(57)【要約】【課題】  微量な標的物質であっても迅速且つ効率よく分離・精製する。【解決手段】独立分散している粒子サイズ１ｎｍ以上５０ｎｍ以下の磁性体ナノ粒子、好ましくは下記一般式（Ｉ）で表される表面修飾剤で表面修飾された磁性体ナノ粒子を含有する試料液中で、媒質として存在する塩の種類及びその濃度あるいはｐＨを変化させることによって、前記磁性体ナノ粒子を分散又は凝集する。  一般式（Ｉ）    Ｒ1Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｌ−Ｘ［Ｒ1は、炭素鎖長１以上２０以下のアルキル基を表す；Ｌは、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、分岐鎖を有していてよい炭素鎖長１以上４以下のアルキレン基を表す；Ｘはカルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基又はホウ酸基を表す；ｎは、１以上１０以下の整数を表す。］【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
独立分散している粒子サイズ１ｎｍ以上５０ｎｍ以下の磁性体ナノ粒子を含有する試料液中で、媒質として存在する塩の種類、その濃度及び試料液のｐＨの少なくとも１つを変化させることによって、前記磁性体ナノ粒子の分散と凝集を制御する磁性体ナノ粒子の分散・凝集制御方法。
【請求項２】
前記磁性体ナノ粒子が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物によって表面修飾されていることを特徴とする請求項１記載の分散・凝集制御方法。
一般式（Ｉ）
Ｒ1Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｌ−Ｘ
［Ｒ1は、炭素鎖長１以上２０以下のアルキル基あるいはアルケニル基、無置換又は炭素鎖長１０以下のアルキル基若しくはアルコキシル基で置換されたフェニル基を表す；Ｌは、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、分岐鎖を有していてよい炭素鎖長１以上４以下のアルキレン基を表す；Ｘは、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基又はホウ酸基を表す；ｎは、１以上１０以下の整数を表す。］
【請求項３】
前記塩が、多価カチオン及び多価アニオンの塩の少なくとも一方である請求項１又は２に記載の分散・凝集制御方法。
【請求項４】
前記式中Ｘがカルボン酸基であり、このとき、凝集条件をｐＨ５未満とし、分散条件をｐＨ５以上とする請求項２記載の分散・凝集制御方法。
【請求項５】
前記磁性体ナノ粒子が酸化鉄又はフェライトである請求項１記載の分散・凝集制御方法。
【請求項６】
独立分散している粒子サイズ１ｎｍ以上５０ｎｍ以下の磁性体ナノ粒子を含有する試料液中で、媒質として存在する塩の種類、その濃度及び試料液のｐＨの少なくとも１つを変化させて、前記磁性体ナノ粒子を凝集させること、
凝集させた磁性体ナノ粒子を、外部磁場に付して捕集すること、
を特徴とする磁性体ナノ粒子の捕集方法。
【請求項７】
表面にカルボン酸を有し且つ独立分散している粒子サイズ１nm以上５０nm以下の磁性体ナノ粒子を含有する試料液中で、試料液のｐＨを５未満に変化させることによって、該磁性体ナノ粒子を凝集させること、
凝集させた磁性体ナノ粒子を、外部磁場に付して捕集すること
を含む請求項６記載の捕集方法。
【請求項８】
捕集した磁性体ナノ粒子を分離・精製すること、
分離・精製した磁性体ナノ粒子を、溶液のｐＨを５以上に変化させることによって、該溶液中で再分散させること、
を含む請求項７記載の捕集方法。
【請求項９】
前記磁性体ナノ粒子が、試料液中の標的物質に対して親和性を有する化合物を表面に有していることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項記載の捕集方法。
【請求項１０】
表面にカルボン酸を有し且つ独立分散している粒子サイズ１nm以上５０nm以下の磁性体ナノ粒子を含有する試料液中で、試料液のｐＨを５未満に変化させることによって該磁性体ナノ粒子を凝集させること、
を含む磁性体ナノ粒子含有液の処理方法。
【請求項１１】
前記凝集している磁性体ナノ粒子を含む試料液中で、試料液のｐＨを５以上に変化させることによって、該磁性体ナノ粒子を再分散させること、
