(57)【要約】  【課題】従来の転写物マッピング方法は貧弱で正しくない結果を生じさせ、転写物構造に関して与えられる情報は不完全であいまいなものであるため、改良した転写物マッピング方法を提供する。  【解決手段】ショートタグを基礎としたＳＡＧＥ及びＭＰＳＳによる効率性と完全長ｃＤＮＡの正確性とを結合させたＧＩＳ分析法である。遺伝子の転写物から５’末端タグと３’末端タグを取得し、ＧＩＳ結合タグを形成し、ゲノム配列の少なくとも一部に対し５’末端タグをマッチングさせ、次に３’末端タグをマッチングさせ、少なくとも１つの発生セグメントを同定し、少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定し、この可能性のある遺伝子位置の各々があらかじめ定義された遺伝子長の配列長を超えないようにする。ゲノム配列にインデックスを付けるために圧縮添字列ＣＳＡを用いる。  【選択図】  図３
2006075162.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子の転写物マッピング方法であって、
遺伝子の転写物から５’末端タグと３’末端タグを取得する工程と、
ゲノム配列の少なくとも一部に対し前記５’末端タグをマッチングさせる工程で、これによりそこから少なくとも１つの５’部位を同定し、この少なくとも１つの５’部位の各々が前記５’末端タグにマッチングする配列を有しているようなマッチング工程と、
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し前記３’末端タグをマッチングさせる工程で、これによりそこから少なくとも１つの３’部位を同定し、この少なくとも１つの３’部位の各々が前記３’末端タグにマッチングする配列を有しているようなマッチング工程と、
少なくとも１つの発生セグメントを同定する工程で、ここで少なくとも１つの発生セグメントの各々が前記少なくとも１つの５’部位の１つから前記少なくとも１つの３’部位の１つへと延伸するゲノム配列に沿った配列セグメントであり、前記少なくとも１つの発生セグメントの各々が配列長を有しているような同定工程と、
少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する工程で、この可能性のある遺伝子位置の各々が、あらかじめ定義された遺伝子長の配列長を超えない配列長を有する前記少なくとも１つの発生セグメントの１つであるような同定工程とを包含してなる遺伝子の転写物マッピング方法。
【請求項２】
５’末端タグと３’末端タグを同定する工程が、
前記５’末端タグを形成するための少なくとも１６の塩基対を有するヌクレオチド配列を供給する段階と、
前記３’末端タグを形成するための少なくとも１６の塩基対を有するヌクレオチド配列を供給する段階とを包含している請求項１記載の転写物マッピング方法。
【請求項３】
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し５’末端タグをマッチングさせる工程が、５’末端タグを染色体配列にマッチングさせる段階を包含している請求項１記載の転写物マッピング方法。
【請求項４】
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し３’末端タグをマッチングさせる工程が、３’末端タグを染色体配列にマッチングさせる段階を包含している請求項３記載の転写物マッピング方法。
【請求項５】
さらに前記ゲノム配列にインデックスを付けるためのデータ構造を生成する工程を包含する請求項１記載の転写物マッピング方法。
【請求項６】
さらに前記ゲノム配列にインデックスを付けるためのツリー構造及び順序付けられた列の少なくとも１つを生成する工程を包含する請求項１記載の転写物マッピング方法。
【請求項７】
さらに前記ゲノム配列にインデックスを付けるための添字列、添字ツリー、二進ツリー及び圧縮された添字列の少なくとも１つを生成する工程を包含する請求項１記載の転写物マッピング方法。
【請求項８】
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し５’末端タグをマッチングさせる工程が、ゲノム配列を前進横断させるか後退横断させるか少なくとも１つの横断をさせ、少なくとも１つの５’部位を取得するように、５’末端タグを前記ゲノム配列の少なくとも一部と比較するようになっている段階を包含している請求項７記載の転写物マッピング方法。
【請求項９】
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し３’末端タグをマッチングさせる工程が、ゲノム配列を前進横断させるか後退横断させるか少なくとも１つの横断をさせ、少なくとも１つの３’部位を取得するように、３’末端タグを前記ゲノム配列の少なくとも一部と比較するようになっている段階を包含している請求項８記載の転写物マッピング方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する工程が、前記少なくとも１つの発生セグメントの各々と前記少なくとも１つの５’部位の１つとそれに対応する前記少なくとも１つの３’部位の１つとの配列順序を、ゲノム配列の少なくとも一部と比較し、そこから少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を取得するようになっている段階を包含している請求項１記載の転写物マッピング方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの発生セグメントの各々と前記少なくとも１つの５’部位の１つとそれに対応する前記少なくとも１つの３’部位の１つとの配列順序を比較する工程が、５’−発生セグメント−３’構造に従って、前記少なくとも１つの発生セグメントの各々と前記少なくとも１つの５’部位の１つとそれに対応する前記少なくとも１つの３’部位の１つとの配列順序を比較する段階を包含している請求項１０記載の転写物マッピング方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する工程が、前記少なくとも１つの発生セグメントの各々の５’−３’方向性を同定し、そこから少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を取得する段階を包含している請求項１記載の転写物マッピング方法。
