(57)【要約】【課題】ＴＮＦリガンド及びそれを含有する薬学的組成物。【解決手段】ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのメンバーに対するリガンドが得られる。リガンドはこのようなレセプターのＣ−末端システィンループの領域に結合する。リガンドを含む製剤学的組成物ならびにリガンドの調製に関するプロセスも提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ７５ＴＮＦ−Ｒに対する抗体又はそのフラグメントであって、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒの細胞を殺す効果のためのシグナリングを阻害することはできるがｐ７５ＴＮＦ−Ｒに対するＴＮＦの結合は阻害しない抗体又はフラグメントであり、
当該抗体又はフラグメントは、ｐ７５ＴＮＦ−ＲのＣ−末端システインループであってｐ７５ＴＮＦ−Ｒのアミノ酸配列Ｃｙｓ−１６３からＴｈｒ−１７９よりなるループの領域に結合する抗体の抗原結合部分を含み、
但し、当該抗体又はフラグメントは、ＣＮＣＭ受託番号Ｎｏ．Ｉ−１３５８又はＣＮＣＭ受託番号Ｎｏ．Ｉ−９２８としてそれぞれ寄託された継代株クローン３２又は７０由来のモノクローナル抗体ではない、
上記抗体又はフラグメント。
【請求項２】
以下に示したモノクローナル抗体Ｎｏ．３２の重鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸残基が、異なったアミノ酸残基で置換されているか及び／又は除去されているか、及び／又は１個以上のアミノ酸残基が当該アミノ酸配列に付加されている変異アミノ酸配列を含み、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒのアミノ酸配列Ｃｙｓ−１６３からＴｈｒ−１７９よりなるループの領域に結合することを維持し、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒの細胞を殺す効果のためのシグナリングを阻害することはできるがｐ７５ＴＮＦ−Ｒに対するＴＮＦの結合は阻害しないままである請求項１記載の抗体又はフラグメント。
2006014742.tif 000002
【請求項３】
以下に示したモノクローナル抗体Ｎｏ．３２の軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸残基が、異なったアミノ酸残基で置換されているか及び／又は除去されているか、及び／又は１個以上のアミノ酸残基が当該アミノ酸配列に付加されている変異アミノ酸配列を含み、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒのアミノ酸配列Ｃｙｓ−１６３からＴｈｒ−１７９よりなるループの領域に結合することを維持し、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒの細胞を殺す効果のためのシグナリングを阻害することはできるがｐ７５ＴＮＦ−Ｒに対するＴＮＦの結合は阻害しないままである請求項１記載の抗体又はフラグメント。
2006014742.tif 000003
【請求項４】
以下に示したモノクローナル抗体Ｎｏ．７０の重鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸残基が、異なったアミノ酸残基で置換されているか及び／又は除去されているか、及び／又は１個以上のアミノ酸残基が当該アミノ酸配列に付加されている変異アミノ酸配列を含み、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒのアミノ酸配列Ｃｙｓ−１６３からＴｈｒ−１７９よりなるループの領域に結合することを維持し、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒの細胞を殺す効果のためのシグナリングを阻害することはできるがｐ７５ＴＮＦ−Ｒに対するＴＮＦの結合は阻害しないままである請求項１記載の抗体又はフラグメント。
2006014742.tif 000004
【請求項５】
以下に示したモノクローナル抗体Ｎｏ．５７の重鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸残基が、異なったアミノ酸残基で置換されているか及び／又は除去されているか、及び／又は１個以上のアミノ酸残基が当該アミノ酸配列に付加されている変異アミノ酸配列を含み、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒのアミノ酸配列Ｃｙｓ−１６３からＴｈｒ−１７９よりなるループの領域に結合することを維持し、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒの細胞を殺す効果のためのシグナリングを阻害することはできるがｐ７５ＴＮＦ−Ｒに対するＴＮＦの結合は阻害しないままである請求項１記載の抗体又はフラグメント。
2006014742.tif 000005
【請求項６】
以下に示したモノクローナル抗体Ｎｏ．５７の重鎖のＣＤＲ領域に対するアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体又はフラグメント。
2006014742.tif 000006
【請求項７】
グループ３２抗体のｓｃＦｖを含む請求項１記載の抗体又はフラグメント。
【請求項８】
以下からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードするＤＮＡ分子：
ｉ）以下に示したモノクローナル抗体Ｎｏ．３２の重鎖の３つのＣＤＲ領域に対する３つのアミノ酸配列；
2006014742.tif 000007
ｉｉ）以下に示したモノクローナル抗体Ｎｏ．３２の軽鎖の３つのＣＤＲ領域に対する３つのアミノ酸配列；
2006014742.tif 000008
ｉｉｉ）以下に示したモノクローナル抗体Ｎｏ．７０の重鎖の３つのＣＤＲ領域に対する３つのアミノ酸配列；
2006014742.tif 000009
ｉｖ）以下に示したモノクローナル抗体Ｎｏ．５７の重鎖の２つのＣＤＲ領域に対する２つのアミノ酸配列；
2006014742.tif 000010
【請求項９】
ａ）以下からなる群から選択されるポリペプチドのいずれかを含む、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒの細胞を殺す効果のためのシグナリングを阻害することはできるがｐ７５ＴＮＦ−Ｒに対するＴＮＦの結合は阻害しないポリペプチド：
ｉ）以下に示したモノクローナル抗体Ｎｏ．３２の重鎖のＣＤＲ領域のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド；
2006014742.tif 000011
ｉｉ）以下に示したモノクローナル抗体Ｎｏ．３２の軽鎖のＣＤＲ領域のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド；
2006014742.tif 000012
ｉｉｉ）以下に示したモノクローナル抗体Ｎｏ．７０の重鎖のＣＤＲ領域のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド；
2006014742.tif 000013
ｉｖ）以下に示したモノクローナル抗体Ｎｏ．５７の重鎖のＣＤＲ領域のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド；
2006014742.tif 000014
ｂ）上記ｉ）〜ｉｖ）に定義されたアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加によってａ）のポリペプチドから誘導されるポリペプチド、