を更に含む請求項１０記載の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性体ナノ粒子の凝集・分散制御方法、磁性体ナノ粒子の捕集方法及び磁性体ナノ粒子含有液の処理方法に関し、特に、水溶液中の磁性体ナノ粒子の凝集・分散制御方法及び磁性体ナノ粒子の捕集方法、並びにこのような磁性体ナノ粒子含有液を処理する処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、標的物質を効率よく収集する手段として、磁性体粒子が提案されている。磁性体粒子は外部磁場を使用することによって簡便に且つ効率よく集めることができるため、生体物質などの検出方法、診断方法に精度よい検出手段として用いられている（例えば、非特許文献１）。
しかしながら、用いられる磁性体粒子の粒子径が大きいと磁石への応答性はよくなるが、標的物質の吸着量や分析感度が充分でなく、粒子径を数十ｎｍ以下に小さくすると磁石への応答性が劣り、精度よく分析することが困難になる。
このため、ナノクラスの磁性体ナノ粒子であっても外部磁場に確実に反応させて、試料中の微量な標的物質でも確実に精度よく分析できるように、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）や上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を有する高分子を利用して、磁性体ナノ粒子同士を凝集させることが提案されている（例えば、非特許文献２及び特許文献１〜３）。
【非特許文献１】Bio Industry, 2004 Vol.21, No.8, pp.39-47
【非特許文献２】Bio Industry, 2004 Vol.21, No.8, pp.31-38
【特許文献１】国際公開第０２／１６５７１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／１６５２８号パンフレット
【特許文献３】特開２００２−６０４３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、凝集工程において上記の熱刺激応答性高分子等を用いた場合には、ウイルス等の標的物質とポリマー鎖との非特異的相互作用によって、分離精製効率の低下等の問題を生ずる可能性があった。
【０００４】
従って、本発明の目的は、微量な標的物質であっても迅速且つ効率よく分離・精製することができる磁性体ナノ粒子の凝集・分散制御方法、磁性体ナノ粒子の捕集方法及び磁性体ナノ粒子含有液の処理方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の磁性体ナノ粒子の凝集・分散制御方法は、独立分散している粒子サイズ１ｎｍ以上５０ｎｍ以下の磁性体ナノ粒子を含有する試料液中で、媒質として存在する塩の種類、その濃度及び試料液のｐＨの少なくとも１つを変化させることによって、前記磁性体ナノ粒子の分散と凝集を制御することを特徴としている。
また、本発明の磁性体ナノ粒子の捕集方法は、独立分散している粒子サイズ１ｎｍ以上５０ｎｍ以下の磁性体ナノ粒子を含有する試料液中で、媒質として存在する塩の種類、その濃度及び試料液のｐＨの少なくとも１つを変化させて、前記磁性体ナノ粒子を凝集させること、凝集させた磁性体ナノ粒子を、外部磁場に付して捕集すること、を特徴としている。
【０００６】
更に本発明の磁性体ナノ粒子含有液の処理方法は、表面にカルボン酸を有し且つ独立分散している粒子サイズ１nm以上５０nm以下の磁性体ナノ粒子を含有する試料液中で、試料液のｐＨを５未満に変化させることによって該磁性体ナノ粒子を凝集させること、を含むことを特徴としている。
このとき、前記凝集している磁性体ナノ粒子を含む試料液中で、試料液のｐＨを５以上に変化させることによって、該磁性体ナノ粒子を再分散させること、を更に含んでもよい。
【０００７】
ここで、前記磁性体ナノ粒子が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物によって表面修飾されていることが好ましい。
一般式（Ｉ）
Ｒ1Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｌ−Ｘ
［Ｒ1は、炭素鎖長１以上２０以下のアルキル基あるいはアルケニル基、無置換又は炭素鎖長１０以下のアルキル基若しくはアルコキシル基で置換されたフェニル基を表す；Ｌは、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、分岐鎖を有していてよい炭素鎖長１以上４以下のアルキレン基を表す；Ｘは、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基又はホウ酸基を表す；ｎは、１以上１０以下の整数を表す。］
