(57)【要約】【課題】基材上に付着させた生体分子モータによってレール分子を移動させ、所定波長の光を照射することにより前記生体分子モータを失活させてレール分子を固定することによって、試薬を使用することなく、容易に、確実に、レール分子を所定位置において所定方向に配向させて固定することができるようにする。【解決手段】極性を備え、該極性に応じた方向に生体分子モータが移動するレール分子を固定する方法であって、基材上に生体分子モータを付着させ、該生体分子モータによってレール分子を移動させ、該レール分子が所定位置に到達すると、所定波長の光を照射して前記生体分子モータを失活させることにより、前記レール分子を所定方向に配向させて固定する。【選択図】図１
2006312211.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）極性を備え、該極性に応じた方向に生体分子モータが移動するレール分子を固定する方法であって、
（ｂ）基材上に生体分子モータを付着させ、
（ｃ）該生体分子モータによってレール分子を移動させ、
（ｄ）該レール分子が所定位置に到達すると、所定波長の光を照射して前記生体分子モータを失活させることにより、前記レール分子を所定方向に配向させて固定することを特徴とするレール分子固定方法。
【請求項２】
（ａ）前記基材上にチャネル形成部材を接合することによって、前記基材上に配向用チャネルを形成し、
（ｂ）該配向用チャネルの一端から前記レール分子を前記配向用チャネル内に進入させ、
（ｃ）該配向用チャネル内の所定位置に前記レール分子を固定する請求項１に記載のレール分子固定方法。
【請求項３】
前記レール分子を固定した後、前記チャネル形成部材を除去する請求項２に記載のレール分子固定方法。
【請求項４】
前記レール分子は細胞骨格繊維である請求項１に記載のレール分子固定方法。
【請求項５】
前記所定波長は４２０〜５００〔ｎｍ〕である請求項１に記載のレール分子固定方法。
【請求項６】
前記光は６０秒以上照射する請求項１に記載のレール分子固定方法。
【請求項７】
複数本の前記レール分子を相互に平行に、かつ、同一方向に配向させて固定する請求項１に記載のレール分子固定方法。
【請求項８】
前記レール分子を曲線又は折れ線を形成するように固定する請求項１に記載のレール分子固定方法。
【請求項９】
（ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載のレール分子固定方法によって固定されたレール分子と、
（ｂ）該レール分子上を該レール分子の極性に応じた方向に移動する生体分子モータとを有し、
（ｃ）該生体分子モータが前記レール分子に沿って搬送物を搬送することを特徴とするナノ搬送デバイス。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のレール分子固定方法によって固定されたことを特徴とするナノ搬送デバイス用のレール分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レール分子固定方法及びナノ搬送デバイスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、数ナノメートル〜数十ナノメートルの領域の技術であるナノテクノロジーの分野においては、化学エネルギーを運動に転換することができ、生物界において一般的に見受けられる生体分子モータを利用して工学的なデバイスを作成するための技術に関する研究が行われている。生体分子モータの一種であるキネシン（Ｋｉｎｅｓｉｎ）は、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の加水分解に伴い、レール分子の一種である微小管（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｌｅ）の上を移動することが知られている（例えば、非特許文献１〜８参照。）。この場合、微小管は極性を有しており、キネシンは微小管のマイナス端側からプラス端側に向けて移動するので、微小管の活性を保ったままで、微小管の極性の向きを所定の方向にする、すなわち、配向することが重要である。
【非特許文献１】Vale, R.D., Reese, T.S. and sheetz, M.P., "Identification of a novel force-generating protein, kinesin, involved in microtubule-based motility," Cell, vol. 42, pp. 39-50(1985)
【非特許文献２】Howard, J., Hudspeth, A.J. and Vale, R., "Movement of microtubules by single kinesin molecules," Nature, vol. 342, pp. 154-159(1989)
【非特許文献３】Vale, R.D., Funatsu, T., Pierce, D.W., Romberg, L., Harada, Y. and Yanagida, T., "Direct observation of single kinesin molecules moving along microtubules," Nature, vol. 380, pp. 451-453(1996)