【請求項１３】
前記５’−３’方向性を同定する段階が、残ったＡＡヌクレオチドを同定することを包含し、この残ったＡＡヌクレオチドは前記３’末端タグの一部を構成している請求項１２記載の転写物マッピング方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する工程が、前記発生したセグメントの各々に対応する少なくとも１つの５’部位の１つと少なくとも１つの３’部位の１つとの各々が、そこから少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定するように位置決めされている染色体を同定する段階を包含している請求項１記載の転写物マッピング方法。
【請求項１５】
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し５’末端タグをマッチングさせる工程が、少なくとも１つの５’部位の量を同定する段階を包含し、前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し３’末端タグをマッチングさせる工程が、少なくとも１つの３’部位の量を同定する段階を包含している請求項１記載の転写物マッピング方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの発生セグメントを同定する工程が、ゲノム配列に沿って少なくとも１つの５’部位の各々からその末端の１つに向けて横断させ、少なくとも１つの３’部位の少なくとも１つを同定するようになっている段階を包含している請求項１５記載の転写物マッピング方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する工程が、前記ゲノム配列に沿って、少なくとも１つの５’部位の各々のために同定された少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置の１つに応答して横断を終了させる段階を包含している請求項１６記載の転写物マッピング方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの発生セグメントを同定する工程が、ゲノム配列に沿って少なくとも１つの３’部位の各々からその末端の１つに向けて横断させ、少なくとも１つの５’部位の少なくとも１つを同定するようになっている段階を包含している請求項１５記載の転写物マッピング方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する工程が、前記ゲノム配列に沿って、少なくとも１つの３’部位の各々のために同定された少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置の１つに応答して横断を終了させる段階を包含している請求項１８記載の転写物マッピング方法。
【請求項２０】
遺伝子の転写物マッピングシステムであって、
遺伝子の転写物から５’末端タグと３’末端タグを取得する手段と、
ゲノム配列の少なくとも一部に対し前記５’末端タグをマッチングさせる手段で、これによりそこから少なくとも１つの５’部位を同定し、この少なくとも１つの５’部位の各々が前記５’末端タグにマッチングする配列を有しているようなマッチング手段と、
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し前記３’末端タグをマッチングさせる手段で、これによりそこから少なくとも１つの３’部位を同定し、この少なくとも１つの３’部位の各々が前記３’末端タグにマッチングする配列を有しているようなマッチング手段と、
少なくとも１つの発生セグメントを同定する手段で、ここで少なくとも１つの発生セグメントの各々が前記少なくとも１つの５’部位の１つから前記少なくとも１つの３’部位の１つへと延伸するゲノム配列に沿った配列セグメントであり、前記少なくとも１つの発生セグメントの各々が配列長を有しているような同定手段と、
少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する手段で、この可能性のある遺伝子位置の各々が、あらかじめ定義された遺伝子長の配列長を超えない配列長を有する前記少なくとも１つの発生セグメントの１つであるような同定手段とを包含してなる遺伝子の転写物マッピングシステム。
【請求項２１】
５’末端タグと３’末端タグを同定する手段が、
前記５’末端タグを形成するための少なくとも１６の塩基対を有するヌクレオチド配列を供給する手段と、
前記３’末端タグを形成するための少なくとも１６の塩基対を有するヌクレオチド配列を供給する手段とを包含している請求項２０記載の転写物マッピングシステム。
【請求項２２】
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し５’末端タグをマッチングさせる手段が、５’末端タグを染色体配列にマッチングさせる手段を包含している請求項２０記載の転写物マッピングシステム。
【請求項２３】
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し３’末端タグをマッチングさせる手段が、３’末端タグを染色体配列にマッチングさせる手段を包含している請求項２２記載の転写物マッピングシステム。
【請求項２４】
さらに前記ゲノム配列にインデックスを付けるためのデータ構造を生成する手段を包含する請求項２０記載の転写物マッピングシステム。
【請求項２５】
さらに前記ゲノム配列にインデックスを付けるためのツリー構造及び順序付けられた列の少なくとも１つを生成する手段を包含する請求項２０記載の転写物マッピングシステム。
【請求項２６】
さらに前記ゲノム配列にインデックスを付けるための添字列、添字ツリー、二進ツリー及び圧縮された添字列の少なくとも１つを生成する手段を包含する請求項２０記載の転写物マッピングシステム。
【請求項２７】
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し５’末端タグをマッチングさせる手段が、ゲノム配列を前進横断させるか後退横断させるか少なくとも１つの横断をさせ、少なくとも１つの５’部位を取得するように、５’末端タグを前記ゲノム配列の少なくとも一部と比較するようになっている手段を包含している請求項２６記載の転写物マッピングシステム。