また、前記磁性体ナノ粒子が、酸化鉄またはフェライトであることが好ましい。
【０００８】
本発明では、試料液中の塩の種類、濃度及び試料液のｐＨの少なくとも１つの変化に応じて磁性体ナノ粒子の挙動を変化させるので、磁性体ナノ粒子の凝集・分散を容易に制御することができ、外部磁場を用いた捕集を精度よく確実且つ容易に行うことができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、試料中の微量な標的物質であっても迅速且つ効率よく分離・精製することができる磁性体ナノ粒子の凝集・分散制御方法、磁性体ナノ粒子の捕集方法及び磁性体ナノ粒子含有液の処理方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の磁性体ナノ粒子の凝集・分散制御方法は、独立分散している粒子サイズ１ｎｍ以上５０ｎｍ以下の磁性体ナノ粒子を含有する試料液中で、媒質として存在する塩の種類、その濃度及び試料液のｐＨの少なくとも１つを変化させることによって、前記磁性体ナノ粒子の分散と凝集を制御するものである。
【００１１】
［１］磁性体ナノ粒子
本発明における磁性体ナノ粒子は、平均粒子径が１〜５０ｎｍの磁性を有するナノ粒子である。平均粒子径が１ｎｍ以上であるので安定可能に作製可能であり、５０ｎｍ以下であるので、例えば細胞内の物質を標的とした場合であっても細胞内まで侵入して標的物質を捉えることができる。また、磁性体ナノ粒子の表面が大きいため反応効率が高く、極微量の標的物質も迅速に捕集することができる。磁性体ナノ粒子の平均粒子径は、結晶の安定性および磁力応答性の観点から３〜５０ｎｍが好ましく、５〜４０ｎｍが特に好ましい。
【００１２】
このような磁性体ナノ粒子は、例えば特表２００２−５１７０８５号等に記載された方法に従って製造することができる。例えば鉄（II）化合物、または鉄（II）化合物および金属（II）化合物を含有する水溶液を、磁性酸化物の形成のために必要な酸化状態下に置き、溶液のｐＨを７以上の範囲に維持して、酸化鉄またはフェライト磁性体ナノ粒子を形成することができる。また、金属（II）化合物含有の水溶液と鉄（III）含有の水溶液をアルカリ性条件下で混合することによっても、本発明の磁性体ナノ粒子を得ることができる。さらに、バイオカタリシス（Biocatalysis）１９９１年、第５巻、６１〜６９頁に記載の方法を用いることもできる。
【００１３】
本発明では好ましい磁性体ナノ粒子は、金属酸化物、特に、酸化鉄およびフェライト（Ｆｅ，Ｍ）3Ｏ4からなる群から選択されるものである。ここで酸化鉄には、とりわけマグネタイト、マグヘマイト、またはそれらの混合物が含まれる。また、表面と内部が異なるコアシェル型構造であっても良い。前記式中Ｍは、該鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成することのできる金属イオンであり、典型的には遷移金属の中から選択され、最も好ましくはＺｎ2+、Ｃｏ2+、Ｍｎ2+、Ｃｕ2+、Ｎｉ2+、Ｍｇ2+などであり、Ｍ／Ｆｅのモル比は選択されるフェライトの化学量論的な組成に従って決定される。金属塩は固形でまたは溶液状で供給されるが、塩化物塩、臭化物塩、または硫酸塩であることが好ましい。
このうち、安全性の観点から酸化鉄が好ましい。
【００１４】
例えばマグネタイトを形成するためには、溶液中に鉄が２種類の異なる酸化状態、Ｆｅ2+およびＦｅ3+で存在することが好ましい。２つの酸化状態は、鉄（II）塩および鉄（III）塩の混合物を、好ましくは所望の磁性酸化物の組成に対してＦｅ（II）塩をＦｅ（III）塩より少し多いモル量で添加すること、または鉄（II）塩もしくは鉄（III）塩を添加して、必要に応じてＦｅ2+またはＦｅ3+の一部を他方の酸化状態に、好ましくは酸化または場合により還元によって変換することにより、溶液中に存在できるようになる。
【００１５】
この磁性金属酸化物は、３０℃から１００℃の温度、好ましくは５０℃から９０℃の間の温度で熟成することが好ましい。
磁性金属酸化物を形成するために各種の金属イオン間の相互作用を起こさせるには溶液のｐＨが７以上である必要がある。ｐＨは、適切なバッファー溶液を最初の金属塩の添加時の水溶液として用いるか、または必要な酸化状態にした後に溶液に塩基を添加することによって所望の範囲に維持される。ひとたびｐＨ値としてその７以上の範囲にある特定の値を選択した後は、最終産物の大きさの分布が実質的に均一となることを確保するために、そのｐＨ値を磁性ナノ粒子の調製工程の全体にわたって維持することが好ましい。