をコードするＤＮＡ分子。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又はフラグメントに対する抗−イディオタイプ抗体であって、ＴＮＦの作用を阻害することはできるがｐ７５ＴＮＦ−Ｒに対するＴＮＦの結合は阻害しない抗−イディオタイプ抗体。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又はフラグメント或いは請求項１０記載の抗−イディオタイプ抗体を含む融合蛋白質。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又はフラグメント、請求項１１記載の融合蛋白質の機能誘導体であって、そのアミノ酸残基に側鎖として存在する官能基、及び／又は、そのＮ末端残基及び／又はＣ末端残基に官能基を有し、
ｐ７５ＴＮＦ−ＲのＣ−末端システインループ領域に結合することを維持し、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒの細胞を殺す効果のためのシグナリング、又は、ＴＮＦの効果を阻害することはできるがｐ７５ＴＮＦ−Ｒに対するＴＮＦの結合は阻害しないままである請求項１０記載の抗−イディオタイプ抗体に対して、阻害活性を維持する、
上記機能誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒｓ）に対するリガンドに関するものである。このようなリガンドはＴＮＦの作用を阻害するがＴＮＦ−Ｒｓへの結合は阻害しない。また本発明はＴＮＦ／ＮＧＦ系の他のレセプターと相互作用をするリガンドにも関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は多面性のサイトカインであり、多くの細胞種、主として活性化されたマクロファージによって産生される。ＴＮＦは免疫及び炎症性反応の主要なメディエータの１つである。ＴＮＦがエンドトキシンショックや大脳マラリヤ、移植片対宿主反応などの広範囲な病態の病因に関与している証拠があることから、近年その機能に対する興味がかなり持たれている。ＴＮＦの多くの作用が生体にとって有害であることから、ＴＮＦの宿主細胞に対する作用を阻止する方法を見いだすことはかなり興味あることである。このような介入の標的は明らかにＴＮＦがその作用を発現するために結合する分子、すなわちＴＮＦ−Ｒｓである。これらの分子は細胞に結合した形で存在するばかりでなく、レセプターそのものの切断された細胞外ドメインからなる可溶性の状態（Ｎｏｐｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，９（１０）：３２６９〜７８，１９９０）でも存在する。この可溶性レセプターはＴＮＦに結合する能力を維持しており、したがって細胞表面のレセプターと拮抗してＴＮＦの作用を阻止する能力を持っている。細胞結合分子と拮抗する原理に基づいたもう１つのＴＮＦ作用を阻止する方法は、ＴＮＦレセプターを認識してリガンドの結合を妨害する抗体を使用する方法である。
【０００３】
細胞表面ＴＮＦ−Ｒｓは体内の殆んどすべての細胞に発現している。ＴＮＦの種々の作用すなわち細胞毒性、増殖促進その他の作用は、ＴＮＦがレセプターへ結合することによってＴＮＦレセプターから伝えられる。これらのレセプターには分子量の異なる２種類があり、５５キロダルトン及び７５キロダルトンと記載されており、ここではそれぞれＰ５５ＴＮＦ−Ｒ及びＰ７５ＴＮＦ−Ｒと呼ぶ。しかしこれらのレセプターをまたＰ６０及びＰ８０と呼んでいる報告もあることに注意する必要がある。
【０００４】
ＴＮＦ−Ｒｓは他の重要な生物学的過程に関与するレセプターの系統群に属する。これらレセプターの例として低親和性ＮＧＦレセプターがある。これは神経細胞の増殖、分化の制御に重要な役割を演じている。その他のいくつかのレセプターはＣＤＷ４０やその他いくつかのリンパ球の増殖制御に関与している。この系統群のもう１つのレセプターはＡＰＯとも呼ばれるＦＡＳレセプターであり、このレセプターは細胞消滅の伝達に関与しており、またこの機能の不完全なマウスを用いた研究から、狼瘡様疾患の病因に重要な役割を演じていると思われる。ここでは、この系統群のレセプターを“ＴＮＦ／ＮＧＦレセプター群”と呼ぶ。
【０００５】
いくつかの疾患の病因に関与していると考えられる他のサイトカインと比較して、ＴＮＦの最も顕著な特徴の１つは細胞の死を誘導する能力である。ＴＮＦのこの殺細胞活性はＰ５５レセプターによって誘導されるものと考えられる。しかしながら、このＰ５５レセプター活性はＰ７５レセプターによって助長されるが、そのメカニズムは不明である。
【０００６】
ヨーロッパ特許公告番号０，３９８，３２７及び０，４１２，４８６は可溶性ＴＮＦ−Ｒｓに対する抗体を開示している。これらの抗体は可溶性ＴＮＦ−Ｒｓを認識し、ＴＮＦが細胞表面上のＴＮＦ−Ｒｓに結合するのを阻止することが認められた。完全な抗体はＴＮＦの細胞毒性作用に似ていることが認められているのに、１価のＦ（ａｂ）フラグメントはＴＮＦ作用を阻止した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はＴＮＦ／ＮＧＦレセプター系統群の１つのメンバーに対して１つのリガンドを提供するものであり、そのリガンドはこのようなレセプターのＣ末端のシスティンループの領域に結合する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
好ましくはこの領域はＰ７５ＴＮＦ−Ｒ中のアミノ酸配列ｃｙｓ−１６３〜ｔｈｒ−１７９又はＴＮＦ／ＮＧＦ系統群の他のレセプターにおける相当する領域を含む。
【０００９】
好ましくはこのレセプターはＴＮＦ−Ｒ、特にＰ７５ＴＮＦ−Ｒである。
【００１０】
１個のこのようなリガンドは図１１に示すモノクローナル抗体Ｎｏ．３２の重鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列及び／又は図１２に示すこの抗体の軽鎖ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
もう１つのこのようなリガンドは図１１に示すモノクローナル抗体Ｎｏ．７０の重鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
なおもう１つのこのようなリガンドは図１１に示すモノクローナル抗体Ｎｏ．５７の重鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
上記抗体をここでは簡単のため“グループ３２”抗体と呼ぶ。
【００１４】
本発明の他の態様において、このリガンドはグループ３２抗体のｓｃＦｖを含む。
【００１５】
リガンドは例えば蛋白質、ペプチド、イムノアドヘジン、抗体あるいは他の有機化合物を含む。
【００１６】
蛋白質は例えば他の蛋白質とリガンドがペプチドリンカーによって随意に連結された融合蛋白質を含む。このような融合蛋白質はリガンドの体内における滞留時間を長くし、したがってリガンド−蛋白複合体は潜在因子あるいはワクチンとして使用される。
【００１７】
蛋白質という言葉は、突然変異蛋白質、融合蛋白質、それらの塩、機能性誘導体及び活性フラクションを含む。
【００１８】
このペプチドには、ペプチド結合置換体及び／又はペプチド模倣体、すなわちこの技術分野において知られているプソイドペプチド（例えばＧ，Ｊｕｎｇ，Ｅ．Ｂａｙｅを編集：第２０回ヨーロッパペプチドシンポジウム議事録、Ｐ．２８９〜３３６、及びその参考文献を参照）、ならびにその塩及び特定の適応療法にしたがって、経口投与、局所投与、鼻孔撒布、目による肺投与、静脈投与、あるいは皮下投与に適した生物活性ペプチドとするための製剤調製物及び／又は製剤処方などが含まれる。このような塩、処方、アミノ酸置換体及びプソイドペプチド構造は安定性、処方性、投与性を高めるために（例えば徐放製剤、プロドラッグ）、あるいは生産の経済性を改善するために、ペプチドの生物活性を損なわない限り、必要で望ましいものである。
【００１９】
