(57)【要約】【課題】胚性幹細胞を生着させた組織工学用スキャホールド材の表面付近では胚性幹細胞を血管内皮細胞に分化させ、組織工学用スキャホールド材内部では平滑筋細胞に分化させることができ、３次元的な階層構造を有したハイブリッド型人工血管を製造することが可能な細胞分化誘導法を提供する。【解決手段】多孔質三次元網状構造を有した熱可塑性樹脂製の組織工学用スキャホールド材に細胞を生着させ、該細胞の分化を誘導する方法において、該細胞に対し拍動流を加えつつ培養する。拍動流負荷によって生じるずり応力によって内皮細胞が分化誘導され、周期的伸縮と圧拍動によって平滑筋細胞が分化誘導される。複数の血管壁構成細胞が同時に分化誘導できることから、３次元的な階層構造を有するハイブリッド型人工血管を構築できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質三次元網状構造を有した熱可塑性樹脂製の組織工学用スキャホールド材に細胞を生着させ、該細胞の分化を誘導する方法において、該細胞に対し拍動流を加えつつ培養することを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項２】
請求項１において、該熱可塑性樹脂がポリウレタン樹脂、ポリアミド樹脂、ポリ乳酸樹脂、ポリオレフィン樹脂、ポリエステル樹脂、フッ素樹脂、アクリル樹脂及びメタクリル樹脂並びにこれらの誘導体からなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項３】
請求項２において、該熱可塑性樹脂がポリウレタン樹脂であることを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項４】
請求項３において、該ポリウレタン樹脂が生体親和性物質でコーティングされていることを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、拍動の周期が０．１Ｈｚ〜１００００Ｈｚであることを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、拍動の最高圧と最低圧との差が１ｍｍＨｇ〜５００ｍｍＨｇであることを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、細胞が幹細胞であることを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項８】
請求項７において、幹細胞が胚性幹細胞であることを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、該組織工学用スキャホールド材が管状であり、細胞の分化によって人工血管を製造することを特徴とする細胞分化誘導法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の分化誘導方法に係り、特に人工血管を製造するのに好適な細胞分化誘導法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の分化は細胞分裂と異なり、いくつかの細胞へ変化する可能性があり、特に幹細胞のような多分化能を有する細胞は、多種多様な細胞へ分化することが可能である。組織工学においては、培養した細胞又は培養している細胞を目的とする細胞へ分化誘導する必要があり、従って、細胞を選択的に分化誘導することは重要な技術である。
【０００３】
未分化胚性幹（ＥＳ）細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管壁構成細胞への分化誘導に関して、生化学的手法を利用し、ＶＥＧＦやＰＤＧＦなどのサイトカインによって血管内皮細胞や周皮細胞が誘導され、さらに３次元培養によって毛細血管様の管状組織体が形成されることが報告されている。
【非特許文献１】Yamashita  J,  Itoh  H,  et  al.  Flk1  positive  cells  derived  from  embryonic  stem  cells  serveas  vascular  progenitors.  Nature  408:  92-96,  2000.
【非特許文献２】Yurugi-Kobayashi  T,  Itoh  H,  Yamashita  J,  et  al.  Effective  contribution  of  transplanted  vascular  progenitor  cells  derived  from  embryonic  stem  cells  to  about  neovascularization  in  proper  differentiation  stage.  Blood  101:  2675-2678,  2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
胚性幹細胞は近年注目される再生医学、再生医療に利用できる可能性が大きい細胞であるが、未分化の状態で生体内へ移植された場合、腫瘍細胞となる危険性があることは公知の事実である。従って、再生医療において胚性幹細胞を未分化のものを残すことなく分化させること、特に、スキャホールド材へ生着させた細胞を目的とする細胞に分化誘導する技術の確立は大きな課題である。
【０００５】
本発明は、胚性幹細胞を生着させた組織工学用スキャホールド材の表面付近では胚性幹細胞を血管内皮細胞に分化させ、組織工学用スキャホールド材内部では平滑筋細胞に分化させることができ、３次元的な階層構造を有したハイブリッド型人工血管を製造することが可能な細胞分化誘導法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