【非特許文献４】Svoboda, K., Schmidt, C., Schnapp, B, and Block, S., "Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry," Nature, vol.365, pp.721-727(1993)
【非特許文献５】Nishiyama, M., Muto, E., Inoue, y., Yanagida, T. and Higuchi, H., "Substeps within the 8-nm step of the ATPase cycle of single kinesin molecules," Nat. Cell Biol., vol. 3, pp. 425-428(2001)
【非特許文献６】Meyhofer, E. and Howard, J., "The force generated by a single kinesin molecule against an elastic load," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 92, pp.574-578(1995)
【非特許文献７】Coppin, C.M., Pierce, D.W., Hsu, L. and Vale, R.D., "The load dependence of kinesin's mechanical cycle," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 94, pp.8539-8544(1997)
【非特許文献８】Kojima, H., Muto, E., Higuchi, H. and Yanagida, T., "Mechanics of Single Kinesin Molecules Measured by Optical Trapping Nanometry," Biophys. J., vol. 73, pp. 2012-2022(1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、前記従来の技術は、微小管の配向及び固定をデバイス内全体において行うようになっているので、微小管を固定した後も、固定に使用した試薬を前記デバイス内から完全に除去しなければ、次に使用するキネシンが活性を失ってしまう。すなわち、失活してしまう。そのため、度重なる試薬の交換が必要となり、極めて煩雑になってしまう。
【０００４】
本発明は、前記従来の問題点を解決して、基材上に付着させた生体分子モータによってレール分子を移動させ、所定波長の光を照射することにより前記生体分子モータを失活させてレール分子を固定することによって、試薬を使用することなく、容易に、確実に、レール分子を所定位置において所定方向に配向させて固定することができるレール分子固定方法及びナノ搬送デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そのために、本発明のレール分子固定方法においては、極性を備え、該極性に応じた方向に生体分子モータが移動するレール分子を固定する方法であって、基材上に生体分子モータを付着させ、該生体分子モータによってレール分子を移動させ、該レール分子が所定位置に到達すると、所定波長の光を照射して前記生体分子モータを失活させることにより、前記レール分子を所定方向に配向させて固定する。
【０００６】
本発明の他のレール分子固定方法においては、さらに、前記基材上にチャネル形成部材を接合することによって、前記基材上に配向用チャネルを形成し、該配向用チャネルの一端から前記レール分子を前記配向用チャネル内に進入させ、該配向用チャネル内の所定位置に前記レール分子を固定する。
【０００７】
本発明の更に他のレール分子固定方法においては、さらに、前記レール分子を固定した後、前記チャネル形成部材を除去する。
【０００８】
本発明の更に他のレール分子固定方法においては、さらに、前記レール分子は細胞骨格繊維である。
【０００９】
本発明の更に他のレール分子固定方法においては、さらに、前記所定波長は４２０〜５００〔ｎｍ〕である。
【００１０】
本発明の更に他のレール分子固定方法においては、さらに、前記光は６０秒以上照射する。
【００１１】
本発明の更に他のレール分子固定方法においては、さらに、複数本の前記レール分子を相互に平行に、かつ、同一方向に配向させて固定する。
【００１２】
本発明の更に他のレール分子固定方法においては、さらに、前記レール分子を曲線又は折れ線を形成するように固定する。
【００１３】
本発明のナノ搬送デバイスにおいては、前記レール分子固定方法によって固定されたレール分子と、該レール分子上を該レール分子の極性に応じた方向に移動する生体分子モータとを有し、該生体分子モータが前記レール分子に沿って搬送物を搬送する。
【００１４】
本発明のナノ搬送デバイス用のレール分子においては、前記レール分子固定方法によって固定された。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、レール分子固定方法においては、極性を備え、該極性に応じた方向に生体分子モータが移動するレール分子を固定する方法であって、基材上に生体分子モータを付着させ、該生体分子モータによってレール分子を移動させ、該レール分子が所定位置に到達すると、所定波長の光を照射して前記生体分子モータを失活させることにより、前記レール分子を所定方向に配向させて固定する。
