(57)【要約】【課題】本発明は、幹細胞由来の膵臓ホルモン産生細胞を効率よく取得する方法等を提供する。【解決手段】本発明の膵臓ホルモン産生細胞取得方法は、幹細胞を膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程を含む膵臓ホルモン産生細胞取得方法である。また、本発明の膵臓ホルモン産生細胞は、幹細胞を膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導することによって得られる。【選択図】図１２
2006075022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を、膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程を含む、膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項２】
幹細胞を、付着細胞と膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程と、
前記浮遊細胞を単離する工程と
を含む、膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項３】
前記浮遊細胞は、前記付着細胞よりも膵臓ホルモンを産生する細胞の割合が多い、請求項２に記載の膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項４】
さらに、前記浮遊細胞を継代する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項５】
前記幹細胞は、ＥＳ細胞または組織幹細胞である、請求項１または２に記載の膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項６】
前記幹細胞は哺乳動物由来である、請求項１、２、または５のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項７】
前記哺乳動物は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、マウス、またはラットである、請求項６に記載の膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項８】
さらに、膵臓関連遺伝子を発現させる工程を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項９】
前記膵臓関連遺伝子を、レポーター遺伝子と組み合わせて発現させる、請求項８に記載の膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項１０】
前記膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子は、外因性の膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子である、請求項８または９に記載の膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項１１】
前記膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子の発現は、遺伝子発現制御システムによって制御される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項１２】
さらに、膵臓関連遺伝子またはレポーター遺伝子の発現レベルを基準の一つとして細胞を分類する工程を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項１３】
前記分類する工程は、前記膵臓関連遺伝子またはレポーター遺伝子の発現が高い細胞を濃縮する工程である、請求項１２に記載の膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項１４】
前記膵臓関連遺伝子は、ｐｄｘ−１遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、及びＨＮＦ６遺伝子からなる群より選ばれる１または２以上の遺伝子である、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項１５】
前記レポーター遺伝子は、ＧＦＰ遺伝子、ＥＧＦＰ遺伝子、ＣＦＰ遺伝子、ＢＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、Ｖｅｎｕｓ遺伝子、ｄｓＲｅｄ遺伝子、またはｌａｃＺ遺伝子である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項１６】
前記膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、または膵ポリペプチド（ＰＰ）産生細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞取得方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって得られた、膵臓ホルモン産生細胞。
【請求項１８】
幹細胞を、膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導することによって得られる膵臓ホルモン産生細胞。
【請求項１９】
幹細胞を、膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導することによって得られる浮遊細胞を継代することによって得られる、膵臓ホルモン産生細胞。
【請求項２０】
前記膵臓ホルモン産生細胞は浮遊細胞である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞。
【請求項２１】
前記幹細胞は、ＥＳ細胞または組織幹細胞である、請求項１８または１９に記載の膵臓ホルモン産生細胞。
【請求項２２】
前記幹細胞は哺乳動物由来である、請求項１８、１９、または２１のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞。
【請求項２３】
前記哺乳動物は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、マウス、またはラットである、請求項２２に記載の膵臓ホルモン産生細胞。
【請求項２４】
膵臓関連遺伝子を発現している、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞。
【請求項２５】
前記膵臓関連遺伝子は、ｐｄｘ−１遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、及びＨＮＦ６遺伝子からなる群より選ばれる１または２以上の遺伝子である、請求項２４に記載の膵臓ホルモン産生細胞。
【請求項２６】
医薬品候補物質の前臨床試験、医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品の効能試験、あるいは医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品の候補物質の効能試験で用いられる、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞。
【請求項２７】
前記膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、または膵ポリペプチド（ＰＰ）産生細胞である、請求項１７〜２６に記載の膵臓ホルモン産生細胞。
【請求項２８】
請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞を含む組成物。
【請求項２９】
前記組成物は、薬剤である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物は、医療用組成物である、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記医療用組成物は、免疫隔離膜によって覆われたバイオ人工臓器の態様である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
膵臓疾患の予防・治療に用いることができる、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
糖尿病、糖尿病の合併症、網膜症、または腎症の予防・治療に用いることができる、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記組成物は、実験試薬または実験キットである、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞を担持した、モデル動物。
【請求項３６】
前記モデル動物は疾患モデル動物である、請求項３５に記載のモデル動物。
【請求項３７】
前記疾患モデル動物が有する疾患は、膵臓疾患である、請求項３６に記載のモデル動物。
【請求項３８】
前記疾患モデル動物が有する疾患は、糖尿病、糖尿病の合併症、網膜症、または腎症である、請求項３６に記載のモデル動物。
【請求項３９】
前記モデル動物は、免疫不全モデル動物である、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のモデル動物。
【請求項４０】
医薬品候補物質の前臨床試験、医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品の効能試験、あるいは医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品の候補物質の効能試験で用いられる、請求項３５〜３９に記載のモデル動物。
【請求項４１】
膵臓ホルモン産生細胞について膵臓関連遺伝子の発現を検討する工程を含む、膵臓ホルモン産生能予測方法。
【請求項４２】
前記膵臓ホルモン産生細胞は、請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞である、請求項４１に記載の膵臓ホルモン産生能予測方法。
【請求項４３】
膵臓関連遺伝子の発現を膵臓ホルモン産生能を予測する指標の一つとする、請求項４１または４２に記載の膵臓ホルモン産生能予測方法。
【請求項４４】
前記膵臓関連遺伝子は、ｐｄｘ−１遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、またはＨＮＦ６遺伝子である、請求項４１または４３に記載の膵臓ホルモン産生能予測方法。
【請求項４５】
前記膵臓ホルモンは、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチド（ＰＰ）である、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生能予測方法。
【請求項４６】
請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞を用いた、疾患の予防・治療方法。
【請求項４７】
請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞を生物に移植する工程を含む、疾患の予防・治療方法。
【請求項４８】
前記膵臓ホルモン産生細胞は、免疫隔離膜によって覆われたバイオ人工臓器の態様である、請求項４６または４７に記載の疾患の予防・治療方法。
【請求項４９】
前記膵臓ホルモン産生細胞が由来とする幹細胞は、前記膵臓ホルモン産生細胞の移植を受ける生物の自己由来である、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の疾患の予防・治療方法。
【請求項５０】
前記幹細胞は、ＥＳ細胞または組織幹細胞である、請求項４９に記載の疾患の予防・治療方法。
【請求項５１】
前記幹細胞は哺乳動物由来である、請求項４９または５０に記載の疾患の予防・治療方法。
【請求項５２】
前記哺乳動物は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、マウス、またはラットである、請求項５１に記載の疾患の予防・治療方法。
【請求項５３】
前記疾患は膵臓疾患である、請求項４６〜５２のいずれか一項に記載の疾患の予防・治療方法。
【請求項５４】
前記疾患は糖尿病、糖尿病の合併症、網膜症、または腎症である、請求項４６〜５２のいずれか一項に記載の疾患の予防・治療方法。
【請求項５５】
請求項１７〜２７に記載の膵臓ホルモン産生細胞に、１または２以上の被験物質を作用させる工程と、
前記被験物質を作用させた場合の前記膵臓ホルモン産生細胞と、前記被験物質を作用させない場合の前記膵臓ホルモン産生細胞を、比較検討する工程と
を含む、被験物質が膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響の検討方法。
【請求項５６】
前記被験物質は、核酸、タンパク質またはペプチド、あるいはこれら以外の化合物である、請求項５５に記載の被験物質が膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響の検討方法。
【請求項５７】
前記比較検討する工程は、細胞の形態、細胞の生存率、細胞の増殖率、膵臓ホルモン発現が変化した細胞数または細胞割合、細胞が産生する膵臓ホルモン量、特定の遺伝子の発現量、特定の核酸の局在、特定のタンパク質の局在、特定のタンパク質の活性、あるいは特定のタンパク質の量の増加または減少を指標の一つとする、請求項５５に記載の被験物質が膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響の検討方法。
【請求項５８】
前記特定の遺伝子、特定の核酸、及び特定のタンパク質はそれぞれ、膵臓関連遺伝子、膵臓関連遺伝子産物をコードする核酸、及び膵臓関連遺伝子産物である、請求項５７に記載の被験物質が膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響の検討方法。
【請求項５９】
前記膵臓関連遺伝子は、ｐｄｘ−１遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、またはＨＮＦ６遺伝子である、請求項５８に記載の被験物質が膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響の検討方法。
【請求項６０】
前記被験物質が膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響は、膵臓ホルモン産生細胞に対する毒性、膵臓ホルモン産生能の促進、または膵臓関連遺伝子発現の変化である、請求項５５〜５９に記載の被験物質が膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響の検討方法。
【請求項６１】
請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の膵臓ホルモン産生細胞に、１または２以上の特定の影響を及ぼす物質の候補物質を作用させる工程と、
前記候補物質を作用させた場合の前記膵臓ホルモン産生細胞と、前記候補物質を作用させない場合の前記膵臓ホルモン産生細胞を、比較検討する工程と
を含む、膵臓ホルモン産生細胞に特定の影響を及ぼす物質のスクリーニング方法。
【請求項６２】
前記候補物質は、核酸、タンパク質またはペプチド、あるいはこれら以外の化合物である、請求項６１に記載の膵臓ホルモン産生細胞に特定の影響を及ぼす物質のスクリーニング方法。
【請求項６３】
前記候補物質は、ライブラリーの態様である、請求項６１または６２に記載の膵臓ホルモン産生細胞に特定の影響を及ぼす物質のスクリーニング方法。
【請求項６４】
前記比較検討する工程は、細胞の形態、細胞の生存率、細胞の増殖率、膵臓ホルモン発現が変化した細胞数または細胞割合、細胞が産生する膵臓ホルモン量、特定の遺伝子の発現量、特定の核酸の局在、特定のタンパク質の局在、特定のタンパク質の活性、あるいは特定のタンパク質の量の増加または減少を指標の一つとする、請求項６１に記載の膵臓ホルモン産生細胞に特定の影響を及ぼす物質のスクリーニング方法。
【請求項６５】
前記特定の遺伝子、特定の核酸、及び特定のタンパク質はそれぞれ、膵臓関連遺伝子、膵臓関連遺伝子産物をコードする核酸、及び膵臓関連遺伝子産物である、請求項６４に記載の膵臓ホルモン産生細胞に特定の影響を及ぼす物質のスクリーニング方法。
【請求項６６】
前記膵臓関連遺伝子は、ｐｄｘ−１遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、またはＨＮＦ６遺伝子である、請求項６５に記載の膵臓ホルモン産生細胞に特定の影響を及ぼす物質のスクリーニング方法。
【請求項６７】
前記特定の影響を及ぼす物質は、膵臓ホルモン産生促進因子、膵臓ホルモン産生阻害因子、膵臓ホルモン分泌促進因子、膵臓ホルモン分泌阻害因子、膵臓ホルモン産生細胞分化促進因子、膵臓ホルモン産生細胞分化阻害因子、膵臓細胞分化関連因子、膵臓ホルモン産生細胞分化関連因子、膵臓疾患関連因子、糖尿病関連因子、ブドウ糖反応性関連因子、β細胞アポトーシス阻害剤、糖尿病治療に有効な薬剤、または自己免疫疾患抑制剤である、請求項６１〜６６に記載の膵臓ホルモン産生細胞に特定の影響を及ぼす物質のスクリーニング方法。
【請求項６８】
膵臓ホルモン産生能を有する付着細胞及び浮遊細胞における、１また２以上の遺伝子の発現量を検討する工程と、
両細胞間における前記遺伝子それぞれの発現量を比較する工程と、
両細胞間で発現量の異なる遺伝子を特定する工程と
を含む、膵臓ホルモン産生細胞に関与する遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項６９】
前記膵臓ホルモン産生能を有する付着細胞及び浮遊細胞は、請求項１７〜２７に記載の膵臓ホルモン産生細胞である、請求項６８に記載の膵臓ホルモン産生細胞に関与する遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項７０】
ＥＳ細胞を、インスリンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程を含む、インスリン産生細胞取得方法。
【請求項７１】
ＥＳ細胞を、付着細胞とインスリンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程と、
前記浮遊細胞を単離する工程と
を含む、インスリン産生細胞取得方法。
【請求項７２】
前記浮遊細胞は、前記付着細胞よりもインスリンを産生する細胞の割合が多い、請求項７１に記載のインスリン産生細胞取得方法。
【請求項７３】
さらに、前記浮遊細胞を継代する工程を含む、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞取得方法。
【請求項７４】
さらに、ｐｄｘ−１を発現させる工程を含む、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載のインスリン産生細胞取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓ホルモン産生細胞取得方法、及び前記方法によって得られる膵臓ホルモン産生細胞等に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓は内分泌細胞と外分泌細胞を有し、内分泌と外分泌の両方で重要な役割を担っている器官である。内分泌細胞は膵臓ホルモンを分泌する役割を果たし、膵α細胞から分泌されるグルカゴン、膵β細胞からインスリン、膵δ細胞からソマトスタチン、ＰＰ細胞から膵ポリペプチド（ＰＰ）が分泌されることが知られている。特にインスリンは血糖値低下作用を有し、血糖を正しい濃度に保つ重要な役割を果たす。
【０００３】
糖尿病は、インスリンが不足したりその働きが失われたりすることによって発症する疾患であり、一度発症すると根治するのが難しい疾患である。糖尿病患者は近年著しい増加を示しており、例えば日本における糖尿病患者数は、現在約６００万人に達し、４０歳以上の１０人に１人は糖尿病だといわれている。
【０００４】
糖尿病は、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）とＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）の大きく２つのタイプに分類することができる。
【０００５】
ＩＩ型糖尿病は、インスリンに対し抵抗性をもつために発症する慢性疾患であり、食べ過ぎや運動不足によっておこる肥満やストレス等、生活習慣と関わりで問題となっている糖尿病である。ＩＩ型糖尿病は中高年で発病することが多く、その患者数は全糖尿病患者数の約９０％を占めている。
【０００６】