請求項１の細胞分化誘導法は、多孔質三次元網状構造を有した熱可塑性樹脂製の組織工学用スキャホールド材に細胞を生着させ、該細胞の分化を誘導する方法において、該細胞に対し拍動流を加えつつ培養することを特徴とするものである。
【０００７】
請求項２の細胞分化誘導法は、請求項１において、該熱可塑性樹脂がポリウレタン樹脂、ポリアミド樹脂、ポリ乳酸樹脂、ポリオレフィン樹脂、ポリエステル樹脂、フッ素樹脂、アクリル樹脂及びメタクリル樹脂並びにこれらの誘導体からなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項３の細胞分化誘導法は、請求項２において、該熱可塑性樹脂がポリウレタン樹脂であることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項４の細胞分化誘導法は、請求項３において、該ポリウレタン樹脂が生体親和性物質でコーティングされていることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項５の細胞分化誘導法は、請求項１ないし４のいずれか１項において、拍動の周期が０．１Ｈｚ〜１００００Ｈｚであることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項６の細胞分化誘導法は、請求項１ないし５のいずれか１項において、拍動の最高圧と最低圧との差が１ｍｍＨｇ〜５００ｍｍＨｇであることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項７の細胞分化誘導法は、請求項１ないし６のいずれか１項において、細胞が幹細胞であることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項８の細胞分化誘導法は、請求項７において、幹細胞が胚性幹細胞であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項９の細胞分化誘導法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、該組織工学用スキャホールド材が管状であり、細胞の分化によって人工血管を製造することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、拍動流負荷によって生じるずり応力によって内皮細胞が分化誘導され、周期的伸縮と圧拍動によって平滑筋細胞が分化誘導されると考えられる。
【００１６】
管状の組織工学用スキャホールド材を用いた場合には、複数の血管壁構成細胞が同時に分化誘導できることから、３次元的な階層構造を有するハイブリッド型人工血管を構築できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の好ましい形態について詳細に説明する。
【００１８】
まず、本発明の細胞分化誘導法に用いられる組織工学用スキャホールド材について説明する。
【００１９】
この組織工学用スキャホールド材を構成する熱可塑性樹脂からなる三次元網状構造部は、好ましくは管状であり、連通性の、即ち、連続気孔性の多孔性三次元網状構造であれば良く、内壁から外壁にいたる全体が類似の構造を有してもいても、内壁付近と外壁付近とで相違していても良い。また、部分的に平均孔径や見掛け密度が変化するものであっても良く、例えば、内壁から外壁方向へ向けて平均孔径が徐々に変化する、所謂、異方性を有していても良い。管状体の外周面にスキン層が設けられていてもよい。
【００２０】
この熱可塑性樹脂からなる多孔性三次元網状構造の平均孔径は、好ましくは２０〜６５０μｍで、見掛け密度は０．０１〜０．５ｇ／ｃｍ３であるが、より好ましくは３０〜１００μｍである。見掛け密度としては０．０１〜０．５ｇ／ｃｍ３範囲内であれば、細胞生着性が良好で、優れた物理的強度を維持し、生体に近似した弾性特性が得られるが、好ましくは０．０１〜０．２ｇ／ｃｍ３、より好ましくは０．０１〜０．１ｇ／ｃｍ３である。
【００２１】
孔径の分布は単分散の方が好ましく、細胞の侵入に重要な孔径サイズである孔径３０〜１００μｍの孔の寄与率が高いことが望ましい。孔径３０〜１００μｍの孔の寄与率が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上あると、細胞が侵入し易く、また、侵入した細胞が接着、成長しやすいため、スキャホールド材及び人工血管としての用途に有効である。
【００２２】
このような平均孔径、見掛け密度及び孔径分布の多孔性三次元網状構造であれば、細胞及び培養液等が容易に空孔部分へ浸透し、多孔性構造層へ細胞が接着、成長しやすい。従って、これを管状に成形した場合には、内壁から外周にいたる全体に細胞を生着させることができるため、閉塞の危険性の低い、開存率の高い人工血管を実現することができる。
【００２３】
この組織工学用スキャホールド材を構成する熱可塑性樹脂としては、ポリウレタン樹脂、ポリアミド樹脂、ポリ乳酸樹脂、ポリオレフィン樹脂、ポリエステル樹脂、フッ素樹脂、アクリル樹脂、メタクリル樹脂並びにそれらの誘導体を例示することができ、これらは１種を単独で使用しても良く、２種以上を併用しても良いが、好ましくは、ポリウレタン樹脂であり、中でもセグメント化ポリウレタン樹脂が抗血栓性や物理特性などの点でも優れた人工血管を得ることができ、好ましい。
【００２４】
また、熱可塑性樹脂が加水分解性又は生分解性を有するものであれば、人工血管の生体移植後に徐々に分解、吸収され、最終的には生着した細胞を残したまま樹脂製の基材自体を生体から排除することも可能である。
【００２５】
このスキャホールド材の表面にフィブロネクチンなどの生体親和性化合物をコーティングすることにより、細胞の付着性を向上させることができる。
【００２６】