血中、組織その他に存在するプロティナーゼ及びペプチダーゼによる分解の危険はあるが、レセプターに結合する生物活性ペプチドを設計する時、置換体以外に、ペプチド模倣体及び／又は特定の関連を有する類似体構造の３つの特定の型が挙げられ、次の例によって説明される：第一は、バックボーンキラル中心のＤ−アミノ酸残基構造への転化、特にＮ−末端での転化は、活性を損うことなく、蛋白加水分解に対する安定性を上昇させる。その１例は“ＴｒｉｔｒｉａｔｅｄＤ−ａｌａ′−Ｐｅｐｔｉｄｌ  Ｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ”、Ｓｍｉｔｈ  Ｃ．Ｓ．ら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｒｅｓ．１５，ｐｐ３７１〜３７９（１９８８）に報告されている。第二は、ＮからＣへの鎖間イミドやラクタムのような安定性を有する環状構造である（Ｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｓｍｉｔｈ
ａｎｄ  Ｒｉｖｉｅｒ（Ｅｄｓ．）“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｅｓｃｏｍ，Ｌｅｉｄｅｎ（１９９１），ｐ２６８〜２７０）、また環状類似体を形成することによってレセプター結合が高められることもある。その１例は“構造的に制限されたチモペンチン様化合物”、米国特許４，４５７，４８９（１９８５），Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．に示されている。第三は、ペプチド結合を置換するためにケトメチレン、メチルスルフィド又はレトロインバース結合を導入することである。すなわちＣＯ部分とＮＨ部分の交換は安定性と効力の両者を高めるようである。このタイプの１例が“チモペンチの生物学的に活性なレトロインバース類似体”、Ｓｉｓｔｏ  Ａ．ら、Ｒｉｖｉｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｇ．Ｒ．（編集）“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｅｓｃｏｍ，Ｌｅｉｄｅｎ（１９９０）ｐ．７２２−７７３、に示されている。
【００２０】
本発明のペプチドは理論上知られている種々の方法によって合成することができる。すなわち化学的カップリング法（参照；Ｗｕｎｓｃｈ，Ｅ：“Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｄｅｒ  ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ”，Ｖｏｌｕｍｅ１５，Ｂａｎｄ  １＋２，Ｓｙｎｔｈｅｓｅ  ｖｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｒ，ｔｈｉｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ（１９７４），及びＢａｒｒａｎｙ，Ｇ．；Ｍａｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．：“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｅｄｓ．Ｅ．Ｇｒｏｓｓ，Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｖｏｌｕｍｅ２，Ｃｈａｐｔｅｒ  １，ｐ．１〜２８４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８０））、又は酵素的カップリング法（参照；Ｗｉｄｍｅｒ，Ｆ．Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．４４，ｐ．３７〜４６（１９７９），及びＫｕｌｌｍａｎｎ，Ｗ．：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌ．（１９８７）、及びＷｉｄｍｅｒ，Ｆ．，Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｊ．Ｔ．ｉｎ“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ：，ｅｄｓ．Ａｌｉｔａｌｏ，Ｋ．，Ｐａｒｔａｎｅｎ，Ｐ．，Ｖａｔｉｅｒｉ，Ａ．，ｐ．７９〜８６，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８５））、あるいは化学的方法と酵素的方法の併用が工程設計及び経済的に有利であるならばこの方法によって合成することができる。
【００２１】
システィン残基がペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端の両方に付加され、これがジスルフィド結合を形成することによってペプチドの環状化が起こる。
【００２２】
本発明のペプチドを生物学的活性を減少させないで修飾する方法はすべて本発明の範囲内に入る。
【００２３】
ある抗原に対する抗イデオタイプ抗体（ａｎｔｉ−Ｉｄ  Ａｂｓ）が動物細胞や細胞成分との相互作用においてその抗原のように機能する能力を説明する例は多く存在する。したがって、ペプチドホルモン抗原に対するａｎｔｉ−Ｉｄ  Ａｂｓはホルモン様活性を有し、レセプターと同じ方法でメディエータと特異的に相互作用する。（これらの性質についての総説は次のものを参照：Ｇａｕｌｔｏｎ，Ｇ．Ｎ．，Ｇｒｅａｎｅ，Ｍ．Ｉ．１９８６．生物学的レセプターのイデオタイプ模擬体、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．４，ｐ．２５３〜２８０；Ｓｅｇｅ  Ｋ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ａ．，１９７８，抗イデオタイプ抗体の細胞表面レセプタープローブとしての利用、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．７５，ｐ．２４４３〜２４４７）。
【００２４】
ａｎｔｉ−Ｉｄ  Ａｂと抗原の機能的類似性から、抗原の内部像を有するａｎｔｉ−Ｉｄ  Ａｂｓはこのような抗原に対する免疫を誘導し得ることが期待される。（Ｈｉｅｒｎａｕｘ，Ｊ．Ｒ．，１９８８，イデオタイプワクチンと感染性疾患、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．５６，ｐ．１４０７〜１４１３の総説を参照）。
【００２５】
したがって本発明のペプチドに対する抗体で、同じような生物学的活性を有する抗イデオタイプ抗体を産生することが可能である。
【００２６】
したがって本発明はまた本発明のペプチドに対する抗イデオタイプ抗体を提供するものであり、この抗イデオタイプ抗体はＴＮＦの毒性を阻害することができるが、そのレセプターへの結合は阻害しない。
【００２７】
抗体の個々の特異性は抗体の可変ドメインの相補決定領域（ＣＤＲｓ）を構成するペプチドループの構造に存在する。一般にａｎｔｉ−Ｉｄ  ＡｂのＣＤＲペプチドのアミノ酸配列は、元来それが誘導されたペプチド抗原のアミノ酸配列と同一でもなければ類似もしていないので、当然の結果としてアミノ酸配列が全く似ていないペプチド類がある環境において極めて類似した３次元構造をとることができる。Ｇｅｙｓｏｎによって“機能的に同等の配列”またはミモトープと名付けられたこのタイプのペプチドの概念は既知である。（Ｇｅｙｓｏｎ，Ｈ．Ｍ．ら、１９８７、ペプチド合成を利用するエピトープ分析の戦略．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．１０２，ｐ．２５９〜２７４）。
【００２８】