【００１６】
また磁性ナノ粒子の粒子サイズを制御する目的で、追加の金属塩を溶液に添加する工程を設けてもよい。この場合、次の２つの異なる操作様式にて行うことができる。１つの操作様式は段階的増加によるもので、以後段階的様式の操作と呼ぶが、その操作様式では各成分（金属塩、酸化剤および塩基）を数回に分けて、好ましくは毎回等量で、定めた順序で溶液に連続的に添加し、それらの工程を所望のナノ粒子のサイズが得られるまで必要な回数繰り返し、その各回の添加量は溶液中（すなわち粒子の表面上以外）での金属イオンの重合を実質的に避けることのできる量とする。
他方は、連続した操作様式であり、各成分（金属塩、酸化剤、および塩基を定められた順序で、粒子表面以外の部位での金属イオンの重合を避けるために各成分毎に実質的に均一な流速で、連続的に溶液中に添加する。この段階的又は連続的操作様式を用いることによって、大きさの分布が狭い粒子を形成することができる。
【００１７】
［２］表面修飾剤
本発明に係る表面修飾剤は、親水性の官能基を有する化合物であればよく、下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることが特に好ましい。
一般式（Ｉ）
Ｒ1Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｌ−Ｘ
【００１８】
式中Ｒ1は、疎水性基であって、炭素鎖長１以上２０以下のアルキル基あるいはアルケニル基、無置換又は炭素鎖長１０以下のアルキル基若しくはアルコキシル基で置換されたフェニル基を表し、水系媒体中での分散安定性の観点から好ましくは炭素鎖長が５以上２０以下のアルキル基を挙げることができる。
【００１９】
式中Ｌは、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、炭素鎖長１以上４以下のアルキレン基を表し、分散安定性の観点から好ましくは炭素鎖長１以上２以下のアルキレン基を表す。このアルキレン基は分岐鎖を有していてよく、分岐鎖としてはメチル基を挙げることができる。
【００２０】
式中Ｘは、酸基であって、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基又はホウ酸基を表し、多種の分子との結合が容易なカルボン酸基が好ましい。また、これらの酸基は有機・無機カチオンと塩を形成していても良い。
式中ｎは、１以上１０以下の整数、分散安定性の観点から好ましくは１以上６以下の整数である。
【００２１】
このような本発明にかかる表面修飾剤としては、以下のものを挙げることができる。
【００２２】
【化１】
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【００２３】
【化２】
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【００２４】
このうち、標的物質に対して親和性を有する化合物を結合させやすい観点から本発明における表面修飾剤として特に好ましいのは、（１）〜（７）である。
【００２５】
本発明に係る一般式（Ｉ）の表面修飾剤は、磁性体ナノ粒子の表面に、標的物質に対して親和性を有する化合物（以下、連結体という）と結合可能な官能基を多数配置することができる。この磁性体ナノ粒子表面に配置される官能基の密度（従って表面修飾剤の添加量）は、標的物質および磁性体ナノ粒子の種類やサイズによって異なる。粒子表面に結合している表面修飾剤の量は、化学分析によって確認することができ、当業者であれば、適切な分析法を容易に選択することができる。
【００２６】
本発明に使用する表面修飾剤は、磁性体ナノ粒子の表面に対して高濃度に表面修飾剤を有することができるが、全体としての表面修飾剤の量が充分であれば、磁性体ナノ粒子全体を被覆していても、その一部に結合していてもよい。また、本発明において表面修飾剤は、単独で用いても複数併用してもよい。
【００２７】
また本発明においては、上記表面修飾剤に加えて、公知の表面修飾剤（例えば、ポリエチレングリコール、トリオクチルホスフィン、トリオクチルホスフィンオキシド、ポリリン酸ナトリウム、ビス（２−エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウムなど）がナノ粒子合成時、あるいは合成後共存させてもよい。
【００２８】
本発明に係る表面修飾剤の添加量は、磁性体ナノ粒子の粒子サイズ、粒子の濃度、表面修飾剤の種類（大きさ、構造）、標的物質の種類やサイズ等により変動するが、磁性体ナノ粒子に対し、好ましくは０．００１〜１０倍モル、さらに好ましくは０．０１〜２倍モルである。
