】
【表１０】
2006246701.tif 000011
【０１５４】
表１０に示すように、各形質転換株のＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素活性は、元株のそれに比べて高かったことから、酢酸菌のＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素遺伝子を酢酸菌に導入して発現させることによって該酵素活性が増強されることが明らかとなった。
上記のようにして得られたプラスミドｐＬＤＨを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、実施例１と同様な方法で酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育をＯＤ６６０ｎｍで測定して、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
各菌株の結果を表１１に示す。
【０１５５】
【表１１】
2006246701.tif 000012
【０１５６】
その結果、表１１に示すように、３％酢酸を添加した培地で、形質転換株は旺盛に増殖したのに対して、元株はほとんど増殖しなかった。
このことから、ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素遺伝子を増強させた酢酸菌は、酢酸存在下で高い生育能を示し、生育促進機能が発揮されていることが確認できた。
【０１５７】
（実施例７）グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）由来のＮＡＤＨ脱水素酵素複合体のサブユニットｎｕｏＭをコードする遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸存在下での生育の向上
（１）ＮＡＤＨ脱水素酵素複合体のサブユニットｎｕｏＭをコードする遺伝子のクローニング
グルコンアセトバクター・キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８株をＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン含有）中で、３０℃にて２４時間振盪培養を行ない、該菌株を用いた他は実施例１に記載したのと同様な方法で、調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、また、プライマーとして、プライマー１５（配列表の配列番号４７記載の塩基配列参照）およびプライマー１６（配列表の配列番号４８記載の塩基配列参照）を用いて、実施例１と同様な条件でＰＣＲ法を実施して、ＮＡＤＨ脱水素酵素複合体のサブユニットｎｕｏＭをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
その結果、配列表の配列番号１６記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。この配列番号１６記載の塩基配列は、塩基番号１８６〜１７２７部分にＮＡＤＨ脱水素酵素複合体のサブユニットｎｕｏＭ遺伝子のＯＲＦ（配列番号１７記載のアミノ酸配列に対応）を含む。
得られたＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【０１５８】
このようにして調製したＤＮＡを実施例１と同様な方法で大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＵＣ１８由来のｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターと同じ転写方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＮＤＨを保有する形質転換株を得、得られた形質転換株から定法によりプラスミドＤＮＡを調製してｐＮＤＨを得た。
【０１５９】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＮＤＨを用いて、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８を実施例１と同様な方法で形質転換し、形質転換株を取得した。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８／ｐＮＤＨ株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月２２日付けで寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２５５である。
【０１６０】
ｐＮＤＨの形質転換株とベクターｐＧＩ１８のみを保有する元株をＹＰＧ培地で２日間培養し、得られた菌体の細胞破砕液のＮＡＤＨ脱水素酵素活性は、「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２６巻、ｐ．７７３２−ｐ．７７３７、１９８７年」に記載の方法に準じて測定した。その結果を表１２に示した。
【０１６１】
【表１２】
2006246701.tif 000013
【０１６２】
表１２に示すように、各形質転換株のＮＡＤＨ脱水素酵素活性は、元株のそれに比べて高かったことから、酢酸菌のＮＡＤＨ脱水素酵素遺伝子を酢酸菌に導入して発現させることによって該酵素活性が増強されることが明らかとなった。
上記のようにして得られたプラスミドｐＮＤＨを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、実施例１と同様な方法で酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育をＯＤ６６０ｎｍで測定して、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
各菌株の結果を表１３に示す。
【０１６３】
【表１３】
2006246701.tif 000014
【０１６４】
その結果、表１３に示すように、３％酢酸を添加した培地で、形質転換株は旺盛に増殖したのに対して、元株はほとんど増殖しなかった。
このことから、ＮＡＤＨ脱水素酵素遺伝子を増強させた酢酸菌は、酢酸存在下で高い生育能を示し、生育促進機能が発揮されていることが確認できた。
【０１６５】
（実施例８）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸存在下での生育の向上
（１）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子のクローニング
実施例１に記載したのと同様な方法で調製したグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の染色体ＤＮＡを鋳型として、また、プライマーとして、プライマー１７（配列表の配列番号４９記載の塩基配列参照）およびプライマー１８（配列表の配列番号５０記載の塩基配列参照）を用いて、実施例１と同様な条件でＰＣＲ法を実施して、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