【００１６】
この場合、試薬を使用することなく、容易に、確実に、レール分子を所定位置において所定方向に配向させて固定することができる。そのため、レール分子上を移動する生体分子モータを所定の方向に移動させることができる。
【００１７】
他のレール分子固定方法においては、さらに、前記基材上にチャネル形成部材を接合することによって、前記基材上に配向用チャネルを形成し、該配向用チャネルの一端から前記レール分子を前記配向用チャネル内に進入させ、該配向用チャネル内の所定位置に前記レール分子を固定する。
【００１８】
この場合、レール分子は、所定の極性を備える端を先頭にして配向用チャネル内に進入するので、レール分子を確実に所定方向に配向させて固定することができる。また、配向用チャネルの形状に応じた形状となるようにレール分子を固定することができるので、レール分子上を移動する生体分子モータを任意の形状の経路に沿って移動させることができる。
【００１９】
本発明によれば、ナノ搬送デバイスにおいては、前記レール分子固定方法によって固定されたレール分子と、該レール分子上を該レール分子の極性に応じた方向に移動する生体分子モータとを有し、該生体分子モータが前記レール分子に沿って搬送物を搬送する。
【００２０】
この場合、搬送物を所定の方向に搬送することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２２】
図１は本発明の実施の形態における微小管を固定するナノチャネルの母型を製造する方法を示す図、図２は本発明の実施の形態における微小管を固定するナノチャネルの構成を示す図である。なお、図１（ａ）〜（ｄ）において、（２）は基板の上面を示し、（１）は（２）のＡ−Ｂ矢視断面を示している。
【００２３】
図１は、内部にレール分子としての後述される微小管３１を所定方向に配向させて固定するための配向用チャネル、すなわち、後述されるナノチャネル２９の母型を製造する流れを示している。なお、本実施の形態においては、生体の細胞内において細胞小器官等を輸送する生体分子モータを使用する。生体分子モータは、モータタンパク（モータプロテイン：Ｍｏｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）とも称されるものであり、極性を有する細胞骨格繊維に結合し、該細胞骨格繊維沿いに一定方向に移動する。そして、細胞内には数十種類の生体分子モータが存在し、本実施の形態における生体分子モータは、いかなる種類のものであってもよく、例えば、ミオシン（Ｍｙｏｓｉｎ）、ダイニン（Ｄｙｎｅｉｎ）等であってもよいが、本発明の発明者は、生体分子モータとして後述されるキネシン３２を使用して実験を行ったので、ここでは、生体分子モータがキネシン３２である場合について説明する。また、生体分子モータが移動するためのレール分子は、細胞内においては、前述のように細胞骨格繊維であり、例えば、アクチンフィラメント（Ａｃｔｉｎ  Ｆｉｌａｍｅｎｔ）であってもよいが、本発明の発明者はレール分子として微小管３１を使用して実験を行ったので、ここでは、レール分子が微小管３１である場合について説明する。
【００２４】
ナノチャネル２９の母型を製造する場合、まず、Ｓｉ、ＳｉＯ2 等から成る母型の基板１１上の全面に、電子線レジスト１２（例えば、ＳＡＬ６０１）を塗布し、電子ビームリソグラフィーによってパターニングを行った。これにより、基板１１の上面に、図１（ａ）に示されるような電子線レジスト１２のパターンが形成された。該パターンは、微小管３１を固定するナノチャネル２９に該当するものである。
【００２５】
続いて、基板１１上の全面にＵＶ（紫外線）レジスト１３（例えば、Ｓ１８０５）を塗布し、紫外線を使用したフォトリソグラフィーによってパターニングを行った。これにより、基板１１の上面に、図１（ｂ）に示されるようなＵＶレジスト１３のパターンが形成された。該パターンは、前記ナノチャネル２９が接続される後述されるアクセスチャネル２６ａ及び２６ｂに該当するものである。
【００２６】
続いて、前記電子線レジスト１２及びＵＶレジスト１３をマスクとして、ディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ：Ｄｅｅｐ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｉｏｎ  Ｅｔｃｈｉｎｇ）によって、基板１１の表面の周辺部１４をエッチングした。これにより、該周辺部１４は、図１（ｃ）に示されるように、深さａだけエッチングされた。なお、該深さａは、約４〔μｍ〕であり、微小管３１を固定するナノチャネル２９の深さに該当する。
【００２７】
続いて、基板１１の表面から電子線レジスト１２及びＵＶレジスト１３を除去すると、図１（ｄ）に示されるように、凸部１５を有する母型を得ることができた。前記凸部１５はナノチャネル２９並びに後述されるアクセスチャネル２６ａ及び２６ｂに該当する。そして、基板１１の表面を覆うように、ＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）のプレポリマーを塗布し、該プレポリマーを硬化させた後、剥（はく）離した。これにより、図２（ａ）に示されるようなＰＤＭＳフィルム２１を得ることができた。