さらに、生物学的に活性なペプチドの３次元構造及び機能は他の化合物によって模倣することができる。これら化合物のいくつかは性質において全くペプチド的でないけれども、このようなペプチドの活性によく似ている。この分野はＧｏｏｄｍａｎ，Ｍ．（１９９０）の総説に総括されている。（ペプチド研究における合成、分光学およびコンピューターシミュレーション、第１１回アメリカペプチドシンポジウム、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ−Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．３−２９；Ｅｄｓ．Ｒｉｖｉｅｒ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｇ．Ｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｅｓｃｏｍ）．
【００２９】
本発明のペプチドと同じ３次元構造を有するペプチド及び非ペプチド化合物を作ることは可能である。これらの“機能的に同等の構造”又は“ペプチド模倣体”は本発明のペプチドに対する抗体と反応し、そしてまたＴＮＦ毒性を阻害することができる。
【００３０】
したがって本発明の実施態様はさらに、薬物団として本発明のペプチドの３次元構造に類似した３次元構造を有する化合物を提供するものであり、その化合物の特徴は、本発明のペプチドに対する抗体と反応することであり、そしてＴＮＦの毒性を阻止することができることである。
【００３１】
薬物団についてのさらに詳細については、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｒｉｖｉｅｒ編集、“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｅｓｃｏｍ，Ｌｅｉｄｅｎ発行（１９９１）の、Ｂｏｌｉｎら，ｐ．１５０，Ｐｏｌｉｎｓｋｙら，ｐ．２８７，Ｓｍｉｔｈら，ｐ４８５に記載されている。
【００３２】
すべての分子（蛋白質、ペプチド等）はここで述べた従来の化学的方法又は組換えＤＮＡによって生産することができる。
【００３３】
本発明はまた本発明によるリガンドをコードするＤＮＡ分子、それらを含むベクター及びそのベクターを含みそして本発明にしたがってリガンドを発現することができる宿主細胞を提供するものである。
【００３４】
宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。
【００３５】
さらに本発明は上記ＤＮＡ分子に対合し、同じ活性を有するリガンドをコードするＤＮＡ分子を提供するものである。
【００３６】
本発明はまた上記リガンドを含み、内因的に生成された又は外因的に投与されたＴＮＦの作用により誘導又は引き起こされた疾患の治療に有効な医薬組成物を提供するものである。
【００３７】
上述のようにＴＮＦは１種のサイトカインであり、細胞表面の２つの特異的レセプター：Ｐ５５レセプター及びＰ７５レセプターと結合することによって細胞機能への作用を開始する。これらレセプターの細胞外ドメインへの抗体の結合はその作用を妨げることができる。しかしながら、多くの研究において示されているごとく、レセプターの細胞外ドメインへの抗体の結合はまた、Ｐ５５レセプター及びＰ７５レセプターの凝集を誘導することによってＴＮＦの作用を誘発することができる。（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６５，Ｎｏ．２４，ｐ．１４４９７〜１４５０４，１９９０；及び未発表データ）。
【００３８】
Ｐ７５レセプターにおける１つの特定領域に結合するある種の抗体は、このレセプターによる細胞致死作用の伝達に対して模倣的ではなくむしろ阻害的であることを我々は発見した。この領域に結合する時、これらの抗体はＴＮＦの結合を阻止せずむしろある程度それを増加させるという事実があるにもかかわらずである。
【００３９】
本発明は、我々が３２グループと呼ぶこれらの抗体によって認識されるこの領域はＰ７５レセプターの細胞外ドメインにおける２個のＣ末端システィン間プラス１個のアミノ酸、スレオニン１７９、が付加した範囲に広がっている領域である。この明細書においてはこの領域を簡単のため“システィンループ”と呼ぶ。
【００４０】
本発明はまたこのグループに属する３種の抗体、すなわち抗体３２、５７及び７０の重鎖のＣＤＲにおけるヌクレオチド配列及び演繹アミノ酸配列を提供するものである。抗体３２と７０の重鎖のＣＤＲにおけるアミノ酸配列間に顕著な類似性が見いだされたが、これは抗原への結合に最も必要なものに近いことを示すものである。さらに、本発明は抗体３２の軽鎖のヌクレオチド配列及び演繹アミノ配列をも提供するものである。これらの配列に基づいて、Ｐ７５レセプターの機能を阻害する低分子量化合物、ペプチドあるいは模倣化合物は限定される。
【００４１】
このような低分子化合物が実際これを達成できるという証拠、および抗体はレセプターを凝集することができることが知られているが、凝集の必要がないという証拠から、３２グループの抗体の１価のＦ（ａｂ）フラグメントもまた、毒性がＴＮＦによって誘発される時Ｐ７５レセプターによる毒性の伝達を阻害するということが発見された。
【００４２】
これらの所見ならびにこの特定の系統群に属するレセプターの緊密な類似性から見て、本発明はまたＴＮＦ／ＮＧＦレセプター群に属する他の種々のレセプターの細胞外ドメインのＣ末端システィンループに結合して、ＴＮＦ機能の調節と同様に、他のレセプターの機能を調節する因子にも関する。このレセプター系統群においては、細胞外ドメインにおけるシスティンの局在と空間は高度に維持されている。この系統群中のあるレセプター、例えばＣＤｗ４０はＰ７５レセプターに特に高い類似性を示している。特にこのようなレセプターにおいては、これらの領域に結合する因子は、３２抗体のＰ７５レセプターに対する作用と類似した作用を有することが期待される。
【００４３】
上述したように、本発明によるリガンドは蛋白質、ペプチド、イムノアドヘシン、抗体又は他の有機化合物を含む。
【００４４】
蛋白質は、例えば、実質的に上記ストレッチに相当するアミノ酸配列を有する分子をリガンドとして用いるリガンドアフィニティ精製によって細胞抽出液から単離される。
【００４５】
ペプチドは、本発明に従がってＴＮＦの作用を阻害するリガンドを結合することが認められているＴＮＦ−Ｒのアミノ酸ストレッチに相当する目的ペプチドを最初に合成することによって調製する。その後、それに結合する他のリガンドをペプチドライブラリーから選択する。これらの領域に結合するペプチドをさらにスクリーニングしてＴＮＦ−Ｒにも結合するものを選択する。最後に目的ペプチドとＴＮＦ−Ｒの両者に強くアフィニティ結合するペプチドをスクリーニングして期待する生物学的活性を発揮する能力のあるペプチドを選択する。
【００４６】
同様にして、他の適応症が知られている薬剤も含めて各種の有機分子について、ＴＮＦの作用を阻害するのに極めて重要であることが認められたアミノ酸ストレッチに結合する能力があるかどうかについてスクリーニングを行う。
【００４７】
有機分子に加えて、細菌培養生産物、真菌培養生産物、真核生物培養生産物、および粗サイトカイン調製物のような生物学的物質のブロスも上述のアミノ酸ターゲットペプチドでスクリーニングをする。このスクリーニングで得られた分子をさらに期待する生物学的機能を遂行する能力の有無についてスクリーニングを行う。
【００４８】
あるいはまたレセプター中のアミノ酸ストレッチの４次構造に空間的に適合する分子を設計する。
【００４９】
上述の方法で得られる活性な分子は、それらが生物学的物質である限りにおいては、生物工学的方法によっても調製することができる。この方法では、これらの分子の大量生産が可能であろう。ペプチド類は既知のペプチド合成法あるいはそれらをコードしているＤＮＡ配列を含有している発現ベクターを用いても生産することができる。他の分子もそれが酵素的方法で生産されるならば、適当な培養細胞中に含まれるその酵素を生産することによって作ることができる。
【００５０】
本発明のリガンドを含む薬剤組成物は哺乳動物においてＴＮＦ作用の拮抗剤として使用される。
【００５１】