その結果、配列表の配列番号１８記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。この配列番号１８記載の塩基配列は、塩基番号９１〜１１１３部分に大腸菌のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子をコードするｇａｐＡと４８％の相同性を有すると共に、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素において共通に保存されているモチーフＰｆａｍ０００４４ともｓｃｏｒｅ６３０．２の高い相同性を有していた。このことから配列番号１８記載の塩基配列は、塩基番号９１〜１１１３部分にグリセルアルデヒドー３−リン酸脱水素酵素遺伝子のＯＲＦ（配列番号１９記載のアミノ酸配列に対応）を含むことが確認できた。
得られたＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【０１６６】
このようにして調製したＤＮＡを実施例１と同様な方法で大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＵＣ１８由来のｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターと同じ転写方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＧＬＤを保有する形質転換株を得、得られた形質転換株から定法によりプラスミドＤＮＡを調製してｐＧＬＤを得た。
【０１６７】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＧＬＤを用いてグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８を実施例１と同様な方法で形質転換し、形質転換株を取得した。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter  xylinus）ＩＦＯ３２８８／ｐＧＬＤ株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月２２日付けで寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２５３である。
【０１６８】
上記のようにして得られたプラスミドｐＧＬＤを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、実施例１と同様な方法で酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育をＯＤ６６０ｎｍで測定して、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
各菌株の結果を表１４に示す。
【０１６９】
【表１４】
2006246701.tif 000015
【０１７０】
その結果、表１４に示すように、３％酢酸を添加した培地で、形質転換株は旺盛に増殖したのに対して、元株はほとんど増殖しなかった。
このことから、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子を増強させた酢酸菌は、酢酸存在下で高い生育能を示し、生育促進機能が発揮されていることが確認できた。
【０１７１】
（実施例９）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のエノラーゼ遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸存在下での生育の向上
（１）エノラーゼ遺伝子のクローニング
実施例１に記載したのと同様な方法で調製したグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の染色体ＤＮＡを鋳型として、また、プライマーとして、プライマー１９（配列表の配列番号５１記載の塩基配列参照）およびプライマー２０（配列表の配列番号５２記載の塩基配列参照）を用いて、実施例１と同様な条件でＰＣＲ法を実施して、エノラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
その結果、配列表の配列番号２０記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。この配列番号２０記載の塩基配列は、塩基番号６８〜１３９３部分に大腸菌のｅｎｏと５２％の騒相同性を有し、エノラーゼにおいて共通に保存されているモチーフＰｆａｍ００１１３ともｓｃｏｒｅ６７８．２の高い相同性を有していた。このことから配列番号２０記載の塩基配列は、塩基番号６８〜１３９３部分にエノラーゼ遺伝子のＯＲＦ（配列番号２１記載のアミノ酸配列に対応）を含むことが確認できた。
このＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【０１７２】
このようにして調製したＤＮＡを実施例１と同様な方法で大腸菌（Escherichia  coli）ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＵＣ１８由来のｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターと同じ転写方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＥＮＯを保有する形質転換株を得、得られた形質転換株から定法によりプラスミドＤＮＡを調製してｐＥＮＯを得た。
【０１７３】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＥＮＯを用いて、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８を実施例１と同様な方法で形質転換し、形質転換株を取得した。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８／ｐＥＮＯ株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月２日付けで寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２１１である。
【０１７４】
上記のようにして得られたプラスミドｐＥＮＯを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、実施例１と同様な方法で酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育をＯＤ６６０ｎｍで測定して、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
各菌株の結果を表１５に示す。
【０１７５】
【表１５】
2006246701.tif 000016
【０１７６】
その結果、表１５に示すように、３％酢酸を添加した培地で、形質転換株は旺盛に増殖したのに対して、元株はほとんど増殖しなかった。
このことから、エノラーゼ遺伝子を増強させた酢酸菌は、酢酸存在下で高い生育能を示し、生育促進機能が発揮されていることが確認できた。
【０１７７】