一方、Ｉ型糖尿病は、自己免疫疾患やウィルス感染等によってインスリン産生細胞が破壊され、インスリンが体内に分泌されないことによっておこる慢性疾患である。Ｉ型糖尿病は、年齢等に関係なく誰にでも発症することが知られており、患者は注射等により、自身で毎日インスリンを補わなければならない。インスリン注射によって血糖値のコントロールを厳密に行うには、その都度の状況を判断し必要量を推測する作業が必要となるが、コントロールが不十分な状態で２０〜３０年経過すれば、合併症により失明したり、腎不全のため透析が必要になる可能性がある。
【０００７】
従って、体内で常に変化する血糖値を自動的にコントロールでき、かつ、患者の負担を軽くできる治療法として、Ｉ型糖尿病患者に対し、膵臓移植または膵島移植が行われている。これらの治療法によって正常な血糖値を達成することは可能であるが、移植は１００％成功するものではなく、また移植可能な膵臓または膵島も不足しているのが現状である。また、移植片に対する免疫拒絶反応を制御するために、患者は免疫抑制剤を一生投与され続ける必要があるが、感染症の危険性や免疫抑制剤による副作用等の問題が残る。
【０００８】
Ｉ型糖尿病について近年研究が進められている新しい治療法の一つに、インスリン産生細胞自体を再生し移植する方法が挙げられる。この治療法によって体内でインスリンを作り出すことができれば、根本的な糖尿病の治療につながると期待される。またこの方法によって短期間で多くのインスリン産生細胞を得ることが可能になったり、本人由来の細胞を用いることによって拒絶反応の問題が解消されたりする等、安全性や安定性の面で多くの利点があると考えられる。
【０００９】
インスリン産生細胞を得る方法としては、ＥＳ細胞から分化させる方法、患者の膵の組織幹細胞から分化させる方法、患者の膵管上皮由来細胞を体外に取り出して分化させる方法等が知られている。例えば、ＥＳ細胞にｐｄｘ−１を導入して培養することによって、効率よくインスリン産生細胞が分化誘導されることが知られている。ｐｄｘ−１は膵臓の発生に関わる重要な転写因子であり、インスリン産生細胞の発生、機能維持の役割も担っていることが知られている。
【００１０】
しかし、これらの方法によって得られるインスリン産生細胞は、正常な膵β細胞と比較してインスリン産生効率がかなり低く、機能的なインスリン産生細胞を効率的に得られる方法の開発が求められている。同様に、得られる細胞数を糖尿病治療等のための実用化レベルまで増加させることが求められている。さらに、従来から研究されているインスリン産生細胞の再生方法は、培養シャーレに付着させる段階を経て分化誘導を行っているため、インスリン産生能を有する付着細胞のみが注目されている。しかし、付着細胞は浮遊細胞と比較して継代培養操作に手間がかかり、また細胞回収率も浮遊細胞に劣る。
【非特許文献１】ミヤザキ（Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｓ．）ら、「ダイアビーテス（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）」、２００４年、第５３巻、ｐ．１０３０−７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、幹細胞由来の膵臓ホルモン産生細胞を効率よく取得する方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
【００１２】
１、膵臓ホルモン産生細胞取得方法
本発明の膵臓ホルモン産生細胞取得方法は、幹細胞を、膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程を含む。これによれば、幹細胞由来で浮遊細胞を含む膵臓ホルモン産生細胞を得ることができる。
【００１３】
本発明において「膵臓ホルモン産生細胞」とは、膵臓ホルモンを産生する能力を有する細胞を指す。前記膵臓ホルモン産生細胞は常に膵臓ホルモンを産生している必要はなく、膵臓ホルモンの産生能力を有していれば足りる。また、前記膵臓ホルモン産生細胞が有する膵臓ホルモン産生能力も特に限定されないものとする。
【００１４】
また、本発明において「浮遊細胞」とは、細胞培養液等の液体中に浮遊している生細胞を指す。なお、本明細書において単に「浮遊細胞」と記載した場合は、１個の浮遊細胞、２個以上の浮遊細胞からなるｓｐｈｅｒｅ（細胞塊）、及びこれらが混在した浮遊細胞の集団を含むものとする。
【００１５】
本発明の膵臓ホルモン産生細胞取得方法は、
幹細胞を、付着細胞と膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程と、
前記浮遊細胞を単離する工程と
を含む。これによれば、幹細胞由来で膵臓ホルモン産生能を有する細胞集団の中から、特に浮遊細胞を取得することができる。従って、浮遊系で培養可能である膵臓ホルモン産生細胞を得ることができる。
【００１６】
本発明において、前記浮遊細胞は、前記付着細胞よりも膵臓ホルモンを産生する細胞の割合が多いことができる。これによれば、膵臓ホルモンを効率的に産生する浮遊細胞を得ることができる。従って、例えば疾患の治療に関して、付着細胞よりも実用化に近いレベルで膵臓ホルモンを産生できる機能的な浮遊細胞を得ることができる。
【００１７】
本発明の膵臓ホルモン産生細胞取得方法はさらに、前記浮遊細胞を継代する工程を含むことができる。本発明によって得られる浮遊細胞は、浮遊系で継代培養することによって長期に渡って増殖させることが可能である。また、浮遊細胞の継代操作や回収操作は、付着細胞のように培養用容器からはがす操作を必要としないために細胞に及ぶダメージが少なく、操作自体も簡便であり、さらに細胞回収率においても優れている。従って本発明によれば、膵臓ホルモン産生能を有する浮遊細胞を、浮遊細胞の継代操作、細胞回収率等における利点を利用して、容易かつ多量に増殖させることが可能である。
【００１８】
本発明において、前記幹細胞は、ＥＳ細胞または組織幹細胞であることができる。これによれば、ＥＳ細胞または組織幹細胞由来の膵臓ホルモン産生細胞を取得することができる。これらの幹細胞は、全ての細胞または特定の細胞に分化する能力を備えるとともに自己複製能を備えており、適切な条件下で継代培養することによって分化能を維持したまま増幅することが可能である。また、後述の実施例より、ｐｄｘ−１をノックインしたＥＳ細胞は、適切な条件下で継代培養することによってインスリン産生能を維持したまま増幅することが可能であることが明らかになった。従って本発明によれば、これらの方法を用いることによって多量の膵臓ホルモン産生細胞を取得することが可能である。また、本発明によって得られる膵臓ホルモン産生細胞を移植に用いる場合は、移植される自己由来の幹細胞を用いて膵臓ホルモン産生細胞を得ることによって、免疫拒絶反応の問題が回避される等、安全性・安定性の面で利点があると考えられる。
【００１９】
前記幹細胞は哺乳動物由来であることができる。これによれば、哺乳動物由来の膵臓ホルモン産生細胞を得ることができる。哺乳動物は、ヒトでなくとも遺伝的にヒトに近い生物であると考えられるため、哺乳動物由来の幹細胞を用いることによって、ヒトが本来有するものに近い膵臓ホルモン産生細胞を得ることができる。従って、例えば免疫抑制剤や免疫隔離膜を利用することによって、ヒトの膵臓疾患や糖尿病等の治療に用いることが可能である。
【００２０】
前記哺乳動物は、例えば、ヒト、サル、イヌ、ブタ、マウス、またはラットであることができる。これらの哺乳動物は幹細胞樹立の研究が進んでいる生物であり、本発明によれば、これらの哺乳動物由来の膵臓ホルモン産生細胞を得ることができる。特にヒトの膵臓疾患や糖尿病等の治療において、ヒト由来の幹細胞を用いて得られる膵臓ホルモン産生細胞を移植する場合は、移植される自己由来の幹細胞を用いることによって、免疫拒絶反応の問題を回避することが可能である。
【００２１】
本発明の膵臓ホルモン産生細胞取得方法はさらに、膵臓関連遺伝子を発現させる工程を含むことができる。本発明において「膵臓関連遺伝子」とは、膵臓の発生分化過程において発現する遺伝子、幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導に関与する遺伝子、膵臓ホルモン産生に関わる遺伝子、膵臓ホルモン産生細胞で発現している遺伝子、前記以外の膵臓細胞で発現している遺伝子、膵臓の機能や環境維持に関わる遺伝子等、膵臓に何らかの関わりを有する遺伝子を指し、その関わりは特に限定されるものではない。具体的には例えば、ｐｄｘ−１遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、及びＨＮＦ６遺伝子からなる群より選ばれる１または２以上の遺伝子であることができる。これによれば、前記膵臓関連遺伝子の作用に係る性質を有する膵臓ホルモン産生細胞を取得することができる。具体的には例えば、前記膵臓関連遺伝子を発現させる工程を含まない場合よりも効率よく膵臓ホルモン産生細胞を得たり、本発明によって得られた膵臓ホルモン産生細胞における膵臓ホルモン産生効率を上昇させたりすること等が可能になる。特に、ＥＳ細胞にｐｄｘ−１遺伝子を導入することによってインスリン産生細胞を効率よく分化誘導できること、及びｐｄｘ−１の発現が高いほどインスリンの発現レベルが高いことが、後述の実施例より明らかになった。従って、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法においてｐｄｘ−１を発現させる工程を含むことによって、効率よくインスリン産生細胞を分化誘導して得ることや前記細胞のインスリン産生能を高めることが可能である。
【００２２】
前記膵臓関連遺伝子は、レポーター遺伝子と組み合わせて発現させることができる。これによれば、前記レポーター遺伝子の発現を前記膵臓関連遺伝子の発現として捉えて可視化することが可能になる。従って、レポーター遺伝子の発現を指標として、前記膵臓関連遺伝子が導入された細胞を識別したり、前記膵臓関連遺伝子の発現をモニターしたりすることができる。本発明は、前記膵臓関連遺伝子の導入効率や発現レベルが低い場合に特に有効である。前記レポーター遺伝子としては、例えば、ＧＦＰ遺伝子、ＥＧＦＰ遺伝子、ＣＦＰ遺伝子、ＢＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、Ｖｅｎｕｓ遺伝子、ｄｓＲｅｄ遺伝子、またはｌａｃＺ遺伝子であることができる。特に、ＧＦＰ遺伝子、ＥＧＦＰ遺伝子、ＣＦＰ遺伝子、ＢＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、Ｖｅｎｕｓ遺伝子、ｄｓＲｅｄ遺伝子等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を用いた場合は蛍光にコファクターや基質を要しないため細胞の固定処理や破壊処理が必要なく、細胞が生きた状態で膵臓関連遺伝子の導入効率や発現レベル等を検討することができる。また、ＦＡＣＳ等を用いることによって、蛍光標識されている細胞、すなわち前記膵臓関連遺伝子が導入された細胞を単離・濃縮することが可能である。また、レポーター遺伝子としてｌａｃＺ遺伝子を用いた場合は、Ｘ−ｇａｌを基質として用いる発色法によりで膵臓関連遺伝子の導入効率や発現レベル等を検討することができる。
【００２３】
なお、前記膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子は、外因性の膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子であることができる。
【００２４】
本発明において「外因性の遺伝子」とは、使用する細胞が本来有している遺伝子か否かに関わらず外部から導入された遺伝子を指す。
【００２５】
これによれば、使用する細胞が本来有していない遺伝子を発現させることや、使用する細胞が本来有している遺伝子であってもその遺伝子をさらに強発現させること等が可能になる。外因性の膵臓関連遺伝子を発現させる場合は、前記遺伝子の有する働きによって、膵臓ホルモン産生細胞をより効率よく分化誘導することや、膵臓ホルモン産生効率を上昇させること等が可能になる。また、外因性の膵臓関連遺伝子及びレポーター遺伝子を発現させる場合は、レポーター遺伝子の発現を指標として、膵臓関連遺伝子が導入されている、または発現している細胞を識別・単離・濃縮することができ、機能的な膵臓ホルモン産生細胞を得ることが可能になる。
【００２６】
前記膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子の発現は、遺伝子発現制御システムによって制御されることができる。これによれば、前記膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子の発現時期、発現領域、または発現量等を所望の態様に制御することができる。従って、例えば、これまで自己複製条件において培養していた幹細胞を膵臓ホルモン産生細胞に分化誘導する時期や、本発明によって得られる膵臓ホルモン産生細胞が膵臓ホルモンを発現する期間を制御すること等が可能になる。
【００２７】
本発明の膵臓ホルモン産生細胞取得方法はさらに、膵臓関連遺伝子またはレポーター遺伝子の発現レベルを基準の一つとして細胞を分類する工程を含むことができる。これによれば、前記膵臓関連遺伝子を発現していることによって示される効果に従って、本発明によって得られた細胞をグループ化することが可能である。例えば、幹細胞が膵臓ホルモン産生細胞に分化することによって特定の膵臓関連遺伝子を発現することが知られる場合は、本発明の工程を含むことによって、幹細胞と膵臓ホルモン産生細胞が混在する細胞集団を、幹細胞の集団と膵臓ホルモン産生細胞の集団にグループ化することができる。また、膵臓ホルモン産生能を獲得した細胞において、特定の膵臓関連遺伝子の発現レベルと膵臓ホルモン産生能との間に何らかの相関関係が認められる場合は、本発明の工程を含むことによって、前記細胞を膵臓ホルモン産生レベルに従ってグループ化することが可能である。本発明に係る相関関係とは、特定の膵臓関連遺伝子の発現と膵臓ホルモン産生能との間に成り立つ一定の関係を指す。前記関係は必ずしも厳密に成り立つ関係である必要はなく、膵臓ホルモン産生能予測の目安として用いうる程度に成り立つ関係であればよい。具体的には例えば、前記特定の膵臓関連遺伝子の発現が高いほど、膵臓ホルモン産生能が高いまたは低い等の関係を挙げることができる。なお、前記膵臓関連遺伝子がレポーター遺伝子と組み合わせて発現されている場合は、前記レポーター遺伝子の発現レベルを前記膵臓関連遺伝子の発現レベルと置き換えて解釈することが可能である。
【００２８】
前記分類する工程は、例えば、前記膵臓関連遺伝子またはレポーター遺伝子の発現が高い細胞を濃縮する工程であることができる。これによれば、前記膵臓関連遺伝子の発現レベルと膵臓ホルモン産生能との間に正の相関関係が認められる場合に、本発明によって得られた膵臓ホルモン産生細胞から、高い膵臓ホルモン産生能を有する細胞を単離・濃縮することができる。なお、前記膵臓関連遺伝子がレポーター遺伝子と組み合わせて発現されている場合は、前記レポーター遺伝子の発現レベルを前記膵臓関連遺伝子の発現レベルと置き換えて解釈することが可能である。
【００２９】
前記膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、または膵ポリペプチド（ＰＰ）産生細胞であることができる。これによれば、幹細胞由来で浮遊細胞を含むインスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、または膵ポリペプチド（ＰＰ）産生細胞を得ることができる。
【００３０】
２、膵臓ホルモン産生細胞
本発明の膵臓ホルモン産生細胞は、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法によって得ることができる。すなわち、本発明の膵臓ホルモン産生細胞は、幹細胞を、膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導することによって得ることができる。これによれば、本発明の膵臓ホルモン産生細胞は、幹細胞由来で膵臓ホルモン産生能を有する浮遊細胞を含む細胞であることができる。
【００３１】
本発明の膵臓ホルモン産生細胞は、幹細胞を、膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導することによって得られる浮遊細胞を継代することによって得ることができる。浮遊細胞の継代操作や回収操作は、付着細胞のように培養用容器からはがす操作を必要としないために細胞に及ぶダメージが少なく、操作自体も簡便であり、さらに細胞回収率も優れている。また後述の実施例より、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞は長期培養が可能であることが明らかになった。従って本発明は、幹細胞由来で膵臓ホルモン産生能を有する浮遊細胞から、容易かつ多量に得ることが可能である膵臓ホルモン産生細胞であることができる。
【００３２】
前記膵臓ホルモン産生細胞は浮遊細胞であることができる。これによれば、本発明の膵臓ホルモン産生細胞は、膵臓ホルモン産生能を有する浮遊細胞であることができ、前述のような継代操作、細胞回収率等における利点を有することができる。
【００３３】
前記幹細胞は、ＥＳ細胞または組織幹細胞であることができる。これによれば、本発明の膵臓ホルモン産生細胞は、ＥＳ細胞または組織幹細胞由来であることができる。従って例えば、前記ＥＳ細胞または組織幹細胞を自己複製能を保ったまま増幅してから膵臓ホルモン産生細胞に分化誘導したり、自己のＥＳ細胞または組織幹細胞由来の膵臓ホルモン産生細胞を移植治療に用いることによって免疫拒絶反応の問題を回避したりすること等が可能になる。
【００３４】
前記幹細胞は哺乳動物由来であることができる。これによれば、本発明の膵臓ホルモン産生細胞は哺乳動物由来の細胞であることができ、ヒトが本来有するものに近い膵臓ホルモン産生細胞を得ることができる。
【００３５】
前記哺乳動物は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、マウス、またはラットであることができる。これらの哺乳動物は幹細胞樹立の研究が進んでいる生物であり、これによれば、本発明の膵臓ホルモン産生細胞はこれらの哺乳動物由来の細胞であることができる。
【００３６】
本発明の膵臓ホルモン産生細胞は、膵臓関連遺伝子を発現していることができる。前記膵臓関連遺伝子としては、例えば、ｐｄｘ−１遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、及びＨＮＦ６遺伝子からなる群より選ばれる１または２以上の遺伝子であることができる。これによれば、本発明の膵臓ホルモン産生細胞は、発現している膵臓関連遺伝子の作用に係る性質を有する細胞であることができる。例えば後述の実施例より、本発明に係るインスリン産生細胞において、ｐｄｘ−１遺伝子の発現が高いほどインスリンの発現量が高いことが明らかになった。従って、本発明に係る膵臓関連遺伝子としてｐｄｘ−１を高発現していることによって、インスリン産生量が高い細胞であることが示唆される。
【００３７】
本発明の膵臓ホルモン産生細胞は、医薬品候補物質の前臨床試験、医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品の効能試験、あるいは医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品の候補物質の効能試験で用いることができる。これによれば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞に特定の作用を有すると考えられる医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品、あるいはこれらの候補物質について、試験・検討・改良・評価等を行うことができる。前記特定の作用とは例えば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の膵臓ホルモン発現期間、その産生効率等に及ぼす作用であることができる。
【００３８】
本発明の膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、または膵ポリペプチド（ＰＰ）産生細胞であることができる。これによれば、本発明の膵臓ホルモン産生細胞を、例えば、糖尿病等の疾患患者に対する移植治療に用いることができる。
【００３９】
３、組成物
本発明の組成物は、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞を含む組成物である。これによれば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞を、用途に適したさまざまな態様で用いることができる。これによって、例えば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞を使用しやすい態様にすること、前記細胞における膵臓ホルモン産生能を高める態様にすること等が可能になる。
【００４０】
前記組成物は、薬剤であることができる。
【００４１】
前記組成物は、医療用組成物であることができる。これによれば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞を医薬品や医療用キットとして、疾患の予防や治療に用いることができる。
【００４２】