本発明においては、一般式（Ｉ）で表される本発明の表面修飾剤以外に、前述のように公知の表面修飾剤を併用することができる。公知の表面修飾剤の添加量は特に制限はないが、好ましくは０．０１〜１００倍モル、さらに好ましくは０．０５〜１０倍モルである。
【００２９】
本発明に係る表面修飾剤は、磁性体ナノ粒子の合成時に添加することも、合成後に添加することもでき、該磁性体ナノ粒子と結合して、ナノ粒子の表面の少なくとも一部を被覆（表面修飾）させる。磁性体ナノ粒子合成後表面修飾剤を添加する場合、磁性体ナノ粒子は、磁気分離により精製することが好ましいが、遠心分離やろ過などの常法により洗浄、精製後、本発明に用いられる表面修飾剤を含有する溶媒（好ましくは水や、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、２−エトキシエタノールなどの親水性有機溶媒）に分散させて被覆してもよい。また、磁性体ナノ粒子合成時に表面修飾剤を添加する場合は、磁気分離、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、電気泳動など公知の方法で精製することができる。
【００３０】
なお、磁性体ナノ粒子の表面が表面修飾剤で被覆されていることは、ＦＥ−ＴＥＭ等の高分解性ＴＥＭで観察した際に粒子間に一定の間隔が認められること、および化学分析により確認することができる。
【００３１】
本発明に係る一般式（Ｉ）で表される表面修飾剤で被覆された磁性体ナノ粒子は活性化されて、その表面修飾剤の末端基である式中のXを反応基としてアミド化反応等により、さらに後述する連結体と結合することができる。
【００３２】
アミド化反応は、カルボキシル基あるいはその誘導基（エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物など）とアミノ基の縮合により行われる。酸無水物や酸ハロゲン化物を用いる場合には塩基を共存させることが望ましい。カルボン酸のメチルエステルやエチルエステルなどのエステルを用いる場合には、生成するアルコールを除去するために加熱や減圧を行なうことが望ましい。カルボキシル基を直接アミド化する場合には、ＤＣＣ、Ｍｏｒｐｈｏ−ＣＤＩ、ＷＳＣなどのアミド化試薬、ＨＢＴなどの縮合添加剤、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ｐ−ニトロフェニルトリフルオロアセテート、２，４，５−トリクロロフェノールなどの活性エステル剤などのアミド化反応を促進する物質を共存させたり、予め反応させておいてもよい。また、アミド化反応時、アミド化により結合させる親和性分子のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを常法に従って適当な保護基で保護し、反応後脱保護することが望ましい。
【００３３】
アミド化反応により連結体と結合した磁性体ナノ粒子は、ゲルろ過などの常法により洗浄、精製後、水または親水性溶媒（好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、２−エトキシエタノールなど）に分散させて使用する。この分散液中のナノ粒子磁性体の濃度は、標的物質および連結体の種類や濃度によって異なるので特に限定されないが、１Ｍ〜１０-8Ｍが好ましく、より好ましくは１０-2Ｍ〜１０-7Ｍである。
【００３４】
［３］試料液
上記本発明に係る上述の磁性体ナノ粒子は、試料液中で独立分散している。ここで、「独立分散」とは、磁性体ナノ粒子が試料中で略均一に分散している状態をいい、個々の磁性体ナノ粒子が互いに結合していない、或いは結合しているとしても、振盪などの物理的な手段によって容易に分離可能な状態であることをいう。
なお、試料液中での磁性体ナノ粒子の濃度は、磁性体ナノ粒子の種類や試料液の種類によっても異なるが、分散安定性の観点から、一般に、０．０１ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌの範囲であることが好ましい。
【００３５】
磁性体ナノ粒子が独立分散している試料液とは、検出対象となる標的物質を含む可能性を有する液体の試料をいい、磁性体ナノ粒子による分析等の用途によって異なるが、磁性体ナノ粒子の凝集・分散が可能な粘度を有する水溶液を挙げることができる
【００３６】
本発明では、試料中に媒質として存在する塩の種類、その濃度及び試料液のｐＨの少なくとも１つを変化させることによって、磁性体ナノ粒子の分散と凝集を制御する。なお、塩の種類、塩の濃度及びｐＨの各条件は、いずれか１つを用いてもよく、これらを複数組み合わせてもよい。