かかる組成物は有効成分として本発明によるリガンドを含む。この薬剤組成物は敗血症ショック、悪液質、移植片対宿主反応、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患、その他同種類の疾患等の症状に適用される。またＴＮＦの過量投与を中和するために処方される。
【００５２】
本発明による薬剤組成物は治療すべき病状によって投与可能な方法で投与される。例えば敗血症ショックの例では静脈内投与が好ましい。該薬物組成物は連続的にすなわち輸液法によって投与してもよいし、あるいは経口的に投与してもよい。処方及び投与量は治療状態、投与経路、及び治療すべき患者の状態、体重によって異なる。正確な投与量は主治医によって決定される。
【００５３】
本発明による薬剤組成物は通常の方法、例えば、有効成分を場合場合で製剤学的及び生理学的に利用可能な担体及び／又は安定剤及び／又は添加剤と混合して調製し、例えば投与バイアル中で凍結乾燥して剤型に調製する。
【００５４】
ここで用いられている“突然変異蛋白質”という語は、結合していることが知られている蛋白質中の１個以上のアミノ酸残基が、異なったアミノ酸残基で置換されているか又は除去されているか、あるいは１個以上のアミノ酸残基が原配列に添加されていて、しかもその結果生じた生成物の活性が著しく変化していない蛋白質、ペプチドその他同種類のものの類似体を指す。これらの突然変異蛋白質は既知の合成法及び／又は位置指定突然変異誘発法、あるいはそれに適した何らかの他の既知の方法によって調製される。
【００５５】
“融合蛋白質”という語は体液中で長い滞留時間を有する他の蛋白質と融合したリガンド又はリガンドの突然変異蛋白質を含有するポリペプチドを指す。このようにリガンドは他の蛋白質、ポリペプチドあるいは他の同種類のもの、例えば免疫グロブリン又はそのフラグメントと融合されてもよい。
【００５６】
ここでの“塩”という語は、リガンド、突然変異蛋白質及びそれらの融合蛋白質のカルボキシル基の塩及びアミノ基の酸付加塩を指す。カルボキシル基の塩は技術上周知の方法で作られ、例えば、Ｎａ、Ｃａ、ＮＨ4 、Ｆｅ（ＩＩＩ）又はＺｎ塩などの無機塩、及びトリエタノールアミン、アルギニン又はリジン、ピペリジン、プロカインなどのアミンで生成されるような有機塩基を持つ塩を含む。酸付加塩は、例えば、塩酸あるいは硫酸のような鉱酸を持つ塩、及び例えば酢酸あるいは蓚酸のような有機酸を持つ塩を含む。
【００５７】
ここで用いられている“機能性誘導体”は、残基の側鎖として存在する官能基、又はＮ末端あるいはＣ末端基から技術上周知の方法で調製されるリガンド及びそれらの融合蛋白質および突然変異蛋白質の誘導体を含み、そしてそれらが製剤的に使用可能である限り、すなわち、それらがリガンドの活性を破壊せず、またそれを含む組成物に毒性を付与しない限り機能性誘導体は本発明に含まれる。これらの誘導体は例えば抗原部位をマスクし、リガンドの体液中での滞留を長びかせると思われるポリエチレングリコールの側鎖を含んでもよい。他の誘導体はカルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアあるいは第一級又は第二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（例えばアルカノイル基又はカルボサイクリックアロイル基）で生成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、あるいはアシル部分で生成される遊離ヒドロキシル基（例えばセリン又はスレオニン残基の遊離ヒドロキシル基）のＯ−アシル誘導体を含む。
【００５８】
以下本発明を実施例より説明するが本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００５９】
本発明を以下の非制限実施例によって示す：
例１：グループ３２抗体によって認識されるＰ７５レセプターの領域の決定
主な適用の例５において、大腸菌中の発現によっていくつかの構築物を調製し、アミノ酸１２５−１８２の間の抗体ｎｏ．３２マップによってエピトープが認識されることが結論された。
【００６０】
われわれは今ではさらなる構築物を調製してそれらの完全なリストをしらべ、同時に可溶性Ｐ７５Ｒの構造に対するそれらの相関関係を図１に示してある。グループ３２の抗体により認識される構築物を太字の数字で表示し実線で示した。これらの抗体と反応しない構築物は細字の数字で表示し破線で示した。すべての構築物をそれらのＮ−およびＣ−末端アミノ酸残基で同定した。
【００６１】
図１は、構築物の図による表示の上に、Ｐ７５ＴＮＦ−Ｒのアミノ酸配列部分を示しており、これらの領域はレセプターの可溶型に対応する領域およびボックスされたトランスメンブラン領域に対応する。ヒトとマウスで保存されているアミノ酸残基には下線を付けてある。
【００６２】
図２に示したグループ３２抗体の、図１に示した構築物のあるものへの結合のウェスターンブロット分析を主要適用の例５と同じように実施した。
【００６３】
例２：グループ３２抗体と合成ペプチドの間のＰ７５ＴＮＦ−Ｒの細胞外ドメインへの結合に対する競合
いくつかの合成ペプチドで、それらの配列がグループ３２エピトープを疑わせるＴＮＦ−Ｒ上の領域の種々の部分に対応しているものを合成した（残基１６０−１７９，１６２−１７９，１６３−１７９，１６５−１７９および１６７−１７９）。それらのペプチドをグループ３２の抗体への結合に対する競合の能力についてＥＬＩＳＡテストでしらべた。
【００６４】
Ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ（図３のＰ７５構築物）のアミノ酸３から１８０に対応する細菌によって産生された構築物を抗体３２でプレコートしたＰＶＣプレートに指定濃度で適用し、そのあとＴＢＰ−ＩＩ（Ｐ７５可溶性ＴＮＦ−Ｒ）にウサギ抗血清を適用した。プレートに結合したウサギ抗血清の量をウサギ免疫グロブリンに対するヤギ抗血清を適用することにより測定し、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびプレートに結合したヤギ免疫グロブリン量の評価と組み合わせた。図３はアミノ酸残基１６３から１７９に対応する合成ペプチドが結合に関して競合することがわかった実験のデータを示す。
【００６５】
図４はある１つの実験のデータを示すが、そこではマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）とＰ７５レセプターの１２５から１９２に拡がるアミノ酸の配列との融合蛋白質を用いて１０μｇ／ｍｌの濃度でＰＶＣプレートをコートするのに用い、ついでＮｏ．３２ＭｃＡｂを以下に示す種々のペプチドの指示濃度と共に２μｇ／ｍｌの濃度で適用した：
ＤＷ１６−アミノ酸１６５−１７９
ＤＷ１８−アミノ酸１６３−１７９
ＤＷ１９−アミノ酸１６２−１７９
ＤＷ２１−アミノ酸１６０−１７９
【００６６】
したがって、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗−マウスを加えることによって反応を展開させた。図４に示すように、モノクローナル抗体Ｎｏ．３２による融合蛋白質認識の顕著な阻害は全エピトープをカバーする３つのペプチドについてのみ観察された。
【００６７】
例３：３２エピトープの突然変異的研究
アミノ酸３から１８１に対応する配列をもつ組換えペプチド中のシスティン１７８をアラニンで置換すると、この蛋白質はグループ３２抗体によって認識されなくなる。この知見から示唆されることは、これらの抗体で認識されるためには、グループ３２エピトープ領域中の２つのシスティンは互いに自由に相互作用できなければならない；すなわち、抗体で認識される構造はループであるということである。この考え方を支持するものとして、われわれは以下のことを見出した：すなわちＳＤＳ  ＰＡＧＥとウェスターンブロット分析の前にジチオスレイトールでペプチドを還元するとグループ３２抗体によるペプチドの認識の効率がいくらか減少し、ジチオスレイトールによる還元のあとにヨードアセトアミドでアルキル化すると抗体による認識は完全に失われる。