【００２８】
図２（ａ）に示される例においては、ＰＤＭＳフィルム２１の下面の円で囲まれる部分２４にナノチャネル２９並びにアクセスチャネル２６ａ及び２６ｂが形成されている。そして、ＰＤＭＳフィルム２１を、図２（ａ）において矢印２３で示されるように、Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐとして示されている基材としてのガラス板２２に密着するように接合（Ｂｏｎｄｉｎｇ）させた。なお、ガラス板２２はカバー板として機能する。これにより、図２（ｂ）に示されるようなチャネル形成部材を得ることができた。また、図２（ａ）において矢印２５で示される部分は、ナノチャネル２９並びにアクセスチャネル２６ａ及び２６ｂに、生理食塩水等から成るバッファ（緩衝液）を注入するための注入孔（こう）、すなわち、Ｔｈｒｏｕｇｈ  ｈｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎである。
【００２９】
図２（ｂ）には、前記部分２４が拡大して示されている。この場合、図２（ｂ）に示されるように、中央凸部２８と、該中央凸部２８の両側に位置する周辺凸部２７との間に、矢印によって示されるアクセスチャネル２６ａ及び２６ｂが形成されている。なお、図２（ｂ）において、アクセスチャネル２６ａ及び２６ｂは、Ｍａｉｎ  ｃｈａｎｎｅｌ（Ａ）及び（Ｂ）として示されている。
【００３０】
また、中央凸部２８には、複数のナノチャネル２９が形成されている。図２（ｂ）において、ナノチャネル２９は、Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｓｕｂ−ｃｈａｎｎｅｌ（ｓ）として示されている。ナノチャネル２９は、その両端がアクセスチャネル２６ａ及び２６ｂに各々接続され、アクセスチャネル２６ａ及び２６ｂと同一の深さを備える。該深さは、前述のように、約４〔μｍ〕である。
【００３１】
図２（ｃ）は、ＰＤＭＳフィルム２１の下面の円で囲まれる部分２４を観察した走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）の写真である。写真の上下にアクセスチャネル２６ａ及び２６ｂが観察され、中央部にナノチャネル２９が観察される。この場合、ナノチャネル２９の長さは５０〔μｍ〕、幅は５００〜２０００〔ｎｍ〕、高さは４〔μｍ〕である。
【００３２】
また、図２（ｄ）は蛍光色素を使用して可視化したナノチャネル２９を示している。ＰＤＭＳフィルム２１にガラス板２２に密着するように接合させた後、注入孔からバッファを注入すると、毛細管現象によってナノチャネル２９内にバッファが導入される。濃度１０〔ｍＭ〕のテトラメチルローダミン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｌｙ  ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を用いて、ナノチャネル２９を蛍光色素によって可視化したものが図２（ｄ）である。図２（ｄ）において、右側の細いナノチャネル２９の幅は５００〔ｎｍ〕であり、左側の太いナノチャネル２９の幅は７５０〔ｎｍ〕である。
【００３３】
次に、所定波長の光を照射することによって微小管３１を固定する方法について説明する。
【００３４】
図３は本発明の実施の形態における微小管及びキネシンを示す模式図、図４は本発明の実施の形態における照射光の波長とキネシンの失活との関係を示す図、図５は本発明の実施の形態における光の照射時間と微小管の動きとの関係を示す図、図６は本発明の実施の形態における光の照射時間と微小管の動きとの関係を示す写真である。
【００３５】
図３において、３１はレール分子としての微小管であり、３２は該微小管３１に沿って移動するリニア駆動の生体分子モータとしてのキネシンである。そして、微小管３１は、３種類存在する細胞骨格繊維の１つであり、モノマーであるチューブリン（Ｔｕｂｕｌｉｎ）を重合することによって得られる直径２５〔ｎｍ〕、長さ数十〔μｍ〕の円筒状構造を備えるフィラメント、すなわち、繊維である。なお、チューブリンは、α−チューブリン及びβ−チューブリンという２個の球状ポリペプチドが、非共有結合によって固く結合したヘテロ二量体である。
【００３６】
また、微小管３１は極性を有し、一方の端（図３における左端）がプラス端であり、他方の端（図３における右端）がマイナス端である。プラス端とマイナス端とは、微小管３１を構成するサブユニットであるチューブリンが重合する速度によって識別され、重合する速度が高く、速く伸長する端がプラス端と呼ばれ、重合する速度が低く、ゆっくりと伸長する端がマイナス端と呼ばれる。
【００３７】
一方、キネシン３２は、ヘッド（頭）部が１０〔ｎｍ〕、全長が８０〔ｎｍ〕程度のタンパク分子である。そして、２個の球形のヘッド部と細長いより合わせコイル部とを有し、ヘッド部が微小管３１への付着と解離とを交互に繰り返すことによって、両手で繊維を手繰るように、１歩ずつ前進する。この場合、キネシン３２の運動は、８〔ｎｍ〕のステップから成り、最大速度が８００〔ｎｍ／ｓ〕程度であり、図３において矢印で示されるように、微小管３１上をマイナス端側からプラス端側に向けて移動する。また、キネシン３２の発生力は５〜８〔ｐＮ〕である。