（実施例１０）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のグルコース−６−リン酸脱水素酵素遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸存在下での生育の向上
（１）グルコース−６−リン酸脱水素酵素遺伝子のクローニング
実施例１に記載したのと同様な方法で調製したグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の染色体ＤＮＡを鋳型として、また、プライマーとして、プライマー２１（配列表の配列番号５３記載の塩基配列参照）およびプライマー２２（配列表の配列番号５４記載の塩基配列参照）を用いて、実施例１と同様な条件でＰＣＲ法を実施して、グルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
その結果、配列表の配列番号２２記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。この配列番号２２記載の塩基配列は、塩基番号７１〜１６００部分にグルコース−６−リン酸脱水素酵素遺伝子のＯＲＦ（配列番号２３記載のアミノ酸配列に対応）を含む。
得られたＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【０１７８】
このようにして調製したＤＮＡを実施例１と同様な方法で大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＵＣ１８由来のｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターと同じ転写方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＧ６Ｐを保有する形質転換株を得、得られた形質転換株から定法によりプラスミドＤＮＡを調製してｐＧ６Ｐを得た。
【０１７９】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＧ６Ｐを用いてグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８を実施例１と同様な方法で形質転換し、形質転換株を取得した。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８／ｐＧ６Ｐ株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月２日付けで寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２１５である。
【０１８０】
ｐＧ６Ｐの形質転換株とベクターｐＧＩ１８のみを保有する元株をＹＰＧ培地で２日間培養し、得られた菌体の細胞破砕液のグルコース−６−リン酸脱水素酵素活性は、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，６７巻，１２号，ｐ．２６４８−２６５１，２００３年」に記載の方法に準じて測定した。
その結果を表１６に示した。
【０１８１】
【表１６】
2006246701.tif 000017
【０１８２】
表１６に示すように、各形質転換株のグルコース−６−リン酸脱水素酵素活性は、元株のそれに比べて高かったことから、酢酸菌のグルコース−６−リン酸脱水素酵素遺伝子を酢酸菌に導入して発現させることによって該酵素活性が増強されることが明らかとなった。
上記のようにして得られたプラスミドｐＧ６Ｐを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、実施例１と同様な方法で酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育をＯＤ６６０ｎｍで測定して、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
各菌株の結果を表１７に示す。
【０１８３】
【表１７】
2006246701.tif 000018
【０１８４】
その結果、表１７に示すように、３％酢酸を添加した培地で、形質転換株は旺盛に増殖したのに対して、元株はほとんど増殖しなかった。
このことから、グルコース−６−リン酸脱水素酵素遺伝子を増強させた酢酸菌は、酢酸存在下で高い生育能を示し、生育促進機能が発揮されていることが確認できた。
【０１８５】
（実施例１１）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸存在下での生育の向上
（１）６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子のクローニング
実施例１に記載したのと同様な方法で調製したグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の染色体ＤＮＡを鋳型として、また、プライマーとして、プライマー２３（配列表の配列番号５５記載の塩基配列参照）およびプライマー２４（配列表の配列番号５６記載の塩基配列参照）を用いて、実施例１と同様な条件でＰＣＲ法を実施して、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
その結果、配列表の配列番号２４記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。この配列番号２４記載の塩基配列は、塩基番号６１〜８７３部分にメソリゾビウム・ロチ（Ｍｅｓｏｒｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）のｍｌｌ１６５１４と３２％の相同性を有していた。このことから、配列番号２４記載の塩基配列は、塩基番号６１〜８７３部分に６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子のＯＲＦ（配列番号２５記載のアミノ酸配列に対応）を含むことを確認した。
得られたＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【０１８６】
このようにして調製したＤＮＡを実施例１と同様な方法で大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＵＣ１８由来のｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターと同じ転写方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＰＧＬを保有する形質転換株を得、得られた形質転換株から定法によりプラスミドＤＮＡを調製してｐＰＧＬを得た。
【０１８７】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＰＧＬを用いてグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８を実施例１と同様な方法で形質転換し、形質転換株を取得した。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８／ｐＰＧＬ株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月２日付けで寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２２３である。