【請求項２８】
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し３’末端タグをマッチングさせる手段が、ゲノム配列を前進横断させるか後退横断させるか少なくとも１つの横断をさせ、少なくとも１つの３’部位を取得するように、３’末端タグを前記ゲノム配列の少なくとも一部と比較するようになっている手段を包含している請求項２７記載の転写物マッピングシステム。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する手段が、前記少なくとも１つの発生セグメントの各々と前記少なくとも１つの５’部位の１つとそれに対応する前記少なくとも１つの３’部位の１つとの配列順序を、ゲノム配列の少なくとも一部と比較し、そこから少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を取得するようになっている手段を包含している請求項２０記載の転写物マッピングシステム。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの発生セグメントの各々と前記少なくとも１つの５’部位の１つとそれに対応する前記少なくとも１つの３’部位の１つとの配列順序を比較する手段が、５’−発生セグメント−３’構造に従って、前記少なくとも１つの発生セグメントの各々と前記少なくとも１つの５’部位の１つとそれに対応する前記少なくとも１つの３’部位の１つとの配列順序を比較する手段を包含している請求項２９記載の転写物マッピングシステム。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する手段が、前記少なくとも１つの発生セグメントの各々の５’−３’方向性を同定し、そこから少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を取得する手段を包含している請求項２０記載の転写物マッピングシステム。
【請求項３２】
前記５’−３’方向性を同定する手段が、残ったＡＡヌクレオチドを同定することを包含し、この残ったＡＡヌクレオチドは前記３’末端タグの一部を構成している請求項３１記載の転写物マッピングシステム。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する手段が、前記発生したセグメントの各々に対応する少なくとも１つの５’部位の１つと少なくとも１つの３’部位の１つとの各々が、そこから少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定するように位置決めされている染色体を同定する手段を包含している請求項２０記載の転写物マッピングシステム。
【請求項３４】
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し５’末端タグをマッチングさせる手段が、少なくとも１つの５’部位の量を同定する手段を包含し、前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し３’末端タグをマッチングさせる手段が、少なくとも１つの３’部位の量を同定する手段を包含している請求項２０記載の転写物マッピングシステム。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの発生セグメントを同定する手段が、ゲノム配列に沿って少なくとも１つの５’部位の各々からその末端の１つに向けて横断させ、少なくとも１つの３’部位の少なくとも１つを同定するようになっている手段を包含している請求項３４記載の転写物マッピングシステム。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する手段が、前記ゲノム配列に沿って、少なくとも１つの５’部位の各々のために同定された少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置の１つに応答して横断を終了させる手段を包含している請求項３５記載の転写物マッピングシステム。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの発生セグメントを同定する手段が、ゲノム配列に沿って少なくとも１つの３’部位の各々からその末端の１つに向けて横断させ、少なくとも１つの５’部位の少なくとも１つを同定するようになっている手段を包含している請求項３４記載の転写物マッピングシステム。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する手段が、前記ゲノム配列に沿って、少なくとも１つの３’部位の各々のために同定された少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置の１つに応答して横断を終了させる手段を包含している請求項３７記載の転写物マッピングシステム。
【請求項３９】
遺伝子の転写物マッピング方法であって、
遺伝子の転写物から５’末端タグと３’末端タグを取得する工程と、
ゲノム配列の少なくとも一部に対し前記５’末端タグをマッチングさせる工程で、これによりそこから少なくとも１つの５’部位を同定し、この少なくとも１つの５’部位の各々が前記５’末端タグにマッチングする配列を有しているようなマッチング工程と、
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し前記３’末端タグをマッチングさせる工程で、これによりそこから少なくとも１つの３’部位を同定し、この少なくとも１つの３’部位の各々が前記３’末端タグにマッチングする配列を有しているようなマッチング工程と、
少なくとも１つの発生セグメントを同定する工程で、ここで少なくとも１つの発生セグメントの各々が前記少なくとも１つの５’部位の１つから前記少なくとも１つの３’部位の１つへと延伸するゲノム配列に沿った配列セグメントであり、前記少なくとも１つの発生セグメントの各々が配列長を有しているような同定工程と、