【００３８】
本実施の形態においては、所定波長の光を照射することによってキネシン３２を失活させることにより、微小管３１をキネシン３２によって固定する方法を採用した。該方法においては、まず、基材の表面に多数のキネシン３２を固定する。ここに微小管３１を導入して、ＡＴＰを与えるとキネシン３２の生体分子モータとしての作用によって、微小管３１が動き出す。すなわち、基材の表面に固定されたキネシン３２が微小管３１上を移動するので、微小管３１が基材等の表面を移動することになる。そして、該微小管３１が所望の位置に到達すると、所定波長の光を照射する。これにより、キネシン３２は、失活し、該キネシン３２のヘッド部に微小管３１が付着した状態で、動きを停止する。そのため、微小管３１が停止する。この場合、キネシン３２のヘッド部が微小管３１に付着した状態を維持するので、微小管３１が固定される。
【００３９】
本発明の発明者は、実験によって、前記所定波長が４２０〜５００〔ｎｍ〕であることを見出した。具体的には、４種類の光フィルタを組み合わせて実験を行った結果、図４（ａ）に示されるような結果を得ることができた。前記４種類の光フィルタは、次の（１）〜（４）である。
（１）Ｌ４２：波長が４２０〔ｎｍ〕以下の光をカットするＵＶカットフィルタ
（２）ロボン：波長が８００〔ｎｍ〕以上の光をカットする赤外光カットフィルタ
（３）ＩＦ５５０：波長が５００〜６００〔ｎｍ〕の光を透過させるバンドパスフィルタ
（４）Ｙ５０：波長が５００〔ｎｍ〕以下の光をカットするフィルタ
そして、図４（ｂ）は、（１）〜（４）の４種類の光フィルタが透過する光の波長の関係を示している。なお、図４（ｂ）において、横軸には波長を採ってある。
【００４０】
また、前記実験は、グライディングアッセイ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｌｉｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）中に、組み合わされた光フィルタを透過した水銀ランプの光を照射することによって、キネシン３２を失活させ、微小管３１の動きを停止させるものである。グライディングアッセイは、カバーガラス２枚又はカバーガラスとスライドガラスとを用いて制作したフローセル内で行った。この場合、該フローセル内にキネシン３２のテール側（図３における上側）をガラス上に固定すると、ＡＴＰを加水分解する際にヘッド側（図３における下側）が微小管３１を動かす。そして、前記光を照射することによってキネシン３２の生体分子モータとしての動きが停止すると、微小管３１の動きが停止する。
【００４１】
前記実験において、まず、図４（ａ）の左欄に示されるように、（１）〜（４）の４種類の光フィルタをすべて透過した水銀ランプの光を照射し、照射の前後における微小管３１の動きを観察した。この場合、生体分子モータとしてのキネシン３２は動きを継続し、停止しなかった。そして、図４（ｂ）から、（１）〜（４）の４種類の光フィルタをすべて透過して照射された光の波長は、５００〜６００〔ｎｍ〕であることが分かる。
【００４２】
次に、図４（ａ）の中欄に示されるように、（１）及び（２）の２種類の光フィルタを透過した水銀ランプの光を照射し、照射の前後における微小管３１の動きを観察した。この場合、生体分子モータとしてのキネシン３２は動きを停止した。そして、図４（ｂ）から、（１）及び（２）の２種類の光フィルタを透過して照射された光の波長は、４２０〜８００〔ｎｍ〕であることが分かる。
【００４３】
最後に、図４（ａ）の右欄に示されるように、（１）、（２）及び（４）の３種類の光フィルタを透過した水銀ランプの光を照射し、照射の前後における微小管３１の動きを観察した。この場合、生体分子モータとしてのキネシン３２は動きを継続し、停止しなかった。そして、図４（ｂ）から、（１）、（２）及び（４）の３種類の光フィルタを透過して照射された光の波長は、５００〜８００〔ｎｍ〕であることが分かる。
【００４４】
このような実験により、前述のように、キネシン３２を失活させる光の所定波長が４２０〜５００〔ｎｍ〕であることを見出した。そこで、本発明の発明者は、キネシン３２を失活させるために、波長が４２０〜５００〔ｎｍ〕の光として、（１）及び（２）の２種類の光フィルタを透過した水銀ランプの光を使用することとした。
【００４５】
続いて、本発明の発明者は、更なる実験により、キネシン３２を失活させるために必要な光の照射時間が６０秒以上であることを見出した。具体的には、前述のキネシン３２を失活させる光の波長を見出すための実験と同様に、グライディングアッセイ中に、波長が４２０〜５００〔ｎｍ〕の水銀ランプの光を照射することによって、キネシン３２を失活させ、微小管３１の動きを停止させる実験を行った。この場合、前記グライディングアッセイ中に１００〔Ｗ〕の水銀ランプの光を照射する時間を１０秒から９０秒まで変化させ、照射の前後における微小管３１の動きを観察した。
【００４６】
そして、キネシン３２を失活させるために必要な水銀ランプの光の照射時間を見出すための実験の結果は、図５に示されている。図５は、水銀ランプの光の照射時間と微小管３１の動きとの関係を示し、横軸に水銀ランプの光の照射時間を採り、縦軸に動いている微小管３１の割合を採ってある。なお、図５において、●は照射の前の状態を示し、■は照射の後の状態を示している。そして、図５から、水銀ランプの光の照射時間が６０秒以上であれば、キネシン３２を失活させ、すべての微小管３１の動きを停止させることができると言える。そこで、本発明の発明者は、キネシン３２を失活させるために、前記波長の水銀ランプの光を６０秒以上照射することとした。