【００６８】
例４：ＴＮＦ毒性に対する種々の抗体およびそのフラグメントの作用
（ａ）グループ３２抗体の機能を比較するために、３２エピトープ領域に対する上流のレセプターに結合する抗体（抗−ＴＢＰ−ＩＩ抗体の大半が期待されるように）のみならず、そのエピトープ領域に対する下流のレセプターに結合する抗体に対しても、われわれはＭＢＰに連結した３２エピトープ（アミノ酸１８１から２３５；“スタルク”領域）に対する下流に拡がる領域に対応するキメラ構築物でマウスを免疫化した。ウサギはキメラに結合する抗体を産生し、無傷のＰ５５ＴＮＦレセプターに対するのと同じようにそのキメラによって免疫化される。これらの抗体はキメラ蛋白質への結合によってアフィニティカラム法で精製されてＡｆｆｉ−ｇｅｌ  １０カラムに連結し、ＴＮＦ機能と結合への作用に関してテストされた（アフィニティカラムで精製した抗体調製物を“３１８”と名付けた）。
【００６９】
（ｂ）アフィニティカラム精製のアンチスタルク抗体と同じようにすべてのモノクローナル抗−ＴＢＰ−ＩＩ抗体を、Ｐ７５受容体を過剰発現するように作られた上皮様ＨｅＬａ細胞のクローン中でのＴＮＦ毒性に対する作用に関してテストした（それらをＰ７５レセプターのｃＤＮＡでトランスフェクトすることによって。ここで示した実験で用いた特別に過剰発現したクローンをＨｅＬａ  Ｐ７５．３と呼ぶことにする）。ＴＮＦ機能を阻害することがわかった抗体だけがグループ３２エピトープの抗体であった；それらは阻害しないという事実にもかかわらず、レセプターに対するＴＮＦ結合をいくらか増大させる（図８と９）。他の抗−ＴＢＰ−ＩＩ抗体（図６および９のＮｏ．６７およびＮｏ．８１）のうちの２つはレセプターへのＴＮＦ結合またはＴＮＦ毒性に対してごく僅かの作用しかなかった。他のすべてのモノクローナル抗−ＴＢＰ−ＩＩ抗体はＴＮＦ結合と競合するにもかかわらず、ＴＮＦの細胞致死作用をいくらか強化させた（たとえば図６および９の抗体３６）。“抗−スタルク”抗体はＴＮＦ結合または機能に対してごく僅かの作用しかなかった（図６および９）。抗−スタルク抗体を３２グループの抗体と一緒に細胞に適用したところＴＮＦ機能に対する後者の阻害作用に対して妨害しなかった。
【００７０】
（ｃ）同じ登録簿中の抗体についてＴＮＦによる骨髄球Ｕ９３７の殺傷作用に関してテストした。ＨｅＬａ細胞中の抗−ＴＮＦレセプター抗体の擬症効果に対立するものとして、実施された実験条件下では、抗−Ｐ５５、抗−７５レセプター抗体いずれもＵ９３７細胞に対するＴＮＦの致死作用への擬症効果は示さなかった。ＴＮＦの作用に対して似た作用をする能力はもってはいないが、Ｐ７５レセプター（たとえば図９の抗体１４、３１および３６）またはＰ５５レセプター（たとえば図７の抗体番号１８）へのＴＮＦ結合に対して競合するすべてのモノクローナル抗体はＴＮＦ作用に対して阻害的である。レセプター（たとえば図９の番号６７）へのＴＮＦ結合に対してなんの影響も与えない抗体はＴＮＦ機能に対して何の作用も有しない（図６）。グループ３２抗体はＴＮＦ結合に対してなんらの阻害作用も有しないのに、この細胞中でＴＮＦ機能を阻害する能力を有する点でユニークであった。実際にこれら抗体はＨｅＬａ  Ｐ７５．３細胞中におけるよりもはるかにこれらの細胞中でＴＮＦの結合を高めた（図８）。グループ３２抗体の阻害作用はＰ５５レセプターへのＴＮＦの結合を遮断する抗体のそれと相加的であった（たとえば図７の組合せ１８／３２）。
【００７１】
例５：ＴＮＦ−ＲｓからのＴＮＦの分離に対するグループ３２抗体およびそれらの１価フラグメントの作用
グループ３２抗体がＴＮＦ結合における増大をひき起こす作用機序を探究するために、これら抗体の存在および非存在におけるＨｅＬａ７５．３細胞からのＴＮＦの分離速度を比較した。
【００７２】
放射標識したＴＮＦをＨｅＬａ  Ｐ７５．３密集細胞に添加して細胞を氷上で２時間インキュベートした。非結合リガンドを洗い流し、冷ＴＮＦ５００ｎｇ／ｍｌを含む結合緩衝液１ｍｌを氷上で指定の時間の間４重の井穴中に加えた。その後、井穴を冷ＰＢＳでもう一度洗滌し、残余リガンドの量をＰＢＳ／ＥＤＴＡ溶液とのインキュベーションによりプレートから引き離された細胞の放射能を測定することによって決定した。抗体は定量の間中１０μｇ／ｍｌの濃度で供給した。
【００７３】
図１０に示すように、これら抗体とそれらのＦ（ａｂ）１価フラグメントの両者いずれもレセプターからのＴＮＦ分離の速度を減少させる。ＴＮＦのそのレセプターへの結合にこれらの抗体が影響を与えるそのやり方についての考えられる解釈を与えるだけでなく、この知見はこの作用に対するもう一つの応用を示唆している。グループ３２抗体によるのと同じようなコンホメーション変化がその内部で起こるような、Ｐ７５ＴＮＦ−ＲｓまたはＰ５５レセプターまたはＴＮＦ／ＢＧＦレセプター系統群のいずれか他のメンバーの可溶型はそれぞれの作動薬のより良い阻害剤として働らくであろう。
【００７４】
例６：モノクローナル抗体３２，５７および７０（グループ３２抗体）の重鎖のＣＤＲ中および抗体３２の軽（Ｋａｐｐａ）鎖のＣＤＲ中のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列の決定
抗体３２，５７および７０の重鎖のＣＤＲのヌクレオチド配列を決定するために、プロメガプロトコールにより全ＲＮＡをグアニジニウムチオイソシアネートを用いてそれぞれのハイブリドーマ細胞から分離した。このＲＮＡ上での第１鎖ｃＤＮＡ合成をＡＭＶ逆転写およびプライマーとしてオリゴ（ｄＴ）１５−１８またはネズミＩｇＧの重鎖の定常部に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて実施した。ｃＤＮＡをＰＣＲのための鋳型として使用し、部分的に縮重した５′−プライマーを適用した。４０サイクルのＰＣＲを行なった。約３５０ｂｐの大きさのＰＣＲ産物を電気泳動法を用いて精製し、ブルースクリプトベクター中でクローン化した。正しい大きさの挿入断片を有するクローンの塩基配列決定を行なった。抗体ｎｏ．３２の軽鎖のＣＤＲ領域の二重鎖のｃＤＮＡを同じようにして合成した。
【００７５】
ジデオキシ鎖終結法により得られたヌクレオチド配列、およびそれから推定されたアミノ酸配列を図１１および１２に示す。ＣＤＲ１，２および３領域には下線を施してある。
【００７６】
例７：グループ３２抗体のｓｃＦｖの調製
グループ３２のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のクローン化した種々の領域を１５個のアミノ酸の長さのリンカーと連結し、市販の発現ベクター中に導入した。そのベクターはたとえばｌａｃのようなプロモーター、ｐｅｌ−Ｂのようなリーダー配列と同時に、小さなペプチド（“ｔａｇ”ペプチド）をコードする配列で、それに対するモノクローナル抗体が市販品として入手できるようなものを含んでいる。現在ではプラスミドは大腸菌中に導入され細菌はＯ．Ｄ．  ０．５−１．０にまで増殖させている。ｓｃＦｖの発現はＩＰＴＧの添加により誘導し増殖をさらに６−２４時間継続させる。ついで可溶性のｓｃＦｖ−ｔａｇ複合体をｔａｇに対するモノクローナル抗体を用い免疫アフィニティ精製法により培養培地から分離し、そのあと金属アフィニティカラム上で精製した。
【００７７】
細菌中に蓄積したｓｃＦｖはどんなものも封入体を分離し、くり返し洗滌することによって精製し、ひき続いてたとえば尿素またはグアニジニウムで可溶化し、そのあと再生する。
【００７８】
代わりの可能性はｔａｇとしてオリゴヒスチジンを使用し、ｌａｃの代わりにより強力なプロモーター、すなわちＴ７を用いて、リーダー配列なしのベクターを構築するか、または無関係な配列の“ｔａｉｌ”をコードする配列をｓｃＦｖの５′末端位のベクトル中に導入することである。この“ｔａｉｌ”は生物学的に活性であってはならない、というのはそれの唯一の目的は天然のｓｃＦｖよりも長い分子をつくることであり、これによって体内での保持時間をより長くすることができるからである。