【０１８８】
上記のようにして得られたプラスミドｐＰＧＬを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、実施例１と同様な方法で酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育をＯＤ６６０ｎｍで測定して、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
各菌株の結果を表１８に示す。
【０１８９】
【表１８】
2006246701.tif 000019
【０１９０】
その結果、表１８に示すように、３％酢酸を添加した培地で、形質転換株は旺盛に増殖したのに対して、元株はほとんど増殖しなかった。
このことから、６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子を増強させた酢酸菌は、酢酸存在下で高い生育能を示し、生育促進機能が発揮されていることが確認できた。
【０１９１】
（実施例１２）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来の６−ホスホグルコネート脱水素酵素遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸存在下での生育の向上
（１）６−ホスホグルコネート脱水素酵素遺伝子のクローニング
実施例１に記載したのと同様な方法で調製したグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の染色体ＤＮＡを鋳型として、また、プライマーとして、プライマー２５（配列表の配列番号５７記載の塩基配列参照）およびプライマー２６（配列表の配列番号５８記載の塩基配列参照）を用いて、実施例１と同様な条件でＰＣＲ法を実施して、ホスホグルコネート脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
その結果、配列表の配列番号２６記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。この配列番号２６記載の塩基配列は、塩基番号７２〜１０７０部分にホスホグルコネート脱水素酵素遺伝子のＯＲＦ（配列番号２７記載のアミノ酸配列に対応）を含む。
得られたＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【０１９２】
このようにして調製したＤＮＡを実施例１と同様な方法で大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＵＣ１８由来のｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターと同じ転写方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＰＧＤを保有する形質転換株を得、得られた形質転換株から定法によりプラスミドＤＮＡを調製してｐＰＧＤを得た。
【０１９３】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＰＧＤを用いてグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８を実施例１と同様な方法で形質転換し、形質転換株を取得した。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８／ｐＰＧＤ株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月２日付けで寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２２１である。
【０１９４】
ｐＰＧＤの形質転換株とベクターｐＧＩ１８のみを保有する元株をＹＰＧ培地で２日間培養し、得られた菌体の細胞破砕液の６−ホスホグルコネート脱水素酵素活性は、「バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，６７巻，１２号，ｐ．２６４８−２６５１，２００３年」に記載の方法に準じて測定した。その結果を表１９に示した。
【０１９５】
【表１９】
2006246701.tif 000020
【０１９６】
表１９に示すように、各形質転換株の６−ホスホグルコネート脱水素酵素活性は、元株のそれに比べて高かったことから、酢酸菌の６−ホスホグルコネート脱水素酵素遺伝子を酢酸菌に導入して発現させることによって該酵素活性が増強されることが明らかとなった。
上記のようにして得られたプラスミドｐＰＧＤを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、実施例１と同様な方法で酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育をＯＤ６６０ｎｍで測定して、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
各菌株の結果を表２０に示す。
【０１９７】
【表２０】
2006246701.tif 000021
【０１９８】
その結果、表２０に示すように、３％酢酸を添加した培地で、形質転換株は旺盛に増殖したのに対して、元株はほとんど増殖しなかった。
このことから、６−ホスホグルコネート脱水素酵素遺伝子を増強させた酢酸菌は、酢酸存在下で高い生育能を示し、生育促進機能が発揮されていることが確認できた。
【０１９９】
（実施例１３）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のホスホグルコネートデヒドラターゼ遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸存在下での生育の向上
（１）ホスホグルコネートデヒドラターゼ遺伝子のクローニング
実施例１に記載したのと同様な方法で調製したグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の染色体ＤＮＡを鋳型として、また、プライマーとして、プライマー２７（配列表の配列番号５９記載の塩基配列参照）およびプライマー２８（配列表の配列番号６０記載の塩基配列参照）を用いて、実施例１と同様な条件でＰＣＲ法を実施して、ホスホグルコネートデヒドラターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
その結果、配列表の配列番号２８記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を得た。この配列番号２８記載の塩基配列は、塩基番号７８〜１９１６部分にホスホグルコネートデヒドラターゼ遺伝子のＯＲＦ（配列番号２９記載のアミノ酸配列に対応）を含む。
このＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐGI18の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【０２００】