前記医療用組成物は、例えば、免疫隔離膜によって覆われたバイオ人工臓器の態様であることができる。免疫隔離膜は、膵臓ホルモンを通過させることはできるが、免疫拒絶反応に関与する免疫担当細胞や抗体等を通過させることができない。従って、例えば、本発明に係る医療用組成物を移植療法に用いる場合、前記組成物に含まれる膵臓ホルモン産生細胞が自己由来の細胞でなくても、患者に免疫抑制剤を投与し続ける必要がなく、免疫抑制剤投与によっておこる副作用や感染症の危険性を避けることができる。また、本発明に係る医療用組成物が不必要になったり除去する必要が生じたりした場合は、本発明によって一度患者の体内に移植した前記医療用組成物を回収することも可能である。
【００４３】
本発明の組成物は、膵臓疾患、糖尿病、糖尿病の合併症、網膜症、または腎症の予防・治療に用いることができる。これによれば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の有する性質・特徴・利点等を生かし、例えば移植療法等を用いることによって前記疾患を予防・治療することができる。
【００４４】
前記組成物は、実験試薬または実験キットであることができる。これによれば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞を、研究・実験等に適した態様で用いることができる。前記研究・実験は、例えば、前記膵臓ホルモン遺伝子の発現に関わるシグナル伝達経路の研究、幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化経路に関わる研究、医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品、あるいはこれらの候補物質の試験・検討・改良・評価等に関わる実験等であることができる。
【００４５】
４、モデル動物
本発明のモデル動物は、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞を担持したモデル動物であることができる。これによれば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞を担持することによってモデル動物に及ぼす影響を解析・検討することができる。前記影響とは例えば、前記モデル動物の血中膵臓ホルモン濃度変化、その変化に伴う影響の有無、その影響によるモデル動物の状態変化等であることができる。また、本発明のモデル動物に何らかの物質を作用させ、前記物質が前記モデル動物または前記モデル動物が担持する本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響を解析・検討することも可能である。前記影響とは例えば、前記モデル動物が担持する本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の膵臓ホルモン発現期間変化、その産生効率変化、前記モデル動物の血中膵臓ホルモン濃度変化、膵臓ホルモン産生細胞の細胞数変化等であることができる。なお、これらの影響はモデル動物の体内や体外において検討することが可能である。
【００４６】
前記モデル動物は疾患モデル動物であることができる。前記疾患モデル動物が有する疾患は、例えば、膵臓疾患、糖尿病、糖尿病の合併症、網膜症、または腎症であることができる。これによれば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞がモデル動物体内においてこれらの疾患に及ぼす影響を検討することができる。前記影響は、疾患モデル動物の体内や体外において検討することが可能である。
【００４７】
前記モデル動物は、免疫不全モデル動物であることができる。免疫不全動物は自己由来でない細胞を拒絶することができない動物である。従って本発明によれば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞が自己由来の細胞でない場合でも、免疫抑制剤や免疫隔離膜を用いずに本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を安定して担持することが可能である。
【００４８】
本発明のモデル動物は、医薬品候補物質の前臨床試験、医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品の効能試験、あるいは医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品の候補物質の効能試験で用いることができる。これによれば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞を担持したモデル動物を用いて、医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品、あるいはこれらの候補物質の試験・検討・改良・評価等を行うことができる。前記医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品、あるいはこれらの候補物質は、前記モデル動物の担持する本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞に作用する物質であることができる。具体的には例えば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の膵臓ホルモン発現期間、その産生効率等に影響を及ぼす物質であることができる。
【００４９】
５、膵臓ホルモン産生能予測方法
本発明の膵臓ホルモン産生能予測方法は、膵臓ホルモン産生細胞について膵臓関連遺伝子の発現を検討する工程を含む。また、前記膵臓ホルモン産生細胞は、例えば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞であることができる。これによれば、特定の膵臓関連遺伝子の発現量、発現領域、または発現時期等を検討しその結果を基準として、前記膵臓ホルモン産生細胞が有する膵臓ホルモン産生能を予測することができる。
【００５０】
本発明の膵臓ホルモン産生能予測方法は、膵臓関連遺伝子の発現を膵臓ホルモン産生能を予測する指標の一つとすることができる。これによれば、膵臓ホルモン産生細胞における膵臓ホルモン産生能と何らかの相関関係を有する膵臓関連遺伝子の発現を検討することによって、前記細胞の膵臓ホルモン産生能を予測することが可能になる。
【００５１】
前記膵臓関連遺伝子は、ｐｄｘ−１遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、またはＨＮＦ６遺伝子であることができる。これによれば、これらの膵臓関連遺伝子の発現を検討することによって、膵臓ホルモン産生能を予測することができる。特にｐｄｘ−１遺伝子は、後述の実施例より、その発現レベルが高いほどインスリンの発現量が高いことが明らかになった。従って、本発明に係るインスリン産生細胞においてｐｄｘ−１の発現レベルを検討することによって、前記インスリン産生細胞のインスリン産生能を予測することができる。
【００５２】
前記膵臓ホルモンは、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチド（ＰＰ）であることができる。これによれば、特定の膵臓関連遺伝子の発現を検討することによって、検討した膵臓ホルモン産生細胞におけるインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチド（ＰＰ）産生能を予測することができる。
【００５３】
６、疾患の予防・治療方法
本発明の疾患の予防・治療方法は、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞を用いた予防・治療方法である。前述のように本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞は、幹細胞または膵臓ホルモン産生細胞の状態で増幅でき、浮遊細胞であるために継代操作や回収操作が細胞に及ぼすダメージが少なく、また操作自体も簡便である。さらに細胞回収率においても、付着細胞と比較して優れている。また、後述の実施例より、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞は長期培養が可能であることが明らかになった。従って本発明によれば、これらの本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の性質・特徴・利点を生かして細胞数を増幅する等によって、疾患の予防・治療に必要な膵臓ホルモン産生細胞を確保し、前記疾患の予防・治療を行うことが可能になる。また、さらに本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞が、膵臓関連遺伝子の発現レベルを指標として膵臓ホルモン産生能を予測することが可能である場合は、所望の膵臓ホルモン発現レベルを有する細胞のみを取得すること等によって、疾患の予防・治療を行うことができる。
【００５４】
本発明の疾患の予防・治療方法は、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞を生物に移植する工程を含む予防・治療方法である。これによれば、移植された本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞が生物体内で膵臓ホルモンを産生することによって、疾患を予防・治療することができる。本発明の方法は膵臓ホルモン産生細胞自体を移植するため、体内で常に変化する膵臓ホルモン量を前記細胞が感知し、膵臓ホルモン産生量または分泌量を自動的に制御できる可能性がある。従って、従来から行われている膵臓ホルモン投与による治療法と比較して、膵臓ホルモン量のより厳密な制御が可能になり、また、注射の手間・必要量の判断等の患者の負担を大きく軽減することができる。
【００５５】
なお、本発明の疾患の予防・治療方法は、必要に応じて免疫拒絶反応を回避する手段を用いることができる。例えば、前記膵臓ホルモン産生細胞は、免疫隔離膜によって覆われたバイオ人工臓器の態様であることができる。免疫隔離膜は、膵臓ホルモンを通過させることはできるが、免疫拒絶反応に関与する免疫担当細胞や抗体等を通過させることができない。従って、前記膵臓ホルモン産生細胞が自己由来の細胞でなくても、患者に免疫抑制剤を投与し続ける必要がなく、また、一度患者の体内に移植した前記膵臓ホルモン産生細胞を回収することも可能である。
【００５６】
前記膵臓ホルモン産生細胞が由来とする幹細胞は、前記膵臓ホルモン産生細胞の移植を受ける生物の自己由来であることができる。これによれば、免疫拒絶反応を回避して、疾患を予防・治療することができる。従って非自己由来の幹細胞を用いるよりも安定して前記膵臓ホルモン産生細胞を保持することができる。
【００５７】
本発明において、前記幹細胞は、ＥＳ細胞または組織幹細胞であることができる。これらの幹細胞は、全ての細胞または特定の細胞に分化する能力を備えるとともに自己複製能を備えており、適切な条件下で継代培養することによって分化能を維持させたまま増幅することが可能である。従って本発明によれば、ＥＳ細胞または組織幹細胞から得られた、本発明に係る自己由来の膵臓ホルモン産生細胞を用いて、疾患を予防・治療することが可能である。
【００５８】
前記幹細胞は哺乳動物由来であることができる。さらに前記哺乳動物は、例えば、幹細胞樹立の研究が進んでいるヒト、サル、イヌ、ブタ、マウス、またはラットであることができる。これによれば、これらの哺乳動物由来で、かつ自己由来の幹細胞から得られた本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞を用いて、これらの哺乳動物の疾患を予防・治療することができる。
【００５９】
前記疾患は膵臓疾患、糖尿病、糖尿病の合併症、網膜症、または腎症であることができる。これによれば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞を用いて、これらの疾患を予防・治療することができる。特に、前記疾患が糖尿病である場合は、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞としてインスリン産生細胞を用いて、糖尿病を予防・治療することができる。
【００６０】
７、被験物質が膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響の検討方法
本発明の被験物質が膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響の検討方法は、
本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞に、１または２以上の被験物質を作用させる工程と、
前記被験物質を作用させた場合の前記膵臓ホルモン産生細胞と、前記被験物質を作用させない場合の前記膵臓ホルモン産生細胞を、比較検討する工程と
を含む。これによれば、前記被験物質によって本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞におこる影響を、適切なコントロールを用いて比較検討することができる。
【００６１】
本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞に作用させる被験物質は特に限定されずさまざまな物質を用いることができるが、例えば前記被験物質は、核酸、タンパク質またはペプチド、あるいはこれら以外の化合物であることができる。
【００６２】
前記比較検討する工程は、細胞の形態、細胞の生存率、細胞の増殖率、膵臓ホルモン発現が変化した細胞数または細胞割合、細胞が産生する膵臓ホルモン量、特定の遺伝子の発現量、特定の核酸の局在、特定のタンパク質の局在、特定のタンパク質の活性、あるいは特定のタンパク質の量の増加または減少を指標の一つとすることができる。これによれば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞のこれらの要素に被験物質が及ぼす影響を検討することによって、被験物質の有する効果を予測することができる。例えば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞に被験物質を作用させた場合に、前記被験物質を作用させない場合と比較して細胞増殖率の向上がみられた場合は、前記被験物質は、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の細胞周期等に影響を与える物質である可能性が考えられる。
【００６３】
前記特定の遺伝子、特定の核酸、及び特定のタンパク質はそれぞれ、膵臓関連遺伝子、膵臓関連遺伝子産物をコードする核酸、及び膵臓関連遺伝子産物であることができる。前記膵臓関連遺伝子としては特に限定されるものではないが、例えばｐｄｘ−１遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、またはＨＮＦ６遺伝子であることができる。これによれば、被験物質が、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞における前記膵臓関連遺伝子の発現量、前記膵臓関連遺伝子産物をコードする核酸の局在、あるいは膵臓関連遺伝子産物の局在または活性に及ぼす影響を検討することができる。例えば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞であって、前記細胞に被験物質を作用させた場合に前記被験物質を作用させない場合と比較してｐｄｘ−１遺伝子の発現量が向上した場合は、前記被験物質は、ｐｄｘ−１遺伝子の発現に影響を与え、かつ前記細胞のインスリン産生能に影響を与える物質である可能性等が考えられる。なおここで、前記細胞がレポーター遺伝子を含み、前記膵臓関連遺伝子の発現とレポーター遺伝子の発現が連動している場合は、前記レポーター遺伝子の発現レベルを前記膵臓関連遺伝子の発現レベルと置き換えて解釈することが可能である。
【００６４】
前記被験物質が膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響は、膵臓ホルモン産生細胞に対する毒性、膵臓ホルモン産生能の促進、または膵臓関連遺伝子発現の変化であることができる。これによれば、被験物質が本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞にこれらの影響を及ぼすか否かについて検討することができる。
【００６５】
８、膵臓ホルモン産生細胞に特定の影響を及ぼす物質のスクリーニング方法
本発明の膵臓ホルモン産生細胞に特定の影響を及ぼす物質のスクリーニング方法は、
本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞に、１または２以上の特定の影響を及ぼす物質の候補物質を作用させる工程と、
前記候補物質を作用させた場合の前記膵臓ホルモン産生細胞と、前記候補物質を作用させない場合の前記膵臓ホルモン産生細胞を、比較検討する工程と
を含む。これによれば、前記候補物質の中から本発明の膵臓ホルモン産生細胞に特定の影響を及ぼす物質を、適切なコントロールを用いて探索することができる。
【００６６】
本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞に作用させる候補物質は特に限定されずさまざまな物質を用いることができるが、例えば前記候補物質は、核酸、タンパク質またはペプチド、あるいはこれら以外の化合物であることができる。
【００６７】
また、前記候補物質は、ライブラリーの態様であることができる。これによれば、本発明の膵臓ホルモン産生細胞に特定の影響を及ぼす物質を網羅的に探索することができる。
【００６８】
前記比較検討する工程は、細胞の形態、細胞の生存率、細胞の増殖率、膵臓ホルモン発現が変化した細胞数または細胞割合、細胞が産生する膵臓ホルモン量、特定の遺伝子の発現量、特定の核酸の局在、特定のタンパク質の局在、特定のタンパク質の活性、あるいは特定のタンパク質の量の増加または減少を指標の一つとすることができる。これによれば、候補物質の中から本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞のこれらの要素に影響を及ぼす物質を探索することができる。例えば、膵臓ホルモン産生量を指標の一つとして、候補物質を作用させた場合と作用させない場合の本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞を比較検討することによって、膵臓ホルモン産生量に影響を及ぼしうる物質を探索することができる。
【００６９】
前記特定の遺伝子、特定の核酸、及び特定のタンパク質はそれぞれ、膵臓関連遺伝子、膵臓関連遺伝子産物をコードする核酸、及び膵臓関連遺伝子産物であることができる。前記膵臓関連遺伝子としては特に限定されるものではないが、例えばｐｄｘ−１遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、またはＨＮＦ６遺伝子であることができる。これによれば、候補物質が、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞における前記膵臓関連遺伝子の発現量、前記膵臓関連遺伝子産物をコードする核酸の局在、あるいは前記膵臓関連遺伝子産物の局在または活性等に影響を及ぼす物質を探索することができる。例えば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞であって、前記細胞に被験物質を作用させた場合に前記被験物質を作用させない場合と比較して、前記細胞におけるｐｄｘ−１遺伝子の発現量が向上する物質を探索することによって、ｐｄｘ−１遺伝子の発現に影響を与え、かつ前記細胞のインスリン産生能に影響を与えうる物質をスクリーニングすることが可能である。なおここで、前記細胞がレポーター遺伝子を含み、前記膵臓関連遺伝子の発現とレポーター遺伝子の発現が連動している場合は、前記レポーター遺伝子の発現レベルを前記膵臓関連遺伝子の発現レベルと置き換えて解釈することが可能である。
【００７０】
前記特定の影響を及ぼす物質は、膵臓ホルモン産生促進因子、膵臓ホルモン産生阻害因子、膵臓ホルモン分泌促進因子、膵臓ホルモン分泌阻害因子、膵臓ホルモン産生細胞分化促進因子、膵臓ホルモン産生細胞分化阻害因子、膵臓細胞分化関連因子、膵臓ホルモン産生細胞分化関連因子、膵臓疾患関連因子、糖尿病関連因子、ブドウ糖反応性関連因子、β細胞アポトーシス阻害剤、糖尿病治療に有効な薬剤、または自己免疫疾患抑制剤であることができる。これによれば、これらの因子・薬剤等として機能しうる物質を候補物質の中から探索することができる。
【００７１】
９、膵臓ホルモン産生細胞に関与する遺伝子のスクリーニング方法
本発明の膵臓ホルモン産生細胞に関与する遺伝子のスクリーニング方法は、
膵臓ホルモン産生能を有する付着細胞及び浮遊細胞における、１また２以上の遺伝子の発現量を検討する工程と、
両細胞間における前記遺伝子それぞれの発現量を比較する工程と、
両細胞間で発現量の異なる遺伝子を特定する工程と
を含む。これによれば、膵臓ホルモン産生能を有する細胞において、付着性を有する細胞と浮遊性を有する細胞の相違の決定に関与する遺伝子を探索することができる。