【００７９】
例８：図１３は２つのＴＮＦ−Ｒｓの細胞外ドメイン中の内部システィンリッチ繰返し体とそれらと相同なヒトＦＡＳ、神経成長因子（ＮＧＦ）およびＣＤＷ４０ならびに同じくラットＯｘ４０の細胞外ドメイン中の繰返し体とを並べて示したものである。アミノ酸配列（一文字記号）を最高相同に関して配列してある。レセプター中のアミノ酸の位置を左側縁に示した。
【００８０】
例９：活性ペプチドおよびその他の分子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子の創製とそれらの発現
ペプチドおよびその他の分子もまた遺伝子工学的方法で調製することができ、それらの調製には遺伝子工学的方法で用いられるすべての道具が用いられる。こうしてこれらペプチドおよびその他の生物学的分子に関してコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子が供給される。これらのＤＮＡ分子はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびそれらの組み合わせとなりうる。
【００８１】
このようなペプチドおよび分子をコードするＤＮＡ分子の創製は、これらのペプチドおよびその他の分子のアミノ酸配列が一旦決定されれば通常の方法は実施される。
【００８２】
組換え蛋白質の発現は適当な発現ベクターを用いて真核細胞、細菌または酵母中で実現させることができる。技術的に知られている方法はどんなものでも使われるかもしれない。
【００８３】
たとえば、上述の方法で得られたペプチドまたはその他の分子をコードするＤＮＡ分子は技術的によく知られた方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｈａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｈａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８２））によって適当に構築された発現ベクター中へ挿入される。二重鎖ｃＤＮＡはホモポリメリックテーリングまたは合成ＤＮＡリンカーまたは平滑末端連結技法の使用を含む制限連結によってプラスミドベクターに連結される。ＤＮＡ分子を配位子結合させるのにはＤＮＡリガーゼを用い、アルカリフォスファターゼによる処理によって好ましくない連結を避ける。
【００８４】
望みの生物学的物質、すなわちペプチドまたは蛋白質（以後簡単のために“蛋白質”とする）の発現を可能にするために、発現ベクターは遺伝子発現と蛋白質の産生が可能なように望みの蛋白質をコードするＤＮＡに連結した転写および翻訳調節情報を含む特定のヌクレオチド配列を含まなければならない。第１に、遺伝子が転写されるためには、その前にＤＮＡポリメラーゼによって認識され得るプロモーターが存在しなければならず、ポリメラーゼはこれに結合して転写のプロセスが始まる。使用に供されているこのようなプロモーターにはいろいろのものがあり、働らく効率も異なっている（強および弱プロモーター）。それらは原核細胞と真核細胞では異なっている。
【００８５】
本発明で使用可能なプロモーターは構成的なもの、たとえばバクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクトマーゼ、およびｐＰＲ３２５のクロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターなどか、あるいは以下に示すような誘導的なものになるかもしれない：バクテリオファージλ（ＰL およびＰR ）、大腸菌のｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，ｌａｃＩ，ｏｍｐＦおよびｇａｌプロモーターなど（Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．（１９８７）Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１：２７７−２８２）。
【００８６】
原核細胞中で高レベルの遺伝子発現を実現するためには、大量のｍＲＮＡを作り出す強力なプロモーターの使用のほかに、ｍＲＮＡが効率良く翻訳されることを保証するためにリボソーム−結合部位を使用することも必要である。１つの例はＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列で、開始コドンから適当な位置にありかつ１６Ｓ  ＲＮＡの３′−末端配列に相補的である。
【００８７】
真核宿主については、宿主の性質に応じて異なる転写および翻訳調節配列が用いられる。それらはウィルス起原のもので、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス、シミアンウィルス、または同じようなものがあり、そこでの調節シグナルは高レベルの発現を有する特定の遺伝子と関連している。例としてはヘルペスウィルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、酵母ｇａｌ  ４遺伝子プロモーター等がある。転写開始調節シグナルは抑制と活性化が可能で、それによって遺伝子の発現が調節できるものが選択される。
【００８８】
本発明のペプチドまたはその他の分子をコードするヌクレオチド配列を含み、実施可能なように転写および翻訳シグナルを連結したＤＮＡを、宿主細胞染色体中へ望みの遺伝子を組み込むことができるベクター中へ挿入する。導入されたＤＮＡを染色体中へ安定に組み込んだ細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞を選択できる１つまたはそれ以上のマーカーを導入することによっても選択することができる。プロトトロフィーに関してマーカーは栄養要求性宿主に対して生物致死剤、たとえば抗生物質または銅やその類似体などの重金属を提供するであろう。選択可能なマーカー遺伝子は発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列に直接連結し得るか、あるいは同時トランスフェクションによって同じ細胞中へ導入される。単鎖結合蛋白質ｍＲＮＡの最適合成のためには付加的要素もまた必要となる。これらの要素は転写プロモーター、エンハンサーおよび終結シグナルと同様にスプライスシグナルを含むであろう。このような要素を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターはＯｋａｙａｍａ，Ｈ．，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３：２８０によって記載されたようなものを含んでいる。
【００８９】
好ましい態様では、導入ＤＮＡ分子は受容宿主中で自律的複製ができるプラスミドまたはウィルスベクター中へ取り込まれるであろう。特定のプラスミドまたはウィルスベクターを選択するにあたっての重要な因子として以下のものが含まれる：ベクターを含む受容細胞が認識できてベクターを含まない細胞からの選択が容易であること；特定の宿主中で要求されるベクターのコピー数；および異なる種の宿主細胞間で“シャトル”できることが望ましいかどうかということなどである。
【００９０】