前記少なくとも１つの発生セグメントから少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する工程で、この少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置の各々が前記少なくとも１つの発生セグメントの１つであり、その配列長の少なくとも１つはあらかじめ定義した遺伝子長の配列長を超えないようになっており、前記少なくとも１つの発生セグメントと前記少なくとも１つの５’部位の１つとそれに対応する前記少なくとも１つの３’部位の１つとの配列順序を、５’−発生セグメント−３’構造に従い、ゲノム配列の対応する部分の配列順序とマッチングさせ、５’部位と少なくとも１つの５’部位の１つとこれに対応する少なくとも１つの３’部位の１つとが５’−３’方向性を有し、前記発生セグメントの各々に対応する少なくとも１つの５’部位の１つと少なくとも１つの３’部位の１つとが同じ染色体の中に位置しているようにする同定工程とを包含している遺伝子の転写物マッピング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子の転写物（transcript）をマッピングする方法及びシステムに関し、特に遺伝子の転写物から、インデックスを付されたゲノム配列（genome sequence ）の圧縮された添字列（suffix array）にマッピングする方法及びシステムに関する。
【０００２】
ヒト及びいくつかの他の生物に対しゲノム配列を完成することについて、注目されるのは、ゲノムに機能的な要素としての注釈（annotation）を付けることであり、それは遺伝子（gene）の符号化（coding）転写物ユニット及びそれを規定するシス（ｃｉｓ）作用要素を含み、それらは遺伝子の表現レベルを調整するものである。
【０００３】
現在、ゲノム注釈には３つの主要なアプローチがある。第１のアプローチはゲノムにおける遺伝子符号化を同定（identify）するために現存する転写物データを用いる方法である。第２のアプローチは遺伝子及び規則的要素（regulatory element）を統計学的に予言するコンピュータアルゴリズムを用いる方法である。第３のアプローチは、ゲノムにおける機能的要素は進化の間も保存されていただろうという見方を基礎にして、保存されていた領域に対する他の脊椎動物からゲノム配列を比較することである。
【０００４】
かなりの成功を収めたとはいえ、これらのアプローチはヒトゲノムについての全ての機能的要素の完全で正確な内容を決定するには不満足なものである。その結果、ヒトゲノムについての遺伝子の完全なリストはまだ入手されていない。特に、全ての低い豊富な細胞に特有な遺伝子はまだ同定されていない。多くの遺伝子モデルは、現在のゲノム注釈が正しくなく、特に転写物が始まる位置と終わる位置がどこかという点で正しくない、としている。
【０００５】
全ての遺伝子予言は実験的手段によって有効とされなければならない。見込みのある遺伝子はさらなる機能的研究のために完全長についてクローン（clone ）化されなければならない。それゆえ、ヒトゲノム注釈の分野を多くの挑戦が包囲しているのは明らかである。
【０００６】
１つの挑戦は、ヒト及びモデル生物の遺伝子から表現された全ての遺伝子及び全ての転写物を同定することである。遺伝子の転写物において、完全長のｃＤＮＡ（complementary DNA ）をクローン化し配列決定（sequencing）することは最も決定的なものであり、転写物の分析のためのゴールドスタンダードと見られよう。しかしながら、このアプローチは、大量の数の種や生物学的条件にわたる大量の転写物を扱う場合には、高価で遅いものとなる。そこでショートタグを用いたアプローチとして、ＳＡＧＥ（serial analysis of gene expression）やＭＰＳＳ（massively parallel signature sequence ）がある。これらのショートタグをベースとする方法は、各転写物を説明するために１４−２０ｂｐ（base pair:塩基対）のサイン（signature ）を抽出する。これらのアプローチはある与えられた転写体における転写物にタグを付けたり計算したりするのには有効であるが、タグの特性はしばしば貧弱であり、転写物構造に関して与えられる情報はほとんど不完全であいまいなものである。
【０００７】
完全長ｃＤＮＡクローンのインターリンクされた５’と３’の端部を抽出して結合タグ（ditag ）構造にすることから得られるＧＩＳ（gene identificationsignature ）結合タグ配列法は、重要なタグ特性を提供する。しかしながら、このＧＩＳ結合タグ配列をゲノムにマッピングするための容易に適用可能なコンピュータアルゴリズムは存在していない。過去において、ＳＡＧＥ及びＭＰＳＳタグは２つのステップによるアプローチを用いて分析されていた。タグは最初にｃＤＮＡ配列にマッチさせられ、次にゲノムにマッチさせられる。このアプローチでは、ｃＤＮＡデータベースに存在しない新規な転写物はマッピングされないことになる。さらに２つのしばしば用いられる配列整列ツールがＢＬＡＳＴ（basic local alignment search tool ）とＢＬＡＴ（BLAST-like alignment tool ）であるが、これらはショートタグ配列のために設計されていないため、しばしば貧弱で正しくない結果を生じさせる。かくして、改良された転写物マッピング方法に対する要求が高まっているのである。
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−１７６７３０「ｃＤＮＡ配列をゲノム配列にマッピングする方法」には、ゲノム配列を互いに重ならない連続するＫ塩基の文字列に分割して高速にマッピングする方法が記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、従来の転写物マッピング方法はしばしば貧弱で正しくない結果を生じさせ、転写物構造に関して与えられる情報はほとんど不完全であいまいなものである。従って、改良された転写物マッピング方法が求められている。
本発明のある態様における転写物マッピング方法は、後述する方法であって、転写体の認識可能な特性のために、ショートタグをベースとしたＳＡＧＥ及びＭＰＳＳの効率と、完全長ｃＤＮＡ（ｆｌｃＤＮＡ）の正確さとを結合したものである。この方法はまた前述したＧＩＳ分析としても知られている。この方法では、完全長ｃＤＮＡクローンの５’と３’の端部が最初に結合タグ構造へと抽出され、結合タグの結合タグコンカテマー（concatemer）が続いて効率的な方法で連続化され、最終的に遺伝子構造を定義するためのゲノムへとマッピングされる。