このようにして調製したＤＮＡを実施例１と同様な方法で大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株に形質転換し、ｐＵＣ１８由来のｌａｃプロモーターの下流にｌａｃプロモーターと同じ転写方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＰＧＨを保有する形質転換株を得、得られた形質転換株から定法によりプラスミドＤＮＡを調製してｐＰＧＨを得た。
【０２０１】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たＰＧＨを用いてグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８を実施例１と同様な方法で形質転換し、形質転換株を取得した。
得られた形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８／ｐＰＧＨ株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月２２日付けで寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２５６である。
【０２０２】
ｐＰＧＨの形質転換株とベクターｐＧＩ１８のみを保有する元株をＹＰＧ培地で２日間培養し、得られた菌体の細胞破砕液のホスホグルコネートデヒドラターゼ活性は、「ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ）」，１０５巻，ｐ．１１−３１，２００３年」に記載の方法に準じて測定した。その結果を表２１に示した。
【０２０３】
【表２１】
2006246701.tif 000022
【０２０４】
表２１に示すように、各形質転換株のホスホグルコネートデヒドラターゼ活性は、元株のそれに比べて高かったことから、酢酸菌のホスホグルコネートデヒドラターゼ遺伝子を酢酸菌に導入して発現させることによって該酵素活性が増強されることが明らかとなった。
上記のようにして得られたプラスミドｐＰＧＨを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、実施例１と同様な方法で酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育をＯＤ６６０ｎｍで測定して、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
各菌株の結果を表２２に示す。
【０２０５】
【表２２】
2006246701.tif 000023
【０２０６】
その結果、表２２に示すように、３％酢酸を添加した培地で、形質転換株は旺盛に増殖したのに対して、元株はほとんど増殖しなかった。
このことから、ホスホグルコネートヒドラターゼ遺伝子を増強させた酢酸菌は、酢酸存在下で高い生育能を示し、生育促進機能が発揮されていることが確認できた。
【０２０７】
（実施例１４）グルコンアセトバクター・キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）由来のＮＡＤＨ脱水素酵素複合体のサブユニットｎｕｏＭをコードする遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸発酵試験
実施例７で得られたプラスミドｐＮＤＨを保有するアンピシリン耐性を有するグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８の形質転換株について、製造例１のプラスミドベクターｐＧＩ１８のみを有するグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）ＩＦＯ３２８８（元株）と酢酸発酵能を比較した。
具体的には、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）を用いて、酢酸４．９％、エタノール２％、グルコース１．２５％、酵母エキス０．１２５％、ポリペプトン０．０５％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１．７Ｌの培地にて、３０℃、５００ｒｐｍ、０．３ｖｖｍの通気攪拌培養を行った。発酵中は培地中のエタノール濃度を２％に制御した。
発酵成績を表２３にまとめた。
【０２０８】
【表２３】
2006246701.tif 000024
【０２０９】
表２３から明らかなように、元株と形質転換株において、生育の指標であるＯＤ６６０ｎｍ最高値から比増殖速度を割り出して比較すると、形質転換株は元株よりも１．２２倍早く増殖していた。このことから、形質転換株は、元株と比較して、酢酸存在下で生育能が向上していることが分かった。
また、平均生産速度は、元株と比較して約４．４％早く、発酵時間の短縮が可能であることも明らかとなった。
更に、最終的に到達した酸度（最終到達酸度）は、元株の１１．４１％に対して、１１．９１％と上昇していたことから、形質転換株は、高酸度の食酢の製造に利用可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０２１０】
本発明によれば、酢酸菌に対して、酢酸存在下での生育能を高めることができる。そして、酢酸に対する耐性が顕著に向上する。その結果、培地中での酢酸発酵速度の向上や高濃度の酢酸を効率良く食酢を製造することができる。
本発明によれば、酢酸存在下での生育能が顕著に改善された酢酸菌が提供され、また、該酢酸菌を効率良く育種するための方法が提供される。この酢酸存在下での生育の向上した酢酸菌は、食酢の効率的な製造や高濃度の酢酸の製造に利用することができ、有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】グルコンアセトバクター・エンタニイ（アセトバクター・アルトアセチゲネス）由来のプラスミドｐＧＩ1の制限酵素地図を示した図である。
【図２】ｐＧＩ１８の構築図及び制限酵素地図を示した図である。
【図３】実施例３におけるＰＣＲ法のプライマーの位置を示した図である。
【符号の説明】
【０２１２】
図１中、「Ｓｆｉ  Ｉ」及び「Ｈｉｎｃ  ＩＩ」は、制限酵素認識部位（括弧内の数値は各認識部位の配列番号）を示す。また、括弧内の数字は、ｂｐ単位で示した塩基番号を示す。更に、中央の「ｐＧＩ１」はプラスミド名を、「３０８０ｂｐ」はプラスミドの総塩基数を示す。
図２中、「Ａａｔ  ＩＩ」及び「Ｓｆｉ  Ｉ」は、制限酵素認識部位を示す。また、ＭＣＳはマルチクローニングサイトを、Ａｍｐｒは、アンピシリン耐性遺伝子部位を、括弧内の数字は、ｂｐ単位で示した塩基番号を示す。更に、中央の「ｐＵＣ１８」、「ｐＧＩ１」及び「ｐＧＩ１８」はプラスミド名を、「２．７ｋｂｐ」、「３．１ｋｂｐ」及び「５．８ｋｂｐ」は、プラスミドの総塩基数を示す。
図３中、Ｐｒｉｍｅｒ１及びＰｒｉｍｅｒ２は、それぞれプライマー１及びプライマー２を示し、「Ｓｆｉ  Ｉ」及び「Ａａｔ  ＩＩ」は、制限酵素認識部位を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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