【００７２】
前記膵臓ホルモン産生能を有する付着細胞及び浮遊細胞は、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞であることができる。これによれば、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法において生じる膵臓ホルモン産生能を有する細胞において、付着性を有する細胞と浮遊性を有する細胞の相違の決定に関与する遺伝子を探索することができる。
【００７３】
１０、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法の好ましい一態様
本発明のインスリン産生細胞取得方法は、ＥＳ細胞を、インスリンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程を含む。これによれば、ＥＳ細胞由来のインスリン産生細胞を得ることができる。
【００７４】
本発明のインスリン産生細胞取得方法は、
ＥＳ細胞を、付着細胞とインスリンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程と、
前記浮遊細胞を単離する工程と
を含む。これによれば、ＥＳ細胞から得られた付着細胞と浮遊細胞が混在するインスリン産生細胞集団から、浮遊系で培養可能なインスリン産生細胞を得ることができる。浮遊細胞の継代操作や回収操作は、付着細胞のように培養用容器からはがす操作を必要としないために細胞に及ぶダメージが少なく、また操作自体も簡便であり、さらに細胞回収率も優れている。従って、付着細胞よりも容易かつ多量にインスリン産生細胞を取得することができる。
【００７５】
本発明において、前記浮遊細胞は、前記付着細胞よりもインスリンを産生する細胞の割合が多いことができる。これによれば、例えば糖尿病の治療に関して、付着細胞よりも実用化に近いレベルのインスリン産生能を有する、機能的な浮遊細胞を得ることができる。
【００７６】
本発明はさらに、前記浮遊細胞を継代する工程を含むことができる。浮遊細胞の継代操作や回収操作は、付着細胞のように培養用容器からはがす操作を必要としないために細胞に及ぶダメージが少なく、また操作自体も簡便であり、さらに細胞回収率も優れている。また後述の実施例より、本発明に係るインスリン産生細胞は長期培養が可能であることが明らかになった。従って本発明によれば、インスリン産生能を有する浮遊細胞を、浮遊細胞の継代操作、細胞回収率等における利点を利用して、容易かつ多量に増殖させることが可能である。
【００７７】
本発明はさらに、ｐｄｘ−１を発現させる工程を含むことができる。ＥＳ細胞にｐｄｘ−１遺伝子を導入することによってインスリン産生細胞を効率よく分化誘導できること、及びｐｄｘ−１の発現が高いほどインスリンの発現レベルが高いことが、後述の実施例より明らかになった。従って、本発明によれば、インスリン遺伝子の発現が効率よく誘導されたインスリン産生細胞を得ることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７８】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の要旨を超えない範囲で種々の変更が可能である。
【００７９】
１、膵臓ホルモン産生細胞取得方法
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法は、幹細胞を、膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程を含む。
【００８０】
また、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法は、幹細胞を、付着細胞と膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程と、前記浮遊細胞を単離する工程とを含む。
【００８１】
本実施の形態における幹細胞は、ＥＳ細胞または組織幹細胞であることができる。これらの幹細胞を得る方法は特に限定されず、当業者に公知の手法をはじめとした、それぞれの幹細胞を得るのに適した種々の方法を用いることができる。幹細胞がＥＳ細胞である場合は、組織幹細胞を用いた場合よりも多くの膵臓ホルモン産生細胞を得ることが可能である。ＥＳ細胞は理論的には無限に増殖可能であるため、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞の原料として安定な供給源となりうる。さらに、ＥＳ細胞は細胞系列が明確であり品質管理がしやすいという利点がある。幹細胞が組織幹細胞である場合は、前記組織幹細胞は例えば、表皮幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、または腸管幹細胞であることができ、好ましくは内胚葉系である肝幹細胞、膵幹細胞、または腸管幹細胞、特に好ましくは膵幹細胞であることができる。
【００８２】
本実施の形態において、幹細胞が由来とする生物は、ＥＳ細胞または組織幹細胞を得ることができる生物であれば特に限定されずさまざまな生物を用いることができるが、好ましくは哺乳動物、特に好ましくは、幹細胞樹立やヒトへの再生医療に関する研究が進んでいるヒト、サル、イヌ、ブタ、マウス、またはラットであることができる。
【００８３】
本実施の形態において「膵臓ホルモン」とは、膵臓から分泌されるホルモンを指す。具体的には例えば、膵島から分泌されることが知られるグルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチド（ＰＰ）を挙げることができる。
【００８４】
本実施の形態において、幹細胞を膵臓ホルモンを産生する細胞に分化誘導する手法としては、結果的に膵臓ホルモンを産生できる細胞が得られれば特に限定されずさまざまな方法を用いることができる。具体的には、例えばＥＳ細胞を用いてインスリン産生細胞を得る場合、ＥＳ細胞を無血清培地で培養して胚様体を形成させ、そこにさまざまな分化誘導因子を加え、さらにｐｄｘ−１遺伝子、ｎｅｕｒｏＤ遺伝子、Ｉｓｌ１遺伝子、またはＰａｘ６遺伝子等を導入することによってインスリン産生細胞を分化誘導することができる。また、同様にしてＥＳ細胞にＰａｘ４遺伝子、Ｎｋｘ２．２遺伝子等を導入することによってグルカゴン産生細胞を、Ｐａｘ４遺伝子等を導入することによってソマトスタチン産生細胞を、Ｎｋｘ２．２遺伝子等を導入することによって膵ポリペプチド（ＰＰ）産生細胞を分化誘導することができうる。また、後述の実施例より、ＥＳ細胞におけるｐｄｘ−１の発現が高いほど、ソマトスタチンの発現が低下することも明らかになった。
【００８５】
分化誘導に用いる培地としては、幹細胞及び膵臓ホルモン産生細胞の生存や増殖、幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導等が害されない限り特に限定されず、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｆ１２培地等を用いることができる。
【００８６】
幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞へ効果的に分化誘導するために、前記培地にはさらに種々の添加物を加えることができる。前記添加物としては、上記同様、幹細胞及び膵臓ホルモン産生細胞の生存や増殖、幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導が害されない限り特に限定されるものではないが、例えば、サイトカインや膵臓ホルモン産生細胞分化促進因子、ケモカイン、ペプチド、増殖因子等の生理活性物質であることができる。具体的には例えば、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレスシン、亜セレン酸ナトリウム、ヒトケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）（ペプロテック社製）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｂ２７サプリメント、ニコチンアミド等であることができるが、前記添加物は無論これらに限定されるものではない。また、細胞の培養、分化誘導、継代過程において、これらの因子は必要に応じて除去及び添加することができる。
【００８７】
なお、本実施の形態に係る幹細胞を膵臓ホルモン産生細胞に分化誘導する工程は、膵臓ホルモン産生能を有する細胞、または、膵臓ホルモン関連遺伝子を蛍光色素をコードするレポーター遺伝子と組み合わせて発現させた場合に蛍光を発する細胞を分離する工程を含むことができる。前記分離工程に用いる手法は、結果として膵臓ホルモン産生細胞を得ることができれば特に限定されないが、例えばＦＡＣＳ等を用いて、幹細胞には発現しておらず膵臓ホルモン産生細胞において特有に発現している表面抗原を有する細胞を単離する手法を用いることができる。
【００８８】
本実施の形態において幹細胞から分化誘導された細胞集団は、膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む。本実施の形態において、「浮遊細胞」とは細胞培養液等の液体中に浮遊している生細胞を指し、例えばｓｐｈｅｒｅ状で浮遊する細胞を含むことができる。前記「ｓｐｈｅｒｅ状」の細胞とは、増殖した細胞が集合したほぼ球形の浮遊細胞塊を指す。一方、本実施の形態において、「付着細胞」とは培養用容器に付着している生細胞を指す。浮遊細胞と付着細胞は、同じ培養用容器で混在させて培養している場合でも、例えば顕微鏡等によって観察することによって見た目で区別することが可能である。前記見た目による区別の基準としては、例えば、軽くディッシュをゆすると動く細胞を浮遊細胞と判断することによることができる。
【００８９】
本実施の形態において浮遊細胞を単離する手段としては、例えば、浮遊細胞を含む培地を培養用ピペット等を用いて回収する方法を用いることができる。前記方法は、必要に応じて、遠心等によって培地と浮遊細胞を分離し培地を除く工程を含むこともできる。
【００９０】
上記のように、浮遊細胞を単離する操作は、細胞を培養用容器からはがす操作を必要としない。培養用容器等によっては浮遊細胞が底面に付着しやすい場合もあるが、培地で培養用容器を軽く洗うことによって容易に細胞をはがすことが可能である。一方、付着細胞を単離する手段は、付着細胞が有する付着性質のために、トリプシン等の酵素溶液を用いたりスクレイパー等で機械的にかきとったりすることによって培養用容器から細胞をはがす操作を必要とする。従って、浮遊細胞は付着細胞よりも回収操作や単離操作が簡便である。さらに、培養用容器から細胞を取り残すことをできるだけ防止することが可能であるため、浮遊細胞は付着細胞よりも細胞回収率において優れている。
【００９１】
従来から研究されている膵臓ホルモン産生細胞取得方法、例えば、インスリン産生細胞取得方法においては、培養シャーレに付着させる段階を経て分化誘導を行っているため、インスリン産生能を有する付着細胞のみが注目されている。しかし、前述のように、付着細胞は浮遊細胞と比較して継代操作や回収操作に手間がかかり、また、これらの操作によって細胞にダメージが及ぶ。さらに細胞回収率においても、付着細胞は浮遊細胞に劣る。本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法は、浮遊系で培養維持が可能であるという利点があり、また、このような浮遊系の膵臓ホルモン産生細胞自体が新規である。
【００９２】
無血清培地で細胞を浮遊培養する工程を含む方法として、Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法が知られている。Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法は神経幹細胞の選択的培養法であり、多くの場合浮遊細胞のみを培養維持し、継代可能なｐ１０まではほぼ浮遊細胞のみしか見られない。これに対して、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法は、培養過程で付着細胞と浮遊細胞が混在しており、この混在状態から浮遊細胞のみを選択培養していく点で、前記Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法とは異なる。また、ＥＳ細胞を浮遊培養して形成させた胚様体（ＥＢ）は、例えばゼラチンコートしたディッシュの上では、ほぼ全ての細胞がディッシュに付着する性質を有する。これに対して、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法によって得られた浮遊細胞は、分化誘導のステップをいくつか経て、付着細胞とともに培養維持して得られた浮遊細胞であり、ゼラチンコートなしのディッシュの上だけでなくゼラチンコートしたディッシュの上でも、ある程度の量の浮遊細胞が出現する。従って、これらの細胞は性質が異なると考えられる。すなわち、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法によって得られる浮遊細胞は、積極的に浮遊培養しなくとも浮遊する性質を有し浮遊してきた細胞であるということができる。
【００９３】
本実施の形態において、前記浮遊細胞は、前記付着細胞よりも膵臓ホルモンを産生する細胞の割合が多いことができる。
【００９４】
浮遊細胞及び付着細胞それぞれにおける膵臓ホルモン産生能を検討する手法については特に限定されず、さまざまな手法を用いることができる。前記それぞれの細胞が生きている状態を保ったままで膵臓ホルモン産生能を検討する場合は、例えば、浮遊細胞と付着細胞を分離し、培地中に放出される単位細胞数、単位時間あたりの膵臓ホルモン量を検討する手法を用いることができる。前記それぞれの細胞を分離するには、例えば、付着細胞を培養用容器からはがさないように注意して浮遊細胞を含む培地を回収する操作を数回繰り返す手法を用いることができる。膵臓ホルモン量を検討するには、例えば、一定時間後に培地を回収し、前記培地中に存在する膵臓ホルモン量をウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法等を用いて定量する手法を用いることができる。また、それぞれの細胞の一部を膵臓ホルモン産生能検討用サンプルとして分離し膵臓ホルモン産生能を検討する場合は、当業者に公知の手法等を用いてそれぞれのサンプルから膵臓ホルモンタンパク質または前記タンパク質をコードする核酸を抽出し、それらの発現量を検討する手法を用いることができる。タンパク質量を検討する場合は、前記同様、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法等を用いることができる。核酸量を検討する場合は、前記核酸は例えばＲＮＡであることができ、ノーザンブロッティング法、ＲＴ―ＰＣＲ法等を用いることができる。また、サンプルから前記タンパク質または核酸を抽出せず、例えば免疫染色法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法等を用いた染色によって、膵臓ホルモン産生能を評価することも可能である。
【００９５】
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法はさらに、前記浮遊細胞を継代する工程を含むことができる。
【００９６】
浮遊細胞を継代する手法としては、当業者に公知の手法、例えば前記浮遊細胞を単離する手段を用いて浮遊細胞を回収し新たな培地に懸濁する方法を用いることができる。また、必要に応じてピペッティングを行い、浮遊細胞のばらし具合を調節することができる。本実施の形態における好ましいばらし具合は、数個の細胞塊を残した状態であることができる。
【００９７】
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法はさらに、膵臓関連遺伝子を発現させる工程を含むことができる。前記膵臓関連遺伝子は、レポーター遺伝子と組み合わせて発現させることができる。また、前記膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子は、他の作用を有する遺伝子とさらに組み合わせた態様で発現させることも可能である。
【００９８】
前記膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子は、外因性の膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子であることができる。また、前記膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子の発現は、遺伝子発現制御システムによって制御されることができる。
【００９９】
本実施の形態に係る膵臓関連遺伝子としては、幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導や、前記膵臓ホルモン産生細胞の継代維持を妨げるものでなければ特に限定されないが、好ましくは、幹細胞を膵臓ホルモン産生細胞に効率よく分化誘導する作用を有する遺伝子や、膵臓ホルモン産生能を高める作用を有する遺伝子であることができる。具体的には例えば、ｐｄｘ−１遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、及びＨＮＦ６遺伝子からなる群より選ばれる１または２以上の遺伝子であることができる。本実施の形態において特に好ましい膵臓関連遺伝子はｐｄｘ−１遺伝子である。例えばＥＳ細胞にｐｄｘ−１遺伝子を導入することによって、効率よくインスリン産生細胞を分化誘導することができる。
【０１００】
また、本実施の形態に係るレポーター遺伝子としては、その発現を検出・測定することが可能な遺伝子であれば特に限定されるものではないが、好ましくは、蛍光タンパク質をコードする遺伝子や、基質を用いることによって発光または発色反応を示す遺伝子であることができる。具体的には例えば、前記レポーター遺伝子は、ＧＦＰ遺伝子、ＥＧＦＰ遺伝子、ＣＦＰ遺伝子、ＢＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、Ｖｅｎｕｓ遺伝子、ｄｓＲｅｄ遺伝子、またはｌａｃＺ遺伝子であることができる。
【０１０１】
前記膵臓関連遺伝子産物及び／またはレポーター遺伝子産物をコードする核酸は、完全なタンパク質をコードする態様だけでなく、前記タンパク質の一部分をコードする態様や、前記タンパク質のアミノ酸配列の一部に変更を加えたタンパク質をコードする態様等であることもできる。これによって、例えば前記遺伝子が発現することによって期待される作用を高めることや前記遺伝子の発現量を高めること等が可能である。前記アミノ酸配列の一部の変更とは、例えば、１または２以上のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／または挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするような変更であることができる。また、前記核酸の塩基配列の一部を、そのコードするアミノ酸を変更しない塩基配列に変更することも可能である。
【０１０２】
本実施の形態において前記膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子を発現させる手法としては、目的とする膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子の発現レベルを高めることができれば特に限定されない。前記膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子が内在性の遺伝子である場合は、例えば前記遺伝子の発現レベルを上昇させることが知られるサイトカインや膵臓ホルモン産生細胞分化促進因子、ケモカイン、ペプチド、増殖因子等の生理活性物質を培地に添加することによって、または、前記遺伝子の発現レベルを上昇させることが知られる上流遺伝子を細胞に導入することによって、目的とする遺伝子の発現レベルを高めることができる。また、前記膵臓関連遺伝子及び／またはレポーター遺伝子が外因性の遺伝子である場合は、前記遺伝子を細胞に導入することによって、目的とする遺伝子の発現レベルを高めることができる。
【０１０３】
本実施の形態において、細胞に遺伝子を導入する方法としては、結果として目的遺伝子が細胞内に導入され発現することができれば特に限定されず、リポフェクション法、ヒートショック法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、アデノウィルスベクター法、レトロウィルスベクター法、アデノ随伴ウィルスベクター法等をはじめとした当業者に公知の手法等を用いることができる。
【０１０４】
また、本実施の形態において細胞に導入される遺伝子は、相同組換え等を利用したゲノムに組み込まれる態様もゲノムに組み込まれない態様も選択することができるが、好ましくはゲノムに組み込まれる態様である。これによれば、安定して前記遺伝子産物を発現させることや、細胞分裂後も前記遺伝子を確実に娘細胞に受け継がせること等が可能になる。
【０１０５】