好ましい原核生物のベクターには以下のものが含まれる：大腸菌中で複製できるプラスミド、たとえばｐＢＲ３２２，ＣｏｌＥ１，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４，など（Ｍａｎｉａｔｉｓ他，（１９８２）ｏｐ．ｃｉｔ．）；ｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７など（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８２）；ｐＩＪ１０１を含むストレプトミセスプラスミド（Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｋ．Ｊ．他，（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−８３）；φＣ３１のようなストレプトミセスバクテリオファージ（Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．他，ｉｎ：Ｓｉｘｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６），およびシュードモナスプラスミド（Ｊｏｈｎ，Ｊ．Ｆ．他（１９８６）Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４；ａｎｄ  Ｉｚａｋｉ，Ｋ．（１９７８）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３３：７２９−７４２）。
【００９１】
好ましい真核生物プラスミドはＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、２−ミクロンサークルなど、またはそれらの誘導体を含む。このようなプラスミドは技術的によく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．他（１９８２）Ｍｉａｍｉ  Ｗｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．１９，ｐｐ．２６５−２７４；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．４４５−４７０（１９８１）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．，（１９８２）Ｃｅｌｌ，２８：２０３−２０４；Ｂｏｌｌｏｎ，Ｄ．Ｐ．他（１９８０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１０：３９−４８；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｉｎ：Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．５６３−６０８（１９８０））。
【００９２】
構築物を含むベクターまたはＤＮＡ配列が発現のために一旦調製されると、ＤＮＡ構築物は適合した種々の方法のいずれかによって適当な宿主細胞中へ導入される：形質転換、トランスフェクション、接合、原形質体融合、エレクトロポレーション、燐酸カルシウム沈澱、直接ミクロインジェクションなど。
【００９３】
本発明で使用されるべき宿主細胞は原核生物のものかあるいは真核生物のものとなるだろう。好ましい原核生物宿主に含まれるのは大腸菌、バチルス属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、サルモネラ属、セラチア属などの細菌である。最も好ましい原核生物宿主は大腸菌である。特別に興味のある細菌宿主には大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ- ，λ- ，プロトロピック（ＡＴＣＣ２７３２５））、およびネズミチフス菌または霊菌のような腸内細菌および種々のシュードモナス種がある。このような条件下では蛋白質は糖化されないだろう。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプリコンおよび制御配列と適合しなければならない。
【００９４】
好ましい真核生物宿主はたとえばヒト、サル、マウスおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞である、というのはそれらは正しい折りたたみまたは正しい部位での糖化を含む蛋白質分子への翻訳後修飾を与えるからである。また酵母細胞は糖化を含む翻訳後ペプチド修飾を行うことができる。いくつかの組換えＤＮＡ戦略があり、それによると強力なプロモーター配列および酵母中で望みの蛋白質の産生のために使用しうるプラスミドを用いる。酵母はクローン化した哺乳動物遺伝子産物上のリーダー配列を認識してリーダー配列を有するペプチド（すなわちプレ−ペプチド）を分泌する。
【００９５】
ベクター導入後、宿主細胞を選択培地中で増殖させ、これによってベクター含有細胞の増殖が選択される。クローン化遺伝子配列が発現するとその結果望みの蛋白質が産生する。
【００９６】
組換え蛋白質の精製はこの目的のために知られている方法のいずれか１つによって行われる。
【００９７】
寄託について
ハイブリドーマＴＢＰ−ＩＩ  ７０−２をＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ（ＣＮＣＭ）に１９９０年３月１２日に寄託し、受託番号Ｎｏ．Ｉ−９２８が付与された。
ハイブリドーマＴＢＰ−ＩＩ  ３２−５は、１９９３年９月１日にＣＮＣＭに寄託され、受託番号Ｎｏ．Ｉ−１３５８が付与された。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】グループ３２の抗体が結合しており、配列の決定に使用されるバクテリア構築物を図式的に説明したものである。
【図２】図１に示した構築物への抗体の結合を決定するウェスタンブロッティング分析法の１例を示したものである。
【図３】３２グループ又はその１部のモノクローナル抗体によって認識されるエピトープの領域を配列中に含む合成ペプチドと、このグループの抗体との構築物に対する結合の拮抗を示したものである。この構築物にはエピトープが存在するＴＢＰ−ＩＩの１部が含まれている。
【図４】３２グループ又はその１部のモノクローナル抗体によって認識されるエピトースの領域を配列中に含む合成ペプチドと、このグループの抗体との構築物に対する結合の拮抗を示したものである。この構築物にはエピトープが存在するＴＢＰ−ＩＩの１部が含まれている。
【図５】Ｐ７５レセプターのヌクレオチド及び演繹されたアミノ酸配列を示したものである。ＴＢＰ−ＩＩ及びトランスメンブランドメインは線で囲み斜線が付けてある。グループ３２によって認識される領域は下線が付けてある。
【図６】Ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ及びそのフラグメントに対する種々のモノクローナル抗体によるＨｅＬａ  ｐ７５．３細胞（後で定義する）のＴＮＦ細胞毒性からの防御パターンを示したものである。
【図７】ＴＮＦによるＵ９３７細胞の殺細胞度への、ＴＢＰ−Ｉに対するモノクローナル抗体及びＴＢＰ−ＩＩに対する数個のモノクローナル抗体の影響を示したものである。
【図８】モノクローナル抗体７０及びそのＦａｂフラグメントのＴＮＦ結合に対する影響であって、ＡはＰ７５．３細胞への結合に対しての図、ＢはＵ９３７細胞への結合に対しての図である。
【図９】ＨｅＬａ  Ｐ７５．３細胞へのＴＮＦの結合に対する抗体３２の影響をＰ７５ＴＮＦ−Ｒに対する他の抗体と比較したものである。
【図１０】抗体Ｎｏ．７０及びその１価Ｆａｂフラグメントの存在下及び非存在下におけるＨｅＬａ  Ｐ７５．３細胞からのＴＮＦの解離を示したものである。
【図１１】３２グループの３種モノクローナル抗体の重鎖のＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列及び演繹されたアミノ酸配列を示したものである。
【図１２】モノクローナル抗体Ｎｏ．３２の軽鎖のＣＤＲ領域に対するヌクレオチド配列及び演繹されたアミノ酸配列を示したものである。
【図１３】図はＴＮＦ／ＮＧＦレセプター系統群の幾つかのメンバー間の配列の相同性を示したものである。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図２】
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【配列表】
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