このスキャホールド材に生着させる細胞としては胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、ＥＳ細胞由来のＦｌｋ−１陽性細胞が好適である。
【００２７】
この細胞を上記スキャホールド材に生着させるには、この細胞浮遊液を、必要に応じ少なくとも一部をＭＡＣＳ（磁気細胞分離装置）によって純化処理した後、スキャホールド材に播種すればよい。この純化処理方法としては、ＦＬＫ−１抗体を固定した磁気ビーズでＦＬＫ−１陽性細胞を磁気ラベルし、カラムにて分離する方法が例示される。純化率としては９０％以上であることが好ましい。また、磁気ラベルされた細胞はそのまま(抗体を固定した磁気ビーズを外すことなく)スキャホールド材へ播種することが好ましい。
【００２８】
本発明の方法によって人工血管を製造する場合、スキャホールド材は中空管状とされ、細胞浮遊液が管腔内面に播種される。具体的には、ノズルを管腔に差し込み、このノズルから細胞浮遊液を吐出させつつ管状スキャホールド材を軸心回りに回転させ、内腔面に均一に細胞浮遊液を付着させる方法や、中空管状のスキャホールド材の片側末端を密閉し、もう一方の末端から細胞浮遊液を注入し、そのまま加圧することで播種する方法、あるいは中空管状のスキャホールド材に細胞浮遊液を注入し、連続的にあるいは断続的に回転させながら静置培養する方法などが例示される。
【００２９】
内腔面単位面積当りの細胞付着量は１〜５０万ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２程度が好適であるが、これに限定されない。
【００３０】
播種後は、０．５〜４日程度、ＶＥＧＦや、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、形質転換増殖因子α、インスリン様増殖因子、インスリン様増殖因子結合蛋白、肝細胞増殖因子、アンジオポイエチン、神経増殖因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、形質転換増殖因子β、潜在型形質転換増殖因子β、アクチビン、骨形質タンパク、繊維芽細胞増殖因子、腫瘍増殖因子β、二倍体繊維芽細胞増殖因子、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子、シュワノーマ由来増殖因子、アンフィレグリン、ベーターセルリン、エピグレリン、リンホトキシン、エリスロエポイエチンなどのサイトカインを０．１〜１０ｕｇ／ｍＬ程度含んだ培養途中で静置培養した後、ＶＥＧＦやＰＤＧＦなどのサイトカインを含まない培養液を管腔内に流通させる。この流通に際し、培養液を拍動させる。
【００３１】
培養液の培地としては、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、グルタマックスなどを用いることができる。
【００３２】
培養液の平均流通速度（管軸方向の平均流速）は５〜２５０ｍｌ／ｍｉｎ程度が好適である。
【００３３】
拍動させるには脈動式ポンプを用いればよい。拍動の周期は０．７〜１．２秒程度が好適であり、１回の拍動のうち収縮期は０．２〜０．４秒程度、拡張期は０．４〜０．６秒程度が好適である。拍動の平均圧は１０〜１００ｍｍＨｇ程度が好適であり、拍動の最高圧と最低圧との差は１０〜１５０ｍｍＨｇ程度が好適である。
【実施例】
【００３４】
実施例１
未分化マウスＥＳ細胞由来のＦｌｋ−１陽性細胞を主構成成分とする濃度５×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞浮遊液を調製し、ＦＬＫ−１抗体を固定した磁気ビーズで磁気ラベルした後にＭＡＣＳにて磁気細胞分離することにより純化処理した後に、未純化のものと混合して細胞浮遊液とした。
【００３５】
外周面にスキン層を設けたポリウレタン製スポンジチューブとして、内径５ｍｍ、外径６ｍｍ、長さ３０ｍｍのものと、内径１．８ｍｍ、外径３０ｍｍ、長さ３０ｍｍのものを用意した。スキン層の厚みはいずれも約０．０５〜０．２ｍｍである。このスポンジチューブの平均孔径は４０μｍであり、見掛け密度は０．２３ｇ／ｃｍ３である。各チューブの内周面に０．１％フィブロネクチンを含むＰＢＳ溶液に３０分浸漬させることでフィブロネクチンを薄くコーティングした。
【００３６】
これらのチューブをホルダで保持し、２０００ｒｐｍにて軸心回りに回転させながら、管腔内にノズルを差し込んで上記細胞浮遊液を吐出させ、内腔面より播種した。内腔面の単位面積当りの播種量は３００万ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２である。
【００３７】
次いで、ＶＥＧＦを０．１μｇ／ｍＬ含有するα−ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳと５×１０−５Ｍの２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含む）よりなる培養液中にて２日間静置前培養を行った。その後、ＶＥＧＦを含有しない他は上記と同一の培養液を各チューブの内腔に脈動式ポンプを用いて通液した。
【００３８】
通液の平均線速度は、５０ｍＬ／ｍｉｎとした。拍動は、収縮期０．３秒、拡張期０．５秒、拍動最高圧３０ｍｍＨｇ、拍動最低圧１０ｍｍＨｇ、ずり応力−０．９８〜２．２ｄｙｎ／ｃｍ２、周辺応力４．６〜９．６×１０４ｄｙｎ／ｃｍ２の条件にて行った。
【００３９】
２日間この通液を行った後細胞種を免疫組織的に調べ、内腔面の細胞形態をＳＥＭで観察した。その結果、血管内皮細胞マーカー（ＣＤ３１、ＣＤ１４４）陽性細胞と平滑筋細胞マーカー（αＳＭＡ）陽性細胞が認められた。
【００４０】
これは、拍動流負荷によって生じるずり応力によって、内皮細胞が分化誘導され、周期的伸縮と圧拍動によって平滑筋細胞が分化誘導されたためであると考えられる。