本実施の形態において、膵臓関連遺伝子とレポーター遺伝子を組み合わせて発現させる具体的な態様としては、例えば、前記膵臓関連遺伝子とレポーター遺伝子を機能的に連結したベクターを細胞に導入する態様や、前記膵臓関連遺伝子とレポーター遺伝子をそれぞれ別のベクターに導入して一定の割合で混合し細胞に導入する態様等を用いることができる。前者の態様で「機能的に連結」しているとは、前記膵臓関連遺伝子とレポーター遺伝子が同一の導入するベクター上に配置され同一の制御系によって制御されることによって発現が連動することを指す。また、後者の態様で「一定の割合」とは特に、例えば（膵臓関連遺伝子）：（レポーター遺伝子）の比が５：１、１０：１等の、膵臓関連遺伝子の割合の方が高いことを指す。これらの態様によれば、前記膵臓関連遺伝子産物と前記レポーター遺伝子産物が一定の比を保って発現することができる。これによって、前記レポーター遺伝子の発現を指標として、前記膵臓関連遺伝子の発現量の評価・比較・モニター等を行うことができる。また、単に前記膵臓関連遺伝子が導入されたか否かを判別することも可能である。なお、前記膵臓関連遺伝子産物と前記レポーター遺伝子産物は、発現の比が保たれれば、別個のタンパク質として発現しても結合タンパク質として発現してもよい。
【０１０６】
本実施の形態において、幹細胞に膵臓関連遺伝子を発現させる時期は特に限定されるものではなく、前記膵臓関連遺伝子の特性に合わせて時期を選択することができる。例えば、ＥＳ細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する際にｐｄｘ−１遺伝子を発現させる場合は、ＥＳ細胞から胚様体（ＥＢ）を形成させる段階で発現させるのが好ましい。
【０１０７】
本実施の形態に係る遺伝子発現制御システムは、前記膵臓関連遺伝子の発現時期等を制御することができる機構であれば特に限定されないが、例えば薬剤を用いた当業者に公知の転写制御システムを用いることができる。前記システムとしては、例えばテトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン等のテトラサイクリン系抗生物質を用いたシステムを挙げることができる。これらのテトラサイクリン系抗生物質を培地に添加または除去することによって、前記膵臓関連遺伝子の発現を制御することが可能である。より具体的には、例えばドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を培地に添加することによって前記膵臓関連遺伝子の発現を抑えることができ、除去することによって前記膵臓関連遺伝子を発現させることができる。また逆に、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を培地に添加することによって前記膵臓関連遺伝子を発現させることができ、除去することによって前記膵臓関連遺伝子を抑えるシステムであることも可能である。
【０１０８】
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法はさらに、膵臓関連遺伝子またはレポーター遺伝子の発現レベルを基準の一つとして細胞を分類する工程を含むことができる。
【０１０９】
本実施の形態において、ある遺伝子の発現レベルを基準として細胞を分類するとは、具体的には例えば、前記遺伝子を発現している細胞と発現していない細胞を分離する操作、前記遺伝子の発現量が高い細胞群、中程度の細胞群、低い細胞群といったようにグループ分けする操作、前記遺伝子を特定量以上または特定量以下に発現している細胞群のみを選択してくる操作等を指す。従って、前記分類する工程は、前記膵臓関連遺伝子またはレポーター遺伝子の発現が高い細胞を濃縮する工程であることもできる。前記工程には、例えばＦＡＣＳ等を用いることができる。これらによれば、前記遺伝子を使用態様に合った所望の程度に発現している細胞群を取得することができる。
【０１１０】
後述の実施例より、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞においてｐｄｘ−１の発現レベルが高いほど、インスリンの発現量が高いことが明らかになった。従って、本実施の形態に係る膵臓関連遺伝子としてｐｄｘ−１遺伝子を用い、ｐｄｘ−１の発現が高い細胞を濃縮することによって、インスリン発現量が高い細胞を効率的に取得することができる。
【０１１１】
なお、前記膵臓関連遺伝子がレポーター遺伝子と組み合わせて発現されている場合は、前記レポーター遺伝子の発現レベルを前記膵臓関連遺伝子の発現レベルと置き換えて解釈することができる。
【０１１２】
従来の研究結果よりＥＳ細胞にｐｄｘ−１を高発現させすぎると細胞毒性を示す場合があることが示唆されている。従って、本実施の形態に係る膵臓関連遺伝子としてｐｄｘ−１遺伝子を用い本実施の形態に係る方法を用いてインスリン産生細胞を得る場合、前述のようにｐｄｘ−１の発現が高い細胞のみを濃縮して用いるだけでなく、ｐｄｘ−１の発現が中程度または低い細胞群も有効に用いうる可能性がある。
【０１１３】
本実施の形態において細胞を分類する具体的手法としては、結果として必要とする遺伝子発現レベルの膵臓ホルモン産生細胞を得ることができれば特に限定されるものではないが、例えばＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ベクトン・ディッキンソン社製）やａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）等を用いて行うことができる。ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた場合に用いるマーカーは、好ましくは細胞表面タンパク質、蛍光標識されたタンパク質、特定のタンパク質と一定の比率で発現させた蛍光タンパク質等であることができる。ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いた場合、前記分離選別に用いるマーカーは、好ましくは細胞表面タンパク質等であることができる。
【０１１４】
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法によって得られる膵臓ホルモン産生細胞は、例えば、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、またはＰＰ細胞から産生されるホルモンを産生しうる細胞であることができる。具体的には例えば、グルカゴン産生細胞、インスリン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、または膵ポリペプチド（ＰＰ）産生細胞であることができる。本実施の形態において特に好ましい膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞である。
【０１１５】
２、膵臓ホルモン産生細胞
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞は、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法によって得られた膵臓ホルモン産生細胞である。すなわち、上述したように、幹細胞を、膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導することによって得ることや、幹細胞を、膵臓ホルモンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導することによって得られる浮遊細胞を継代することによって得ることができる。
【０１１６】
本実施の形態に係る幹細胞は、ＥＳ細胞または組織幹細胞であることができる。幹細胞がＥＳ細胞である場合は、組織幹細胞を用いた場合よりも多くの膵臓ホルモン産生細胞を得ることが可能である。ＥＳ細胞は理論的には無限に増殖可能であるため、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞の原料として安定な供給源となりうる。さらに、ＥＳ細胞は細胞系列が明確であり品質管理がしやすいという利点がある。幹細胞が組織幹細胞である場合は、前記組織幹細胞は例えば、表皮幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、または腸管幹細胞であることができ、好ましくは内胚葉系である肝幹細胞、膵幹細胞、または腸管幹細胞、特に好ましくは膵幹細胞であることができる。
【０１１７】
本実施の形態において、幹細胞が由来とする生物は、ＥＳ細胞または組織幹細胞を得ることができる生物であれば特に限定されずさまざまな生物を用いることができるが、好ましくは哺乳動物、特に好ましくは、幹細胞樹立やヒトへの再生医療に関する研究が進んでいるヒト、サル、イヌ、ブタ、マウス、またはラットであることができる。
【０１１８】
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞は、浮遊細胞であることができる。
【０１１９】
細胞をディッシュから回収する場合、浮遊細胞は、細胞培養液等の液体中に浮遊している細胞であるため、細胞培養液を回収することによって細胞自体を回収することができ、培養用容器からはがす操作を必要としない。一方、付着細胞は培養用容器に付着している細胞であるため、回収には培養用容器から細胞をはがす操作を必要とする。前記操作は多くの場合、トリプシン等の酵素溶液を用いたりスクレイパー等で物理的にかきとったりすることによって行う。従って、浮遊細胞は、付着細胞よりも簡便に細胞を回収することができる。さらに、浮遊細胞は、回収の際に培養用容器等に残留する細胞量が付着細胞よりも少なくて済むため、細胞回収率においても付着細胞より優れている。
【０１２０】
また、細胞を継代する際に細胞どうしをばらす場合、浮遊細胞は付着細胞と比較して、酵素処理や物理的な刺激をよりマイルドな条件で行うことが可能である。従って、浮遊細胞は付着細胞と比較して継代操作によって細胞に及ぶダメージが少ない。
【０１２１】
以上より、細胞回収、継代操作において、付着細胞と比較した浮遊細胞の特長は、細胞を長期に渡って継代維持する必要がある場合や多量に継代維持・増幅する必要がある場合において、大きな利点となる。また、浮遊系で継代培養可能である膵臓ホルモン産生細胞自体が新規である。
【０１２２】
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞は、膵臓関連遺伝子を発現していることができる。前記膵臓関連遺伝子としては、幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導や、前記膵臓ホルモン産生細胞の継代維持を妨げるものでなければ特に限定されないが、好ましくは、幹細胞を膵臓ホルモン産生細胞に効率よく分化誘導する作用を有する遺伝子や、膵臓ホルモン産生能を高める作用を有する遺伝子であることができる。具体的には例えばｐｄｘ−１遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、及びＨＮＦ６遺伝子からなる群より選ばれる１または２以上の遺伝子であることができる。本実施の形態において特に好ましい膵臓関連遺伝子はｐｄｘ−１遺伝子である。例えばＥＳ細胞にｐｄｘ−１遺伝子を導入することによって、効率よくインスリン産生細胞を分化誘導することができる。
【０１２３】
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞は、医薬品候補物質の前臨床試験、医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品の効能試験、あるいは医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品の候補物質の効能試験で用いることができる。
【０１２４】
医薬品の開発は一般に、前臨床試験、すなわち実験動物を用いて医薬品候補物質の有効性及び安全性を確認する試験を経て臨床試験に入るプロセスを経る。従って、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を担持した実験動物に医薬品候補物質を作用させることによって、医薬品候補物質の前臨床試験を行うことができる。本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を担持した実験動物は、例えば、後述の本実施の形態に係るモデル動物を用いることができる。また、前記実験動物に医薬品候補物質を作用させる方法としては、例えば、前記物質を注射する方法や経口投与する方法等、当業者に公知の手法等を用いることができる。
【０１２５】
前記医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品、あるいはこれらの候補物質の効能試験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏでの毒性試験等を含む。前記効能試験は、前記医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品、あるいはこれらの候補物質を、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞に作用させることによって、または、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を担持した実験動物に作用させることによって行うことができる。本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞に作用させる具体的方法としては、例えば、前記医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品、あるいはこれらの候補物質を、前記細胞を培養している培地に直接添加する方法等、さまざまな方法を用いることができる。また、前記実験動物に作用させる具体的方法としては例えば、経口投与する方法や皮膚等に塗布する方法等、さまざまな方法を用いることができる。
【０１２６】
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞は、例えば、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、またはＰＰ細胞から産生されるホルモンを産生しうる細胞であることができる。具体的には例えば、グルカゴン産生細胞、インスリン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、または膵ポリペプチド（ＰＰ）産生細胞であることができる。本実施の形態において特に好ましい膵臓ホルモン産生細胞は、インスリン産生細胞である。
【０１２７】
３、組成物
本実施の形態に係る組成物は、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を含む組成物である。前記組成物の態様は特に限定されず、またさまざまな用途に用いることができる。前記態様としては例えば、他の物質と混合した態様、液体に懸濁した態様、他の物質と組み合わせた態様等であることができる。また、前記組成物中の本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞が産生する膵臓ホルモンのみが実際に用いられる態様であることも可能である。また、前記用途としては例えば、膵臓疾患や糖尿病等の治療に用いたり、前記疾患の治療用組成物として販売したりすることができる。
【０１２８】
前記組成物は薬剤であることができる。本実施の形態に係る薬剤の態様や用途は特に限定されるものではないが、例えば糖尿病の治療剤であることができる。糖尿病の治療剤の態様としては、例えば、インスリン投与を必要とする患者に対する細胞医薬品であることができる。前記細胞医薬品は、ヒトだけでなく、例えばイヌ、ネコ等のペットに用いることができる態様とすることができる。
【０１２９】
前記組成物は医療用組成物であることができる。前記医療用組成物の態様は特に限定されるものではなく、生体内に直接投与しうる態様や生体外で用いうる態様であることができる。生体内に直接投与しうる態様としては例えば、注射や点滴等であることができる。生体外で用いる態様としては例えば、前記医療用組成物中の本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞から、さらに膵臓ホルモン産生細胞を医療用に増幅する態様、または膵臓ホルモンを医療用に取得する態様であることができる。また、医療用キットの態様であることも可能である。
【０１３０】
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を移植に用いる場合、前記医療用組成物は、好ましくはカプセル等の免疫隔離膜によって覆われたバイオ人工臓器の態様であることができる。具体的には、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を免疫隔離膜に封入し患者の体内に移植する。これにより、前記細胞が産生する膵臓ホルモンを体内に分泌させることができる。
【０１３１】
免疫隔離膜を用いた態様によれば、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞として非自己由来の細胞を用いた場合も免疫抑制剤の投与が不要となる。さらに、一度体内に移植した膵臓ホルモン産生細胞を回収することも可能になる。また、移植した膵臓ホルモン産生細胞が有する遺伝子発現制御システムを利用することによって、前記細胞が産生する膵臓ホルモン量を体外から制御することも可能である。
【０１３２】
免疫隔離膜として使用される半透膜としては、封入された本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を免疫拒絶反応から保護し、かつ前記細胞が産生する膵臓ホルモンを透過させることができれば特に限定されず、さまざまな材料を用いることができる。好ましくは、前記材料は低アレルゲン性であり、容易かつ安定に標的組織に入れられる態様である。具体的には例えば、当業者に公知の、アガロースゲルビーズに封入したマイクロカプセルの態様や、塩化ビニル−アクリロニトリル共重合体膜製のマクロカプセルの態様等を用いることができるが、無論これらに限定されるものではない。また、細胞の封入方法についても当業者に公知の方法等を用いることができる。また、患者の体内に移植する方法については例えば、腹腔内移植や皮下移植、門脈内移植等、当業者に公知の方法等を用いることができる。
【０１３３】
本実施の形態に係る組成物は、膵臓疾患、糖尿病、糖尿病の合併症、網膜症、または腎症の予防・治療に用いることができる。具体的には例えば、本実施の形態に係る組成物が、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞としてインスリン産生細胞を含む場合、例えば、門脈内移植を行い肝臓に生着させることによって行うことができる。なお、本実施の形態に係る組成物を用いた疾患の予防・治療の態様は、無論これに限定されるものではない。
【０１３４】
本実施の形態に係る組成物は、実験試薬または実験キットであることができる。これによれば、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を、さまざまな研究に適した態様で用いることができる。前記研究としては、例えば、付着系膵臓ホルモン産生細胞と浮遊系膵臓ホルモン産生細胞の相違、幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化機構、膵臓ホルモン産生細胞における膵臓ホルモン産生・分泌機構、またはそのシグナル伝達経路において機能する遺伝子の機能等の解析であることができる。前記膵臓ホルモンは、例えば、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチド（ＰＰ）であることができる。
【０１３５】
４、モデル動物
本実施の形態に係るモデル動物は、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を担持したモデル動物であることができる。
【０１３６】
前記モデル動物としては例えば、マウス、ラット等であることができるがこれらに限定されるものではない。本実施の形態における好ましいモデル動物は、マウスである。モデル動物としてマウスを用いた場合は、旺盛な繁殖力を有することや遺伝子レベルでヒトと非常に近い関係にあること等のマウスの利点を研究・試験等に利用することができる。
【０１３７】
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞をモデル動物に担持させる部位は特に限定されず所望の部位を選択することができ、モデル動物の体の一部分でも体全体でもよく、一箇所でも複数箇所でもよい。本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞である場合、モデル動物に前記細胞を担持させる好ましい部位は、腎皮下膜である。
【０１３８】