【００１０】
ＧＩＳ分析においては、各配列の読み（read）が１５の転写物を表現する約１５の結合タグを明らかにする。このアプローチは、現在のｆｌｃＤＮＡクローン及び配列法によるアプローチと比較して、完全長転写物を同定しかつ量を定めるために少なくとも３０倍まで効率を増加させる。各ＧＩＳ結合タグ配列は転写物の最初と最後を表現するために３６の塩基対（ｂｐ）を包含しているので、タグ−ゲノムのマッピングの特性は、１４−２１ｂｐのＳＡＧＥ及びＭＰＳＳタグと比較して、非常に増大させられる。加えて、ＧＩＳ結合タグはある転写物の５’と３’端部を表現しているので、ＳＡＧＥ及びＭＰＳＳタグよりもさらに情報を多く含んでいる。
【００１１】
ＧＩＳ結合タグデータを収容するために、添字列（suffix array）をベースとしたタグ−ゲノム（ＳＡＴ２Ｇ）アルゴリズムが、ＧＩＳ結合タグ配列を、進歩したデータ構造である圧縮された添字列（ＣＳＡ）上に構築されかつインデックスを付けられたゲノム配列へとマッピングするために用いられる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はその第１の態様において、遺伝子の転写物マッピング方法であって、
遺伝子の転写物から５’末端タグ（terminal tag）と３’末端タグを取得する工程と、
ゲノム配列の少なくとも一部に対し前記５’末端タグをマッチングさせる工程で、これによりそこから少なくとも１つの５’部位（site）を同定し、この少なくとも１つの５’部位の各々が前記５’末端タグにマッチングする配列を有しているようなマッチング工程と、
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し前記３’末端タグをマッチングさせる工程で、これによりそこから少なくとも１つの３’部位を同定し、この少なくとも１つの３’部位の各々が前記３’末端タグにマッチングする配列を有しているようなマッチング工程と、
少なくとも１つの発生セグメント（occurring segment)を同定する工程で、ここで少なくとも１つの発生セグメントの各々が前記少なくとも１つの５’部位の１つから前記少なくとも１つの３’部位の１つへと延伸するゲノム配列に沿った配列セグメントであり、前記少なくとも１つの発生セグメントの各々が配列長を有しているような同定工程と、
少なくとも１つの可能性のある（feasible）遺伝子位置を同定する工程で、この可能性のある遺伝子位置の各々が、あらかじめ定義された遺伝子長の配列長を超えない配列長を有する前記少なくとも１つの発生セグメントの１つであるような同定工程とを包含してなる遺伝子の転写物マッピング方法を提供する。
【００１３】
本発明はその第２の態様において、遺伝子の転写物マッピングシステムであって、
遺伝子の転写物から５’末端タグと３’末端タグを取得する手段と、
ゲノム配列の少なくとも一部に対し前記５’末端タグをマッチングさせる手段で、これによりそこから少なくとも１つの５’部位を同定し、この少なくとも１つの５’部位の各々が前記５’末端タグにマッチングする配列を有しているようなマッチング手段と、
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し前記３’末端タグをマッチングさせる手段で、これによりそこから少なくとも１つの３’部位を同定し、この少なくとも１つの３’部位の各々が前記３’末端タグにマッチングする配列を有しているようなマッチング手段と、
少なくとも１つの発生セグメントを同定する手段で、ここで少なくとも１つの発生セグメントの各々が前記少なくとも１つの５’部位の１つから前記少なくとも１つの３’部位の１つへと延伸するゲノム配列に沿った配列セグメントであり、前記少なくとも１つの発生セグメントの各々が配列長を有しているような同定手段と、
少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する手段で、この可能性のある遺伝子位置の各々が、あらかじめ定義された遺伝子長の配列長を超えない配列長を有する前記少なくとも１つの発生セグメントの１つであるような同定手段とを包含してなる遺伝子の転写物マッピングシステムを提供する。
【００１４】
本発明はその第３の態様において、遺伝子の転写物マッピング方法であって、
遺伝子の転写物から５’末端タグと３’末端タグを取得する工程と、
ゲノム配列の少なくとも一部に対し前記５’末端タグをマッチングさせる工程で、これによりそこから少なくとも１つの５’部位を同定し、この少なくとも１つの５’部位の各々が前記５’末端タグにマッチングする配列を有しているようなマッチング工程と、
前記ゲノム配列の少なくとも一部に対し前記３’末端タグをマッチングさせる工程で、これによりそこから少なくとも１つの３’部位を同定し、この少なくとも１つの３’部位の各々が前記３’末端タグにマッチングする配列を有しているようなマッチング工程と、
少なくとも１つの発生セグメントを同定する工程で、ここで少なくとも１つの発生セグメントの各々が前記少なくとも１つの５’部位の１つから前記少なくとも１つの３’部位の１つへと延伸するゲノム配列に沿った配列セグメントであり、前記少なくとも１つの発生セグメントの各々が配列長を有しているような同定工程と、
前記少なくとも１つの発生セグメントから少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置を同定する工程で、この少なくとも１つの可能性のある遺伝子位置の各々が前記少なくとも１つの発生セグメントの１つであり、その配列長の少なくとも１つはあらかじめ定義した遺伝子長の配列長を超えないようになっており、前記少なくとも１つの発生セグメントと前記少なくとも１つの５’部位の１つとそれに対応する前記少なくとも１つの３’部位の１つとの配列順序を、５’−発生セグメント−３’構造に従い、ゲノム配列の対応する部分の配列順序とマッチングさせ、５’部位と少なくとも１つの５’部位の１つとこれに対応する少なくとも１つの３’部位の１つとが５’−３’方向性を有し、前記発生セグメントの各々に対応する少なくとも１つの５’部位の１つと少なくとも１つの３’部位の１つとが同じ染色体の中に位置しているようにする同定工程とを包含している遺伝子の転写物マッピング方法を提供する。
【００１５】