【００４７】
また、暗視野顕微鏡によって、波長４２０〜５００〔ｎｍ〕の水銀ランプの光を照射し、照射前後の微小管３１の動きを観察することができた。この観察の結果が図６に示されている。図６は、照射前後におけるグライディングアッセイ中の微小管３１の動きを示す暗視野顕微鏡写真である。ここで、図６（１）〜（３）は、照射前のものであり、微小管３１が動いていることを示している。その後、前記波長の水銀ランプの光を４０秒間照射して、キネシン３２を失活させたところ、図６（４）〜（６）に示されるように、微小管３１の動きが停止し、固定された。
【００４８】
このように、波長４２０〜５００〔ｎｍ〕の水銀ランプの光を照射することによって、微小管３１の動きが停止して固定されるのは、ガラス上に固定してあるキネシン３２が失活するためである。もっとも、失活したキネシン３２が微小管３１との結合を解離してしまうと、微小管３１を固定することができない。しかし、キネシン３２は波長４２０〜５００〔ｎｍ〕の光の照射によって失活しても微小管３１との結合を保つため、前記波長の光を照射した場所に微小管３１が固定されることが分かった。
【００４９】
そして、波長４２０〜５００〔ｎｍ〕の光を照射することによって微小管を固定する方法には、次のような利点がある。図３に示されるように、キネシン３２は微小管３１上をマイナス端側からプラス端側に向けて移動するので、グライディングアッセイ中に動いている微小管３１の先端はマイナス端となる。そこで、動いている微小管３１を暗視野顕微鏡写真によって可視化しながら固定することによって、極性が明らかな状態で微小管３１を固定することができる。すなわち、配向した状態で固定することができる。そして、極性が明らかな配向した状態で固定された微小管３１上を移動するキネシン３２によって物質の搬送を行えば、その搬送方向は明らかである。
【００５０】
また、波長４２０〜５００〔ｎｍ〕の光を照射することによって局所的に微小管３１を固定することもできる。例えば、フォトリソグラフィのように、マスクを用いて特定の領域に前記波長の光を照射する。キネシン３２は光の照射を受けた部分だけで失活するので、前記特定の領域にある微小管３１だけを固定することができる。
【００５１】
このように、レール分子としての微小管３１が所定位置に到達すると、前記波長の光を照射して生体分子としてのキネシン３２を失活させることによって、微小管３１を所定方向に配向させて固定することができる。これにより、例えば、図２（ｂ）に示されるようなチャネル形成部材によって形成されるナノチャネル２９内にのみ、微小管３１を極性が明らかな状態で固定することができる。
【００５２】
次に、微小管３１をナノチャネル２９内に固定する方法について説明する。
【００５３】
図７は本発明の実施の形態における微小管をナノチャネル内に固定する方法を示す図、図８は本発明の実施の形態におけるナノチャネル内に微小管が導入する様子を示す写真、図９は本発明の実施の形態におけるナノチャネル内の微小管上を移動するビーズの様子を示す写真である。
【００５４】
ここでは、図７に示されるような試験用のユニット３５におけるナノチャネル２９内に微小管３１を配向した状態で導入して固定する方法について説明する。この場合、前記ユニット３５は、図２（ａ）に示されるように、基材としてのガラス板２２にチャネル形成部材としてのＰＤＭＳフィルム２１を密着するように接合させて構成されたものである。そして、図７は、図２（ｂ）に示されるようなチャネル形成部材の上面にガラス板２２を接合したものを反転させ、中央凸部２８と周辺凸部２７とを残して、上側のＰＤＭＳフィルム２１を除去したような状態を示している。
【００５５】
なお、配向用チャネルとしてのナノチャネル２９は、ガラス板２２に接合されたチャネル形成部材の一部である中央凸部２８によって、複数形成されている。また、中央凸部２８と、該中央凸部２８の両側に位置する周辺凸部２７との間に、矢印によって示されるアクセスチャネル２６ａ及び２６ｂが形成されている。なお、図７において、アクセスチャネル２６ａ及び２６ｂは、Ｍａｉｎ  ｃｈａｎｎｅｌ（Ａ）及び（Ｂ）として示されている。また、ナノチャネル２９の底面はガラス板２２の上面によって構成されている。
【００５６】
そして、キネシン３２を含む溶液で前記ユニット３５におけるチャネル、すなわち、アクセスチャネル２６ａ及び２６ｂとナノチャネル２９とを満たし、ガラス板２２の上面をキネシン３２でコーティングする。続いて、微小管３１をアクセスチャネル２６ａから導入すると、図７（１）に示されるように、微小管３１はアクセスチャネル２６ａ内のキネシン３２によって捉えられる。
【００５７】
図７において、微小管３１は太い矢印で示され、矢印の先端がマイナス端であり、後端がプラス端である。ここで、微小管３１に剛性があり、また、アクセスチャネル２６ａの幅とナノチャネル２９の幅とに違いがあるので、図７（１）に示されるように、微小管３１はナノチャネル２９に入らず、アクセスチャネル２６ａ内においてのみガラス板２２の上面に付着する。
【００５８】