また、前記細胞をモデル動物に担持させる方法は、結果として前記細胞を前記モデル動物に担持させることができれば特に限定されない。前記細胞を体の一部分に担持させる手法としては、例えば、移植等の手法を用いることができる。移植の具体的方法は、前記細胞を移植針にて移植する方法、前記細胞懸濁液を注射針で移植する方法等、当業者に公知の手法を用いることができる。体全体に担持させる手法としては、例えば、ノックアウト動物やトランスジェニック動物等の遺伝子改変動物の作製方法等を用いることができる。
【０１３９】
また、本実施の形態に係るモデル動物は、疾患モデル動物であることができる。前記疾患モデル動物が有する疾患は特に限定されるものではないが、例えば膵臓疾患、糖尿病、糖尿病の合併症、網膜症、または腎症であることができる。
【０１４０】
本実施の形態に係る疾患モデル動物は、自然発症した膵臓ホルモン産生細胞に係る疾患または膵臓ホルモンに係る疾患を有する疾患モデル動物や、人工的に発症させた膵臓ホルモン産生細胞に係る疾患または膵臓ホルモンに係る疾患を有する疾患モデル動物であることができる。前記自然発症による疾患モデル動物としては、例えば糖尿病モデル動物、具体的には糖尿病マウスモデル、糖尿病ラットモデル、糖尿病サルモデル、糖尿病イヌモデル等であることができる。また、前記人工的に発症させた疾患モデル動物としては、例えば膵臓ホルモンタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトしたノックアウト動物や、前記膵臓ホルモンの欠乏や働きの低下等によっておこる疾患を発症させる遺伝子を導入したトランスジェニック動物等の、遺伝子改変動物であることができる。具体的には、例えば糖尿病発生遺伝子をマウスに導入した糖尿病発生トランスジェニックマウス等であることができる。
【０１４１】
本実施の形態に係るモデル動物は、免疫不全モデル動物であることができる。免疫不全動物は、非自己由来の細胞を移植されても拒絶できず安定して保持することができる。前記モデル動物がマウスである場合は、前記マウスはヌードマウスやスキッドマウス等であることができる。前記モデル動物がラットである場合は、前記ラットはＴ細胞機能欠如ラット等であることができる。
【０１４２】
本実施の形態に係るモデル動物は、医薬品候補物質の前臨床試験、医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品の効能試験、あるいは医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品の候補物質の効能試験で用いることができる。
【０１４３】
本実施の形態に係るモデル動物を医薬品候補物質の前臨床試験に用いる場合の具体例を以下に示す。前記疾患モデル動物が糖尿病モデルマウスであって、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞である場合、本実施の形態に係るモデル動物は、本実施の形態に係るインスリン産生細胞を担持した糖尿病モデルマウスであることができる。従って、このマウスに医薬品候補物質を作用させ前記マウスの血糖値の変化や副作用の有無等を検討することによって、前記医薬品候補物質の前臨床試験を行うことができる。この場合、前記医薬品候補物質は例えば、本実施の形態に係るインスリン産生細胞のインスリン産生能に影響を及ぼす作用を有する糖尿病治療薬または糖尿病治療補助薬等であることができる。前記影響は例えば、インスリンの産生期間、産生効率、または産生量等に及ぼす影響であることができる。
【０１４４】
また、本実施の形態に係るモデル動物を医薬品、医薬部外品、食品、または化粧品、あるいはこれらの候補物質の効能試験で用いる場合も、前記医薬品候補物質の前臨床試験に用いる場合の具体例と同様にして、または、試験項目や試験方法等を適宜変更して用いることができる。具体的には例えば、本実施の形態に係る糖尿病モデルマウスに特定の食品を与えた後の血糖値の変化等を検討することによって、前記食品の効能試験を行うことができる。この場合、前記食品は例えば、本実施の形態に係るインスリン産生細胞のインスリン産生に影響を及ぼす糖尿病治療用補助食品であることができる。
【０１４５】
なお、本実施の形態に係るモデル動物の有する疾患、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞、試験を行う態様等は、無論上記に限定されるものではない。
【０１４６】
５、膵臓ホルモン産生能予測方法
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生能予測方法は、膵臓ホルモン産生細胞について膵臓関連遺伝子の発現を検討する工程を含む。また、前記膵臓ホルモン産生細胞は、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞であることができる。
【０１４７】
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生能予測方法は、個別の細胞における膵臓ホルモン産生能、細胞集団全体として有する膵臓ホルモン産生能、及び細胞集団において膵臓ホルモン産生能を有する細胞の割合等を予測する方法を含む。
【０１４８】
本実施の形態において、膵臓関連遺伝子の発現を検討する手法については特に限定されず、さまざまな手法を用いることができる。また、前記膵臓関連遺伝子の発現をレポーター遺伝子の発現によってモニターできる場合は、前記レポーター遺伝子の発現に基づいて前記膵臓関連遺伝子の発現を評価することができる。これらの遺伝子の発現をタンパク質の発現量によって検討する場合は、例えば当業者に公知のウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法等を用いることができる。また、核酸の発現量によって検討する場合は、前記核酸は例えばＲＮＡであることができ、ノーザンブロッティング法、ＲＴ―ＰＣＲ法等を用いることができる。また、サンプルから前記タンパク質または核酸を抽出せず、例えば免疫染色法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法等を用いた染色法を用いることも可能である。また、レポーター遺伝子産物の有する活性を指標として前記膵臓関連遺伝子の発現を評価することもできる。
【０１４９】
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生能予測方法は、膵臓関連遺伝子の発現を検討した結果を用いて膵臓ホルモン産生能を予測することが可能である。例えば、膵臓関連遺伝子の発現を膵臓ホルモン産生能を予測する指標の一つとすることができる。前記膵臓関連遺伝子は特に限定されるものではないが、例えば前記膵臓関連遺伝子は、ｐｄｘ−1遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、またはＨＮＦ６遺伝子であることができる。後述の実施例より、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法によって得られたインスリン産生細胞において、ｐｄｘ−１遺伝子の発現レベルが高いほどインスリンの発現量が高いことが明らかになった。従って、前記方法によって得られたインスリン産生細胞におけるｐｄｘ−１の発現レベルを検討することによって、前記インスリン産生細胞のインスリン産生能を予測することができる。
【０１５０】
また、本実施の形態に係る膵臓ホルモンはインスリンだけでなく、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチド（ＰＰ）であることができる。
【０１５１】
６、疾患の予防・治療方法
本実施の形態に係る疾患の予防・治療方法は、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を用いた疾患の予防・治療方法である。
【０１５２】
前記疾患は例えば、膵臓疾患、糖尿病、糖尿病の合併症、網膜症、または腎症であることができる。
【０１５３】
前記疾患の予防・治療方法は例えば、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を生物に移植する工程を含むことができる。
【０１５４】
移植の具体的方法は、前記細胞を門脈内移植で肝臓に生着させる方法等、当業者に公知の手法を用いることができる。
【０１５５】
また、成人の糖尿病患者の治療には、１×１０４個／ｋｇの膵島細胞が必要であることが知られている。従って、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を移植に用いる場合に用いる細胞量は、例えば、前記値を目安とし、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞の膵臓ホルモン産生能を考慮して決定することができる。
【０１５６】
しかし、移植によるヒト疾患の予防・治療方法においては、非自己由来の細胞移植によっておこる免疫拒絶反応が最も懸念される。同種他家細胞移植においては、免疫抑制剤を使用したり、遺伝子改変を行ったり、ＥＳ細胞の核のみを患者細胞のものと置換することで、免疫拒絶反応を回避することが可能である。異種由来の細胞や臓器をヒトに移植した場合には、移植直後の超急性の拒絶反応が起きると救済はとても困難であり、さらに、長年ヒトに感染しないと信じられてきたその生物特有の微生物やウィルスが、ヒトに感染する危険因子であることが判明する場合もある。
【０１５７】
そこで、前記膵臓ホルモン産生細胞が由来とする幹細胞は、前記膵臓ホルモン産生細胞の移植を受ける生物の自己由来であることができる。これによれば、移植によっておこる免疫拒絶反応を回避することができる。なお、自己由来の幹細胞を用いた場合でも、幹細胞に刺激等を加えたことによって細胞の抗原性、特性等が変化し免疫拒絶反応が起こる可能性もあり、この場合は免疫抑制剤等を用いて免疫拒絶反応を回避することができる。
【０１５８】
前記幹細胞は、ＥＳ細胞または組織幹細胞であることができる。幹細胞がＥＳ細胞である場合は、組織幹細胞を用いた場合よりも多くの膵臓ホルモン産生細胞を得ることが可能である。ＥＳ細胞は理論的には無限に増殖可能であるため、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞の原料として安定な供給源となりうる。さらに、ＥＳ細胞は細胞系列が明確であり品質管理がしやすいという利点がある。幹細胞が組織幹細胞である場合は、前記組織幹細胞は例えば、表皮幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、または腸管幹細胞であることができ、好ましくは内胚葉系である肝幹細胞、膵幹細胞、または腸管幹細胞、特に好ましくは膵幹細胞であることができる。
【０１５９】
本実施の形態において、幹細胞が由来とする生物は、ＥＳ細胞または組織幹細胞を得ることができる生物であれば特に限定されずさまざまな生物を用いることができるが、好ましくは哺乳動物、特に好ましくは、幹細胞樹立やヒトへの再生医療に関する研究が進んでいるヒト、サル、イヌ、ブタ、マウス、またはラットであることができる。
【０１６０】
また、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞は、免疫隔離膜によって覆われたバイオ人工臓器の態様であることもできる。これによれば、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞が非自己の細胞由来である場合に免疫拒絶反応を抑制することができ、さらに一度体内に移植した膵臓ホルモン産生細胞を回収することが可能である。
【０１６１】
７、被験物質が膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響の検討方法
本実施の形態に係る被験物質が膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響の検討方法は、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞に、１または２以上の被験物質を作用させる工程と、前記被験物質を作用させた場合の前記膵臓ホルモン産生細胞と、前記被験物質を作用させない場合の前記膵臓ホルモン産生細胞を、比較検討する工程とを含む。
【０１６２】
前記被験物質としては特に限定されず、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響を検討したい物質であればどのようなものでも用いることができるが、例えば、核酸、タンパク質またはペプチド、あるいはこれら以外の化合物であることができる。また、これらの混合物や、生物体、生物組織、または生物細胞からの抽出物、あるいは前記生物体、生物組織、または生物自体であることもできる。また、前記被験物質は天然物でも合成物でもよい。
【０１６３】
また、１または２以上の被験物質を作用させる工程に用いられる手法は、特に限定されるものではなく種々の手法を用いることができる。例えば、被験物質の存在下で、幹細胞から本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞に分化誘導される過程にある細胞や本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を、培養する手法を用いることができる。また、被験物質とこれらの細胞を、適切なバッファー中で一定時間混合する手法や、被験物質を本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞に導入する手法も用いることができる。
【０１６４】
被験物質を作用させた場合の本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞と、作用させない場合の本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を比較検討する工程は、さまざまな観点から行うことができ、例えば、細胞の形態、細胞の生存率、細胞の増殖率、膵臓ホルモン発現が変化した細胞数または細胞割合、細胞が産生する膵臓ホルモン量、特定の遺伝子の発現量、特定の核酸の局在、特定のタンパク質の局在、特定のタンパク質の活性、あるいは特定のタンパク質の量の増加または減少を指標の一つとすることができる。前記特定の遺伝子、特定の核酸、及び特定のタンパク質はそれぞれ、膵臓関連遺伝子、膵臓関連遺伝子産物をコードする核酸、及び膵臓関連遺伝子産物であることができる。前記膵臓関連遺伝子は特に限定されるものではないが、例えばｐｄｘ−１遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、またはＨＮＦ６遺伝子であることができる。
【０１６５】
また、前記比較検討に用いる具体的手法についても特に限定されず、上記それぞれの指標に基づいて検討するのに適した手法を用いることができる。例えば、細胞が産生する膵臓ホルモン量について検討する場合は、それぞれの細胞中に存在する、または培地中に放出される膵臓ホルモン量を、例えば当業者に公知のウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法等によって定量することによって検討することができる。また、例えば、特定の核酸の局在変化を検討する場合は、前記核酸は例えばＲＮＡであることができ、例えば当業者に公知の免疫染色法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法等の染色法を用いて検討することが可能である。また、この比較検討する工程は、それぞれの細胞をモデル動物に担持させて行うことも可能である。なお、本実施の形態に係る比較検討する工程は、無論上記態様に限定されるものではない。
【０１６６】
前記被験物質が膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響は特に限定されるものではないが、例えば、膵臓ホルモン産生細胞に対する毒性、膵臓ホルモン産生能の促進、または膵臓関連遺伝子発現の変化であることができる。
【０１６７】
８、膵臓ホルモン産生細胞に特定の影響を及ぼす物質のスクリーニング方法
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞に特定の影響を及ぼす物質のスクリーニング方法は、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞に、１または２以上の特定の影響を及ぼす物質の候補物質を作用させる工程と、前記候補物質を作用させた場合の前記膵臓ホルモン産生細胞と、前記候補物質を作用させない場合の前記膵臓ホルモン産生細胞を、比較検討する工程とを含む。
【０１６８】
前記特定の影響とは、幹細胞から本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を取得する過程で生じる細胞や本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞に及ぼす影響であれば特に限定されないが、前記特定の影響を及ぼす物質とは例えば、膵臓ホルモン産生促進因子、膵臓ホルモン産生阻害因子、膵臓ホルモン分泌促進因子、膵臓ホルモン分泌阻害因子、膵臓ホルモン産生細胞分化促進因子、膵臓ホルモン産生細胞分化阻害因子、膵臓細胞分化関連因子、膵臓ホルモン産生細胞分化関連因子、膵臓疾患関連因子、糖尿病関連因子、ブドウ糖反応性関連因子、β細胞アポトーシス阻害剤、糖尿病治療に有効な薬剤、または自己免疫疾患抑制剤であることができる。
【０１６９】
前記候補物質としては特に限定されずどのようなものでも用いることができるが、例えば、核酸、タンパク質またはペプチド、あるいはこれら以外の化合物であることができる。また、これらの混合物や、生物体、生物組織、または生物細胞からの抽出物、あるいは前記生物体、生物組織、または生物自体であることもできる。また、前記候補物質は天然物でも合成物でもよい。
【０１７０】
前記候補物質は、ライブラリーの態様であることができる。これによれば、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞に特定の影響を及ぼす物質を網羅的にスクリーニングすることができる。前記ライブラリーとしては特に限定されるものではないが、例えば、ｃＤＮＡライブラリー、ペプチドライブラリー、合成化合物ライブラリー等であることができる。
【０１７１】
また、前記候補物質を選択したり入手したりする手段は特に限定されず、あらかじめ用意された物質を用いることや、新たに作製した物質を用いることができる。前記物質が例えば化合物である場合、あらかじめ用意された化合物を用いる場合は、例えば、ウェブ上で公開されているさまざまな化合物情報データベースを利用することができる。前記データベースとしては、例えば、ＮＣＩ（米国国立がん研究所）等で公開されている化合物データベースを用いることができる。また、新たに作製した化合物を用いる場合は、例えば、特定の医薬品開発目的で合成した独自の化合物を用いることができる。特定の医薬品とは特に限定されるものではないが、例えば、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞の膵臓ホルモン産生促進薬、膵臓ホルモン分泌促進薬、膵臓ホルモン産生細胞分化促進薬等であることができる。また、前記物質群を合成するには、例えば、コンビナトリアル・ケミストリー等の技術を用いることができる。
【０１７２】
また、前記候補物質は、前記候補物質が有する活性等を予測することによって、あらかじめ選別されることも可能である。予測する手段としては、さまざまなデータベースに加えて種々のソフトウェアを用いることもできる。前記ソフトウェアとしては、例えば、その物質の薬理活性や薬物動態、毒性等を事前に検証することができるソフトウェアや、化合物の体内での挙動をあらかじめ検証することができるソフトウェア等を挙げることができる。このような手段を利用することによって、コンピュータ上で大量の候補物質を高速で検証することが可能になり、本スクリーニング自体や例えばその後の製薬ステップにかかる、時間や労力、コスト等を削減することが期待できる。
【０１７３】
また、１または２以上の候補物質を作用させる工程に用いられる手法は、特に限定されるものではなく種々の手法を用いることができる。例えば、幹細胞から本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞に分化誘導される過程で生じる細胞や本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を、候補物質の存在下で培養する手法を用いることができる。また、候補物質とこれらの細胞を、適切なバッファー中で一定時間混合する手法や、候補物質を本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞に導入する手法も用いることができる。
【０１７４】