以下において、添付図面を参照しながら本発明の実施態様について説明する。図１はゲノム注釈に用いるための５’と３’末端タグＳＡＧＥ技法の概略図である。図２は本発明の実施態様による転写物マッピング方法のプロセス流れ図である。図３は図２の転写物マッピング方法に適用するためのＧＩＳ結合タグの概略図である。図４はゲノム配列から５’部位と３’部位を前進及び後退しながらサーチするための図２の転写物マッピング方法の疑似コード「部位発見」のコード表である。図５は発生セグメントの配列長を同定するための図２の転写物マッピング方法の疑似コード「マッチ部位１」を表し、ここでの配列長は続いて、そこから可能性のある遺伝子位置を同定するためのあらかじめ定義された長さと比較される。図６はそこから可能性のある遺伝子位置が続けて得られる状態に合致しないときに、発生セグメントを同定するための図２の転写物マッピング方法の疑似コード「マッチ部位２」を表している。
【００１６】
前述した問題点を解決するための転写物マッピング方法について以下に説明する。完全なゲノム注釈は、転写物開始部位（ＴＩＳ）とポリアデニレーション（polyadenylation ）部位とによって境界付けられた転写物ユニットの正確な同定に依存している。これを容易にするため、１対の補足的方法、すなわち５’ＬｏｎｇＳＡＧＥ（long serial analysis of gene expression ）と３’ＬｏｎｇＳＡＧＥが発展してきた。これらの方法は、最初のＳＡＧＥとＬｏｎｇＳＡＧＥを基礎としており、これらは代表的な完全長ｃＤＮＡクローン技法を利用して、各転写物の最初と最後の２０塩基対（ｂｐ）を高いスループットで抽出させることを可能にしている。５’と３’のＬｏｎｇＳＡＧＥタグをゲノムにマッピングすることは、ＴＩＳ及びＰＡＳの局所限定を許容する。
【００１７】
しかしながら、ゲノム配列における同じ転写物から抽出された５’と３’タグのマッチングは、常に率直なものとはいえず、しばしば非常にあいまいなものとなる。１つの解決法として、５’と３’のタグをインターリンクさせることにより、同じ転写物の５’と３’のタグをクローン化することである。これを達成するため、クローンアダプタとベクターからなる特別に設計されたデバイスが、同じ転写物から抽出された５’タグと３’タグとをリンクさせて結合タグにすることができる。
【００１８】
多数の結合タグを線状につないでクローン化し配列化することができ、各結合タグは個別の転写物を表現する。シングルタグの配列とは異なり、対にされた結合タグ配列は特別に複合化することもでき、転写物のフレーム（位相）はゲノム配列にマッピングされたときに正確に定義可能となる。このアプローチは、すなわちＧＩＳ分析であり、図１に示すように、遺伝子によって符号化された転写物ユニットの５’と３’の端部を正確にマッピングする。
【００１９】
ＧＩＳ分析において、従来のキャップトラッパー（cap-trapper ）方法は、完全長ｃＤＮＡと、ｃＤＮＡ断片の各端部にあるＭｍｅＩ（タイプＩＩ制限酵素）制限部位を負担する合体したアダプタ配列とを濃厚化するために適用される。それから、ｃＤＮＡ断片はクローンベクター内でＧＩＳ完全長ｃＤＮＡライブラリを構成するようにクローン化される。そのライブラリから準備されたプラスミド（plasmid ）はＭｍｅＩによって軟化させられ、その結合部位の下流側で２０ｂｐに裂かれる。
【００２０】
軟化の後、ライブラリの完全長ｃＤＮＡ挿入物はプラスミドから落下し、学習したクローンベクターが付いた状態で、１８ｂｐの５’と３’端部のサインを残す。ベクターを再度円形にすることにより、ＧＩＳ単独の結合タグライブラリを創造することができよう。それからライブラリの結合タグは薄く切り出され線状にするために純粋化され、配列分析のための最終的なＧＩＳ結合タグライブラリを生成するためにクローン化される。代表的には、ＧＩＳ結合タグクローンの各配列読みは１５の結合タグを明らかにする。結合タグ配列の各ユニットは、５’サインの１８ｂｐと３’サインの１８ｂｐと一方の結合タグ配列を他方から分離するための１２ｂｐのスペーサとを備える。
【００２１】
ゲノムに対する結合タグのマッピングは、ゲノム配列におけるあるパターンの発生を検索することと類似している。パターン検索のためのアプローチは従来のＢＬＡＳＴやＢＬＡＴの方法を包含する。ＢＬＡＳＴやＢＬＡＴの方法は、それぞれ検索すべきパターンをゲノム全体にわたってスキャンしなければならないため、非常に遅い。さらに、小さなミスマッチのマージンをも含めてパターンの正確な発生を必要とするならば、従来のフルテキストインデックスを常に用いなければならない。効率的なフルテキストのインデックス付きデータ構造は添字ツリー（suffix tree ）と添字列（suffix array）を含む。
【００２２】
添字ツリーはツリー状データ構造であり、根から延伸する枝を有し、各枝はゲノム配列の添字を符号化する葉で終端している。添字列は辞書編集上の順序に従ってゲノムの全ての添字が分類された配列である。添字列は例えば列ＳＡ［ｉ］ここでｉ＝１．．．ｎ、列ＳＡ［ｉ］＝ｊでｊの添字（文字ｊから開始する添字）が辞書編集上の順序でｉ番目の最も小さな添字であるような列などである。
【００２３】
添字ツリーも添字列も共に迅速なパターン検索を可能とする。長さｘのパターンが与えられたとき、ゲノムＧ［１．．．ｎ］におけるその発生は、それぞれ添字ツリーにおけるＯ（ｘ）時間と添字列におけるＯ（ｘ  ｌｏｇ  ｎ）時間で報告される。質問の時間は短いとしても、添字ツリーや添字列は、大きなスペースを必要とするから、常に構築が可能とは限らない。例えば、マウスゲノムでは、添字ツリーと添字列にはそれぞれ４０ＧＢ（ギガバイト）と１３ＧＢとを必要とする。そのようなメモリー要求は通常のコンピュータのメモリースペース容量をはるかに超過している。
【００２４】
このメモリースペース問題を解決するため、本発明者等はデータ構造にインデックスを付してスペース効率を高めた圧縮された添字列ＣＳＡ（compressed suffix array ）を適用する。ＣＳＡは添字列の圧縮されたフォームである。それは巨大なメモリーを必要とすることなく、公知のアルゴリズムを用いて有効に構築することができる。また、構築されたＣＳＡは非常に小さい。例えば、マウスゲノム（ｍｍ３）のためのＣＳＡは約１．３ＧＢを占有する。加えて、ＣＳＡは検索効率を高めることもできる。長さｘのパターンの検索に要するのはＯ（ｘ  ｌｏｇ  ｎ）時間だけである。
【００２５】