【００３７】
磁性体ナノ粒子の凝集・分散を行う際に試料液中に含まれる塩としては、多価カチオン及び多価アニオンの少なくとも一方の塩を挙げることができる。
このような多価カチオンの塩としては、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、等を挙げることができ、一方、多価アニオンの塩としては、リン酸塩、硫酸塩、ホウ酸塩、リンタングステン酸あるいはリンモリブデン酸などのポリ酸塩、デキストラン硫酸あるいはヘパリンなどの硫酸化多糖等を挙げることができる。このうち、広範囲のｐＨ領域で緩衝液を調整可能なリン酸塩が好ましい。
【００３８】
通常、磁性体ナノ粒子は、試料液中の粒子濃度にも依存するが、一般に、精製水、生理食塩水、ＧＯＯＤ緩衝液など各種緩衝液中で安定に分散可能である。このような試料液中に存在する各種塩の濃度は、通常、長期的な保存安定性の観点から好ましくは０．１Ｍ以下である。
【００３９】
磁性体ナノ粒子を凝集状態にするには、分散液中に多価カチオンまたは多価アニオンからなる塩を添加すればよく、例えば５．０ｇ／Ｌの酸化鉄を含む磁性ナノ粒子水溶液は、等量の０．２Ｍリン酸緩衝液を添加することで容易に凝集状態にすることができる。
【００４０】
なお塩添加により磁性体ナノ粒子の分散・凝集を行う際の試料液のｐＨは、５以上が望ましい。生体物質の精製分離の観点から好ましくは５〜１０である。温度は取り扱う物質の安定性に合わせ水溶液中で任意の温度を設定することができる。また、ｐＨ変化により磁性体ナノ粒子の分散・凝集を行う際は、ｐＨ５以上で分散させ、ｐＨ５未満で凝集を行うことができる。特に、磁性体ナノ粒子の表面にカルボン酸基が存在する場合には、凝集条件をｐＨ５未満とし、分散条件をｐＨ５とすることによって効率よく分散・凝集を行うことができるため、好ましい。
【００４１】
このように塩濃度、塩の種類及び／又は試料液のｐＨを変更させるには、磁性体ナノ粒子を含有する試料液に対して、所望の塩濃度又は種類或いはｐＨとなるように塩溶液を添加すればよい。塩溶液としては、磁性体ナノ粒子の種類や試料液の種類・濃度によって異なるが、一般に、多価カチオンあるいは多価アニオンを含む緩衝液あればよく、例えば、リン酸緩衝液（ｐＨ５〜９）、クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５〜９）等を挙げることができる。ｐＨによる凝集分散の制御は任意の緩衝液を用いることができる。
【００４２】
特に本発明に係る磁性体ナノ粒子が上述した一般式（Ｉ）で表される表面修飾剤で表面修飾されたものである場合には、このような凝集・分散を極めて容易に行うことができる。
【００４３】
一方、凝集させた磁性体ナノ粒子を分散させるには、それぞれ、分散前の塩の濃度、種類及びｐＨに再度変更すればよく、所望の種類及び／又は濃度の塩溶液を添加するか、精製水などで塩濃度を希釈すればよい。
【００４４】
このような塩の種類及び／又は濃度を変化させることによって、試料液中での磁性体ナノ粒子を凝集・分散することができる。このとき磁性体ナノ粒子が表面に、試料中の標的物質との結合を可能にする連結体を有する場合には、標的物質と共に凝集・分散することができる。
【００４５】
［４］連結体（リガンド）
本発明における磁性体ナノ粒子は、連結体を介して標的物質に結合可能にすることができる。ここで標的物質及び連結体は、本発明における磁性体ナノ粒子の利用分野によって適宜変更することができる。
【００４６】
このような連結体としては、生体関連分子及び生体関連分子に対して親和性を有する各種有機・無機化合物を挙げることができる。
生体関連分子で「リガンドと標的物質」の親和性相互作用を期待できる組合せとして、核酸同士のハイブリダイゼーション、抗原及び抗体（モノクローナルやポリクローナル）、酵素及び基質、核酸とタンパク、アジビン−ビオチン等を挙げることができる。また、リガンドとしての生体関連分子には、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質や多糖類、更には脂質等を挙げることができる。
例えば、核酸を用いた場合には、種々のタンパク質の中から、種々の塩基配列に対して転写の制御を行うことができる転写制御因子を、迅速且つ容易に分離することができる。その他、種々の物質を用いることによって種々の物質間の関連性、例えば、相互作用の強さ、構造の類似性等を認識することができる。
【００４７】