候補物質を作用させた場合の本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞と、作用させない場合の本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞を比較検討する工程は、さまざまな観点から行うことができ、例えば、細胞の形態、細胞の生存率、細胞の増殖率、膵臓ホルモン発現が変化した細胞数または細胞割合、細胞が産生する膵臓ホルモン量、特定の遺伝子の発現量、特定の核酸の局在、特定のタンパク質の局在、特定のタンパク質の活性、あるいは特定のタンパク質の量の増加または減少を指標の一つとすることができる。前記特定の遺伝子、特定の核酸、及び特定のタンパク質はそれぞれ、膵臓関連遺伝子、膵臓関連遺伝子産物をコードする核酸、及び膵臓関連遺伝子産物であることができる。前記膵臓関連遺伝子は特に限定されるものではないが、例えばｐｄｘ−１遺伝子、ｎｇｎ３遺伝子、ｐ４８遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｐｃ２遺伝子、またはＨＮＦ６遺伝子であることができる。
【０１７５】
また、前記比較検討に用いる具体的手法についても特に限定されず、上記それぞれの指標に基づいて検討するのに適した手法を用いることができる。例えば、膵臓ホルモン産生促進因子や膵臓ホルモン産生細胞分化促進因子等をスクリーニングする場合は、例えば、細胞が産生する膵臓ホルモン量を比較検討する指標の一つとし、候補物質を作用させた場合と作用させない場合における、細胞中に存在する、または培地中に放出される膵臓ホルモン量を比較検討することができる。ここで比較検討に用いる手法としては、例えば当業者に公知のウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法等を用いることができる。この比較検討の結果、候補物質を作用させた場合の方が膵臓ホルモン量が上昇していた場合は、前記候補物質は、膵臓ホルモン産生促進因子や膵臓ホルモン産生細胞分化促進因子等である可能性がある。前記候補物質がライブラリーであることによって、候補物質を網羅的に比較検討してスクリーニングすることができる。また、この比較検討する工程は、それぞれの細胞をモデル動物に担持させて行うことも可能である。なお、本実施の形態に係る比較検討する工程は、無論上記態様に限定されるものではない。
【０１７６】
９、膵臓ホルモン産生細胞に関与する遺伝子のスクリーニング方法
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞に関与する遺伝子のスクリーニング方法は、膵臓ホルモン産生能を有する付着細胞及び浮遊細胞における、１また２以上の遺伝子の発現量を検討する工程と、両細胞間における前記遺伝子それぞれの発現量を比較する工程と、両細胞間で発現量の異なる遺伝子を特定する工程とを含む。
【０１７７】
これによれば、膵臓ホルモン産生細胞の付着性質及び／または浮遊性質の決定に関与している遺伝子を探索することができる。
【０１７８】
１また２以上の遺伝子の発現量を検討する工程、比較する工程、特定する工程に用いられる手法は特に限定されるものではなく、種々の手法を用いることができるが、例えば当業者に公知のマイクロアレイやサブトラクション法等を用いることができる。
【０１７９】
前記膵臓ホルモン産生能を有する付着細胞及び浮遊細胞は、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞であることができる。
【０１８０】
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞のように浮遊系で継代維持可能な膵臓ホルモン産生細胞は新規である。また、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法によって付着細胞及び浮遊細胞が得られる場合、前記付着細胞及び浮遊細胞は、同じ培養条件のもとで得られてきた細胞である。浮遊細胞は付着細胞と比較して、細胞の継代操作や回収操作、前記操作の際に細胞に及ぶダメージの低さ、及び細胞回収率等において多くの利点を有している。従って、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞に関与する遺伝子のスクリーニング方法によれば、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法によって得られる付着細胞及び浮遊細胞において、付着性質及び／または浮遊性質の決定に関与している遺伝子を探索することができる。また、これらの遺伝子は付着性質及び／または浮遊性質の決定だけでなく、膵臓ホルモン産生能に関わるシグナル伝達にも関与している可能性もある。
【０１８１】
１０、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法の好ましい一態様
以下に、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法の好ましい一態様を示す。
【０１８２】
本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法において、好ましい膵臓ホルモンはインスリンである。また、好ましい幹細胞はＥＳ細胞である。
【０１８３】
従って、本実施の形態に係るインスリン産生細胞取得方法の好ましい態様は、ＥＳ細胞を、インスリンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程を含む態様や、ＥＳ細胞を、付着細胞とインスリンを産生する浮遊細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程と、前記浮遊細胞を単離する工程とを含む態様である。
【０１８４】
前記方法は、さらにｐｄｘ−１を発現させる工程を含むことが好ましい。これによって効率よくインスリン産生細胞を得たり、インスリンを効率よく産生させたりすることが可能になる。具体的には、ＧＦＰ遺伝子等のレポーター遺伝子によってｐｄｘ−１遺伝子の発現レベルをモニターできる態様で、ＥＳ細胞のゲノムに組み込まれていることが好ましい。また、これらの遺伝子の発現は、テトラサイクリンやドキシサイクリン等を添加することによって制御可能であることが好ましい。
【０１８５】
前記方法はさらに、本実施の形態によって得られる浮遊細胞を継代する工程を含むことができる。後述の実施例より、ｐｄｘ−１を発現させる工程を含む本実施の形態に係るインスリン産生細胞取得方法によって得られたインスリン産生細胞は、長期培養しても増殖維持することが可能であり、ｐｄｘ−１の発現を維持している細胞はインスリン産生能を維持できることが明らかになった。従って、本実施の形態に係るインスリン産生細胞は継代を繰り返して増幅することが可能であり、移植等に用いるために必要な量のインスリン産生細胞を取得することが可能である。
【０１８６】
前記浮遊細胞は、前記付着細胞よりもインスリンを産生する細胞の割合が多いことができる。
【０１８７】
１１、本発明のその他の有用性
また、膵臓と肝臓は共に内胚葉由来の組織であり、膵臓細胞と肝臓細胞との間の相互変換が可能であることが知られている。従って、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法を応用することによって、肝細胞を分化させることが可能であると考えられる。前記肝細胞は、幹細胞由来で、浮遊系で培養可能であることができる。従って、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法等は、膵臓ホルモン産生細胞に係る疾患や膵臓ホルモンに係る疾患を有する患者に有効であるだけでなく、肝疾患の患者にも有効に応用することができ、肝疾患の予防・治療に用いうる。また、胃、腸等、他の内胚葉由来の細胞においても同様に、本実施の形態に係る膵臓ホルモン産生細胞取得方法を応用することによって分化誘導しうると考えられる。
【実施例１】
【０１８８】
以下、本発明を実験例に基づき、図面を参照しながらより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は本実施例に限定されるものではない。
【０１８９】
（実験例１）インスリン産生細胞の分化誘導
ＥＳ細胞から分化誘導したインスリン産生細胞を得るために、発明者らが以前に樹立したｐｄｘ−１及びＥＧＦＰ遺伝子をノックインしたマウスＥＳ細胞（ミヤザキ（Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｓ．）ら、「ダイアビーテス（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）」、２００４年、第５３巻、ｐ．１０３０−７、図１）を用いて、分化誘導実験を行った。なお、前記ｐｄｘ−１及びＥＧＦＰ遺伝子をノックインしたＥＳ細胞は、図１の模式図に示すように、ｐｄｘ−１遺伝子及びＥＧＦＰ遺伝子の発現をテトラサイクリンによって同時に制御されることができる。また、ノックインベクターはＲＯＳＡ２６遺伝子座にノックインされている（以下、このＥＳ細胞を「ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ細胞」と記す。）。なお、図１において、"ｎｅｏ"は「ネオマイシン耐性遺伝子」、"ｔＴＡ"は「サイクリン制御性転写活性化因子」、"ＤＴＡ"は「ジフテリアトキシンＡフラグメント」をそれぞれ示す。
【０１９０】
（１）ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ細胞からインスリン細胞への分化誘導は、図２に示す実験ステップに従って行った。まず、ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ細胞を、１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）（シグマ社製）存在下でｐｄｘ−１及びＥＧＦＰ遺伝子を発現させずに培養した（ステージ０）。培地は、１０％  ＦＣＳ（セルカルチャーテクノロジー社製）を加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（ギブコ社製）を用いた。
【０１９１】
（２）２〜３日後、Ｄｏｘを除去した培地を用いて大腸菌培養用ディッシュに細胞を継代し、４〜５日後に胚様体（ＥＢ）を形成させた（ステージ１）。
【０１９２】
（３）さらに１〜２日後、ゼラチンコートしたディッシュに継代してＥＳをディッシュに張り付かせた（ステージ２）。
【０１９３】
（４）翌日、培地を無血清ＩＴＳＦｎ培地（５μｇ／ｍｌ  インスリン（シグマ社製）、５０μｇ／ｍｌ  トランスフェリン（シグマ社製）、３０ｎＭ  塩化セレン（シグマ社製）、５μｇ／ｍｌ  フィブロネクチン（バイオメディカルテクノロジー社製）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地））に交換して３〜６日間培養し、ネスチン陽性細胞をセレクションした（ステージ３）。
【０１９４】
（５）生き残った細胞をゼラチンコートしたディッシュに継代し、さらに６〜８日間培養した。培地は、２５μｇ／ｍｌインスリン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０ｎｍｌ／ｌプロゲステロン、６０μｍｏｌ／ｌプトレスシン、３０ｎｍｏｌ／ｌ亜セレン酸ナトリウム、１０ｎｇ／ｍｌヒトケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）（ペプロテック社製）、２０ｎｇ／ｍｌ上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（シグマアルドリッチ社製）、２５ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（ストラスマンバイオテック社製）、Ｂ２７サプリメント（インビトロジェン社製）、１０ｎｇ／ｍｌニコチンアミドを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地（以下、この培地を「ＭＨＭ培地＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ＋ＫＧＦ」と記す。）を用いた（ステージ４）。
【０１９５】
（６）細胞をゼラチンコートしたディッシュに継代した。培地は、（５）で用いた培地からｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦを除いたＭＨＭ培地を用いた（以下、この培地を単に「ＭＨＭ培地」と示す。）（ステージ５）。
【０１９６】
（７）この結果、ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ細胞から効率よくインスリン産生細胞が分化誘導され、付着細胞だけでなく、ｓｐｈｅｒｅ状に浮遊するインスリン産生細胞も得られた（以下、このｓｐｈｅｒｅ状細胞を「ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅ」と記す。）。
【０１９７】
（８）（７）のディッシュから培養用ピペットを用いて培地を回収することによって、付着細胞と分離してＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅのみを回収した。このＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅを、酵素処理及びピペッティングにより１〜数個の細胞からなる細胞塊になるようにばらし、ＭＨＭ培地で希釈して継代維持した。なお、実験例２以降の実験は、このＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅを用いて行った。
【０１９８】
（実験例２）ＧＦＰ強発現ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅの単離
実験例１で分化誘導して得られたＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅは、ＭＨＭ培地を用いて継代を繰り返すと、ｓｐｈｅｒｅ状のまま増殖維持することができる。しかし、そのインスリン産生能は次第に低下し、また、ＧＦＰを発現する細胞も減少する傾向が見られる（図３）。
そこで、実験例１でＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅからＧＦＰを強発現している細胞株、すなわちＰＤＸ−１を強発現している細胞株を濃縮することを目的として、ＥＧＦＰをマーカーとしてソーティングを行った。
【０１９９】
（１）継代１２回目のＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅから、ＥＧＦＰをマーカーとして蛍光標識された細胞をソーティングした。ソーティングには、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。
【０２００】
（２）図４に、ＧＦＰ陽性細胞のＦＡＣＳのプロフィールを示す。図４において、"Ｓｐｅｃｉｍｅｎ"は「試料」、"Ｓａｍｐｌｅ"は「サンプル」、"ＳＳＣ−Ａ"は「側方錯乱光」、"ＦＳＣ−Ａ"は「前方錯乱光」、"Ｃｏｕｎｔ"は「細胞数」、"ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ａ"は「ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）」、"ＰＥ−Ａ"は「ＰＥ（フィコエリスリン）」、"ＦＩＴＣ−Ａ"は「ＦＩＴＣ」、"Ｔｕｂｅ"は「チューブ」、"Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ"は「集団」、"Ａｌｌ  Ｅｖｅｎｔｓ"は「総計数」、"Ｐａｒｅｎｔ"は「母集団」、"Ｔｏｔａｌ"は「合計」をそれぞれ示す。図４のＰ４より、用いたＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅ全体から、ＧＦＰを弱く発現している細胞は１．７％、Ｐ３より、ＧＦＰを強発現している細胞は０．７％の割合で採取できたことがわかった。以下、ＧＦＰの発現強度を指標として、前者のＧＦＰを弱く発現している細胞を「ＧＦＰ＋  ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅ」、後者のＧＦＰを強発現している細胞を「ＧＦＰ＋＋  ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅ」と記す。また、これらの細胞をまとめて「ＧＦＰ発現ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅ」と記す。
【０２０１】
（３）（２）で得られた細胞を、１．４×１０３／ｃｅｌｌ  ｏｆ  ９６  ｗｅｌｌの濃度でプレーティングし（継代１３回目）、同じくＭＨＭ培地で培養した。
【０２０２】
（４）（３）でプレーティングしたＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおけるＧＦＰの発現を図５に示す。図５において、左の２図は、ＧＦＰ＋  ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅ、右の２図は、ＧＦＰ＋＋  ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅを示す。また、上の２図はプレーティング直後（継代１３回目）、下の２図はプレーティングして２日後（継代１３回目＋２日）のＧＦＰの発現像を示す。この結果から、ＥＧＦＰをマーカーとしてソーティングすることにより、ＧＦＰ強発現ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅを濃縮できることがわかった。また、ソーティングによって得られた細胞は、再培養しても増殖することが明らかになった。
【０２０３】
（実験例３）ＧＦＰ強発現ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅの遺伝子発現
実験例２において単離したＧＦＰ強発現ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおける遺伝子発現を検討するために、ＲＴ―ＰＣＲ解析を行った。
【０２０４】
（１）実験例１で得られたＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅの継代９回目の細胞、同じく継代１０日目の細胞、実験例２で得られた継代１３日目のＧＦＰ＋  ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅ、同じくＧＦＰ＋＋  ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅ、及びＭＩＮ６からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。なお、ＭＩＮ６はマウスインスリノーマ由来の培養細胞であり、ＰＤＸ−１、Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｉ、及びＩｎｓｕｌｉｎ  ＩＩを発現しているポジティブコントロール細胞として用いた。また、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出はＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０（テルテスト社製）を用い、付属のプロトコールに従って行った。
【０２０５】
（２）（１）で得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として、Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｉ、Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩ、ＰＤＸ−１、及びＧＡＰＤＨについてＲＴ−ＰＣＲ解析を行い、発現量を比較した。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは、Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｉについては配列表の配列番号１と配列番号２、Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩについては配列表の配列番号３と配列番号４、ＰＤＸ−１については配列表の配列番号５と配列番号６、ＧＡＰＤＨについては配列表の配列番号７と配列番号８に示す配列を用いた。なお、ＰＤＸ−１について、このＲＴ−ＰＣＲ用いたプライマーは、内在性及び外因性のＰＤＸ−１どちらもの発現について検出することができるプライマーである。また、ＧＡＰＤＨはコントロールとして用いた。ＲＴ−ＰＣＲの条件は、Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｉ、Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩについては９４℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクル、ＰＤＸ−１については９４℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃３０秒を４０サイクル、ＧＡＰＤＨについては９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を２５サイクルで行った。