図２を参照しながら、本発明の第１の実施態様である転写物マッピング方法２０について説明する。図２は転写物マッピング方法１００のプロセス流れ図を表している。この転写物マッピング方法１００は、遺伝子から得られた転写物に対して適用するものである。転写物マッピング方法１００は、コンピュータをベースとしたシステムによって構築されることが望ましい。転写物マッピング方法１００の第１ステップ１１０において、５’末端タグ２４と３’末端タグ２６が転写物から得られる。
【００２６】
図３に示すように、５’末端タグ２４と３’末端タグ２６は上述したようにしてＧＩＳ結合タグ３０を形成する。ＧＩＳ結合タグ３０は３６ｂｐの結合タグ長３２を有し、５’末端タグ２４から誘導された１８ｂｐのヌクレオチド（nucleotide）配列と３’末端タグ２６から誘導された１８ｂｐのヌクレオチド配列とを備えている。分子クローン化の過程での酵素の変化により、ＧＩＳ結合タグ３０の結合タグ長３２は３４ｂｐから３８ｂｐまで変化することがある。
【００２７】
変化はしばしば５’末端タグ２４と３’末端タグ２６の端部近くで発生するが、内部のヌクレオチドは構造的に保持されたままである。３’末端タグ２６では、２つの残存ヌクレオチド３４（ＡＡ）が、そこからポリ（Ａ）尾部を除去するまでの間、保持されている。ＡＡ残存ヌクレオチド３４は、その後、方向指示器として利用される。従って、ＧＩＳ結合タグ３０における３’末端タグ２６の１６ｂｐだけが、ゲノム配列３６へのマッピングのために利用される。
【００２８】
ステップ１１０に続き、５’末端タグ２４と３’末端タグ２６の各々は、ステップ１１２でゲノム配列にマッチさせられる。ステップ１１２において、５’部位３８と３’部位４０とは、５’末端タグ２４と３’末端タグ２６とがそれぞれゲノム配列３６にマッチした時に同定（identify）される。５’部位３８の各々と３’部位４０の各々は、それぞれが５’末端タグ２４と３’末端タグ２６に概ね合致する配列を有するゲノム配列３６の一部である。
【００２９】
ステップ１１４において、ゲノム配列３６から少なくとも１つの発生（occurring ）セグメント４２が同定される。少なくとも１つの発生セグメント４２の各々は、１つの５’部位３８と１つの３’部位４０との間に位置するゲノム配列に沿った配列セグメントである。少なくとも１つの発生セグメント４２の各々は配列長４４を有する。
【００３０】
転写物（Ｒ）のためにＧＩＳ結合タグ３０（Ｐ）が与えられると、ゲノム配列３６（Ｇ）内の位置（Ｒ）を計算する問題が転写物位置同定問題として追求される。従って、Ｇ［１．．．ｎ］及びＰ［１．．．ｎ］が与えられると、発生セグメント４２は以下の場合にＰの可能性のある遺伝子位置として同定される、すなわち、
（１）シーケンス長４４（ｊ−ｉ）があらかじめ定義されていた遺伝子長（maxlength ）よりも小さい。この遺伝子長は代表的には公知の遺伝子についての長さが百万ｂｐよりも小さい。
（２）５’末端タグ２４と３’末端タグ２６はそれぞれあらかじめ定義されていたminlength5とminlength3よりも大きい（minlength5は１６ｂｐ、minlength3は１４ｂｐ）。
（３）Ｒの５’末端タグ２４と３’末端タグ２６はそれぞれＰ［１．．．boundary5 ］のサブストリング及びＰ［boundary3 ．．．ｍ］のサブストリングである（ここでboundary5 は１９、boundary3 は１８）。
【００３１】
ゲノム配列３６は好適には圧縮された添字列（ＣＳＡ）を用いてインデックスが付される。５’末端タグ２４と３’末端タグ２６は、好適には圧縮された添字列に二進数（binary）検索を適用してゲノム配列にマッチさせられる。５’末端タグ２４と３’末端タグ２６をマッチさせるための二進数検索は２つの補助定理（lemma ）に依存しており、第１の補助定理は圧縮添字列上の前進検索であり、第２の補助定理は圧縮添字列上の後退検索である。
【００３２】
補助定理１（前進検索）：ある塩基ｃ∈｛アデニン（Ａ），シトシン（Ｃ），グアニン（Ｇ），チミン（Ｔ）｝に対し、ゲノムＧ［１．．．ｎ］及びＧにおけるパターンＱの発生のセットが与えられたならば、パターンＱｃの発生のセットはＯ（ｌｏｇ  ｎ）時間で得られる。前進二進数検索は、通常の二進数検索アルゴリズムを修正することで達成できる。すなわち、圧縮添字列内の値、及び二進数検索でのパターンＱと比較したときにゲノム配列３６内の添字のための明確なテキストの代わりとしての添字列の値を用いて達成することができる。
【００３３】
補助定理２（後退検索）：ある塩基ｃ∈｛Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ｝に対し、ゲノムＧ［１．．．ｎ］及びＧにおけるパターンＱの発生のセットが与えられたならば、パターンｃＱの発生のセットはＯ（ｌｏｇ  ｎ）時間で得られる。
【００３４】
図４には、前進検索及び後退検索の両方を行うための疑似コード「部位発見」のコード表を示している。図２のステップ１１４で前進検索と後退検索の両方を交互に行う代わりに、代替的アプローチとして補助定理１を使った前進検索だけ、あるいは補助定理２を使った後退検索だけを、ゲノム配列３６に対して実行して少なくとも１つの発生セグメント４２を同定するようにすることもできる。
【００３５】
ＧＩＳ結合タグ３０は、ゲノム配列３６においてセンス側（in sense）なのかアンチセンス側なのかという問題が起こるかもしれない。この問題を解決するために、センスゲノム配列とアンチセンスゲノム配列のそれぞれのためにインデックスが作られる。２つの独立したインデックス列を作る代わりに、アンチセンス側のＧＩＳ結合タグが作られる。ステップ１１０において、５’末端タグ２４と３’末端タグ２６のそれぞれのために添字列が２回検索され、第１回目はセンスＧＩＳ結合タグ３０を用いて検索し、第２回目はアンチセンスＧＩＳ結合タグ（図示なし）を用いて検索する。
【００３６】
加えて、ゲノム配列３６は染色体内へと自然に分割されている。このことは、各染色体の配列セグメントのために圧縮添字列が作られることを可能にしている。そうすることにより、５’部位３８及び３’部位４０は、完全なゲノム配列３６の代わりに特定の染色体のために取得可能となる。
【００３７】
圧縮添字列、添字列、添字ツリー、二進数又は同様のもの以外でも、インデックス付きデータ構造を使って、上述したような方法で、ゲノム配列３６にインデックスを付けることができる。
【００３８】