ここで、「核酸」は、狭義には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）であり、広義には、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）を含めても良い。ＲＮＡには、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡがある。また、ＤＮＡ、ＲＮＡ全体のみならず、そのＤＮＡ、ＲＮＡの断片である場合も含む。
更には、標的物質としてウィルス若しくは細菌等の生物体若しくはその一部を挙げることができる。連結体としてレクチン等を用いることができる。
【００４８】
［５］磁性体ナノ粒子の捕集方法
本発明の磁性体ナノ粒子の凝集・分散制御方法は、次いで、凝集させた磁性体ナノ粒子を、外部磁場に付して捕集する捕集工程を含む磁性体ナノ粒子の捕集方法に適用することができる。
本発明では、上述したように磁性体ナノ粒子を、試料液の塩濃度、種類及び／又はｐＨの変化によって迅速に凝集・分散させる。凝集させたときに得られる磁性体ナノ粒子の凝集体は外部磁場に対して応答可能となるので、磁性体ナノ粒子がその表面の連結体を介して試料液中の微量な標的物質と結合していた場合には、微量な標的物質を迅速に且つ精度よく捕集することができる。
【００４９】
ここで用いられる外部磁場の強さとしては、７．９６〜１５９２ｋＡ／ｍ（１００〜２００００Ｏｅ）とすることが好ましく、２３．９〜１２７４ｋＡ／ｍ（３００〜１６０００Ｏｅ）とすることがより好ましい。外部磁場は、永久磁石を使用して印加することができる。
また、外部磁場の付与は、被検体と磁性体ナノ粒子の混合液を一定の速度で外部磁場を通過させながら行ってもよいし、容器の中でバッチ処理的に行ってもよい。
【００５０】
本発明の捕集方法は、外部磁場によって捕集された磁性体ナノ粒子の凝集体を試料液から分離・精製する分離工程を含んでもよい。試料液から凝集体を分離する手段は、凝集体を回収する又は、試料液を除去した後に外部磁場の付与を停止又は外部磁場から遮断する等、このような目的に用いられている公知の方法をそのまま適用することができる。
これにより標的物質を結合した磁性体ナノ粒子の凝集体を、高濃度に得ることができると共に、容易に試料液から分離することができる。
【００５１】
本発明の捕集方法は、捕集工程によって捕集された磁性体ナノ粒子の凝集体に対して、更に塩濃度等を変化させることによって再分散させる再分散工程を含んでもよい。これにより、磁性体ナノ粒子の分散物を再度得ることができる。
なお、この再分散は、凝集体を得た試料液中で行ってもよく、又は分離工程によって凝集体を試料液から分離した後に他の溶液中で行ってもよい。
【００５２】
このとき、磁性体ナノ粒子が連結体を介して標的物質を結合していた場合には、標的物質を効率よく回収することができる。また、分散時の容量を調整することによって、所望する濃度の標的物質の溶液を得ることができ、例えば高濃度の標的物質を容易に得ることができる。このような再分散によって、標的物質の濃縮や精製を容易に且つ迅速に行うことができる。
【００５３】
なお、本発明では、磁性体ナノ粒子を含有する溶液中で、磁性体ナノ粒子を凝集状態及び分散状態に変化させることを含む処理であればよく、磁性体ナノ粒子又は磁性体ナノ粒子に結合する標的物質の捕集や回収を主目的とする用途のみに限定されるものではない。このような他の用途としては、試料液中の物質の濃縮、精製又は、混合溶液からの特定物質の除去を挙げることができる。従って、本発明は、磁性体ナノ粒子を含む試料液中において物質の挙動を変化させることを含むあらゆる目的・用途の処理に適用することができる。
【実施例】
【００５４】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００５５】
［実施例１］
磁性ナノ粒子分散液の調整
塩化鉄（III）６水和物１０．８ｇおよび塩化鉄（II）４水和物６．４ｇをそれぞれ１Ｎ−塩酸水溶液８０ｍｌに溶解し混合した。この溶液を攪拌しながらこの中にアンモニア水（２８重量％）９６ｍｌを２ｍｌ／分の速度で添加した。その後８０℃で３０分加熱した後室温に冷却した。得られた凝集物をデカンテーションにより水で精製した。結晶子サイズ約１２ｎｍのマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）の生成をＸ線回折法により確認した。
この凝集物に、ポリオキシエチレン（４，５）ラウリルエーテル酢酸２．３ｇを溶解した水溶液（ＮａＯＨでｐＨを６．８に調製したもの）１００ｍｌを加え分散し、磁性ナノ粒子分散液を調整した。
【００５６】