【０２０６】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ解析の図６に示す。図６より、実験例２で得られたＧＦＰ＋  ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅ及びＧＦＰ＋＋  ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおいて、Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩの発現が上昇していることがわかった。また、Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｉの発現は観察されなかった。
【０２０７】
（４）次に、ＧＦＰ強発現ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおいて、内在性のＰＤＸ−１の発現が誘導されているかどうかについて検討するため、内在性のＰＤＸ−１のみを検出できるプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。内在性ＰＤＸ−１の検出は配列表の配列番号９と配列番号１０に示す配列を有するプライマーを用いて行い、ＲＴ−ＰＣＲの条件は９４℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃６０秒を３５サイクルで行った。また、コントロールのＧＡＰＤＨについては、（３）で用いた配列と同じの塩基配列を持つプライマーを用い、同じＲＴ−ＰＣＲ条件で行った。
【０２０８】
（５）（４）の結果を図７に示す。図７より、ＧＦＰ＋＋  ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおいて、内在性ＰＤＸ−１の発現が誘導される可能性が示唆された。
【０２０９】
（実験例４）長期培養したＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおけるＧＦＰの発現
ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅについて長期培養を行い、ＧＦＰの発現変化を検討した。
【０２１０】
（１）検討群として用意した長期培養ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅを、図８に模式的に示す。図８における色のついた丸は、ＧＦＰを発現している細胞を表している。検討群として、実験例１で得られたＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅの継代２９回目の細胞を、これまで除去していたＤｏｘを培地に加えて継代した細胞群Ａ、Ｄｏｘを除いた培地に継代した細胞群Ｂ、ＥＧＦＰをマーカーとしてソーティングして得たＧＦＰを発現する細胞群Ｄ、及びＧＦＰを発現していない細胞群Ｃの４群を用意した。培地はＭＨＭ培地を用いた。ＥＧＦＰをマーカーとしたソーティングは、実験例２と同様にして行った。なお、細胞群Ａでは培地にＤｏｘを添加しているためＧＦＰを発現している細胞が存在しないと考えられるが、細胞群ＢではＤｏｘを添加していないためＧＦＰを発現している細胞が含まれている。
【０２１１】
（２）ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて、蛍光強度を解析した結果のドットプロットパターンを図９に示す。図９より、細胞群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄにはそれぞれ、ＧＦＰを発現する細胞が、細胞全体の０．１％、１８．３％、０．６％、９８．２％の割合で含まれていることがわかった。
【０２１２】
（３）次に、それぞれの細胞群をプレーティングし、細胞の増殖を検討した。図１０に、プレーティング後５日目におけるＧＦＰの発現像を示す。図１０より、それぞれのＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅは、再培養しても増殖することがわかった。また、ＧＦＰの発現が認められない細胞群Ｃからは、再培養中にＧＦＰを発現する細胞が再び出現する現象がみられることがわかった。
【０２１３】
（実験例５）長期培養したＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおける遺伝子発現
長期培養したＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおける遺伝子発現を検討するために、ＲＴ―ＰＣＲ解析を行った。
【０２１４】
（１）実験例４で得られた細胞群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ（それぞれ継代３０回目に相当）、及びＭＩＮ６から、実験例３（１）と同様の方法を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
【０２１５】
（２）（１）で得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ解析を行い、内胚葉分化マーカー遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリングに関与する遺伝子の発現量を比較した。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマー及びＲＴ−ＰＣＲの条件は、外因性ＰＤＸ−１については配列表の配列番号１１と配列番号１２で９４℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃６０秒を２６サイクル、内在性ＰＤＸ−１については配列表の配列番号９と配列番号１０で９４℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃６０秒を３５サイクルで行った。また、内胚葉分化マーカー遺伝子のＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマー及びＲＴ−ＰＣＲの条件は、Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｉについては配列表の配列番号１と配列番号２で９４℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクル、Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩについては配列表の配列番号３と配列番号４で９４℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクル、ｇｌｕｃａｇｏｎについては配列表の配列番号１３と配列番号１４で９４℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃６０秒を４０サイクル、ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎについては配列表の配列番号１５と配列番号１６で９４℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃６０秒を３０サイクル、Ｐ４８については配列表の配列番号１７と配列番号１８で９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒を３５サイクル、ＰＰについては配列表の配列番号１９と配列番号２０で９４℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃６０秒を３０サイクル、ａｍｙｌａｓｅについては配列表の配列番号２１と配列番号２２で９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒を３０サイクル、Ｃａｒｂｏｘｙ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ａについては配列表の配列番号２３と配列番号２４で９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃６０秒を３０サイクル、Ｐａｘ４については配列表の配列番号２５と配列番号２６で９４℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃６０秒を４０サイクル、Ｉｓｌ  １については配列表の配列番号２７と配列番号２８で９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒を４０サイクル、Ｂｅｔａ  ２については配列表の配列番号２９と配列番号３０で９４℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃６０秒を３０サイクル、Ｎｋｘ  ６．１については配列表の配列番号３１と配列番号３２で９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃６０秒を４０サイクル、Ｇｌｕｔ  ２については配列表の配列番号３３と配列番号３４で９４℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃６０秒を３０サイクル、Ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅについては配列表の配列番号３５と配列番号３６で９４℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃６０秒を３０サイクル、Ｋｉｒ  ６．２については配列表の配列番号３７と配列番号３８で９４℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃６０秒を３０サイクル、Ｏｃｔ−３／４については配列表の配列番号３９と配列番号４０で９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒を３０サイクルで行った。Ｎｏｔｃｈシグナリングに関与する遺伝子のＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは、Ｎｏｔｃｈ  １については配列表の配列番号４１と配列番号４２、Ｎｏｔｃｈ  ２については配列表の配列番号４３と配列番号４４、Ｎｏｔｃｈ  ３については配列表の配列番号４５と配列番号４６、Ｎｏｔｃｈ  ４については配列表の配列番号４７と配列番号４８��Ｄｌｌについては配列表の配列番号４９と配列番号５０、Ｊａｇｇｅｄ  １については配列表の配列番号５１と配列番号５２、Ｊａｇｇｅｄ  ２については配列表の配列番号５３と配列番号５４に示す配列を用いた。なお、これらのＮｏｔｃｈシグナリングに関与する遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの条件はすべて、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒を３５サイクルで行った。また、コントロールのＧＡＰＤＨについては配列表の配列番号７と配列番号８で９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を２５サイクルで行った。
【０２１６】
（３）ＲＴ−ＰＣＲの結果を図１１に示す。図１１の結果より、内胚葉分化マーカー遺伝子については、ＰＤＸ−１の発現レベルが高ければ、Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩの発現量が高いことが示唆された。また、ＰＤＸ−１の発現の低下に伴い、ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎの発現が増強することが認められた。さらに、ＰＤＸ−１の発現レベルが高いと、Ｐａｘ４、Ｉｓｌ１、Ｋｉｒ６．２等の発現が抑制されることがわかった。
【０２１７】
また、Ｎｏｔｃｈシグナリングに関与する遺伝子については、ＰＤＸ−１の発現の低下に伴い、Ｎｏｔｃｈ２の発現が増強することが認められた。この事実から、ＰＤＸ−１は、Ｎｏｔｃｈ２の発現に関与している可能性が示唆された。
【０２１８】
また、Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＩＩの発現は確認できたが、内在性ＰＤＸ−１の発現は誘導されていないことが確認された。これは、継代を繰り返した影響であることが原因の一つとして考えられた。
【０２１９】
（実験例６）長期培養したＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおけるインスリンの発現
長期培養（継代３０回目）したＧＦＰ強発現ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅ、及びＧＦＰ非発現ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅを用いて、Ｃ−ペプタイド及びＰＤＸ−１の発現を検討した。なお、Ｃ−ペプタイドはインスリンを生成する過程で生じる副産物であり、Ｃ−ペプタイドの発現検討によってインスリンの発現検討に代えることができる。
【０２２０】
（１）実験例４において、ＥＧＦＰをマーカーとして用いたソーティングにより単離したＧＦＰ強発現ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅ（細胞群Ｄ）、及びＧＦＰ非発現ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅ（細胞群Ｃ）から、当業者に公知の方法を用いてサイトスピン標本を作製し、免疫染色を行った。抗Ｃ−ペプタイド抗体は、Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉ（ｒａｔ）（矢内原研究所製）及びＣ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ＩＩ（ｒａｔ）（矢内原研究所製）の２種類を用い、抗ＰＤＸ−１抗体は、抗ＰＤＸポリクローナル抗体（ウサギ）（トランスジェニック社製）を用いた。
【０２２１】
（２）（１）の免疫染色結果を図１２に示す。図１２において、左２列は細胞群Ｄの染色像を示し、右２列は細胞群Ｃの染色像を示す。また、それぞれの細胞群の左列の像において、上２段は、前記２種類の抗Ｃ−ペプタイド抗体による染色像を示し、下１段は、前記抗ＰＤＸ−１抗体による染色像を示す。また、それぞれの細胞群の右列は、ＤＡＰＩ染色像であり核を示している。図１２より、細胞群Ｄ及び細胞群Ｃともに、抗Ｃ−ペプタイド抗体で染まる細胞が観察された。
【０２２２】
（実験例７）ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅの接着能及びインスリンの発現
浮遊状態で培養したＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅについて、接着能及びインスリンの発現を検討した。
【０２２３】
（１）実験例４で用意した、Ｄｏｘを除いた培地に継代した継代３０回目の細胞群Ｂ、及びＤｏｘを培地に加えて継代した継代３０回目の細胞群Ａを、それぞれゼラチンコートしたディッシュに継代し３日間培養した。図１３に操作の模式図を示す。
【０２２４】
（２）図１４に（１）の細胞を免疫染色結果を示す。図１４において、上２段は、細胞群Ｂの染色像を示し、下２段は、細胞群Ａの染色像を示す。また、それぞれの細胞群において、左列からＣ−ペプタイドの発現、ＧＦＰの発現、ＤＡＰＩ染色像、明視野像を示し、Ｃ−ペプタイドの発現は、実験例８と同様に２種類の抗体を用いて検出した。図１４の結果より、浮遊状態で培養したＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅはゼラチンコートしたディッシュに接着し、付着細胞が観察された。しかし、この付着細胞は継代することができなかった。また、免疫染色の結果、細胞群Ｂ及び細胞群Ａともに、抗Ｃ−ペプタイド抗体で染まる細胞が観察された。
【０２２５】
（実験例８）ゼラチンコートディッシュに接着したＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおける遺伝子発現
ゼラチンコートディッシュに接着したＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおける遺伝子発現を検討するために、ＲＴ―ＰＣＲ解析を行った。
【０２２６】
（１）実験例７で得られた細胞群Ａ、Ｂ、及びＭＩＮ６から、実験例３（１）、（２）と同様の方法を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
【０２２７】
（２）（１）で得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ解析を行い、内胚葉分化マーカー遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリングに関与する遺伝子の発現量を比較した。また、ＧＡＰＤＨはコントロールとして用いた。ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマー及びＲＴ−ＰＣＲの条件は、実験例５の（２）と同様にして行った。
【０２２８】
（３）ＲＴ−ＰＣＲの結果を図１５に示す。図１５より、実験例５の浮遊状態の細胞の場合と同様に、ＰＤＸ−１の発現が高ければＩｎｓｕｌｉｎ  ＩＩの発現が高いことが明らかになった。また、Ｎｏｔｃｈ２の発現についても実験例５の結果と同様に、ＰＤＸ−１の発現に呼応していることが認められた。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】ｐｄｘ−１及びＥＧＦＰ遺伝子のノックインしたＥＳ細胞（ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ細胞）作製の模式図である。
【図２】インスリン産生細胞の分化誘導の実験ステップを示す図である。
【図３】ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅの継代１２回目の像を示す図である。左図はＧＦＰの発現像を示し、右図は明視野像を示す。
【図４】ＦＡＣＳによるＧＦＰ強発現ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅの単離を示す図である。
【図５】単離したＧＦＰ強発現ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおけるＧＦＰの発現像を示す図である。
【図６】ＧＦＰ強発現ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおける遺伝子発現の検討を示す図である。
【図７】ＧＦＰ強発現ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおける内在性のＰＤＸ−１の発現検討を示す図である。
【図８】長期培養したＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅの４つの検討群を模式的に示した図である。
【図９】ＦＡＣＳを用いて解析したＧＦＰを発現する細胞割合を示す図である。
【図１０】プレーティング後５日目のＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおけるＧＦＰの発現像を示す。左図は明視野像を示し、右図はＧＦＰの発現像を示す。
【図１１】長期培養したＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおける遺伝子発現の検討を示す図である。
【図１２】ＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおけるＣ−ペプタイド及びＰＤＸ−１の発現を示す図である。
【図１３】ゼラチンコートディッシュに継代したＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅの模式図を示す。
【図１４】ゼラチンコートディッシュに付着したＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおけるＣ−ペプタイドの発現を示す図である。
【図１５】ゼラチンコートディッシュに付着したＲＯＳＡ−ＰＤＸ−１  ＥＳ  ｓｐｈｅｒｅにおける遺伝子発現の検討を示す図である。
【図１】
2006075022.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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