続いて、アクセスチャネル２６ａから濃度１〔ｍＭ〕のＡＴＰを加えると、キネシン３２は、ＡＴＰの加水分解に伴い微小管３１上を移動する。そのため、微小管３１がガラス板２２の上面に固定されたキネシン３２によって搬送され、図７（２）に示されるように、確率的にナノチャネル２９内に進入する。この場合、アクセスチャネル２６ａ及びナノチャネル２９の幅、微小管３１の濃度、並びに、アッセイ時間を変化させることによって、１本のナノチャネル２９（例えば、幅５００〔ｎｍ〕）にほぼ１本の微小管３１が進入するように最適化される。なお、前述のように、キネシン３２が微小管３１上をマイナス端側からプラス端側に向けて移動するので、微小管３１は矢印の示す方向に移動する。
【００５９】
そして、微小管３１がナノチャネル２９内に進入した時に波長４２０〜５００〔ｎｍ〕の水銀ランプの光を照射することによって、キネシン３２が失活し、微小管３１が固定される。そのため、図７（３）に示されるように、ナノチャネル２９内に極性が明らかな配向した状態で微小管３１を固定することができる。これにより、レール分子としての微小管３１が配向した状態で固定されたナノ搬送デバイスを得ることができる。
【００６０】
続いて、図７（４）に示されるように、アクセスチャネル２６ｂからキネシンビーズ３６を導入して濃度１〔ｍＭ〕のＡＴＰを加えると、微小管３１にアクセスしたキネシンビーズ３６は、アクセスチャネル２６ａに向かって搬送される。ここで、キネシンビーズ３６は、表面にキネシン３２をコーティングしたポリスチレンビーズ（直径３２０〔ｎｍ〕、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂ．）であり、該ポリスチレンビーズとキネシン３２とを混合してインキュベートすることによって得ることができた。この場合、キネシンビーズ３６に固定されたキネシン３２が微小管３１上を移動することによって、該微小管３１のマイナス端からプラス端に向けて、搬送物としてのキネシンビーズ３６が搬送されることになる。
【００６１】
本発明の発明者は、微小管３１が幅７５０〔ｎｍ〕のナノチャネル２９内に進入する様子を、微小管３１として蛍光微小管を使用することによって、図８に示されるように、可視化した。なお、蛍光微小管は、蛍光色素によってラベリングされた蛍光チューブリンと、蛍光色素によってラベリングされていないチューブリンとを適切な比で混合して重合することによって得ることができた。そして、図８は、１５秒毎に撮影された連続写真であり、グライディングアッセイによるナノチャネル２９内に微小管３１が進入する様子を示している。
【００６２】
この場合、図８（１）に示されるように、微小管３１のマイナス端がナノチャネル２９に入った後、１５秒おきの連続写真を図８（６）まで、順に撮影した。なお、途中で微小管３１の一部が切れているように見えるが、撮影に使用した対物レンズの焦点深度（０．２〔μｍ〕）を外れて微小管３１が動いているためである。これは、キネシン３２が、ガラス板２２の上面だけでなく、ＰＤＭＳから成る中央凸部２８のナノチャネル２９の側壁面にも付着して動いているので、微小管３１がナノチャネル２９の側壁面上を移動するからである。また、図８（７）には、複数のナノチャネル２９内に微小管３１が進入した様子が示されている。
【００６３】
なお、図８に示される例において、写真の中央に見えるナノチャネル２９は、長さが５０〔μｍ〕、幅が５００〜７５０〔ｎｍ〕、高さ（深さ）が４〔μｍ〕である。また、写真の左右に見えるＭａｉｎ  ｃｈａｎｎｅｌ（Ａ）及び（Ｂ）としてのアクセスチャネル２６ａ及び２６ｂは、幅が３００〔μｍ〕、高さ（深さ）が４〔μｍ〕である。
【００６４】
また、本発明の発明者は、図９に示されるように、非蛍光の微小管３１をナノチャネル２９内に配向した状態で固定した後に、Ｍａｉｎ  ｃｈａｎｎｅｌ（Ｂ）としてのアクセスチャネル２６ｂにキネシンビーズ３６を導入し、前記ナノチャネル２９内の微小管３１上でビーズアッセイを行った。図９（１）は、キネシンビーズ３６がナノチャネル２９内に導入される状態を示す写真であり、また、図９（２）〜（４）は２０秒毎に撮影された連続写真であり、キネシンビーズ３６がナノチャネル２９を搬送される様子を示している。
【００６５】
この場合、キネシンビーズ３６は、微小管３１のアクセスチャネル２６ｂ側の一端（マイナス端）に付着した後、Ｍａｉｎ  ｃｈａｎｎｅｌ（Ａ）としてのアクセスチャネル２６ａ側（図９における左側）に向かって８００〔ｎｍ／ｓ〕の速度で移動した。すなわち、キネシンビーズ３６が一方向に向かって搬送速度８００〔ｎｍ／ｓ〕で搬送されたことが確認された。これにより、ナノチャネル２９内に微小管３１が配向した状態で固定されたことが示された。
【００６６】
このように、本実施の形態においては、生体分子モータとしてのキネシン３２がコートされた基材としてのガラス板２２上に形成された配向用チャネルとしてのナノチャネル２９内にレール分子としての微小管３１を移動させ、所定波長、すなわち、波長４２０〜５００〔ｎｍ〕の光を照射することによってキネシン３２を失活させることにより、微小管３１をナノチャネル２９内に固定するようになっている。この場合、微小管３１は、マイナス端を先頭にしてナノチャネル２９内に進入するので、所定の方向に配向されて固定される。そのため、試薬を使用することなく、容易に、確実に、微小管３１を所定位置において所定方向に配向させて固定することができる。そのため、微小管３１上を移動するキネシン３２を所定の方向、すなわち、プラス端の方向に移動させることができる。