ステップ１１４に続いて、５’部位３８及び３’部位４０は、可能性のある遺伝子位置を同定するための一連のチェックを受ける。このチェックは長さ、局地性、方向性及び順序などのチェックからなる。
【００３９】
図２のステップ１１６において、長さチェックは、少なくとも１つの発生セグメント４２の各々の配列長４４をステップ１１６でのあらかじめ定義された遺伝子長と比較することにより実行される。最初に５’部位３８及び３’部位４０が、好適には昇順で分類される。次に、予め定義された遺伝子長（maxlength ）の配列長を超えない配列長４４を有する少なくとも１つの発生セグメント４２の各々が、ポテンシャルと可能性のある（feasible）遺伝子位置として同定される。図５にはステップ１１６に対する疑似コード「マッチ部位１」が示されている。
【００４０】
図２のステップ１１８において、局地性チェックは、少なくとも１つの発生セグメント４２に対応する５’部位３８及び３’部位４０が分析され、それら各々のどの染色体が内部に位置するかを同定するための分析がなされる。発生セグメント４２は、その５’部位３８及び３’部位４０が同じ染色体に属するときだけ、ポテンシャルと可能性のある遺伝子位置を同定する。
【００４１】
図２のステップ１２０において、方向性チェックは、少なくとも１つの発生セグメント４２に対応する５’部位３８及び３’部位４０の方向を同定することによって達成される。５’部位３８及び３’部位４０の方向は、残存ヌクレオチド３４の位置を決めることにより同定される。好適には、５’部位３８及び３’部位４０は、ポテンシャルと可能性のある遺伝子位置を同定するために、その発生セグメント４２のための５’−３’方向を持たなければならない。
【００４２】
図２のステップ１２２において、順序チェックは、発生セグメント４２とそれに対応する５’部位３８及び３’部位４０の各々をゲノム配列３６と比較することによって達成される。好適には、発生セグメント４２とそれに対応する５’部位３８及び３’部位４０の各々の順序は、ポテンシャルと可能性のある部位とするために、５’−発生セグメント−３’に従わなければならない。
【００４３】
転写物マッピング方法による図２のステップ１１６−１２２は、それらを連結して実行することもできるし、単独で実行することもできる。
【００４４】
可能性のある遺伝子位置がＧＩＳ結合タグ３０から発見されなかったような場合は、ステップ１１２において、ゲノム配列３６に３’末端タグをマッチさせるときに少なくとも１つのミスマッチを許容するなどの方法で制限を緩和することができる。
【００４５】
他の方法として、図２のステップ１１２で５’部位３８と３’部位４０がゲノム配列３６にマッチさせられる前に、５’部位３８の量（quantity）と３’部位４０の量が最初に取得される。このことは、５’部位３８と３’部位４０の間の量の不一致、例えば５’部位３８が１０未満で３’部位４０が１万以上あったりその逆であったりするような場合に、そのような不一致を同定することを可能にする。
【００４６】
５’部位３８の量と３’部位４０の量との間に大きな不一致が存在した場合、本発明による転写物マッピング方法は、ゲノム配列３６に余分なマッピングを多数回反復することになる。そこで大きな量の不一致が発生したときは、転写物マッピング方法１００に修正したアプローチが必要になる。量の不一致を同定するために、不一致の条件を次式で検出する。
（１／threshold5，3）≧（count5／count3）≧  threshold5，3
【００４７】
ここで、count5は５’部位３８の量、count3は３’部位４０の量、threshold5，3はあらかじめ定義されたしきい値で、例えばしきい値threshold5，3＝１００００で、count5とcount3の間の量的な不一致を限定するものである。ＣＳＡ（圧縮添字列）は、５’部位３８あるいは３’部位４０の両方を計数することなしに、count5とcount3の両方を取得することを可能にする。
【００４８】
図６に示す疑似コード「マッチ部位２」に記述される方法は、上述した不一致が生じた場合に適用される。疑似コード「マッチ部位２」において、ゲノム配列３６にマッピングするために必要な反復数はcount5とcount3のうちの小さな方で定められる。例えば、５’部位３８が２つだけならば、対応する３’部位４０を取得するためにゲノム配列に沿ってマッピングあるいは横断を行う場合は２回反復するだけでよいことになる。すなわち、そこから発生セグメント４２を取得するために、５’部位３８の各々について１回だけマッピングや横断を行えばよい。
【００４９】
しかしながら、上述した不一致条件が発生しなければ、count5とcount3の間の量的不一致は大きくないことになり、転写物マッピング方法は、発生セグメント４２を取得するための上述した「マッチ部位１」の方法へと立ち帰ることになる。
【００５０】
上述した内容において、従来のマッピング方法の前述した欠点を解決するための本発明の１つの実施態様による転写物マッピング方法について説明してきた。本発明について１つの実施態様しか説明しなかったけれども、この分野の技術者であれば、本発明の範囲と精神から離れることなく多くの変形や修正を加えることが可能であることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ゲノム注釈に用いるための５’と３’末端タグＳＡＧＥ技法の概略図である。
【図２】本発明の実施態様による転写物マッピング方法のプロセス流れ図である。
【図３】図２の転写物マッピング方法に適用するためのＧＩＳ結合タグの概略図である。
【図４】ゲノム配列から５’部位と３’部位を前進及び後退しながらサーチするための疑似コード「部位発見」のコード表である。
【図５】発生セグメントの配列長を同定するための疑似コード「マッチ部位１」のコード表である。
【図６】発生セグメントを同定するための疑似コード「マッチ部位２」のコード表である。
【符号の説明】
【００５２】
２４  ５’末端タグ
２６  ３’末端タグ
３０  結合タグ
３２  結合タグ長
３４  残存ヌクレオチド
３６  ゲノム配列
３８  ５’部位
４０  ３’部位
４２  セグメント
４４  配列長
【図１】
2006075162.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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