［実施例２］
磁性ナノ粒子分散液の凝集と磁界応答性制御
実施例１で調製した磁性ナノ粒子溶液の１０倍希釈液０．５ｍｌにｐＨ７．８クエン酸−リン酸緩衝液（Ｎａ2ＨＰＯ4濃度を０．１Ｍから１Ｍまで変えて調製）０．５ｍｌを加え、凝集性を沈降速度で測定した（分離特性分析装置；ＬｕＭｉＦＵＧＥ−１１４、条件；１０００ｒｐｍ、１０ｓ間隔で１５０回測定）。結果を図１に示す。
その結果、リン酸塩濃度の増加に伴い沈降速度の増加即ち凝集性が増加していることがわかった。磁性ナノ粒子溶液の１０倍希釈液は３０００Ｏｅ（２３７ｋＡ／ｓ）の磁石に全く応答しなかったが、０．２Ｍから磁石への応答性が良好になり、凝集性が増すに従い磁石への応答・回収が容易になった。磁石への応答・回収は、０．７Ｍから更に良好となり、特に、１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液を加えると直ちに凝集を生じ磁石による回収が可能であった。さらに、上清を除き精製水に再分散させると完全に元の透明分散液に戻り、磁石への応答性は失われた。
【００５７】
［実施例３］
ビオチン化磁性ナノ微粒子の調製
実施例１の磁性ナノ粒子分散液２．５ｍｌに０．１ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）７．５ｍｌを加え、ＷＳＣ（水溶性カルボジイミド）１９ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）１８ｍｇを添加し室温で３０分攪拌する。これにBiotin-PEO-Amine（Pierce社製）２８ｍｇを加え一晩振とうする。１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２００μｌを加えて反応停止後、ＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製し、ビオチン化磁性ナノ粒子溶液を得た。
【００５８】
［実施例４］
ビオチン化磁性ナノ粒子によるＨＲＰ−アビジンの濃縮
実施例３のビオチン化磁性ナノ微粒子分散液１００μｌに、各種濃度（１．０，０．１，０．０１μｇ／ｍｌ）のＨＲＰ−アビジン（Ｓｉｇｍａ社製）溶液１００μｌを添加後、クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８、Ｎａ2ＨＰＯ4濃度１Ｍ）を加えて凝集させ磁石で回収した。リン酸緩衝液で洗浄後、精製水に再分散しペルオキシダーゼ活性をＴＭＢ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を基質として測定した。その際、分散液容量を１／１０あるいは１／１００として捕捉ＨＲＰ−アビジンの濃縮を試みた。
その結果、１．０μｇ／ｍｌのＨＲＰ−アビジンを用いた場合のペルオキシダーゼ活性を１００として０．１μｇ／ｍｌのＨＲＰ−アビジンで５５（濃縮無しでは１０）、０．０１μｇ／ｍｌのＨＲＰ−アビジンで４１（濃縮無しでは１）となり、それぞれ５．５倍、４１倍の濃縮効果が得られた。
【００５９】
［実施例５］
実施例１の磁性ナノ粒子分散液０．５ｍｌに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０）をそれぞれ０．５ｍｌ加えて４つのサンプルを調製し、実施例２と同様に沈降速度の測定を行った。結果を表１に示す。表１に示された傾向は、実施例１の磁性体ナノ粒子分散物では、ｐＨ５未満で凝集性が増加することを示している。
【００６０】
【表１】
2006242597.tif 000005
【００６１】
次いで、ｐＨ４．０の懸濁液を磁石で沈降させ、上清をのぞいた後ｐＨ６．０の緩衝液を加えると、元通り完全な分散体とすることができた。
【００６２】
このように本発明によれば、試料液中の塩濃度を変更することによって容易に磁性体ナノ粒子を凝集させて外部磁場による捕集、濃縮を可能にすることができる一方で、塩濃度を低くすることによって容易に再分散させることができる。
また、試料液をｐＨ５未満にすることによっても容易に磁性体ナノ粒子を凝集させて外部磁場による捕集、濃縮を可能にすることができ、更に、ｐＨ変化により凝集させた磁性ナノ粒子は、溶液のｐＨを５以上することによって容易に再分散させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の実施例に係る試料液中の塩濃度と磁性体ナノ粒子の沈降速度との関係を表すグラフである。
【図１】
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