【００６７】
なお、本実施の形態においては、ナノチャネル２９の形状が直線である場合についてのみ説明したが、ナノチャネル２９の形状は、曲線であってもよいし、折れ線であってもよいし、いかなる形状であってもよい。さらに、前記ナノチャネル２９の形状は、二次元的な曲線や折れ線でなく、三次元的な曲線や折れ線であってもよい。例えば、ガラス板２２の面が平面でなく曲面であったり、また、ガラス板２２の面に凹凸が形成されている場合、ナノチャネル２９の形状を三次元方向に屈曲する曲線又は折れ線とすることができる。ナノチャネル２９を形成するチャネル形成部材は、ＰＤＭＳから成り、柔軟性があるので、曲面であったり、凹凸が形成されているガラス板２２の面にも容易に付着させることができる。また、ナノチャネル２９の長さも任意に設定することができる。これにより、固定された微小管３１上をキネシン３２によって搬送される搬送物の経路を、任意の長さで、任意の形状で、任意の場所を通過するように設定することができる。
【００６８】
また、ナノチャネル２９を形成するチャネル形成部材としての中央凸部２８や周辺凸部２７は、微小管３１を固定した後で、ガラス板２２上から除去することができる。すなわち、キネシン３２は、ナノチャネル２９の有無に係わらず、微小管３１上を移動して搬送物を搬送するので、ナノチャネル２９が存在しなくても、搬送物は固定された微小管３１に沿って搬送される。
【００６９】
そして、前述の方法によってガラス板２２上に固定された微小管３１と、該微小管３１上をプラス端の方向に移動するキネシン３２とによって、キネシンビーズ３６のように微小な搬送物を搬送するためのナノ搬送デバイスを得ることができる。この場合、レール分子としての微小管３１が所定の方向に配向されて固定されているので、微小管３１の極性に応じた方向に移動する生体分子モータとしてのキネシン３２によって、搬送物を所定の方向に搬送することができる。また、前述のように、微小管３１を任意の長さで、任意の形状で、任意の場所を通過するように固定することができるので、前記ナノ搬送デバイスは、搬送物を任意の長さで、任意の形状で、任意の場所を通過する経路で搬送することができる。さらに、容易に、確実に、微小管３１を所定位置において所定方向に配向させて固定することができるので、前記ナノ搬送デバイスを容易に、確実に、低コストで製造することができる。
【００７０】
また、レール分子としての微小管３１複数本を、相互に平行に、かつ、同一方向に配向させて固定することによって、大型の搬送物であっても搬送することができる。すなわち、微小管３１が１本の場合、例えば、縦５〔μｍ〕、横５〔μｍ〕、厚さ２〔μｍ〕の直方体程度の大きさの搬送物であれば搬送することができるが、それ以上大型の搬送物は搬送することができない。これに対し、複数本の微小管３１を相互に平行に、かつ、同一方向に配向させて固定させた場合、搬送物に固定された複数のキネシン３２が複数本の微小管３１上を同一の方向に並行して移動することによって、大型の搬送物であっても搬送することができる。なお、搬送物が大型であっても、該搬送物をキネシン溶液に浸漬することによって、その表面に複数のキネシン３２を固定することができる。これにより、例えば、縦５〔ｍｍ〕、横５〔ｍｍ〕、厚さ２〔μｍ〕の直方体程度の大きさの搬送物であっても搬送することができる。
【００７１】
なお、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々変形させることが可能であり、それらを本発明の範囲から排除するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の実施の形態における微小管を固定するナノチャネルの母型を製造する方法を示す図である。
【図２】本発明の実施の形態における微小管を固定するナノチャネルの構成を示す図である。
【図３】本発明の実施の形態における微小管及びキネシンを示す模式図である。
【図４】本発明の実施の形態における照射光の波長とキネシンの失活との関係を示す図である。
【図５】本発明の実施の形態における光の照射時間と微小管の動きとの関係を示す図である。
【図６】本発明の実施の形態における光の照射時間と微小管の動きとの関係を示す写真である。
【図７】本発明の実施の形態における微小管をナノチャネル内に固定する方法を示す図である。
【図８】本発明の実施の形態におけるナノチャネル内に微小管が導入する様子を示す写真である。
【図９】本発明の実施の形態におけるナノチャネル内の微小管上を移動するビーズの様子を示す写真である。
【符号の説明】
【００７３】
２１    ＰＤＭＳフィルム
２２    ガラス板
２７    周辺凸部
２８    中央凸部
２９    ナノチャネル
３１    微小管
３２    キネシン
３６    キネシンビーズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2006312211.tif 000008
【図７】
2006312211.tif 000009
【図８】
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【図９】
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